KR20220058554A

KR20220058554A - 오스테오폰틴에 대한 치료용 항체

Info

Publication number: KR20220058554A
Application number: KR1020227007828A
Authority: KR
Inventors: 티모시 마일스; 로렌스 엘. 케이. 룽; 마이클 제이. 모저
Original assignee: 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티; 더 유나이티드 스테이츠 거번먼트 애즈 리프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 베테랑스 어페어즈
Priority date: 2019-08-09
Filing date: 2020-08-07
Publication date: 2022-05-09
Also published as: CN114867746A; CA3146092A1; EP4010369A4; US20220324956A1; WO2021030209A1; EP4010369A1; JP2022543657A; AU2020331301A1

Abstract

본 발명은 오스테오폰틴에 특이적인 치료용 항체 및 오스테오폰틴 관련 질환을 치료하기 위해 이를 사용하는 방법을 제공한다. 상세하게는, 오스테오폰틴의 트롬빈 절단을 억제하거나 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 단편의 활성을 차단하는 항체 또는 그 항원-결합 단편을 제공한다. 추가적으로, 항체 접합체 및 항체 또는 항체 접합체를 포함하는 제약 조성물 또는 제제 뿐만 아니라 항체, 접합체 또는 제제를 포함하는 키트를 제공한다.

Description

오스테오폰틴에 대한 치료적 항체

본 발명은 오스테오폰틴에 특이적인 치료용 항체 및 오스테오폰틴 관련 질환을 치료하기 위해 이를 사용하는 방법을 제공한다.

오스테오폰틴(Osteopontin: OPN)은 광범위한 인테그린에 결합하는 고도로 보존된 RGD 도메인을 가진 모세포 다기능 단백질이다. 쥐의 Arg153(인간의 Arg168)에서 트롬빈 절단은 OPN-Arg(OPN-R) 및 OPN-C-말단 단편(OPN-CTF)을 생성한다. C-말단에 SVVYGLR(서열번호 3)이 있는 OPN-R은 전장 OPN이 결합하지 않는 인테그린의 서브세트(α4βi 및 α9βi)에 결합한다. OPN-R 단편의 생리학적 기능은 세포 접착, 이동 및 생존을 촉진하는 면역 조절제(immune modulator)로서의 기능을 포함하는 것으로 생각된다(Kahles F. et al. (2014) Mol. Metab. 3:384). OPN-CTF 단편의 역할은 깊이 연구되지 않았지만 케모카인에 대한 반응 시 그 주화성(chemotaxis)을 촉진하는 수지상 세포와 상호작용하는 것으로 나타났다(ShaoZ. et al. (2014) J. Biol. Chem. 289:27146). OPN-R은 류마티스 관절염과 같은 염증 질환과 관련이 있지만(Song JJ. et. al. (2011) J. Clin. Invest. 121:3517) 암에서의 기능은 아직 알려져 있지 않다(Castello LM. et. al. (2017) Mediators Inflamm. 2017:4049098). 카르복시펩티다아제 B2(CPB2) 또는 카르복시펩티다아제 N(CPN)은 OPN-R에서 C-말단 아르기닌을 제거함으로써 이를 OPN-Leu(OPN-L)로 전환하여 SVVYGLR(서열번호 3) 결합 모티프에 대한 인테그린 결합을 억제한다(Myles T. et al. (2003) J Biol Chem. 278(51):51059-51067, Shao Z. et. al. (2014) J. Biol. Chem. 289:27146). 류마티스 관절염 환자의 활액 샘플에서 상승된 OPN-R 및 OPN-L이 관찰되었지만 골관절염 또는 건선성 관절염 환자만큼 상승한 수준은 아니었다(Sharif S. et. al. (2009) Arthritis Rheum 60:2902). OPN-CTF의 기능은 OPN-CTF에 대한 항체가 예방 효과가 있음을 시사하는 쥐 실험 자가면역 뇌염(EAE) 모델에서도 입증된 바 있다(Clemente N. et. al. (2017) Front. Immunol. 8:321).

개요

오스테오폰틴에 특이적인 치료용 항체 및 오스테오폰틴 관련 질환을 치료하기 위해 이를 사용하는 방법을 제공한다, 상세하게는, 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 또는 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 단편과 인테그린 및/또는 기타 세포 수용체의 상호작용을 억제하는 항체는 염증, 심장비대증, 심근섬유증 및 흑색종, 교모세포종, 난소암, 유방암, 폐암 등의 오스테오폰틴 과발현 암과 같은 오스테오폰틴 관련 질환을 치료하는 데 효과적이다.

일 측면에서, 오스테오폰틴 또는 그 트롬빈 절단 단편에 특이적으로 결합하는 단리 항체 또는 그 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 항체는 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 또는 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 단편에 대한 인테그린 결합을 억제한다. 특정 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 OPN-R 단편 또는 OPN-CTF 단편에 특이적으로 결합한다. 특정 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 오스테오폰틴의 Arg168을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 1-7, 서열번호 9-12 및 서열번호 47로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 구성된 오스테오폰틴 펩티드에 특이적으로 결합한다.

특정 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역(heavy chain complementarity-determining region) 1(CDR-H1), 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3), 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(light chain) 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 일부 실시예들에서, 항체 또는 그 항원 결합 단편은 서열번호 14 또는 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성과 같이 범위 내 임의의 동일성 백분율을 포함하여 그에 대해 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 포함한다. 일부 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 16 또는 서열번호 20의 아미노산 서열, 또는 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성과 같이 그 범위 내의 임의의 퍼센트 동일성을 포함하여 그에 대해 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함한다.

특정 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3), 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 일부 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 22의 아미노산 서열 또는 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성과 같이 범위 내 임의의 동일성 백분율을 포함하여 그에 대해 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 포함한다. 일부 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 24의 아미노산 서열 또는 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성과 같이 범위 내 임의의 동일성 백분율을 포함하여 그에 대해 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함한다.

특정 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3), 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2), 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 일부 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 26의 아미노산 서열 또는 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성과 같이 범위 내 임의의 동일성 백분율을 포함하여 그에 대해 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 포함한다. 일부 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 28의 아미노산 서열 또는 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성과 같이 범위 내 임의의 동일성 백분율을 포함하여 그에 대해 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함한다.

특정 실시예들에서, 항체는 단클론 항체, 다클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 나노바디, 이중특이성 항체, 이중특이성 T 세포 결합 항체, 삼중특이성 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, Fv 단편, 또는 scFv 단편이다.

또 다른 측면에서, 오스테오폰틴 관련 질환을 치료하기 위한 조성물이 제공되며, 본 명세서에 기재한 바, 오스테오폰틴 또는 그 트롬빈 절단 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 항원-결합 단편으로 이루어진 조성물로, 여기서 항체 또는 그 항원 결합 단편은 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 또는 인테그린이 트롬빈 절단 단편에 결합하는 것을 억제한다. 일부 실시예들에서, 오스테오폰틴 관련 질환은 흑색종, 교모세포종, 암종, 심장비대증, 심근섬유증 또는 염증이다.

특정 실시예들에서, 조성물은 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시예들에서, 약제학적으로 허용가능한 담체는 크림, 에멀젼, 젤, 리포솜, 나노 입자 및 연고로 구성된 군으로부터 선택된다.

특정 실시예들에서, 조성물은 화학요법제, 면역치료제, 생물학적 치료제, 세포자멸사 촉진제, 혈관신생 억제제, 광활성제, 방사선감작제 및 방사성 동위원소, 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 국한되지 않는 항암치료제를 추가로 포함한다.

특정 실시예들에서, 조성물은 B-Raf 억제제, MEK 억제제 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다. 예시적인 B-Raf 억제제는 다브라페닙, 베무라페닙, 소라페닙, LGX818, GDC-0879 및 PLX-4720을 제한없이 포함한다. 예시적인 MEK 억제제는 트라메티닙, 코비메티닙, 비니메티닙, 셀루메티닙 및 PD-325901을 제한없이 포함한다.

또 다른 측면에서, 오스테오폰틴 관련 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 본 명세서에 기재한 바, 트롬빈 절단 부위에서 오스테오폰틴에 또는 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 항원-결합 단편의 치료적 유효량(therapeutically effective amount)을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이다. 특정 실시예들에서, 항체는 OPN-R 단편 또는 OPN-CTF 단편에 특이적으로 결합한다. 일부 실시예들에서, 항체는 OPN-R 단편에 대한 인테그린 결합을 억제한다. 항체는 대상체(subject)에서 트롬빈 응고촉진 활성(procoagulant activity)을 방해하지 않는 것이 바람직하다.

특정 실시예들에서, 오스테오폰틴 관련 질환은 오스테오폰틴을 과발현하는 암이다. 예를 들어, 오스테오폰틴을 과발현하는 암은 흑색종, 교모세포종, 난소암, 유방암 및 폐암을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 일부 실시예들에서, 상기 방법은 화학요법제, 면역치료제, 생물학적 치료제, 세포자멸사 촉진제, 혈관신생 억제제, 광활성제, 방사선감작제 및 방사성 동위원소, 또는 이들의 조합을 제한 없이 포함하는 하나 이상의 추가 항암치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

특정 실시예들에서, 상기 방법은 B-Raf 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 예시적인 B-Raf 억제제는 다브라페닙, 베무라페닙, 소라페닙, LGX818, GDC-0879 및 PLX-4720을 제한없이 포함한다.

특정 실시예들에서, 상기 방법은 미토겐-활성화 단백질 키나제(MEK) 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 예시적인 MEK 억제제는 트라메티닙, 코비메티닙, 비니메티닙, 셀루메티닙 및 PD-325901을 제한없이 포함한다.

특정 실시예들에서, 항체 또는 그 항원 결합 단편을 1일 투여 요법에 따라 또는 간헐적으로 투여한다. 다중 치료 주기는 적어도 부분적 종양 반응 또는 더 바람직하게는 완전한 종양 반응에 영향을 미치기에 충분한 기간 동안 대상체에게 투여할 수 있다. 일부 실시예들에서, 기간은 최소 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 1.5년, 2년 또는 그 이상이다.

또 다른 측면에서, 대상체에 종양 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 방법이 제공되며, 본 명세서에 기술하는 바, 오스테오폰틴 또는 그 트롬빈 절단 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 항원-결합 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법으로, 여기서 항체 또는 그 항원-결합 단편은 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 또는 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 단편에 대한 인테그린 결합을 억제한다.

또 다른 측면에서, 본 명세서에 기술된 항체 또는 그 항원-결합 단편 및 항암치료제, 검출가능한 표지 및 영상화제로 구성된 군으로부터 선택되는 작용제(agent)를 포함하는 접합체(conjugate)가 제공된다. 예시적인 항암치료제는 세포독성제, 약물, 독소, 뉴클레아제, 호르몬, 면역조절제, 세포자멸사 촉진제, 혈관신생 억제제, 붕소 화합물, 광활성제 및 방사성 동위원소를 제한 없이 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 명세서에 기술된 항체 또는 그 항원-결합 단편을 포함하는 조성물 및 오스테오폰틴 관련 질환을 치료하기 위한 키트 사용 설명서를 포함하는 키트가 제공된다. 키트는 조성물을 대상체에 투여하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 서열번호 5-7, 서열번호 9-12, 서열번호 47로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 면역원성 펩티드(immunogenic peptide)에 대해 대상체에서 면역 반응을 유도하는 단계를 포함하는 항체 생산 방법이 제공된다.

또 다른 측면에서, a) 서열번호 13, 서열번호 17, 서열번호 21 및 서열번호 25로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드(nucleotide) 서열, b) 서열번호 14, 서열번호 18, 서열번호 22, 및 서열번호 26으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, c) 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 23 및 서열번호 27로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, d) 서열번호 16, 서열번호 20, 서열번호 24 및 서열번호 28로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, e) a)-d)의 뉴클레오티드 서열에 대해 80-100% 서열 동일성(81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%와 같이 그 범위 내 임의의 동일성 백분율 포함)을 갖는 뉴클레오티드 서열, 그리고 f) a)-e)의 상보체(complements)를 포함하는 단리된 핵산(isolated nucleic acid)이 제공된다.

또 다른 측면에서, 본 명세서에 기술된 핵산에 작동가능하게 연결된(operably linked) 프로모터(promoter)를 포함하는 재조합 핵산(recombinant nucleric acid)이 제공된다.

또 다른 측면에서, 본 명세서에 기술된 항체 또는 그 항원-결합 단편을 암호화하는 벡터를 하나 이상 포함하는 벡터 시스템이 제공된다.

특정 실시예들에서, 벡터 시스템은 항체 또는 그 항원 결합 단편을 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함하며, 여기서 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3), 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 특정 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 14 또는 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 14 또는 서열번호 18의 아미노산 서열과 80% 이상 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 16 또는 서열번호 20의 아미노산 서열 또는 서열번호 16 또는 서열번호 20의 아미노산 서열과 80% 이상 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

특정 실시예들에서, 벡터 시스템은 항체 또는 그 항원 결합 단편을 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함하며, 여기서 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3), 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 특정 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 22의 아미노산 서열 또는 서열번호 22의 아미노산 서열과 80% 이상 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 24의 아미노산 서열 또는 서열번호 24의 아미노산 서열과 80% 이상 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

특정 실시예들에서, 벡터 시스템은 항체 또는 그 항원 결합 단편을 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함하며, 여기서 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3), 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 특정 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 26의 아미노산 서열 또는 서열번호 26의 아미노산 서열과 80% 이상 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 28의 아미노산 서열 또는 서열번호 28의 아미노산 서열과 80% 이상 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

특정 실시예들에서, 본 명세서에 기술된 벡터 시스템은 키메라화(chimerized) 또는 인간화(humanized)된 항체 또는 그 항원-결합 단편을 암호화한다.

또 다른 측면에서, 본 명세서에 기술된 벡터 시스템을 포함하는 숙주 세포가 제공된다.

또 다른 측면에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편을 생산하는 방법이 제공되며, 전술한 방법은 a) 항체 또는 그 항원-결합 단편의 생산에 적합한 조건 하에 본 명세서에 기술된 벡터 시스템을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 b) 숙주 세포로부터 항체 또는 그 항원-결합 단편을 분리하는 단계를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 명세서에 기술된 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)가 제공된다.

