PT1565491E - ANTICORPOS QUE SE LIGAM AO ½CARROSSEL MáGICO” (MR „ ½MAGIC ROUNDABOUT”) HUMANO, SEUS POLIPéPTIDOS E SUAS UTILIZAÎES PARA INIBIÆO DA ANGIOGéNESE - Google Patents

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DESCRIÇÃO "Anticorpos que se ligam ao "carrossel mágico" (MR - "magic roundabout") humano, seus polipéptidos e suas utilizações para inibição da angiogénese" A presente invenção refere-se a anticorpos e polipéptidos, e em particular a anticorpos ECSM4 e polipéptidos que inibem a angiogénese e à sua utilização para esse efeito.

As células endoteliais formam uma camada celular simples que reveste todos os vasos sanguíneos e regula as permutas entre a corrente sanguínea e os tecidos circundantes. Novos vasos sanguíneos desenvolvem-se a partir das paredes de vasos pequenos existentes através da excrescência destas células endoteliais que têm a capacidade de formar tubos capilares ocos mesmo quando isoladas em cultura. In vivo, tecidos danificados e alguns tumores atraem um fornecimento sanguíneo segregando factores que estimulam células endoteliais vizinhas a construir novos brotos capilares. Os tumores que não conseguem atrair um fornecimento sanguíneo são severamente limitados no seu crescimento. 0 processo através do qual são originados novos vasos na forma de capilares, que brotam de vasos pequenos existentes, é denominado angiogénese. Pode portanto observar-se que a angiogénese desempenha um papel crucial no normal desenvolvimento e na reparação de tecidos e na progressão de algumas condições patológicas.

Uma vez totalmente desenvolvido o sistema vascular, as células endoteliais de vasos sanguíneos permanecem normalmente quiescentes sem formação de novos vasos, com a excepção da formação de novos vasos sanguíneos na cicatrização natural de feridas. Contudo, podem ocorrer uma desregulação do crescimento de vasos sanguíneos e um aumento anómalo na densidade dos vasos em doenças ou condições tais como tumorigénese, retinopatia diabética, psoríase e inflamação. Portanto a capacidade de inibir uma angiogénese inapropriada 2 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ ou indesejada pode ser útil no tratamento destas doenças ou condições.

Foi anteriormente mostrado que o "carrossel mágico" (MR -"magic roundabout" humano; também conhecido como molécula 4 específica de células endoteliais, ECSM4) possui um perfil de expressão altamente selectivo de células endoteliais (Huminiecki & Bicknell (2000), Genome Research, 1_0, 1796-1806; e WO 02/36771) . Mostrou-se que a expressão de MR in vivo é restrita a locais de angiogénese activa, notavelmente vasos de tumores (Huminiecki et al. (2002) Genomics, 7_9(4), 547-552).

Com base nesta informação foi sugerido em WO 02/36771 que compostos compreendendo uma porção que se liga a MR, tais como um anticorpo, e uma outra porção funcional, podem ser úteis para uma variedade de propósitos médicos incluindo a imagética do epitélio vascular; o diagnóstico ou prognóstico de uma condição que envolve o endotélio vascular; a avaliação da eficácia de terapias anti-angiogénicas; a detecção de danos endoteliais; a detecção de um tumor ou de neovasculatura tumoral ou doença cardíaca ou endometriose ou aterosclerose; tratamento de uma doença proliferativa que envolve o endotélio vascular tal como cancro, psoríase, retinopatia diabética, arteriosclerose ou menorragia; a introdução de material genético em células endoteliais vasculares; e a modulação da angiogénese.

Por exemplo, em WO 02/36771 ensina-se um composto compreendendo uma porção que se liga a MR, tal como um anticorpo, e uma outra porção tal como um inibidor da angiogénese (página 27) . Em WO 02/36771 também se ensina um composto compreendendo uma porção que se liga a MR, tal como um anticorpo, e uma outra porção tal como uma porção citotóxica que destrói ou retarda ou inverte o crescimento da neovasculatura (página 35).

Contudo, em cada caso, a porção que se liga a MR meramente dirige a porção funcional para uma localização endotelial desejada para utilização. Em WO 02/36771 não se sugere que a porção que se liga a MR seja ela própria funcional, abandonando a ideia de que iniba MR ou possa ser utilizada para inibir a angiogénese. 3 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ

Mostrámos agora que um anticorpo que se liga selectivamente à região extracelular de MR resulta em inibição da angiogénese.

No parágrafo que se estende nas páginas 71-72 de WO 02/36771 afirma-se que tanto anticorpos que estimulam ou activam MR como anticorpos que previnem a estimulação e activação de MR podem ser utilizados para modular a angiogénese. Contudo, não é sugerido que um anticorpo que se liga selectivamente à região extracelular de MR possa ser utilizado para inibir a angiogénese. Adicionalmente, tanto quanto é do conhecimento dos inventores, nem WO 02/36771 nem nenhum outro documento mostra qualquer evidência de que um anticorpo que se liga selectivamente à região extracelular de MR iniba, de facto, a angiogénese. É portanto proporcionada de acordo com um primeiro aspecto da invenção a utilização de um anticorpo que se liga selectivamente aos resíduos 46-209 do "carrossel mágico" (MR -"magic roundabout") humano na preparação de um medicamento para inibição da angiogénese.

Em "inibição da angiogénese" incluímos o significado de redução da taxa ou nível de angiogénese. A redução pode ser uma redução de nível baixo de cerca de 10%, ou cerca de 20%, ou cerca de 30%, ou cerca de 40% da taxa ou nível de angiogénese. Preferivelmente, a redução é uma redução de nível médio de cerca de 50%, ou cerca de 60%, ou cerca de 70%, ou cerca de 80% de redução da taxa ou nível de angiogénese. Mais preferivelmente, a redução é uma redução de nível elevado de cerca de 90%, ou cerca de 95%, ou cerca de 99%, ou cerca de 99,9%, ou cerca de 99,99% da taxa ou nível da angiogénese. O mais preferivelmente, a inibição pode também incluir a eliminação da angiogénese ou a sua redução para um nível indetectável.

Os métodos e ensaios para a determinação da taxa ou nível da angiogénese, e portanto para determinar se, e em que medida um anticorpo inibe a angiogénese, são conhecidos na especialidade. 4

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Por exemplo, a Patente US 6225118B1 de Grant et al., descreve um ensaio multicelular in vitro para modelar as etapas combinadas da angiogénese, nomeadamente as etapas de proliferação, migração e diferenciação do desenvolvimento celular. 0 AngioKit, n.° de Catálogo ZHA-1000, da TCS CellWorks Ltd, Buckingham MK18 2LR, RU, é um modelo adequado de angiogénese humana para a análise de propriedades angiogénicas ou anti-angiogénicas de compostos de teste. A taxa ou nível de angiogénese pode também ser determinada utilizando o ensaio do anel aórtico descrito no Exemplo 2.

Preferivelmente, o anticorpo também inibe a angiogénese in vivo, especialmente em mamíferos, e mais preferivelmente em seres humanos.

Em "MR" incluímos o produto génico do gene do "carrossel mágico" ("magic roundabout") humano (também conhecido como ECSM4) e suas variantes de ocorrência natural. 0 ADNc e a sequência de aminoácidos de MR encontram-se no Genbank com os n.°s de acesso AF361473 e AAL31867, e estão mostrados na Figura 1 (SEQ ID N0:1 e 2, respectivamente). 0 MR é uma proteína transmembranar e foi previsto que tinha uma região extracelular nos resíduos 1-467 (SEQ ID N0:3), uma região transmembranar nos resíduos 468-490, e uma região intracelular nos resíduos 491-1007 (Huminiecki et al., 2002). A região extracelular de MR tem uma região de imunoglobulina (Ig) nos resíduos 46-209 (SEQ ID NO:4), que pode ainda ser subdefinida num domínio de IgA nos resíduos 46-116 (SEQ ID NO: 5) , e num domínio de IgB nos resíduos 151-209 (SEQ ID NO: 6) , e dois domínios de fibronectina tipo III nos resíduos 252-335 (SEQ ID NO:7) e 347-432 (SEQ ID NO:8). A numeração dos resíduos de aminoácido de MR é a que foi atribuída em AF361473, AAL31867 e na Figura 1B.

Em um anticorpo que "se liga selectivamente" a um domínio ou região especificados de MR, tal como um domínio de Ig, incluímos o significado de que o anticorpo se liga ao domínio 5 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ específico com uma maior afinidade do que a qualquer outra região de MR. Preferivelmente, o anticorpo liga-se ao domínio especificado de MR com pelo menos 2, ou pelo menos 5, ou pelo menos 10 ou pelo menos 50 vezes maior afinidade do que a qualquer outra região de MR. Mais preferivelmente, o anticorpo liga-se ao domínio específico de MR com pelo menos 100, ou pelo menos 1000, ou pelo menos 10 000 vezes maior afinidade do que a qualquer outra região de MR. Esta ligação pode ser determinada por métodos bem conhecidos na especialidade. Preferivelmente, o anticorpo liga-se selectivamente a um epítopo particular no interior de MR e não se liga a outros epítopos.

Preferivelmente, quando o medicamento é administrado a um indivíduo, o anticorpo liga-se a MR no domínio especificado com uma afinidade maior do que para com qualquer outra molécula no indivíduo. Preferivelmente, o anticorpo liga-se a MR no domínio específico com pelo menos 2, ou pelo menos 5, ou pelo menos 10 ou pelo menos 50 vezes maior afinidade do que a qualquer outra molécula no indivíduo. Mais preferivelmente, o anticorpo liga-se a MR no domínio específico com pelo menos 100, ou pelo menos 1000, ou pelo menos 10 000 vezes maior afinidade do que a qualquer outra molécula no indivíduo. A inibição da angiogénese pode ser útil no combate a qualquer doença ou condição que envolva angiogénese indesejada, indesejável ou inapropriada. Estas condições incluem tumores/cancro, psoríase, aterosclerose, menorragia, endometriose, artrite (tanto inflamatória como reumatóide), degenerescência macular, doença de Paget, retinopatia e suas complicações vasculares (incluindo proliferativas e de prematuridade, e retinopatia diabética), proliferações vasculares benignas, fibroses, obesidade e inflamação.

Em cancro está incluído sarcoma de Kaposi, leucemia, linfoma, mieloma, carcinomas sólidos (tanto primários como secundários (metástase), tumores vasculares incluindo hemangioma (tanto capilar como juvenil (infantil)), hemangiomatose e hemagioblastoma. 6 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ

Os tumores que podem ser tratados com os medicamentos da invenção incluem quaisquer tumores que estão associados à produção de novos vasos sanguíneos. 0 termo "tumor" deve ser entendido como referindo-se a quaisquer formas de crescimento celular neoplásico, incluindo tumores do pulmão, fígado, células sanguíneas, pele, pâncreas, estômago, cólon, próstata, útero, mama, glândulas linfáticas e bexiga. Os tumores sólidos são especialmente adequados. Contudo crê-se agora também que os cancros sanguíneos, incluindo leucemias e linfomas, envolvem formação de novos vaso sanguíneos e podem ser tratados com os medicamentos da invenção. A invenção inclui assim a utilização de um anticorpo que se liga selectivamente aos resíduos 46-209 de MR na preparação de um medicamento para o combate a uma doença ou condição seleccionadas entre tumores/cancro, psoríase, aterosclerose, menorragia, endometriose, artrite (tanto inflamatória como reumatóide), degenerescência macular, doença de Paget, retinopatia e suas complicações vasculares (incluindo proliferativas e de prematuridade, e retinopatia diabética), proliferações vasculares benignas, fibroses, obesidade e inflamação.

Em "combate" incluímos o significado de que o medicamento pode ser utilizado para aliviar sintomas da desordem (i.e. o método é utilizado paliativamente), ou para tratar a desordem, ou para prevenir a desordem (i.e. o método é utilizado profilacticamente).

Assim, a invenção compreende a utilização de um anticorpo que se liga selectivamente aos resíduos 46-209 de MR na preparação de um medicamento para o tratamento de um paciente que tem uma doença em que a angiogénese contribui para a patologia.

Tipicamente, a doença está associada a formação de neovasculatura indesejável e o medicamento reduz esta formação numa extensão útil. 7

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Os medicamentos podem ser adequados para seres humanos ou animais. Preferivelmente, os medicamentos da invenção são utilizados para tratar seres humanos.

Em "anticorpo" incluímos não apenas moléculas de imunoglobulina completas mas também seus fragmentos tais como Fab, F(ab')2, Fv e outros seus fragmentos que retêm o local de ligação ao antigénio. Similarmente, o termo "anticorpo" inclui derivados geneticamente manipulados de anticorpos tais como moléculas de Fv de cadeia simples (scFv) e anticorpos de domínio (dAb). 0 termo também inclui moléculas semelhantes a anticorpos que podem ser produzidas utilizando técnicas de exibição em fagos ou outras técnicas de selecção aleatória para moléculas que se ligam a MR ou a regiões especificadas de MR. Assim, o termo anticorpo inclui todas as moléculas que contêm uma estrutura, preferivelmente uma estrutura peptídica, que faz parte do local de reconhecimento (i.e. a parte do anticorpo que se liga ou se combina com o epítopo ou o antigénio) de um anticorpo natural.

Os domínios variável pesado (VH) e variável leve (VL) do anticorpo estão envolvidos no reconhecimento do antigénio, um facto reconhecido pela primeira vez em experiências anteriores de digestão por protease. Encontrou-se uma confirmação adicional através da "humanização" de anticorpos de roedores. Os domínios variáveis de origem murina podem ser fundidos com domínios constantes de origem humana de modo a que o anticorpo resultante retenha a especificidade antigénica do anticorpo aparentado de roedor (Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 6851-6855).

Essa especificidade antigénica é conferida por domínios variáveis e é independente dos domínios constantes e é conhecida através de experiências que envolvem a expressão bacteriana de fragmentos de anticorpos, todos contendo um ou mais domínios variáveis. Estas moléculas incluem moléculas do tipo Fab (Better et al. (1988) Science 240, 1041); moléculas de Fv (Skerra et al. (1988) Science 240, 1038); moléculas de

Fv de cadeia simples (ScFv) onde os domínios VH e VL parceiros estão ligados por via de um oligopéptido flexível (Bird et al. (1988) Science 242, 423; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 5879) e anticorpos de domínio único (dAb) 8

ΕΡ 1 565 491/PT compreendendo domínios V isolados (Ward et al. (1989) Nature 341, 544) . Uma revisão geral das técnicas envolvidas na síntese de fragmentos de anticorpos que retêm os seus locais de ligação específica encontra-se em Winter & Milstein (1991) Nature 349,293-299. "Moléculas ScFv" significam moléculas em que os domínios VH e VL parceiros estão ligados através de um oligopéptido flexível. Anticorpos manipulados, tais como anticorpos ScFv, podem ser preparados utilizando as técnicas e abordagens descritas em J. Huston et al., (1988) "Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single chain Fv analogue produced in E. coli", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85, pp.5879-5883, e em A. Pluckthun, (June 1991) "Antibody engineering; Advances from use of E. coli expression Systems", Bio/technology vol 9.

As vantagens da utilização de fragmentos de anticorpos, em vez de anticorpos completos, são várias. A menor dimensão dos fragmentos pode conduzir a propriedades farmacológicas melhoradas, tais como melhor penetração no local alvo. São removidas as funções efectoras dos anticorpos completos, tais como a ligação ao complemento. Os fragmentos de anticorpos Fab, Fv, ScFv e dAb podem todos ser expressos e segregados por E. coli, desse modo permitindo a fácil produção de grandes quantidades dos fragmentos.

Os anticorpos completos, e os fragmentos F(ab')2 são "bivalentes". Por "bivalente" entendemos que os anticorpos e os fragmentos F(ab')2 possuem dois locais de combinação com antigénio. Em contraste, os fragmentos Fab, Fv, ScFv e dAb são monovalentes, possuindo apenas um local de combinação com antigénio.

Embora o anticorpo possa ser um anticorpo policlonal, prefere-se que seja um anticorpo monoclonal. Em algumas circunstâncias, particularmente se o anticorpo vai ser administrado repetidamente a um paciente humano, prefere-se que o anticorpo monoclonal seja um anticorpo monoclonal humano ou um anticorpo monoclonal humanizado. 9 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ

Os anticorpos monoclonais adequados que são reactivos como aqui se descreve podem ser preparados por técnicas conhecidas, por exemplo as divulgadas em "Monoclonal

Antibodies; A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) e em "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and

Application", SGR Hurrell (CRC Press, 1982). Podem ser produzidos anticorpos policlonais que são poliespecificos ou monoespecificos. Prefere-se que sejam monoespecificos.

Anticorpos quiméricos são discutidos por Neuberger et al. (1998, 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792- 799) .

Prefere-se que o anticorpo seja um anticorpo humanizado. Os anticorpos não humanos adequadamente preparados podem ser "humanizados" de maneiras conhecidas, por exemplo inserindo as regiões CDR de anticorpos de ratinho no esqueleto de anticorpos humanos. Os anticorpos humanizados podem ser preparados utilizando as técnicas e abordagens descritas em M. Verhoeyen, C. Milstein e G. Winter (1988) "Reshaping human antibodies: Grafting an antilysozyme activity", Science, 239, 1534-1536, e em C. Kettleborough et al., (1991) "Humanisation of a mouse monoclonal antiboby by CDR grafting; The importance of framework residues in loop conformation", Protein Engineering, P4(7), 773-783.

