MXPA05005470A

MXPA05005470A - Anticuerpos, polipeptidos y usos de los mismos.

Info

Publication number: MXPA05005470A
Application number: MXPA05005470A
Authority: MX
Inventors: Lorna Mary Dyet Stewart
Original assignee: Cancer Rec Tech Ltd
Priority date: 2002-11-20
Filing date: 2003-11-20
Publication date: 2005-09-08
Also published as: DK1565491T3; US8394381B2; CA2506724C; AU2003285500B8; CA2506724A1; DE60331945D1; IL204453A; US20060099143A1; US20080019963A1; EP1565491A2; ATE462727T1; SI1565491T1; JP2012050442A; WO2004046191A3; JP5336566B2; JP2006524485A; JP4869603B2; CY1110661T1; WO2004046191A2; AU2003285500A1

Abstract

Un metodo de inhibir la angiogenesis en un individuo que los necesita, que comprende administrar un anticuerpo que se une selectivamente a la region extracelular del entorno magico (MR) humano al individuo; un anticuerpo que tiene las secuencias de aminoacidos (i) a (iii), las secuencias de aminoacidos (iv) a (vi), o la secuencia de aminoacidos (i)a (iv): (i) S A S S S V S Y M Y, ii) L T S N L A S, (iii) Q Q W S S N P L T, (iv) D Y N L N, (v) V I N P N Y G T T S Y N Q K F K G, (vi) G R D Y F G Y A; un metodo de inhibir la angiogenesis de un individuo que lo necesita , que comprenden administrar el dominio extracelular (residuos 1-467) de MR, o un fragmento del mismo que inhibe la angiogenesis, al individuo; un metodo de inhibir la migracion y/o la proliferacion de celulas endoteliales, que comprende administrar el dominio intracelular del MR, o un fragmento del mismo que inhibe la migracion y/o la proliferacion de celulas endoteliales.

Description

ANTICUERPOS, POLIPEPTIDOS Y USOS DE LOS MISMOS MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a anticuerpos y polipéptidos, y en particular a anticuerpos y polipéptidos ECSM4 que inhiben la angiogénesis y el uso de los mismos. Las células endoteliales a partir de una capa de una sola célula revisten todos los vasos sanguíneos y regulan el intercambio entre el torrente sanguíneo y los tejidos aledaños. El desarrollo de nuevos vasos sanguíneos a partir de las paredes de vasos sanguíneos pequeños existentes mediante el exocrecimiento de estas células endoteliales las cuales tienen la capacidad de formar tubos capilares huecos incluso cuando se encuentran aisladas en cultivo. In vivo, los tejidos dañados y algunos tumores atraen el suministro sanguíneo mediante la secreción de factores que estimulan a las células endoteliales cercanas para construir nuevos brotes capilares. Los tumores que no pueden atraer un suministro sanguíneo están severamente limitados en su crecimiento. El proceso mediante el cual los vasos sanguíneos nuevos se originan como capilares, los cuales brotan a partir de vasos sanguíneos existentes, se denomina angiogénesis. Por lo tanto se puede observar que la angiogénesis desempeña un papel principal en el desarrollo normal del tejido y en la reparación y en la progresión de algunas condiciones patológicas.

Una vez que el sistema vascular está completamente desarrollado, las células endoteliales de los vasos sanguíneos normalmente permanecen quiescentes sin formación de nuevos vasos sanguíneos, con la excepción de la formación de nuevos vasos sanguíneos en la cicatrización natural. No obstante, se puede presentar una desregulación del crecimiento de los vasos sanguíneos y un incremento anormal en la densidad de los vasos sanguíneos en enfermedades o condiciones tales como tumorigénesis, retinopatía diabética, psoriasis e inflamación. Por lo tanto puede ser útil la capacidad de inhibir la angiogénesis inapropiada o no deseable en el tratamiento de estas enfermedades o condiciones. Se ha observado previamente que la roundabout magic de humano (MR; también conocida como molécula 4 específica de células endotelial, ECSM4) tiene un perfil de expresión altamente selectivo para la célula endotelial (Huminiecki & Bicknell (2000), Genome Research, 10, 1796-1806; y WO 02/36771 ). Se observó que la expresión de MR in vivo se restringe a sitios de angiogénesis activa, notablemente vasos sanguíneos tumorales (Huminiecki et al. (2002) Genomics, 79 (4), 547-552). Basándose en esta información, se sugirió en el documento WO 02/36771 que los compuestos que comprenden una porción que se une a MR, tal como un anticuerpo, y una porción funcional adicional, se pueden utilizar para una variedad de propósitos médicos incluyendo formación de imágenes del epitelio vascular; diagnóstico o prognosis de una condición que implica al endotelial vascular; evaluación de la eficiencia de terapias anti-angiogénicas; detección de daño endotelial; detección de un tumor o una neovasculatura tumorai o enfermedad cardiaca o endometriosis o aterosclerosis; tratamiento de una enfermedad proliferativa que implica el endotelio vascular tal como cáncer, psoriasis, retinopatía diabética, arterosclerosis o menorragia; introducción de material genético dentro de células endoteliales vasculares; y modulación de la angiogénesis. Por ejemplo, el documento WO 02/36771 enseña un compuesto que comprende una porción que se une a MR, tal como un anticuerpo, y una porción adicional tal como un inhibidor de la angiogénesis (página 27). El documento WO 02/36771 también enseña un compuesto que comprende una porción que se une a MR, tal como un anticuerpo, y una porción adicional tal como una porción citotóxica que destruye o que disminuye o que revierte el crecimiento de la neovasculatura (página 35). No obstante, en cada caso, la porción que se une a MR dirige meramente la porción funcional hacia una ubicación endotelial deseada para su uso. El documento WO 02/36771 no sugiere que la porción que se une a MR es funcional por sí misma, menos aún que inhibe a MR o puede ser utilizada para inhibir la angiogénesis. Actualmente los inventores han demostrado que un anticuerpo que se une selectivamente a la región extracelular de MR produce la inhibición de la angiogénesis. En el párrafo que abarca las páginas 71-72, el documento WO 02/36771 establece que ambos anticuerpos los cuales estimulan o activan a MR y los anticuerpos los cuales previenen la estimulación o activación de MR se pueden utilizar para modular la angiogénesis. No obstante, no se sugiere que un anticuerpo que se une selectivamente a la región extracelular de MR pueda ser utilizado para inhibir la angiogénesis. Además, en la medida del conocimiento de los inventores, ni el documento WO 02/36771 ni ningún otro documento muestra ninguna evidencia de que un anticuerpo que se une selectivamente a la región extracelular de MR, de hecho, inhiba la angiogénesis. Por lo tanto se provee de conformidad con un primer aspecto de la invención un método para inhibir la angiogénesis en un individuo que necesita del mismo que comprende la administración de un anticuerpo que se une selectivamente a la región extracelular de magic roundabout de humano (MR) al individuo. Por "inhibición de la angiogénesis" los inventores incluyen el significado de reducción de la velocidad o nivel de la angiogénesis. La reducción puede ser una reducción al nivel bajo de aproximadamente 10%, o de aproximadamente 20%, o de aproximadamente 30%, o de aproximadamente 40% de la velocidad o nivel de la angiogénesis. Preferiblemente, la reducción es una reducción al nivel medio de aproximadamente 50%, o de aproximadamente 60%, o de aproximadamente 70%, o de aproximadamente 80% en la reducción de la velocidad o nivel de la angiogénesis. Más preferiblemente, la reducción es una reducción al nivel alto de aproximadamente 90%, o de aproximadamente 95%, o de aproximadamente 99%, o de aproximadamente 99.9%, o de aproximadamente 99.99% de la velocidad o nivel de la angiogénesis. Más preferiblemente, la inhibición también puede incluir la eliminación de la angiogénesis o su reducción hasta un nivel indetectable. Los métodos y ensayos para determinar la velocidad o nivel de la angiogénesis, y por lo tanto para determinar si y hasta qué grado un anticuerpo inhibe la angiogénesis, se conocen en la técnica. Por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 6,225,118 B1 a Grant et al, incorporada en la presente invención como referencia, describe un ensayo multicelular in vitro para el modelamiento de las etapas combinadas de la angiogénesis es decir las etapas dé proliferación, migración y diferenciación del desarrollo celular. El AngioKit, número de catálogo ZHA-1000, por TCS CellWorks Ltd, Buckingham MK18 2LR, RU, es un modelo adecuado de la angiogénesis en humano para analizar las propiedades angiogénicas o anti-angiogénicas de compuestos prueba. La velocidad o nivel de la angiogénesis también se puede determinar utilizando el ensayo de anillo aórtico descrito en el ejemplo 2. Preferiblemente, el anticuerpo también inhibe la angiogénesis in vivo, especialmente en mamíferos, y más preferiblemente en humanos. Por "MR" los inventores incluyen el producto génico del gen magic roundabout de humano (también conocido como ECSM4) y variantes del mismo que se presentan de manera natural. El ADNc y la secuencia de aminoácidos de MR se encuentran en Genbank número de acceso AF361473 y AAL31867, y se muestran en las figuras 1A y 1 B (SEQ ID NOs: 1 y 2, respectivamente). MR es una proteína transmembranal y se ha pronosticado que tiene una región extracelular en los residuos 1-467 (SEQ ID NO: 3), una región transmembranal en los residuos 468-490, y una región intracelular en los residuos 491-1007 (Huminiecki et al., 2002). La región extracelular de MR tiene una región de inmunoglobulina (Ig) en los residuos 46-209 (SEQ ID NO: 4), la cual se puede subdefinir adicionalmente en un dominio IgA en los residuos 46-116 (SEQ ID NO: 5), y un dominio IgB en los residuos 151-209 (SEQ ID NO: 6), y dos dominios tipo III de fibronectina en los residuos 252-335 (SEQ ID NO: 7) y 347-432 (SEQ ID NO: 8). La numeración de los residuos de aminoácidos en MR es aquella proporcionada en AF361473, AAL31867 y en la figura 1B. Por un anticuerpo que se "une selectivamente" a un dominio específico o región de MR, tal como un dominio Ig, los inventores incluyen el significado de que el anticuerpo se une al dominio específico con una afinidad mayor que aquélla para cualquier otra región de MR. Preferiblemente, el anticuerpo se une al dominio especificado de MR con al menos 2, o al menos 5, o al menos 10 o al menos 50 veces más afinidad que para cualquier otra región de MR. Más preferiblemente, el anticuerpo se une al dominio específico de MR con al menos 100, o al menos 1 ,000, o al menos 10,000 veces más afinidad que para cualquier otra región de MR. Dicha unión se puede determinar mediante métodos bien conocidos en la técnica. Preferiblemente, el anticuerpo se une selectivamente a un epítope particular en MR y no se une a otros epítopes. Preferiblemente, cuando el anticuerpo se administra a un individuo, el anticuerpo se une a MR en el dominio especificado con una afinidad mayor que para cualquier otra molécula en el individuo. Preferiblemente, el agente se une a MR en el dominio específico con al menos 2, o al menos 5, o al menos 10 o al menos 50 veces más afinidad que aquélla para cualquier otra molécula en el individuo. Más preferiblemente, el agente se une a MR en el dominio específico con al menos 100, o al menos 1,000, o al menos 10,000 veces mayor afinidad que para cualquier otra molécula en el individuo. La inhibición de la angiogénesis puede ser útil en el combate de cualquier enfermedad o condición que implica angiogénesis no deseada, no deseable o ¡napropiada. Dichas condiciones incluyen tumores/cáncer, psoriasis, aterosclerosis, menorragia, endometriosis, artritis (tanto inflamatoria como reumatoide), degeneración macular, enfermedad de Paget, retlnopatía y sus complicaciones vasculares (incluyendo retinopatía proliferativa y de premadurez, y diabética), proliferaciones vasculares benignas, fibrosis, obesidad e inflamación. Por cáncer se incluye el sarcoma de Kaposi, leucemia, linfoma, mieloma, carcinomas sólidos (tanto primarios como secundarios (metástasis), tumores vasculares incluyendo hemangioma (tanto capilar como juvenil (infantil)), hemangiomatosis y hemagioblastoma. Los tumores que se pueden tratar mediante los métodos de la invención incluyen cualesquiera tumores los cuales están asociados con la producción de nuevos vasos sanguíneos. El término "tumor" debe entenderse que se refiere a todas las formas de crecimiento de célula neoplásica, incluyendo tumores del pulmón, hígado, células sanguíneas, piel, páncreas, estómago, colon, próstata, útero, mama, glándulas linfáticas y vejiga. Los tumores sólidos son especialmente adecuados. No obstante, actualmente se cree que los cánceres de la sangre, incluyendo leucemias y llnfomas están implicados en la formación de nuevos vasos sanguíneos y se pueden tratar mediante los métodos de la invención. Por lo tanto, la invención incluye un método para combatir una enfermedad o condición seleccionada a partir de tumores/cáncer, psoriasis, aterosclerosis, menorragia, endometriosis, artritis (tanto inflamatoria como reumatoide), degeneración macular, enfermedad de Paget, retinopatía y sus complicaciones vasculares (incluyendo retinopatía proliferativa y de premadurez, y diabética), proliferaciones vasculares benignas, fibrosis, obesidad e inflamación en un individuo, el método comprendiendo la administración de un anticuerpo que se une selectivamente a la región extracelular de MR al individuo. Por "combate" los inventores incluyen el significado de que el método se puede utilizar para aliviar síntomas del trastorno (por ejemplo el método se utiliza de manera paliativa), o para tratar el trastorno, o para prevenir el trastorno (por ejemplo el método se utiliza de manera profiláctica). Por lo tanto, la invención comprende un método para tratar a un paciente el cual tiene una enfermedad en la cual la angiogénesis contribuye a la patología, el momento comprendiendo el paso de administrar al paciente un anticuerpo que se une selectivamente a la región extracelular de MR. Típicamente, la enfermedad se asocia con la formación de neovasculatura no deseable y el tratamiento reduce esto hasta un grado útil. La terapia (tratamiento) puede ser en humanos o animales. Preferiblemente, los métodos de la invención se utilizan para tratar humanos. Por "anticuerpo" los inventores incluyen no solamente moléculas totales de inmunoglobulina sino también fragmentos de las mismas tales como Fab, F(ab')2, Fv y otros fragmentos de las mismas que retienen el sitio de unión al antígeno. De manera similar el término "anticuerpo" incluye derivados genéticamente diseñados de anticuerpos tales como moléculas Fv de cadena sencilla (scFv) y dominios del anticuerpo (dAbs). El término también incluye moléculas semejantes al anticuerpo las cuales se pueden producir utilizando técnicas de exhibición del fago u otras técnicas de selección al azar para moléculas las cuales se unen a MR o a regiones específicas de MR. Por lo tanto, el término anticuerpo incluye todas las moléculas las cuales contienen una estructura, preferiblemente una estructura peptídica, la cual es parte del sitio de reconocimiento (por ejemplo la parte del anticuerpo que se une o que se combina con el epítope o antígeno) de un anticuerpo natural.

Los dominios de cadena pesada variable (VH) y de cadena ligera variable (VL) del anticuerpo están implicados en el reconocimiento del antígeno, un hecho reconocido inicialmente por experimentos de digestión temprana con proteasa. La confirmación adicional se encontró mediante la "humanización" de anticuerpos de roedor. Los dominios variables de origen de roedor se pueden fusionar a los dominios constantes de origen de humano de tal manera que el anticuerpo resultante retiene la especificidad antigénica del anticuerpo parental del roedor (Morrison et al (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 , 6851-6855). La especificidad del antígeno que se confiere por dominios variables y es independiente de los dominios constantes se conoce a partir de experimentos que implican la expresión bacteriana de fragmentos del anticuerpo, todos conteniendo uno o más dominios variables. Estas moléculas incluyen moléculas semejantes a Fab (Better et al (1988) Science 240, 1041 ); moléculas Fv (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); moléculas Fv (ScFv) de cadena sencilla en donde los dominios partícipes VH y VL están enlazados vía un oligopéptido flexible (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85, 5879) y anticuerpos del dominio particular (dAbs) que comprenden dominios V aislados (Ward et al (1989) Nature 341 , 544). Una revisión general de las técnicas implicadas en la síntesis de fragmentos de anticuerpo los cuales retienen sus sitios de unión específicos se encuentra en Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299.

Por "moléculas ScFv" los inventores se refieren a moléculas en donde los dominios partícipes VH y VL están enlazados vía un oligopéptido flexible. Los anticuerpo diseñados, tales como los anticuerpos ScFv, se pueden elaborar utilizando las técnicas y métodos descritos en J. Huston et al., (1988) "Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity ¡n an anti-digoxin single chain Fv analogue produced in E. coli", Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85, pp. 5879-5883, y en A. Pluckthun, (Junio 1991) "Antibody engineering; Advances from use of E. coli expression systems", Bio/technology vol 9, incorporado en la presente invención como referencia. Las ventajas de la utilización de fragmentos del anticuerpo, más que de anticuerpos completos, son numerosas. El tamaño más pequeño de los fragmentos puede producir propiedades farmacológicas mejoradas, tal como una mejor penetración al sitio blanco. Se remueven las funciones efectoras de los anticuerpos totales, tales como unión al complemento. Todos los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv, ScFv y dAb se pueden expresar en y secretar a partir de E. coli, permitiendo así la fácil producción de grandes cantidades de los fragmentos. Los anticuerpos totales, y los fragmentos F(ab')2 son "bivalentes". Por "bivalente" los inventores se refieren a que los anticuerpos y fragmentos F(ab')2 tienen dos sitios de combinación al antígeno. En contraste, los fragmentos Fab, Fv, ScFv y dAb son monovalentes, teniendo solamente un sitio de combinación al antígeno.