도면
본 발명은 첨부 도면과 함께 읽을 때 하기의 상세한 설명을 참조함으로써 가장 잘 이해할 수 있다. 일반적인 관행에 따라 다양한 특징의 도면은 비례적(to-scale)인 것이 아님을 주의한다. 반면 다양한 특징의 치수는 명료성을 위해 임의로 확대 또는 축소하였다. 다음 도면이 포함된다.
도 1은 트롬빈 및 CPB2-매개 OPN 절단의 개략도를 나타낸다.
도 2A-2B는 WT 마우스와 비교하여 OPN KO 및 OPNR153A K1 마우스에서 감소된 B16 종양 성장을 보여준다.
도 3A-3B는 B16 종양 성장이 OPN KO 및 OPN K1 마우스에 대한 전이 모델에서 유사하게 억제되었음을 보여준다.
도 4A-4B는 측면에 B16 흑색종을 보유하는 마우스의 다비가트란 에텍실레이트 처리가 OPN-KI 마우스가 아닌 WT에서 종양 성장을 억제함을 보여준다.
도 5A-5B는 폐에 B16 흑색종 전이가 있는 마우스의 다비가트란 에텍실레이트 처리가 WT에서 종양 성장을 억제했지만 OPN-KO 또는 OPN-KI 마우스에서는 억제하지 않았음을 보여준다.
도 6은 WT 마우스와 비교하여 OPN-KI 마우스에서 감소된 Id8 난소 암종 성장을 보여준다.
도 7은 전장 오스테오폰틴(OPN-FL)에 결합하고 트롬빈에 의한 이의 절단을 차단하는 단클론 항체(Mab)를 확인하기 위한 스크리닝 전략을 보여준다. 트롬빈 절단 부위 주변의 OPN 단백질 서열(단일 문자 아미노산 코드)은 토끼, 쥐, 마우스, 인간, 붉은털 원숭이, 사이노몰구스 및 돼지와 같은 종에서 표시된다. 아미노산의 색상은 화학적 특성을 나타낸다. 트롬빈 절단 부위는 검은색 상자에 둘러싸여 있다. 별표는 보존된 아미노산을 표시한다. 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)에 공유 결합된 펩티드 항원 YGLRSKS(서열 번호 11, 굵은 글씨체의 아미노산은 트롬빈에 의해 절단됨)는 토끼 단클론 항체를 개발하기 위해 토끼에서 항체를 생성하는 데 사용되었다. 트롬빈 절단 부위 주변의 OPN 서열이 마우스 또는 인간 서열: YRLKRSKS(서열번호 47, 굵게 표시된 아미노산은 트롬빈에 의해 절단됨)과 다르기 때문에 토끼를 선택하였다. 펩티드 항원에 결합하는 항체를 생산하는 세포는 중쇄 및 경쇄 cDNA가 클로닝되어 토끼 IgG를 발현하는 발현 벡터에 삽입되었다. 그런 다음 이러한 발현 벡터를 HEK293F 세포에 형질감염시키고 배지를 분석하였다. 그런 다음 항체 스크리닝을 사용하여 마우스, 래트 및 인간 오스테오폰틴과 반응하는 항체를 생성하는 클론을 식별하였다. 그런 다음 일부 선택된 클론(아래 도 참조)을 더 큰 규모로 성장시키고 배지를 수확하고 IgG를 정제하였다.
도 8은 OPN 항원 펩티드에 대한 직접 ELISA에서 토끼 단클론 클론을 스크리닝한 결과를 나타낸다. 35개의 양성(표시됨)이 확인되었다. 항-OPN IgG를 생성하는 클론을 확인하기 위한 분석을 위해, 30분 동안 비오틴으로 표지된 OPN 항원 펩티드를 첨가하기 전에 96웰 플레이트를 2 ug/mL 아비딘으로 밤새 코팅하였다. 그런 다음 클론의 상청액을 1:50으로 희석한 후 103배로 희석한 HRP(horse radish peroxidase)로 표지된 항-토끼 IgG Fc로 검출하였다. HRP용 기질을 첨가하고 색상을 측정하였다. 클론 상청액(clone supernatants)에서 IgG의 농도를 결정하기 위해 96웰 플레이트를 2ug/mL 항-토끼 IgG로 밤새 코팅하였다. 그런 다음 클론의 상청액을 1:50으로 희석한 후 103배로 희석한 HRP로 표지된 항-토끼 IgG Fc로 검출하였다. HRP용 기질을 첨가하고 색상을 측정하였다. 클론 상청액의 IgG 농도는 토끼 IgG의 표준 희석 곡선으로부터 계산되었다.
도 9는 항원 펩티드(중간 회색, 도 8의 데이터), 마우스 OPN-FL(밝은 회색) 및 인간 OPN-FL(짙은 회색)에 대한 직접적인 ELISA에서 토끼 단클론 항체를 스크리닝한 결과를 보여준다. 인간 OPN-FL 또는 마우스 OPN-FL에 결합하는 클론이 확인되었다. 마우스 또는 인간 OPN-FL에 대한 결합을 기반으로 추가 조사를 하기 위해 4개의 클론을 선택하였다(화살표).
도 10은 펩티드 항원 결합 분석에서 4개의 클론에 대한 EC50의 측정을 보여준다. 정제된 항-OPN IgG에 대한 EC50을 결정하기 위해, 30분 동안 비오틴으로 표지된 OPN 항원 펩티드를 첨가하기 전에 96웰 플레이트를 2 ug/mL 아비딘으로 밤새 코팅하였다. 그런 다음 선택된 클론의 상등액에 있는 IgG를 단백질 A/G 세파로스 비드에 결합하고 용출하여 정제하였다. 정제된 IgG는 103배로 희석된 HRP로 표지된 항-토끼 IgG Fc로 검출 전에 연속적으로 희석되었다. HRP용 기질을 첨가하고 색상을 측정하였다.
도 11은 OPN 항원 펩티드에 대한 결합을 위한 4개의 클론에 대한 EC50 값을 나타낸다. 도 4의 데이터를 기반으로, EC₅₀ 값은 도 10의 데이터를 사용하여 Prism Graphpad를 사용하여 4-매개변수 적합 방정식으로부터 계산되었다. A2=2.6 ng/mL, A6=3.2 ng/mL; E5=4.0 ng/mL 및 G7=93.2 ng/mL.
도 12는 마우스 OPN-FL에 대한 직접 결합 ELISA에서 4개의 클론에 대한 EC50 값의 결정을 보여준다. 클론 A2, A6 및 E5는 마우스 OPN-FL에 결합한다. PBS 완충액 중 염소 다클론 항-마우스 오스테오폰틴 IgG(2 ug/ml)(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 96-웰 ELISA 플레이트에 코팅하고 PBS 중 1% BSA로 1시간 동안 비특이적 결합 부위를 차단하였다. 재조합 마우스 오스테오폰틴 단백질(R&D Systems, Minneapolis, MN)을 PBS 중 1% BSA로 희석하고(200ng/ml에서 시작하여 희석) 2시간 동안 인큐베이션하였다.PBS 중 0.05% Tween 20으로 세척한 후, 샘플을 1% BSA가 포함된 PBS 중 정제된 항체 A2, A6, E5, G7 또는 IgG 대조군(500ng/ml)과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS 중 0.05% Tween 20으로 세척한 후, 샘플을 1% BSA가 포함된 PBS 중 퍼옥시다제-접합 염소 항-토끼 IgG 항체(100ng/ml)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 테트라메틸벤지딘 기질을 10분 동안 배양한 후 정지액(Stop Solution)을 첨가하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 13은 인간 OPN-FL에 대한 직접 결합 ELISA에서 4개의 선택된 클론에 대한 EC50 값의 결정을 보여준다. 4개의 클론 모두 인간 OPN-FL에 결합한다. 96-웰 ELISA 플레이트에 PBS 완충액에 녹인 마우스 단클론 항-인간 오스테오폰틴 항체(4 ㎍/ml)(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 1시간 동안 PBS에 녹인 1% BSA로 비특이적 결합 부위를 차단하였다. 재조합 인간 오스테오폰틴 단백질(GST-OPN-his, 사내 정제)을 PBS 중 1% BSA로 희석하고(200ng/ml에서 시작하여 희석) 2시간 동안 인큐베이션하였다.PBS 중 0.05% Tween 20으로 세척한 후, 샘플을 1% BSA가 포함된 PBS 중 정제된 항체 A2, A6, E5, G7 또는 IgG 대조군(500ng/ml)과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS 중 0.05% Tween 20으로 세척한 후, 샘플을 1% BSA가 포함된 PBS 중 퍼옥시다제-접합 염소 항-토끼 IgG 항체(100ng/ml)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 테트라메틸벤지딘 기질을 10분 동안 배양한 후 정지액(Stop Solution)을 첨가하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 14는 OPN-R에 대한 특이적 ELISA에서 절단 산물 중 하나인 OPN-R의 생성을 결정함으로써 4개의 클론에 대한 인간 OPN-FL의 트롬빈 절단 억제의 결정을 보여준다.4개의 클론 모두 인간 OPN-FL의 트롬빈 절단을 억제한다. 3.2 μm의 재조합 인간 오스테오폰틴 단백질 (Myles T. et al. (2003) J Biol Chem. 278(51):51059-51067에 기술한 바와 같이 정제됨; 본 명세서에 참고로 포함)을 정제된 항체 A2, A6, E5, G7 또는 IgG 대조군(데이터에 표시된 농도)과 함께 또는 없이 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다.인간 트롬빈(32nM)(R&D 시스템)을 샘플에 첨가하고 37°C에서 10분 동안 인큐베이션한 후 PPACK을 4.8pM으로 첨가하였다. 샘플을 PBS 중 1% BSA로 1/300 희석하고 생성된 OPN-R을 OPN-R 특이적 ELISA로 측정하였다. 인간 OPN-R ELISA: 96-웰 ELISA 플레이트에 PBS 완충액에 녹인 마우스 단클론 항-인간 오스테오폰틴 항체(4 ㎍/ml)(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 1시간 동안 PBS에 녹인 1% BSA로 비특이적 결합 부위를 차단하였다. 글루타티온 S-트랜스퍼라제 태그가 있는 재조합 인간 OPN-R 단백질(GST-OPN-R, Myles et al. (2003), 상기 참조)을 보정 표준으로서 PBS 중 1% BSA로 희석하였다(200ng/ml에서 시작하여 아래로 희석). 트롬빈 절단 산물의 표준 및 샘플(1/300 희석으로 시작하여 더 묽게 희석)을 2시간 동안 인큐베이션하였다.PBS 중 0.05% Tween 20으로 세척한 후, 샘플을 1% BSA가 포함된 PBS 중 비오틴화(Biotinylated) 토끼 다클론성 항-OPN-R 항체(500ng/ml) (Sharif et al, 2009 A+R)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 샘플을 1% BSA가 포함된 PBS에서 퍼옥시다제-접합된 스트렙타비딘(100ng/ml)과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 테트라메틸벤지딘 기질을 10분 동안 배양한 후 정지액(Stop Solution)을 첨가하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 샘플에서 생성된 OPN-R의 양은 OPN-R ELISA의 OPN-R 표준으로부터 계산된 다음 항체가 없는 대조군과 비교하여 상이한 농도에서 각 항체 클론의 트롬빈 절단 억제를 계산하고 그래프로 표시하였다.
도 15는 도 14로부터의 데이터에 기초하여 인간 OPN-FL의 절단을 억제함에 있어서 4개의 클론에 대한 억제율(%)을 나타낸다. A2=82%; A6=95.4%; E5=77.2% 및 G7=60.1%
도 16은 OPN-R에 대한 특이적 ELISA에서 절단 산물 중 하나인 OPN-R의 생성을 결정함으로써 4개의 클론에 대한 마우스 OPN-FL의 트롬빈 절단 억제의 결정을 보여준다.4개의 클론 모두 마우스 OPN-FL의 트롬빈 절단을 억제한다. 재조합 마우스 오스테오폰틴 단백질(R&D 시스템)(2 μM)을 정제된 항체 A2, A6, E5, G7 또는 IgG 대조군(2 pM)과 함께 또는 없이 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다.인간 트롬빈(20nM)(R&D 시스템)을 샘플에 첨가하고 37°C에서 10분 동안 인큐베이션한 후 PPACK을 4.7pM으로 첨가하였다. 샘플을 PBS 중 1% BSA로 1/100 또는 1/30으로 희석하고 생성된 OPN-R을 마우스 OPN-R-특이적 ELISA로 측정하였다. 각 샘플에서 생성된 OPN-R의 양을 OPN-R ELISA의 OPN-R 표준으로부터 계산한 다음 다른 농도에서 각 항체 클론의 트롬빈 절단 억제를 계산하여 그래프로 나타내었다.

오스테오폰틴에 특이적인 치료용 항체 및 오스테오폰틴 관련 질환을 치료하기 위해 이를 사용하는 방법을 제공한다, 상세하게는, 오스테오폰틴의 트롬빈 절단을 억제하거나 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 단편의 활성을 차단하는 항체 또는 그 항원-결합 단편을 제공한다. 추가적으로, 항체 접합체 및 항체 또는 항체 접합체를 포함하는 제약 조성물 또는 제제 뿐만 아니라 항체, 접합체 또는 제제를 포함하는 키트를 제공한다.

치료 항체 및 이 항체를 오스테오폰틴 관련 질환 치료에 사용하는 방법을 설명하기 전에, 전술한 내용은 달라질 수 있으므로 본 발명은 기술된 특정 방법 또는 조성물에 제한되지 않음을 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 범위가 덧붙인 청구범위에 의해서만 제한될 것이므로, 본 명세서에서 사용된 용어는 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로 본 발명을 한정하려는 의도가 아님을 이해한다.

값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 명확하게 지시하지 않는 한 해당 범위의 상한과 하한 사이의 각 중간 값이 하한 단위의 10분의 1까지 구체적으로 개시되는 것으로 이해한다. 명시된 범위에 있는 임의의 명시된 값 또는 중간 값과 그 명시된 범위에 있는 다른 임의의 명시된 값 또는 중간 값 사이의 각각의 더 작은 범위는 본 발명에 포함된다. 이 더 작은 범위의 상한과 하한은 독립적으로 범위에 포함되거나 제외될 수 있으며, 더 작은 범위에 제한 중 하나 포함, 둘 다 포함되지 않거나 모두 포함되는 각 범위도 명시된 범위에서 구체적으로 배제된 제한에 따라 발명에 포함된다. 명시된 범위가 제한 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 포함된 제한 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.

본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 상응하는 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 이하에서는 일부 잠재적이고 바람직한 방법 및 재료를 기술한다. 본 명세서에 언급된 모든 공개는 참조로 포함되어 해당 공개가 인용되는 것과 관련된 방법 및/또는 자료를 개시하고 설명한다. 본 개시는 상충 내용이 있는 범위에서 통합된 공개의 개시를 대체하는 것으로 이해된다.

본 개시 내용을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본 명세서에 기술되고 예시된 각각의 개별 실시예는 본 발명의 범위 또는 정신을 벗어남이 없이 다른 몇몇의 특징들로부터 쉽게 분리되거나 결합될 수 있는 별개의 구성요소 및 특징을 갖는다. 재인용된 방법은 재인용된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 다른 순서로 수행될 수 있다.

첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어 "항체"에 대한 언급은 이러한 항체의 복수를 포함하고 "암성 세포"에 대한 언급은 당업자에게 알려진 하나 이상의 암세포 및 그의 등가물, 예를 들어 암세포, 종양 세포, 신생물 세포 및 악성 종양 등에 대한 언급을 포함한다.

용어 "항체(antibody)"는 단클론 항체, 폴리클로날 항체뿐만 아니라 하이브리드 항체, 변경된 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체를 포함한다. 항체라는 용어에는 하이브리드(키메라) 항체 분자(참조 예: Winter et al. (1991) Nature 349:293-299; 및 미국 특허 번호 4,816,567); 이중특이성 항체, 이중특이성 T 세포 관여 항체 (BiTE), 삼중특이성 항체 및 기타 다중특이성 항체 (참조 예: Fan et al. (2015) J. Hematol. Oncol. 8:130, Krishnamurthy et al. (2018) Pharmacol Ther. 185:122-134), F(ab')2 및 F(ab) 단편; Fv 분자(비공유성 이종이량체(noncovalent heterodimer), 참조 예: Inbar et al. (1972) Proc Natl Acad Sci USA 69:2659-2662; 및 Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096); 단일쇄 Fv 분자(scFv) (참조 예:: Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883); 나노바디 또는 단일-도메인 항체(sdAb), (참조 예: Wang et al. (2016) Int J Nanomedicine 11:3287-3303, Vincke et al. (2012) Methods Mol S/'o/ 911:15-26; 이량체 및 삼량체 항체 단편 작제물, 미니바디 (참조 예: Pack et al. (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber et al. (1992) J Immunology 149B:120-126); 인간화 항체 분자 (참조 예: Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534-1536; 및 U.K. 특허 공개 번호 GB 2,276,169, 1994년 9월 21일 공개), 그리고 전술한 분자로부터 수득된 임의의 기능적 단편으로 모항체 (parent antibody) 분자의 특정 항원-결합 특성을 유지하는 단편을 포함한다.

항원(예: 오스테오폰틴 또는 그 트롬빈 절단 단편)에 대한 항체의 결합과 관련하여 "특이적으로(또는 선택적으로) 결합한다"라는 문구는 단백질 및 기타 생물의 이종 집단에서 항원의 존재를 결정하는 결합 반응을 의미한다. 따라서, 지정된 면역 분석 조건에서 특정 항체는 배경에 대해 특정 항원에 2회 이상 결합하며, 샘플에 존재하는 다른 항원에는 실질적으로 의미있는 양으로는 결합하지 않는다. 이러한 조건에서 항원에 대한 특이적 결합은 특정 항원에 대한 특이성을 위해 선택된 항체를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 다형성 변이체 및 대립 유전자를 제외하고 다른 단백질이 아닌 항원과 특이적으로 면역반응성인 항체만을 얻기 위해 들쥐, 생쥐 또는 인간과 같은 특정 종의 항원에 대해 생성된 항체를 선택할 수 있다. 이러한 선택은 다른 종의 분자와 교차 반응하는 항체를 추출하여 수행할 수 있다. 다양한 면역분석 형식을 사용하여 특정 항원과 특이적으로 면역반응하는 항체를 선택할 수 있다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역분석은 단백질과 특이적으로 면역반응을 보이는 항체를 선택하기 위해 일상적으로 사용된다(특정 면역반응성을 결정하는 데 사용할 수 있는 면역분석 형식 및 조건에 대해서는 Harlow & Lane. Antibodies, A Laboratory Manual (1988)를 참조한다). 일반적으로 특정 또는 선택적 반응은 배경 신호 또는 잡음의 최소 2배, 더 일반적으로는 배경의 10~100배 이상이다.

본 원에서 사용된 "항체 단편" 및 그 모든 변이형은 온전한 항체의 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부로 정의되며, 여기서 전술한 일부에는 온전한 항체의 Fc 영역의 불변 중쇄 도메인이 없다(즉, 항체 동형에 따라 CH2, CH3 및 CH4). 항체 단편의 예는 다음과 같다: Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 하나의 연속된 아미노산 잔기의 연속된 서열로 구성된 1차 구조를 갖는 폴리펩티드인 임의의 항체 단편("단일쇄 항체 단편" 또는 "단일쇄 폴리펩타드"로 지칭됨)을 포함하나 이에 제한되지 않음 (1) 단일쇄 Fv(scFv) 분자 (2) 하나의 경쇄 가변 도메인만을 함유하는 단일쇄 폴리펩티드, 또는 결합된 중쇄 부분 없이 경쇄 가변 도메인의 3개의 CDR을 함유하는 그 단편 (3) 하나의 중쇄 가변 영역만을 함유하는 단일쇄 폴리펩티드, 또는 결합된 경쇄 부분 없이 중쇄 가변 영역의 3개의 CDR을 함유하는 그 단편 및 (4) 비-인간 종 또는 다른 특이적 단일-도메인 결합 모듈로부터의 단일 Ig 도메인을 포함하는 나노바디; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 또는 다가 구조. 하나 이상의 중쇄를 포함하는 항체 단편의 경우, 중쇄는 무손상의 비-Fc 영역에서 발견되는 임의의 불변 도메인 서열(예, IgG 이소형에서 CH1)을 포함할 수 있고/있거나 무손상 항체에서 발견되는 임의의 힌지 영역 서열을 포함할 수 있고/있거나 중쇄의 힌지 영역 서열 또는 불변 도메인 서열에 융합되거나 또는 위치된 류신 지퍼(leucine zipper) 서열을 포함할 수 있다.

"인간화 항체"는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 면역글로불린 분자이다. 인간화 항체에는 인간화 항체에는 인간 면역글로불린(수용자 항체)이 포함되며, 여기서 수용자의 상보적 결정 영역(CDR)의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 용량을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종의 CDR의 잔기(공여자 항체)로 대체된다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 또한 수용자 항체나 유입된(imported) CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나의, 통상적으로 두 개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 영역에 상응하고 프레임워크(FR) 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린 공통 서열의 영역이다. 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 통상적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역을 최적으로 포함할 것이다.

본원에서, 용어 "에피토프"는 항체의 파라토프(paratope)가 결합하는 항원 상의 임의의 항원 결정기를 의미한다. 에피토프 결정기는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 기 그룹들로 구성되며, 일반적으로 특이적인 3차원 구조 특징 뿐만 아니라 특이적인 하전 특징을 가진다.

"단리된"이란 폴리펩티드를 언급할 때 지시된 분자가 전체 유기체로부터 분리되어 있음을 의미하며, 전술한 분자는 자연에서 발견되거나 동일한 유형의 다른 생물학적 거대 분자가 실질적으로 없을 때 존재한다. 폴리뉴클레오티드와 관련하여 "단리된"이라는 용어는 자연에서 정상적으로 결합된 서열; 또는 자연에 존재하지만 그와 결합된 이종성 서열을 갖는 서열; 또는 염색체에서 분리된 분자가 전체적으로 또는 부분적으로 결여된 핵산 분자이다.

용어 "접합된"는 2개의 화합물 또는 작용제를 공유 또는 비공유 수단에 의해 연결하는 것을 의미한다.

본원에서 "치료", "치료하는", "치료하다" 등의 용어는 일반적으로 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭하는 데 사용된다. 그 효과는 질병 또는 그 증상(들)을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 점에서 예방적일 수 있고/있거나 질병 및/또는 질병에 기인할 수 있는 역효과에 대한 부분적 또는 완전한 안정화 또는 치유의 측면에서 치료적일 수 있다. 용어 "치료"는 포유동물, 특히 인간의 질병의 모든 치료를 포함하며 다음을 포함한다: (a) 질병 또는 증상에 대한 소인이 있을 수 있지만 아직 이를 갖는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질병 및/또는 증상이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질병 및/또는 증상을 억제하는 것, 즉 그들의 발달을 저지하는 것; 또는 (c) 질병 증상의 완화, 즉 질병 및/또는 증상의 퇴행 유발. 치료가 필요한 사람은 이미 발병한 사람(예: 암에 걸린 사람)과 예방이 필요한 사람(예: 암에 대한 감수성이 높은 사람, 암이 의심되는 사람, 재발 위험이 있는 사람 등)을 포함한다.

본원에서 용어 "단위 투여 형태(unit dosage from)"는 "단위 투여 형태"는 인간 및 동물 대상에 대한 단일 투여량으로 적합한, 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 비히클과 관련하여 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 계산된 본 개시 내용의 화합물의 미리 결정된 양을 함유한다. 새로운 단위 투여 형태에 대한 사양은 사용된 특정 화합물, 달성할 효과, 숙주의 각 화합물과 관련된 약물동력학적 변화 (pharmacodynamics)에 따라 다르다.

"오스테오폰틴 관련 질환"은 염증, 심장비대증, 심근섬유증 및 흑색종, 교모세포종, 난소암, 유방암, 폐암 등의 오스테오폰틴 과발현 암을 제한 없이 포함하여, 오스테오폰틴 또는 그 트롬빈 절단 단편의 수치 상승과 관련된 모든 질병 또는 장애를 포함한다.