Os anticorpos podem ser anticorpos humanos no sentido de que possuem a sequência de aminoácidos de anticorpos humanos anti-MR mas podem ser preparados utilizando métodos conhecidos na especialidade que não requerem imunização de seres humanos. Por exemplo, estão disponíveis ratinhos transgénicos que contêm, em essência, genes de imunoglobulinas humanas (veja-se Vaughan et al. (1998) Nature Biotechnol. 16, 535-539.

Um segundo aspecto da invenção proporciona um método de inibição da angiogénese in vitro compreendendo a administração de um anticorpo que se liga selectivamente aos resíduos 46-209 de MR humano a tecido ou células in vitro. As células podem ser linhas celulares estabelecidas, ou células que foram recolhidas de um indivíduo. O tecido ou as células são preferivelmente tecido ou células de mamífero, e mais preferivelmente são tecido ou células humanos. 10

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Nos primeiros dois aspectos da invenção, o anticorpo liga-se selectivamente à região Ig de MR que está localizada nos resíduos 46-209 de MR (Figura 3, SEQ ID NO:4).

Numa concretização preferida, o anticorpo liga-se selectivamente ao domínio IgA de MR, que está localizado nos resíduos 46-116 de MR (Figura 4A, SEQ ID NO:5).

Numa concretização preferida alternativa, o anticorpo liga-se selectivamente ao domínio IgB de MR, que está localizado nos resíduos 151-209 de MR (Figura 4B, SEQ ID NO:6).

Numa concretização de cada um dos primeiros dois aspectos da invenção, o anticorpo tem pelo menos uma região variável de cadeia leve que incorpora as seguintes CDR: CDRl: SASSSVSYMY (SEQID NO:9); CDR2: L T S N L A S (SEQ ID NO:10); e CDR3: QQWSSNPLT (SEQ ID NO:ll).

Numa concretização mais específica, o anticorpo pode ter pelo menos uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos: QIVLTQ SP ALMS ASPGEKVTMTCS ASS S V S YM YW YQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTS YSLTISSMEAED AATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLE LK (SEQID NO: 12).

Preferivelmente, a cadeia leve é uma cadeia leve capa.

Numa concretização de cada um dos primeiros dois aspectos da invenção, o anticorpo tem pelo menos uma região variável de cadeia pesada que incorpora as seguintes CDR: CDRl: D Y N L N (SEQ ID NO:13); CDR2: VINPNYGTTSYNQKFKG (SEQ ID NO:14); e CDR3: G R D Y F G Y (SEQ ID NO:15). 11 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ

Numa concretização mais específica, o anticorpo pode ter pelo menos uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos: Q VK/QLQE S GP EL VKPG A S VKI SCKASGYSLTDYNL NWVKQNKGKSLEWIGVINPNYGTTSYNQKEKGKA TLTVDQSSSTTYMQLNSLTSEDSAVYYCARGRDY FGYWGQGTTVTVSS(SEQIDNOs: 16 e 17), onde K/Q significa que está presente K ou Q nessa posição (K está presente em SEQ ID NO:16, enquanto Q está presente em SEQ ID NO:17).

Numa concretização ainda mais específica, o anticorpo tem pelo menos uma região variável de cadeia leve como definido acima e pelo menos uma região variável de cadeia pesada como definido acima.

Um terceiro aspecto da invenção proporciona a utilização de um polinucleótido que codifica um anticorpo como definido acima na preparação de um medicamento para inibição da angiogénese.

Um quarto aspecto da invenção proporciona um método de inibição da angiogénese in vitro compreendendo a administração de um polinucleótido que codifica um anticorpo como definido acima a tecido ou células in vitro.

Um quinto aspecto da invenção proporciona um anticorpo que se liga aos resíduos 40-209 de MR humano e que contém as sequências de aminoácidos i) a iii), as sequências de aminoácidos iv) a vi) , ou preferivelmente as sequências de aminoácidos i) a vi): i) SASSSVSYMY (SEQ ID NO:9) ii) L T S N L A S* (SEQ ID NO:10) iii) QQWSSNPLT (SEQ ID NO:ll) iv) D Y N L N (SEQ ID NO:13) v) VINPNYGTTSYNQKFKG (SEQ ID NO:14) vi) G R D YF G Y (SEQ ID NO:15). 12 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ

Embora as CDR que determinam a especificidade de ligação a um antigénio possam ser determinadas empiricamente, foi demonstrado que num número significativo de casos a CDR3 de IgH é a região CDR mais importante. A invenção inclui assim um anticorpo com uma região CDR3 da cadeia pesada de Ig possuindo a sequência de aminoácidos G R D Y F G Y (SEQ ID NO:15).

Preferivelmente, o anticorpo inibe uma função de MR. Essas funções incluem a inibição de ligação a ligandos, a interacção com outras moléculas da superfície celular e a inibição de activação do receptor.

Preferivelmente, o anticorpo tem pelo menos uma região variável de cadeia leve que incorpora as seguintes CDR: CDR1: S A S s s V S Y Μ Y (SEQ ID NO:9) CDR2 : L T S N L A S (SEQ ID NO:10) CDR3 : Q Q W S S N P L T (SEQ ID NO:11)

Mais preferivelmente, o anticorpo tem pelo menos uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos: QIVLTQSPALMSASPGEKVT MT CSASSSVSYMYW YQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTS YSLTISSMEAEDAATYYCQQ WSSNPLTFGAGTKLE LK{SEQIDNO: 12).

Preferivelmente, a cadeia leve é uma cadeia leve capa.

Preferivelmente, o anticorpo tem pelo menos uma região variável de cadeia pesada que incorpora as seguintes CDR: CDR1: D Y N L N (SEQ ID NO:13) CDR2 : V I N PN Y G T TSYNQKFKG (SEQ ID NO:14 CDR3 : G R D Y F G Y (SEQ ID NO:15)

Mais preferivelmente, o anticorpo tem pelo menos uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos: 13 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ

QVK/QLQESGPELVKPGASVKISCKASGYSLTDYNL nwvkqnkgkslewigvinpnygttsynqkfkgka TLTVDQSSSTTYMQLNSLTSEDSAVYYCARGRDY FGYWGQGTTVTVSS (SEQID NOs: 16 e 17).

Ainda mais preferivelmente, o anticorpo tem pelo menos uma região variável de cadeia leve como definido acima no quinto aspecto da invenção e pelo menos uma região variável de cadeia pesada como definido acima no quinto aspecto da invenção. 0 mais preferivelmente, o anticorpo tem pelo menos uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos: QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYW YQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTS YSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLE L K (SEQ ID NO: 12) e pelo menos uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos: QVK/QLQESGPELVKPG AS VKIS CKAS GYSLTDYNL NWVKQNKGKSLEWIGVINPNYGTTSYNQKFKGKA TLTVDQSSSTTYMQLNSLTSEDSAVYYCARGRDY FGYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NOs: 16 e 17).

Prefere-se que o anticorpo seja um anticorpo humanizado. É ainda preferido que 0 anticorpo seja um anticorpo humanizado possuindo as : segui .nt .es ; CDR: CDR1 de cadeia leve: S A S S S V S Y Μ Y (SEQ ID NO:9); CDR2 de cadeia leve: L T S N L A S (SEQ ID NO:10 ); CDR3 de cadeia leve: Q Q W S S N P L T (SEQ ID NO:11); CDR1 de cadeia pesada: D Y N L N (SEQ ID NO:13); CDR2 de cadeia pesada: V I N P N YGTTSYNQ K F K G (SEQ H U 2 O 1—1 4) ; e CDR3 de cadeia pesada: G R D Y F G Y (SEQ ID NO: 15) . Um sexto . aspecto da invenção proporciona um anticorpo que se liga selectivamente ao epítopo de MR que é ligado 14

ΕΡ 1 565 491/PT selectivamente por um anticorpo possuindo pelo menos uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos:

QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYW

YQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTS YSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLE LK(SEQIDNO: 12) e pelo menos uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos: QVK/QLQESGPELVKPGAS VKISCKASGYSLTDYNL N WVKQNKGKSLEWIGVINPNYGTTSYNQKFKGK A TLTVDQSSSTTYMQLNSLTSEDSAVYYCARGRDY FGYWGQGTTVTVSS (SEQID NOs: 16 e 17).

Em anticorpo que se liga selectivamente a um epitopo de MR que é ligado selectivamente por outro anticorpo definido, incluímos um anticorpo que compete com o anticorpo definido. Estes anticorpos podem ser determinados, por exemplo, utilizando ensaios de ligação competitiva, preferivelmente ensaios de ligação de elevado rendimento, como é bem conhecido dos peritos na especialidade. Os ensaios adequados incluem um ELISA de competição cruzada em que um fragmento extracelular de MR é incubado com o anticorpo definido e um anticorpo de teste, para determinar se o anticorpo de teste compete ou não com o anticorpo definido pela ligação ao epitopo de MR.

Um sétimo aspecto da invenção proporciona um polinucleótido que codifica um anticorpo como definido nos quinto ou sexto aspectos da invenção.

Numa concretização, o polinucleótido compreende pelo menos uma das sequências nucleotídicas: i) AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC (SEQ ID NO:18); ii) TCT CAC ATC CAA CCT GGC TTC T (SEQ ID NO:19); e iii) CAG CAG TGG AGT AGT AAC CCA CTC ACG (SEQ ID NO:20).

Preferivelmente, o polinucleótido compreende duas das três ou as três sequências nucleotídicas i), ii) e iii) . 15

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Preferivelmente, o polinucleótido compreende a sequência nucleotidica: CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA GCA CTC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA AGA TCC TCC CCC AAA CCC TGG ATT TAT CTC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGC ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT AGT AAC CCA CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA (SEQ ID NO: 21).

Numa concretização alternativa ou adicional, o polinucleótido compreende pelo menos uma das sequências nucleotidicas: iv) GAC TAC AAC CTG AAC (SEQ ID NO:22) v) GTA ATT AAT CCA AAC TAT GGT ACT AGT TAC AAT CAG AAG TTC AAG GGC (SEQ ID NO:23), e vi) GGG AGG GAT TAC TTC GGC TAC (SEQ ID NO:24)

Preferivelmente, o polinucleótido compreende duas das três ou as três sequências nucleotídicas iv) , v) e vi) .

Preferivelmente, o polinucleótido compreende a sequência nucleotidica:

CAG GTC AAG(or A/CAA) CTG CAG GAG TCA GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGC GCT TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC TCA CTC ACT GAC TAC AAC CTG AAC TGG GTG AAG CAG AAC AAA GGA AAG AGC CTT GAG TGG ATT GGA GTA ATT AAT CCA AAC TAT GGT ACT AGT TAC AAT CAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GTA GAC CAA TCT TCC AGC ACA ACC TAC ATG CAG CTC AAC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC TAT TAC TGT GCA AGA GGG AGG GAT TAC TTC GGC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA. 16

ΕΡ 1 565 491/PT (Ο polinucleótido possuindo AAG no terceiro codão é SEQ ID NO:25; o polinucleótido possuindo AAA no terceiro codão é SEQ ID NO:26; e o polinucleótido possuindo CAA no terceiro codão é SEQ ID NO:27).

Mais preferivelmente, o polinucleótido compreende pelo menos uma sequência nucleotidica: CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA GCA CTC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA AGA TCC TCC CCC AAA CCC TGG ATT TAT CTC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGC ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT AGT AAC CCA CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA (SEQ ID NO: 21), e pelo menos uma sequência nucleotidica: CAG GTC AAG(or A/CAA) CTG CAG GAG TCA GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGC GCT TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC TCA CTC ACT GAC TAC AAC CTG AAC TGG GTG AAG CAG AAC AAA GGA AAG AGC CTT GAG TGG ATT GGA GTA ATT AAT CCA AAC TAT GGT ACT AGT TAC AAT CAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GTA GAC CAA TCT TCC AGC ACA ACC TAC ATG CAG CTC AAC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC TAT TAC TGT GCA AGA GGG AGG GAT TAC TTC GGC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA (SEQ ID NOs: 25-27).

Numa concretização, as duas reqiões de codificação podem estar no mesmo polinucleótido, por exemplo, num polinucleótido para expressão de um anticorpo ScFv.

Um oitavo aspecto da invenção proporciona um anticorpo que se liqa selectivamente à região Ig de MR (resíduos 46-209, SEQ ID NO: 4) mas que não se liga selectivamente ao péptido LLQPPARGHAHDGQALSTDL (resíduos 91-109 de MR, SEQ ID NO:28) ou 17 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ ao péptido LSQSPGAVPQALVAWRA (resíduos 165-181 de MR, SEQ ID NO:29).

Numa concretização, a invenção inclui um anticorpo que se liga selectivamente à região IgA de MR (resíduos 46-116, SEQ ID NO: 5) mas não se liga select ivamente ao péptido LLQPPARGHAHDGQALSTDL (resíduos 91-109 de MR, SEQ ID NO:28).

Numa concretização alternativa, a invenção inclui um anticorpo que se liga select ivamente à região IgB de MR (resíduos 151-209, SEQ ID NO:6) mas não se liga selectivamente ao péptido LSQSPGAVPQALVAWRA (resíduos 165-181 de MR, SEQ ID NO:29).

Um nono aspecto da invenção proporciona um polinucleótido que codifica um anticorpo como definido no oitavo aspecto da invenção.

Um décimo aspecto da invenção proporciona um composto compreendendo um anticorpo como definido acima nos quinto, sexto e oitavo aspectos da invenção, e uma porção citotóxica. A porção citotóxica é de preferência directamente ou indirectamente tóxica para as células na neovasculatura ou para células que estão em estreita proximidade e associadas com a neovasculatura.

Em "directamente citotóxico" incluímos o significado de que a porção é uma porção que por si só é citotóxica. Em "indirectamente citotóxico" incluímos o significado de que a porção é uma porção que, embora não seja por si só citotóxica, pode induzir citotoxicidade, por exemplo através das sua acção sobre uma outra molécula ou através de acção adicional sobre ela.

Numa concretização a porção citotóxica é um agente citotóxico e quimioterapêutico. Os agentes citotóxicos e quimioterapêuticos são bem conhecidos na especialidade.

Os agentes citotóxicos e quimioterapêuticos, tais como agentes anticancerosos, incluem: agentes alquilantes incluindo mostardas de azoto como mecloretamina (HN2) , ciclofosdamida, 18 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ ifosfamida, melfalano (L-sarcolisina) e clorambucilo; etileniminas e metilmelaminas tais como hexametilmelamina, tiotepa; sulfonatos de alquilo tais como busulfano; nitrosoureias tais como carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), semustina (metil-CCNU) e estreptozocina (estreptozotocina); e triazenos tais como decarbazina (DTIC; dimetiltriazeno- imidazolocarboxamida); Antimetabolitos incluindo análogos de ácido fólico tais como metotrexato (ametopterina); análogos de pirimidina tais como fluorouracilo (5-fluorouracilo; 5-FU), floxuridina (fluorodesoxiuridina; FUdR) e citarabina (arabinósido de citosina); e análogos de purina e inibidores relacionados tais como mercaptopurina (6-mercaptopurina; 6-MP), tioguanina (6-tioguanina; TG) e pentostatina (2'-desoxicoformicina). Produtos naturais incluindo alcaloides de vinca como vinblastina (VLB) e vincristina; epipodofilotoxinas tais como etoposido e teniposido; antibióticos tais como dactinomicina (actinomicina D), daunorubicina (daunomicina; rubidomicina), doxorubicina, bleomicina, plicamicina (mitramicina) e mitomicina (mitomicina C) ; enzimas tais como L-asparaginase; e modificadores de resposta biológica tais como alfenomas de interferão. Outros agentes incluindo complexos de coordenação de platina tais como cisplatina (cis-DDP) e carboplatina; antacenodiona tal como mitoxantrona e antraciclina; ureia substituída tal como hidroxiureia; derivado de metil-hidrazina tal como procarbazina (N-metil-hidrazina, MIH); e supressor adrenocortical tal como mitotano (ο,ρ'-DDD) e aminoglutetimida; taxol e análogos/derivados; e agonistas/antagonistas de hormonas tais como flutamida e tamoxifeno. Vários destes agentes foram anteriormente ligados a anticorpos e outros agentes de entrega dirigida a um alvo, e portanto os compostos da invenção compreendendo estes agentes podem prontamente ser preparados por um perito na especialidade. Por exemplo, a conjugação de carbodiimida (Bauminger & Wilchek (1980) Methods Enzymol. 70, 151-159; aqui incorporado por referência) pode ser utilizada para conjugar uma variedade de agentes, incluindo doxorubicina, a anticorpos.

As carbodiimidas constituem um grupo de compostos que têm a fórmula geral R-N=C=N-R', onde R e R' podem ser alifáticos 19 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ ou aromáticos, e são utilizados para a síntese de ligações peptídicas. O procedimento preparativo é simples, relativamente rápido, e é realizado sob condições moderadas. Os compostos de carbodiimida atacam grupos carboxílicos para os transformar em locais reactivos para grupos amino livres. A carbodiimida solúvel em água, l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) é particularmente útil para conjugação de uma porção funcional com um anticorpo e pode ser utilizada para conjugar doxorubicina a péptidos orientadores para tumores. A conjugação de doxorubicina e um anticorpo reguer a presença de um grupo amino, gue é proporcionado pela doxorubicina, e de um grupo carboxilo, gue é proporcionado pelo anticorpo tal como um anticorpo ou péptido.