Aunque el anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, se prefiere que sea un anticuerpo monoclonal. En algunos casos, particularmente si el anticuerpo se va a administrar de manera repetida a un paciente humano, se prefiere que el anticuerpo monoclonal sea un anticuerpo monoclonal de humano o un anticuerpo monoclonal humanizado. Los anticuerpos monoclonales adecuados los cuales son reactivos como se describen en la presente invención se pueden preparar mediante técnicas conocidas, por ejemplo aquellas descritas en "Monoclonal Antibodies; A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) y en "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application", SGR Hurrell (CRC Press, 1982). Se pueden producir los anticuerpos policlonales los cuales son poliespecíficos o monoespecíficos. Se prefiere que sean monoespecíficos. Los anticuerpos quiméricos se discuten por Neuberger et al (1998, 8th International Biotechnology Symposium Parte 2, 792-799). Se prefiere que el anticuerpo sea un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos no preparados de manera adecuada pueden ser "humanizados" en métodos conocidos, por ejemplo al insertar las regiones CDR de anticuerpos de ratón en la estructura base de anticuerpos de humano. Los anticuerpos humanizados se pueden elaborar utilizando las técnicas y métodos descritos en M. Verhoeyen, C. Milstein y G. Winter (1988) "Reshaping human antibodies: Grafting an antilysozyme activity", Science, 239, 1534-1536, y en C. Kettleborough et al., (1991) "Humanisation of a mouse monoclonal antibody by CDR grafting; The importance of framework residues in loop conformation", Protein Engineering, 14 (7), 773-783, incorporados en la presente invención como referencia. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos de humano en el sentido de que éstos tienen la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos anti-MR de humano pero se pueden preparar utilizando métodos conocidos en la técnica que no requieren inmunización de humanos. Por ejemplo, están disponibles los ratones transgénicos los cuales contienen, en esencia, genes de inmunoglobulina de humano (véase Vaughan et al (1998) Nature Biotechnol. 16, 535- 539. Un segundo aspecto de la invención provee el uso de un anticuerpo que se une selectivamente a la región extracelular de MR en la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis. El medicamento puede ser útil para combatir cualquier enfermedad o condición que implica angiogénesis no deseada o inapropiada. Dichas condiciones incluyen aquellas anteriormente descritas con referencia al primer aspecto de la invención. Por lo tanto la invención incluye el uso de un anticuerpo que se une selectivamente a la región extracelular de MR en la preparación de un medicamento para combatir una enfermedad o condición seleccionada a partir de tumores/cáncer, especialmente tumores sólidos, psoriasis, aterosclerosis, menorragia, endometriosis, artritis (tanto inflamatoria como reumatoide), degeneración macular, enfermedad de Paget, retinopatía y sus complicaciones vasculares (incluyendo retinopatía proliferativa y de premadurez, y diabética), proliferaciones vasculares benignas, fibrosis, obesidad e inflamación. Un tercer aspecto de la invención provee un método in vitro para inhibir la angiogénesis que comprende la administración de un anticuerpo que se une selectivamente a la región extracelular de MR a un tejido o células in vitro. Las células pueden ser líneas celulares establecidas, o células que han sido removidas a partir de un individuo. Este tejido o células preferiblemente son tejido o células de mamífero, y más preferiblemente son tejidos o células de humano. En una modalidad de cada uno de los tres primeros aspectos de la invención, el anticuerpo se une selectivamente a la región Ig de MR. La región Ig de MR se localiza en los residuos 46-209 de MR (figura 3, SEQ ID NO: 4). En una modalidad preferida, el anticuerpo se une selectivamente al dominio IgA de MR, el cual se localiza en los residuos 46-116 de MR (figura 4A, SEQ ID NO: 5). En una modalidad preferida alternativa, el anticuerpo se une selectivamente al dominio IgB de MR, el cual se localiza en los residuos 151-209 de MR (figura 4B, SEQ ID NO: 6). En una modalidad de cada uno de los tres primeros aspectos de la invención, el anticuerpo tiene al menos una región variable en la cadena ligera que incorpora las siguientes CDRs: CDR1 :SASSSVSYMY (SEQ ID NO: 9) CDR2: L T S N L A S (SEQ ID NO: 10) CDR3: QQWSSNPLT (SEQ ID NO: 11 ) En una modalidad más específica, el anticuerpo puede tener al menos una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos: QIVLTQSPAL SASPGEKVTMTCSASSSVSY MYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSG TSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLE LK (SEQ ID NO: 12). Preferiblemente, la cadena ligera es una cadena ligera kappa. En una modalidad de cada uno de los tres primeros aspectos de la invención, el anticuerpo tiene al menos una región variable en la cadena pesada que incorpora las siguientes CDRs: CDR : D Y N L N (SEQ ID NO: 13) CDR2: VINPNYGTTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 14) CDR3: G R D Y F G Y (SEQ ID NO: 15) En una modalidad más específica, el anticuerpo puede tener al menos una región variable en la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos: Q V K/Q LQESGPELVKPGASVKISCKASGYSLT DYNLNWVKQNKGKSLEWIGVINPNYGTTSYNQKF G KATLTVDQSSSTTYMQLNSLTSEDSAVYYCARGRDYF GYWGQGTTVTVSS (SEQ ID N0s:16 y 17), en donde K/Q significa que ya sea K o Q está presente en esa posición (K está presente en SEQ ID NO: 16, mientras que Q está presente en SEQ ID NO: 17). En incluso una modalidad más específica, el anticuerpo tiene al menos una región variable en la cadena ligera como se definió anteriormente y al menos una región variable en la cadena pesada como se definió anteriormente. Un cuarto aspecto de la invención provee un método para inhibir la angiogénesis en un individuo que necesita del mismo que comprende la administración al individuo de un polinucleótido que codifica un anticuerpo como se definió anteriormente. Un quinto aspecto de la invención provee el uso de un polinucleótido que codifica un anticuerpo como se definió anteriormente en la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis. Un sexto aspecto de la invención provee un método in vitro para inhibir la angiogénesis que comprende la administración a un tejido o células in vitro de un polinucleótido que codifica un anticuerpo como se definió anteriormente. Un séptimo aspecto de la invención provee un anticuerpo que contiene las secuencias de aminoácidos i) a iii), las secuencias de aminoácidos iv) a vi), o preferiblemente las secuencias de aminoácidos i) a vi): i) SASSSVSY Y (SEQ ID NO: 9) ii) LTSNLAS(SEQIDNO: 10) iii) QQWSSNPLT (SEQ ID NO: 11 ) iv) D Y N L N (SEQ ID NO: 13) v) VINPNYGTTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 14) vi) G R D Y F G Y (SEQ ID NO: 15). Aunque las CDRs que determinan la especificidad de unión a un antígeno se pueden determinar empíricamente, se ha demostrado que en un número significativo de casos la CDR3 de IgH es la región CDR más importante. Por lo tanto la invención incluye un anticuerpo con una región CDR3 de Ig de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos G R D YFG Y (SEQ ID NO: 15). Preferiblemente, el anticuerpo se une selectivamente a la región extracelular de MR (residuos 1-467 de MR, figura 2B, SEQ ID NO: 3), y la unión selectiva a MR se confiere por la presencia de estas secuencias de aminoácidos. Preferiblemente, el anticuerpo inhibe una función de MR. Dichas funciones incluyen la inhibición de la unión al ligando, la interacción con otras moléculas de superficie celular y la inhibición de la activación del receptor. Preferiblemente, el anticuerpo tiene al menos una región variable en la cadena ligera que incorpora las siguientes CDRs: CDR1 :SASSSVSYMY (SEQ ID NO: 9) CDR2: L T S N L A S (SEQ ID NO: 10) CDR3: QQWSSNPLT (SEQ ID NO: 11) Más preferiblemente, el anticuerpo tiene al menos una región variable en la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos: QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSY MYW YQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSG TSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLE L K (SEQ ID NO: 12). Preferiblemente, la cadena ligera es una cadena ligera kappa. Preferiblemente, el anticuerpo tiene al menos una región variable en la cadena pesada que incorpora las siguientes CDRs: CDR1 : D Y N L N (SEQ ID NO: 13) CDR2: VINPNYGTTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 14) CDR3: G R D Y F G Y (SEQ ID NO: 5) Más preferiblemente, el anticuerpo tiene al menos una región variable en la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos: Q V K/Q LQESGPELVKPGASVKISCKASGYSLT DYNLNWVKQNKGKSLEWIGVINPNYGTTSYNQKFKG KATLTVDQSSSTTYMQLNSLTSEDSAVYYCARGRDYF GYWGQGTTVTVSS(SEQIDNOs:16y 17). Incluso más preferiblemente, el anticuerpo tiene al menos una región variable en la cadena ligera como se definió anteriormente como se definió anteriormente en el séptimo aspecto de la invención y al menos una región variable en la cadena pesada como se definió anteriormente en el séptimo aspecto de la invención. Más preferiblemente, el anticuerpo tiene al menos una región variable en la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos: QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSY MYW YQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSG TSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLE LK(SEQIDN0:12) y al menos una región variable en la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos: Q V KQ LQESGPELVKPGASVKISCKASGYSLT DYNLNWVKQNKGKSLEWIGVI NPNYGTTSYNQKFKG KATLTVDQSSSTTYMQLNSLTSEDSAVYYCARGRDYF GYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NOs: 16 y 17). Se prefiere que el anticuerpo sea un anticuerpo humanizado. Se prefiere adicionalmente que el anticuerpo sea un anticuerpo humanizado que tiene las siguientes CDRs: CDR1 de cadena ligera: SASSSVSYMY (SEQ ID NO: 9) CDR2 de cadena ligera: L T S N L A S (SEQ ID NO: 10) CDR3 de cadena ligera: QQWSSNPLT (SEQ ID NO: 11) CDR1 de cadena pesada: D Y N L N (SEQ ID NO: 13) CDR2 de cadena pesada: VI N PNYGTTSYN QKFKG (SEQ ID NO: 14) CDR3 de cadena pesada: G R D Y F G Y (SEQ ID NO: 15) Un octavo aspecto de la invención provee un anticuerpo que se une selectivamente al epítope MR selectivamente unido por un anticuerpo que tiene al menos una región variable en la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos: QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSY MYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSG TSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLE L K (SEQ ID NO: 12) y al menos una región variable en la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos: Q V K/Q LQESGPELVKPGASVKISCKASGYSLT DYNLNWVKQNKGKSLEWIGVINPNYGTTSYNQKFKG KATLTVDQSSSTTYMQLNSLTSEDSAVYYCARGRDY FGYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:16 y 17). Por un anticuerpo que se une selectivamente a un epítope MR selectivamente unido por otro anticuerpo definido, los inventores incluyen un anticuerpo que compite con el anticuerpo definido. Dichos anticuerpos se pueden determinar, por ejemplo, utilizando ensayos de unión competitiva, preferiblemente ensayos de unión de alta resolución, como se conocen bien por una persona experta en la técnica. Los ensayos adecuados incluyen un ELISA de competencia intercalada en el cual un fragmento extracelular de MR se incuba con el anticuerpo definido y un anticuerpo prueba, para determinar si o no el anticuerpo prueba compite con el anticuerpo definido para la unión al epítope MR.

Un noveno aspecto de la invención provee un polinucleótido que codifica un anticuerpo como se define en el séptimo u octavo aspecto de la invención. En una modalidad, el polinucleótido comprende al menos una de las secuencias nucleotídicas: i) AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC (SEQ ID NO: 18) ¡i) TCT CAC ATC CAA CCT GGC TTC T (SEQ ID NO: 19) iii) CAG CAG TGG AGT AGT AAC CCA CTC ACG (SEQ ID NO: 20) Preferiblemente, el polinucleótido comprende dos de las secuencias nucleotídicas o las tres secuencias nucleotídicas i), ii) y iii). Preferiblemente, el polinucleótido comprende la secuencia nucleotídica: CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA GCA CTC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA AGA TCC TCC CCC AAA CCC TGG ATT TAT CTC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGC ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT AGT AAC CCA CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA (SEQ ID NO: 21).

En una modalidad alternativa o adicional, el polinucleótido comprende al menos una de las secuencias nucleotídicas: iv) GAC TAC AAC CTG AAC (SEQ ID NO: 22) v) GTA ATT AAT CCA AAC TAT GGT ACT AGT TAC AAT CAG AAG TTC AAG GGC (SEQ ID NO: 23), y vi) GGG AGG GAT TAC TTC GGC TAC (SEQ ID NO: 24) Preferiblemente, el polinucleótido comprende dos de las secuencias nucleotídicas o las tres secuencias nucleotídicas iv), v) y vi). Preferiblemente, el polinucleótido comprende la secuencia nucleotídica: CAG GTC AAG (o A/CAA) CTG CAG GAG TCA GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGC GCT TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC TCA CTC ACT GAC TAC AAC CTG AAC TGG GTG AAG CAG AAC AAA GGA AAG AGC CTT GAG TGG ATT GGA GTA ATT AAT CCA AAC TAT GGT ACT AGT TAC AAT CAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GTA GAC CAA TCT TCC AGC ACA ACC TAC ATG CAG CTC AAC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC TAT TAC TGT GCA AGA GGG AGG GAT TAC TTC GGC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA. (El polinucleótido que tiene AAG en el tercer codón es SEQ ID NO: 25; el polinucleótido que tiene AAA en el tercer codón es SEQ ID NO: 26; y el polinucleótido que tiene CAA en el tercer codón es SEQ ID NO: 27).

Más preferiblemente, el polinucleótido comprende al menos una secuencia nucleotídica: CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA GCA CTC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA AGA TCC TCC CCC AAA CCC TGG ATT TAT CTC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGC ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT AGT AAC CCA CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA (SEQ ID NO: 21 ), y al menos una secuencia nucleotídica: CAG GTC AAG (o A/CAA) CTG CAG GAG TCA GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGC GCT TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC TCA CTC ACT GAC TAC AAC CTG AAC TGG GTG AAG CAG AAC AAA GGA AAG AGC CTT GAG TGG ATT GGA GTA ATT AAT CCA AAC TAT GGT ACT AGT TAC AAT CAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GTA GAC CAA TCT TCC AGC ACA ACC TAC ATG CAG CTC AAC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC TAT TAC TGT GCA AGA GGG AGG GAT TAC TTC GGC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA (SEQ ID NOs: 25-27). En una modalidad, las dos regiones codificantes pueden estar en el mismo polinucleótido, por ejemplo en un polinucleótido para la expresión de un anticuerpo ScFv.

Un décimo aspecto de la invención provee un anticuerpo que se une selectivamente a la región Ig de MR (residuos 46-209, SEQ ID NO: 4) pero el cual no se une selectivamente al péptido LLQPPARGHAHDGQALSTDL (residuos 91- 109 de MR, SEQ ID NO: 28) o al péptido LSQSPGAVPQALVAWRA (residuos 165-181 de MR, SEQ ID NO: 29). En una modalidad, la invención incluye un anticuerpo que se une selectivamente a la región IgA de MR (residuos 46-116, SEQ ID NO: 5) pero no se une selectivamente al péptido LLQPPARGHAHDGQALSTDL (residuos 91- 109 de MR, SEQ ID NO: 28). En una modalidad alternativa, la invención incluye un anticuerpo que se une selectivamente a la región IgB de MR (residuos 151-209, SEQ ID NO: 6) pero no se une selectivamente al péptido LSQSPGAVPQALVAWRA (residuos 165-181 de MR, SEQ ID NO: 29). Un decimoprimer aspecto de la invención provee un polinucleótido que codifica un anticuerpo como se define en el décimo aspecto de la invención. Un decimosegundo aspecto de la invención provee un compuesto que comprende un anticuerpo como se definió anteriormente en el séptimo, octavo y noveno aspectos de la invención, y una porción citotóxica. La porción citotóxica preferiblemente es directamente o indirectamente tóxica a las células en la neovasculatura o a las células las cuales se encuentran en proximidad cercana y asociadas con la neovasculatura.

Por "directamente citotóxica" los inventores incluyen el significado de que la porción es una que por sí misma es citotóxica. Por "indirectamente citotóxica" los inventores incluyen el significado de que la porción es una que, aunque por sí misma no es citotóxica, puede inducir citotoxicidad, por ejemplo mediante su acción sobre una molécula adicional o mediante acción adicional sobre ésta. En una modalidad la porción citotóxica es un agente quimioterapéutico citotóxico. Los agentes quimioterapéuticos citotóxicos se conocen bien en la técnica. Los agentes quimioterapéuticos citotóxicos, tales como agentes anticancerosos, incluyen: agentes alquilatantes incluyendo nitrógeno mostazas tales como mecloretamina (HN2), ciclofosfamida, ¡fosfamida, melfalan (L-sarcolisina) y clorambucil; etileniminas y metilmelaminas tales como hexametilmelamina, tiotepa; alquil sulfonatos tales como busulfan; nitrosoureas tales como carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), semustina (metil-CCNU) y estreptozocina (estreptozotocina); y triacenos tales como decarbazina (DTIC; dimetiltriazenoimidazol-carboxamida); Antimetaboütos incluyendo análogos de ácido fólico tales como metotrexato (ametopterina); análogos de pirimidina tales como fluorouracilo (5-fluorouracilo; 5-FU), floxuridina (fluorodeoxiuridina; FUdR) y citarabina (citosin arabinósido); y análogos de purina e inhibidores relacionados tales como mercaptopurina (6-mercaptopurina; 6-MP), tioguanina (6-tioguanina; TG) y pentostatina (2 -deoxicoformicina). Los productos naturales incluyendo alcaloides vinca tales como vinblastina (VLB) y vincristina; epipodofilotoxinas tales como etopósido y tenipósido; antibióticos tales como dactinomicina (actinomicina D), daunorubicina (daunomicina; rubidomicina), doxorubicina, bleomicina, plicamicina (mitramicina) y mitomicina (mitomicina C); enzimas tales como L-asparaginasa; y modificadores de respuesta biológica tales como interferón alphenomas. Agentes misceláneos incluyendo complejos de coordinación de platino tales como cisplatina (cis-DDP) y carboplatina; antracenediona tales como mitoxantrona y antraciclina; urea sustituida tales como hidroxiurea; derivados de metil hidracina tales como procarbacina (N-metilhidracina, MIH); y supresores adrenocorticales tales como mitotano(o,p'-DDD) y aminoglutetimida; taxol y análogos/derivados; y agonistas/antagonistas de hormona tales como flutamida y tamoxifén. Varios de estos agentes se han unido previamente a anticuerpos y otros agentes para administración a sitio blanco, y así los compuestos de la invención que comprenden estos agentes se pueden elaborar fácilmente por la persona experta en la técnica. Por ejemplo, la conjugación de carbodiimida (Bauminger & Wilchek (1980) Methods Enzymol. 70, 151-159; incorporado en la presente invención como referencia) se puede utilizar para conjugar una variedad de agentes, incluyendo doxorubicina, a anticuerpos. Las carbodiimidas comprenden un grupo de compuestos que tienen la fórmula general R-N=C=N-R\ en donde R y R' pueden ser alifáticos o aromáticos, y se utilizan para la síntesis de enlaces peptídicos. El procedimiento preparativo es simple, relativamente rápido, y se lleva a cabo bajo condiciones leves. Los compuestos de carbodiimida atacan grupos carboxílicos para cambiarlos hacia sitios reactivos para grupos amino libres. La carbodiimida soluble en agua, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) es particularmente útil para conjugar una porción funcional a un anticuerpo y se puede utilizar para conjugar la doxorubicina a los péptidos de guía del tumor. La conjugación de la doxorubicina y un anticuerpo requiere la presencia de un grupo amino, el cual se provee por doxorubicin, y un grupo carboxilo, el cual se provee por el anticuerpo tales como un anticuerpo o péptido. Además del uso de carbodiimidas para la formación directa de enlaces peptídicos, EDC también se puede utilizar para preparar ésteres activos tales como éster de N-hidroxisuccinimida (NHS). El éster de NHS, el cual se une solamente al grupo amino, se puede utilizar entonces para inducir la formación de un enlace amida con el grupo amino particular de la doxorubicina. El uso de EDC y NHS en combinación se utiliza comúnmente para la conjugación con el objeto de incrementar la producción de la formación del conjugado (Bauminger & Wilchek, anteriormente mencionado, 1980). También se pueden utilizar otros métodos para conjugar una porción citotóxica a un anticuerpo. Por ejemplo, se puede utilizar la oxidación de peryodato de sodio seguido por la alquilatación reductiva de reactivos apropiados, como puede ser el entrecruzamiento de glutaraldehído. No obstante, se reconoce que, sin importar cual método de producción de un compuesto de la invención de seleccione, se debe realizar una determinación en la que el anticuerpo mantenga su capacidad direccionadora y que la porción unida mantenga su función relevante. En una modalidad adicional de la invención, la porción citotóxica es un péptido o porción polipeptídica citotóxica por medio de la cual los inventores incluyen cualquier porción que lleva a la muerte celular. Las porciones peptídicas y polipeptídicas citotóxicas se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, ricina, abrina, exotoxina de Pseudomonas, factor tisular y los similares. Los métodos para enlazarlos a las porciones direccionadoras tales como anticuerpos también se conocen en la técnica. El uso de ricina como un agente citotóxico se describe en Burrows & Thorpe (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90, 8996- 9000, incorporado en la presente invención como referencia, y el uso del factor tisular, lo cual lleva a la coagulación sanguínea localizada y al infarto de un tumour, se ha descrito por Ran et al (1998) Cáncer Res. 58, 4646-4653 y Huang et al (1997) Science 275, 547-550. Tsai et al (1995) Dis. Colon Rectum 38, 1067-1074 describe la cadena A de abrina conjugada a un anticuerpo monoclonal y se incorpora en la presente invención como referencia. Otras proteínas inactivadoras del ribosoma se describen como agentes citotóxicos en WO 96/06641. La exotoxina de Pseudomonas también se puede utilizar como la porción polipeptídica citotóxica (véase, por ejemplo, Aiello et al (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92, 10457-10461 ; incorporado en la presente invención como referencia).