용어 "종양", "암" 및 "신생물"은 상호호환적으로 사용되며, 그 성장, 증식 또는 생존이 정상적인 대응 세포의 성장, 증식 또는 생존보다 더 큰 포유동물의 세포 또는 세포 집단을 지칭한다 (예: 세포 증식성, 과증식성 또는 분화 장애). 일반적으로 성장은 통제되지 않는다. 용어 "악성"은 주변 조직의 침윤을 의미한다. 용어 "전이" 또는 이차, 재발성 또는 재발성 종양, 암 또는 신생물은 종양, 암 또는 신생물이 대상체 내의 다른 부위, 위치 또는 영역으로 퍼지거나 전파되는 것을 의미하며, 여기서 부위, 위치 또는 영역은 원발성 종양 또는 암과 구별된다. 신생물, 종양 및 암은 양성, 악성, 전이성 및 비전이성 유형이 포함되며, 임의의 병기(I, II, III, IV 또는 V) 또는 등급(G1, G2, G3 등)의 신생물, 종양 또는 암, 또는 진행성, 악화, 안정화 또는 관해 상태인 신생물, 종양, 암 또는 전이를 포함한다. 상세하게는, 용어 "종양", "암", "신생물"은 편평 세포 암종, 선암종, 선편평 암종, 역형성 암종, 대세포 암종 및 소세포 암종과 같은 암종을 포함하며, 두경부암, 피부암, 유방암, 난소암, 흑색종, 췌장암, 말초신경종, 교모세포종, 부신피질암, AIDS 관련 림프종, 항문암, 방광암, 수막종, 신경교종, 성상세포종, 자궁경부암, 만성 골수증식성 장애, 결장암, 자궁내막암, 뇌실막종, 식도암, 유잉육종, 두개외 생식세포종양, 간외담관암, 담낭암, 위암, 위장관 유암종, 임신성 융모성 종양, 모발세포 백혈병, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 하인두암, 섬세포암종, 카포시육종, 후두암, 백혈병, 입술암, 구강암, 간암, 남성 유방암, 악성 중피종, 수모세포종, 메르켈 세포암종, 전이성 편평 경부 세포암종, 다발성 골수종 및 기타 형질 세포 신생물, 균상식육종 및 세자리 증후군, 골수이형성 증후군, 비인두암, 신경모세포종, 비소세포폐암, 소세포폐암, 구인두암, 골육종 및 뼈의 악성 섬유성 조직구종을 포함한 골암, 부비동암, 부갑상선암, 음경암, 갈색세포종, 뇌하수체종양, 전립선암, 직장암, 신세포암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 소장암, 연조직육종, 천막상 원시신경외배엽 종양, 송과체모세포종, 고환암, 흉선종, 흉선암, 갑상선암, 신우 및 요관의 이행세포암, 요도암, 자궁육종, 질암, 외음부암 및 빌름스 종양과 기타 소아 신장 종양과 같은 암을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

특히, 용어 "흑색종"은 전이성 흑색종을 포함하여 모든 단계의 모든 유형의 흑색종을 포함한다. 예를 들어, 용어 "흑색종"은 악성 흑색점, 악성 흑자형 흑색종, 표재성 확산 흑색종, 선단 흑자형 흑색종, 점막 흑색종, 결절성 흑색종, 폴립성 흑색종 및 섬유조직형성 흑색종을 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 흑색종은 게놈 DNA 서열의 변화(돌연변이)를 포함할 수 있으며, 이는 흑색종 세포에 의해 암호화된 단백질이 환자 신체의 다른 부분과 다르다는 것을 의미한다. 예를 들어, 세포로의 신호 성장에 관여하는 단백질인 B-RAF는 돌연변이를 가질 수 있다. 따라서, 상기 용어는 또한 V600E 돌연변이 또는 V600K 돌연변이를 포함하는 흑색종을 제한 없이 포함하는 B-RAF 돌연변이 흑색종도 포함한다.

"항종양 활성"은 세포 증식 속도의 감소 및 그에 따른 기존 종양의 성장 또는 치료 동안 발생하는 종양의 감소 및/또는 기존 신생물(종양) 세포 또는 새로 형성된 신생물 세포의 파괴 및 그에 따른 치료 중 종양의 전체 크기 감소를 의도한다. 이러한 활성은 동물 모델을 사용하여 평가할 수 있다.

오스테오폰틴 또는 그 트롬빈 절단 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 항원-결합 단편의 "치료적 유효 용량 또는 양"은 본원에 기술된 바와 같이 투여될 때, 항종양 활성 또는 항염증 활성과 같은 긍정적인 치료 반응을 일으키는 양을 의미한다. 필요한 정확한 양은 개체의 종, 연령 및 일반적인 상태, 치료 증상의 중증도, 사용되는 특정 약물(들), 투여 방식 등에 따라 대상체마다 다를 수 있다. 임의의 개별 사례에 적절한 "유효" 양은 본원에 제공된 정보에 기초하여 일상적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.

본원에서 용어 "종양 반응"은 모든 측정 가능한 병변의 감소 또는 제거를 의미한다. 종양 반응에 대한 기준은 WHO 보고 기준[WHO Offset Publication, 48-World Health Organization, Geneva, Switzerland, (1979)]에 따른다. 각 평가마다 일차원 또는 이차원적으로 측정 가능한 모든 병변을 측정하는 것이 이상적이다. 어떤 장기에 여러 병변이 있는 경우, 전술한 측정이 불가능할 수 있으며 해당 상황에서는 가능하다면 최대 6개의 대표적인 병변을 선택한다.

본원에서 용어 "완전 반응"(CR)은 최소 4주 간격으로 2회의 평가에 의해 결정된, 임상적으로 검출 가능한 모든 악성 질병의 완전한 소실을 의미한다.

본원에서 용어 "부분적 반응"(PR)은 최소 4주 간격으로 최소 2회의 연속 평가에 의해 결정된 바, 평가 가능한 질병의 진행 및 새로운 병변의 증거 없이 모든 측정가능한 질병의 가장 긴 수직 직경의 곱의 합이 기준선에서 50% 이상 감소하는 것을 의미한다. 평가에서 용해성 병변 크기의 부분적 감소, 용해성 병변의 재석회화 또는 모세포 병변의 밀도 감소가 나타나야 한다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호호환적으로 사용된다. 상기 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 상응하는 자연 발생 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에도 적용된다.

"실질적으로 정제된"이란 일반적으로 물질(예: 항체, 접합체, 화합물, 약물, 핵산, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드)을 해당 물질이 존재하는 샘플의 대부분을 구성하고 전체 샘플의 백분율로 정의되도록 분리하는 것을 의미한다. 일반적으로 샘플에서 실질적으로 정제된 성분은 샘플의 50%, 바람직하게는 80%-85%, 더 바람직하게는 90-95%를 구성한다. 관심 물질을 정제하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 밀도에 따른 침강을 포함한다.

본원에서 용어 "수혜자", "개체", "대상체", "숙주" 및 "환자"는 상호호환적으로 사용되며 진단, 치료 또는 치료요법이 필요한 포유동물 피험자, 특히 인간을 지칭한다. 치료 목적의 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장동물, 동물원, 스포츠 또는 애완용 동물(개, 말, 고양이, 소, 양, 염소, 돼지 등)을 포함하여, 포유류로 분류되는 모든 동물과 지칭한다.바람직하게는, 포유류는 인간이다.

"약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체"는 본 발명의 조성물에 선택적으로 포함될 수 있고 환자에게 심각하게 유해한 독성 효과를 일으키지 않는 부형제를 지칭한다.

"약제학적으로 허용가능한 염"은 아미노산 염, 무기산으로 제조된 염(염화물, 황산염, 인산염, 이인산염, 브롬화물 및 질산염 등) 또는 전술한 염 중 어느 하나의 상응하는 무기산 형태로부터 제조된 염(염산염 등) 또는 유기산으로 제조된 염(말레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 타르트레이트, 숙시네이트, 에틸숙시네이트, 시트레이트, 아세테이트, 락테이트, 메탄설포네이트, 벤조에이트, 아스코르브산염, 파라톨루엔설포네이트, 팔모에이트, 살리실레이트 및 스테아레이트, 그리고 에스톨레이트, 글루셉테이트 및 락토비오네이트 염 등)을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 이와 유사하게, 약제학적으로 허용가능한 양이온을 함유하는 염은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 알루미늄, 리튬 및 암모늄(치환된 암모늄 포함)을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

본원에서 용어 "검출가능한 표지", "검출제", "영상화제", "진단제" 및 "검출가능한 부분(moieties)"는 상호호환적으로 사용되며, 형광체, 화학발광체, 발색단, 생물발광 단백질, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제, 동위원소 표지, 반도체 나노입자, 염료, 금속 이온, 금속 졸, 리간드(예: 비오틴, 스트렙타비딘 또는 합텐) 등을 포함하지만 이에 국한되지 않는, 검출할 수 있는 분자 또는 물질을 의미한다. 용어 "형광제"는 검출가능한 범위에서 형광을 나타낼 수 있는 물질 또는 그 일부를 지칭한다. 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 검출가능한 표지의 특정 예는 ³H, ²H,¹²⁰I, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S, ¹¹C, ¹³C, ¹⁴C, ³²P, ¹⁵N, ¹³N, ¹¹⁰ln, ¹¹¹ln, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸F, ⁵²Fe, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁸⁶Y, ⁹⁰Y, ⁸⁹Zr, ⁹⁴mTc, ⁹⁴Tc, ⁹⁹mTc, ¹⁵⁴Gd, ¹⁵⁵Gd, ¹⁵⁶Gd, ¹⁵⁷Gd, ¹⁵⁸Gd, ¹⁵O, 186Re ¹⁸⁸Re, ⁵¹M, ⁵²mMn, ⁵⁵Co, ⁷²As, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ⁸²mRb, 및 ⁸³Sr와 같은 방사성 및 비방사성 동위원소를 포함하는 동위원소 표지를 포함한다. 특히, 검출가능한 표지는 ⁶⁴Cu, ⁸⁹Zr, ⁶⁸Ga, ¹⁷⁷Lu, ⁸²Rb, ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O 및 ¹⁸F와 같은(이에 국한되지 않음) PET 영상화에 적합한 양전자 방출 방사성 핵종; 또는 ⁶⁷Ga, ⁹⁹mTc, ¹²³I 및 ¹³¹I와 같은(이에 국한되지 않음) 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT) 영상화에 적합한 감마 방출 방사성 핵종을 포함할 수 있다. 검출가능한 표지에는 Mn²⁺, Fe³⁺, Fe²⁺ Gd³⁺, Ti²⁺, Cr³⁺, Co²⁺, Ni²⁺ 및 Cu²⁺와 같은 MRI 영상화에 적합한 비방사성 상자성 금속 이온도 포함될 수 있다. 검출가능한 표지는 또한 SYBR 그린, SYBR 골드, CAL Fluor 염료(CAL Fluor Gold 540, CAL Fluor Orange 560, CAL Fluor Red 590, CAL Fluor Red 610 및 CAL Fluor Red 635 등), Quasar 염료(Quasar 570, Quasar 670, Quasar 705 등), Alexa Fluor(Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 647 및 Alexa Fluor 784 등), 시아닌 염료(Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7), 플루오레세인, 2',4',5',7'-테트라클로로-4-7-디클로로플루오레세인(TET), 카복시플루오레세인(FAM), 6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인(JOE), 헥사클로로플루오레세인(HEX), 로다민, 카르복시-X-로다민(ROX), 테트라메틸 로다민(TAMRA), FITC, 단실, 움벨리페론, 디메틸아크리디늄에스테르(DMAE), 텍사스 레드, 루미놀, 퀀텀닷, 효소(알칼리성 인산분해효소(AP), 베타-락타마제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 아데노신 데아미나제(ADA), 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제(neor, G4181) 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 하이그로마이신-B-포스포트랜스퍼라제(HPH), 티미딘 키나제(TK), β-갈락토시다제(lacZ) 및 크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(XGPRT), 베타-글루쿠로니다제(거스), 태반 알칼리 인산분해효소(PLAP) 및 분비형 배아 알칼리 인산분해효소(SEAP) 등)를 제한 없이 포함한 형광물질을 포함할 수 있다. 효소 태그는 동족 기질과 함께 사용된다. 이 용어는 또한 루미놀, 이소루미놀, 아크리디늄 에스테르, 퍼옥시옥살레이트와 같은 화학발광 표지와 반딧불이 루시퍼라제, 박테리아 루시퍼라제, 레닐라 루시페라제 및 애쿼린과 같은 생물발광 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 알려진 형광 강도의 색상 코딩된 미소구체(참조 예: Luminex(텍사스 오스틴)에서 생산한 xMAP 기술이 적용된 미소구체); 양자점 나노결정을 포함하는 미소구체(양자점 색상의 다른 비율 및 조합을 포함 등)(예: Life Technologies(캘리포니아 칼즈배드)에서 생산한 Qdot 나노결정); 유리 코팅된 금속 나노입자(참조 예: Nanoplex Technologies, Inc.(캘리포니아 마운틴뷰)에서 생산한 SERS 나노태그); 바코드 재료(참조 예: Nanoplex Technologies, Inc.에서 생산한 Nanobarcodes 와 같은 서브마이크론 크기의 줄무늬 금속 막대), 컬러 바코드가 있는 암호화된 마이크로입자(참조 예: Vitra Bioscience에서 생산한 CellCard, vitrabio.com), 디지털 홀로그램 코드 이미지가 있는 유리 마이크로입자(참조 예: Illumina(캘리포니아주 샌디에고)에서 생산한 CyVera 마이크로비드), 근적외선(NIR) 프로브 및 나노쉘도 포함한다. 상기 용어는 또한 초음파 조영제(예: 육불화황을 포함하는 SonoVue 미세기포, 알부민 쉘 및 옥타플루오로프로판 가스 코어를 포함하는 옵티슨 미세기포, 지질/갈락토스 쉘 및 공기 코어를 포함하는 레보비스트 미세기포, 퍼플루오로카본 미세기포를 포함하는 퍼플렉산 지질 미소구체, 그리고 외부 지질 쉘에 캡슐화된 옥타플루오로프로판을 포함하는 퍼플루트렌 지질 미소구체), 자기공명영상(MRI) 조영제(예: 가도디아미드, 가도벤산, 가도펜텐산, 가도테리돌, 가도포스베셋, 가도베르세트아미드, 가독세트산), 그리고 컴퓨터 단층촬영(CT), 방사선 촬영 또는 형광투시용 방사선 조영제(예: 디아트리조산, 메트리조산, 아이오다마이드, 아이오탈람산, 아이옥시탈라민산, 아이오글리신, 아세트리조익산, 아이오카르민산, 메티오달, 다이오돈, 메트리자마이드, 아이오헥솔, 아이옥사글릭산, 아이오파미돌, 아이오프로마이드, 아이오트롤란, 아이오베르솔, 아이오트롤란, 아이오베르솔, 프로디올릭산 이옥실란, 요오독삼산, 요오트록산, 요오글리삼산, 아디피오돈, 요오벤즈삼산, 요오파노산, 요세탐산, 나트륨 요오포데이트, 티로파노산 및 칼슘 요오포데이트)와 같은 조영제도 포함한다. 검출가능한 표지 또는 영상화제는 항체에 간접적으로 또는 직접적으로 부착될 수 있으며, 이에 의해 표지 또는 조영제는 영상화에서 항체의 사용을 용이하게 한다.

"상동성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 동일성 퍼센트를 의미한다. 2개의 핵산, 또는 2개의 폴리펩티드 서열은 정의된 분자 길이에 대해 서열이 적어도 약 50% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 75% 서열 동일성, 더 바람직하게는 적어도 약 80%-85% 서열 동일성, 더 바람직하게는 적어도 약 90% 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%-98% 서열 동일성을 나타낼 때 서로 "실질적으로 상동적"이다. 본원에서 실질적으로 상동적이란 또한 지정된 서열과 완전한 동일성을 나타내는 서열을 의미한다. 일반적으로, "동일성"은 각각 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산 대응을 의미한다. 동일성 퍼센트는 서열을 정렬하고, 정렬된 두 서열 사이의 정확한 일치 수를 세고, 더 짧은 서열의 길이로 나눈 다음 결과에 100을 곱하고 두 분자 간의 서열 정보를 직접 비교하여 결정할 수 있다. 쉽게 구할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 분석을 지원할 수 있으며, 예를 들어 ALIGN, Dayhoff, M.O. (Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353 358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC)는 Smith and Waterman Advances(Appl. Math. 2:482 489, 1981)의 로컬 상동성 알고리즘을 펩티드 분석에 적용한다. 뉴클레오티드 서열 동일성을 결정하는 프로그램은 Wisconsin Sequence Analysis Package 버전 8(Genetics Computer Group, Madison, WI에서 이용 가능)에서 사용할 수 있으며, 예를 들어 Smith and Waterman 알고리즘에 의존하는 BESTFIT, FASTA 및 GAP 프로그램이 있다. 이러한 프로그램은 제조업체가 권장하고 전술한 Wisconsin Sequence Analysis Package에 설명된 기본 매개변수를 사용하여 쉽게 활용된다. 예를 들어, 참조 서열에 대한 특정 뉴클레오티드 서열의 동일성 퍼센트는 기본 스코어링 표 및 6개 뉴클레오티드 위치의 갭 패널티와 함께 Smith and Waterman의 상동성 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다.

본 발명의 맥락에서 동일성 퍼센트를 설정하는 또 다른 방법은 에딘버러 대학이 저작권을 보유하고, John F. Collins와Shane S. Sturrok이 개발하고,IntelliGenetics, Inc.(캘리포니아 마운틴뷰)가배포한 MPSRCH 프로그램 패키지를 사용하는 것이다. 이 패키지 모음에서, 기본 매개변수가 스코어링 표에 사용되는 경우 Smith Waterman 알고리즘을 사용할 수 있다(예: 갭 개방 패널티 12, 갭 확장 패널티 1, 갭 6). 생성된 데이터에서 "일치" 값은 "시퀀스 ID"를 반영한다. 서열 간의 동일성 퍼센트 또는 유사성을 계산하기에 적합한 기타 프로그램은 일반적으로 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 또 다른 정렬 프로그램으로는 기본 매개변수와 함께 사용되는 BLAST가 있다. 예를 들어, BLASTN 및 BLASTP는 다음 기본 매개변수를 사용하여 사용할 수 있다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 다; 컷오프 = 60; 기대 = 1 0; 배열 = BLOSUM62; 설명 = 50개 시퀀스; 정렬 기준 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비이중화, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translation + Swiss protein + Spupdate + PIR. 이러한 프로그램의 세부 정보는 쉽게 이용할 수 있다.

대안적으로, 상동성은 상동적 영역 사이에 안정된 이중체를 형성하는 조건 하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화에 이어 외가닥 특정 뉴클레아제(들)를 사용한 분해 및 분해된 단편의 크기 결정으로 결정될 수 있다. 실질적으로 상동적인 DNA 서열은, 예를 들어 특정 시스템에 대해 정의된 엄격한 조건 하에서 서던 하이브리다이제이션(Southern hybridization) 실험에서 확인될 수 있다. 적절한 하이브리다이제이션 조건을 정의하는 것은 당업계의 기술 범위에 속한다. 예를 들어, Sambrook et al., supra] DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra를 참조한다.

본원에서 핵산 분자를 설명하는 데 사용되는 "재조합"은 게놈, cDNA, 바이러스, 반합성 또는 합성 유래의 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 이는 자연에서 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부와 원래 또는 조작에 의해 결합되지 않는다. 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 사용된 용어 "재조합"은 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 생성된 폴리펩티드를 의미한다. 일반적으로, 관심 유전자는 클로닝된 다음, 하기에 상세히 기술하는 바와 같이 형질전환된 유기체에서 발현된다. 숙주 유기체는 발현 조건에서 단백질을 생산하기 위해 외래 유전자를 발현한다.