Em adição à utilização de carbodiimidas para a formação directa de ligações peptídicas, a EDC também pode ser utilizada para preparar ésteres activos tais como o éster N-hidroxissuccinimida (NHS). 0 éster NHS, que se liga apenas a grupos amino, pode então ser utilizado para induzir a formação de uma ligação amida com o grupo amino único da doxorubicina. A utilização de EDC e NHS em combinação é vulgarmente utilizada para conjugação de modo a aumentar o rendimento da formação de conjugados (Bauminger & Wilchek, supra, 1980) .

Podem também ser utilizados outros métodos para conjugação de uma porção citotóxica a um anticorpo. Por exemplo, por ser utilizada a oxidação com periodato de sódio seguida por alquilação redutora dos reagentes apropriados, assim como a reticulação com glutaraldeído. Contudo, é reconhecido que, independentemente do método de produção de um composto da invenção seleccionado, tem que se determinar se o anticorpo mantém a sua capacidade de direccionamento e se a porção ligada mantém a sua função relevante. e

Numa outra concretização da invenção, a porção citotóxica é uma porção peptídica ou polipeptídica citotóxica, no que incluímos qualquer porção que conduza a morte celular. As porções peptídicas e polipeptídicas citotóxicas são bem conhecidas na especialidade e incluem, por exemplo, ricina, abrina, exotoxina de Pseudomonas, factor tissular 20

ΕΡ 1 565 491/PT semelhantes. Os métodos para a sua ligação a porções de direccionamento, como anticorpos, são também conhecidos na especialidade. A utilização de ricina como agente citotóxico está descrita em Burrows & Thorpe (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 8996-9000, e a utilização de factor tissular, que conduz a coagulação sanguínea e enfarte localizados de um tumor, foi descrita por Ran et al. (1998) Câncer Res. 58, 4646-4653 e Huang et al. (1997) Science 275, 547-550. Tsai et al. (1995) Pis. Colon Rectum 38, 1067-1074 descrevem a cadeia A de abrina conjugada com um anticorpo monoclonal. Outras proteínas inactivadoras de ribossomas estão descritas como agentes citotóxicos em WO 96/06641. A exotoxina de Pseudomonas pode também ser utilizada como porção polipeptídica citotóxica (veja-se, por exemplo, Aiello et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92, 10457-10461.

Certas citoquinas, como TNFa e IL-2, podem também ser úteis como agentes citotóxicos.

Certos átomos radioactivos podem também ser citotóxicos se entregues em doses suficientes. Assim, a porção citotóxica pode compreender um átomo radioactivo que, em utilização, entrega uma quantidade suficiente de radioactividade ao local alvo de modo a ser citotóxico. Os átomos radioactivos adequados incluem fósforo-32, iodo-125, iodo-131, índio-111, rénio-186, rénio-188 ou ítrio-90, ou qualquer outro isótopo que emita suficiente energia para destruir células vizinhas, organelos ou ácido nucleico. Preferivelmente, os isótopos e a densidade de átomos radioactivos no composto da invenção são tais que uma dose de mais de 4000 cGy (preferivelmente pelo menos 6000, 8000 ou 10000 cGy) seja entregue ao local alvo e, preferivelmente, às células no local alvo e seus organelos, particularmente o núcleo.

O átomo radioactivo pode ser fixado ao anticorpo de maneiras conhecidas. Por exemplo EDTA ou outro agente quelante pode ser ligado ao anticorpo e utilizado para ligar i:L1In ou 90Y. Os resíduos de tirosina podem ser marcados com 125I 131-,- OU I . A porção citotóxica pode ser um polipéptido indirectamente citotóxico adequado. Numa concretização 21

ΕΡ 1 565 491/PT particularmente preferida, o polipéptido indirectamente citotóxico é um polipéptido que tem actividade enzimática e pode converter um pró-fármaco relativamente não tóxico num fármaco citotóxico. Quando a porção de direccionamento é um anticorpo este tipo de sistema é frequentemente referido como ADEPT (Terapia de Pró-fármacos Enzimáticos Dirigida por Anticorpos). 0 sistema requer que a porção de direccionamento localize a porção enzimática no local pretendido no corpo do paciente (i.e. o local que expressa MR, tal como novo tecido vascular associado a um tumor) e depois de dar tempo para que a enzima se localize no local, administrar um pró-fármaco que é um substrato para a enzima, sendo o produto final da catálise um composto citotóxico. 0 objectivo da abordagem é maximizar a concentração de fármaco no local pretendido e minimizar a concentração de fármaco em tecidos normais (veja-se Senter, P.D. et al. (1988) "Anti-tumor effects of antibody-alkaline phosphatase conjugates in combination with etoposide phosphate" Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 4842-4846; Bagshawe (1987) Br. J. Câncer 56, 531-2; e Bagshawe, K.D. et al. (1988) "A cytotoxic agent can be generated selectively at câncer sites" Br. J. Câncer. 58, 700-703.) A substância citotóxica pode ser qualquer fármaco anticanceroso existente como um agente alquilante; um agente que se intercala no ADN; um agente que inibe quaisquer enzimas chave tal como di-hidrofolato-redutase, timidina-sintetase, ribonucleótido-redutase, nucleósido-quinases ou topoisomerase; ou um agente que efectua morte celular através de interaeção com quaisquer outros constituintes celulares. O etoposido é um exemplo de um inibidor de topoisomerase.

Sistemas de pró-fármacos relatados incluem: um pró-fármaco de mostarda de fenol activado por uma β-glucuronidase de E. coli (Wang et al., 1992 e Roffler et al., 1991); um pró-fármaco de doxorubicina activado por uma β-glucuronidase humana (Bosslet et al., 1994); outros pró-fármacos de doxorubicina activados por α-galactosidase do grão do café (Azoulay et al., 1995); pró-fármacos de daunorubicina, activados por α-D-galactosidase do grão do café (Gesson et al., 1994); um pró-fármaco de 5-fluorouridina activado por uma β-D-galactosidase de E. coli (Abraham et al., 1994); e pró-fármacos de metotrexato (e.g. metotrexato-alanina) activados 22 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ por carboxipeptidase A (Kuefner et al., 1990, Vitols et al., 1992 e Vitols et al., 1995) . Estes e outros estão incluídos na Tabela 1.

Tabela 1

Enzima Pró-fármaco Carboxipeptidase G2 Derivados de ácido L-glutâmico e mostardas de ácido benzóico, mostardas de anilina, mostardas de fenol e mostardas de fenilenodiamina; derivados fluorados destes Fosfatase alcalina Fosfato de etoposido Fosfato de mitomicina Beta-glucuronidase mostarda de p-Hidroxianilina-glucuronida Epirubicina-glucuronida Penicilina-V-amidase Adriamicina-N-fenoxiacetilo Penicilina-G-amidase N-(4'-hidroxifenilacetil)palitoxina Doxorubicina e melfalano Beta-lactamase Mostarda de azoto-cefalosporina p-fenilenodiamina; derivados de doxorubicina; derivado de vinblastina-cefalosporina, mostarda de cefalosporina; um derivado de taxol Beta-glucosidase Ácido cianofenilmetil-beta-D-glucopiranósido-urónico Nitro-redutase 5-(Azaridin-l-il-)-2,4-dinitrobenzamida Citosina-desaminase 5-Fluorocitosina Carboxipeptidase A Metotrexato-alanina (Esta tabela é adaptada de Bagshawe (1995) Drug Dev. Res. 34, 220-230, de onde se podem obter referências completas destes vários sistemas; o derivado de taxol está descrito em Rodrigues, M.L. et al. (1995) Chemistry & Biology 2:, 223) .

As enzimas adequadas para fazerem parte da porção enzimática da invenção incluem: exopeptidases, tais como carboxipeptidases G, G1 e G2 (para pró-fármacos de mostarda glutamilatada) , carboxipeptidases A e B (para pró-fármacos à base de MTX) e aminopeptidases (para pró-fármacos de 2-a- 23

ΕΡ 1 565 491/PT aminocil-MTC); endopeptidases, tais como e.g. trombolisina (para pró-fármacos de trombina); hidrolases, tais como fosfatases (e.g. fosfatase alcalina) ou sulfatases (e.g. arilsulfatases) (para pró-fármacos fosfilatados ou sulfatados); amidases, tais como penicilina-amidases e arilacil-amidase; lactamases, tais como β-lactamases; glicosidases, tais como β-glucuronidase (para antraciclinas de β-glucuronomida), α-galactosidase (para amigdalina) e β-galactosidase (para antraciclina de β-galactose); desaminases, tais como citosina-desaminase (para 5FC) ; quinases, tais como uroquinase e timidina-quinase (para ganciclovir); redutases, tais como nitro-redutase (para CB1954 e análogos), azo-redutase (para mostardas de azobenzeno) e DT-diaforase (para CB1954); oxidases, tais como glucose-oxidase (para glucose), xantina-oxidase (para xantina) e lactoperoxidase; DL-racemases, anticorpos catalíticos e ciclodextrinas. 0 pró-fármaco é relativamente não tóxico comparativamente com o fármaco citotóxico. Tipicamente, tem menos de 10% da toxicidade, preferivelmente menos de 1% da toxicidade como medida num teste de citotoxicidade in vitro adequado. É provável que a porção que é capaz de converter um pró-fármaco num fármaco citotóxico seja activa no isolamento do resto do composto mas é necessário apenas que seja activa quando (a) está em combinação com o resto do composto e (b) o composto está ligado a, adjacente a, ou internalizado em células alvo.

Quando cada porção do composto é um polipéptido, as duas porções podem ser ligadas uma à outra por qualquer das maneiras convencionais para reticular polipéptidos, tais como as genericamente descritas em 0'Sullivan et al. (1979) Anal. Biochem. 100, 100-108. Por exemplo, o anticorpo anti-MR pode ser enriquecido com grupos tiol e a outra porção reagida com um agente bifuncional capaz de reagir com esses grupos tiol, por exemplo o éster de N-hidroxissuccinimida de ácido iodoacético (NHIA) ou N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP). As ligações amida e tioéter, conseguidas por exemplo com éster de m-maleimidobenzoí1-N- 24 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ hidroxissuccinimida, são geralmente mais estáveis in vivo do que as ligações dissulfureto.

Alternativamente, o composto pode ser produzido na forma de um composto de fusão por técnicas de ADN recombinante pelo que um comprimento de ADN compreende as respectivas regiões que codificam as duas porções do composto da invenção quer adjacentes uma à outra quer separadas por uma região que codifica um péptido ligante que não destrói as propriedades desejadas do composto. É concebível que as duas porções do composto possam estar sobrepostas completa ou parcialmente. 0 ADN é depois expresso num hospedeiro adequado para produzir um polipéptido compreendendo o composto da invenção. A porção citotóxica pode ser um radiossensibilizador. Os radiossensibilizadores incluem fluoropirimidinas, análogos de timidina, hidroxiureia, gencitabina, fludarabina, nicotinamida, pirimidinas halogenadas, 3-aminobenzamida, 3-aminobenzodiamida, etanixadole, pimonidazole e misonidazole (veja-se, por exemplo, McGinn et ai. (1996) J. Natl. Câncer Inst. 88, 1193-11203; Shewach & Lawrence (1996) Invest. New

Drugs 14, 257-263; Horsman (1995) Acta Oncol. 34, 571-587;

Shenoy & Singh (1992) Clin. Invest. 10, 533-551; Mitchell et al. (1989) Int. J. Radiat. Biol. 56, 827-836; Iliakis &

Kurtzman (1989) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16, 1235- 1241; Brown (1989) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16, 987-993; Brown (1985) Câncer 55, 2222-2228).

Também, a entrega de genes a células pode radiossensibilizá-las, por exemplo a entrega do gene de p53 ou ciclina D (Lang et al. (1998) J. Neurosurg. 89, 125-132; Coco

Martin et al. (1999) Câncer Res. 59, 1134-1140). A porção adicional pode ser uma porção que se torna citotóxica, ou liberta uma porção citotóxica, por irradiação. Por exemplo, o isótopo boro-10, quando apropriadamente irradiado, liberta partículas α que são citotóxicas (veja-se por exemplo, US 4348376 de Goldenberg; Primus et al. (1996) Bioconjug. Chem. 1_, 532-535) . 25

ΕΡ 1 565 491/PT

Similarmente, a porção citotóxica pode ser uma que seja útil em terapia fotodinâmica tal como fotofrina (veja-se, por exemplo, Dougherty et al. (1998) J. Natl. Câncer Inst. 90, 889-905). A porção citotóxica pode ser uma molécula de ácido nucleico que é directa ou indirectamente citotóxica. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico pode ser um oligonucleótido anti-sentido que, após localização no local alvo é capaz de entrar nas células e conduzir à sua morte. O oligonucleótido, portanto, pode ser um que previne a expressão de um gene essencial, ou um que conduz a uma alteração na expressão génica que provoca apoptose.

Os exemplos de oligonucleótidos adequados incluem os que são dirigidos a bcl-2 (Ziegler et al. (1997) J. Natl. Câncer Inst. 89, 1027-1036), e ADN-polimerase α e topoisomerase lia (Lee et al. (1996) Anticancer Res. 16, 1805-1811. Ácidos nucleicos peptídicos podem ser úteis em vez dos ácidos nucleicos convencionais (veja-se Knudsen & Nielsen (1997) Anticancer Drugs 8_, 113-118) .

Um décimo primeiro aspecto da invenção proporciona um polinucleótido que codifica um composto como definido acima no décimo aspecto da invenção, em que o anticorpo e a porção citotóxica são polipéptidos que estão fundidos.

Um décimo segundo aspecto da invenção proporciona um composto compreendendo um anticorpo como definido acima no quinto, no sexto e no oitavo aspectos da invenção, e uma porção prontamente detectável.

Um composto compreendendo um anticorpo anti-MR como definido acima e uma porção prontamente detectável pode ser utilizado, em combinação com um método de detecção apropriado, para detectar a localização do composto no indivíduo, e portanto para identificar os locais e a extensão da angiogénese no indivíduo, assim como a inibição da angiogénese no indivíduo. 26

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Em "porção prontamente detectável" incluímos o significado de que a porção é uma porção que, quando localizada no local alvo após administração do composto da invenção a um paciente, pode ser detectada, tipicamente de forma não invasiva de fora do corpo e o local do alvo localizado. Assim, os compostos desta concretização da invenção são úteis em imagética e diagnóstico.

Tipicamente, a porção prontamente detectável é ou compreende um átomo radioactivo que é útil em imagética. Os átomos radioactivos adequados incluem tecnécio-99m ou iodo-123 para estudos cintigráficos. Outras porções prontamente detectáveis incluem, por exemplo, marcadores de spin para imagética por ressonância magnética (MRI) tais como iodo-123 novamente, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, azoto-15, oxigénio-17, gadolínio, manganês ou ferro. Claramente, o composto da invenção tem que ter suficiente quantidade dos isótopos atómicos apropriados para que a molécula seja prontamente detectável.

Os marcadores radioactivos ou outros marcadores podem ser incorporados no composto da invenção de maneiras conhecidas. Por exemplo, se o anticorpo for um polipéptido pode ser biossintetizado ou pode ser sintetizado por síntese química de aminoácidos utilizando precursores de aminoácidos adequados envolvendo, por exemplo, flúor-19 no lugar de hidrogénio. Marcadores como 99mTc, 123I, 186Rh, 188Rh e ιηΙη podem, por exemplo, ser ligados através de resíduos de cisteína ao anticorpo. 0 ítrio-90 pode ser ligado através de um resíduo de lisina. 0 método IODOGEN (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 49-57) pode ser utilizado para incorporar iodo-123. A referência ("Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", J-F Chatal, CRC Press, 1989) descreve outros métodos em detalhe.

Um décimo terceiro aspecto da invenção proporciona um vector compreendendo um polinucleótido como definido acima no sétimo, no nono e no décimo primeiro aspectos da invenção.

Os vectores plasmídicos procariotas típicos são: pUC18, pUC19, pBR322 e pBR329 disponíveis da Biorad Laboratories (Richmond, CA, EUA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 e 27 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ pRIT5 disponíveis da Pharmacia (Piscataway, NJ, EUA); vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, ρΝΗ8Α, ρΝΗΙβΑ, pNHl8A, pNH46A disponíveis da Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA 92037, EUA).

Um vector plasmídico de células de mamífero típico é o pSVL disponível na Pharmacia (Piscataway, NJ, EUA). Este vector utiliza o promotor tardio de SV40 para conduzir a expressão de genes clonados, sendo o mais elevado nível de expressão encontrado em células produtoras de antigénio T, tais como células COS-1. Um exemplo de um vector de expressão indutível de mamífero é o pMSG, também disponível na Pharmacia (Piscataway, NJ, EUA) . Este vector utiliza o promotor indutível por glucocorticóides da repetição terminal longa do vírus do tumor mamário de ratinho para conduzir a expressão do gene clonado.

Os vectores plasmídicos de levedura úteis são o pRS403-406 e o pRS413-416 e estão geralmente disponíveis em Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA 92037, EUA). Os plasmídeos pRS403, pRS404, pRS405 e pRS406 são plasmídeos integrantes de levedura (YIp) e incorporam os marcadores seleccionáveis de levedura HIS3, TRP1, LEU2 e URA3. Os plasmídeos pRS413-416 são plasmídeos centroméricos de levedura (YCp). Métodos bem conhecidos dos peritos na especialidade podem ser utilizados para construir vectores de expressão contendo a sequência de codificação e, por exemplo controlos da transcrição ou da tradução apropriados. Um destes métodos envolve a ligação através de caudas homopoliméricas. As caudas homopoliméricas polidA (ou polidC) são adicionadas a grupos -OH expostos a 3' no fragmento de ADN a clonar por desoxinucleotidil-transferases terminais. O fragmento é então capaz de hibridar com as caudas polidT (ou polidG) adicionadas às extremidades de um vector plasmídico linearizado. Os hiatos deixados após a hibridação podem ser preenchidos por ADN-polimerase e as extremidades livres podem ser unidas por ADN-ligase.