Ciertas citocinas, tales como TNFa e IL-2, también se pueden utilizar como agentes citotóxicos. Ciertos átomos radioactivos también pueden ser citotóxicos si se administran en dosis adecuadas. Por lo tanto, la porción citotóxica puede comprender un átomo radioactivo el cual, en uso, administra una cantidad suficiente de radiactividad al sitio blanco de manera que sea citotóxico. Los átomos radioactivos adecuados incluyen fósforo-32, yodo-125, yodo-131 , indio-111, renio-186, renio-188 o itrio-90, o cualquier otro isótopo el cual emite suficiente energía para destruir a las células, organelos o ácido nucléico vecinos. Preferiblemente, los isótopos y la densidad de átomos radioactivos en el compuesto de la invención son tales que una dosis mayor de 4000 cGy (preferiblemente al menos 6000, 8000 o 10000 cGy) se administra al sitio blanco y, preferiblemente, a las células en el sitio blanco y sus organelos, particularmente el núcleo. El átomo radioactivo puede estar unido al anticuerpo en métodos conocidos. Por ejemplo el EDTA u otro agente quelante puede estar unido al anticuerpo y se utiliza para unir 1 ln o 90Y. Los residuos de tirosina pueden estar marcados con 125l o con 13 1. La porción citotóxica puede ser un polipéptido adecuado indirectamente citotóxico. En una modalidad particularmente preferida, el polipéptido indirectamente citotóxico es un polipéptido el cual tiene actividad enzimática y el cual puede convertir un profármaco relativamente no tóxico hacia un fármaco citotóxico. Cuando la porción blanco es un anticuerpo este tipo de sistema frecuentemente se refiere como ADEPT (terapia de profármaco por enzima dirigida al anticuerpo). El sistema requiere que la porción direccionadora localice la porción enzimática en el sitio deseado en el cuerpo del paciente (por ejemplo el sitio que expresa MR, tales como nuevo tejido vascular asociado con un tumour) y luego de dar tiempo para que la enzima se localice en el sitio, administrar un profármaco el cual es un sustrato para la enzima, el producto terminal de la catálisis siendo un compuesto citotóxico. El objetivo del método es maximizar la concentración del fármaco en el sitio deseado y minimizar la concentración del fármaco en tejidos normales (véase Senter, P. D. et al (1988) "Anti-tumor effects of antibody-alkaline fosfatase conjugates in combination with etoposide fosfate" Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85, 4842-4846; Bagshawe (1987) Br. J. Cáncer 56, 531-2; y Bagshawe, K. D. et al (1988) "A cytotoxic agent can be generated selectively at cáncer sites" Br. J. Cáncer. 58, 700-703.) La sustancia citotóxica puede ser cualquier fármaco anti-cáncer existente tales como un agente alquilatante; un agente el cual se intercala en el ADN; un agente el cual inhibe cualquier enzima clave tales como dihidrofolato reductasa, timidina sintetasa, ribonucleótido reductasa, nucleósido cinasas o topoisomerasa; o un agente el cual afecta la muerte celular mediante la interacción con cualquier otro constituyente celular. E! etopósido es un ejemplo de un inhibidor de la topoisomerasa. Los sistemas de profármacos reportados incluyen: un profármaco de fenol mostaza activado por una ß-glucuronidasa de E. coli (Wang et al, 1992 y Roffler et al, 1991); un profármaco de doxorubicina activado por una ß-glucuronidasa de humano (Bosslet et al, 1994); profármacos adicionales de doxorubicina activados por a-galactosldasa de grano de café (Azoulay et al, 1995); profármacos de daunorubicina, activados por cc-D-galactosidasa de grano de café (Gesson et al, 1994); un profármaco de 5-fluorouridina activado por una ß-D-galactosidasa de E. coli (Abraham et al, 1994); y profármacos de metotrexato (por ejemplo metotrexato-alanina) activados por carboxipeptidasa A (Kuefner et al, 1990, Vitols et ai, 1992 y Vitols et al, 995). Estos y otros se incluyen en el cuadro 1.

CUADRO 1 Enzima Profármaco Carboxipeptidasa G2 Derivados de ácido L-glutámico y ácido benzoico mostazas, anilina mostrazas, fenol mostazas y fenilendiamina mostazas; derivados fluorinados de éstas Fosfatasa alcalina Etopósido fosfato Mitomicina fosfato Beta-glucuronidasa p-Hidroxianilina mostaza-glucurónido Epirubicin-glucurónido Penicilina-V-amidasa Adriamicin-N fenoxiacetil Penicilina-G-amidasa N-(4'-hidroxifenil acet¡I)palitoxina Doxorubicina y melfalan Beta-lactamasa Nitrógeno mostaza-cefalosporina p- fenilendiamina; derivados de doxorubicina; derivado de vinblastina-cefalosporina; cefalosporina mostaza; un derivado de taxol Beta-glucosidasa Acido cianofenilmetil-beta-D-gluco- piranosidurónico Nitroreductasa 5-(Azaridin-1-il)-2,4-d¡nitrobenzamida Citosina deaminasa 5-fluorocitosina Carboxipeptidasa A Metotrexato-alanina (Este cuadro está adaptado a partir de Bagshawe (1995) Drug Dev. Res. 34, 220-230, a partir del cual se pueden obtener todas las referencias para estos diversos sistemas; el derivado de taxol se describe en Rodrigues, M. L. et al (1995) Chemistry & Biology 2, 223). Las enzimas adecuadas para formar parte de la porción enzimática de la invención incluyen: exopeptidasas, tales como carboxipeptidasas G, G1 y G2 (para profármacos de mostaza glutamilada), carboxipeptidasas A y B (para profármacos basados en MTX) y aminopeptidasas (para profármacos 2- -aminocil MTC); endopeptidasas, tales como por ejemplo trombolisina (para profármacos de trombina); hidrolasas, tales como fosfatasas (por ejemplo fosfatasa alcalina) o sulfatasas (por ejemplo aril sulfatasas) (para profármacos fosforilados o sulfatados); amidasas, tales como penicilina amidasas y arilacil amidasa; lactamasas, tales como ß-lactamasas; glicosidasas, tal como ß-glucuronidasa (para ß-glucuronomida antraciclinas), a-galactosidasa (para amigdalina) y ß-galactosidasa (para ß-galactosa antraciclina); deaminasas, tales como citosina deaminasa (para 5FC); cinasas, tales como uroquinasa y timidina cinasa (para ganciclovir); reductasas, tales como nitroreductasa (para CB1954 y análogos), azoreductasa (para azobencen mostazas) y DT-diaforasa (para CB1954); oxidasas, tales como glucosa oxidasa (para glucosa), xantina oxidasa (para xantina) y lactoperoxidasa; DL racemasas, anticuerpos catalíticos y ciclodextrinas.

El profármaco es relativamente no tóxico en comparación con el profármaco citotóxico. Típicamente, éste tiene menos del 10% de toxicidad, preferiblemente menos de 1 % de la toxicidad como se mide en una prueba de citotoxicidad adecuada in vitro. Es probable que la porción que es capaz de convertir un profármaco hacia un profármaco citotóxico será activa en aislamiento a partir del resto del compuesto pero es necesaria solamente para que sea activa cuando (a) está en combinación con el resto del compuesto y (b) el compuesto está unido a, adyacente a o internalizado en células blanco. Cuando cada porción del compuesto es un polipéptido, las dos porciones pueden estar unidas mediante cualesquiera de los métodos convencionales de entrecruzamiento de polipéptidos, tales como aquellos generalmente descritos en O'Sullivan et al (1979) Anal. Biochem. 100, 100-108. Por ejemplo, el anticuerpo anti-MR puede estar enriquecido con grupos tiol y la porción adicional reacciona con un agente bifuncional capaz de reaccionar con aquellos grupos tiol, por ejemplo el éster de N-hidroxisuccinimida del ácido yodoacético (NHIA) o N-succinim¡dil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP). Los enlaces amida y tioéter, por ejemplo logrados con un éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, son generalmente más estables in vivo que los enlaces disulfuro. Alternativamente, el compuesto se puede producir como un compuesto de fusión mediante técnicas de ADN recombinante en donde una longitud de ADN comprende regiones respectivas que codifican las dos porciones del compuesto de la invención ya sea adyacentes entre sí o separadas por una región que codifica un péptido eníazador el cual no destruye las propiedades deseadas del compuesto. De manera concebible, las dos porciones del compuesto se pueden superponer completamente o parcialmente. Luego el ADN se expresa en un hospedero adecuado para producir un polipéptido que comprende el compuesto de la invención. La porción citotóxica pueden ser un radiosensibilizador. Los radiosensibilizadores incluyen fluoropirimidinas, análogos de timidina, hidroxiurea, gemcitabina, fludarabina, nicotinamida, pirimidinas halogenadas, 3-aminobenzamida, 3-aminobenzodiamida, etanixadol, pimonidazol y misonidazol (véase, por ejemplo, cGinn et al (1996) J. Nati. Cáncer Inst. 88, 1193-11203; Shewach & Lawrence (1996) Invest. New Drugs 14, 257-263; Horsman (1995) Acta Oncol. 34, 571-587; Shenoy & Singh (1992) Clin. Invest. 10, 533-551 ; Mitchell et al (1989) Int. J. Radiat. Biol. 56, 827-836; lliakis & Kurtzman (1989) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16, 1235-1241; Brown (1989) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16, 987-993; Brown (1985) Cáncer 55, 2222-2228). También, la administración de los genes dentro de las células puede radiosensibilizarlas, por ejemplo la administración del gen p53 o de ciclina D (Lang et al (1998) J. Neurosurg. 89, 125-132; Coco Martin et al (1999) Cáncer Res. 59, 1134-1140).

La porción adicional puede ser una la cual se vuelva citotóxica, o libere una porción citotóxica, después de la irradiación. Por ejemplo, el isótopo boro-10, cuando se irradia adecuadamente, libera partículas las cuales son citotóxicas (véase por ejemplo, US 4,348,376 a Goldenberg; Primus et al (1996) Bioconjug. Chem. 7, 532-535). De manera similar, la porción citotóxica puede ser una la cual es útil en la terapia fotodinámica tal como fotofrina (véase, por ejemplo, Dougherty et al (1998) J. Nati. Cáncer Inst. 90, 889-905). La porción citotóxica puede ser una molécula de ácido nucléico la cual es directamente o indirectamente citotóxica. Por ejemplo, la molécula de ácido nucléico puede ser un oligonucleótido antisentido el cual, después de la localización en el ciclo blanco es capaz de entrar a las células y producir su muerte. Por lo tanto, el oligonucleótido puede ser uno el cual previene la expresión de un gen esencial, o uno el cual produce un cambio en la expresión del gen el cual ocasiona apoptosis. Los ejemplos de oligonucleótidos adecuados incluyen aquellos dirigidos en bcl-2 (Ziegler et al (1997) J. Nati. Cáncer Inst. 89, 1027-1036), y ADN polimerasa y topoisomerasa lia (Lee et al (1996) Anticancer Res. 16, 1805-1811. Los ácidos nucleicos del péptido pueden ser útiles en lugar de los ácido nucleicos convencionales (véase Knudsen & Nielsen (1997) Anticancer Drugs 8, 113-118).

Un decimotercer aspecto de la invención provee un polinucleótido que codifica un compuesto como se definió anteriormente en el decimosegundo aspecto de la invención, en donde el anticuerpo y la porción citotóxica son polipéptidos los cuales están fusionados. Un decimocuarto aspecto de la invención provee un compuesto que comprende un anticuerpo como se definió anteriormente en el séptimo, octavo y décimo aspectos de la invención, y una porción fácilmente detectable. Un compuesto que comprende un anticuerpo anti-MR como se definió anteriormente y se puede utilizar una porción fácilmente detectable, en combinación con un método de detección apropiado, para detectar la ubicación del compuesto en el individuo, y por lo tanto para identificar los sitios y grado de la angiogénesis en el individuo, así como la inhibición de la angiogénesis en el individuo. Por una "porción fácilmente detectable" los inventores incluyen el significado de que la porción es una la cual, cuando se localiza en el sitio blanco después de la administración del compuesto de la invención en un paciente, se puede detectar, típicamente de manera no invasiva desde afuera del cuerpo y del sitio del blanco localizado. Por lo tanto, los compuestos de esta modalidad de la invención son útiles en formación de imágenes y diagnosis. Típicamente, la porción fácilmente detectable es o comprende un átomo radiactivo el cual es útil en formación de imágenes. Los átomos radioactivos adecuados incluyen tecnecio-99m o yodo-123 para estudios de graficación de centelleo. Otras porciones fácilmente detectables incluyen, por ejemplo, marcas de giro para formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) tales como yodo-123 de nuevo, yodo-131 , indio-111 , flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Claramente, el compuesto de la invención debe tener suficiente de los isótopos atómicos apropiados con el objeto de que la molécula sea fácilmente detectable. Las marcas radioactivas o otras marcas se pueden incorporar en el compuesto de la invención mediante métodos conocidos. Por ejemplo, si el anticuerpo es un polipéptido éste se puede biosintetizar o se puede sintetizar mediante síntesis química de aminoácidos utilizando precursores de aminoácidos adecuados incluyendo, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Las marcas tales como 99mTc, 23l, 86Rh, 188Rh y 11ln pueden, por ejemplo, estar unidos vía residuos de cisteína en el anticuerpo. El itrio-90 se puede unir vía un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker er al (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 49-57) se puede utilizar para incorporar yodo-123. La referencia ("Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", J-F Chatal, CRC Press, 1989) describe otros métodos en detalle. Un decimoquinto aspecto de la invención provee un vector que comprende un polinucleótido como se definió anteriormente en el noveno, decimoprimer y décimotercer aspectos de la invención.

Los vectores plasmídicos procariontes típicos son: pUC 8, pUC19, pBR322 y pBR329 disponibles a partir de Biorad Laboratories (Richmond, CA, EUA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 y pRIT5 disponibles a partir de Pharmacia (Piscataway, NJ, EUA); vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A disponibles a partir de Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA 92037, EUA). Un vector plasmídico típico de célula de mamífero es pSVL disponible a partir de Pharmacia (Piscataway, NJ, EUA). Este vector utiliza el promotor tardío de SV40 para dirigir la expresión de genes clonados, el nivel más alto de expresión encontrándose en las células T productoras de antígeno, tales como células COS-1. Un ejemplo de un vector inducible para expresión en mamífero es pMSG, también disponible a partir de Pharmacia (Piscataway, NJ, EUA). Este vector utiliza el promotor inducible por glucocorticoide del repetido terminal largo del virus tumoral de mama de ratón para dirigir la expresión del gen clonado. Los vectores plasmídicos de levadura útiles son pRS403-406 y pRS413-416 y generalmente están disponibles a partir de Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA 92037, EUA). Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos integradores de levadura (Ylps) e incorporan los marcadores de selección en levadura HIS3, TRP1 , LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos del centrómero de levadura (YCps).