용어 "형질전환"은 삽입에 사용된 방법과 상관없이 외인성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 삽입하는 것을 의미한다. 예를 들어, 직접 흡수, 형질도입(transduction) 또는 f-교배(f-mating)가 포함된다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 통합되지 않은 벡터(예: 플라스미드)로서 유지되거나 그렇지 않으면 숙주 게놈 내로 통합될 수 있다.

"재조합 숙주 세포", "숙주 세포", "세포", "세포주", "세포 배양물" 및 단세포 개체로 배양된 미생물 또는 고등 진핵 세포주를 나타내는 기타 용어는 재조합 벡터 또는 기타 전달된 DNA의 수용자로 사용될 수 있거나 사용된 세포를 말하며, 형질감염된 원래 세포의 원래 자손을 포함한다.

"암호화 서열" 또는 선택된 폴리펩티드를 "암호화"하는 서열은 적절한 조절 서열(또는 "제어 요소")의 제어 하에 놓일 때 생체 내에서 전사되고(DNA의 경우) 폴리펩티드로 번역되는(mRNA의 경우) 핵산 분자이다. 암호화 서열의 경계는 5'(아미노) 말단의 시작 코돈 및 3'(카르복시) 말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정될 수 있다. 암호화 서열은 바이러스, 원핵생물 또는 진핵생물 mRNA로부터의 cDNA, 바이러스 또는 원핵생물 DNA로부터의 게놈 DNA 서열 및 합성 DNA 서열까지도 포함할 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 전사 종결 서열은 암호화 서열의 3'에 위치할 수 있다.

일반적인 "제어 요소"는 전사 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결 신호, 폴리아데닐화 서열(번역 정지 코돈의 3'에 위치), 번역 개시의 최적화를 위한 서열(암호화 서열의 5'에 위치), 및 번역 종결 서열을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

"작동가능하게 연결된"은 설명된 구성 요소가 일반적인 기능을 수행하도록 구성된 구성요소의 배열을 의미한다. 따라서, 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 특정 프로모터는 적절한 효소가 존재할 때 암호화 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 프로모터가 그 발현을 지시하는 기능을 하는 한, 프로모터는 암호화 서열과 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 중간에 번역되지 않았지만 전사된 서열이 프로모터 서열과 암호화 서열 사이에 존재할 수 있으며, 프로모터 서열은 여전히 암호화 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.

"발현 카세트" 또는 "발현 작제물"은 관심 서열(들) 또는 유전자(들)의 발현을 지시할 수 있는 어셈블리를 지칭한다. 발현 카세트는 전술한 바와 같이 일반적으로 관심 서열(들) 또는 유전자(들)에 작동가능하게 연결된 (전사를 지시하기 위해) 프로모터와 같은 제어 요소를 포함하며, 종종 폴리아데닐화 서열도 포함한다. 본 발명의 특정 실시예들 내에서, 본원에 기술된 발현 카세트는 공여자 폴리뉴클레오티드 플라스미드 또는 바이러스 벡터 작제물 내에 포함될 수 있다. 발현 카세트의 구성요소 외에, 작제물은 또한 하나 이상의 선택가능한 마커, 작제물이 외가닥 DNA로 존재하도록 하는 신호(예: M13 복제 기점), 하나 이상의 다중 클로닝 부위 및 "포유류" 복제 기점(예: SV40 또는 아데노바이러스 복제 기점)도 포함할 수 있다.

"정제된 폴리뉴클레오티드"는 폴리뉴클레오티드가 자연적으로 결합되는 단백질이 본질적으로 없는, 예를 들면 약 50% 미만, 바람직하게는 약 70% 미만, 더 바람직하게는 약 90% 미만을 함유하는 관심 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편을 의미한다. 관심 폴리뉴클레오티드를 정제하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 카오트로픽제로 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포의 파괴 및 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 밀도에 따른 침강에 의한 폴리뉴클레오디드 및 단백질의 분리를 포함한다.

용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 DNA의 흡수를 나타내는 데 사용된다. 외인성 DNA가 세포막 내로 도입되면 세포가 "형질감염"된 것이다. 다양한 형질감염 기술이 일반적으로 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning, a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1995) Basic Methods in Molecular Biology, 2nd edition, McGraw-Hill, and Chu et al. (1981) Gene 13:197을 참조한다. 이러한 기술을 사용하여 하나 이상의 외인성 DNA 부분을 적합한 숙주 세포에 도입할 수 있다. 이 용어는 유전 물질의 안정적이고 일시적인 흡수를 나타내며, 펩티드 또는 항체 연관 DNA의 흡수를 포함한다.

"벡터(vector)"는 핵산 서열을 표적 세포(예: 바이러스 벡터, 비바이러스 벡터, 미립자 담체 및 리포솜)로 전달할 수 있다. 일반적으로, "벡터 작제물(vector construct)", "발현 벡터(expression vector)" 및 "유전자 전달 벡터(gene transfer vector)"는 관심 핵산의 발현을 지시할 수 있고 핵산 서열을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 의미한다. 따라서 이 용어는 클로닝 및 발현 비히클, 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함한다.

본 명세서에 인용된 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 개시하는 데 한해서 제공된다. 본 명세서의 어떤 기술도 본 발명이 선행 발명에 의한 이러한 공개보다 선행할 자격이 없다고 인정하는 것으로 해석될 수 없다. 또한 제공된 공개일은 실제 공개일과 다를 수 있으므로 별도의 확인이 필요할 수 있다.

본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있음은 통상의 기술자에게 자명할 것이다.

항오스테오폰틴 항체

하나 이상의 오스테오폰틴 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-오스테오폰틴 항체가 제공된다. 일부 실시예에서, 항-오스테오폰틴 항체는 트롬빈 절단 부위에 특이적으로 결합하여 오스테오폰틴의 트롬빈 절단을 억제하고/하거나 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 단편(예: OPN-R 단편 또는 OPN-CTF 단편)에 특이적으로 결합하여 트롬빈 절단 단편의 생물학적 활성을 감소시킨다. 특정 실시예에서, 항-오스테오폰틴 항체는 오스테오폰틴의 Arg168을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 상기 번호는 인간 오스테오폰틴의 참조 아미노산 서열(서열번호 8)에 대한 것이며, 다른 종으로부터 수득된 오스테오폰틴 단백질의 상응하는 위치 또한 본 개시내용에 포함하도록 의도되는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에 사용된 용어 "항-오스테오폰틴 항체"는 전장 항체 및 항체의 항원-결합 영역을 포함하는 그 항원-결합 단편, 예를 들어, Fab, F(ab')2 또는 Fv 단편과 같은 항-오스테오폰틴 항제의 CDR을 포함하는 분자, 단일쇄 가변 단편(scFv), 또는 관심 단편의 임의의 다른 유형의 항체 단편(상기 용어 "항체"의 정의 참조)을 포함한다.본 발명의 대상 방법의 실시에 사용될 수 있는 항-오스테오폰틴 항체는 단클론 항체, 다클론 항체, 하이브리드 항체, 변경된 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체 및 다음을 포함하나 이에 국한되지 않는다: 하이브리드(키메라) 항체 분자(참고 예: Winter et al. (1991) Nature 349:293-299; 및 미국 특허 번호 4,816,567); F(ab')₂ 및 F(ab) 단편; Fv 분자(비공유성 이종이량체, 참고 예: Inbar et al. (1972) Proc Natl Acad Sci USA 69:2659-2662; 및 Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096); 단일쇄 Fv 분자(sFv) (참고 예: Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883); 나노바디 또는 단일-도메인 항체(sdAb) (참고 예: Wang et al. (2016) Int J Nanomedicine 11:3287-3303, Vincke et al. (2012) Methods Mol Biol 911:15-26; 이량체 및 삼량체 항체 단편 작제물, 미니바디(참고 예: Pack et al. (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber et al. (1992) J Immunology 149B:120-126); 인간화 항체 분자(참고 예: Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534-1536; 및 영국 특허 공개 번호 GB 2,276169, 1994년 9월 21일 공개),그리고 전술한 분자로부터 수득된 임의의 기능적 단편으로 모항체(parent antibody) 분자의 특정 결합 특성을 유지하는 단편을 포함한다.

특정 실시예들에서, 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 1-7, 서열번호 9-12 및 서열번호 47로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 구성된 오스테오폰틴 펩티드에 특이적으로 결합한다.

특정 실시예들에서, 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3), 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 일부 실시예들에서, 항체 또는 그 항원 결합 단편은 서열번호 14 또는 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성과 같이 범위 내 임의의 동일성 백분율을 포함하여 그에 대해 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 포함한다. 일부 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 16 또는 서열번호 20의 아미노산 서열 또는 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성과 같이 범위 내 임의의 동일성 백분율을 포함하여 그에 대해 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함한다.

특정 실시예들에서, 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3), 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 일부 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 22의 아미노산 서열 또는 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성과 같이 범위 내 임의의 동일성 백분율을 포함하여 그에 대해 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 포함한다. 일부 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 24의 아미노산 서열 또는 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성과 같이 범위 내 임의의 동일성 백분율을 포함하여 그에 대해 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함한다.

특정 실시예들에서, 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3), 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 일부 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 26의 아미노산 서열 또는 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성과 같이 범위 내 임의의 동일성 백분율을 포함하여 그에 대해 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 포함한다. 일부 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 28의 아미노산 서열 또는 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성과 같이 범위 내 임의의 동일성 백분율을 포함하여 그에 대해 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함한다.

트롬빈 절단 부위의 오스테오폰틴 또는 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 단편(예: OPN-R 단편 또는 OPN-CTF 단편)에 특이적으로 결합하는 항체는 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986); 및 Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975)를 참조한다. 예를 들어, 오스테오폰틴 트롬빈 절단 부위 또는 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 단편(예: OPN-R 단편 또는 OPN-CTF 단편)을 포함하는 오스테오폰틴 펩티드 단편으로 이루어진 항원은 마우스, 래트(rat), 토끼, 기니피그, 원숭이 또는 인간과 같은 포유동물에서 다클론항체를 생산하기 위한 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있다. 항-오스테오폰틴 항체를 생성하기 위한 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있는 예시적인 펩티드는 서열번호 1-7, 서열번호 9- 12 및 서열번호 47로 이루어진 오스테오폰틴 펩티드를 포함하나 이에 국한되지 않는다(실시예 참조). 원하는 경우 항원을 소 혈청 알부민, 티로글로불린 및 키홀 림펫 헤모시아닌과 같은 담체 단백질에 접합할 수 있다. 숙주 종에 따라 다양한 보조제를 사용하여 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 이러한 보조제는 프로인트 보조제, 미네랄 젤(예: 수산화알루미늄) 및 표면 활성 물질(예: 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 및 디니트로페놀)을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 인간에게 사용되는 보조제 중에서는 BCG(bacilli Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)이 특히 효과적이다.

오스테오폰틴 항원에 특이적으로 결합하는 단클론 항체는 배양 시 연속 세포주로 항체 분자를 생산하는 임의의 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 기술은 하이브리도마 기술, 인간 B 세포 하이브리도마 기술 및 EBV 하이브리도마 기술이 포함하나 이에 국한되지 않는다(Kohler etal., Nature 256, 495-97, 1985; Kozbor et al., J. Immunol. Methods 81, 31 42, 1985; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026-30, 1983; Cole etal., Mol. Cell Biol. 62, 109-20, 1984).

또한, "키메라 항체" 생산을 위해 개발된 기술로, 적절한 항원 특이성과 생물학적 활성을 갖는 분자를 얻기 위해 마우스 항체 유전자를 인간 항체 유전자에 스플라이싱하는 기술을 사용할 수 있다(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-55, 1984; Neuberger et al., Nature 312, 604-08, 1984; Takeda et al., Nature 314, 452-54, 1985). 또한 단클론 및 기타 항체를 "인간화"하여 환자가 치료적으로 사용된 항체에 대해 면역 반응을 일으키는 것을 방지할 수 있다. 이러한 항체는 치료에 직접 사용되는 인간 항체와 서열이 충분히 유사하거나 몇 가지 주요 잔기의 변경이 필요할 수 있다. 설치류 항체와 인간 서열 사이의 서열 차이는 개별 잔기의 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 또는 전체 상보성 결정 영역의 격자에 의해 인간 서열에서와 상이한 잔기를 대체함으로써 최소화할 수 있다.

대안적으로, 인간화 항체를 하기 기술된 바와 같이 재조합 방법을 사용하여 생성할 수 있다. 특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 미국 특허 번호 5,565,332에 개시된 바와 같이, 부분적으로 또는 완전히 인간화된 항원 결합 부위를 포함할 수있다. 인간 단클론 항체는 [Simmons et al., PLoS Medicine 4(5), 928-36, 2007]에 기술된 바와 같이 시험관 내에서 제조할 수 있다.

대안적으로, 단일쇄 항체의 생산에 대해 기재된 기술을, 특정 항원에 특이적으로 결합하는 단일쇄 항체를 생산하기 위해 당업계에 알려진 방법을 사용하여 적용할 수 있다. 관련 특이성을 갖지만 고유한 이디오타입(idiotypic) 구성의 항체는 무작위 조합 면역글로빈 라이브러리에서 사슬 셔플링에 의해 생성될 수 있다(Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120-23, 1991). 단일쇄 항체는 또한 하이브리도마 cDNA를 주형으로 사용해 PCR과 같은 DNA 증폭 방법을 사용하여 작제할 수 있다(Thirion et al., Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11, 1996). 단일쇄 항체는 단일 또는 이중 특이적일 수 있으며 2가 또는 4가가 될 수 있다. 4가의 이중특이성 단일쇄 항체의 작제는 예를 들어, Coloma & Morrison, Nat. Biotechnol. 15, 159-63, 1997에 교시되어 있다. 2가의 이중특이성 단일쇄 항체의 작제는 Mallender & Voss, J. Biol. Chem. 269, 199-206, 1994에 교시되어 있다.

단일쇄 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 수동 또는 자동 뉴클레오티드 합성을 사용하여 작제하고, 표준 재조합 DNA 방법을 사용하여 발현 작제물로 클로닝하고, 하기에 기술된 바와 같이 암호화 서열을 발현하기 위해 세포에 도입할 수 있다. 대안적으로, 단일쇄 항체는 예를 들어, 필라멘트 파지(phage) 기술을 사용하여 직접 생산할 수 있다(Verhaar et al., Int. J Cancer 61, 497-501, 1995; Nicholls et al., J. Immunol. Meth. 165, 81-91, 1993).

오스테오폰틴 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 림프구 집단에서 생체내 생산을 유도하거나 문헌에 개시된 바와 같이 면역글로불린 라이브러리 또는 매우 특이적인 결합 시약 패널을 스크리닝함으로써 생산할 수 있다(Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833 3837, 1989; Winter et al., Nature 349, 293 299, 1991).

키메라 항체는 WO 93/03151에 개시된 바와 같이 작제할 수 있다. 면역글로불린으로부터 유래되고 WO 94/13804에 기재된 "디아바디"와 같이 다가(multivalent) 및 다중특이적인 결합 단백질 또한 작제할 수 있다.

일부 실시예들에서, B 림프구의 항-오스테오폰틴 항체는 혈액 공여자(donor)로부터 얻어서 복제된다. 항체 경쇄 및 중쇄 또는 가변 도메인 상보성-결정 영역(예: Fab)을 포함하는 그 단편을 암호화하는 핵산은 PCR로 증폭하고 벡터로 클로닝할 수 있다. ScFv 항체는 하나의 ORF(open reading frame)에서 링커(linker)를 통해 경쇄와 중쇄를 연결하는 작제물인 벡터로 클로닝하여 생성할 수 있다. 혈액 공여자(blood donor)는 모든 종이 될 수 있다. 일부 실시예들에서, 인간 혈액 공여자는 인간 항체 생성에 사용된다. 다른 실시예들에서는 낙타과 혈액 공여자가 낙타 항체 생성에 사용된다. 낙타류 항체는 예를 들어 단봉 낙타, 박트리아 낙타, 라마 및 알파카로부터 유래될 수 있다. 전술한 낙타류는 경쇄가 없는 독특한 유형의 항체를 생산한다. 중쇄 항체(HCAb) 또는 그 가변 도메인 단편(예: 단일 도메인 항체 또는 나노바디)도 본 발명의 대상 방법에 사용할 수 있다(참조 예: Vincke et al. (2012) Methods Mol. Biol. 911:15-26, Krah et al. (2016) Immunopharmacol. Immunotoxicol. 38(1):21-8: 본 명세서에 참조로 포함).

항체는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 항체는 관련 항원이 결합된 컬럼을 통과하여 친화성 정제될 수 있다. 결합된 항체는 염 농도가 높은 완충액을 사용하여 컬럼에서 용출될 수 있다.

키메라 및 인간화 항체

적합한 항-오스테오폰틴 항체는 이러한 항체의 완전한 인간, 인간화 또는 키메라 버전을 포함한다. 예를 들어, 인간화 항체는 항원성이 낮기 때문에 인간의 생체 내(in vivo) 적용에 유용하다. 유사하게, 개화, 고양이화 등의 항체는 각각 개, 고양이 및 기타 종에 적용하는 데 유용하다. 관심 항체는 인간화 항체, 또는 개화, 고양이화, 말화, 소화, 돼지화 등, 항체, 및 그의 변이체를 포함한다.

비인간(예: 마우스) 단클론 항체의 가변 Ig 도메인이 인간 불변 Ig 도메인에 융합된 키메라 단클론 항체는 당업계에 알려진 표준 절차를 사용하여 생성할 수 있다 (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6841-6855 (1984); 및 Boulianne etal, Nature 312, 643-646, (1984) 참조).

인간화 항체는 예를 들어: (1) 비인간 상보성 결정 영역(CDR)을 인간 프레임워크 및 불변 영역에 이식(grafting)하는 단계(당업계에서 "CDR 이식"을 통한 인간화로 지칭되는 프로세스); (2) 전체 비인간 가변 도메인을 이식하되, 표면 잔기의 교체에 의해 인간과 유사한 표면으로 이들을 "은폐(cloaking)" (당업계에서 "비니어링(veneering)"이라고 하는 과정); 또는 (3) 항원 결합 또는 단백질 폴딩에 부정적인 영향을 미칠 것 같지 않지만 인간 환경(예: HUMAN ENGINEERING)에서 면역원성을 감소시킬 가능성이 있는 것으로 결정된 위치에서 인간 아미노산을 대체 단계를 포함한 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 본 개시내용에서, 인간화 항체는 "인간화", "비니어링된" 및/또는 "인간 엔지니어링된" 항체를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, Jones et al., Nature 321:522 525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31:169-217 (1994); Studnicka et al. 미국 특허 번호 5,766,886; Studnicka et al., (Protein Engineering 7: 805-814, 1994; Co et al., J. Immunol. 152, 2968-2976 (1994); Riechmann, et al., Nature 332:323-27 (1988); 및 Kettleborough et al., Protein Eng. 4:773-783 (1991)에 개시되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참조로 포함된다.