Outro método envolve a ligação através de extremidades coesivas. Podem ser geradas extremidades coesivas compatíveis 28

ΕΡ 1 565 491/PT no fragmento de ADN e vectores através da acção de enzimas de restrição adequadas. Estas extremidades irão hibridar rapidamente através de emparelhamento de bases complementares e os cortes remanescentes podem ser fechados através da acção de ADN-ligase.

Um outro método utiliza moléculas sintéticas denominadas ligantes e adaptadores. Fragmentos de ADN com extremidades lisas são gerados por ADN-polimerase de bacteriófago T4 ou ADN-polimerase I de E. coli que removem terminais protuberantes a 3' e preenchem extremidades 3' recessas. Os ligantes sintéticos, porções de ADN de cadeia dupla com extremidades lisas que contêm sequências de reconhecimento para enzimas de restrição definidas, podem ser ligados a fragmentos de ADN com extremidades lisas por ADN-ligase de T4. São subsequentemente digeridos com enzimas de restrição apropriadas para criar extremidades coesivas e ligados a um vector de expressão com terminais compatíveis. Os adaptadores são também fragmentos de ADN sintetizados quimicamente que contêm uma extremidade lisa utilizada para ligação mas que também possuem uma extremidade coesiva pré-formada.

Ligantes sintéticos contendo uma variedade de locais para endonucleases de restrição estão comercialmente disponíveis de várias fontes incluindo International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, EUA.

Uma maneira desejável de modificar o ADN que codifica o polipéptido da invenção é utilizar a reacção em cadeia pela polimerase como divulgado por Saiki et al. (1988) Science 239, 487-491. Neste método o ADN a amplificar enzimaticamente está flanqueado por dois iniciadores oligonucleotídicos específicos que eles próprios ficam incorporados no ADN amplificado. Os iniciadores específicos podem conter locais de reconhecimento para endonucleases de restrição que podem ser utilizados para clonagem em vectores de expressão utilizando métodos conhecidos na especialidade.

Um décimo quarto aspecto da invenção proporciona uma célula hospedeira compreendendo um polinucleótido como definido no sétimo, no nono e no décimo primeiro aspectos da 29 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ invenção, ou um vector como definido no décimo terceiro aspecto da invenção. São conhecidos muitos sistemas de expressão, incluindo sistemas que empregam: bactérias (e.g. E. coli e Bacillus subtilis) transformadas com, por exemplo, vectores de expressão de ADN bacteriofágico recombinante, plasmídico ou cosmídico; leveduras (e.g. Saccharomyces cerevisiae) transformadas com, por exemplo, vectores de expressão de levedura; sistemas de células de insecto transformadas com, por exemplo, vectores de expressão virais (e.g. baculovirus); sistemas de células de plantas transfectadas com, por exemplo vectores de expressão virais ou bacterianos; sistemas de células animais transfectadas com, por exemplo, vectores de expressão adenovirais.

Os vectores podem incluir um replicão procariota, tal como o Col EI ori, para propagação num procariota, mesmo que o vector se destine a utilização para expressão em outros tipos de células não procariotas. Os vectores podem também incluir um promotor apropriado tal como um promotor procariota capaz de dirigir a expressão (transcrição e tradução) dos genes numa célula hospedeira bacteriana, tal como E. coli, com eles transformada.

Um promotor é um elemento de controlo da expressão formado por uma sequência de ADN que permite a ligação de ARN-polimerase e a ocorrência da transcrição. As sequências promotoras compatíveis com hospedeiros bacterianos exemplificativos são tipicamente proporcionadas em vectores plasmídicos contendo locais de restrição convenientes para inserção de um segmento de ADN da presente invenção. 0 polinucleótido numa célula hospedeira adequada pode ser expresso para produzir o anticorpo ou o composto da invenção. Assim, o polinucleótido pode ser utilizado de acordo com técnicas conhecidas, apropriadamente modificadas tendo em vista os ensinamentos aqui contidos, para construir um vector de expressão, que é então utilizado para transformar uma célula hospedeira apropriada para a expressão e produção do anticorpo ou do composto da invenção. Estas técnicas incluem as divulgadas nas Patentes US 4440859 concedida em 3 de Abril 30

ΕΡ 1 565 491/PT de 1984 a Rutter et al.r 4530901 concedida em 23 de Julho de 1985 a Weissman, 4582800 concedida em 15 de Abril de 1986 a Crowl, 4677063 concedida em 30 de Junho de 1987 a Mark et al., 4678751 concedida em 7 de Julho de 1987 a Goeddel, 4704362 concedida em 3 de Novembro de 1987 a Itakura et al., 4710463 concedida em 1 de Dezembro de 1987 a Murray, 4757006 concedida em 12 de Julho de 1988 a Toole, Jr. et al., 4766075 concedida em 23 de Agosto de 1988 a Goeddel et al. e 4810648 concedida em 7 de Março de 1989 a Stalker. O polinucleótido pode ser unido a uma ampla variedade de outras sequências de ADN para introdução num hospedeiro apropriado. O ADN acompanhante dependerá da natureza do hospedeiro, do modo de introdução do ADN no hospedeiro, e do facto de se pretender manutenção epissómica ou integração.

Geralmente, o polinucleótido é inserido num vector de expressão, tal como um plasmídeo, na orientação correcta e no quadro de leitura correcto para a expressão. Se necessário, o ADN pode ser ligado a sequências nucleotídicas de controlo reguladoras da transcrição e da tradução adequadas reconhecidas pelo hospedeiro pretendido, embora estes controlos estejam geralmente disponíveis no vector de expressão. Assim, a inserção de ADN pode estar operativamente ligada a um promotor apropriado. Os promotores bacterianos incluem os promotores lacl e lacZ de E. coli, os promotores de T3 e T7, o promotor gpt, os promotores PR e PL do fago λ, o promotor phoA e o promotor trp. Os promotores eucariotas incluem o promotor precoce imediato de CMV, o promotor da timidina-quinase de HSV, os promotores precoce e tardio de SV40 e os promotores de LTR retrovirais. Outros promotores adequados serão conhecidos dos peritos. As construções de expressão conterão desejavelmente também locais para iniciação e terminação da transcrição, e na região transcrita, um local de ligação ao ribossoma para tradução. (Hastings et al., Pedido Internacional de Patente WO 98/16643). O vector é então introduzido no hospedeiro através de técnicas padrão. Geralmente, nem todos os hospedeiros serão transformados pelo vector e será portanto necessário seleccionar as células hospedeiras transformadas. Uma técnica de selecção envolve a incorporação no vector de expressão de 31

ΕΡ 1 565 491/PT uma sequência de ADN marcadora, com quaisquer elementos de controlo necessários, que codifica um traço seleccionável na célula transformada. Estes marcadores incluem os genes de di-hidrofolato-redutase, resistência a G418 ou a neomicina para cultura de células eucariotas, e de resistência a tetraciclina, canamicina ou ampicilina para cultura em E. coli e outras bactérias.

Alternativamente, o gene para este traço seleccionável pode estar num outro vector, que é utilizado para co-transformar a célula hospedeira desejada.

As células hospedeiras que foram transformadas pelo ADN recombinante da invenção são então cultivadas durante um tempo suficiente e sob condições apropriadas conhecidas dos peritos na especialidade tendo em vista os ensinamentos aqui divulgados para permitir a expressão do polipéptido, que pode então ser recuperado. 0 anticorpo ou composto podem ser recuperados e purificados a partir de culturas de células recombinantes por métodos bem conhecidos incluindo precipitação em sulfato de amónio ou etanol, extracção ácida, cromatografia de permuta aniónica ou catiónica, cromatografia em fosfocelulose, cromatografia de interacção hidrófoba, cromatografia de afinidade, cromatografia em hidroxilapatite e cromatografia em lectina. Mais preferivelmente, emprega-se cromatografia liquida de alta resolução ("HPLC") para a purificação.

Um décimo quinto aspecto da invenção proporciona uma linha de células hospedeiras estável que produz um anticorpo como definido no quinto, no sexto ou no oitavo aspectos da invenção, ou um composto como definido no décimo aspecto da invenção em que o anticorpo e a porção citotóxica são polipéptidos que estão fundidos, resultante da incorporação na linha celular de um polinucleótido exógeno como definido no sétimo, no nono e no décimo primeiro aspectos da invenção, ou um vector como definido no décimo terceiro aspecto da invenção.

Um décimo sexto aspecto da invenção proporciona uma um composição ou formulação farmacêuticas compreendendo 32 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ anticorpo como definido no quinto, no sexto ou no oitavo aspectos da invenção, ou um polinucleótido como definido no sétimo, no nono e no décimo primeiro aspectos da invenção, ou um composto como definido no décimo ou no décimo segundo aspectos da invenção, e um transportador farmaceuticamente aceitável.

Em "farmaceuticamente aceitável" está incluído que a formulação é estéril e isenta de pirogénios. Os transportadores farmacêuticos adequados são bem conhecidos na arte da farmácia. 0 ou os transportadores têm que ser "aceitáveis" no sentido de serem compatíveis com o composto da invenção e não prejudiciais para os seus recebedores. Tipicamente, os transportadores serão água ou solução salina que serão estéreis e isentas de pirogénios; contudo, podem ser utilizados outros transportadores aceitáveis.

Numa concretização, as composições ou formulações farmacêuticas da invenção são para administração parentérica, mais particularmente para administração intravenosa.

Numa concretização preferida, a composição farmacêutica é adequada para administração intravenosa a um paciente, por exemplo por injecção.

As formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções estéreis aquosas e não aquosas para injecção que podem conter antioxidantes, tampões, bacterióstatos e solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do recebedor pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes.

Numa concretização preferida alternativa, a composição farmacêutica é adequada para administração tópica a um paciente.

Preferivelmente, a formulação está numa dosagem unitária contendo uma dose ou unidade diária, uma subdose diária ou uma sua fracção apropriada, do ingrediente activo. 33

ΕΡ 1 565 491/PT Ο anticorpo, ο polinucleótido ou o composto da invenção serão normalmente administrados oralmente ou por qualquer via parentérica, na forma de uma formulação farmacêutica compreendendo o ingrediente activo, opcionalmente na forma de um sal de adição de ácido ou de base, não tóxico, orgânico ou inorgânico, numa forma de dosagem farmaceuticamente aceitável. Dependendo da desordem e do paciente a tratar, assim como da via de administração, as composições podem ser administradas em várias doses.

Em terapia humana, o anticorpo, o polinucleótido ou o composto da invenção podem ser administrados sozinhos mas serão geralmente administrados em mistura com um excipiente, diluente ou transportador farmacêuticos adequados seleccionados tendo em conta a via de administração pretendida e a prática farmacêutica padrão.

Por exemplo, o anticorpo, o polinucleótido ou o composto da invenção podem ser administrados por via oral, bucal ou sublingual na forma de comprimidos, cápsulas, óvulos, elixires, soluções ou suspensões, que podem conter agentes aromatizantes ou corantes, para aplicações de libertação imediata, retardada ou controlada. 0 anticorpo, o polinucleótido ou o composto da invenção podem também ser administrados por via de injecção intracavernosa.

Estes comprimidos podem conter excipientes tais como celulose microcristalina, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico e glicina, desintegrantes tais como amido (preferivelmente amido de milho, batata ou tapioca), amido-glicolato de sódio, croscarmelose de sódio e certos silicatos complexos, e aglutinantes de granulação tais como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), hidroxipropilcelulose (HPC), sacarose, gelatina e goma-arábica. Adicionalmente, podem ser incluídos agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio, ácido esteárico, beenato de glicerilo e talco.

Composições sólidas de um tipo semelhantes podem também ser empregues como enchimentos em cápsulas de gelatina. Os excipientes preferidos a este respeito incluem lactose, amido, 34 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ uma celulose, açúcar lácteo ou polietilenoglicóis de elevado peso molecular. Para suspensões aquosas e/ou elixires, os compostos da invenção podem ser combinados com vários agentes edulcorantes ou aromatizantes, matéria corante ou pigmentos, com agentes emulsionantes e/ou de suspensão e com diluentes tais como água, etanol, propileneoglicol e glicerina, e suas combinações. 0 anticorpo, o polinucleótido ou o composto da invenção podem também ser administrados parentericamente, por exemplo, por via intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intraesternal, intracraniana, intramuscular ou subcutânea, ou podem ser administrados por técnicas de infusão. São mais bem utilizados na forma de uma solução aquosa estéril que pode conter outras substâncias, por exemplo, sais ou glucose suficientes para tornar a solução isotónica com o sangue. As soluções aquosas deverão ser adequadamente tamponadas (preferivelmente a um pH de 3 a 9), se necessário. A preparação de formulações parentéricas adequadas sob condições estéreis é prontamente realizada por técnicas farmacêuticas padrão bem conhecidas dos peritos na especialidade.

As formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções estéreis aquosas e não aquosas para injecção que podem conter antioxidantes, tampões, bacterióstatos e solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do recebedor pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou multidoses, por exemplo ampolas e frascos selados, e podem ser armazenadas numa condição criodessecada (liofilizada) que requeira apenas a adição do transportador líquido estéril, por exemplo água para injecções, imediatamente antes da utilização. Soluções e suspensões extemporâneas para injecção podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis do tipo previamente descrito.

Para administração oral e parentérica a pacientes humanos, o nível de dosagem diária do anticorpo, do polinucleótido ou do composto da invenção serão usualmente de 35

ΕΡ 1 565 491/PT 1 a 1000 mg por adulto (i.e. de cerca de 0,015 a 15 mg/kg) , administrados em doses únicas ou divididas.

Assim, por exemplo, os comprimidos ou as cápsulas do anticorpo, do polinucleótido ou do composto da invenção podem conter de 1 mg a 1000 mg de agente activo para administração individualmente ou duas ou mais de cada vez, conforme apropriado. O médico em qualquer caso determinará a dosagem efectiva que será mais adequada para um paciente individual e variará com a idade, peso e resposta do paciente particular. As dosagens anteriores são exemplificativas do caso médio. Podem, evidentemente, haver casos individuais em que são necessárias gamas de dosagem superiores ou inferiores e estas estão no âmbito da presente invenção. O anticorpo, o polinucleótido ou o composto da invenção podem também ser administrados por via intranasal ou por inalação e são convenientemente entregues na forma de uma apresentação de inalador de pó seco ou pulverizador aerossol a partir de um recipiente pressurizado, uma bomba, um pulverizador ou nebulizador com utilização de um propulsor adequado, e.g. diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetane, um hidrofluoroalcano tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134A, ou 1,1,1,2,3,3,3- heptafluoropropano (HFA 227EAC), dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para entregar uma quantidade medida. O recipiente pressurizado, a bomba, o pulverizador ou o nebulizador podem conter uma solução ou suspensão do composto activo, e.g. utilizando uma mistura de etanol e o propulsor como solvente, que pode adicionalmente conter um lubrificante, e.g. trioleato de sorbitano. As cápsulas e cartuchos (feitos, por exemplo, de gelatina) para utilização num inalador ou insuflador, podem ser formulados de modo a conter uma mistura em pó de um composto da invenção e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido.

As formulações de pó seco ou aerossol são preferivelmente dispostas de modo a que cada dose medida ou "puff" contenha pelo menos 1 mg de um anticorpo, um polinucleótido ou um composto da invenção para entrega ao paciente. Notar-se-á que 36

ΕΡ 1 565 491/PT a dose diária total com um aerossol variará de paciente para paciente, e pode ser administrada numa dose única ou, mais usualmente, em doses divididas ao longo de todo o dia.

Alternativamente, o anticorpo, o polinucleótido ou o composto da invenção podem ser administrados na forma de um supositório ou pessário, ou podem ser aplicados topicamente na forma de uma loção, solução, creme, unguento ou pó. Os compostos da invenção podem também ser administrados transdermicamente, por exemplo, utilizando um emplastro cutâneo. Podem também ser administrados pela via ocular, particularmente para o tratamento de doenças dos olhos.

Para utilização oftálmica, o anticorpo, o polinucleótido ou o composto da invenção podem ser formulados na forma de suspensões micronizadas em solução salina estéril isotónica, com pH ajustado, ou, preferivelmente, na forma de soluções em solução salina estéril isotónica, com pH ajustado, opcionalmente em combinação com um conservante tal como um cloreto de benzilalcónio. Alternativamente, podem ser formulados num unguento tal como vaselina.

Para aplicação tópica na pele, o anticorpo, o polinucleótido ou o composto da invenção podem ser formulados na forma de um unguento adequado contendo o composto activo suspenso ou dissolvido, por exemplo, uma mistura com um ou mais dos seguintes: óleo mineral, vaselina liquida, vaselina branca, propilenoglicol, composto polioxietileno polioxipropileno, cera emulsionante e água. Alternativamente, podem ser formulados na forma de uma loção ou creme adequados, suspensos ou dissolvidos em, por exemplo, uma mistura de um ou mais dos seguintes: óleo mineral, monoestearato de sorbitano, um polietilenoglicol, parafina liquida, polissorbato 60, cera de cetilésteres, álcool cetearilico, 2-octildodecanol, álcool benzilico e água.