Se pueden utilizar los métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificante y, por ejemplo controles transcripcionales o traduccionales apropiados. Uno de dichos métodos implica la ligación vía colas de homopolímero. Las colas de homopoiímero polidA (o polidC) se añaden a los grupos 3'-OH expuestos en el fragmento de ADN a ser clonado por las deoxinucleotidil transferasas terminales. Posteriormente el fragmento es capaz de fijarse a las colas polidT (o polidG) añadidas a los extremos de un vector plasmídico linearizado. Los espacios que quedan después de la fijación se pueden llenar mediante ADN polimerasa y los extremos libres se unen mediante ADN ligasa. Otro método implica la ligación vía extremos cohesivos. Los extremos cohesivos compatibles se pueden generar en el fragmento de ADN y en el vector mediante la acción de enzimas de restricción adecuadas. Estos extremos se fijarán rápidamente a través del apareamiento de bases complementario y los espacios remanentes se pueden cerrar mediante la acción de la ADN ligasa. Un método adicional utiliza moléculas sintéticas denominadas enlazadores y adaptadores. Los fragmentos de ADN con extremos romos se generan mediante ADN polimerasa de bacteriófago T4 o ADN polimerasa I de E. coli la cual remueve los extremos 3' que protruyen y llena los extremos 3' deprimidos. Los enlazadores sintéticos, piezas de ADN de doble cadena con extremos romos los cuales contienen las secuencias de reconocimiento para las enzimas de restricción definidas, se pueden ligar a los fragmentos de ADN de extremos romos mediante ADN ligasa T4. Estos se digieren subsecuentemente con enzimas de restricción apropiadas para crear extremos cohesivos y se ligan a un vector de expresión con extremos compatibles. Los adaptadores también son fragmentos de ADN químicamente sintetizados los cuales contienen un extremo romo utilizado para ligación pero el cual también posee un extremo cohesivo preformado. Los enlazadores sintéticos que contienen una variedad de sitios para endonucleasa de restricción están comercial mente disponibles a partir de numerosas fuentes incluyendo International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, EUA. Una manera deseable de modificar el ADN que codifica el polipéptido de la invención es utilizando la reacción en cadena de la polimerasa como se describe por Saiki et al (1988) Science 239, 487-491. En este método el ADN que va a ser enzimáticamente modificado se flanquea por dos iniciadores oligonucleótidos específicos los cuales se incorporan dentro del ADN amplificado. Los iniciadores específicos pueden contener sitios de reconocimiento para endonucleasa de restricción los cuales se pueden utilizar para clonación dentro de vectores de expresión utilizando métodos conocidos en la técnica. Un decimosexto aspecto de la invención provee una célula hospedera que comprende un polinucleótido como se define en el noveno, decimoprimero y decimotercero aspectos de la invención, o un vector como se define en el decimoquinto aspecto de la invención. Se conocen muchos sistemas de expresión, incluyendo sistemas que emplean: bacterias (por ejemplo E. coli y Bacillus subtilis) transformadas con, por ejemplo, bacteriófago recombinante, vectores de expresión de ADN plasmídico o de cósmido; levaduras (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae) transformadas con, por ejemplo, vectores para expresión en levadura; sistemas en célula del insecto transformada con, por ejemplo, vectores para expresión viral (por ejemplo baculovirus); sistemas en célula vegetal transfectada con, por ejemplo vectores para expresión viral o bacteriana; sistemas en célula animal transfectada con, por ejemplo, vectores para expresión de adenovirus. Los vectores pueden incluir un replicón procarionte, tales como el ori Col El, para propagación en un procarionte, incluso si el vector se va a utilizar para expresión en otros tipos celulares, no procariontes. Los vectores también pueden incluir un promotor apropiado tales como un promotor procarionte capaz de dirigir la expresión (transcripción y traducción) de los genes en una célula hospedera bacteriana, tales como E. coli, transformada con éstos. Un promotor es un elemento para el control de la expresión formado por una secuencia de ADN que permite que ocurra la unión de la ARN polimerasa y la transcripción. Las secuencias promotoras compatibles con hospederos bacterianos ejemplares típicamente se proveen en vectores plasmídicos que contienen sitios de restricción convenientes para la inserción de un segmento de ADN de la presente invención. El polinucleótido en una célula hospedera adecuada se puede expresar para producir el anticuerpo o compuesto de la invención. Por lo tanto, el polinucleótido se puede utilizar de conformidad con las técnicas conocidas, se puede modificar apropiadamente en vista de las enseñanzas contenidas en la presente invención, para construir un vector de expresión, el cual se utiliza entonces para transformar una célula hospedera apropiada para la expresión y producción del anticuerpo o compuesto de la invención. Dichas técnicas incluyen aquellas descritas en las Patentes de E.U.A. Nos. 4,440, 859 emitida el 3 de abril de 1984 a Rutter et al, 4,530,901 emitida el 23 de julio de 1985 a Weissman, 4,582,800 emitida el 15 de abril de 1986 a Crawl, 4,677,063 emitida el 30 de junio de 1987 a Mark et al, 4,678,751 emitida el 7 de julio de 1987 a Goeddel, 4,704,362 emitida el 3 de noviembre de 1987 a Itakura et al, 4,710,463 emitida el 1 de diciembre de 1987 a Murray, 4,757,006 emitida el 12 de julio de 1988 a Toóle, Jr. et al, 4,766,075 emitida el 23 de agosto de 1988 a Goeddel et al y 4,810,648 emitida el 7 de marzo de 1989 a Stalker, todas las cuales se incorporan en la presente invención como referencia. El polinucleótido puede estar unido a una amplia variedad de otras secuencias de ADN para la introducción dentro de un hospedero apropiado. El ADN asociado dependerá de la naturaleza del hospedero, la manera de introducción del ADN dentro del hospedero, y si se desea el mantenimiento o la integración episomal. Generalmente, el polinucleótido se inserta dentro de un vector de expresión, tal como un plásmido, en una orientación adecuada y en un marco de lectura correcto para la expresión. Si es necesario, el ADN se puede unir a las secuencias nucleotídicas apropiadas para el control de la regulación transcripcional y traduccional reconocidas por el hospedero deseado, aunque dichos controles generalmente están disponibles en el vector de expresión. Por lo tanto, el inserto de ADN puede estar operativamente asociado a un promotor apropiado. Los promotores bacterianos incluyen los promotores lacl y lacZ de E. coli, los promotores T3 y T7, el promotor gpt, los promotores PR y PL del fago ?, el promotor phoA y el promotor trp. Los promotores eucariontes incluyen el promotor temprano inmediato de C V, el promotor de la timidina cinasa HSV, los promotores temprano y tardío de SV40 y los promotores de LTRs retrovirales. Otros promotores adecuados serán conocidos por el experto en la técnica. De manera deseable las construcciones de expresión también contienen sitios para el inicio de la transcripción y la terminación, y en la región transcrita, un sitio para unión al ribosoma para la traducción. (Hastings et al, International Patent No. WO 98/16643, publicada el 23 de abril de 1998). Luego el vector se introduce dentro del hospedero a través de técnicas estándares. Generalmente, no todos los hospederos serán transformados por el vector y por lo tanto será necesario seleccionar para las células hospederas transformadas. Una técnica de selección incluye la incorporación dentro del vector de expresión de un marcador de secuencia de ADN, con cualesquiera elementos control necesarios, que codifica para un rasgo detectable en la célula transformada. Estos marcadores incluyen dihidrofolato reductasa, resistencia a G418 o a neomicina para el cultivo de célula eucarionte, y genes para resistencia a tetraciclina, canamicina o ampicilina para cultivo en E. coli y otras bacterias. Alternativamente, el gen para dicho rasgo de selección puede estar en otro vector, el cual se utiliza para la co-transformación de la célula hospedera deseada. Las células hospederas que han sido transformadas mediante el ADN recombinante de la invención se cultivan entonces por un tiempo adecuado y bajo condiciones de cultivo apropiadas conocidas por aquellos expertos en la técnica en vista de las enseñanzas descritas en la presente invención para permitir la expresión del polipéptido, el cual puede ser entonces recuperado. El anticuerpo o compuesto se puede recuperar y purificar a partir de cultivos celulares recombinantes mediante métodos bien conocidos incluyendo precipitación con sulfato de amonio o con etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía por afinidad, cromatografía con hidroxilapatita y cromatografía con lectina. Más preferiblemente, se emplea para purificación la cromatografía líquida de aita resolución ("CLAR"). Un decimoséptimo aspecto de la invención provee una línea de célula hospedera estable que produce un anticuerpo como se define en el séptimo, octavo o décimo aspectos de la invención, o un compuesto como se define en el decimosegundo aspecto de invención en donde el anticuerpo y la porción citotóxica son polipéptidos los cuales están fusionados, que se producen a partir de incorporación en la línea celular de un polinucleótido exógeno como se define en noveno, decimoprimero y decimotercero aspectos de la invención, o un vector como se define en el decimoquinto aspecto de invención. Un décimoctavo aspecto de invención provee una composición farmacéutica o formulación que comprende un anticuerpo como se define en el séptimo, octavo o décimo aspectos de la invención, o un polinucleótido como se define en el noveno, decimoprimero y decimotercero aspectos de la invención, o un compuesto como se define en el decimosegundo y decimocuarto aspectos de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por "farmacéuticamente aceptable" se incluye que la formulación es estéril y libre de pirógenos. Los vehículos farmacéuticos adecuados se conocen bien en la técnica de farmacia. El vehículo(s) debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con el compuesto de la invención y no es deletéreo a los recipientes del mismo. Típicamente, los vehículos serán agua o solución salina los cuales estarán estériles y libres de pirógenos; no obstante, se pueden utilizar otros vehículos aceptables. En una modalidad, las composiciones farmacéuticas o formulaciones de la invención son para administración parenteral, más particularmente para administración intravenosa. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica es adecuada para administración intravenosa a un paciente, por ejemplo mediante inyección. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas y no acuosas estériles para inyección las cuales pueden contener anti-oxidantes, reguladores de pH, bacteriostatos y solutos los cuales vuelven a la formulación ¡sotónica con la sangre del recipiente pretendido; y suspensiones acuosas y no acuosas estériles las cuales pueden incluir agentes para suspensión y agentes espesantes. En una modalidad preferida alternativa, la composición farmacéutica es adecuada para administración tópica a un paciente. Preferiblemente, la formulación es una dosis unitaria que contienen una dosis diaria o unitaria, sub-dosis diarias o una fracción apropiada de la misma, del ingrediente activo. El anticuerpo, polinucleótido o compuesto de la invención se administrará normalmente de manera oral o mediante cualquier ruta parenteral, en la forma de una formulación farmacéutica que comprende el ingrediente activo, opcionalmente en la forma de una sal de adición orgánica, o inorgánica, ácida, o básica no tóxica, en una forma de dosis farmacéuticamente aceptable. Dependiendo del trastorno y del paciente a ser tratado, así como la ruta de administración, las composiciones se pueden administrar en dosis variables. En terapia de humano, el anticuerpo, polinucleótido o compuesto de la invención se puede administrar solo pero generalmente se administrará en mezcla con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéutico adecuado seleccionado con respecto a la ruta de administración pretendida y a la práctica farmacéutica estándar. Por ejemplo, el anticuerpo, polinucleótido o compuesto de la invención se puede administrar oralmente, bucalmente o sublingualmente en la forma de tabletas, cápsulas, óvulos, elíxires, soluciones o suspensiones, los cuales pueden contener agentes saborizantes o colorantes, para aplicaciones de liberación inmediata, retrasada o controlada. El anticuerpo, polinucleótido o compuesto de la invención también se puede administrar vía inyección intracavernosal. Dichas tabletas pueden contener excipientes tales como celulosa microcristalina, lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibásico y glicina, desintegrantes tales como almidón (preferiblemente almidón de maíz, de patata o de tapioca), glicolato de almidón sódico, croscarmelosa sódica y ciertos complejos de silicatos, y aglutinantes para granulación tales como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxi- propilcelulosa (HPC), sacarosa, gelatina y acacia. Adicionalmente, se pueden incluir los agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, gliceril behenato y talco. Las composiciones sólidas de un tipo similar también se pueden emplear como llenadores en cápsulas de gelatina. Los excipientes preferidos a este respecto incluyen lactosa, almidón, una celulosa, lactosa o polietilenglicoles de alto peso molecular. Para suspensiones acuosas y/o elíxires, los compuestos de la invención se pueden combinar con diversos agentes edulcorantes o saborizantes, materias colorantes o tinturas, con agentes emulsificantes y/o para suspensión y con diluyentes tales como agua, etanol, propilenglicol y glicerina, y combinaciones de los mismos. El anticuerpo, polinucleótido o compuesto de la invención también se puede administrar parenteralmente, por ejemplo, intravenosamente, ¡ntra-arterialmente, intraperitonealmente, intratecalmente, intraventricularmente, intraesternalmente, intracranealmente, intra-muscularmente o subcutáneamente, o se pueden administrar mediante técnicas de infusión. Estos se utilizan mejor en la forma de una solución acuosa estéril la cual puede contener otras sustancias, por ejemplo, sales o glucosa suficiente para hacer a la isotónica con la sangre. Las soluciones acuosos deben tener el pH regulado de manera adecuada (preferiblemente a un pH de 3 a 9), si es necesario. La preparación de formulaciones parenterales adecuadas bajo condiciones estériles se logra fácilmente mediante técnicas farmacéuticas estándares bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas y no acuosas estériles para inyección las cuales pueden contener anti-oxidantes, reguladores de pH, bacteriostatos y solutos los cuales vuelven a la formulación isotónica con la sangre del recipiente pretendido; y suspensiones acuosas y no acuosas estériles las cuales pueden incluir agentes para suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones se pueden presentar en contenedores de dosis unitaria o de dosis múltiple, por ejemplo ampolletas y viales sellados, y se pueden almacenar en una condición de secado mediante congelamiento (liofilizada) que requiere solamente la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporánea se pueden preparar a partir de polvos estériles, gránulos y tabletas de la clase previamente descrita. Para administración oral y parenteral a pacientes humanos, el nivel de dosis diario del anticuerpo, polinucleótido o compuesto de la invención usualmente será de 1 a 1000 mg por adulto (por ejemplo de aproximadamente 0.015 a 15 mg/kg), administrado en dosis particulares o divididas. Por lo tanto, por ejemplo, las tabletas o cápsulas del anticuerpo, polinucleótido o compuesto de la invención pueden contener de 1 mg a 1000 mg del agente activo para la administración particular o de dos o más al mismo tiempo, como sea apropiado. En cualquier caso el médico determinará la dosis real que será más adecuada para cualquier paciente individual y variará con la edad, peso y respuesta del paciente particular. Las dosis anteriormente mencionadas son ejemplares del caso promedio. Por supuesto, pueden existir casos individuales, en donde se merecen intervalos de dosis más altos o más bajos y los cuales están dentro del alcance de esta invención. El anticuerpo, polinucleótido o compuesto de la invención también se puede administrar intranasalmente o mediante inhalación y se administra convenientemente en la forma de un inhalador de polvo seco o una presentación de aerosol en aspersión a partir de un contenedor presurizado, bomba, aspersor o nebulizador con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoro-etano, un hidrofluoroalcano tales como 1 ,1 ,1 ,2-tetrafluoroetano (HFA134A, o 1 ,1 ,1 ,2, 3,3,3-heptafluoropropano (HFA227EA), dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad dosis se puede determinar al proveer una válvula para administrar una cantidad medida. El contenedor presurizado, bomba, aspersor o nebulizador puede contener una solución o suspensión del compuesto activo, por ejemplo utilizando una mezcla de etanol y el propelente como el solvente, el cual puede contener adicionalmente un lubricante, por ejemplo trioleato de sorbitano. Las cápsulas y cartuchos (elaboradas, por ejemplo, de gelatina) para uso en un inhalador o insuflador se pueden formular para que contenga una mezcla en polvo de un compuesto de la invención y una base en polvo adecuada tales como lactosa o almidón. Las formulaciones en aerosol o en polvo seco se arreglan preferiblemente de manera que cada dosis medida o "bocanada" contiene al menos 1 mg de un anticuerpo, polinucleótido o compuesto de la invención para administración al paciente. Se apreciará que la dosis diaria general con un aerosol variará de paciente a paciente, y se puede administrar en una dosis particular o, más usualmente, en dosis divididas a lo largo del día. Alternativamente, el anticuerpo, polinucleótido o compuesto de la invención se puede administrar en la forma de un supositorio o pesario, o se puede aplicar tópicamente en la forma de una loción, solución, crema, ungüento o polvo fino. Los compuestos de la invención también se pueden administrar transdermalmente, por ejemplo, mediante el uso de un parche para la piel. Estos también se pueden administrar mediante la ruta ocular, particularmente para tratar enfermedades del ojo. Para uso oftálmico, el anticuerpo, polinucleótido o compuesto de la invención se puede formular como suspensiones micronizadas en solución isotónica, pH ajustado, solución salina estéril, o, preferiblemente, como soluciones en solución isotónica, pH ajustado, solución salina estéril, opcionalmente en combinación con un conservador tal como un cloruro de bencilalconio. Alternativamente, se puedan formular en un ungüento tal como petrolato.

Para la aplicación tópica a la piel, el anticuerpo, polinucleótido o compuesto de la invención se puede formular como un ungüento adecuado que contiene el compuesto activo suspendido o disuelto en, por ejemplo, una mezcla con uno o más de los siguientes: aceite mineral, petrolato líquido, petrolato blanco, propilenglicol, compuesto de polioxietileno polioxipropileno, cera emulsificante y agua. Alternativamente, se pueden formular como una loción o crema adecuada, se pueden suspender o disolver en, por ejemplo, una mezcla de uno o más de los siguientes: aceite mineral, monoestearato de sorbitano, un polietilenglicol, parafina líquida, polisorbato 60, ésteres de cetilo cerosos, cetearil alcohol, 2-octildodecanol, bencil alcohol y agua. Las formulaciones adecuadas para administración tópica en la boca incluyen tabletas que comprenden el ingrediente activo en una base saborizada, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tales como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en un vehículo líquido adecuado. Para uso veterinario, un compuesto de la invención se administra como una formulación aceptable de manera adecuada de conformidad con la práctica veterinaria normal y la cirugía veterinaria determinará el régimen de dosis y la ruta de administración que será la más apropiada para un animal particular. Un decimonoveno aspecto de la invención provee un anticuerpo como se define en el séptimo, octavo o décimo aspectos de la invención, o un polinucleotido como se define en el noveno, decimoprimero y decimotercero aspectos de la invención, o un compuesto como se define en el decimosegundo o decimocuarto aspectos de la invención, para uso en medicina. Un vigésimo aspecto de la invención provee el uso de un anticuerpo como se define en el séptimo, octavo, o décimo aspectos de la invención, o un polinucleotido como se define en el noveno, decimoprimero y decimotercero aspectos de la invención, o un compuesto como se define en el decimosegundo o decimocuarto aspectos de la invención, en la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis. Las condiciones que incluyen angiogénesis no deseada o no deseable se describieron anteriormente. Un vigésimoprimer aspecto de la invención provee un método para inhibir la angiogénesis en un individuo que necesita del mismo que comprende la administración de un anticuerpo como se define en el séptimo, octavo, o décimo aspectos de la invención, o un polinucleotido como se define en el noveno, décimoprimero y decimotercero aspectos de la invención, o un compuesto como se define en el decimosegundo o décimocuarto aspectos de la invención, al individuo. En una modalidad, los polipéptidos, tales como anticuerpos, se pueden administrar utilizando un sistema de inyección para administración del fármaco en forma de liberación sostenida. Estos se diseñan específicamente para reducir la frecuencia de las inyecciones. Un ejemplo de dicho sistema es Nutropin Depot el cual encapsula a la hormona de crecimiento recombinante de humano (rhGH) en microesferas biodegradabies que, una vez inyectadas, liberan rhGH lentamente durante un período sostenido. El polipéptido se puede administrar por un dispositivo implantado mediante cirugía que libera el fármaco directamente en el sitio requerido. Por ejemplo, Vitrasert libera ganciclovir directamente dentro del ojo para tratar la retinitis por CMV. La aplicación directa de este agente tóxico al sitio de la enfermedad logra una terapia efectiva sin los efectos laterales sistémicos significativos del fármaco. Los sistemas de terapia por electroporación (EPT) también se pueden emplear para la administración de polipéptidos. Un dispositivo el cual administra un campo eléctrico en pulso a las células incrementa la permeabilidad de las membranas celulares al fármaco, produciendo una mejoría significativa de la administración ¡ntracelular del fármaco. Los polipéptidos también se pueden administrar mediante electroincorporación (El). La El se presenta cuando partículas pequeñas de hasta 30 micrones en diámetro sobre la superficie de la piel experimentan pulsos eléctricos idénticos o similares a aquellos utilizados en la electroporación. En la El, estas partículas se dirigen hacia el estrato córneo y dentro de las capas profundas de la piel. Las partículas se pueden cargar o revestir con fármacos o genes o pueden actuar simplemente como "balas" que generan poros en la piel a través de los cuales los fármacos pueden entrar.

Un método alternativo para la administración del polipéptido es el sistema inyectable ReGel que es termo-sensible. Por debajo de la temperatura corporal, ReGel es un líquido inyectable mientras que a temperatura corporal éste forma inmediatamente un reservorio en gel que se erosiona lentamente y se disuelve dentro de polímeros conocidos, seguros, biodegradables. El fármaco activo se administra durante el tiempo conforme se disuelven los biopolímeros. Los elementos farmacéuticos polipeptídicos también se pueden administrar oralmente. El procedimiento emplea un procedimiento natural para la toma oral de vitamina B12 en el cuerpo para co-administrar proteínas y péptidos. Al recorrer el sistema de toma de la vitamina B 2, la proteína o péptldo se puede mover a lo largo de la pared intestinal. Los complejos se sintetizan entre los análogos de la vitamina B-|2 y el fármaco que retiene tanto la afinidad significativa para el factor intrínseco (IF) en la porción de la vitamina B12 del complejo así como la bioactividad significativa de la porción de fármaco del complejo. Los polinucleótidos se pueden administrar mediante cualquier método efectivo, por ejemplo, parenteralmente (por ejemplo intravenosamente, subcutáneamente, intramuscularmente) o mediante administración oral, nasal u otros métodos los cuales permiten que los oligonucleótidos tengan acceso y circulen en el torrente sanguíneo del paciente. Los polinucleótidos sistémicamente administrados se proporcionan preferiblemente además de los polinucleótidos localmente administrados, pero también tienen utilidad en la ausencia de la administración local. Una dosis en el intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 gramos por administración a un humano adulto generalmente será efectiva para este propósito. El polinucleótido se puede administrar como una construcción genética adecuada como se describe a continuación y se administra al paciente en donde se expresa. Típicamente, el polinucleótido en la construcción genética está operativamente asociado a un promotor el cual puede expresar el anticuerpo o compuesto en la célula. Aunque las construcciones genéticas para la administración de polinucleótidos pueden ser de ADN o ARN se prefiere que sean de ADN. Preferiblemente, la construcción genética se adapta para la administración a una célula de humano. Los modos y métodos de introducción de una construcción genética dentro de una célula en un cuerpo animal se conocen en la técnica. Por ejemplo, las construcciones de la invención se pueden introducir dentro de células mediante cualquier método conveniente, por ejemplo métodos que incluyen retrovirus, de manera que la construcción se inserta dentro del genoma de la célula. Por ejemplo, en Kuriyama et al (1991 ) Cell Struc. and Func. 16, 503-510 se administran los retrovirus purificados. Las construcciones de ADN retroviral que comprenden un polinucleótido como se describió anteriormente se pueden elaborar utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Para producir un retrovirus activo a partir de dicha construcción es usual utilizar una línea celular empaquetadora ecotrópica psi2 crecida en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS). La transfección de la línea celular se realiza de manera conveniente mediante coprecipitación con fosfato de calcio, y se seleccionan los transformantes estables mediante la adición de G418 a una concentración final de 1 mg/ml (asumiendo que la construcción retroviral contiene un gen neoR). Las colonias independientes se aislan y expanden y el sobrenadante del cultivo se remueve, se filtra a través de un filtro con tamaño de poro de 0.45 µ?t? y se almacena a -70°C. Para la introducción del retrovirus dentro de las células tumorales, es conveniente inyectar directamente el sobrenadante retroviral al cual se le han añadido 10 µ9/??? de Polybrene. Para los tumores que exceden los 10 mm en diámetro es apropiado inyectar entre 0.1 mi y 1 mi del sobrenadante retroviral; preferiblemente 0.5 mi. Alternativamente, como se describe en Culver et al (1992) Science 256, 1550-1552, se inyectan las células que producen retrovirus. Las células productoras de retrovirus así introducidas son diseñadas para producir activamente partículas del vector retroviral de manera que se presentan las producciones continuas del vector dentro de la masa tumoral in situ. Por lo tanto, las células epidemiales en proliferación se pueden traducir exitosamente in vivo si se mezclan con las células productoras del vector retroviral. Los retrovirus direccionados también están disponibles para uso en la invención; por ejemplo, las secuencias que confieren afinidades específicas de unión se pueden diseñar dentro de genes env virales preexistentes (véase Miller & Vile (1995) Faseb J. 9, 190-199 para una revisión de esto y otros vectores direccionados para terapia génica). Otros métodos implican la simple administración de la construcción dentro de la célula para la expresión en ésta ya sea por un tiempo limitado o, siguiendo a la integración dentro del genoma, por un tiempo más largo. Un ejemplo del último método incluye liposomas (Nássander et al (1992) Cáncer Res. 52, 646-653). Para la preparación de immuno-liposomas MPB-PE (N-[4-(p-maleimidofenil)butiril]-fosfatidiletanolamina) se sintetiza de conformidad con el método de Martin & Papahadjopoulos (1982) J. Biol. Chem. 257, 286-288. MPB-PE se incorpora dentro de las bicapas liposomales para permitir un acoplamiento covalente del anticuerpo, o fragmento del mismo, a la superficie liposomal. El liposoma se carga convenientemente con el ADN u otra construcción genética de la invención para la administración a las células blanco, por ejemplo, mediante la formación de dichos liposomas en una solución del ADN u otra construcción genética, seguido por la extrusión secuencial a través de los filtros con membrana de policarbonato con 0.6 µ?? y 0.2 µ?? de tamaño de poro bajo presiones de nitrógeno de hasta 0.8 MPa. Después de la extrusión, la construcción de ADN atrapado se separa de la construcción de ADN libre mediante ultracentrifugación a 80 000 x g por 45 minutos. Los MPB-PE-liposomas recientemente preparados en regulador de pH deoxigenado se mezclan con anticuerpo recientemente preparado (o fragmento del mismo) y las reacciones de acoplamiento se llevan a cabo en una atmósfera de nitrógeno a 4°C bajo rotación constante extremo sobre extremo durante toda la noche. Los inmunoliposomas se separan a partir de los anticuerpos no conjugados mediante ultracentrifugación a 80 000 x g por 45 minutos. Los inmunoliposomas se pueden inyectar ¡ntraperitonealmente o directamente dentro de un tumor. Otros métodos de administración incluyen adenovirus que portan ADN externo vía un enlace anticuerpo-polilisina (véase Curiel Prog. Med. Viral. 40, 1-18) y conjugados de transferrina-policatión como vehículos (Wagner et al (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414). En el primero de estos métodos se forma un complejo policatión-anticuerpo con la construcción de ADN u otra construcción genética de la invención, en donde el anticuerpo es específico ya sea para adenovirus de tipo silvestre o un adenovirus variante en el cual se ha introducido un epítope nuevo el cual se une al anticuerpo. La porción del policatión se une al ADN vía interacciones electrostáticas con la estructura base de fosfato. El adenovirus, debido a que contiene una fibra alterada y proteínas pentonas, se internaliza en la célula y se porta dentro de la célula con la construcción de ADN de la invención. Se prefiere que el policatión sea polilisina. El polinucleótido también se puede administrar mediante adenovirus en donde está presente dentro de la partícula adenoviral, por ejemplo, como se describe a continuación.