CDR 이식(CDR grafting)은 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 Ig 도메인으로부터의 6개의 CDR 중 하나 이상을 인간 가변 Ig 도메인의 적절한 4개의 프레임워크 영역으로 도입하는 것을 포함한다. 이 기술(Riechmann, et al., Nature 332:323-27 (1988))은 보존된 프레임워크 영역(FR1-FR4)을 스캐폴드로 활용하여 항원과의 1차 접촉인 CDR 루프를 지원한다. 단, CDR 이식의 단점으로, 프레임워크 영역의 아미노산이 항원 결합에 기여할 수 있고 CDR 루프의 아미노산이 2개의 가변 Ig 도메인의 결합에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 원래의 마우스 항체보다 결합 친화도가 상당히 낮은 인간화 항체를 생성할 수 있다. 인간화 단클론 항체의 친화성을 유지하기 위해, 원래의 마우스 항체의 프레임워크 영역과 가장 유사한 인간 프레임워크 영역을 선택하고, 항원 결합 부위의 컴퓨터 모델링을 지원하는 프레임워크 또는 CDR 내의 단일 아미노산의 부위 지정(site-directed) 돌연변이를 유발하여 CDR 이식 기술을 개선할 수 있다(예: Co et al., J. Immunol. 152, 2968-2976 (1994)).

항체 단편

항-오스테오폰틴 항체는 항체 단편의 형태일 수 있다. 항체 단편은 무손상 전장 항체의 일부를 포함하고 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체 단편의 예에는 Fab; Fab'; F(ab')2; Fv 단편; 디아바디 선형 항체; 단일쇄 항체 분자(예: scFv); 이중특이성, 삼중특이성 등과 같은 다중특이성항체 단편(예: 디아바디, 트리아바디, 테트라바디); 미니바디; 킬레이트 재조합 항체; 트라이바디 또는 바이바디; 인트라바디; 나노바디; 소형 모듈형 면역약제(SMIP), 결합 도메인 면역글로불린 융합 단백질; 낙타화 항체; VHH 함유 항체; 및 항체 단편으로부터 형성된 다른 폴리펩티드가 포함된다. 예를 들어, Holliger & Hudson (Nat. Biotech. 23:1126-36 (2005))를 참조한다.

항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편이라고 하는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 즉 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 구성된 1가 단편 및 그 이름에 쉽게 결정화되는 능력이 반영된 잔류 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리는 항체의 VH 및 VL 도메인으로 구성된 2개의 단일쇄 "Fv" 또는 "scFv" 항체 단편을 갖는 힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편을 생성하며, 전술한 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. Fv 폴리펩티드는 Fv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있게 하여 단일쇄 항체(scFv)를 생성할 수 있게 하는, VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 VL 및 VH 영역은 이들이 단일 단백질 사슬로 될 수 있도록 해 주는 합성 링커를 통해 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한다(Bird et al., Science 242:423-426, 1988, and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988). scFv에 대한 검토는 Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 1 13, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)를 참조한다. Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인으로 구성된다.

추가적인 항체 단편은 VH 도메인으로 구성된 도메인 항체(dAb) 단편(Ward et al., Nature 341:544-546, 1989)을 포함한다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 사슬에서 발현되지만, 동일한 사슬의 두 도메인 사이의 짯짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용하므로, 도메인이 다른 사슬의 상보적인 도메인과 쌍을 이루도록 하여 두 개의 항원 결합 부위를 생성하는 2가 항체이다(예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993, and Poljaket al., Structure 2:1121-1123, 1994 참조). 디아바디는 이중특이성 또는 단일특이성일 수 있다.

항-오스테오폰틴 항체의 생산 방법

전술한 바와 같이, 본 개시내용은 오스테오폰틴 또는 그의 트롬빈 절단 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 여기서 항체는 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 또는 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 단편과 인테그린 및/또는 다른 세포 수용체의 상호작용을 억제한다. 항-오스테오폰틴 항체를 제조하는 예시적인 방법은 하기에 제시되어 있다.

항체는 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이(phage display) 기술의 사용 또는 이들을 조합한 사용을 포함하여, 당업계에 알려진 매우 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 항체는 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조 및 단리할 수 있다. 항체는 또한 전체 단백질 및 그 단편을 포함하며, 오스테오폰틴을 포함하는 면역원성 조성물로 면역화된 동물 숙주의 혈청으로부터 단리될 수 있다. 예시적인 항체는 오스테오폰틴에(예: 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 부위에) 또는 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체를 포함한다.

파지 디스플레이 패닝(phage display panning)을 위한 웰(well)을 코팅하는 항원 또는 본 개시내용의 항체를 유도하는데 사용되는 면역원성 조성물은 하나 이상의 항원의 응집체(aggregate)를 포함할 수 있다. 이 방법은 응집체를 형성하도록 항원을 응집 조건에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 전술한 제조 방법은 분리된 항원의 응집체를 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 응집 조건의 예는 가열, 응집을 촉진하는 부형제의 첨가 등을 포함한다.

파지 패닝을 위해 웰을 코팅하거나 본 개시내용의 항체를 유도하기 위해 사용되는 항원은 다른 분자에 접합될 수 있다. 예를 들어, 항원은 용해도, 저장성 또는 기타 취급 특성, 세포 투과성, 반감기, 특정 세포(예: 암세포, 심근세포 등) 또는 세포 위치(예: 원형질막, 리소좀, 엔도솜, 미토콘드리아 등), 조직 또는 기타 신체 위치(예: 혈액, 특정 기관, 종양 등)를 대상으로 하여 방출 및/또는 분포를 제어하는 펩티드, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물 등과 같은 제2 분자에 접할될 수 있다.

제2 분자에 접합된 항원의 특정 실시예는 제2 분자가 면역조절제인 경우이다. "면역 조절제"는 면역 반응을 직접 또는 간접적으로 수정하는 분자이다. 면역조절제의 특정 부류는 면역학적 반응의 자극을 자극하거나 보조하는 것을 포함한다. 예로는 파상풍 톡소이드를 포함하는 독소 또는 이의 유도체와 같은 항원 및 항원 담체가 포함된다.

파지 디스플레이

파지 디스플레이는 단백질 상호작용의 고처리량 스크리닝에 사용된다. 파지는 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예: 인간 또는 쥐)로부터 발현된 항원 결합 도메인을 표시하는 데 사용될 수 있다. 오스테오폰틴 또는 그 트롬빈 절단 단편에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지는, 예를 들어, 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 표지된 오스테오폰틴 또는 오스테오폰틴을 사용하여 선택 또는 확인될 수 있다. 이러한 방법에 사용되는 파지는 일반적으로 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 Fab, Fv(경쇄 또는 중쇄의 개별 Fv 영역) 또는 이황화 안정화된 Fv 항체 도메인이 있는 파지에서 발현된 fd 및 M13 결합 도메인을 포함하는 사상 파지이다. 예시적인 방법은 예를 들어 EP 368 684 B1; 미국 특허 번호 5,969,108, Hoogenboom, H. R. and Chames, Immunol. Today 2000, 21:371; Nagy et al. Nat. Med. 2002, 8:801; Huie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98:2682; Lui etal., J. Mol. Biol. 2002, 315:1063에 설명되어 있으며, 각각은 본 명세서에 참조로 포함되어 있다. 여러 간행물에(예: Marks et al., Bio/Technology 1992, 10:779-783) 대형 파지 라이브러리를 구성하기 위한 전략으로 사슬 셔플링, 조합 감염 및 생체내 재조합에 의한 고친화성 인간 항체의 생성이 설명되어 있다. 또 다른 실시예에서, 리보솜 디스플레이를 디스플레이 플랫폼으로서 박테리오파지를 대체하는 데 사용할 수 있다 (예를 들어, Hanes et al., Nat. Biotechnol. 2000, 18:1287; Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98:3750; 또는 Irving et al., J. Immunol. Methods 2001, 248:31 참조). 항체에 대해 세포 표면 라이브러리를 스크리닝할 수 있다 (Boder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97:10701; Daugherty et al., J. Immunol. Methods 2000, 243:211). 이러한 절차는 단클론 항체의 분리 및 후속 복제를 위한 전통적인 하이브리도마 기술에 대한 대안을 제공한다.

파지 디스플레이 방법에서, 기능성 항체 도메인은 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 운반하는 파지 입자의 표면에 표시된다. 예를 들어, 중쇄 가변(VH) 및 경쇄 가변(VL) 영역을 암호화하는 DNA 서열은 증폭되거나 동물 cDNA 라이브러리(예: 림프 조직의 인간 또는 쥐 cDNA 라이브러리) 또는 합성 cDNA 라이브러리로부터 단리된다. VH 및 VL 영역을 암호화하는 DNA는 PCR에 의해 scFv 링커로 함께 연결되고, 파지미드 벡터(예: pCANTAB 6 또는 pComb 3 HSS)로 클로닝될 수 있다. 벡터는 대장균(E. coli)에서 전기천공되고 대장균은 보조 파지로 감염된다. VH 또는 VL 영역은 일반적으로 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII에 재조합적으로 융합된다. 관심 항원에 결합하는 항원 결합 도메인(예: 오스테오폰틴의 세린 프로테아제 도메인)을 발현하는 파지는, 예를 들어, 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 사용하여, 항원으로 선택되거나 확인될 수 있다.

항체를 만드는 데 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 추가 예는 PCT 출원 번호 PCT/GB91/01134; PCT 공개물 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미국 특허 번호 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108을 포함하며, 각각은 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.

상기 나열된 참고 문헌에 기술된 바와 같이, 파지 선택 후, 파지로부터 항체 암호화 영역을 단리하여 인간 항체 또는 원하는 임의의 다른 항원 결합 단편을 포함하는 전체 항체를 생성하고 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 비롯한 임의의 원하는 숙주에서 발현시킬 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생산하는 기술은 또한 PCT 공개물 WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 1992, 12:864-869; 및 Sawai et al., AJRI 1995, 34:26-34; 및 Better et al., Science 1988, 240:1041-1043 에 개시된 것과 같은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 활용할 수도 있다(전술한 참고 문헌은 그 전체가 참조로 포함됨).

면역 및 항체 생산

숙주 동물에서 항체를 유도하는 방법은 오스테오폰틴 또는 그 트롬빈 절단 단편에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도하기 위해 유효량의 오스테오폰틴 또는 그 단편을 항원으로서 숙주 동물(즉, 마우스, 토끼 또는 기니피그와 같은 적합한 포유동물, 닭과 같은 적합한 조류 또는 낙타)에 투여하는 것을 포함한다. 항-오스테오폰틴 항체를 생성하기 위해 숙주 동물에서 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있는 예시적인 면역원성 펩티드는 서열번호 5-7, 서열번호 9-12 및 서열번호 47로 이루어진 면역원성 펩티드 또는 이로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 면역원성 펩티드를 포함하나 이에 국한되지 않는다(예시 참조). 사용된 보조제, 부스터 일정, 주사 부위, 적합한 동물 등을 포함한 동물의 면역화 방법은 예를 들어, Harlow et al. (Antibodies: A Laboratory Manual, First Edition (1988) Cold spring Harbor, N.Y.) 등 당업계에 잘 알려져 있으며, 동물에 대한 살아있는 여러 포유동물 및 조류에 대한 세포의 투여는 예를 들어, McKenzie et al (Oncogene 4:543-8, 1989), Scuderi et al (Med. Oncol. Tumor Pharmacother 2:233-42, 1985), Roth et al (Surgery 96:264-72, 1984) 및 Drebin et al (Nature 312:545-8, 1984)에 기술되어 있다. 다음으로, 항체 생산 세포의 집단이 생성된다. 일 실시예에서, 세포 집단은 당업자에게 잘 알려진 하이브리도마 방법을 사용하여 생성된다(참조 예: Harlow Antibodies: A Laboratory Manual, First Edition (1988) Cold Spring Harbor, N.Y.). 세포는 골수종 세포 또는 형질전환 세포와 같이 세포 배양에서 무한히 복제할 수 있는 불멸화 세포(immortalized cell)에 융합되어 불멸 면역글로불린 분비 세포주를 생성한다. 사용되는 불멸 세포주가 선택되어 특정 영양소의 이용에 필요한 효소가 결핍될 수 있다. 이러한 세포주(예: 골수종)는 대부분 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 티미딘 키나제(TK) 또는 하이포잔틴-구아닌 포스포리복실 트랜스퍼라제(HGPRT)를 포함한다. 이러한 결핍으로, 예를 들어 하이포크산틴 아미노프테린티미딘 배지(HAT)에서 성장하는 능력에 따라 융합된 세포를 선택할 수 있다. 대안적으로, 단클론 항체를 발현하는 세포 집단은 파지 디스플레이 방법을 사용하여 만들어질 수 있다.

항-오스테오폰틴 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 항-오스테오폰틴 항체는 유전 공학에 의해 생산될 수도 있다. 이 기술에서는 표준 하이브리도마 절차와 마찬가지로, 항체 생산 세포는 원하는 항원 또는 면역원에 민감하게 반응한다. 면역 비장 세포(immune spleen cell)나 하이브리도마에서 단리된 전령 RNA를 주형으로 사용하여 PCR 증폭을 통해 cDNA를 만든다. 각각 초기 항원 특이성을 유지하는 하나의 중쇄 유전자와 하나의 경쇄 유전자를 포함하는 벡터 라이브러리는 증폭된 면역글로불린 cDNA의 적절한 섹션을 발현 벡터에 삽입함으로써 생성한다. 중쇄 유전자 라이브러리와 경쇄 유전자 라이브러리를 조합하여 조합 라이브러리를 작제할 수 있다. 이로 인해 중쇄 및 경쇄(항체 분자의 Fab 단편 또는 항원 결합 단편과 유사함)를 공동 발현하는 클론 라이브러리가 생성된다. 이러한 유전자를 운반하는 벡터는 숙주(예: 박테리아, 곤충 세포, 포유동물 세포 또는 기타 적합한 단백질 생산 숙주 세포)에 공동 형질감염된다. 형질감염된 숙주에서 항체 유전자 합성이 유도되면, 중쇄 및 경쇄 단백질이 자가 조립되어 항원 또는 면역원으로 스크리닝하여 검출되는 활성 항체를 생성한다.

파지 패닝 및 스크리닝

항체 생산 세포 또는 파지 집단이 생성되면, 다양한 분석법 중 하나 또는 그 조합을 사용하여 항체를 스크리닝한다. 일반적으로 이러한 분석은 기능적 분석이며 다음과 같이 그룹화할 수 있다: 항체의 결합 친화도 또는 특이성을 감지하는 분석, 그리고 프로세스를 초기화하거나 억제하는 항체의 능력을 감지하는 분석.

예를 들어, 항원은 비드나 웰 또는 기타 고체 지지체에 커플링되고 관심 항체를 표시하는 파지와 함께 인큐베이션된다. 세척 후 결합된 파지는 대수기 대장균 세포를 접종하여 회수된다. 세포는 보조 파지로 성장하고 확장된다. 단계를 반복하여 단단히 결합된 파지를 증폭한다. 여러 차례의 농축 후 파지 감염된 대장균 콜로니(E. coli colony)가 얻어지고 Fab 항체는 주변 세포질 분획에서 정제된다. 그런 다음 정제된 항체를 당업계에 공지된 방법에 따라 분석한다. 특정 예시적인 예가 아래에 자세히 설명되어 있다.

파지-감염 세포 또는 하이브리도마로부터 단리된 항체 집단은 시험관내 또는 원위치에서(예:세포 상에서) 항원의 종균의 단일 항원(즉, 복수의 항원 중 다른 항원과 혼합되지 않은 항원)에 대한 결합에 대해 추가로 분석 및/또는 스크리닝된다. 면역특이적 결합은 통상적이고 당업계에 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다. 사용될 수 있는 면역분석은 웨스턴 블롯, 방사선면역분석, ELISA(효소 결합 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 침전 반응, 면역확산 분석, 응집 분석, 보체 고정 분석과 같은 기술을 사용하는 경쟁 및 비경쟁 분석 시스템, 면역방사측정법, 형광성 면역측정법, 단백질 A 면역측정법과 같은 기술을 사용하는 경쟁적 및 비경쟁적 분석 시스템을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 예를 들어, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York을 참조한다. 본 명세서에 전체가 참조로 포함되어 있다.

본 개시내용의 항체는 또한 생체내에서 스크리닝될 수 있다. 이 방법은 질병 또는 질환(즉, 오스테오폰틴 관련 장애)에 대한 동물 모델에 항-오스테오폰틴 항체를 투여하고 모델 동물의 질병 또는 질환에 대한 항체의 효과를 결정하는 것을 포함한다. 본 발명의 생체내 검정은 대조군(controls)을 포함하며, 여기서 적절한 대조군은 항체 부재 하에 샘플을 포함한다. 일반적으로, 분석 혼합물의 샘플은 다양한 농도에 대한 차등 반응을 얻기 위해 다양한 항체 농도와 병행하여 실행된다. 일반적으로, 이러한 농도 중 하나는 즉 농도가 0이거나 검출 수준 미만에서 음성 대조군 역할을 한다.

관심 단클론 항체는 항체가 없는 대조군과 비교 시, 동물 모델 질병 또는 상태의 증상을 최소한 약 10%, 최소한 약 20%, 최소한 약 25%, 최소한 약 30%, 최소한 약 35%, 최소한 약 40%, 최소한 약 45%, 최소한 약 50%, 최소한 약 55%, 최소한 약 60%, 최소한 약 65%, 최소한 약 70%, 최소한 약 80%, 최소한 약 90% 이상 조절, 즉 감소 또는 증가시키는 항체이다. 일반적으로, 관심 단클론 항체는 대상 동물을 질병이나 질환을 앓지 않는 동등한 동물과 더 유사하게 만든다. 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 확인된 치료적 가치를 갖는 항체는 "치료적" 항체로 지칭된다.

선택된 관심 단클론 항체는 일상적인 조직 배양 방법을 사용하여 시험관 내에서 확장되거나, 포유류 대상체를 사용하여 생체 내에서 확장될 수 있다. 예를 들어, 프리스탄 유도한(pristane-primed) 마우스는 복수 생성을 위해 PBS에서 대수기(log phase) 하이브리도마 세포를 접종할 수 있다. 복수액(Ascites fluid)은 추가 정제 전에 -70℃에서 보관할 수 있다.

스크리닝 방법

본 개시내용에 의해 제공되는 스크리닝 방법은 오스테오폰틴 또는 이의 트롬빈 절단 단편에 특이적으로 결합하고 선택적으로 본 명세서에 기술된 임의의 추가 특징(예: 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 또는 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 단편에 대한 인테그린 결합을 억제함)을 갖는 항체를 스크리닝하기 위한 파지 라이브러리의 사용을 포함할 수 있다. 오스테오폰틴의 강력한 억제 및/또는 그 특이적 결합 친화성을 위해 결합제를 선택할 수 있다. 상기 방법은 전술한 파지 표시 방법에 따라 수행될 수 있다.

간략하게, 오스테오폰틴 또는 그 단편은 소수성 흡착, 비오틴-아비딘 상호작용 및 Ni²⁺-6xHis 상호작용과 같은 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 ELISA 플레이트 또는 비드 상에 고정될 수 있다. 그런 다음 파지 라이브러리를 고정된 항원/프로테아제와 함께 인큐베이션하고, 세척하고, 회수한다. 패닝 및 선택 중에 결합된 파지를 대장균에서 회수하여 증폭한다. 여러 번의 연속 선택 라운드는 오스테오폰틴 또는 그 트롬빈 절단 단편에 특이적인 항체로 작용하는 폴리펩티드를 표시하는 파지의 선택을 보장한다. 세척의 엄격함은 여러 라운드에 걸쳐 증가한다(예: 3회). 회수된 파지의 특이성을 증가시키기 위해 당업계에 잘 알려진 많은 기술이 사용될 수 있다. 예로는 세척 시간 증가, 세제 농도 증가, 염 농도 증가, 알려진 거대분자 억제제(예: 작은 펩티드 기질, BPTI, Ecotin 및/또는 이전에 확인된 항체 억제제)의 포함 등이 있다. 억제 항체의 확인은 ELISA 및 억제 분석을 포함할 수 있다. 항-오스테오폰틴 항체를 선택하고 단리하는 방법에서 수행할 분석에 대한 세부사항은 위에서 기술하였다.