As formulações adequadas para administração tópica na boca incluem rebuçados compreendendo o ingrediente activo numa base aromatizada, usualmente sacarose e goma-arábica ou goma adragante; pastilhas compreendendo o ingrediente activo numa base inerte tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e goma- 37 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ arábica; e colutórios compreendendo o ingrediente activo num transportador líquido adequado.

Um décimo sétimo aspecto da invenção proporciona um anticorpo como definido no quinto, no sexto ou no oitavo aspectos da invenção, ou um polinucleótido como definido no sétimo, no nono e no décimo primeiro aspectos da invenção, ou um composto como definido no décimo ou no décimo segundo aspectos da invenção, para utilização em medicina.

Um décimo oitavo aspecto da invenção proporciona a utilização de um anticorpo como definido no quinto, no sexto, ou no oitavo aspectos da invenção, ou um polinucleótido como definido no sétimo, no nono e no décimo primeiro aspectos da invenção, ou um composto como definido no décimo ou no décimo segundo aspectos da invenção, na preparação de um medicamento para inibição da angiogénese.

As condições que envolvem angiogénese não desejada ou indesejável estão descritas acima.

Numa concretização, polipéptidos, tais como anticorpos, podem ser entregues utilizando um sistema de entrega de fármacos injectável de libertação sustentada. Estes são desenhados especificamente para reduzir a frequência das injecções. Um exemplo destes sistemas é o Nutropin Depot que encapsula hormona de crescimento humana recombinante (rhGH) em microesferas biodegradáveis que, uma vez injectadas, libertam lentamente a rhGH ao longo de um período sustentado. 0 polipéptido pode ser administrado através de um dispositivo implantado cirurgicamente que liberta o fármaco directamente no local pretendido. Por exemplo, o Vitrasert liberta ganciclovir directamente no olho para tratar retinite de CMV. A aplicação directa deste agente tóxico no local da doença consegue uma terapia eficaz sem efeitos secundários sistémicos significativos do fármaco.

Sistemas de terapia por electroporação (EPT) podem também ser empregues para a administração de polipéptidos. Um dispositivo que entrega um campo eléctrico pulsado às células aumenta a permeabilidade das membranas celulares ao fármaco, 38 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ resultando uma melhoria significativa de entrega intracelular do fármaco.

Os polipéptidos podem também ser entregues por electroincorporação (EI) . A EI ocorre quando pequenas partículas de até 30 mícrones de diâmetro na superfície da pele experimentam pulsos eléctricos idênticos ou similares aos utilizados na electroporação. Na EI, estas partículas são conduzidas através do estrato córneo e para camadas mais profundas da pele. As partículas podem ser carregadas ou revestidas com fármacos ou genes ou podem simplesmente actuar como "balas" que geram poros na pele através dos quais os fármacos podem entrar.

Um método alternativo de entrega de polipéptidos é o sistema injectável ReGel que é termossensível. Abaixo da temperatura corporal, o ReGel é um líquido injectável enquanto à temperatura corporal forma imediatamente um reservatório de gel que erode e se dissolve lentamente em polímeros biodegradáveis seguros conhecidos. O fármaco activo é entregue ao longo do tempo à medida que os biopolímeros se dissolvem.

Os polipéptidos farmacêuticos podem também ser entregues oralmente. O processo emprega um processo natural para assimilação oral de vitamina Bi2 no corpo para co-entregar proteínas e péptidos. Ao serem transportados pelo sistema de assimilação de vitamina Bi2, a proteína ou o péptido podem mover-se através da parede intestinal. São sintetizados complexos entre análogos de vitamina B12 e o fármaco que retêm tanto uma afinidade significativa para com o factor intrínseco (IF) na porção vitamina Bi2 do complexo como uma bioactividade significativa da porção de fármaco do complexo.

Os polinucleótidos podem ser administrados através de qualquer método eficaz, por exemplo, parentericamente (e.g. por via intravenosa, subcutânea, intramuscular) ou por um meio oral, nasal ou outros meios que permitam que os oligonucleótidos acedam a, e circulem na corrente sanguínea do paciente. Os polinucleótidos administrados sistemicamente são dados preferivelmente em adição a polinucleótidos administrados localmente, mas também têm utilidade na ausência de administração local. Uma dosagem na gama de cerca de 0,1 a 39

ΕΡ 1 565 491/PT cerca de 10 gramas por administração a um ser humano adulto será geralmente eficaz para este propósito. O polinucleótido pode ser administrado na forma de uma construção genética adequada como descrito adiante e ser entregue ao paciente onde é expresso. Tipicamente, o polinucleótido na construção genética está operativamente ligado a um promotor que possa expressar o anticorpo ou o composto na célula.

Embora as construções genéticas para entrega de polinucleótidos possam ser ADN ou ARN, prefere-se que sejam ADN.

Preferivelmente, a construção genética é adaptada para entrega a uma célula humana.

Meios e métodos de introdução de uma construção genética numa célula no corpo de um animal são conhecidos na especialidade. Por exemplo, as construções da invenção podem ser introduzidas em células através de qualquer método conveniente, por exemplo métodos envolvendo retrovirus, de modo a que a construção seja inserida no genoma da célula. Por exemplo, em Kuriyama et al. (1991) Cell Struc. and Func. 16, 503-510, são administrados retrovirus purificados. As construções de ADN retroviral compreendendo um polinucleótido como descrito acima podem ser preparadas utilizando métodos bem conhecidos na especialidade. Para produzir retrovirus activos a partir desta construção é usual utilizar uma linha celular de empacotamento ecotrópica psi2 crescida em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal de vitelo (FCS). A transfecção da linha celular é convenientemente por co-precipitação com fosfato de cálcio, e os transformantes estáveis são seleccionados por adição de G418 numa concentração final de 1 mg/ml (assumindo que a construção retroviral contém um gene neoR) . São isoladas e expandidas colónias independentes e o sobrenadante da cultura é removido, filtrado através de um filtro de poros de 0,45 pm e armazenado a -70°C. Para a introdução do retrovirus nas células tumorais, é conveniente injectar directamente o sobrenadante retroviral ao qual foi adicionado Polybrene a 10 pg/ml. Para tumores superiores a 10 mm de diâmetro é 40

ΕΡ 1 565 491/PT apropriado injectar entre 0,1 ml e 1 ml de sobrenadante retroviral; preferivelmente 0,5 ml.

Alternativamente, como descrito em Culver et al. (1992) Science 256, 1550-1552, são injectadas células que produzem retrovírus. As células produtoras de retrovírus assim introduzidas são manipuladas para produzir activamente partículas de vector retroviral de modo que ocorrem produções contínuas do vector no interior da massa tumoral in situ. Assim, células epidérmicas em proliferação podem ser transduzidas com sucesso in vivo se misturadas com células produtoras de vector retroviral.

Retrovírus direccionados estão também disponíveis para utilização na invenção; por exemplo, sequências que conferem afinidades de ligação específicas podem ser manipuladas em genes env virais preexistentes (veja-se Miller & Vile (1995) Faseb J. 9_, 190-199 para uma revisão deste e outros vectores direccionados para terapia génica).

Outros métodos envolvem a entrega simples da construção na célula para expressão na mesma, quer durante um tempo limitado quer, após integração no genoma, durante um tempo mais longo. Em exemplo desta última abordagem inclui lipossomas (Nássander et al. (1992) Câncer Res. 52, 646-653).

Para a preparação de imunolipossomas sintetiza-se MPB-PE (N-[4-(p-maleimidofenil)butiril]fosfatidiletanolamina) de acordo com o método de Martin & Papahadjopoulos (1982) J. Biol. Chem. 257, 286-288. A MPB-PE é incorporada nas bicamadas lipossómicas para permitir um acoplamento covalente do anticorpo, ou de um seu fragmento, na superfície lipossómica. 0 lipossoma é convenientemente carregado com o ADN ou outra construção genética da invenção para entrega nas células alvo, por exemplo, por formação dos referidos lipossomas numa solução do ADN ou outra construção genética, seguida de extrusão sequencial através de filtros de membrana de policarbonato com dimensão de poro de 0,6 pm e 0,2 pm sob pressões de azoto até 0,8 MPa. Após extrusão, a construção de ADN aprisionada é separada da construção de ADN livre por ultracentrifugação a 80 000 x g durante 45 min. Os lipossomas de MPB-PE recentemente preparados em tampão desoxigenado são 41 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ misturados com anticorpo recentemente preparado (ou um seu fragmento) e são realizadas as reacções de acoplamento numa atmosfera de azoto a 4°C sob rotação longitudinal constante durante a noite. Os imunolipossomas são separados dos anticorpos não conjugados por ultracentrifugação a 80 000 x g durante 45 min. Os imunolipossomas podem ser injectados intraperitonealmente ou directamente num tumor.

Outros métodos de entrega incluem adenovirus portadores de ADN externo por via de uma ponte anticorpo-polilisina (veja-se Curiel, Prog. Med. Virol. 40, 1-18) e conjugados transferrina-policatião como transportadores (Wagner et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 3410-3414). No primeiro destes métodos forma-se um complexo policatião-anticorpo com a construção de ADN ou outra construção genética da invenção, em que o anticorpo é especifico para adenovirus de tipo selvagem ou para um adenovirus variante em que foi introduzido um novo epitopo que se liga ao anticorpo. A porção policatião liga-se ao ADN por meio de interaeções electrostáticas com o esqueleto de fosfato. O adenovirus, porque contém as proteínas de fibra e pentão inalteradas, é internalizado na célula e consigo transporta para a célula a construção de ADN da invenção. Prefere-se que o policatião seja polilisina. 0 polinucleótido pode também ser entregue por adenovirus em que está presente no interior da partícula de adenovirus, por exemplo, como descrito adiante.

Num método alternativo, emprega-se um sistema de entrega de ácido nucleico de alta eficiência que utiliza endocitose mediada por receptores para transportar macromoléculas de ADN para as células. Isto é realizado por conjugação da proteína de transporte de ferro, transferrina, com policatiões que se ligam a ácidos nucleicos. A transferrina humana, ou o homólogo de galinha, conalbumina, ou suas combinações, são covalentemente ligados à pequena proteína de ligação a ADN protamina ou a polilisinas de várias dimensões através de uma ligação de dissulfureto. Estas moléculas de transferrina modificadas mantêm a sua capacidade de se ligarem ao seu receptor cognato e de mediar um transporte de ferro eficiente para a célula. As moléculas de transferrina-policatão formam complexos electroforeticamente estáveis com construções de ADN 42

ΕΡ 1 565 491/PT ou outras construções genéticas da invenção independentemente da dimensão do ácido nucleico (desde oligonucleótidos curtos até ADN de 21 quilo-pares de bases). Quando são fornecidos complexos de transferrina-policatião e as construções de ADN ou outras construções genéticas da invenção às células tumorais, é esperado um elevado nível de expressão da construção nas células. A entrega mediada por receptores de alta eficiência das construções de ADN ou outras construções genéticas da invenção utilizando a actividade de ruptura de endossomas de partículas de adenovírus defectivo ou quimicamente inactivado produzidas pelos métodos de Cotten et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 6094-6098 pode também ser utilizada. Esta abordagem parece assentar no facto de os adenovírus estarem adaptados a permitir a libertação do seu ADN a partir de um endossoma sem passagem através do lisossoma, e na presença de, por exemplo transferrina ligada à construção de ADN ou outra construção genética da invenção, a construção é assimilada pela célula pela mesma via que a partícula de adenovírus.

Esta abordagem tem as vantagens de que não há necessidade de utilizar construções retrovirais complexas; não há modificação permanente do genoma como ocorre com a infecção retroviral; e o sistema de expressão direccionado está acoplado a um sistema de entrega direccionado, desse modo reduzindo a toxicidade para outros tipos de células.

Notar-se-á que "ADN nu" e ADN complexado com lípidos catiónicos e neutros podem também ser úteis na introdução do ADN da invenção em células do indivíduo a tratar. Abordagens não virais de terapia génica estão descritas em Ledley (1995) Human Gene Therapy 6_, 1129-1144. São também conhecidos sistemas de entrega direccionada alternativos tais como o sistema de adenovírus modificado descrito em WO 94/10323 em que, tipicamente, o ADN é transportado no interior do adenovírus, ou de partículas semelhantes a adenovírus. Michael et al. (1995) Gene Therapy 2, 660-668 descrevem a modificação de adenovírus para adicionar uma porção selectiva da célula numa proteína de fibra. Os adenovírus mutantes que replicam selectivamente em 43

ΕΡ 1 565 491/PT células tumorais humanas deficientes em p53, tais como os descritos em Bischoff et al. (1996) Science 2 74, 373-376 são também úteis para a entrega da construção genética da invenção a uma célula. Assim, notar-se-á que um outro aspecto da invenção proporciona um vírus ou uma partícula semelhante a vírus compreendendo uma construção genética da invenção. Outros vírus, vectores virais ou partículas semelhantes a vírus adequados incluem lentivírus e vectores lentivirais, HSV, vírus adeno-assistidos (AAV) e vectores à base de AAV, vírus vaccinia e parvovírus.

As construções genéticas da invenção podem ser preparadas utilizando métodos bem conhecidos na especialidade.

Um décimo nono aspecto da invenção proporciona um método de inibição da angiogénese in vitro compreendendo a administração de um anticorpo como definido no quinto, no sexto ou no oitavo aspectos da invenção, ou um polinucleótido como definido no sétimo, no nono e no décimo primeiro aspectos da invenção, ou um composto como definido no décimo ou no décimo segundo aspectos da invenção, a tecido ou células in vitro.

Um vigésimo aspecto da invenção proporciona um método de produção de um anticorpo como definido no quinto, no sexto ou no oitavo aspectos da invenção, ou um composto como definido no décimo aspecto da invenção em que o anticorpo e a porção citotóxica são polipéptidos que estão fundidos, o método compreendendo a expressão de um polinucleótido como definido no sétimo, no nono e no décimo primeiro aspectos da invenção, ou a cultura de uma linha de células hospedeiras estável como definido no décimo sétimo aspecto da invenção.

Mostrámos também que o fragmento extracelular de MR (resíduos 1-467, Figura 2B, SEQ ID N0:3, também conhecido como o ectodomínio de MR) inibe a migração de células endoteliais, incluindo a migração induzida por bFGF e VEGF. É interessante que o ectodomínio de MR não parece afectar a ligação de células endoteliais (dados não mostrados). Será de prever que o ectodomínio de MR, e seus fragmentos que apresentam actividade inibidora no ensaio de migração de HUVEC, sejam terapeuticamente úteis em condições em que a migração não 44

ΕΡ 1 565 491/PT desejada, indesejável ou inapropriada de células endoteliais contribui para a patologia.

Mostrámos também que o ectodominio de MR inibe a proliferação de células endoteliais. Será de prever que o ectodominio de MR, e seus fragmentos que apresentam actividade anti-proliferativa num ensaio tal como descrito no Exemplo 5, sejam terapeuticamente úteis em condições em que a proliferação não desejada, indesejável ou inapropriada de células endoteliais contribui para a patologia.

Um vigésimo primeiro aspecto da invenção proporciona a utilização do ectodominio de MR, ou um seu fragmento que inibe a migração e/ou a proliferação de células endoteliais, na preparação de um medicamento para o combate a qualquer doença ou condição que envolva migração e/ou proliferação não desejadas, indesejáveis ou inapropriadas de células endoteliais.

Note-se que, numa concretização, "um fragmento do ectodominio de MR que inibe a migração e/ou a proliferação de células endoteliais" pode inibir a migração de células endoteliais e não a proliferação de células endoteliais, ou pode inibir a proliferação de células endoteliais e não a migração de células endoteliais. Numa concretização alternativa, "um fragmento do ectodominio de MR que inibe a migração e/ou a proliferação de células endoteliais" pode inibir tanto a migração de células endoteliais como a proliferação de células endoteliais. Nesta concretização, o fragmento do ectodominio de MR não inibe necessariamente a migração e/ou a proliferação de células endoteliais na mesma extensão.

Em "inibição da migração e/ou a proliferação de células endoteliais" incluímos o significado de redução da taxa ou nível de migração e/ou proliferação de células endoteliais. A redução pode ser uma redução de baixo nível de cerca de 10%, ou cerca de 20%, ou cerca de 30%, ou cerca de 40% da taxa ou nível de migração e/ou proliferação de células endoteliais. Preferivelmente, a redução é uma redução de nível médio de cerca de 50%, ou cerca de 60%, ou cerca de 70%, ou cerca de 80% de redução da taxa ou nível de migração e/ou proliferação 45

ΕΡ 1 565 491/PT de células endoteliais. Mais preferivelmente, a redução é uma redução de alto nível de cerca de 90%, ou cerca de 95%, ou cerca de 99%, ou cerca de 99,9%, ou cerca de 99,99% da taxa ou nível de migração e/ou proliferação de células endoteliais. O mais preferivelmente, a inibição pode também incluir a eliminação de migração e/ou proliferação de células endoteliais, ou a sua redução para um nível não detectável.

Os métodos e ensaios para determinação da taxa ou nível de migração de células endoteliais, e portanto para determinar se, e em que extensão, qualquer fragmento particular do ectodomínio de MR inibe a migração de células endoteliais, são conhecidos na especialidade e incluem o ensaio de HUVEC descrito no Exemplo 4. Similarmente, os métodos e ensaios para determinação da taxa ou nível de proliferação de células endoteliais, e portanto para determinar se, e em que extensão, qualquer fragmento particular do ectodomínio de MR inibe a proliferação de células endoteliais, são conhecidos na especialidade e incluem o ensaio de HUVEC descrito no Exemplo 5.