En un método alternativo, se emplea un sistema de administración de ácido nucléico de alta eficiencia que utiliza endocitosis mediada por receptor para llevar a las macromoléculas de ADN dentro de las células. Esto se logra mediante la conjugación de la proteína de transporte de hierro transferrina a policationes que se unen a los ácido nucleicos. La transferrina de humano, o el homólogo de pollo conalbúmina, o combinaciones de la misma está covalentemente unida a la proteína de unión a ADN pequeño protamina o a polilisinas de diversos tamaños a través de un enlace disulfuro. Estas moléculas modificadas de transferrina mantienen su capacidad para unirse al receptor cognado y para mediar la eficiencia del transporte del hierro dentro de la célula. Las moléculas de transferrina-policatión forman complejos electroforéticamente estables con construcciones de ADN u otras construcciones genéticas de la invención independientes del tamaño del ácido nucléico (a partir de oligonucleótidos cortos al ADN de 21 kilopares de bases). Cuando se abastecen complejos de transferrina-policatión y las construcciones de ADN u otras construcciones genéticas de la invención a las células tumorales, se espera un alto nivel de expresión a partir de la construcción en las células. También se puede utilizar la administración de alta eficiencia mediada por receptor de las construcciones de ADN u otras construcciones genéticas de la invención utilizando la actividad de alteración del endosoma de partículas adenovirales defectuosas o químicamente inactivadas producidas por los métodos de Cotten et al (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 6094-6098. Este método parece depender del hecho de que los adenovirus se adaptan para permitir la liberación de su ADN a partir de un endosoma sin pasar a través del lisosoma, y en la presencia de, por ejemplo transferrina asociada a la construcción de ADN u otra construcción genética de la invención, la construcción es tomada por las células mediante la misma ruta que la de la partícula adenoviral. Este método tienen las ventajas de que no existe necesidad de utilizar construcciones retrovirales complejas; no hay la modificación permanente del genoma como se presenta con la infección retroviral; y el sistema de expresión dirigido se acopla con un sistema de administración dirigido, por lo tanto reduciendo la toxicidad a otros tipos celulares. Se apreciará que el "ADN desnudo" y el ADN que forma un complejo con lípidos catiónicos y neutros también puede ser útil en la introducción de ADN de la invención dentro de células del individuo a ser tratado. Los métodos no virales a la terapia génica se describen en Ledley (1995) Human Gene Therapy 6, 1129-1144. También se conocen los sistemas alternativos de administración dirigida tal como el sistema de adenovirus modificado descrito en el documento WO 94/10323 en donde, típicamente, el ADN se porta dentro del adenovirus, o en una partícula semejante a adenovirus. Michael et al (1995) Gene Therapy 2, 660-668 describen la modificación del adenovirus para añadir una porción selectiva a la célula dentro de una proteína fibrosa. Los adenovirus mutantes los cuales se replican selectivamente en células íumorales de humano deficientes en p53, tales como aquellos descritos en Bischoff et al (1996) Science 274, 373-376 también son útiles para administrar ia construcción genética de la invención a una célula. Por lo tanto, se apreciará que un aspecto adicional de la invención provee un virus o una partícula semejante a un virus que comprende una construcción genética de la invención. Otros virus adecuados, vectores viales o partículas semejantes a virus incluyen lentivirus y vectores lentivirales, HSV, virus adeno-asistidos (AAV) y vectores basados en AAV, vaccinia y parvovirus. Las construcciones genéticas de la invención se puede preparar utilizando métodos bien conocidos en la técnica. A un vigésimo segundo aspecto de la invención provee un método in vitro para inhibir la angiogénesis que comprende la administración de un anticuerpo como se define en el séptimo, octavo, o décimo aspectos de la invención, o un polinucleótido como se define en el noveno, decimoprimero y decimotercero aspectos de la invención, o un compuesto como se define en el decimosegundo o decimocuarto aspectos de la invención, a un tejido o células in vitro. Un vigésimo tercer aspecto de la invención provee un método para producir un anticuerpo como se define en el séptimo, octavo o décimo aspectos de la invención, o un compuesto como se define en el decimosegundo aspecto de la invención en donde el anticuerpo y la porción citotóxica son polipéptidos los cuales están fusionados, el método comprendiendo la expresión de un polinucleótido como se define en el noveno, decimoprimero y decimotercero aspectos de la invención, o cultivar una línea de célula hospedera estable como se define en el decimoséptimo aspecto de la invención. Los inventores también han demostrado que el fragmento extracelular de MR (residuos 1-467, figura 2B, SEQ ID NO: 3, también conocido como el ectodominio MR) inhibe la migración de las células endoteliales, incluyendo migración inducida por FGFb y VEGF. De manera interesante, el ectodominio MR no parece afectar a la unión de la célula endotelial (datos no mostrados). El ectodominio MR, y fragmentos de éste que muestran actividad inhibidora del ensayo de migración en las HUVEC, se podrían pronosticar como terapéuticamente útiles en condiciones en las cuales la migración no deseada, no deseable o ínapropiada de la célula endotelial contribuye a la patología. Los inventores también han demostrado que el ectodominio MR inhibe la proliferación de las células endoteliales. El ectodominio MR, y fragmentos de éste que muestran actividad antiproliferativa en un ensayo tal como aquel descrito en el ejemplo 5, se podrían pronosticar que son terapéuticamente útiles en condiciones en las cuales la proliferación no deseada, no deseable o ínapropiada de la célula endotelial contribuye a la patología. Un vigésimo cuarto aspecto de la invención provee el ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial.

Se aprecia que, en una modalidad, "un fragmento del ectodominio MR que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial" puede inhibir la migración de la célula endotelial y no la proliferación de la célula endotelial, o puede inhibir la proliferación de la célula endotelial y no la migración de la célula endotelial. En una modalidad alternativa, "un fragmento del ectodominio MR que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial" puede inhibir tanto la migración de la célula endotelial como la proliferación de la célula endotelial. En esta modalidad, el fragmento del ectodominio MR no inhibe necesariamente tanto la migración y/o la proliferación de la célula endotelial hasta el mismo grado. Por "inhibición de la migración y/o proliferación de la célula endotelial" los inventores incluyen el significado de reducción de la velocidad o nivel de migración y/o proliferación de la célula endotelial. La reducción puede ser una reducción de bajo nivel de aproximadamente 10%, o de aproximadamente 20%, o de aproximadamente 30%, o de aproximadamente 40% de la velocidad o de nivel de la migración y/o proliferación de la célula endotelial. Preferiblemente, la reducción es una reducción de nivel medio de aproximadamente 50%, o de aproximadamente 60%, o de aproximadamente 70%, o de aproximadamente 80% de reducción de la velocidad o nivel de la migración y/o proliferación de la célula endotelial. Más preferiblemente, la reducción es una reducción de alto nivel de aproximadamente 90%, o de aproximadamente 95%, o de aproximadamente 99%, o de aproximadamente 99.9%, o de aproximadamente 99.99% de la velocidad o nivel de la migración y/o proliferación de la célula endotelial. Más preferiblemente, la inhibición también puede incluir la eliminación de la migración y/o proliferación de la célula endotelial, o su reducción hasta un nivel indetectable. Los métodos y ensayos para determinar la velocidad o nivel de migración de la célula endotelial, y por lo tanto para determinar si y hasta qué grado cualquier fragmento particular del ectodominio MR inhibe la migración de la célula endotelial, se conocen en la técnica e incluyen el ensayo de HUVEC descrito en el ejemplo 4. De manera similar, se conocen bien en la técnica los métodos y ensayos para determinar la velocidad o nivel de proliferación de la célula endotelial, y por lo tanto para determinar sí y hasta qué grado cualquier fragmento particular del ectodominio MR inhibe la proliferación de la célula endotelial, e incluyen el ensayo de HUVEC descrito en el ejemplo 5. Por "un fragmento del ectodominio MR que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial" los inventores incluyen el ectodominio MR que ha sido truncado o deletado, o un polipéptido que comprende al menos 450 residuos de aminoácidos contiguos del ectodominio MR, el cual es adecuado para inhibir la migración y/o proliferación de la célula endotelial. Más preferiblemente, un fragmento del ectodominio el cual es adecuado para inhibir la migración y/o proliferación de la célula endotelial comprende al menos 400, o al menos 350, o al menos 300, o al menos 250, o al menos 200, o al menos 150, o al menos 100, o al menos 90, o al menos 80, o al menos 70, o al menos 60, o al menos 50, o al menos 40, o al menos 30, o al menos 20, o al menos 15, o al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos del ectodominio MR. Se prefiere más particularmente si el fragmento del ectodominio el cual es adecuado para inhibir la migración y/o proliferación de la célula endotelial comprende al menos 60 residuos de aminoácidos contiguos del ectodominio MR. La inhibición de la migración y/o proliferación de la célula endotelial se puede evaluar, por ejemplo, utilizando los ensayos de HUVEC como se describe en los ejemplos 4 y 5. En una modalidad, el fragmento del ectodominio el cual es adecuado para inhibir la migración y/o proliferación de la célula endotelial consiste de o comprende la región Ig de MR (residuos 46-209, SEQ ID NO: 4). En otra modalidad, el fragmento del ectodominio el cual es adecuado para inhibir la migración y/o proliferación de la célula endotelial consiste de o comprende el dominio IgA de MR (residuos 46-1 6, SEQ ID NO: 5) o el dominio IgB de MR (residuos 151-209, SEQ ID NO: 6). Los inventores han demostrado que el ectodominio MR no parece inhibir la unión de la célula endotelial (datos no mostrados) y, preferiblemente, el fragmento del ectodominio el cual es adecuado para inhibir la migración y/o proliferación de la célula endotelial no inhibe la unión de la célula endotelial. Por lo tanto el ectodominio MR, o fragmento del mismo el cual inhibe la migración de la célula endotelial, se puede utilizar para inhibir la migración y/o proliferación de la célula endotelial sin inhibir la unión de la célula endotelial.

Un vigésimo quinto aspecto de la invención provee e! ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial, para uso en medicina. Un vigésimo sexto aspecto de la invención provee un método para combatir cualquier enfermedad o condición incluyendo migración y/o proliferación de una célula endotelial no deseada, no deseable o inapropiada en un individuo, el método comprendiendo la administración del ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial, al individuo. Por lo tanto, la invención incluye un método para tratar a un paciente el cual tiene una enfermedad o condición en la cual la migración y/o proliferación de la célula endotelial contribuye a la patología, el método comprendiendo el paso de la administración al paciente del ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial. Un vigésimo séptimo aspecto de la invención provee el uso del ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial, en la preparación de un medicamento para combatir cualquier enfermedad o condición que implica la migración y/o proliferación no deseada, no deseable o inapropiada de una célula endotelial. También se ha mostrado que la masa de tejido adiposo se puede regular mediante su vasculatura (Rupnick, M. A. et al (2002) PNAS USA 99 (16): 10730-10735). Además, también se sabe que la leptina, un conocido regulador del apetito y del metabolismo, modula tanto la migración (Goetze, S. et al (2002) Hypertension 40 (5): 748-754) como la angiogénesis de las células endoteliales (Sierra-Honigmann, M. R. et al (1998) Science 281 : 1683). Por lo tanto la inhibición de la migración de las células endoteliales puede reducir la masa de tejido adiposo y puede ser útil en el tratamiento de la obesidad. Las enfermedades o condiciones que implican la migración y/o proliferación de una célula endotelial no deseada, no deseable o inapropiada incluyen tumores/cáncer, psoriasis, aterosclerosis, menorragia, endometriosis, artritis (tanto inflamatoria como reumatoide), degeneración macular, enfermedad de Paget, retinopatía y sus complicaciones vasculares (incluyendo retinopatía proliferativa y de premadurez, y diabética), proliferaciones vasculares benignas, fibrosas, obesidad e inflamación. Por lo tanto la invención incluye un método para combatir una enfermedad o condición seleccionada a partir de tumores/cáncer, psoriasis, aterosclerosis, menorragia, endometriosis, arthritis (tanto inflamatoria como reumatoide), degeneración macular, enfermedad de Paget, retinopatía y sus complicaciones vasculares (incluyendo retinopatía proliferativa y de premadurez, y diabética), proliferaciones vasculares benignas, fibrosis, obesidad e inflamación en un individuo, el método comprendiendo la administración del ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial, al individuo.

La invención también incluye el uso del ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial, en la preparación de un medicamento para combatir una enfermedad o condición seleccionada a partir de tumores/cáncer, psoriasis, ateroscierosis, menorragia, endometriosis, artritis (tanto inflamatoria como reumatoide), degeneración macular, enfermedad de Paget, retinopatía y sus complicaciones vasculares (incluyendo retinopatía proliferativa y de premadurez, y diabética), proliferaciones vasculares benignas, fibrosis, obesidad e inflamación en un individuo. Incluso un aspecto adicional de la invención provee un método ¡n vitro para inhibir la migración y/o proliferación de la célula endotelial que comprende administrar el ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial, a un tejido o células in vitro. Las células pueden ser líneas celulares establecidas, o células que han sido removidas a partir de un individuo. Los tejidos o células preferiblemente son tejido o células del mamífero, y más preferiblemente son tejido o células de humano. Además, se aprecia que la administración del ácido nucleico que codifica el fragmento extracelular de MR o fragmentos activos del mismo, también podrían ser terapéuticamente útiles. Un aspecto adicional de la invención provee un polinucleótido que codifica el ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial, para uso en medicina.

Por lo tanto un aspecto adicional de la invención provee un método para combatir cualquier enfermedad o condición incluyendo migración y/o proliferación de una célula endotelial no deseada, no deseable o inapropiada en un individuo que comprende la administración de un polinucleótido que codifica el ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial, al individuo. Incluso un aspecto adicional de la invención provee el uso de un polinucleótido que codifica el ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial, en la preparación de un medicamento para combatir cualquier enfermedad o condición que incluye la migración y/o proliferación no deseada, no deseable o inapropiada de una célula endotelial. Incluso un aspecto adicional de la invención provee un método in vitro para inhibir la migración y/o proliferación de la célula endotelial que comprende la administración de un polinucleótido que codifica el ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial, a un tejido o células in vitro. Las células pueden ser líneas celulares establecidas, o células que han sido removidas a partir de un individuo. Los tejidos o células preferiblemente son tejido o células de mamífero, y más preferiblemente son tejido o células de humano. Un aspecto adicional de la invención provee un vector que comprende un polinucleótido que codifica el ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial. La invención también incluye una célula hospedera que comprende un polinucleótido que codifica el ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial, o un vector que comprende dicho polinucleótido. Un aspecto adicional de la invención provee una composición farmacéutica que comprende el ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial, o un polinucleótido que codifica el ectodominio MR o el fragmento del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, la composición farmacéutica es adecuada para administración intravenosa a un paciente. Las preferencias para formulaciones farmacéuticas, rutas de administración, vectores, líneas celulares y así sucesivamente, son las mismas en los aspectos de la invención dirigidas a la inhibición de la migración y/o proliferación de la célula endotelial utilizando el ectodominio MR o un fragmento del mismo como las preferencias anteriormente descritas para los aspectos de la invención dirigidos a anticuerpos anti-MR. Los inventores también han demostrado que el ectodominio MR es adecuado para inhibir la formación de brotes de vasos sanguíneos in vitro en el ensayo de anillo aórtico, e in vivo en el ensayo de angiogénesis en esponja, y se podría pronosticar que es terapéuticamente útil en la inhibición de la angiogénesis. Además, los fragmentos (por ejemplo aquellos elaborados de manera recombinante o mediante síntesis peptídica de novo) de la región extracelular de MR que muestran actividad inhibidora en el ensayo de anillo aórtico de rata o en el ensayo de angiogénesis en esponja también se podrían pronosticar que son útiles en la inhibición de la angiogénesis. Por lo tanto un aspecto adicional de la invención provee un método para inhibir la angiogénesis en un individuo que necesita del mismo que comprende la administración del ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la angiogénesis, al individuo. Por "un fragmento del ectodominio MR que inhibe la angiogénesis" los inventores incluyen al ectodominio MR que ha sido truncado o deletado, o un polipéptido que comprende al menos 450 residuos de aminoácidos contiguos del ectodominio MR, el cual es adecuado para inhibir la angiogénesis. Más preferiblemente, un fragmento del ectodominio el cual es adecuado para inhibir la angiogénesis comprende al menos 400, o al menos 350, o al menos 300, o al menos 250, o al menos 200, o al menos 150, o al menos 100, o al menos 90, o al menos 80, o al menos 70, o al menos 60, o al menos 50, o al menos 40, o al menos 30, o al menos 20, o al menos 15, o al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos del ectodominio MR. Se prefiere más particularmente si el fragmento del ectodominio el cual es adecuado para inhibir la angiogénesis comprende al menos 60 residuos de aminoácidos contiguos del ectodominio MR. La inhibición de la angiogénesis se puede evaluar, por ejemplo, utilizando el ensayo de anillo aórtico como se describe en el ejemplo 2 o utilizando el ensayo de angiogénesis en esponja como se describe en el ejemplo 3.