또한 본 개시내용에서는 본 명세서에 기술된 후보 항-오스테오폰틴 항체를 암호화하는 핵산 작제물의 라이브러리가 고려된다. 라이브러리는 공통된 하나 이상의 폴리펩티드 영역(예: 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 CDR) 및 집단 간에 변하는 하나 이상의 다른 폴리펩티드 영역을 가질 수 있는 복수의 후보 항-오스테오폰틴 항체를 암호화한다.

항-오스테오폰틴 항체를 암호화하는 핵산, 벡터 및 벡터 시스템

특정 실시예에서, 항-오스테오폰틴 항체 중쇄 및 경쇄 또는 그 항체 단편(예: Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 또는 scFv 단편)은 벡터로부터 생성된다. "벡터"는 관심 핵산을 세포 내부로 전달하는 데 사용할 수 있는 물질의 조성물이다. 항체 경쇄 및/또는 중쇄 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 단일 벡터 또는 별도의 벡터(즉, 벡터 시스템)로 세포 내에 도입될 수 있다. 항-오스테오폰틴 항체를 생산하는 작제물의 능력은 경험적으로 결정될 수 있다.

선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 결합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하나 이에 국한되지 않는 다양한 벡터가 당업계에 알려져 있다. 따라서, 용어 "벡터"는 자가 복제성 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-부속 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 발현 작제물은 살아있는 세포에서 복제하거나 합성으로 만들 수 있다. 본 출원의 목적을 위해, "발현 작제물", "발현 벡터" 및 "벡터"라는 용어는 일반적이고 예시적인 의미에서 본 발명의 적용을 입증하기 위해 상호호환적으로 사용되며 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다.

일 실시예에서, 항-오스테오폰틴 항체를 발현시키기 위한 발현 벡터는 항-오스테오폰틴 중쇄 및/또는 경쇄 또는 그 단편(예: 그 가변 도메인 CDR을 포함함)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 "작동가능하게 연결된" 프로모터를 포함한다. 문구 "작동가능하게 연결된" 또는 "전사 제어하에"는 프로모터가 RNA 폴리머라제에 의한 전사의 개시 및 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하도록 폴리뉴클레오티드와 관련하여 정확한 위치 및 배향인 것을 의미한다.

특정 실시예들에서, 관심 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 핵산은 프로모터의 전사 제어 하에 있다. "프로모터"는 유전자의 특정 전사를 개시하는 데 필요한 세포의 합성 기계 또는 도입된 합성 기계에 의해 인식되는 DNA 서열을 의미한다. 프로모터라는 용어는 RNA 폴리머라제(polymerase) I, II 또는 III에 대한 개시 부위 주위에 모여 있는 전사 제어 모듈 그룹을 나타내기 위해 본 명세서에서 사용한다. 포유동물 세포 발현을 위한 대표적인 프로모터는 SV40 초기 프로모터, CMV 즉시 초기 프로모터와 같은 CMV 프로모터(미국 특허 No.5,168,062 및 5,385,839 참조. 전체가 참고로 인용됨), 마우스 유방 종양 바이러스 LTR 프로모터, 특히 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(Ad MLP) 및 단순 포진 바이러스 프로모터를 포함한다. 뮤린 메탈로티오네인 유전자에서 유래한 프로모터와 같은 다른 비바이러스 프로모터도 포유동물 발현에 사용된다. 이들 및 다른 프로모터는 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 상업적으로 입수 가능한 플라스미드로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, Sambrook et al., supra를 참조한다. 작제물의 발현 수준을 증가시키기 위해 프로모터와 함께 인핸서(enhancer) 요소를 사용할 수 있다. 그 예로는 Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4:761에 기술된 SV40 초기 유전자 인핸서, Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982b) 79:6777에 기술된 바, 라우스 육종 (Rous Sarcoma) 바이러스의 장말단 반복부 (LTR)에서 유래된 인핸서/프로모터, Boshart et al., Cell (1985) 41:521에 기술된 바, 인간 CMV로부터 유래된 요소, 예를 들어 CMV 인트론 A 서열에 포함된 요소가 포함된다.

전형적으로, 전사 종결자/폴리아데닐화 신호 또한 발현 작제물에 존재할 것이다. 이러한 서열의 예는 Sambrook et al., supra에 기재된 바, SV40 및 소 성장 호르몬 종결자 서열(예를 들어, 미국 특허 No. 5,122,458)로부터 유래된 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가로, 5'-UTR 서열은 코딩 서열에 인접하게 위치하여 그 발현을 향상시킬 수 있다. 이러한 서열은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함하는 UTR을 포함할 수 있다.

IRES를 포함하면 벡터에서 하나 이상의 열린 판독 프레임을 번역할 수 있다. IRES 요소는 진핵생물의 리보솜 번역 개시 복합체를 끌어당겨 번역 개시를 촉진한다. 예를 들어, Kaufman et al., Nuc. Acids Res. (1991) 19:4485- 4490; Gurtu et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1996) 229:295-298; Rees et al., BioTechniques (1996) 20:102-110; Kobayashi et al., BioTechniques (1996) 21:399-402; 및 Mosser et al., BioTechniques (1997 22 150-161을 참조한다. 다수의 IRES 서열이 공지되어 있으며, 여기에는 뇌심근염 바이러스(EMCV) UTR 등 피코르나바이러스의 리더 서열과 같이 다양한 바이러스에서 파생된 서열(EMCV) UTR (Jang et al. J. Virol. (1989) 63:1651-1660), 소아마비 리더 서열, A형 간염 바이러스 리더, C형 간염 바이러스 IRES, 인간 리노바이러스 2형 IRES (Dobrikova et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (2003) 100(25):15125-15130), 구제역 바이러스에서 유래한 IRES 요소 (Ramesh et al., Nucl. Acid Res. (1996) 24:2697-2700), 지아르디 바이러스 IRES (Garlapati etal., J. Biol. Chem. (2004) 279(5):3389-3397) 등을 포함한다. 다양한 비바이러스 IRES 서열 또한 본 명세서에서 그 용도를 설명할 것이며, 여기에는 효모에서 유래한 IRES 서열, 인간 안지오텐신 II 유형 1 수용체 IRES (Martin et al., Mol. Cell Endocrinol. (2003) 212:51-61), 섬유아세포 성장인자 IRES (FGF-1 IRES and FGF-2 IRES, Martineau et al. (2004) Mol. Cell. Biol. 24(17):7622-7635), 혈관 내피 성장 인자 IRES (Baranick et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105(12):4733-4738, Stein et al. (1998) Mol. Cell. Biol. 18(6):3112-3119, Bert et al. (2006) RNA 12(6):1074-1083) 및 인슐린 유사 성장 인자 2 IRES (Pedersen et al. (2002) Biochem. J. 363(Pt 1):37-44)를 포함되나 이에 제한되지 않는다. 이들 요소는 예를 들어 Clontech(Mountain View, CA), Invivogen(San Diego, CA), Addgene(Cambridge, MA) 및 GeneCopoeia(Rockville, MD)에서 판매하는 플라스미드로 쉽게 구할 수 있다. IRESite: 실험적으로 검증된 IRES 구조 데이터베이스(iresite.org)도 참조한다. IRES 서열은, 예를 들어, 항-오스테오폰틴 항체 중쇄 또는 그 단편을 발현 카세트로부터 항-오스테오폰틴 항체 경쇄 또는 그 단편과 조합하여 발현시키기 위해 벡터에 포함될 수 있다.

대안적으로, 바이러스 T2A 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 단일 벡터로부터 다중 단백질 산물(예: 항-오스테오폰틴 항체 경쇄 또는 그 단편과 조합된 항-오스테오폰틴 항체 중쇄 또는 그 단편)을 생산할 수 있다. 2A 링커 펩티드는 멀티시스트론 작제물의 암호화 서열 사이에 삽입된다. 자가 절단되는 2A 펩티드는 멀티시스트론 구조에서 동시 발현된 단백질이 등몰 수준(equimolar level)에서 생성되도록 한다. 구제역 바이러스, 말 비염 바이러스, 토세아 아사인아(Thosea asigna) 바이러스 및 돼지 테스코 바이러스로부터 유래된 2A 펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 바이러스로부터 유래한 2A 펩티드가 사용될 수 있다(Kim et al. (2011) PLoS One 6(4): e18556, Trichas et al. (2008) BMC Biol. 6:40, Provost et al. (2007) Genesis 45(10):625-629, Furler et al. (2001) Gene Ther. 8(11):864-873을 참조한다(전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함되어 있음).

하나 이상의 벡터를 포함하는 발현 벡터 또는 벡터 시스템은 단리된 세포, 세포주 또는 세포 집단을 형질전환하는 데 사용될 수 있으며, 그에 의해 관심 유전자 산물(예: 항체 경쇄 및 중쇄, 또는 그 단편)은 세포 또는 세포들에 의해 선택적으로 발현된다. 어떤 경우에는 항오스테오폰틴 항체가 생성되어 분비된다. 형질전환된 세포는 항체를 주변 배지로 분비한다. 특정 조절 서열은 예를 들어, 조직 플라스미노겐 활성제(TPA) 리더 서열, 인터페론(γ 또는 α) 신호 서열 또는 알려진 분비 단백질로부터 유래된 다른 신호 펩티드 서열을 사용하여 분비를 향상시키기 위해 벡터에 포함될 수 있다. 그 다음, 분비된 항체는 예를 들어, 수산화인회석 수지, 컬럼 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 전기영동, HPLC, 면역흡착 기술, 친화성 크로마토그래피, 면역침전 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 표준 정제기술을 사용하여 본 명세서에 기술된 다양한 기술에 의해 단리될 수 있다.

대안적으로, 단백질은 분비되지 않으며, 형질전환된 세포는 화학적, 물리적 또는 기계적 수단을 사용하여 파괴되는데, 이는 세포는 용해하지만 재조합 단백질은 실질적으로 온전하게 유지한다. 또한 세포내 단백질은 폴리펩티드의 누출이 발생하도록 예를 들어, 세제 또는 유기용매를 사용하여 세포막으로부터 성분을 제거함으로써 얻을 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 알려져 있으며 예를 들어, Protein Purification Applications: A Practical Approach, (Simon Roe, Ed., 2001)에 기술되어 있다.

예를 들어, 세포를 파괴하는 방법에는 초음파 처리 또는 초음파 처리; 동요; 액체 또는 고체 압출; 열처리; 동결 해동; 건조; 폭발적 감압; 삼투압 충격; 트립신, 뉴라미니다제 및 리소자임과 같은 프로테아제를 포함하는 용해 효소 처리; 알칼리 처리; 및 담즙염, 나트륨 도데실 설페이트, 트리톤, NP40 및 CHAPS와 같은 세제 및 용매의 사용이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 세포를 파괴하는 데 사용되는 특정 기술은 주로 선택의 문제이며 폴리펩티드가 발현되는 세포 유형, 배양 조건 및 사용되는 전처리에 따라 달라진다.

세포 파괴 후, 세포 파편은 일반적으로 원심분리에 의해 제거되고, 세포내에서 생성된 폴리펩티드는 표준 정제 기술을 사용하여 추가로 정제되며, 전술한 표준 정제 기술에는 컬럼 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 전기영동, HPLC, 면역흡착 기술, 친화성 크로마토그래피, 면역침전 등이 포함되나 이에 국한되지는 않는다.

중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체 또는 그 단편은 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 항-오스테오폰틴 중쇄 또는 경쇄 에피토프에 결합하는 항체를 사용하는 면역친화성 크로마토그래피, 또는 고정된 오스테오폰틴 항원을 사용한 항원-특이적 친화성 크로마토그래피와 같은 친화성 정제를 사용하여 정제할 수 있다. 적합한 친화성 수지의 선택은 당업계의 기술 범위에 속한다. 친화성 정제 후, 발현된 항체는 상기 기술된 기술 중 임의의 것과 같은 당업계에 널리 알려진 통상적인 기술을 사용하여 추가로 정제될 수 있다.

항체 접합체

또한 항오스테오폰틴 항체는 치료 및 진단(예: 생체내 영상화 등) 분야에서도 사용된다. 예를 들어, 이러한 항체는 치료제(예: 세포독성 페이로드) 또는 표지제(예: 생체내 영상화제)와 같은 페이로드에 접합될 수 있으며, 여기서 항체가 오스테오폰틴 또는 그 트롬빈 절단 단편에 결합할 때, 치료제 또는 표지제는 상승된 수준의 오스테오폰틴 또는 그 트롬빈 절단 단편(예: 오스테오폰틴을 과발현하는 암세포)을 갖는 표적 세포에 선택적으로 전달된다. 오스테오폰틴을 과발현하는 세포에 대한 치료제 또는 영상화제의 선택적 표적화는 치료제에 대한 비표적 세포의 원치 않는 노출을 감소시키고 투여시 독성을 감소시킬 수 있다. 더욱이, 영상화 응용 분야(예: 진단, 예후 및/또는 기타 목적을 위한 생체 내 영상화)에서, 오스테오폰틴을 과발현하는 세포에 대한 항체의 선택적 결합은 이러한 세포에 영상화제를 집중시켜 결과 이미지의 신호 대 잡음비 및 진단/예후 값을 증가시킨다.

따라서, 본 명세서에 기술된 임의의 항-오스테오폰틴 항체는 접합되지 않은 형태일 수 있거나, 치료제 및/또는 영상화(예: 진단) 제제와 같은 제제에 직접 접합될 수 있거나, 이러한 다른 치료제 또는 영상화제를 포함하는 담체 중합체에 간접적으로 접합될 수 있다.

일부 실시예들에서, 항체는 예를 들어, 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소(예: 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그 단편), 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성접합체)와 같은 세포독성제에 접합된다. 적합한 화학요법제는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트 및 빈데신을 포함한다 (Rowland et al., (1986) supra). 적합한 독소는 다음을 포함한다: 디프테리아 독소와 같은 세균성 독소; 리신과 같은 식물 독소; 겔다나마이신과 같은 소분자 독소 (Mandler et al J. Natl. Cancer Inst. 92(19):1573-81 (2000); Mandler et al., Bioorg. Med. Chem. Letters 10:1025-1028 (2000); Mandler et al., Bioconjugate Chem. 13.786-91 (2002)), maytansinoids (EP 1391213; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-23 (1996)), 아우리스타틴 (Doronina et al., Nat. Biotech. 21: 778-84 (2003) 및 칼리케아미신 (Lode et al., Cancer Res. 58:2928 (1998); Hinman et al., Cancer Res. 53:3336- 3342 (1993)).

항체는 방사성 동위원소, 친화성 표지(예: 비오틴, 아비딘 등), 효소 표지(예: 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 등) 형광성 또는 발광성 또는 생물발광성 표지(예: FITC 또는 로다민), 상자성 원자 등을 사용하여 검출 가능하게 표지될 수 있다. 상기 표지화를 수행하는 절차는 알려져 있으며, 예를 들어,(Sternberger, L. A. et al., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970); Bayer, E. A. et al., Meth. Enzym. 62:308 (1979); Engval, E. et al., Immunol. 109:129 (1972); Goding, J. W. J. Immunol. Meth. 13:215 (1976))를 참조한다.

특정 측면에서, 본 개시내용의 항-오스테오폰틴 항체 접합체의 영상화제는 근적외선(NIR) 광학 영상화, SPECT(단일광자 방출 컴퓨터 단층촬영)/CT 영상화 등과 같은 생체 내 영상화에 사용되는 영상화제이다. 이러한 응용 분야에서 사용되는 표지화제는 형광 표지 및 방사성 동위원소 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 특정 측면에서, 표지화제는 2개 이상의 영상화 접근법을 사용하여 생체내 영상화를 허용하는 다중 모드 생체내 영상화제이다 (예를 들어, Thorp-Greenwood and Coogan (2011) Dalton Trans. 40:6129-6143를 참조한다).

항체 모이어티의 접합은 미국 특허 No. 6,306,393에 기술되어 있다. 일반 기술 또한 Shih et al., Int. J. Cancer 41:832-839 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46:1101-1106 (1990); 및 Shih etal., 미국 특허 번호 5,057,313에 기술되어 있다. 이 일반적인 방법은 산화된 탄수화물 부분을 갖는 항체 성분을 하나 이상의 유리 아민 기능을 갖고 약물, 독소, 킬레이터, 붕소 부가물 또는 기타 치료제의 흐름이 로딩된 담체 중합체를 반응시키는 것을 포함한다. 이 반응은 초기 쉬프(Schiff) 염기(이민) 연결을 일으키며, 이는 2차 아민으로 환원되어 최종 접합체를 형성함으로써 안정화될 수 있다.

담체 중합체는 예를 들어, 50개 이상의 아미노산 잔기의 아미노덱스트란 또는 폴리펩티드일 수 있다. 약물 또는 기타 작용제를 담체 중합체에 접합시키는 다양한 기술은 당업계에 알려져 있다. 폴리펩티드 담체는 아미노덱스트란 대신에 사용될 수 있지만, 폴리펩티드 담체는 사슬에 적어도 50개의 아미노산 잔기가 있어야 하며, 약 100-5000개의 아미노산 잔기가 될 수 있다. 적어도 아미노산의 일부는 라이신 잔기 또는 글루타메이트 또는 아스파테이트 잔기여야 한다. 라이신 잔기의 펜던트 아민 및 글루타민 및 아스파르테이트의 펜던트 카르복실레이트는 약물, 독소, 면역조절제, 킬레이터, 붕소 부가물 또는 기타 치료제를 부착하는 데 편리하다. 적합한 폴리펩티드 담체의 예에는 폴리리신, 폴리글루탐산, 폴리아스파르트산, 이들의 공중합체(co-polymer) 및 이들 아미노산의 혼합 중합체, 그리고 예를 들어 세린 등 생성된 담체 및 접합체에 바람직한 용해도 특성을 부여하는 기타 담체를 포함한다. 항체가 접합될 수 있는 제제의 예는 본 명세서에 기술된 임의의 세포독성 화학요법제를 포함한다.

접합 항체는 항체 성분을 치료제 또는 표지제와 직접 접합함으로써 제조할 수 있다. 일반적인 절차는 치료제 또는 표지제가 산화된 항체 성분에 직접 부착된다는 점을 제외하고는, 간접 접합 방법과 유사하다. 예를 들어, 항체의 탄수화물 부분은 반감기를 연장하기 위해 폴리에틸렌 글리콜에 부착될 수 있다.

치료제 또는 표지제는 이황화 결합 형성을 통해, 또는 N-숙시닐 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)와 같은 이종이작용성(heterobifunctional) 가교제를 사용하여 환원된 항체 성분의 힌지 영역에 부착될 수 있다. Yu et al., Int. J. Cancer 56:244 (1994). 이러한 접합을 위한 일반적인 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Wong, Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking (CRC Press 1991); Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), p. 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), p.60-84(Cambridge University Press 1995) 을 참조한다. 다양한 이관능성 단백질 커플링제가 당업계에 공지되어 있으며, 그 예로는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체(예: 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예: 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예: 글루타르알데히드), 비스 -아지도 화합물(예: 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예: 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)이 있다.