Em "um fragmento do ectodomínio de MR que inibe a migração e/ou a proliferação de células endoteliais" incluímos o ectodomínio de MR que foi truncado ou tem deleções, ou um polipéptido compreendendo pelo menos 450 resíduos de aminoácido contíguos do ectodomínio de MR, que seja suficiente para inibir a migração e/ou a proliferação de células endoteliais. Mais preferivelmente, um fragmento do ectodomínio que é suficiente para inibir a migração e/ou a proliferação de células endoteliais compreende pelo menos 400, ou pelo menos 350, ou pelo menos 300, ou pelo menos 250, ou pelo menos 200, ou pelo menos 150, ou pelo menos 100, ou pelo menos 90, ou pelo menos 80, ou pelo menos 70, ou pelo menos 60, ou pelo menos 50, ou pelo menos 40, ou pelo menos 30, ou pelo menos 20, ou pelo menos 15, ou pelo menos 10 resíduos de aminoácido contíguos do ectodomínio de MR. Prefere-se mais particularmente que o fragmento do ectodomínio que é suficiente para inibir a migração e/ou a proliferação de células endoteliais compreenda pelo menos 60 resíduos de aminoácido contíguos do ectodomínio de MR. A inibição da migração e/ou da proliferação de células endoteliais pode ser 46

ΕΡ 1 565 491/PT testada, por exemplo, utilizando os ensaios de HUVEC como descrito nos Exemplos 4 e 5.

Numa concretização, o fragmento do ectodomínio que é suficiente para inibir a migração e/ou a proliferação de células endoteliais consiste em, ou compreende, a região Ig de MR (resíduos 46-209, SEQ ID NO:4).

Noutra concretização, o fragmento do ectodomínio que é suficiente para inibir a migração e/ou a proliferação de células endoteliais consiste em, ou compreende, o domínio IgA de MR (resíduos 46-116, SEQ ID NO: 5) ou o domínio IgB de MR (resíduos 151-209, SEQ ID NO:6).

Mostrámos que o ectodomínio de MR não parece inibir a ligação de células endoteliais (dados não mostrados) e, preferivelmente, o fragmento do ectodomínio que é suficiente para inibir a migração e/ou a proliferação de células endoteliais não inibe a ligação de células endoteliais.

Assim, o ectodomínio de MR, ou um seu fragmento que inibe a migração de células endoteliais, pode ser utilizado para inibir a migração e/ou a proliferação de células endoteliais sem inibir a ligação de células endoteliais.

Um vigésimo quinto aspecto da invenção proporciona o ectodomínio de MR, ou um seu fragmento que inibe a migração e/ou a proliferação de células endoteliais, para utilização em medicina.

Mostrou-se que a massa de tecido adiposo pode ser regulada pela sua vasculatura (Rupnick, M.A. et al. (2002) PNAS USA 9_9 (16): 10 730-10735). Adicionalmente, sabe-se também que a leptina, um conhecido regulador do apetite e do metabolismo, modula tanto a migração de células endoteliais (Goetze, S. et al. (2002) Hypertension _40_(5): 748-754) como a angiogénese (Sierra-Honigmann, M.R. et al. (1998) Science 281: 1683). Portanto a inibição da migração de células endoteliais pode reduzir a massa de tecido adiposo e ser útil no tratamento da obesidade. 47 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ

Doenças ou condições que envolvem migração e/ou proliferação não desejadas, indesejáveis ou inapropriadas de células endoteliais incluem tumores/cancro, psoriase, aterosclerose, menorragia, endometriose, artrite (tanto inflamatória como reumatóide), degenerescência macular, doença de Paget, retinopatia e suas complicações vasculares (incluindo proliferativas e de prematuridade, e retinopatia diabética), proliferações vasculares benignas, fibroses, obesidade e inflamação. A invenção também inclui a utilização do ectodominio de MR, ou de um seu fragmento que inibe a migração e/ou a proliferação de células endoteliais, na preparação de um medicamento para o combate a uma doença ou condição seleccionadas entre tumores/cancro, psoriase, aterosclerose, menorragia, endometriose, artrite (tanto inflamatória como reumatóide), degenerescência macular, doença de Paget, retinopatia e suas complicações vasculares (incluindo proliferativas e de prematuridade, e retinopatia diabética), proliferações vasculares benignas, fibroses, obesidade e inflamação num indivíduo.

Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método in vitro de inibição da migração e/ou da proliferação de células endoteliais compreendendo a administração do ectodominio de MR, ou de um seu fragmento que inibe a migração e/ou a proliferação de células endoteliais, a tecido ou células in vitro. As células podem ser linhas celulares estabelecidas, ou células que foram removidas de um indivíduo. 0 tecido ou as células são preferivelmente tecido ou células de mamífero, e o mais preferivelmente são tecido ou células humanos.

Adicionalmente, note-se que a administração de ácido nucleico que codifica o fragmento extracelular de MR ou seus fragmentos activos, pode também ser terapeuticamente útil.

Um aspecto adicional da invenção proporciona a utilização de um polinucleótido que codifica o ectodominio de MR, ou um seu fragmento que inibe a migração e/ou a proliferação de células endoteliais, na preparação de um medicamento para o combate a qualquer doença ou condição que envolva migração 48

ΕΡ 1 565 491/PT e/ou proliferação não desejadas, indesejáveis ou inapropriadas de células endoteliais.

Um outro aspecto da invenção proporciona um método in vitro de inibição da migração e/ou da proliferação de células endoteliais compreendendo a administração de um polinucleótido que codifica o ectodominio de MR, ou um seu fragmento que inibe a migração e/ou a proliferação de células endoteliais, a tecido ou células in vitro. As células podem ser linhas celulares estabelecidas, ou células que foram removidas de um indivíduo. 0 tecido ou as células são preferivelmente tecido ou células de mamífero, e o mais preferivelmente são tecido ou células humanos.

As preferências para formulações farmacêuticas, e por aí adiante, são as mesmas nos aspectos da invenção dirigidos à inibição da migração e/ou proliferação de células endoteliais utilizando o ectodominio de MR ou um seu fragmento, que as preferências descritas acima para os aspectos da invenção dirigidos a anticorpos anti-MR.

Mostrámos também que o ectodominio de MR é suficiente para inibir a formação de brotos de vasos in vitro no ensaio do anel aórtico, e in vivo no ensaio da angiogénese na esponja, e será de prever que é terapeuticamente útil na inibição da angiogénese. Adicionalmente, prevê-se que fragmentos (por exemplo os preparados recombinantemente ou por síntese de péptidos de novo) da região extracelular de MR que apresentam actividade inibidora no ensaio do anel aórtico de rato ou no ensaio de angiogénese na esponja também serão úteis na inibição da angiogénese.

Um outro aspecto adicional da invenção proporciona a utilização do ectodominio de MR, ou de um seu fragmento que inibe a angiogénese, na preparação de um medicamento para inibição da angiogénese.

Um outro aspecto adicional da invenção proporciona um método in vitro de inibição da angiogénese compreendendo a administração do ectodominio de MR, ou de um seu fragmento que inibe a angiogénese, a tecido ou células in vitro. 49 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ

Em "um fragmento do ectodomínio de MR que inibe a angiogénese" incluímos o ectodomínio de MR que tenha sido truncado ou tem deleções, ou um polipéptido compreendendo pelo menos 450 resíduos de aminoácido contíguos do ectodomínio de MR, que é suficiente para inibir a angiogénese. Mais preferivelmente, um fragmento do ectodomínio que é suficiente para inibir a angiogénese compreende pelo menos 400, ou pelo menos 350, ou pelo menos 300, ou pelo menos 250, ou pelo menos 200, ou pelo menos 150, ou pelo menos 100, ou pelo menos 90, ou pelo menos 80, ou pelo menos 70, ou pelo menos 60, ou pelo menos 50, ou pelo menos 40, ou pelo menos 30, ou pelo menos 20, ou pelo menos 15, ou pelo menos 10 resíduos de aminoácido contíguos do ectodomínio de MR. Prefere-se mais particularmente que o fragmento do ectodomínio que é suficiente para inibir a angiogénese compreenda pelo menos 60 resíduos de aminoácido contíguos do ectodomínio de MR. A inibição da angiogénese pode ser testada, por exemplo, utilizando o ensaio do anel aórtico como descrito no Exemplo 2 ou o ensaio de angiogénese na esponja como descrito no Exemplo 3.

Numa concretização, o fragmento do ectodomínio que é suficiente para inibir a angiogénese consiste em, ou compreende, a região Ig de MR (resíduos 46-209, SEQ ID NO:4).

Noutra concretização, o fragmento do ectodomínio que é suficiente para inibir a angiogénese consiste em, ou compreende, o domínio IgA de MR (resíduos 46-116, SEQ ID NO:5) ou o domínio IgB de MR (resíduos 151-209, SEQ ID NO:6).

Adicionalmente, note-se que a administração de ácido nucleico que codifica o fragmento extracelular de MR ou seus fragmentos activos, será também um modo útil de terapia anti-angiogénica.

Um outro aspecto da invenção proporciona a utilização de um polinucleótido que codifica o ectodomínio de MR, ou um seu fragmento que inibe a angiogénese, na preparação de um medicamento para inibição da angiogénese.

Um outro aspecto adicional da invenção proporciona um método in vitro de inibição da angiogénese compreendendo a 50

ΕΡ 1 565 491/PT administração de um polinucleótido que codifica o ectodominio de MR, ou um seu fragmento que inibe a angiogénese, a tecido ou células in vitro.

As preferências para doenças ou condições a combater, são as mesmas nos aspectos da invenção dirigidos ao ectodominio de MR, ou a um seu fragmento que inibe a angiogénese, que as preferências descritas acima para os aspectos da invenção dirigidos a anticorpos anti-MR. A listagem ou discussão de um documento anteriormente publicado no presente fascículo não deverão ser tomadas necessariamente como um reconhecimento de que o documento faz parte do estado da arte ou é do conhecido comum geral. A invenção será agora descrita com mais detalhes por referência aos seguintes Exemplos e Figuras. A Figura IA apresenta a sequência de ADN da inserção utilizada para gerar o plasmídeo NI (SEQ ID N0:1). A Figura 1B apresenta a sequência de aminoácidos codificada pela inserção (SEQ ID NO:2). Esta sequência é a sequência de aminoácidos de comprimento completo de MR. A Figura 2A apresenta a sequência de ADN da inserção utilizada para gerar o plasmídeo NH10 (SEQ ID NO:30). A Figura 2B mostra a sequência de aminoácidos codificada pela inserção utilizada para gerar o plasmídeo NH10. Esta sequência é designada como o ectodominio de MR e é a sequência de aminoácidos do fragmento extracelular completo de MR (resíduos 1-467, SEQ ID N0:3) . A Figura 3 apresenta a sequência de aminoácidos da região Ig de MR (resíduos 46-209, SEQ ID N0:4). A Figura 4A apresenta a sequência de aminoácidos do domínio IgA de MR (resíduos 46-116, SEQ ID NO:5). A Figura 4B apresenta a sequência de aminoácidos do domínio IgB de MR (resíduos 151-209, SEQ ID NO:5). A Figura 5 apresenta uma representação esquemática da estrutura de MR. 51 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ A Figura 6Α é um gráfico e uma tabela gue mostram o efeito do anticorpo (MR-7) e do domínio extracelular solúvel de MR (MR-Ecto) sobre a formação de novos vasos no ensaio do anel aórtico. A Figura 6B é um gráfico e uma tabela que mostram o efeito do domínio extracelular solúvel de MR (ectodomínio de MR, MR-Ecto) sobre a formação de novos vasos no ensaio do anel aórtico com um controlo de IgG humana. A Figura 7 mostra a formação de brotos a partir de aorta de rato na presença de anticorpo ou domínio extracelular solúvel de MR. Cultivaram-se secções de aorta de rato durante 5 dias na presença de apenas meio (A) , ou em meio contendo 100 pg/ml de anticorpo MR-7 (B), ou 15 pg/ml de domínio extracelular solúvel de MR (resíduos 1-467) (C) . São apresentados quatro quadros para cada grupo de tratamento que são representativos de níveis de formação de brotos a partir de aortas em duplicado. A Figura 8 é um gráfico e uma tabela que mostram o efeito do domínio extracelular solúvel de MR (ectodomínio de MR) sobre a formação de novos vasos sanguíneos no ensaio de angiogénese na esponja. A Figura 9A é um gráfico e uma tabela que mostram que a migração induzida pelo factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) de células endoteliais humanas primárias é inibida pelo domínio extracelular de MR. A Figura 9B é um gráfico e uma tabela que mostram que a migração induzida pelo factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) de células endoteliais humanas primárias é inibida pelo domínio extracelular de MR. A Figura 10 é um gráfico e uma tabela que mostram que o ectodomínio de MR (Robo4-Fc) inibe a proliferação de células endoteliais humanas primárias. 52

ΕΡ 1 565 491/PT

Exemplo 1: Preparação de anticorpos eram como

As construções de ADNc que foram utilizadas descrito na Tabela 2:

Tabela 2

Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 ADNc de MR de comprimento completo ectodominio de MR-Fc IgA+B de MR-Fc IgA de MR-Fc "Fc" refere-se à região Fc do vector pIG. Consiste nos domínios constantes de IgG humana de charneira, CHI, CH2, dentro das extremidades do vector (incluindo um local de clonagem múltipla e a região aceitadora de splicing). A sequência nucleotídica do vector é:

AAGCTTGATATCGAATTCTGCAGCCCGGGGGATCCGGAGGGAGGG

TGTCTGCTGGAAGCAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGG

CTATGCAGCCCCAGTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCTC

TTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGG

TCTTCTGGCTTTTTCCCCAGGCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGC

CCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAG

ACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGC

CCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTTC

TCTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCC

AAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGGTAAGC

CAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTA 53

ΕΡ 1 565 491/PT

GAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACG

TCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTCAACTCCTGGGGGGACCGTC

AGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC

CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAA

GACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG

CATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG

TACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA

ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAG

CCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCGTG

GGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCT

GCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCTACAGGGCAGCC

CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGCCATGACCTG

ACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATC

CCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGA

ACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTT

CTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCA

GGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC

CACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGC

GACGGCCGGCAAGCCCCGCTCCCCGGGCTCTCGCGGTCGCACGACC

ATGCTTGGCACGTACCCCCTGTACATACTTCCCGGGCGCCCAGCAT

GGAAATAAAGCACCCAGCGCTGCCCTGGGCCCCTGCGAGACTGTG

ATGGTTCTTTCCACGGGTCACCCCGAGTCTGAGGCCTGAGTGGCAT GAGGGAGGCAGCGGCCGCGACTCTAG (SEQID NO: 31). A geração de vectores plasmídicos NI e NH10 para a geração de anticorpos anti-MR utilizando imunização genética foi realizada como se segue. Os vectores plasmídicos NI e NH10, codificando NI (ligada à membrana) e NH10 (solúvel), foram gerados como se segue: NI foi gerada por remoção do MR de comprimento completo de pBluescript KS+ por uma digestão com NotI. 0 produto foi limpo a partir de um gel e ligado a pcDNA3 (que tinha sido digerido com NotI). NH10 foi gerada por amplificação do domínio extracelular de MR utilizando iniciadores que incorporaram um local 54 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ 5' ΗίηΌΙΙΙ e um local 3' NotI. Este foi ligado a um vector pcDNA3 que tinha sido digerido com as mesmas enzimas. A imunização genética de ratinhos para gerar anticorpos anti-MR foi realizada como se segue:

As construções NI e NH10 foram utilizadas para imunizar ratinhos de três diferentes fundos genéticos de acordo com o método relatado em (Boyle, J.S., A. Silva, et al. ( 1997) "DNA immunization: induction of higher avidity antibody and effect of route on T cell cytotoxicity." Proc Natl Acad Sei USA 9_4 (26): 14626-31). Os ratinhos foram imunizados com uma injecção intramuscular quinzenal de lOOpg de plasmídeo isento de endotoxina. Após a imunização com as construções de ADN, os ratinhos foram injectados, cada um com 200 μΐ de ectodominio de MR purificado, por via intravenosa como reforço final antes da colheita do baço para gerar os hibridomas. Testaram-se três diferentes estirpes genéticas de ratinhos quanto à sua capacidade de gerar uma resposta imunitária adequada à imunização genética, como mostrado na Tabela 3.

Tabela 3

Grupo Imunização com NI Imunização com NH10 Grupo B - ratinhos Balb/c B1-B5 B6-B10 Grupo C - ratinhos C57B1 C1-C5 C6-C10 Grupo M - ratinhos MFI exogâmicos M1-M5 M6-M10 O programa de imunização é apresentado na Tabela 4. 55 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ

Tabela 4

Dia Pré-Sangria -2 l.a Imunização I/M 0 2.“ Imunização I/M 14 3.“ Imunização I/M 28 Sangria de Teste 35 Reforço I/V com células ou proteína: 200 μΐ de proteína ECSM4 purificada I/V em PBSa a 129 pg/ml 59 Sacrifício dos ratinhos e remoção dos baços para fusão. 63

Durante ο decorrer da imunização, as sangrias de teste foram ensaiadas quanto a anticorpos anti-MR utilizando o seguinte ELISA de captura. Este ELISA é um ensaio robusto e flexível que pode ser utilizado para medir o nível de proteína de fusão no sobrenadante ou a presença/nível de anticorpo contra a proteína de fusão no sobrenadante dos hibridomas. É muito sensível, detectando a IgG humana na gama de 0,001 a 0,5pg/ml. Tem um baixo ruído de fundo, tipicamente na região de DO405 = 0,07. Em comparação, os sobrenadantes de hibridomas em bruto neste sistema (MR-pIG) originam resultados positivos de DO405 >1,0 (e em alguns casos >2,0).