En una modalidad, el fragmento del ectodominio el cual es adecuado para inhibir la angiogénesis consiste de o comprende la región Ig de MR (residuos 46-209, SEQ ID NO: 4). En otra modalidad, el fragmento del ectodominio el cual es adecuado para inhibir la angiogénesis consiste de o comprende el dominio IgA de MR (residuos 46-116, SEQ ID NO: 5) o el dominio IgB de MR (residuos 151-209, SEQ ID NO: 6). Otro aspecto de la invención provee el ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la angiogénesis. Un aspecto adicional de la invención provee el ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la angiogénesis, para uso en medicina. Incluso un aspecto adicional de la invención provee el uso del ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la angiogénesis, en la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis. Incluso un aspecto adicional de la invención provee un método in vitro para inhibir la angiogénesis que comprende la administración del ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la angiogénesis, a tejido o células in vitro. Además, se aprecia que la administración del ácido nucléico que codifica el fragmento extracelular de MR o fragmentos activos del mismo, también podrían ser un modelo útil de terapia anti-angiogénesis. Por lo tanto un aspecto adicional de la invención provee un método para inhibir la angiogénesis en un individuo que necesita del mismo que comprende la administración de un polinucleótido que codifica el ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la angiogénesis. Un aspecto adicional de la invención provee un polinucleótido que codifica el ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la angiogénesis, para uso en medicina. Incluso un aspecto adicional de la invención provee el uso de un polinucleótido que codifica el ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la angiogénesis, en la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis. Incluso un aspecto adicional de la invención provee un método in vitro para inhibir la angiogénesis que comprende la administración de un polinucleótido que codifica el ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la angiogénesis, a un tejido o células in vitro. Un aspecto adicional de la invención provee un vector que comprende un polinucleótido que codifica el ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la angiogénesis. Otro aspecto de la invención provee una célula hospedera que comprende un polinucleótido que codifica el ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la angiogénesis, o un vector que comprende dicho polinucleótido. Un aspecto adicional de la invención provee una composición farmacéutica que comprende el ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la angiogénesis, o un polinucleótido que codifica el ectodominio MR o el fragmento del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, la composición farmacéutica es adecuada para la administración intravenosa a un paciente. Las preferencias para enfermedades o condiciones a ser combatidas, formulaciones farmacéuticas, rutas de administración, vectores, líneas celulares y así sucesivamente, son las mismas en los aspectos de la invención dirigidos al ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la angiogénesis, puesto que las preferencias anteriormente descritas para los aspectos de la invención se dirigen a anticuerpos anti-MR. Todos los documentos referidos en la presente invención se incorporan aquí, en su totalidad, como referencia. El listado o discusión de un documento previamente publicado en esta especificación no debe considerarse necesariamente como una admisión de que el documento es parte del estado de la técnica o es conocimiento general común. La invención se describirá a continuación con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos y figuras. La figura 1A muestra la secuencia de ADN del inserto utilizado para generar el plásmido N1 (SEQ ID NO: 1). La figura 1B muestra la secuencia de aminoácidos codificada por el inserto (SEQ ID NO: 2). Esta secuencia es la secuencia de aminoácidos de MR de longitud total.

La figura 2A muestra la secuencia de ADN del inserto utilizado para generar el plásmido NH10 (SEQ ID NO: 30). La figura 2B muestra la secuencia de aminoácidos codificada por el inserto utilizado para generar el plásmido NH10. Esta secuencia se designa como el ectodominio MR y es la secuencia de aminoácidos del fragmento celular total de MR (residuos 1-467, SEQ ID NO: 3). La figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de la región Ig de MR (residuos 46- 209, SEQ ID NO: 4). La figura 4A muestra la secuencia de aminoácidos del dominio IgA de MR (residuos 46-116, SEQ ID NO: 5). La figura 4B muestra la secuencia de aminoácidos del dominio IgB de MR (residuos 151-209, SEQ ID NO: 5). La figura 5 muestra una representación gráfica de la estructura de MR. La figura 6A es una gráfica y un cuadro que muestra el efecto del anticuerpo (MR-7) y el dominio extracelular soluble de MR (Ecto MR) sobre la formación de nuevos vasos sanguíneos en el ensayo de anillo aórtico. La figura 6B es una gráfica y un cuadro que muestra el efecto del dominio extracelular soluble de MR (ectodominio MR , Ecto MR) sobre los formación de nuevos vasos sanguíneos en el ensayo de anillo aórtico con una IgG control de humano. Las figuras 7A-7C muestra la formación de brote a partir de la aorta de rata en la presencia del anticuerpo o del dominio extracelular soluble de MR. Las secciones de aorta de rata se cultivaron por 5 días en la presencia de medio solo (figura 7A), o en medio que contiene 100 µg ml de anticuerpo MR-7 (figura 7B), o 15 µg/ml del dominio extracelular soluble de MR (residuos 1-467) (figura 7C). Se muestran cuatro ilustraciones para cada grupo de tratamiento y son representativos de los niveles de formación de brotes a partir de aortas por duplicado. La figura 8 es una gráfica y un cuadro que muestra el efecto del dominio extracelular soluble de MR (ectodominio MR) sobre la formación de nuevos vasos sanguíneos en el ensayo de angiogénesis en esponja. La figura 9A es una gráfica y un cuadro que muestra que la migración inducida por el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) de las células endoteliales primarias de humano se inhibe por el dominio extracelular de MR. La figura 9B es una gráfica y un cuadro que muestra que la migración inducida por el factor de crecimiento fibroblástico básico (FGFb) de las células endoteliales primarias de humano se inhibe por el dominio extracelular de MR. La figura 10 es una gráfica y un cuadro que muestra que el ectodominio de MR (Robo4-Fc) inhibe la proliferación de las células endoteliales primarias de humano.

EJEMPLO 1 Preparación de anticuerpos Las construcciones de ADNc que se utilizaron fueron como se describe en el cuadro 2: CUADRO 2 "Fe" se refiere a la región Fe del vector pIG. Es la charnela de los dominios constantes de IgG de humano, CH1 , CH2, dentro de los extremos del vector (incluidos los sitios de clonación múltiple y región de procesamiento del aceptor). La secuencia nucleotídica del vector es: AAGCTTGATATCGAATTCTGCAGCCCGGGGGATCCGGAGG GAGGGTGTCTGCTGGAAGCAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCC CGGCTATGCAGCCCCAGTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCT CTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTC TTCTGGCTTTTTCCCCAGGCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTA ACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTGCCA AGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAG GCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTC CAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTC ACACATGCCCACCGTGCCCAGGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAG CTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGC CCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTCA ACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACG TGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAG CACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTG AATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCC CCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCGTGGGGTGCG AGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCTGCCCTGAGAG TGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCTACAGGGCAGCCCCGAGAACCACAG GTGTACACCCTGCCCCCATCCCGCCATGACCTGACCAAGAACCAGGTCA GCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGA GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCC CGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTG GACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGC ATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCC GGGTAAATGAGTGCGACGGCCGGCAAGCCCCGCTCCCCGGGCTCTCGC GGTCGCACGACCATGCTTGGCACGTACCCCCTGTACATACTTCCCGGGC GCCCAGCATGGAAATAAAGCACCCAGCGCTGCCCTGGGCCCCTGCGAG ACTGTGATGGTTCTTTCCACGGGTCACCCCGAGTCTGAGGCCTGAGTGG CATGAGGGAGGCAGCGGCCGCGACTCTAG (SEQ ID NO: 31).

La generación de vectores plasmídicos N1 y NH10 para la generación de anticuerpos anti-MR utilizando inmunización genética se llevó a cabo como sigue. Los vectores plasmídicos N1 y NH10, que codifican N1 (unido a la membrana) y NH10 (soluble), se generaron como sigue: N1 se generó mediante la remoción del MRpBluescript KS+ de longitud total mediante una digestión con Notl. El producto se limpió a partir de un gel y se ligó dentro de pcDNA3 (el cual había sido digerido con Notl). NH10 se generó mediante la amplificación del dominio extracelular de MR utilizando iniciadores los cuales incorporan un sitio HinDIII 5' y un sitio Notl 3'. Esto se ligó dentro de un vector pcDNA3 el cual había sido digerido con las mismas enzimas. La inmunización genética de los ratones para generar anticuerpos anti-MR se llevó a cabo como sigue: Las construcciones N1 y NH10 se utilizaron para inmunizar ratones a partir de tres ambientes genéticos diferentes de conformidad con el método reportado en (Boyle, J. S., A. Silva, et al (1997) "DNA immunization: induction of higher avidity antibody and effect of route on T cell cytotoxicity." Proc Nati Acad Sci USA 94 (26): 14626-31). Los ratones se inmunizaron con una inyección intramuscular de 100 µg de plásmido libre de endotoxina una vez cada dos semanas. Después de la inmunización con las construcciones de ADN, los ratones fueron inyectados cada uno con 200 µ? del ectodominio MR purificado intravenosamente como un refuerzo final antes de cosechar el bazo para generar los hibridomas. Se evaluaron tres diferentes cepas genéticas de ratones por su capacidad para generar una respuesta inmune adecuada a la inmunización genética, como se muestra en el cuadro 3.

CUADRO 3 El programa para inmunización se muestra en el cuadro 4.

CUADRO 4 Durante el curso de la inmunización, las muestras de sangre se evaluaron para anticuerpos anti-MR utilizando el siguiente ELISA de captura. Este ELISA es un ensayo fuerte y flexible el cual se puede utilizar para medir el nivel de proteína de fusión en el sobrenadante o la presencia/nivel del anticuerpo a la proteína de fusión en el sobrenadante dei hibridoma. Es muy sensible, para la detección de la IgG de humano en el intervalo de 0.001 a 0.5 µ9/???. Tiene una señal de fondo baja, típicamente en la región de OD405 = 0.07. En comparación, los sobrenadantes puros de hibridoma en este sistema (MR-plG) proporcionan resultados positivos de OD405 > 1.0 (y en algunos casos > 2.0). Resumen del método de ELISA Revestir de la placa con 5 µg/ml de IgG Fc-específico antihumano de cabra; bloquear con 1% de BSA en PBS; adicionar el sobrenadante de proteína de fusión o IgG control de humano; adicionar el anticuerpo de detección o conjugado de fosfatasa alcalina anti humano de cabra; adicionar el conjugado secundario si se utilizó anticuerpo para detección no conjugado; adicionar de sustrato pNPP; paro con NaOH 3M después de 20-30 minutos.

Protocolo detallado para ELISA de captura para proteínas de fusión pIG (1) Revestir la placa con 2 a 5 µ9/??1 de anticuerpo IgG antihumano de cabra (Fc-specífico) purificado no conjugado diluido en PBS, por ejemplo Sigma 1-2136. 50 µ?/????, golpear la placa suavemente para asegurar el revestimiento homogéneo de la base de los pozos. (2) Incubar durante toda la noche a +4°C. Las placas se pueden almacenar de ésta manera por al menos una semana, siempre y cuando se mantengan en un contenedor humidificado para prevenir el secado. (3) Lavar 3x con PBS-Tween 20 (0.04% de Tween 20) mediante sumergido de la placa y golpeado para secar sobre papel secante cada vez. (4) Bloquear con 1 % de BSA en PBS, 200 µ?/????. Incubar a temperatura ambiente por 1-2 horas, o durante toda la noche a +4°C. Las placas se pueden almacenar bloqueadas a +4°C, como para el punto (2) anteriormente mencionado. (5) Repetir el paso de lavado (paso 3). (6) Revestir la placa con el sobrenadante con la proteína de fusión por ejemplo MR-ecto-pIG. El sobrenadante que contiene 0.5 a 1.0 µ9 ?p? de la proteína de fusión proporciona un resultado muy fuerte, de manera que no se necesita purificar o concentrar. Incubar 1 hora a temperatura ambiente. La IgG de humano se puede utilizar en lugar del sobrenadante como un control positivo para detectar el dominio Fe y titular para cuantificar la cantidad de la proteína de fusión NABA-plG presente en el sobrenadante. (7) Repetir el paso de lavado (paso 3) (8) Detectar el dominio pIG utilizando IgG anti-humano de cabra conjugado a fosfatasa alcalina, dilución 1/5000 en PBS (control positivo), o suero de ratón a partir de la sangre prueba, diversas diluciones en PBS (1/10 a 1/1000). Incubar 1 hora a temperatura ambiente. Esto se sigue por un paso adicional de un conjugado secundario (fosfatasa alcalina anti-ratón). Incubar por 1 hora adicional a temperatura ambiente. (9) Repetir el paso de lavado (paso 3). (También entre el uso de la detección del anticuerpo y el conjugado secundario, si se utiliza un método alternativo) (10) Mediante el cambio de color utilizando el sustrato Sigma pNPP elaborado a partir de tabletas, 50 µ?/????. Incubar por 20-30 minutos en la oscuridad y luego parar la reacción mediante la adición de 50 µ?/???? de NaOH 3M. Leer el cambio de color a 405 nm.

Los anticuerpos anti-MR se generaron como sigue: Los bazos que se cosecharon a partir de los ratones inmunizados anteriormente mencionados fueron fusionados a células NSO. Los hibridoma resultantes se evaluaron por su capacidad para generar los anticuerpos que reconocen a MR utilizando ELISA. De los anticuerpos identificados, uno se escogió para estudios adicionales - MR7.

El anticuerpo MR7 se caracterizó como sigue: MR7 se evaluó por su capacidad para reconocer diversos dominios de MR utilizando ELISA. Se encontró que MR7 reconoce el dominio IgA de MR. La secuencia de ADN que codifica las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de MR7 se determinó mediante amplificación por PCR y técnica de secuenciación estándares utilizando los iniciadores que se muestran a continuación.

Iniciadores Se utilizó una mezcla de once iniciadores 5' (listada en el cuadro 5) para amplificar las CDRs de la cadena kappa.

CUADRO 5 La secuencia del iniciador la cual amplificó el extremo 5" de la cadena kappa de MR7 fue MK5 La secuencia del iniciador 3' fue GTTTGATCTAGAGCTTGGTCCC (SEQ ID NO: 43) la cual amplifica desde después de la CDR3 y añade un sitio de restricción Xbal en el extremo del producto si uno necesita clonar el producto. El mismo producto también se produjo cuando se utilizó la mezcla 5' con el iniciador de la región constante hacia 3' TTGGAGGGCGTTATCCACCT (SEQ ID NO: 44).

Iniciadores de la cadena pesada El iniciador hacia 5' fue: ATCGGATCCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG (SEQ ID NO: 45), y el iniciador hacia 3' fue: CTCGAATTCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC (SEQ ID NO: 46). La redundancia del código para estos iniciadores se muestra en el cuadro 6.

CUADRO 6 Ambigüedad del código 1UB Nucleótidos Códiqo C+G+T B no A A+G+C+T N Cualquiera (N) Secuencia MR7 La secuencia de aminoácidos de las regiones V de cadena ligera y de cadena pesada del anticuerpo MR7 se proporciona a continuación. Las CDRs están subrayadas.

MR7 de cadena kappa región V: Q IVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSY MYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSG TSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLE L K (SEQ ID NO: 12). MR7 de cadena pesada región V: Q V K/Q LQESGPELVKPGASVKISCKASGYSLT DYNLNWVKQNKGKSLEWIGVI PNYGTTSYNQKFKG KATLTVDQSSSTTYMQLNSLTSEDSAVYYCARGRDYF GYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NOs: 16-17), La secuencia nucleotídica codifica las regiones V de cadena ligera y de cadena pesada del anticuerpo MR7. Las CDRs están subrayadas.

MR7 de cadena kappa región V: CAA, ATT, GTT, CTC, ACC, CAG, TCT, CCA, GCA, CTC, ATG, TCT, GCA, TCT, CCA, GGG, GAG, AAG, GTC, ACC, ATG, ACC, TGC, AGT, GCC, AGC, TCA, AGT. GTA, AGT. TAC, ATG. TAC, TGG. TAC, CAG, CAG, AAG, CCA, AGA, TCC, TCC, CCC, AAA, CCC, TGG, ATT, TAT. CTC. ACA. TCC, AAC. CTG, GCT. TCT, GGA. GTC, CCT, GCT, CGC, TTC, AGT, GGC, AGT, GGG, TCT, GGG, ACC, TCT, TAC, TCT, CTC, ACA, ATC, AGC, AGC, ATG, GAG, GCT, GAA, GAT, GCT, GCC, ACT, TAT, TAC, TGC, CAG. CAG. TGG, AGT. AGT, AAC. CCA, CTC. ACG, TTC. GGT, GCT, GGG, ACC, AAG, CTG, GAG, CTG, AAA (SEQ ID NO: 21 ) R7 de cadena pesada región V: CAG, GCT, AAG (o A/CAA), CTG, CAG, GAG, TCA, GGA, CCT, GAG, CTG, GTG, AAG, CCT, GGC, GCT, TCA, GTG, AAG, ATA, TCC, TGC, AAG, GCT, TCT, GGT, TAC, TCA, CTC, ACT, GAC. TAC. AAC. CTG. AAC. TGG, GTG, AAG, CAG, AAC, AAA, GGA, AAG, AGC, CTT, GAG, TGG, ATT, GGA, GTA. ATT. AAT. CCA. AAC. TAT. GGT. ACT. AGT. TAC. AAT. CAG. AAG, TTC. AAG, GGC. AAG, GCC, ACA, TTG, ACT, GTA, GAC, CAA, TCT, TCC, AGC, ACA, ACC, TAC, ATG, CAG, CTC, AAC, AGC, CTG, ACA, TCT, GAG, GAC, TCT, GCA, GTC, TAT, TAC, TGT, GCA, AGA, GGG. AGG. GAT. TAC, TTC. GGC, TAC. TGG, GGC, CAA, GGG, ACC, ACG, GTC, ACC, GTC, TCC, TCA (SEQ ID NOs: 25-27) EJEMPLO 2 El anticuerpo MR7 y el ectodominio MR (fragmento extracelular de MR residuos 1-467) inhiben la formación de los brotes de vasos sanguíneos en el ensayo de anillo aórtico Resumen Se investigó el papel de MR en la angiogénesis utilizando el ensayo de anillo aórtico de rata. Los segmentos de la aorta de rata se embebieron en Matrigel y se trataron ya sea con el anticuerpo MR7 o con la proteína del ectodominio MR purificada. Los brotes de vasos sanguíneos se dejaron desarrollar durante cinco días antes de llevar a cabo la evaluación por tres observadores independientes. Las evaluaciones promediadas de 20-25 experimentos separados se muestran en las figuras 6A y 6B. La fiabilidad inter-evaluación se evaluó utilizando el método de Landis y Koch. Los valores kappa pesados calculados fueron 0.96 para MR7 y 0.93 para el ectodominio MR. Estos valores kappa muestran que existe un alto grado de consistencia entre los evaluadores independientes.

Métodos Las aortas se cosecharon a partir de ratas de 200 g - 300 g (6-8 semanas de edad) e inmediatamente se colocaron en medio MCDB 131. El tejido conectivo se removió y las aortas se cortaron en anillos de 1 mm-1.5 mm. Las placas de 48-pozos se revistieron con 110 µ? de Matrigel (BD Biosciences) diluido 1 :1 con PBS y se dejó gelificar a 37°C por 30 minutos. Los anillos se colocaron en los pozos y se sellan en su lugar con una sobrecapa de 40 µ? de Matrigel. Los anticuerpos (100 µg/ml) o ectodominio MR (dominio extracelular robo4 soluble) (15 µ9/???) se añadieron a los pozos en un volumen final de 250 µ? de medio MCDB 131 que contenía 20% de suero bovino fetal y 50 µg/ml de suplemento para crecimiento de célula endotelial. El medio se cambió cada dos días y las aortas se analizaron y se fotografiaron después de cinco días.

Resultados Las fotomicrografías representativas de los segmentos de los anillos aórticos se muestran en la figura 7A-7C. Como se muestra en la figura, el tratamiento de los anillos aórticos ya sea con MR7 o con el ectodominio MR produce una disminución significativa en la formación de brotes de vasos sanguíneos a partir del segmento aórtico.

Análisis estadístico del ensayo de anillo aórtico Los anillos aórticos se evaluaron de conformidad con el crecimiento del vaso sanguíneo en una escala de 0 (bajo) a 4 (alto) como sigue: 0 = sin crecimiento, 1 = pocos vasos sanguíneos, 2 = vasos sanguíneos intermedios, 3 = muchos vasos sanguíneos pero centros de formación de brotes esporádicos alrededor del anillo y 4 = muchos vasos sanguíneos brotando a partir de todas las regiones del anillo.