약제학적 조성물

항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편(또는 이를 포함하는 접합체)은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 선택적으로 포함하는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 예시적인 부형제는 탄수화물, 무기 염, 항미생물제, 항산화제, 계면활성제, 완충제, 산, 염기, 및 이들의 조합을 제한 없이 포함한다. 주사가능한(injectable) 조성물에 적합한 부형제는 물, 알코올, 폴리올, 글리세린, 식물성 오일, 인지질 및 계면활성제를 포함한다. 당과 같은 탄수화물, 알디톨과 같은 유도체화 당, 알돈산, 에스테르화 당 및/또는 당 중합체가 부형제로서 존재할 수 있다. 특정 탄수화물 부형제는 예를 들어 과당, 말토오스, 갈락토오스, 글루코오스, D-만노오스, 소르보오스 등과 같은 단당류; 락토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 셀로비오스 등과 같은 이당류; 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등과 같은 다당류; 및 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨, 소르비톨(글루시톨), 피라노실 소르비톨, 미오이노시톨 등과 같은 알디톨을 포함한다. 부형제는 또한 시트르산, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 질산칼륨, 일염기성 인산나트륨, 이염기성 인산나트륨 및 이들의 조합과 같은 무기 염 또는 완충액을 포함할 수 있다.

조성물은 또한 미생물 성장을 방지하거나 저지하기 위한 항미생물제를 포함할 수 있다. 본 발명에 적합한 항균제의 비제한적인 예는 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 벤질 알코올, 염화세틸피리디늄, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알코올, 질산페닐수은, 티머솔 및 이들의 조합을 포함한다.

항산화제 또한 조성물에 존재할 수 있다. 산화 방지제는 산화를 방지하여 항체 또는 제제의 다른 구성 요소의 열화를 방지하는 데 사용된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 항산화제는 예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 차아인산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 중아황산나트륨, 포름알데히드 술폭실산나트륨, 메타중아황산나트륨 및 이들의 조합을 포함한다.

계면 활성제가 부형제로 존재할 수 있다. 예시적인 계면활성제는 "Tween 20" 및 "Tween 80"과 같은 폴리소르베이트 및 F68 및 F88(BASF, Mount Olive, New Jersey)과 같은 플루로닉; 소르비탄 에스테르; 레시틴 및 기타 포스파티딜콜린과 같은 인지질, 포스파티딜에탄올아민(단, 리포솜 형태가 아니어야 바람직함), 지방산 및 지방 에스테르와 같은 지질; 콜레스테롤과 같은 스테로이드; EDTA와 같은 킬레이트제; 그리고 아연 및 기타 적합한 양이온을 포함한다.

산 또는 염기가 조성물에 부형제로 존재할 수 있다. 사용될 수 있는 산의 비제한적인 예는 염산, 아세트산, 인산, 시트르산, 말산, 락트산, 포름산, 트리클로로아세트산, 질산, 과염소산, 인산, 황산, 푸마르산 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 산을 포함한다. 적합한 염기의 예는 수산화나트륨, 아세트산나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 아세트산암모늄, 아세트산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 시트르산나트륨, 포름산나트륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 푸민산칼륨 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 염기를 제한 없이 포함한다.

조성물 중 임의의 개별 부형제의 양은 부형제의 성질 및 기능 및 조성물의 특정 요구에 따라 달라질 것이다. 일반적으로 임의의 개별 부형제의 최적량은 일상적인 실험을 통해, 즉 다양한 양의 부형제를 함유(낮은 함량에서 높은 함량까지)하는 조성물을 제조하고, 안정성 및 기타 매개변수를 조사한 다음 심각한 부작용 없이 최적의 성능이 달성되는 범위를 확정함으로써 결정된다. 단, 일반적으로 부형제는 부형제의 중량 기준으로 약 1중량% 내지 약 99중량%, 바람직하게는 약 5중량% 내지 약 98중량%, 더욱 바람직하게는 약 15 내지 약 95중량%의 양으로 조성물에 존재하며, 30 중량% 미만의 농도가 가장 바람직하다. 전술한 약제학적 부형제는 다른 부형제와 함께 "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995), the "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), 및 Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000에 설명되어 있다.

조성물은 모든 유형의 제형 및 특히 주사에 적합한 제제, 예를 들어 사용 전에 용매로 재구성될 수 있는 분말 또는 동결건조물, 그리고 주사 용액 또는 현탁액용으로 준비된 것, 사용 전에 비히클과 조합하기 위한 건조 불용성 조성물 및 투여 전에 희석을 위한 에멀젼 및 액체 농축물을 포함한다. 주사 전에 고체 조성물을 재구성하기 위한 적합한 희석제의 예는 주사용 정균수, 물 중 덱스트로스 5%, 인산염 완충 식염수, 링거 용액, 식염수, 멸균수, 탈이온수, 및 이들의 조합을 포함한다. 액체 약제학적 조성물과 관련하여, 용액 및 현탁액이 구상되고 있다. 추가의 바람직한 조성물은 경구 또는 국소 전달을 위한 것을 포함한다.

약제학적 제제는 의도된 전달 및 사용 방식에 따라 주사기, 이식 장치 등에 수용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 명세서에 기술된 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편(또는 이를 포함하는 접합체)을 포함하는 조성물은 단위 투여 형태로, 즉 미리 측정되거나 미리 포장된 형태로 단일 용량에 적합한 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편 (또는 이를 포함하는 접합체)의 양을 의미한다.

조성물은 하나 이상의 추가 제제, 예를 들어 오스테오폰틴 관련 장애를 치료하기 위한 약물 또는 질환 또는 질병에 대해 대상을 치료하는 데 사용되는 기타 약물을 임의로 포함할 수 있다 예를 들어, 복합 제제는 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편(또는 이를 포함하는 접합체) 및 암 치료를 위한 하나 이상의 약물, 예를 들어 화학요법제, 면역요법제, 생물학적 치료제, 세포자멸사 촉진제, 혈관신생 억제제, 광활성제, 방사선감작제 및 방사성 동위원소를 포함할 수 있으나 이에 국한되지 않는다. 흑색종을 치료하기 위해, 복합 제제는 B-Raf 억제제, MEK 억제제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예시적인 B-Raf 억제제는 다브라페닙, 베무라페닙, 소라페닙, LGX818, GDC-0879 및 PLX-4720을 제한없이 포함한다. 예시적인 MEK 억제제는 트라메티닙, 코비메티닙, 비니메티닙, 셀루메티닙 및 PD-325901을 제한없이 포함한다. 대안적으로, 이러한 제제는 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편(또는 이를 포함하는 접합체)을 포함하는 조성물과 별개의 조성물에 함유될 수 있고, 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편(또는 이를 포함하는 접합체)를 포함하는 조성물 전 또는 후에 동시 투여될 수 있다.

오스테오폰틴 관련 질환의 치료 방법

본 개시내용은 오스테오폰틴의 활성과 관련된 오스테오폰틴 관련 장애를 치료하는 방법을 제공한다. "오스테오폰틴 관련 질환"은 염증, 심장비대증, 심근섬유증 및 흑색종, 교모세포종, 난소암, 유방암, 폐암 등의 오스테오폰틴 과발현 암을 제한 없이 포함하여, 오스테오폰틴 또는 그 트롬빈 절단 단편의 수치 상승과 관련된 모든 질병 또는 장애를 포함한다.

이 방법은 일반적으로 본 명세서에 기술된 항-오스테오폰틴 항체, 항원-결합 단편 또는 접합체의 치료적 유효량을, 단독으로(예: 단일 요법) 또는 하나 이상의 추가 치료제(예: 항암 치료제, B-Raf 억제제 및/또는 MEK 억제제)와 조합하여(예: 병용 요법), 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 측면에서, 상기 방법은 치료적 유효량의 항-오스테오폰틴 항체(예: 오스테오폰틴 또는 그 트롬빈 절단 단편에 특이적으로 결합하는 본 개시내용의 항체로, 이 항체는 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 또는 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 단편에 대한 인테그린 결합을 억제함)를 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써, 오스테오폰틴 관련 장애를 치료하는 것을 포함한다.

방법에 따라 다양한 숙주를 치료할 수 있다. 일반적으로, 이러한 숙주는 "포유동물" 또는 "포유류"이며, 여기서 이러한 용어는 육식동물(예: 개 및 고양이), 설치류(예: 생쥐, 기니피그, 및 쥐) 및 영장류(예: 인간, 침팬지 및 원숭이) 목을 포함하여 포유류 강에 속하는 유기체를 설명하는 데 광범위하게 사용된다. 많은 경우 호스트는 인간이다.

본 개시내용의 항체 조성물의 전구약물은 또한 본 명세서에 기재된 방법에서 고려된다. 이러한 전구약물은 일반적으로 생체내에서 필요한 화합물로 쉽게 전환될 수 있는 화합물의 기능적 유도체이다. 따라서, 본 개시내용의 방법에서, 용어 "투여"는 구체적으로 개시된 화합물 또는 구체적으로 개시되지 않을 수 있지만 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된 후 생체내에서 특정 화합물로 전환되는 화합물과 함께 투여하는 것을 포함한다. 적합한 전구약물 유도체의 선택 및 제조를 위한 통상적인 절차는 예를 들어, Wermuth, "Designing Prodrugs and Bioprecursors" in Wermuth, ed. Practice of Medicinal Chemistry, 2d Ed., pp. 561-586(Academic Press 2003)에 기재되어 있다. 전구약물에는 생체내(예: 인체에서) 가수분해되어 본 명세서에 기재된 화합물을 생성하는 에스테르가 포함된다. 적합한 에스테르 기는 제한 없이 약학적으로 허용되는 지방족 카르복실산, 특히 알칸산, 알켄산, 시클로알칸산 및 알칸디오산으로부터 유도된 것을 제한 없이 포함하며, 여기서 각각의 알킬 또는 알케닐 부분은 6개 이하의 탄소 원자를 갖는다. 예시적인 에스테르는 포맷, 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 아크릴레이트, 시트레이트, 숙시네이트, 및 에틸숙시네이트를 포함한다.

복용량

본 개시내용의 방법에서, 유효량의 항-오스테오폰틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (또는 이를 포함하는 접합체)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여한다. 투여되는 양은 투여 목표, 치료되는 특정 오스테오폰틴 관련 장애, 치료될 개인의 건강 및 신체 상태, 연령, 치료될 개인의 분류학적 그룹(예: 인간, 인간 영장류, 영장류 등), 원하는 해결 정도, 항-오스테오폰틴 항체 또는 접합체의 제형, 의료 상황에 대한 치료 임상의의 평가 및 기타 관련 요인에 따라 다르다. 투여량은 일상적인 시도를 통해 결정할 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것으로 기대한다. 예를 들어, 염증, 심장 비대, 심근 섬유증, 또는 암세포 성장, 전이 및/또는 침습성을 억제하기 위해 사용되는 항-오스테오폰틴 항체 또는 접합체의 양은 대상체에게 돌이킬 수 없는 독성이 있을 수 있는 양 이하이다(즉, 최대 허용 용량). 다른 경우에, 그 양은 독성 역치에 가깝거나 훨씬 낮으나, 여전히 유효 농도 범위에 있거나 심지어 역치 용량만큼 낮다.

개별 용량은 일반적으로 대상에 대해 측정 가능한 효과를 생성하는 데 필요한 양 이상이며, 항체 또는 접합체의 흡수, 분포, 대사 및 배설("ADME")에 대한 약동학 및 약리학에 기초하여 결정될 수 있으며, 따라서 대상 내에서 조성물의 성향을 기반으로 한다. 여기에는 투여 경로 및 투여량에 대한 고려가 포함되며, 예를 들어 비경구(전신 또는 국소 효과를 위해 소화관 이외의 경로로 적용) 적용을 위해 조정할 수 있다. 예를 들어, 항-오스테오폰틴 항체 또는 접합체의 투여는 전형적으로 국소 또는 주사(예를 들어, 정맥내, 근육내 또는 종양내), 또는 이들의 조합을 통해 이루어진다.

대상체 내에서 항체 또는 접합체의 배치 및 해당 생물학적 활성은 일반적으로 관심 표적에 존재하는 항체의 분획에 대해 측정된다. 예를 들어, 항체는 일단 투여되면 상승된 수준의 오스테오폰틴 또는 이의 트롬빈 절단 단편을 갖는 병든 세포에서 물질을 농축하는 생물학적 표적(예: 오스테오폰틴)에 축적될 수 있다 따라서, 항체가 시간이 지남에 따라 관심 표적에 축적되도록 투여되는 투여 요법은 더 낮은 개별 용량을 허용하는 전략의 일부일 수 있다. 또한 이는 예를 들어, 생체 내에서 더 천천히 제거되는 항체의 용량이 시험관 내 분석에서 계산된 유효 농도에 비해 낮아질 수 있음을 의미할 수 있다(예: 시험관 내 유효량 mM 농도는 생체 내 mM 농도보다 낮다).

예로서, 용량 또는 투여 요법의 유효량은 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 또는 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 단편에 대한 인테그린 결합을 억제하기 위한 주어진 항체의 IC50으로부터 측정될 수 있다. "IC50"은 시험관내 50% 억제에 필요한 농도를 의미한다. 대안적으로, 주어진 항체 농도의 EC50으로부터 유효량을 측정할 수 있다. "EC50"은 생체 내에서 최대 효과의 50%를 얻는 데 필요한 혈장 농도를 의미한다.

일반적으로, 본 개시내용의 항-오스테오폰틴 항체 또는 접합체와 관련하여, 유효량은 일반적으로 200* 계산된 IC50 이하이다. 전형적으로, 투여되는 항체 또는 접합체의 양은 계산된 IC50보다 약 200배 미만, 약 150배 미만, 약 100배 미만 및 대다수 실시예에서 약 75배 미만, 약 60배 미만, 50배 미만, 45배 미만, 40배, 35배 미만, 30x, 25x, 20x, 15x, 10x 및 약 8x 또는 2x 미만이다. 한 실시예에서, 유효량은 계산된 IC50의 약 1x 내지 50x이고, 때때로 계산된 IC50의 약 2x 내지 40x, 약 3x 내지 30x 또는 약 4x 내지 20x이다. 즉, 유효량은 계산된 IC50과 동일하며, 어떤 면에서 유효량은 계산된 IC50보다 많은 양이다.

유효량은 계산된 EC50의 100배를 초과할 수 없다. 예를 들어, 투여되는 항체 또는 접합체의 양은 계산된 EC50보다 약 100x 미만, 약 50x 미만, 약 40x, 35x, 30x 또는 25x 미만 및 대다수 실시예에서 약 20x 미만, 약 15x 미만 및 10배, 9배, 8배, 7배, 6배, 5배, 4배, 3배, 2배 또는 1배 미만이다. 한 실시양태에서, 유효량은 계산된 EC50의 약 1x 내지 30x이고, 때때로 계산된 EC50의 약 1x 내지 20x, 또는 약 1x 내지 10x이다. 즉, 유효량은 계산된 EC50과 동일하며, 어떤 면에서 유효량은 계산된 EC50보다 많은 양이다.

유효량은 시험관내 및 생체내 시험뿐만 아니라 안전성 및 증량 및 용량 범위 시험, 개별 임상의-환자 관계로부터 시험법으로부터 경험적으로 쉽게 결정할 수 있다.

투여

오스테오폰틴의 트롬빈 절단 또는 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 단편에 대한 인테그린 결합을 억제하는 항-오스테오폰틴 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (또는 그의 접합체)의 하나 이상의 치료 유효 용량이 투여될 것이다. 항-오스테오폰틴 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 "치료 유효 용량 또는 양"은 투여될 때 오스테오폰틴 관련 장애에 대한 개체의 치료와 관련하여 긍정적인 치료 반응을 일으키는 양을 의미한다. 항종양 또는 항염증 효과를 제공하거나 심장 비대 또는 심근 섬유증을 감소시키는 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편의 양은 특히 중요하다. "양성 치료 반응"은 본 발명에 따른 치료를 받는 개체가 치료를 받고 있는 개체에 대한 오스테오폰틴 관련 장애의 하나 이상의 증상의 개선을 나타내는 것으로 의도된다.

따라서, 예를 들어 "양성 치료 반응"은 요법과 관련된 질병의 개선 및/또는 요법과 관련된 질병의 하나 이상의 증상의 개선일 수 있다 예를 들어, 암 치료에 대한 긍정적인 치료 반응은 다음 질병의 개선 중 하나 이상을 의미한다: (1) 종양 크기의 감소; (2) 암세포 수의 감소; (3) 종양 성장의 억제(즉, 어느 정도 감속, 바람직하게는 정지); (4) 말초 기관으로의 암세포 침윤의 억제(즉, 어느 정도 감속, 바람직하게는 정지); (5) 종양 전이의 억제(즉, 어느 정도 감속, 바람직하게는 정지); 및 (6) 암과 관련된 하나 이상의 증상으로부터 어느 정도의 경감. 이러한 치료 반응은 개선 정도에 따라 추가로 특징지어질 수 있다 따라서 예를 들어 개선은 완전한 반응으로 특징지어질 수 있다 "완전한 반응"이란 신체 검사, 실험실, 핵 및 방사선 연구(즉, CT(컴퓨터 단층 촬영) 및/또는 MRI(자기 공명 영상)) 및 연구 시작 시점에 양성인 모든 초기 이상 또는 부위에 대해 반복되는 기타 비침습적 절차에 의해 확인된 모든 측정 가능하거나 평가 가능한 질병의 모든 증상 및 징후의 소실에 대한 문서이다. 대안적으로, 질병의 개선은 부분적 반응으로 분류될 수 있다. "부분적 반응"은 치료 전 측정과 비교할 때 모든 측정 가능한 병변의 수직 직경 곱의 합에서 50% 이상 감소를 의도한다(평가 가능한 반응만 있는 환자의 경우 부분 반응은 적용되지 않음).

특정 실시예에서, 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편(또는 이의 접합체) 및/또는 하나 이상의 다른 치료제, 예를 들어 암, 염증, 심장비대, 심근섬유증을 치료하기 위한 약물 및 기타 약물을 포함하는 조성물의 다중 치료 유효 용량이 일일 투여 요법에 따라 또는 간헐적으로 투여된다. 예를 들어, 치료 유효량은 일주일에 하루, 일주일에 이틀, 일주일에 3일, 일주일에 4일, 또는 일주일에 5일 등으로 투여될 수 있다 "간헐적" 투여는 치료 유효량을 예를 들어 격일로, 2일마다, 3일마다 등으로 투여할 수 있는 것으로 의도된다. 예를 들어, 어떤 방식으로든 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편(또는 그 접합체)은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8...10...15...24주와 같은 연장된 기간 동안 주 2회 또는 주 3회 투여될 것이다. "매주 2회" 또는 "주당 2회"는 문제의 제제의 2회의 치료 유효 용량이 투여 첫 주의 1일차에 시작하여 복용 사이에 최소 72시간 및 최대 96시간을 두고 7일 기간 내에 대상체에게 투여된다. "매주 3회" 또는 "주당 3회"는 3회의 치료학적 유효 용량이 복용 간 최소 48시간 및 최대 72시간을 두고, 7일 기간 내에 대상체에게 투여된다. 본 발명의 목적을 위해, 이러한 유형의 투여는 "간헐적" 요법으로 지칭된다. 본 발명의 방법에 따르면, 대상체는 원하는 치료 반응이 달성될 때까지 1주 이상의 주기 동안 간헐적 요법(즉, 치료 유효량의 주 2회 또는 주 3회 투여)을 받을 수 있다. 제제는 하기에 언급된 바와 같이 임의의 허용가능한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.