Sumário do método ELISA

Revestir a placa com IgG de cabra anti-humana específica para Fc a 5pg/ml; bloquear com BSA a 1% em PBS; adicionar sobrenadante de proteína de fusão ou controlo de IgG humana; adicionar anticorpo de detecção ou conjugado de fosfatase alcalina e anti-humano de cabra; adicionar conjugado secundário se for utilizado anticorpo de detecção não conjugado; adicionar substrato pNPP; parar com NaOH 3M após 20-30 min.

Protocolo detalhado para ELISA de captura para proteínas de fusão de pIG (1) Revestir a placa com anticorpo não conjugado purificado IgG de cabra anti-humana (específica para Fc) de 2 56

ΕΡ 1 565 491/PT a 5pg/ml diluído em PBS, e.g. Sigma 1-2136; 50pl/poço, sacudir suavemente a placa para assegurar uma cobertura homogénea da base dos poços. (2) Incubar durante a noite a +4°C. As placas podem ser armazenadas assim durante pelo menos uma semana, desde que sejam mantidas num recipiente humidificado para prevenir a secagem. (3) Lavar 3x com PBS-Tween 20 (Tween 20 a 0,04%) inundando as placas e sacudindo para secar sobre papel de tecido de cada vez . (4) Bloquear com BSA a 1% em PBS, 200yl/poço. Incubar à temperatura ambiente durante 1-2 horas, ou durante a noite a +4°C. As placas podem ser armazenadas bloqueadas a +4°C, como descrito no ponto (2) anterior. (5) Repetir o passo de lavagem (passo 3). (6) Revestir as placas com sobrenadante da proteína de fusão e.g. MR-ecto-pIG. O sobrenadante contendo 0,5 a l,0pg/ml de proteína de fusão origina um resultado muito forte, portanto não há necessidade de purificar ou concentrar. Incubar 1 hora à temperatura ambiente. Pode utilizar-se IgG humana em vez de sobrenadante como controlo positivo para detectar o domínio Fc e titular-se para quantificar a quantidade de proteína de fusão NABA-pIG presente no sobrenadante. (7) Repetir o passo de lavagem (passo 3) (8) Detectar o domínio pIG utilizando conjugado IgG de cabra anti-humana-fosfatase alcalina, diluição de 1/5000 em PBS (controlo positivo), ou soro de ratinho da sangria de teste, em várias diluições em PBS (1/10 a 1/1000). Incubar 1 hora à temperatura ambiente. Isto é seguido de um passo adicional de um conjugado secundário (anti-ratinho-fosfatase alcalina). Incubar durante mais 1 hora à temperatura ambiente. (9) Repetir o passo de lavagem (passo 3) . (Também entre a utilização do anticorpo de detecção e do conjugado secundário, se for utilizado o método alternativo) 57

ΕΡ 1 565 491/PT (10) Medir a alteração de cor utilizando substrato pNPP da Sigma preparado a partir de comprimidos, 50pl/poço. Incubar durante 20-30 min. no escuro e depois parar a reacção através da adição de 50pl/poço de NaOH 3M. Ler a alteração de cor a 405nm.

Os anticorpos anti-MR foram gerados como se seque: os baços colhidos dos ratinhos imunizados acima mencionados foram fundidos com células NSO. Os hibridomas resultantes foram testados quanto à sua capacidade para gerar anticorpos que reconhecem MR utilizando ELISA. Dos anticorpos identificados, escolheu-se um para estudos adicionais - MR7. O anticorpo MR7 foi caracterizado como se segue: o MR7 foi testado quanto à sua capacidade de reconhecer vários domínios de MR utilizando ELISA. Verificou-se que o MR7 reconhece o domínio IgA de MR. A sequência de ADN que codifica as Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR) de MR7 foi determinada por amplificação por PCR e técnicas padrão de sequenciação utilizando os iniciadores mostrados adiante.

Iniciadores

Utilizou-se uma mistura de onze iniciadores 5' (enumerados na Tabela 5) para amplificar as CDR da cadeia capa.

Tabela 5

Iniciador Sequência MKV1 ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG (SEQ ID NO:32) MKV2 ACTAGTCGACATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGT (SEQ ID NO:33) MKV3 ACTAGTCGACATGAGTGTGGCTCACTCAGGTCCTGGSGTTG (SEQ ID NO:34) MKV4 ACTAGTCGACATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGMWTCT TG (SEQ ID NO:35) MKV5 AC T AGT CGACAT GGAT T TWCAGGT GCAGAT TWT CAGC T T C (SEQ ID NO:36) 58

ΕΡ 1 565 491/PT

Iniciador Sequência MKV6 ACTAGTCGACATGAGGTKCCYTGYTCAGYTYCTGRGG (SEQ ID NO:37) MKV7 ACTAGTCGACATGGGCWTCAAGATGGAGTCACAKWYYCWG G (SEQ ID NO:38) MKV8 ACTAGTCGACATGTGGGGAYCTTKTTYAMMTTTTTCAATTG (SEQ ID NO:39) MKV9 ACTAGTCGACATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG (SEQ ID NO:40) MKV10 ACTAGTCGACATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT (SEQ ID NO:41) MKV11 ACTAGTCGACATGGAAGCCCCATGCTCAGCTTCTCTTCC (SEQ ID NO:42) A sequência do iniciador que amplificou a extremidade 5' da cadeia capa de MR7 foi a MK5 A sequência do iniciador 3' era GTTTGATCTAGAGCTTGGTCCC (SEQ ID NO: 43) que amplifica a partir da CDR3 e adiciona um local de restrição Xba I na extremidade do produto se for necessário clonar o produto. 0 mesmo produto foi também produzido quando se utilizou a mistura 5' com o iniciador 3' da região constante TTGGAGGGCGTTATCCACCT (SEQ ID NO:44).

Iniciadores da cadeia pesada 0 iniciador 5' era: ATCGGATCCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG (SEQ ID NO:45), e o iniciador 3' era: CTCGAATTCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC (SEQ ID NO:46).

Os código de redundância para estes iniciadores estão apresentados na Tabela 6. 59

ΕΡ 1 565 491/PT

Tabela 6; Código de ambiguidades IUB

Nucleótidos Código A+C M amino A+G R purina A+T W fraco C + G S forte C + T Y pirimidina G+T K ceto A+G+C V não T A+C + T H não G A+G+T D não C C + G+T B não A A+G+C+T N qualquer

Sequência de MR7 A sequência de aminoácidos das regiões V leve e pesada do anticorpo MR7 é apresentada adiante. As CDR estão sublinhadas. região V capa de MR7: QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTC S A S S S Y S Y Μ Y WY QQKPRSSPKPWIY LTSNLAS GVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAA T Y Y C OOWSSNPLT FGAGTKLELK (SEQ ID NO: 12). região V pesada de MR7: Q V K/Q LQESGPELVKPGASVKISCKASG YSL T D Y N L N WVKQNKGKSLEWIG Y I N P NYGTTSYNOKFKGKATLTVDQSSSTTY MQLNSLTSEDSAVYYCAR G R D Y F G Y W GQGTTYTVSS (SEQ ID NOs: 16-17), A sequência nucleotídica que codifica as regiões V leve e pesada do anticorpo MR7. As CDR estão sublinhadas. 60

ΕΡ 1 565 491/PT

Região V capa de MR7: CAA3ATT3GTT3CTC,ACC,CAG3TCT,CCA3GCA,CTCATG3TCT3GCA3TCT3

CCA.GGG.GAGAAG.GTCACCATG.ACC.TGCAGT.GCCAGC.TCAA

GT.GTAAGT.TACATG.TAC-TGG.TAC.CAG.CAGAAG.CCAAOA.TCC

.TCC.CCC.AAA.CCC.TGGATT.TAT.CTCACA.TCC.AAC.CTG.GCT.TCT /íga.gtc.cct.gctak^toagt.ggc^gt.gggjct.gggacc.tc T,TAC,TCTJCTC}ACAsATC,AGC3AGC}ATG3GAGJGCTJGAA)GAT,GCTtG CCACT.TAT.TAC.TGC.CAG.CAG.TGGAGTAGT.AAC.CCA.CTCACG. TTQGGT.GC^GGGACCAAG^TGGAG^TGAAA (SEQ ID NO: 21).

Região V pesada de MR7:

CAG,GTC,AAG(orA/CAA),CTG,CAG,GAG,TCA,GGA,CCT,GAG,CTG,GT

GAAG,CCT,GGC,GCT,TCA,GTG,AAGATA3TCC,TGC,AAG,GCT,TCT,G GT.TAC.TCA.CTCACT.GAC.TAC.AAC.CTG.AAC.TGG.GTGAAG.CAG.

AAC.AAA.GGA.AAGAGC.CTT.GAG.TGGATT.GGA.GTAATT.AAT.C

CAAAC.TAT.GGTACTAGT.TACAAT.CAG.AAG.TTC.AAG.GGC.AAG

3GCC3ACA,TTG3ACT3GTA3GAC3CAA3TCT3TCCAGC,ACA3ACC3TAC3AT

G3CAG,CTC3AAC3AGC3CTG3ACA3TCT3GAG3GAC3TCT3GCA3GTC3TAT3T

AC.TGT.GCAAGA.GGGAGG.GAT.TAC.TTC.GGC.TAC.TGG.GGC.CAA ,ggg,accacg,gtc,acc3gtc,tcc,tca (seq id nos: 25-27).

Exemplo 2: O anticorpo MR7 e o ectodomínio de MR (fragmento extracelular dos resíduos 1-467 de MR) inibem a formação de brotos de vasos no ensaio do anel aórtico

Sumário 0 papel de MR na angiogénese foi investigado utilizando o ensaio do anel aórtico de rato. Segmentos de aorta de rato foram embutidos em Matrigel e tratados com anticorpo MR7 ou proteína de ectodomínio de MR purificada. Os vasos em formação foram deixados desenvolver ao longo de cinco dias antes serem pontuados por três observadores independentes. As médias das pontuações de 20-25 experiências separadas estão apresentadas nas Figuras 6A e 6B. A fiabilidade inter-pontuações foi avaliada utilizando o método de Landis e Koch. Os valores de capa ponderados calculados foram de 0,96 para o MR7 e de 0,93 para o ectodomínio de MR. Estes valores de capa mostram que 61 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ houve um elevado grau de consistência entre os pontuadores independentes. Métodos

Colheram-se aortas de ratos de 200g - 300g (6-8 semanas de idade) e colocaram-se imediatamente em meios MCDB 131. Removeu-se o tecido conjuntivo e cortaram-se as aortas em anéis de 1 mm - 1,5 mm. Revestiram-se placas de 48 poços com 110 μΐ de Matrigel (BD Biosciences) diluído de 1:1 com PBS e deixou-se gelificar a 37°C durante 30 min. Colocaram-se os anéis nos poços e selaram-se no lugar com uma sobrecamada de 40 μΐ de Matrigel. Adicionaram-se os anticorpos (100 pg/ml) ou o ectodomínio de MR (domínio extracelular robo4 solúvel) (15 pg/ml) aos poços num volume final de 250 μΐ de meio MCDB 131 contendo 20% de soro fetal bovino e 50 pg/ml de suplemento de crescimento de células endoteliais. Mudaram-se os meios após dois dias e analisaram-se e fotografaram-se as aortas após cinco dias.

Resultados

Estão apresentadas na Figura 7 A-C fotomicrografias representativas de segmentos dos anéis aórticos. Como mostra a figura, o tratamento dos anéis aórticos com MR7 ou com o ectodomínio de MR resultou numa diminuição significativa na formação de brotos de vasos a partir do segmento aórtico.

Análise estatística do ensaio do anel aórtico

Os anéis aórticos foram pontuados de acordo com o crescimento de vasos numa escala de 0 (baixo) a 4 (elevado) como se segue: 0 = ausência de crescimento, 1 = poucos vasos, 2 = vasos intermédios, 3 = muitos vasos mas centros esporádicos de formação de brotos em torno do anel e 4 = muitos crescimentos de vasos a partir de todas as regiões do anel.

Todas as experiências foram pontuadas em ocultação por três investigadores independentes. A fiabilidade inter-pontuador foi avaliada utilizando o método de Landis e Koch (Biometrics, 1977, _33 (1), 159-174). Calculou-se o capa 62

ΕΡ 1 565 491/PT ponderado de modo a estabelecer a fiabilidade inter-pontuador dos examinadores. 0 capa ponderado é dado por: kw —

Po(w) ~ Ρφο 1 - P«w) onde po(w) e pe(w) sao a concordância ponderada observada e esperada, calculado com as fórmulas:

Po(w) ~ ~ ΣΣ^>Λ 1*1 >1 vf.c, μ»)=3-ΣΣ 0 i representa a categoria para um examinador e o j representa a categoria para o segundo examinador. 0 r± representa o grande total de casos na categoria i para um examinador, e cq representa o grande total de casos na categoria j para o outro examinador. A diferença entre as categorias é considerada como 1, e portanto com a introdução das novas categorias para a descrição das categorias de transição adicionais, a diferença de uma categoria para outra foi considerada como sendo de

0,5 pontos. O número total de categorias é portanto g = 9. O número de casos é n = 80. O peso Wj_j para a frequência observada f±j de casos que estavam na categoria i para um examinador e na categoria j para o segundo examinador é calculado como: 1 j-j\ S-l

Wy = l - A força da concordância foi considerada como fraca se a estatística do Capa era < 0,00, ligeira para valores 0,00- 0,20, razoável para 0,21-0,40, moderada para 0,41-0,60, substancial para 0,61-0,80 e elevada para 0,81-1,00.

Os dados foram então coligidos e analisados por ANOVA e pelo método Kruskall Wallis. Os valores p resultantes mostram 63 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ uma diferença muito significativa entre o grupo de controlo e os tratados com MR7 ou o ectodomínio.

Exemplo 3: O ectodomínio de MR (fragmento extracelular dos resíduos 1-467 de MR) inibe a formação de brotos de vasos in vivo. A capacidade do ectodomínio de MR inibir a angiogénese in vivo foi testada utilizando um ensaio de angiogénese na esponja (Hori Y. et al. (1996) "Differential effects of angiostatic steroids and dexamethasone on angiogenesis and cytokine leveis in rat sponge implants" Br. J. Pharmacol. 118(7): 1584-1591) realizado com ratinhos pretos C57 fêmeas.

Todos os ratinhos receberam um disco (15 x 5 x 5 mm) de esponja de poliéter estéril subcutâneo (tipo 611-9) sob a pele dorsal no dia 0. Os reagentes de teste foram injectados através da pele directamente nas esponjas de dois em dois dias durante 21 dias (volume de injecção de 100 μΐ) . Grupos de 2 ratinhos receberam controlo de PBS; 10 ng/ml de factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF); ou 10 ng/ml de bFGF + 100 pg/ml de ectodomínio de MR. Os animais foram sacrificados no dia 21 e as esponjas foram removidas, fixadas em paraformaldeído a 3,7% e embutidas em parafina. Coraram-se secções de 5 mícrones com hematoxilina e eosina e obtiveram-se fotografias digitais utilizando um microscópio Zeiss Axioskop 2 plus com uma câmara digital Axiocam a uma ampliação de 20x. 0 número de vasos que invadem as esponjas foi contados como medida da angiogénese.

Houve claras diferenças entre as esponjas dos ratinhos que foram injectados com bFGF apenas (controlos) e aqueles que foram injectados com bFGF e com o ectodomínio de MR. As diferenças foram: a) números significativamente inferiores de vasos nas esponjas tratadas com ectodomínio de MR comparativamente com o controlo (Figura 8; p=0,0014 utilizando o teste t de

Student); b) uma ausência de vasos muito grandes das esponjas tratadas com ectodomínio de MR; e c) densidade celular de fibroblastos muito inferior nas esponjas tratadas com ectodomínio de MR. 64

ΕΡ 1 565 491/PT

Exemplo 4: O ectodomínio de MR (fragmento extracelular dos resíduos 1-467 de MR) inibe a migração de células endoteliais vasculares humanas primárias.

Realizou-se um ensaio de migração de células endoteliais vasculares humanas (HUVEC) primárias utilizando o sistema de angiogénese BD BioCoat™ para Migração de células endoteliais que está disponível com o n.° de Catálogo 354143 da BD Biosciences, Bedford, MA, EUA. As instruções para utilização deste kit podem ser encontradas em http://www.bdbioSciences.com/discovery_labware/Products/drug_ discovery/insert_systems/angiogenesis_system/pdf/Endothelial_ Cell_Migration_Instruct.pdf. Este sistema utiliza um sistema de inserção de 24 poços e consiste numa membrana FluoroBlok de PET da BD Falcon com 3 mícrones de dimensão de poros revestida uniformemente do lado superior com fibronectina. A quantificação da migração celular é conseguida por pós-marcação de células com o corante fluorescente Calcein AM e medição da fluorescência de células migrantes num leitor de fluorescência para placas. A membrana FluoroBlok bloqueia eficazmente a passagem de luz de 490-700 nm com >99% de eficiência, o que significa que as células marcadas que não migraram estão bloqueadas relativamente à detecção. A câmara superior foi semeada com 50 000 HUVEC/poço em meio MCDB 131 suplementado com 1% de soro fetal de vitelo (FCS) inactivado por calor. As câmaras do fundo foram carregadas com ou sem bFGF (5 ng/ml), VEGF (10 ng/ml) e ectodomínio de MR (100 pg/ml) em 750 μΐ de MCDB 131 + 1% de FCS. Após 22 h de incubação a 37°C as membranas inseridas foram coradas com 4 pg/ml de Calcein AM (Molecular Probes) em Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS) durante 90 min. A fluorescência no lado inferior da membrana foi medida a comprimentos de onda de excitação/emissão de 485/530 nm. Obtiveram-se imagens utilizando um microscópio Zeiss Axiovert 135 com uma câmara digital Axiocam a uma ampliação de lOx.