Todos los experimentos se evaluaron en ciego por tres investigadores independientes. La fiabilidad inter-evaluación se evaluó utilizando el método de Landis y Koch (Biometrics, 1977,33(1 ), 159-174). La kappa pesada se calculó con el objeto de establecer la fiabilidad inter-evaluación de los examinadores. La kappa pesada se proporciona por: en donde po(w) y pe(w) son las concordancias pesadas observadas y esperadas calculadas con las fórmulas: La i representa la categoría para un examinador y j representa la categoría para el segundo examinador. La r¡ representa el gran total de los casos en la categoría i para un examinador, y Cj representa el gran total de los casos en la categoría j para el otro examinador. Se considera que la diferencia entre las categorías es de 1, por lo tanto con la introducción de nuevas categorías para la descripción de las categorías de transición adicionales la diferencia de una categoría con respecto a otra se considera que es de 0.5 puntos. Por lo tanto el número total de categorías es g = 9. El número de casos es n = 80.

El peso wij para la frecuencia observada fij de los casos los cuales estaban en la categoría i por un examinador y en la categoría j por el segundo examinador se calcula como: La fuerza de la concordancia se observó como escasa si la Kappa estadística era de < 0.00, leve para los valores 0.00-0. 20, regular para 0.21-0. 40, moderada para 0.41-0. 60, substancial para 0.61-0. 80 y alta para 0.81-1. 00. Posteriormente los datos se recolectaron juntos y se analizaron mediante ANOVA y el método de Kruskall Wallis. Los valores p resultantes muestran una diferencia altamente significativa entre el grupo control y aquellos tratados ya sea con MR7 o con el ectodominio.

EJEMPLO 3 El ectodominio MR (fragmento extracelular de MR residuos 1-467) inhibe la formación de brotes de vasos sanguíneos in vivo La capacidad del ectodominio MR para inhibir la angiogénesis in vivo se evaluó utilizando un ensayo de angiogénesis en esponja (Hori Y. et al (1996) "Differential effects of angiostatic steroids y dexamethasone on angiogénesis and cytokine levéis in rat sponge ¡mplants" Br.J. Pharmacol. 118 (7): 1584-1591) llevado a cabo en ratonas C57 negras. Todas las ratonas recibieron un disco subcutánea estéril de esponja de poliéter (tipo 61 1-9) (15 x 5 x 5 mm) bajo la piel dorsal al día 0. Los reactivos prueba se inyectaron a través de la que directamente en las esponjas cada segundo día por 21 días (volumen de inyección 100 µ?). Los grupos de 2 ratonas recibieron ya sea PBS control; 10 ng/ml de factor de crecimiento fibroblástico básico (FGFb); o 10 ng/ml de bFGF + 100 µ p\\ de ectodominio MR. Los animales se sacrificaron al día 21 y las esponjas se removieron, se fijaron en 3.7% de paraformaldehído y se embebieron en parafina. Las secciones de 5 micrones se tiñeron con hematoxilina y eosina y se tomaron fotos digitales utilizando un microscopio Zeiss Axioskop 2 plus con una cámara digital Axiocam a una amplificación de 20x. Se contó el número de vasos sanguíneos que invaden a las esponjas como una medida de la angiogénesis. Existieron claras diferencias entre las esponjas a partir de las ratonas que fueron inyectadas con FGFb solo (controles) y aquellas que fueron inyectadas tanto con FGFb como con el ectodominio MR. Las diferencias fueron: a) números significativamente menores de vasos sanguíneos en las esponjas tratadas con el ectodominio MR en comparación con el control (figura 8; p=0.0014 utilizando la prueba t de Student); b) una ausencia de vasos sanguíneos muy largos a partir de las esponjas tratadas con el ectodominio MR; y c) mucha menor densidad de células fibroblastos en las esponjas tratadas con el ectodominio MR.

EJEMPLO 4 El ectodominio MR (fragmento extracelular de MR residuos 1-467) inhibe la migración de las células endoteliales vasculares primarías de humano Se llevó a cabo un ensayo de migración de célula endotelial vascular primaria de humano (HUVEC) utilizando el sistema de angiogónesis BDBioCoat™ para la migración de la célula endotelial el cual está disponible como el número de catálogo 354143 a partir de BD Biosciences, Bedford, A, EUA. Las instrucciones para utilizar este equipo se pueden encontrar en http://www.bdbiosciences.com/discovery_labware/Products/drug_discovery/ insert_systems/angiogenesis_system/pdf/Endotelial_Cell_Migration_lnstruct.p df. Este sistema utilizado un sistema de injerto en 24-multipozo y consiste de una membrana BD Falcon FluoroBlok PET con un tamaño de poro de 3 micrones revestida uniformemente en la parte superior con fibronectina. La cuantificación de la migración celular se logra mediante post-marcado de las células con el colorante fluorescente Calcein AM y midiendo la fluorescencia de las células en migración en un lector de placa para fluorescencia. La membrana FluoroBlok bloquea de manera efectiva el paso de la luz a partir de 490-700 nm a > 99% de eficiencia lo que significa que las células marcadas que no han migrado están bloqueadas para la detección. La cámara superior se sembró con 50,000 HUVEC/pozo en medio MCDB 131 suplementado con 1% de suero de ternera fetal (FCS) inactivado con calor. Las cámaras inferiores se cargaron con o sin FGFb (5 ng/ml), VEGF (10 ng/ml) y ectodominio MR (100 ng/ml) en 750 µ? de MCDB 131 + 1 % FCS. Después de 22 horas de incubación a 37°C las membranas de inserto se tiñeron con 4 µg/ml de Calcein AM (Molecular Probes) en solución salina balanceada de Hanks (HBSS) por 90 minutos. La fluorescencia en la parte inferior de la membrana se midió a longitudes de onda de excitación/emisión de 485/530 nm. Las imágenes se tomaron utilizando un microscopio Zelss Axiovert 135 con una cámara digital Axiocam a una amplificación de 0x. Se sabe que tanto bFGF como VEGF estimulan la migración de las células endoteliales (Cross & Claesson-Welsh, 2001 Trends Pharmacol Sci. 22 (4): 201-207). Como se muestra en las figuras 9A y 9B, se muestra que el ectodominio MR inhibe significativamente la migración de las células HUVEC inducida por cualquiera de FGFb o VEGF.

EJEMPLO 5 El ectodominio MR (fragmento extracelular de MR residuos 1-467) inhibe la proliferación de la célula endotelial 5 x 104 célula endoteliales vasculares primarias de humano (HUVEC) se sembraron por pozo de una placa de 6 pozos en 1.5 mi de medio de crecimiento total que contenía el tratamiento (6.25, 12.5, 25, 50 o 100 pg/ml del ectodominio MR (Robo4-Fc) o 100 µg/ml de IgG de humano), o sin tratamiento como un control. Después de cuatro días de incubación a 37°C, las células se lavaron en PBS y se separan de los pozos mediante la adición de 1 mi de solución de tripsina. Después de todas las células se han separado, 400 µ? de la suspensión celular se transfiere a 19.6 mi de regulador de pH Isoton (Beckman Coulter), y se determina el número de células en cada muestra en un contador de partículas Coulter y un analizador de tamaño (Beckman Coulter). El experimento se llevó a cabo por triplicado, y se repitió tres veces. Como se muestra en la figura 10, la incubación en la presencia de 12.5 µg/m\ del ectodominio MR disminuye la proliferación de las células HUVEC a aproximadamente 75% de los niveles control, y las concentraciones más altas del ectodominio MR tienen un fuerte efecto anti-proliferativo creciente.

EJEMPLO 6 Tratamiento de un paciente que exhibe anqiogénesis no deseable mediante la administración de un anticuerpo que se une específicamente a la región extracelular de MR Un paciente que exhibe angiogénesis no deseable se trata con infusiones intravenosas de soluciones salinas de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que se une específicamente a la región extracelular de MR. Las infusiones se administran semanalmente por un tiempo de 3 a 6 meses.

EJEMPLO 7 Tratamiento de un paciente que exhibe angiogénesis no deseable mediante la administración de la región extracelular de MR Un paciente que exhibe angiogénesis no deseable se trata con infusiones intravenosas de soluciones salinas de una composición farmacéutica que comprende el ectodominio MR. Las infusiones se administran semanalmente, típicamente por 3 a 6 meses.

LISTADO DE SECUENCIA <110> CANCER RESEARCH TECHNOLOGY LIMITED <120> ANTICUERPOS, POLIPEPTIDOS Y USOS DE LOS MISMOS <130> CRTV/P29579PC <140> PCT/GB2003/005059 <141> 2003-11-20 <150> GB 0227080.9 <151> 2002-11-20 <150> GB 0321401.2 <151> 2003-09-12 <160> 4S <170> Patente en versión 3.1 <210> 1 <211> 3870 < 12> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 gcggccgcga attcggcacg agcagcagga caaagtgctc gggacaagga catagggctg eo agagtagcca tgggctctgg aggagacagc ctcctggggg gcaggggttc cctgcctctg 120 ctgctcctgc tcatcatggg aggcatggct caggactccc cgccccagat cctagtccac 180 ccccaggacc agctgttcca gggccctggc cctgccagga tgagctgcca agcctcaggc 240 cagccacctc ccaccatccg ctggttgctg aatgggcagc ccctgagcat ggtgccccca 300 gacccacacc acctcctgcc tgatgggacc cttctgctgc tacagccccc tgcccgggga 3S0 catgcccacg atggccaggc cctgtccaca gacctgggtg tctacacatg tgaggccagc 420 aaccggcttg gcacggcagt cagcagaggc gctcggctgt ctgtggctgt cctccgggag 480 gatttccaga tccagcctcg ggacatggtg gctgtggtgg gtgagcagtt tactctggaa 540 tgtgggccgc cctggggcca cccagagccc acagtctcat ggtggaaaga tgggaaaccc eo o ctggccctcc agcccggaag gcacacagtg tccggggggt ccctgctgat ggcaagagca 660 gagaagagtg acgaagggac ctacatgtgt gtggccacca acagcgcagg acatagggag 720 agccgcgcag cccgggtttc catccaggag ccccaggact acacggagcc tgtggagctt 780 ctggctgtgc gaattcagct ggaaaatgtg acactgctga acccggatcc tgcagagggc 840 cccaagccta gaccggcggt gtggctcagc tggaaggtca gtggccctgc tgcgcctgcc 900 caatcttaca cggccttgtt caggacccag actgccccgg gaggccaggg agctccgtgg 960 gcagaggagc tgctggccgg ctggcagagc gcagagcttg gaggcctcca ctggggccaa 1020 5 gactacgagt tcaaagtgag accatcctct ggccgggctc gaggccctga cagcaacgtg 1080 ctgctcctga ggctgccgga aaaagtgccc agtgccccac ctcaggaagt gactctaaag 1140 cctggcaatg gcactgtctt tgtgagctgg gtcccaccac ctgctgaaaa ccacaatggc 1200 atcatccgtg gctaccaggt ctggagcctg ggcaacacat cactgccacc agccaactgg 1260 actgtagttg gtgagcagac ccagctggaa atcgccaccc atatgccagg ctcctactgc 1320 gtgcaagtgg ctgcagtcac tggtgctgga gctggggagc ccagtagacc tgtctgcctc 1380 Q cttttagagc aggccatgga gcgagccacc caagaaccca gtgagcatgg tccctggacc 1440 ctggagcagc tgagggctac cttgaagcgg cctgaggtca ttgccacctg cggtgttgca 1500 ctctggctgc tgcttctggg caccgccgtg tgtatccacc gccggcgccg agctagggtg 1560 cacctgggcc caggtctgta cagatatacc agtgaggatg ccatcctaaa acacaggatg 1620 gatcacagtg actcccagtg gttggcagac acttggcgtt ccacctctgg ctctcgggac 1680 ctgagcagca gcagcagcct cagcagtcgg ctgggggcgg atgcccggga cccactagac 1740 ^ tgtcgtcgct ccttgctctc ctgggactcc cgaagccccg gcgtgcccct gcttccagac 1800 accagcactt tttatggctc cctcatcgct gagctgccct ccagtacccc agccaggcca 1860 agtccccagg tcccagctgt caggcgcctc ccaccccagc tggcccagct ctccagcccc 1920 tgttccagct cagacagcct ctgcagccgc aggggactct cttctccccg cttgtctctg 1980 gcccctgcag aggcttggaa ggccaaaaag aagcaggagc tgcagcatgc caacagttcc 2040 ccactgctcc ggggcagcca ctccttggag ctccgggcct gtgagttagg aaatagaggt 2100 tccaagaacc tttcccaaag cccaggagct gtgccccaag ctctggttgc ctggcgggcc 2160 ctgggaccga aactcctcag ctcctcaaat gagctggtta ctcgtcatct ccctccagca 2220 cccctctttc ctcatgaaac tcccccaact cagagtcaac agacccagcc tccggtggca 2280 ccacaggctc cctcctccat cctgctgcca gcagccccca tccccatcct tagcccctgc 2340 agtcccccta gcccccaggc ctcttccctc tctggcccca gcccagcttc cagtcgcctg 2400 tccagctcct cactgtcatc cctgggggag gatcaagaca gcgtgctgac ccctgaggag 2460 gtagccctgt gcttggaact cagtgagggt gaggagactc ccaggaacag cgtctctccc 2520 atgccaaggg ctccttcacc ccccaccacc tatgggtaca tcagcgtccc aacagcctca 2580 gagttcacgg acatgggcag gactggagga ggggtggggc ccaagggggg agtcttgctg 2640 tgcccacctc ggccctgcct cacccccacc cccagcgagg gctccttagc caatggttgg 2700 ggctcagcct ctgaggacaa tgccgccagc gccagagcca gccttgtcag ctcctccgat 2760 ggctccttcc tcgctgatgc tcactttgcc cgggccctgg cagtggctgt ggatagcttt 2820 ggtttcggtc tagagcccag ggaggcagac tgcgtcttca tagatgcctc atcacctccc 2880 tccccacggg atgagatctt cctgaccccc aacctctccc tgcccctgtg ggagtggagg 2940 ccagactggt tggaagacat ggaggtcagc cacacccagc ggctgggaag ggggatgcct 3000 ccctggcccc ctgactctca gatctcttcc cagagaagtc agctccactg tcgtatgccc 3060 aaggctggtg cttctcctgt agattactcc tgaaccgtgt ccctgagact tcccagacgg 3120 gaatcagaac cacttctcct gtccacccac aagacctggg ctgtggtgtg tgggtcttgg 3180 cctgtgtttc tctgcagctg gggtccacct tcccaagcct ccagagagtt ctccctccac 3240 gattgtgaaa acaaatgaaa acaaaattag agcaaagctg acctggagcc ctcagggagc 3300 aaaacatcat ctccacctga ctcctagcca ctgctttctc ctctgtgcca tccactccca 3360 ccaccaggtt gttttggcct gaggagcagc cctgcctgct gctcttcccc caccatttgg 3420 atcacaggaa gtggaggagc cagaggtgcc tttgtggagg acagcagtgg ctgctgggag 3480 a999ctgtgg aggaaggagc ttctcggagc cccctctcag ccttacctgg gcccctcctc 3540 tagagaagag ctcaactctc tcccaacctc accatggaaa gaaaataatt atgaatgcca 3600 ctgaggcact gaggccctac ctcatgccaa acaaagggtt caaggctggg tctagcgagg 3660 atgctgaagg aagggaggta tgagaccgta ggtcaaaagc accatcctcg tactgttgtc 3720 actatgagct taagaaattt gataccataa aatggtaaag acttgaaaaa aaaaaaaaaa 3780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3870 <210> 2 <211> 1007 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met 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Asp Tyr Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Polinucleótido que codifica el Ab M 7 de la CD <400> 18 agtgccagct caagtgtaag ttacatgtac 30 <210> 19 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Polinucleótido gue codifica el Ab MR7 de la CDR <400> 19 tctcacatcc aacctggctt ct 22 <210> 20 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Polinucleótido que codifica el Ab MR7 de la CDR <400> 20 cagcagtgga gtagtaaccc actcacg 27 <210> 21 <211> 318 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Polinucleótido gue codifica el Ab MR7 de la cadena <400> 21 caaattgttc tcacccagtc tccagcactc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccagca gaagccaaga 120 tcctccccca aaccctggat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cactcacgtt cggtgctggg 300 accaagctgg agctgaaa 318 <210> 22 <211> 15 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Polinucleótido que codifica el Ab MR7 de la CDR <400> 22 gactacaacc tgaac 15 <210> 23 <211> 48 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Polinucleótido que codifica el Ab MR7 de la CDR <400> 23 gtaattaatc caaactatgg tactagttac aatcagaagt tcaagggc 48 <210> 24 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Polinucleótido que codifica el Ab MR7 de la CDR <400> 24 gggagggatt acttcggcta c 21 <210> 25 <211> 345 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Polinucleótido que codifica el Ab MR7 de la cadena <400> 25 caggtcaagc tgcaggagtc aggacctgag ctggtgaagc ctggcgcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcactcact gactacaacc tgaactgggt gaagcagaac 120 aaaggaaaga gccttgagtg gattggagta attaatccaa actatggtac tagttacaat 180 cagaagttca agggcaaggc cacattgact gtagaccaat cttccagcac aacctacatg 240 cagctcaaca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag agggagggat 300 tacttcggct actggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca 345 <210> 25 <211> 345 <212> ADM <213> Artificial <220> <223> Polinucleótido que codifica el Ab MR7 de la cadena <400> 26 caggtcaaac tgcaggagtc aggacctgag ctggtgaagc ctggcgcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcactcact gactacaacc tgaactgggt gaagcagaac 120 aaaggaaaga gccttgagtg gattggagta attaatccaa actatggtac tagttacaat 180 cagaagttca agggcaaggc cacattgact gtagaccaat cttccagcac aacctacatg 240 cagctcaaca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag agggagggat 300 tacttcggct actggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca 345 <210> 27 <211> 345 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Polinucleótido que codifica el Ab MR7 de la cadena <400> 27 caggtccaac tgcaggagtc aggacctgag ctggtgaagc ctggcgcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcactcact gactacaacc tgaactgggt gaagcagaac 120 aaaggaaaga gccttgagtg gattggagta attaatccaa actatggtac tagttacaat 180 cagaagttca agggcaaggc cacattgact gtagaccaat cttccagcac aacctacatg 240 cagctcaaca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag agggagggat tacttcggct actggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca <210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Leu Leu Gln Pro Pro Ala Arg Gly His Ala His Asp Gly Gln Ala Leu 1 5 10 15 Ser Thr Asp Leu 20 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Leu Ser Gln Ser Pro Gly Ala Val Pro Gln Ala Leu Val Ala Trp Arg 1 5 10 15 Ala <210> 30 <211> 1459 <212> ADW <213> Artificial <220> <223> Inserto Plasmídico H10 <400> 30 aagcttaaag tgctcgggac aaggacatag ggctgagagt agccatgggc tctggaggag 60 acagcctcct ggggggcagg ggttccctgc ctctgctgct cctgctcatc atgggaggca 120 tggctcagga ctccccgccc cagatcctag tccaccccca ggaccagctg ttccagggcc 180 ctggccctgc caggatgagc tgccaagcct caggccagcc acctcccacc atccgctggt 240 tgctgaatgg gcagcccctg agcatggtgc ccccagaccc acaccacctc ctgcctgatg 300 ggacccttct gctgctacag ccccctgccc ggggacatgc ccacgatggc caggccctgt 360 ccacagacct gggtgtctac acatgtgagg ccagcaaccg gcttggcacg gcagtcagca 420 gaggcgctcg gctgtctgtg gctgtcctcc gggaggattt ccagatccag cctcgggaca 480 tggtggctgt ggtgggtgag cagtttactc tggaatgtgg gccgccctgg ggccacccag 540 agcccacagt ctcatggtgg aaagatggga aacccctggc cctccagccc ggaaggcaca 600 5 cagtgtccgg ggggtccctg ctgatggcaa gagcagagaa gagtgacgaa gggacctaca 660 tgtgtgtggc caccaacagc gcaggacata gggagagccg cgcagcccgg gtttccatcc 720 aggagcccca ggactacacg gagcctgtgg agcttctggc tgtgcgaatt cagctggaaa 780 atgtgacact gctgaacccg gatcctgcag agggccccaa gcctagaccg gcggtgtggc 840 tcagctggaa ggtcagtggc cctgctgcgc ctgcccaatc ttacacggcc ttgttcagga 900 cccagactgc cccgggaggc cagggagctc cgtgggcaga ggagctgctg gccggctggc 960 Q agagcgcaga gcttggaggc ctccactggg gccaagacta cgagttcaaa gtgagaccat 1020 cctctggccg ggctcgaggc cctgacagca acgtgctgct cctgaggctg ccggaaaaag 1080 tgcccagtgc cccacctcag gaagtgactc taaagcctgg caatggcact gtctttgtga 1140 gctgggtccc accacctgct gaaaaccaca atggcatcat ccgtggctac caggtctgga 1200 gcctgggcaa cacatcactg ccaccagcca actggactgt agttggtgag cagacccagc 1260 tggaaatcgc cacccatatg ccaggctcct actgcgtgca agtggctgca gtcactggtg 1320 5 ctggagctgg ggagcccagt agacctgtct gcctcctttt agagcaggcc atggagcgag 1380 ccacccaaga acccagtgag catggtccct ggaccctgga gcagctgagg gctaccttga 1440 agcggtagta agcggccgc 1453 <210> 31 <211> 1533 <212> ADKT <213> Artificial <220> :0 <223> vector pIG <400> 31 aagcttgata tcgaattctg cagcccgggg gatccggagg gagggtgtct gctggaagca 60 ggctcagcgc tcctgcctgg acgcatcccg gctatgcagc cccagtccag ggcagcaagg 120 caggccccgt ctgcctcttc acccggaggc ctctgcccgc cccactcatg ctcagggaga 180 gggtcttctg gctttttccc caggctctgg gcaggcacag gctaggtgcc cctaacccag 240 gccctgcaca caaaggggca ggtgctgggc tcagacctgc caagagccat atccgggagg 300 accctgcccc tgacctaagc ccaccccaaa ggccaaactc tccactccct cagctcggac 360 accttctctc ctcccagatt ccagtaactc ccaatcttct ctctgcagag cccaaatctt 420 gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc caggtaagcc agcccaggcc tcgccctcca 480 gctcaaggcg ggacaggtgc cctagagtag cctgcatcca gggacaggcc ccagccgggt 540 gctgacacgt ccacctccat ctcttcctca gcacctcaac tcctgggggg accgtcagtc 600 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 660 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 720 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 780 cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 840 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 900 ggtgggaccc gtggggtgcg agggccacat ggacagaggc cggctcggcc caccctctgc 960 cctgagagtg accgctgtac caacctctgt cctacagggc agccccgaga accacaggtg 1020 tacaccctgc ccccatcccg ccatgacctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 1080 gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1140 aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1200 aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1260 catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1320 gtgcgacggc cggcaagccc cgctccccgg gctctcgcgg tcgcacgacc atgcttggca 1380 cgtaccccct gtacatactt cccgggcgcc cagcatggaa ataaagcacc cagcgctgcc 1440 ctgggcccct gcgagactgt gatggttctt tccacgggtc accccgagtc tgaggcctga 1500 gtggcatgag ggaggcagcg gccgcgactc tag 1533 <210> 32 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador oligonucleótido 5' de la cadena ligera Kappa <400> 32 actagtcgac atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg 40 <210> 33 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador oligonucleótido 5' de la cadena ligera Kappa <400> 33 actagtcgac atggagwcag acacactcct gytatgggt 39 <210> 34 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador oligonucleótido 5' de la cadena ligera Kappa <400> 34 actagtcgac atgagtgtgg ctcactcagg tcctggsgtt g 41 <210> 35 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador oligonucleótido 5' de la cadena ligera Kappa <400> 35 actagtcgac atgaggrccc ctgctcagwt tyttggmwtc t 41 <210> 36 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador oligonucleótido 5' de la cadena ligera appa <400> 36 actagtcgac atggatttwc aggtgcagat twtcagcttc 40 <210> 37 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador oligonucleótido 5' de la cadena ligera Kappa <400> 37 actagtcgac atgaggtkcc ytgytcagyt yctgrgg 37 <210> 38 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador oligonucleótido 5' de la cadena ligera Kappa <400> 38 actagtcgac atgggcwtca agatggagtc acakwyycwg g 41 <210> 39 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador oligonucleótido 5' de la cadena ligera Kappa <400> 39 actagtcgac atgtggggay cttkttyamm tttttcaatt g 41 <210> 40 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador oligonucleótido 5' de la cadena ligera Kappa <400> 40 actagtcgac atggtrtccw casctcagtt ccttg 35 <210> 41 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador oligonucleótido 5' de la cadena ligera Kapp. <400> 41 actagtcgac atgtatatat gtttgttgtc tatttct 37 <210> 42 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador oligonucleótido 5" de la cadena ligera Kappa <400> 42 actagtcgac atggaagccc catgctcagc ttctcttcc 39 <210> 43 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador oligonucleótido 3' de la cadena ligera Kappa <400> 43 gtttgatcta gagcttggtc ce 22 <210> 44 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador oligonucleótido 3' de la región constante de la cadena ligera appa <400> 44 ttggagggcg ttatccacct 20 <210> 45 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial <220> <2 3 iniciador 5' de la cadena pe, <400> 45 atcggatcca ggtsmarctg cagsagtcwg g 31 <210> 46 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> iniciador 3 ' de la cadena pesada <400> 4S ctcgaattct gaggagacgg tgaccgtggt cccttggccc c 41