Sabe-se que tanto o bFGF como o VEGF estimulam a migração de células endoteliais (Cross & Claesson-Welsh, 2001 Trends Phannacol Sei. 22(4): 201-207). Como mostrado nas Figuras 9A e 9B, mostrou-se que o ectodomínio de MR inibe 65 ΕΡ 1 565 491/ΡΤ significativamente a migração de células HUVEC induzidas por bFGF ou VEGF.

Exemplo 5: O ectodomínio de MR (fragmento extracelular dos resíduos 1-467 de MR) inibe a proliferação de células endoteliais.

Semearam-se 5 x 104 células endoteliais vasculares humanas (HUVEC) primárias por poço de uma placa de 6 poços em 1.5 ml de meio de crescimento completo contendo tratamento (6,25, 12,5, 25, 50 ou 100 pg/ml do ectodomínio de MR (Robo4-Fc) ou 100 pg/ml de IgG humana) , ou seu tratamento como controlo. Após quatro dias de incubação a 37°C, lavaram-se as células com PBS e destacaram-se dos poços por adição de 1 ml de solução de tripsina. Após todas as células estarem destacadas, transferiram-se 400 μΐ da suspensão celular para 19,6 ml de tampão Isoton (Beckman Coulter), e determinou-se o número de células em cada amostra num aparelho Coulter de contagem de partículas e analisador de tamanhos (Beckman Coulter). A experiência foi realizada em triplicado, e replicada três vezes.

Como mostrado na Figura 10, a incubação na presença de 12.5 pg/ml de ectodomínio de MR diminuiu a proliferação das células HUVEC para cerca de 75% dos níveis do controlo, e concentrações superiores de ectodomínio de MR tinham um efeito anti-proliferativo crescentemente forte.

Exemplo 6: Tratamento de um paciente que exibe angiogénese indesejável por administração de um anticorpo que se liga especificamente à região extracelular de MR

Um paciente que exibe angiogénese indesejável é tratado com infusões intravenosas de soluções salinas de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo que se liga especificamente à região extracelular de MR. As infusões são administradas semanalmente durante um tempo de 3 a 6 meses. ΕΡ 1 565 491/ΡΤ 6 6

Exemplo 7: Tratamento de vim paciente que exibe angiogénese indesejável por administração da região extracelular de MR

Um paciente que exibe angiogénese indesejável é tratado com infusões intravenosas de soluções salinas de uma composição farmacêutica compreendendo o ectodominio de MR. As infusões são administradas semanalmente, tipicamente durante 3 a 6 meses.

Lisboa, 2010-06-29

Claims (48)

1. ΕΡ 1 565 491/ΡΤ 1/9 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um anticorpo que se liga selectivamente aos resíduos de aminoácido 46-209 do "carrossel mágico" (MR -magic roundabout) humano (SEQ ID NO:2) na preparação de um medicamento para inibição da angiogénese.
2. 2. Método in vitro para inibição da angiogénese compreendendo a administração de um anticorpo que se liga selectivamente aos resíduos de aminoácido 46-209 de MR humano (SEQ ID NO:2) a tecido ou células in vitro.
3. 3. Método ou utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que o anticorpo se liga selectivamente aos resíduos 46-116 de MR humano, ou aos resíduos 151-209 de MR humano.
4. 4. Método ou utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 em que o anticorpo possui pelo menos uma região variável de cadeia leve incorporando as seguintes CDR: CDR1: SASSSVSYMY (SEQ ID NO:9); CDR2: L T S N L A S (SEQ ID NO:10); e CDR3: QQWSSNPLT (SEQ ID NO:ll).
5. 5. Método ou utilização de acordo com a reivindicação 4 em que o anticorpo possui pelo menos uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos Q I V L T QSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQ QKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSG TSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFG AGTKLELK (SEQ ID NO:12).
6. 6. Método ou utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 em que o anticorpo possui pelo menos uma região variável de cadeia pesada incorporando as seguintes CDR: CDR1: D Y N L N (SEQ ID NO:13); CDR2: VINPNYGTTSYNQKFKG (SEQ ID NO:14); e CDR3: G R D Y F G Y (SEQ ID NO:15). ΕΡ 1 565 491/PT 2/9
7. 7. Método ou utilização de acordo com a reivindicação 6 em que o anticorpo possui pelo menos uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos Q V K/Q LQESGPELVKPGASVKISCKASGYSLTDYNL NWVKQNKGKSLEWI GVINPNYGTT SYNQKFK GKATLTVDQSSSTTYMQLNSLTSEDSAVYYC ARGRDYFGYWGQGTTVTVS S (SEQ ID NO:16-17).
8. 8. Método ou utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 em que o anticorpo possui pelo menos uma região variável de cadeia leve como definida na reivindicação 4 ou 5 e pelo menos uma região variável de cadeia pesada como definida na reivindicação 6 ou 7.
9. 9. Utilização de um polinucleótido que codifica um anticorpo como definido em qualquer das reivindicações 1 a 8 na preparação de um medicamento para inibição da angiogénese.
10. 10. Método in vitro para inibição da angiogénese compreendendo a administração de um polinucleótido que codifica um anticorpo como definido em qualquer das reivindicações 1 a 8 a tecido ou células in vitro.
11. 11. Anticorpo que se liga selectivamente aos resíduos de aminoácido 46-209 de MR humano (SEQ ID NO: 2) e que contém as sequências de aminoácidos i) a Ui) , as sequências de aminoácidos iv) a vi), ou as sequências de aminoácidos i) a vi) : i) SASSSVSYMY (SEQ ID NO:9); ii) L T S N L A S (SEQ ID NO:10); iii) QQWSSNPLT (SEQ ID N0:11); iv) D Y N L N (SEQ ID NO:13); v) VINPNYGTTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 14); e vi) G R D Y F G Y (SEQ ID NO:15), em que as sequências de aminoácidos i) a iii) correspondem a CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, de uma região variável de cadeia leve e as sequências de aminoácidos iv) a vi) correspondem a CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, de uma região variável de cadeia pesada. ΕΡ 1 565 491/PT 3/9
12. 12. Anticorpo de acordo com a reivindicação 11 possuindo pelo menos uma região variável de cadeia leve incorporando as seguintes CDR: CDR1: SASSSVSYMY (SEQ ID NO:9); CDR2: L T S N L A S (SEQ ID NO:10); e CDR3: QQWSSNPLT (SEQ ID NO:11).
13. 13. Anticorpo de acordo com a reivindicação 12 possuindo pelo menos uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos QIVLTQSPALMSASPGEKV TMTCSASS SVSYMYWYQQKPRSSPKP VV I Y L T SNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAED AATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO:12).
14. 14. Anticorpo de acordo com a reivindicação 11 possuindo pelo menos uma região variável de cadeia pesada incorporando as seguintes CDR: CDRl: D Y N L N (SEQ ID NO:13); CDR2: VINPNYGTTSYNQKFKG (SEQ ID NO:14); e CDR3: G R D Y F G Y (SEQ ID NO:15).
15. 15. Anticorpo de acordo com a reivindicação 14 possuindo pelo menos uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos Q V K/Q LQESGPELVKPGAS VKI SCKASGYSLTDYNLNWVKQNKGKSLEWI GVINPNYGTTSYNQKFKGKATLTVDQSSSTT YMQLNSLT SEDSAVYYCARGRDYFGYWGQGT T V T V S S (SEQ ID NO:16-17).
16. 16. Anticorpo de acordo com a reivindicação 11 possuindo pelo menos uma região variável de cadeia leve de acordo com a reivindicação 12 ou 13 e pelo menos uma região variável de cadeia pesada de acordo com a reivindicação 14 ou 15.
17. 17. Anticorpo que se liga selectivamente ao epitopo de MR ligado por um anticorpo possuindo pelo menos uma região variável capa de cadeia leve de acordo com a reivindicação 13 e pelo menos uma região variável de cadeia pesada de acordo com a reivindicação 15. ΕΡ 1 565 491/PT 4/9
18. 18. Polinucleótido que codifica um anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 17.
19. 19. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 18 compreendendo uma ou mais das sequências nucleotidicas: i) AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC (SEQ ID N0:18); ii) TCT CAC ATC CAA CCT GGC TTC T (SEQ ID N0:19); iii) CAG CAG TGG AGT AGT AAC CCA CTC ACG (SEQ ID NO:20); iv) GAC TAC AAC CTG AAC (SEQ ID NO:22); v) GTA ATT AAT CCA AAC TAT GGT ACT AGT TAC AAT CAG AAG TTC AAG GGC (SEQ ID NO:23); e vi) GGG AGG GAT TAC TTC GGC TAC (SEQ ID NO:24).
20. 20. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 18 ou 19 compreendendo a sequência nucleotidica CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA GCA CTC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA AGA TCC TCC CCC AAA CCC TGG ATT TAT CTC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGC ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT AGT AAC CCA CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA (SEQ ID NO:21), e/ou compreendendo a sequência nucleotidica CAG GTC AAG(ou A/CAA) CTG CAG GAG TCA GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGC GCT TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC TCA CTC ACT GAC TAC AAC CTG AAC TGG GTG AAG CAG AAC AAA GGA AAG AGC CTT GAG TGG ATT GGA GTA ATT AAT CCA AAC TAT GGT ACT AGT TAC AAT CAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GTA GAC CAA TCT TCC AGC ACA ACC TAC ATG CAG CTC AAC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC TAT TAC TGT GCA AGA GGG AGG GAT TAC TTC GGC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA (SEQ ID NO:25-27).
21. 21. Anticorpo que se liga selectivamente aos resíduos 46-209 de MR humano (SEQ ID NO:2) mas não se liga selectivamente aos péptidos LLQPPARGHAHDGQALSTDL (SEQ ID NO:28) OU LSQSPGAVPQALVAWRA (SEQ ID NO:29). ΕΡ 1 565 491/PT 5/9
22. 22. Anticorpo de acordo com a reivindicação 21 que se liga selectivamente aos resíduos 46-116 de MR humano (SEQ ID NO:2) mas não se liga selectivamente ao péptido LLQPPARGHAHDGQALSTDL (SEQ ID NO:28), ou que se liga selectivamente aos resíduos 151-209 de MR humano (SEQ ID NO:2) mas não se liga selectivamente ao péptido LSQSPGAVPQALVAWRA (SEQ ID NO:29).
23. 23. Polinucleótido que codifica um anticorpo de acordo com a reivindicação 21 ou 22.
24. 24. Composto compreendendo um anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 17 ou 21 a 22 e uma porção directamente ou indirectamente citotóxica.
25. 25. Composto de acordo com a reivindicação 24 em que a porção citotóxica é seleccionada entre um agente quimioterapêutico directamente citotóxico, um polipéptido directamente citotóxico, uma porção que é capaz de converter um pró-fármaco relativamente não tóxico num fármaco citotóxico, um radiossensibilizador, um ácido nucleico directamente citotóxico, uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido directamente ou indirectamente citotóxico, uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido terapêutico, ou um átomo radioactivo.
26. 26. Composto de acordo com a reivindicação 25 em que o átomo radioactivo é qualquer um entre fósforo-32, iodo-125, iodo-131, índio-111, rénio-186, rénio-188 ou ítrio-90.
27. 27. Composto de acordo com a reivindicação 24 ou 25 em que o anticorpo e a porção citotóxica são polipéptidos que estão fundidos.
28. 28. Polinucleótido que codifica um composto de acordo com a reivindicação 27.
29. 29. Composto compreendendo um anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 17 ou 21 a 22 e uma porção prontamente detectável. ΕΡ 1 565 491/ΡΤ 6/9
30. 30. Composto de acordo com a reivindicação 29 em que a porção prontamente detectável compreende uma quantidade adequada de qualquer um entre iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, azoto-15, oxigénio-17, tecnécio-99m, gadolínio, manganês ou ferro.
31. 31. Vector compreendendo o polinucleótido de qualquer das reivindicações 18 a 20, 23 ou 28.
32. 32. Células hospedeira compreendendo o polinucleótido de qualquer das reivindicações 18 a 20, 23 ou 28, ou o vector da reivindicação 31.
33. 33. Linha celular hospedeira estável produtora de um anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 17 ou 21 a 22 ou um composto de acordo com a reivindicação 27 resultante da incorporação na linha celular de um polinucleótido exógeno de acordo com qualquer das reivindicações 18 a 20, 23 ou 28, ou um vector de acordo com a reivindicação 31.
34. 34. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 17 ou 21 a 22, ou polinucleótido de acordo com qualquer das reivindicações 18 a 20, 23 ou 28, ou composto de acordo com qualquer das reivindicações 24 a 27 ou 29 a 30, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
35. 35. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 34 adequada para administração a um paciente por injecção.
36. 36. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 17 ou 21 a 22, ou polinucleótido de acordo com qualquer das reivindicações 18 a 20, 23 ou 28, ou composto de acordo com qualquer das reivindicações 24 a 27 ou 29 a 30, para utilização em medicina.
37. 37. Utilização de um anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 17 ou 21 a 22, ou de um polinucleótido de acordo com qualquer das reivindicações 18 a 20, 23 ou 28, ou de um composto de acordo com qualquer das reivindicações 24 a ΕΡ 1 565 491/ΡΤ 7/9 27 ou 29 a 30, na preparaçao de um medicamento para inibição da angiogénese.
38. 38. Método in vitro para inibição da angiogénese compreendendo a administração de um anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 17 ou 21 a 22, ou de um polinucleótido de acordo com qualquer das reivindicações 18 a 20, 23 ou 28, ou de um composto de acordo com qualquer das reivindicações 24 a 27 ou 29 a 30, a tecido ou células in vitro.
39. 39. Método de produção de um anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 17 ou 21 a 22, ou de um composto de acordo com a reivindicação 27, o método compreendendo a expressão de um polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, 23 ou 28, ou a cultura de uma linha celular hospedeira estável de acordo com a reivindicação 33.
40. 40. Utilização de um anticorpo que se liga selectivamente aos resíduos 46-209 de MR humano (SEQ ID NO: 2) na preparação de um medicamento para o combate a uma doença ou condição seleccionadas entre tumores/cancro, psoríase, aterosclerose, menorragia, endometriose, artrite (tanto inflamatória como reumatóide), degenerescência macular, doença de Paget, retinopatia e suas complicações vasculares (incluindo proliferativas e de prematuridade, e retinopatia diabética), proliferações vasculares benignas, fibroses, obesidade e inflamação.
41. 41. Utilização do ectodomínio de MR (SEQ ID NO:3) ou de um seu fragmento que inibe a migração e/ou a proliferação de células endoteliais, ou de um polinucleótido que codifica o ectodomínio de MR ou um seu fragmento que inibe a migração e/ou a proliferação de células endoteliais, na preparação de um medicamento para o combate a uma doença ou condição que envolvem migração e/ou proliferação não desejadas, indesejáveis ou inapropriadas de células endoteliais.
42. 42. Utilização de acordo com a reivindicação 41 em que a doença ou condição que envolvem migração e/ou proliferação não desejadas, indesejáveis ou inapropriadas de células ΕΡ 1 565 491/PT 8/9 endoteliais são seleccionadas entre tumores/cancro, psoríase, aterosclerose, menorragia, endometriose, artrite (tanto inflamatória como reumatóide), degenerescência macular, doença de Paget, retinopatia e suas complicações vasculares (incluindo proliferativas e de prematuridade, e retinopatia diabética), proliferações vasculares benignas, fibroses, obesidade e inflamação.
43. 43. Método in vitro para inibição da migração e/ou da proliferação de células endoteliais compreendendo a administração do ectodominio de MR ou de um seu fragmento que inibe a migração e/ou a proliferação de células endoteliais, de um polinucleótido que codifica o ectodominio de MR ou um seu fragmento que inibe a migração e/ou a proliferação de células endoteliais, a tecido ou células in vitro.
44. 44. Utilização do ectodominio de MR, ou de um seu fragmento que inibe a angiogénese, na preparação de um medicamento para inibição da angiogénese.
45. 45. Utilização do ectodominio de MR, ou de um seu fragmento que inibe a angiogénese, na preparação de um medicamento para o combate a uma doença ou condição seleccionadas entre tumores/cancro, psoríase, aterosclerose, menorragia, endometriose, artrite (tanto inflamatória como reumatóide), degenerescência macular, doença de Paget, retinopatia e suas complicações vasculares (incluindo proliferativas e de prematuridade, e retinopatia diabética), proliferações vasculares benignas, fibroses, obesidade e inflamação.
46. 46. Método in vitro de inibição da angiogénese compreendendo a administração do ectodominio de MR, ou de um seu fragmento que inibe a angiogénese, a tecido ou células in vitro.
47. 47. Utilização de um polinucleótido que codifica o ectodominio de MR, ou um seu fragmento que inibe a angiogénese, na preparação de um medicamento para inibição da angiogénese. ΕΡ 1 565 491/PT 9/9
48. 48. Método in vitro de inibição da angiogénese compreendendo a administração de um polinucleótido que codifica o ectodominio de MR, ou de um seu fragmento que inibe a angiogénese, a tecido ou células in vitro. Lisboa, 2010-06-29