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- El uso de un anticuerpo que se une selectivamente a la región extracelular (residuos 1-467, SEQ ID NO: 3) de magic roundabout de humano (MR) en la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis. 2. - Un método in vitro para inhibir la angiogénesis que comprende la administración de un anticuerpo que se une selectivamente a la región extracelular de MR al tejido o células in vitro. 3. - El uso que se reclama en la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se une selectivamente a la región Ig de MR (residuos 46-209, SEQ ID NO: 4). 4.- El uso que se reclama en la reivindicación 3, en donde el anticuerpo se une selectivamente a la región IgA de MR (residuos 46-116, SEQ ID NO: 5). 5. - El uso que se reclama en la reivindicación 3, en donde el anticuerpo se une selectivamente a la región IgB de MR (residuos 151-209, SEQ ID NO: 6). 6. - El uso que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 5, en donde el anticuerpo tiene al menos una región variable en la cadena ligera que incorpora las siguientes CDRs: CDR1: S A S S S V S Y M Y (SEQ ID NO: 9); CDR2: L T S N L A S (SEQ ID NO: 10); CDR3: Q Q W S S N P L T (SEQ ID NO: 11). 7. - El uso que se reclama en la reivindicación 6, en donde el anticuerpo tiene al menos una región variable en la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos QIVLTQSPALMSASPGE KVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNL ASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQ WSSNPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 12). 8. - El uso que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 5, en donde el anticuerpo tiene al menos una región variable en la cadena pesada que incorpora las siguientes CDRs: CDR1: D Y N L N (SEQ ID NO: 13); CDR2: VINPNYGTTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 14); CDR3: G R D Y F G Y (SEQ ID NO: 15). 9. - El uso que se reclama en la reivindicación 8, en donde el anticuerpo tiene al menos una región variable en la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos Q V K/Q LQESGPELVKPGA SVKISCKASGYSLTDYNLNWVKQNKGKSLEWIGVINP NYGTTSYNQKFKGKATLTVDQSSSTTYMQLNSLTSED SAVYYCARGRDYFGYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 16-17). 10.- El uso que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 5, en donde el anticuerpo tiene ai menos una región variable en la cadena ligera como se define en la reivindicación 6 ó 7 y al menos una región variable en la cadena pesada como se define en la reivindicación 8 ó 9. 11. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el anticuerpo se une selectivamente a la región Ig de MR (residuos 46-209, SEQ ID NO: 4). 12. - El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque el anticuerpo se une selectivamente a la región IgA de MR (residuos 46-1 6, SEQ ID NO: 5). 13. - El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque el anticuerpo se une selectivamente a la región IgB de MR (residuos 151-209, SEQ ID NO: 6). 14. - El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2 y 11 a 13, caracterizado además porque el anticuerpo tiene al menos una región variable en la cadena ligera que incorpora las siguientes CDRs: CDR1: SAS S SVSYM Y (SEQ ID NO: 9); CDR2: L T S N L A S (SEQ ID NO: 10); CDR3: QQWSSNPLT (SEQ ID NO: 11 ). 15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el anticuerpo tiene al menos una región variable en la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos Q I V L T Q SPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPRSS PKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEA EDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 12). 16. - El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2 y 11 a 13, caracterizado además porque el anticuerpo tiene al menos una región variable en la cadena pesada que incorpora las siguientes CDRs: CDR1: D Y N L N (SEQ ID NO: 13); CDR2: V I N P N Y G T TSYNQKFKG (SEQ ID NO: 14); CDR3: G R D Y F G Y (SEQ ID NO: 15). 17. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el anticuerpo tiene al menos una región variable en la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos Q V K/Q L QESGPELVKPGASVKISCKASGYSLTDYNLNWVKQN KGKSLEWIGVINPNYGTTSYNQKFKGKATLTVDQSSS TTYMQLNSLTSEDSAVYYCARGRDYFGYWGQGTTVT VS S (SEQ ID NO: 16-17). 18. - El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2 y 11 a 13, caracterizado además porque el anticuerpo tiene al menos una región variable en la cadena ligera como se define en la reivindicación 14 ó 15 y al menos una región variable en la cadena pesada" como se define en la reivindicación 16 ó 17. 19 - El uso de un polinucleótido que codifica un anticuerpo como el que se define en cualesquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 10 en la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis. 20.- Un método in vitro para inhibir la angiogénesis que comprende la administración de un polinucleótido que codifica un anticuerpo como el que se define en cualesquiera de las reivindicaciones 2 y 11 a 18 a un tejido o células in vitro. 21. - Un anticuerpo que contiene las secuencias de aminoácidos i) a iii), las secuencias de aminoácidos iv) a vi), o preferiblemente las secuencias de aminoácidos i) a vi): ¡)SASSSVSYMY (SEQ ID NO: 9); ii) L T S N L A S (SEQ ID NO: 10); ¡ii) QQWSSNPLT (SEQ ID NO: 11): iv) D Y N L N (SEQ ID NO: 13); v) V I N P N Y G T T S Y N Q K F K G (SEQ ID NO: 14); vi) G R D Y F G Y (SEQ ID NO: 15). 22. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado además porque tiene al menos una región variable en la cadena ligera que incorpora las siguientes CDRs: CDR1 :SASSSVSYMY (SEQ ID NO: 9); CDR2: L T S N L A S (SEQ ID NO: 10); CDR3: QQWSSNPLT (SEQ ID NO: 11). 23. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque tiene al menos una región variable en la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos QIVLTQSPALMSA SPGEKVT TCSASSSVSYMYWYQQKPRSSPKPWIYL TSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLT1SSMEAEDAATYY CQQWSSNPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 12). 24.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado además porque tiene al menos una región variable en la cadena pesada que incorpora las siguientes CDRs: CDR1: D Y N L N (SEQ ID NO: 13); CDR2: VINPNYGTTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 14); CDR3: G R D Y F G Y (SEQ IDNO:15). 25.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque tiene al menos una región variable en la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos Q V K/Q L Q E S G P E LVKPGASVKISCKASGYSLTDYNLNWVKQNKGKSLE WIGVINPNYGTTSYNQKFKGKATLTVDQSSSTTYMQL NSLTS EDSAVYYCARGRDYFGYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NOs: 16-17). 26.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado además porque tiene al menos una región variable en la cadena ligera de conformidad con la reivindicación 22 ó 23 y al menos una región variable en la cadena pesada de conformidad con la reivindicación 24 ó 25. 27. - Un anticuerpo que se une selectivamente al epítope MR unido por un anticuerpo que tiene al menos una región variable en la cadena ligera kappa de conformidad con la reivindicación 23 y al menos una región variable en la cadena pesada de conformidad con la reivindicación 25. 28. - Un polinucleótido que codifica un anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 21 a 27. 29.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 28 caracterizado además porque comprende una o más de las secuencias nucleotídicas: i) AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC (SEQ ID NO: 18); ¡i) TCT CAC ATC CAA CCT GGC TTC T (SEQ ID NO: 19); iii) CAG CAG TGG AGT AGT AAC CCA CTC ACG (SEQ ID NO: 20); iv) GAC TAC AAC CTG AAC (SEQ ID NO: 22); v) GTA ATT AAT CCA AAC TAT GGT ACT AGT TAC AAT CAG AAG TTC AAG GGC (SEQ ID NO: 23), y vi) GGG AGG GAT TAC TTC GGC TAC (SEQ ID NO: 24) 30.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 28 ó 29, caracterizado además porque comprende la secuencia nucleotídica CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA GCA CTC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA AGA TCC TCC CCC AAA CCC TGG ATT TAT CTC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGC ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT AGT AAC CCA CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA (SEQ ID NO: 21). 31.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 28 ó 29, caracterizado además porque comprende la secuencia nucleotídica CAG GTC AAG (o A/CAA) CTG CAG GAG TCA GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGC GCT TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC TCA CTC ACT GAC TAC AAC CTG AAC TGG GTG AAG CAG AAC AAA GGA AAG AGC CTT GAG TGG ATT GGA GTA ATT AAT CCA AAC TAT GGT ACT AGT TAC AAT CAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GTA GAC CAA TCT TCC AGC ACA ACC TAC ATG CAG CTC AAC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC TAT TAC TGT GCA AGA GGG AGG GAT TAC TTC GGC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA (SEQ ID NOs: 25-27). 32. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 28 ó 29, caracterizado además porque comprende la secuencia nucleotídica como se define en la reivindicación 30 y la secuencia nucleotídica como se define en la reivindicación 31. 33. - Un anticuerpo que se une selectivamente a la región Ig de MR (residuos 46-209, SEQ ID NO: 4) pero no se une selectivamente a los péptidos LLQPPARGHAHDGQALSTDL (SEQ ID NO: 28) o LSQSPGAVPQALVAWRA (SEQ ID NO: 29). 34. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque se une selectivamente a la región IgA de MR (residuos 46- 16, SEQ ID NO: 5) pero no se une selectivamente al péptido LLQPPARGHAHDGQALSTDL (SEQ ID NO: 28), o que se une selectivamente a la región IgB de MR (residuos 151-209, SEQ ID NO: 6) pero no se une selectivamente al péptido LSQSPGAVPQALVAWRA (SEQ ID NO: 29). 35. - Un polinucleótido que codifica el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 33 ó 34. 36. - Un compuesto que comprende un anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 21 a 27 ó 33 a 34 y una porción directamente o indirectamente citotóxica. 37. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque la porción citotóxica se selecciona a partir de un agente quimioterapéutico directamente citotóxico, un polipéptido directamente citotóxico, una porción la cual es capaz de convertir un profármaco relativamente no tóxico hacia un fármaco citotóxico, un radiosensibilizador, un ácido nucléico directamente citotóxico, una molécula de ácido nucléico que codifica a un polipéptido directamente o indirectamente citotóxico, una molécula de ácido nucléico que codifica a un polipéptido terapéutico, o un átomo radioactivo. 38. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el átomo radioactivo es cualquiera de fosforó32, yodo-125, yodo-131, indio-111 , renio-186, renio-188 o itrio-90. 39. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 36 ó 37, caracterizado además porque el anticuerpo y la porción citotóxica son polipéptidos los cuales están fusionados. 40. - Un polinucleótido que codifica el compuesto de conformidad con la reivindicación 39. 41. - Un compuesto que comprende un anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 21 a 27 ó 33 a 34 y una porción fácilmente detectable. 42. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque la porción fácilmente detectable comprende una cantidad adecuada de cualquiera de yodo-123, yodo-131 , indio-111 , flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno- 7, tecn¡tio-99m, gadolinio, manganeso o hierro. 43. - Un vector que comprende el polinucleótido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 28 a 32, 35 ó 40. 44. - Una célula hospedera que comprende el polinucleótido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 28 a 32, 35 ó 40, o el vector de conformidad con la reivindicación 43. 45. - Una línea de célula hospedera estable que produce un anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 21 a 27 ó 33 a 34 o un compuesto de conformidad con la reivindicación 39 que resulta de la incorporación en la línea celular de un polinucleótido exógeno de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 28 a 32, 35 ó 40, o un vector de conformidad con la reivindicación 43. 46. - Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 21 a 27 ó 33 a 34, o un polinucleótido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 28 a 32, 33 ó 40, o un compuesto de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 36 a 39 ó 41 a 42, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 47. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada además porque es adecuada para administración a un paciente mediante inyección. 48. - Un anticuerpo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 21 a 27 ó 33 a 34, o un polinucleótido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 28 a 32, 35 ó 40, o un compuesto de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 36 a 39 ó 41 a 42, para su uso en medicina. 49. - El uso de un anticuerpo como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 21 a 27 ó 33 a 34, o un polinucleótido como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 29 a 32, 35 ó 40, o un compuesto como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 36 a 39 ó 41 a 42, en la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis. 50. - Un método in vitro para inhibir la angiogénesis que comprende la administración de un anticuerpo como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 21 a 27 ó 33 a 34, o un polinucleótido como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 28 a 32, 35 ó 40, o un compuesto como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 36 a 39 ó 41 a 42, a un tejido o células in vitro. 51.- Un método para producir un anticuerpo como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 21 a 27 ó 33 a 34, o un compuesto como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 39, dicho método está caracterizado porque comprende expresar un polinucleótido como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 28 a 32, 35 ó 40, o cultivar una línea de célula hospedera estable como la que se reclama en la reivindicación 45. 52.- El uso de un anticuerpo que se une selectivamente a la región extracelular de MR en la preparación de un medicamento para combatir una enfermedad o condición seleccionada a partir de tumores/cáncer, psoriasis, aterosclerosis, menorragia, endometriosis, artritis (tanto inflamatoria como reumatoide), degeneración macular, enfermedad de Paget, retinopatía y sus complicaciones vasculares (incluyendo retinopatía proliferativa y de premadurez, y diabética), proliferaciones vasculares benignas, fibrosis, obesidad e inflamación. 53. - El uso del ectodominio MR o un fragmento del mismo que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial, o un polinucleótido que codifica el ectodominio MR o un fragmento del mismo que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial, en la preparación de un medicamento para combatir una enfermedad o condición que implica la migración y/o proliferación no deseada, no deseable o inapropiada de célula endotelial. 54. - El uso que se reclama en la reivindicación 53, en donde la enfermedad o condición implica la migración y/o proliferación no deseada, no deseable o inapropiada de una célula endotelial seleccionada a partir de tumores/cáncer, psoriasis, aterosclerosis, menorragia, endometriosis, artritis (tanto inflamatoria como reumatoide), degeneración macular, enfermedad de Paget, retinopatía y sus complicaciones vasculares (incluyendo retinopatía proliferativa y de premadurez, y diabética), proliferaciones vasculares benignas, fibrosis, obesidad e inflamación. 55. - Un método in vitro para inhibir la migración y/o proliferación de la célula endotelial que comprende la administración del ectodominio MR o un fragmento del mismo que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial, un polinucleótido que codifica el ectodominio MR o un fragmento del mismo que inhibe la migración y/o proliferación de la célula endotelial, a un tejido o células in vitro. 56.- El uso del ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la angiogénesis, en la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis. 57. - El uso del ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la angiogénesis, en la preparación de un medicamento para combatir una enfermedad o condición seleccionada a partir de tumores/cáncer, psoriasis, aterosclerosis, menorragia, endometriosis, artritis (tanto inflamatoria como reumatoide), degeneración macular, enfermedad de Paget, retinopatía y sus complicaciones vasculares (incluyendo retinopatía proliferativa y de premadurez, y diabética), proliferaciones vasculares benignas, fibrosis, obesidad e inflamación. 58. - Un método in vitro para inhibir la angiogénesis que comprende la administración del ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la angiogénesis, a un tejido o células in vitro. 59. - El uso de un polinucleótido que codifica el ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la angiogénesis, en la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis. 60. - Un método in vitro para inhibir la angiogénesis que comprende la administración de un polinucleótido que codifica el ectodominio MR, o un fragmento del mismo que inhibe la angiogénesis, a un tejido o células in vitro.