항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편(이의 접합체)을 포함하는 조성물은 반드시는 아니지만, 일반적으로 경구, 주사(피하, 정맥내 또는 근육내), 주입, 국소 또는 국부적으로 투여된다. 동맥내, 복강내, 폐, 비강, 경피, 병변내, 흉막내, 실질내, 직장, 경피, 경점막, 척추강내, 심낭, 동맥내, 안구내 등과 같은 추가 투여 방식이 또한 고려된다. 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편(이의 접합체)을 주사로 투여하는 경우, 투여는 연속 주입 또는 단일 또는 다회분(boluse)일 수 있다.

예를 들어, 항-오스테오폰틴 항체 또는 접합체는 주입에 의해 또는 국소 주사에 의해, 예를 들어, 약 75 mg/h 내지 약 375 mg/h, 약 100 mg/h 내지 약 350 mg/h, 약 150 mg/h 내지 약 350 mg/h, 약 200 mg/h 내지 약 300 mg/h, 약 225 mg/h 내지 약 275 mg/h 를 포함하여 약 50 mg/h 내지 약 400 mg/h의 주입 속도로 투여할 수 있다. 예시적인 주입 속도로 예를 들어, 1 mg/m²/일 내지 약 9 mg/m²/일, 약 2 mg/m²/일 내지 약 8 mg/m²/일, 약 3 mg/m²/일 내지 약 7 mg/m²/일, 약 4 mg/m²/일 내지 약 6 mg/m²/day, 약 4.5 mg/m²/일 내지 약 5.5 mg/m²/일을 포함하여 약 0.5 mg/m²/일 내지 약 10 mg/m²/일의 원하는 치료 용량을 달성할 수 있다. 투여(예: 주입에 의한)는 원하는 기간 동안 반복될 수 있고, 예를 들어, 약 1일 내지 약 5일의 기간에 걸쳐 반복되거나, 또는 며칠에 한 번, 예를 들어, 약 5일, 약 1개월에 걸쳐, 약 2개월에 걸쳐 반복될 수 있다.

본 발명에 따른 제제는 또한 국소 치료에 적합하다. 특정 실시양태에서, 조성물은 암 치료를 위한 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편 (또는 그의 접합체)의 국소 전달에 사용된다. 예를 들어, 조성물은 종양 또는 암 세포에 직접 투여될 수 있다. 투여는 국소 카테터 또는 직접적인 병변내 주사를 통한 관류에 의한 것일 수 있다. 흑색종의 치료를 위해, 조성물은 국소적으로, 예를 들어 병변 부위의 피부에 적용되는 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편(또는 이의 접합체)을 함유하는 크림 또는 젤로 투여될 수 있다.

약제학적 제제는 투여 직전에 액체 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있지만, 시럽, 크림, 연고, 정제, 캡슐, 분말, 젤, 매트릭스, 좌제 등과 같은 다른 형태를 취할 수도 있다. 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편(또는 이의 접합체) 및 기타 제제를 포함하는 약제학적 조성물은 당업계에 알려진 임의의 의학적으로 허용되는 방법에 따라 동일하거나 상이한 투여 경로를 사용하여 투여될 수 있다.

또 다른 실시예에서, 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편 (또는 그의 접합체) 및/또는 기타 작용제를 포함하는 제약 조성물은 예를 들어, 오스테오폰틴-관련 장애의 발병 또는 진행을 예방하기 위해 예방적으로 투여된다. 이러한 예방적 용도는 암 진행 또는 심장비대증 또는 섬유증의 위험이 높은 대상에게 특히 효과가 있을 것이다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편 (또는 그의 접합체) 및/또는 기타 작용제를 포함하는 제약 조성물은 서방성 제제 또는 서방성 장치를 사용하여 투여되는 제제이다. 전술한 장치는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 비지속 방출 제약 조성물로 지속 방출 효과를 달성하기 위해 다양한 투여량에서 지속적이고 정상 상태 방식으로 시간 경과에 따른 약물 전달을 제공할 수 있는 경피 패치 및 소형 이식 가능 펌프를 포함한다.

본 발명은 또한 오스테오폰틴 관련 장애가 있는 환자에게 제공된 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편(예를 들어, 치료제, 검출가능한 표지 또는 영상화제에 접합된)을 포함하는 접합체를 투여하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 바람직하게는 약제학적 조성물의 일부로서 제공되는 접합체 또는 약물 전달 시스템의 치료적 유효량을 본 명세서에 기재된 임의의 방식을 통해 투여하는 것을 포함한다. 투여 방법은 항-오스테오폰틴 항체를 사용한 치료에 반응하는 임의의 오스테오폰틴 관련 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다 더 구체적으로, 조성물은 염증, 심장비대증/섬유증 및 오스테오폰틴의 상승된 발현과 관련된 암을 치료하는데 효과적이다.

당업자는 항-오스테오폰틴 항체가 어떤 상태를 효과적으로 치료할 수 있는지 이해할 것이다. 투여될 실제 투여량은 연령, 체중 및 대상체의 일반적인 상태 뿐만 아니라 치료되는 상태의 중증도, 의료 전문가의 판단 및 투여되는 접합체에 따라 달라질 것이다. 치료 유효량은 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 각각의 특정 경우의 특정 요건에 맞게 조정될 것이다.

일반적으로, 치료적 유효량은 매일 약 0.50 mg 내지 5 g의 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편(또는 그의 접합체), 더 바람직하게는 매일 약 5 mg 내지 2 g, 훨씬 더 바람직하게는 매일 약 7mg에서 1.5g의 범위일 것이다. 바람직하게는, 이러한 용량은 10-600 mg 1일 4회(QID), 200-500 mg QID, 25-600 mg 1일 3회(TID), 25-50 mg TID, 50-100 mg TID, 50-200 mg TID, 300-600 mg TID, 200-400 mg TID, 200-600 mg TID, 100-700 mg 1일 2회(BID), 100-600 mg BID, 200-500 mg BID, 또는 200-300 mg BID이다. 투여되는 화합물의 양은 특정 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편(또는 이의 접합체)의 효능, 원하는 크기 또는 효과 및 투여 경로에 따라 달라질 것이다.

정제된 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편 또는 그 접합체(다시 말해, 바람직하게는 약제학적 제제의 일부로서 제공되는)는 단독으로 또는 오스테오폰틴 관련 장애를 치료하기 위해, 임상의의 판단, 환자의 필요 등에 따라, 다양한 투여 일정에 따라 특정 상태 또는 질병을 치료하는 데 사용되는 화학요법, 면역요법, 생물학적 또는 표적 치료제 또는 기타 약물과 같은 하나 이상의 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 특정 투여 일정은 당업자에게 공지되어 있거나 일상적인 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 예시적인 투여 일정은 1일 5회, 1일 4회, 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 매주 3회, 매주 2회, 매주 1회, 매월 2회, 매월 1회 및 이들의 임의의 조합을 제한 없이 포함한다. 바람직한 조성물은 1일 1회 이하의 투여를 필요로 하는 조성물이다.

항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편 또는 그 접합체는 다른 제제 이전에, 이와 동시에, 또는 이후에 투여될 수 있다. 다른 제제와 동시에 제공되는 경우, 항-오스테오폰틴 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그의 접합체는 동일하거나 상이한 조성물로 제공될 수 있다. 따라서, 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편 또는 그 접합체 및 기타 제제는 동시 요법을 통해 개체에게 제공될 수 있다. "동시 요법"은 물질 조합의 치료 효과가 치료를 받는 대상에서 유발되도록 하는 방식으로 대상에 투여하도록 의도된다. 예를 들어, 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편 또는 그 접합체를 포함하는 약제학적 조성물의 용량 및 암 치료를 위해 치료 유효량을 포함하며 다른 약물과 같은 하나 이상의 다른 작용제를 포함하는 약제학적 조성물의 용량을 특정 투여 요법에 따라 조합하여 달성할 수 있다. 유사하게, 항-오스테오폰틴 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 접합체 및 하나 이상의 다른 치료제는 적어도 하나의 치료 용량으로 투여될 수 있다. 별도의 약제학적 조성물의 투여는 이들 물질의 조합의 치료 효과가 치료를 받는 대상에서 유발되는 한 동시에 또는 다른 시간에(즉, 순차적으로, 어느 순서로든, 같은 날에, 또는 다른 날에) 수행될 수 있다.

이전에 언급된 투여 요법에 따라 치료를 받는 대상이 장기간 관해 기간 후에 부분 반응 또는 재발을 나타내는 경우, 질병의 완전한 관해를 달성하기 위해 동시 요법의 후속 과정이 필요할 수 있다 따라서, 제1 치료 기간으로부터 일정 기간의 휴지기 이후에, 대상체는 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편 또는 그 접합체를 사용하여 하나 이상의 추가 치료 기간을 받을 수 있다. 이러한 치료 기간 사이의 휴식 기간을 중단 기간이라고 합니다. 중단 기간의 길이는 이들 치료제를 사용한 동시 요법의 임의의 이전 치료 기간으로 달성된 종양 반응(즉, 완전 대 부분)의 정도에 따라 달라진다.

암 환자에서 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편 또는 그 접합체를 사용한 치료는 암에 대한 임의의 다른 의학적 치료와 조합될 수 있으며, 여기에는 수술, 방사선 요법, 화학요법, 호르몬 요법, 면역 요법, 또는 분자 표적 또는 생물학적 요법이 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원 결합 단편 또는 그 접합체와 이들 다른 의학적 치료 방법의 임의의 조합을 사용하여 대상체에서 암을 효과적으로 치료할 수 있다.

예를 들어, 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편 또는 그 접합체를 사용한 치료는 아비트렉세이트, 아드리아마이신, 아드루실, 암사크린, 아스파라기나제, 안트라사이클린, 아자시티딘, 아자티오프린, 비크누, 블레녹산, 부설판, 블레오마이신, 캄프토사르, 캄프토테신, 카보플라틴, 카무스틴, 세루비딘, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 코스메젠, 시타라빈, 시토사르, 시클로포스파미드, 시톡산, 닥티노마이신, 도세탁셀, 독소루비신, 다우노루비신, 엘렌스, 엘스파, 에피루비신, 에토포사이드, 플루다라빈, 플루오로우라실, 플루다라, 젬시타빈, 젬자, 하이캄틴, 하이드록시우레아, 하이드레아, 이다마이신, 이다루비신, 이포스파미드, 이펙스, 이리노테칸, 란비스, 류케란, 류스타틴, 마툴란, 메클로레타민, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미톡산트론, 미트라마이신, 뮤타마이신, 마일레란, 마일로사르, 나벨빈, 니펜트, 노반트론, 온코빈, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파라플라틴, 펜토스타틴, 플라티놀, 플리카마이신, 프로카바진, 퓨리네톨, 랄리트렉시드, 탁소테레, 탁솔, 테니포시드, 티오구아닌, 토뮤덱스, 토포테칸, 발루비신, 벨반, 베페시드, 빈블라스틴, 빈데신, 빈크리스틴, 비노렐빈, VP-16 및 부몬을 포함하나 이에 제한되지 않고, 하나 이상의 화학요법제를 사용한 화학요법과 결합할 수 있다.

또 다른 예시에서, 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편 또는 그 접합체를 사용한 치료는, 티로신키나제 억제제, 예를 들어 이마티닙 메실레이트(Gleevec, STI-571로도 알려짐), 게피티닙(Iressa, ZD1839로도 알려짐), 에를로티닙(Tarceva로 시판), 소라페닙(Nexavar), 수니티닙(Sutent), 다사티닙(Sprycel) 라파티닙(Tykerb), 닐로티닙(Tasigna) 및 보르테조밉(Velcade); 토파시티닙과 같은 야누스 키나제 억제제; 크리조티닙과 같은 ALK 억제제; 오바토클락스 및 고시폴과 같은 Bcl-2 억제제; 이니파립 및 올라파립과 같은 PARP 억제제; 페리포신과 같은 PI3K 억제제; 아파티닙과 같은 VEGF 수용체 2 억제제; [D-Lys(6)]-LHRH에 연결된 AN-152(AEZS-108) 독소루비신; 베무라페닙, 다브라페닙 및 LGX818과 같은 Braf 억제제; 트라메티닙과 같은 MEK 억제제; PD-0332991 및 LEE011과 같은 CDK 억제제; 살리노마이신과 같은 Hsp90 억제제; 빈타폴라이드와 같은 소분자 약물 접합체; 템시롤리무스(Torisel), 에베롤리무스(Afinitor), 베무라페닙(Zelboraf), 트라메티닙(Mekinist) 및 다브라페닙(Tafinlar)과 같은 세린/트레오닌 키나제 억제제; 그리고 리툭시맙(MabThera 또는 Rituxan으로 시판), 트라스투주맙(Herceptin), 알렘투주맙, 세툭시맙(Erbitux로 시판), 파니투무맙, 베바시주맙(Avastin으로 시판) 및 이필리무맙(Yervoy) 등의 단일클론 항체를 포함하나 이에 제한되지 않고, 하나 이상의 소분자 억제제 또는 단일클론 항체를 사용한 표적 요법과 결합할 수 있다.

추가 예시에서, 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편 또는 그 접합체를 사용한 치료는 다음 중 하나의 사용을 포함하나 이에 제한되지 않는 면역요법과 병행할 수 있다: 암 백신(예: E75 HER2 유래 펩티드 백신, nelipepimut-S(NeuVax), Sipuleucel-T), 항체 요법(예: 트라스투주맙, 아도트라스투주맙 엠탄신, 알렘투주맙, 이필리무맙, 오파투무맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 또는 리툭시맙), 사이토카인 요법(예: 인터페론, I형(IFNa 및 IFN[3) 포함), II형(IFNγ) 및 III형(IFNA) 및 인터루킨(인터루킨-2(IL-2) 포함), 면역보조제 면역화학요법(예: 다당류-K), 선택적 T 세포 요법 및 면역 관문 차단 요법.

추가 예시에서, 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편 또는 그 접합체를 사용한 치료는 요오드-131, 스트론튬-89, 사마륨-153 및 라듐-223을 포함하나 이에 제한되지 않는 방사성 동위원소를 사용한 방사선 요법과 병행할 수 있다. 또한, 방사선 요법은 시스플라틴, 니모라졸 및 세툭시맙을 포함하나 이에 제한되지 않는 방사선 과민성 약물의 투여와 병행할 수 있다.

흑색종 환자의 경우, 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편 또는 그 접합체를 사용한 치료는 B-Raf 억제제, MEK 억제제 또는 이들을 조합한 투여와 결합할 수 있다. 예시적인 B-Raf 억제제는 다브라페닙, 베무라페닙, 소라페닙, LGX818, GDC-0879 및 PLX-4720을 제한없이 포함한다. 예시적인 MEK 억제제는 트라메티닙, 코비메티닙, 비니메티닙, 셀루메티닙 및 PD-325901을 제한없이 포함한다.

키트

본 명세서에 기술된 임의의 조성물이 키트에 포함될 수 있다. 예를 들어, 키트는 항-오스테오폰틴 항체, 그 항원-결합 단편, 항-오스테오폰틴 항체의 접합체, 항-오스테오폰틴 항체 및/또는 그 접합체를 포함하는 약제학적 제형, 항-오스테오폰틴 항체 및/또는 숙주 세포를 암호화하는 재조합 핵산 또는 벡터 시스템을 포함할 수 있다(항-오스테오폰틴 항체를 암호화하는 재조합 핵산 또는 벡터 시스템으로 형질감염되거나 단리됨).

일부 측면에서, 키트는 오스테오폰틴 또는 그 트롬빈 절단 단편에 특이적으로 결합하는 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하고, 여기서 항체는 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 또는 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 단편에 대한 인테그린 결합을 억제한다. 특정 실시예들에서, 키트는 항-오스테오폰틴 항체 접합체 또는 항체 및/또는 접합체를 포함하는 제제를 포함한다.

특정 실시예들에서, 키트에 포함된 항체 또는 그 항원-결합 단편은 OPN-R 단편 또는 OPN-CTF 단편에 특이적으로 결합한다. 특정 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 오스테오폰틴의 Arg168을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 1-7, 서열번호 9-12 및 서열번호 47로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 구성된 오스테오폰틴 펩티드에 특이적으로 결합한다.

특정 실시예들에서, 키트에 포함된 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3), 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 일부 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 14 또는 서열 번호 18의 아미노산 서열 또는 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성과 같이 범위 내 임의의 동일성 백분율을 포함하여 그에 대해 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 포함한다. 일부 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 16 또는 서열번호 20의 아미노산 서열 또는 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성과 같이 범위 내 임의의 동일성 백분율을 포함하여 그에 대해 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함한다.

특정 실시예들에서, 키트에 포함된 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3), 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 일부 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 22의 아미노산 서열 또는 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성과 같이 범위 내 임의의 동일성 백분율을 포함하여 그에 대해 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 포함한다. 일부 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 24의 아미노산 서열 또는 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성과 같이 범위 내 임의의 동일성 백분율을 포함하여 그에 대해 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함한다.

특정 실시예들에서, 키트에 포함된 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3), 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 일부 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 26의 아미노산 서열 또는 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성과 같이 범위 내 임의의 동일성 백분율을 포함하여 그에 대해 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 포함한다. 일부 실시예들에서, 항체 또는 그 항원-결합 단편은 서열번호 28의 아미노산 서열 또는 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 서열 동일성과 같이 범위 내 임의의 동일성 백분율을 포함하여 그에 대해 적어도 약 80-100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함한다.

특정 실시예들에서, 키트에 포함된 항-오스테오폰틴 항체는 모노클로날 항체, 다클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 나노바디, 이중특이성 항체, 이중특이성 T 세포 결합 항체, 삼중특이성 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, _Fv단편, 또는 scFv 단편이다.

키트는 본 명세서에 기재된 항체 조성물을 포함하는 하나 이상의 약제학적 제형을 포함할 수 있다. 이와 같이, 키트는 하나 이상의 단위 투여량으로 존재하는 단일 제약 조성물을 포함할 수 있다. 또 다른 경우에, 키트는 2개 이상의 개별 제약 조성물을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 국소 전달에 적합하다(예를 들어, 흑색종의 치료를 위한 항체 또는 접합체를 포함하는 젤 또는 크림).

일부 실시예들에서, 키트는 B-Raf 억제제, MEK 억제제, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물을 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시예들에서, 키트는 화학요법제, 면역치료제, 생물학적 치료제, 세포자멸사 촉진제, 혈관신생 억제제, 광활성제, 방사선감작제 및 방사성 동위원소, 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 국한되지 않는 항암치료제를 하나 이상 추가로 포함한다.

조성물은 액체 형태일 수 있거나 동결건조될 수 있다. 조성물에 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리나 플라스틱을 비롯한 다양한 재료로 만들 수 있다. 용기에 멸균 접근 포트가 있을 수 있다(예: 정맥주사 용액 백 또는 피하 주사 바늘이 들어가는 마개가 있는 바이알). 키트는 포스페이트 완충 식염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용가능한 완충액을 포함하는 용기를 추가로 포함할 수 있다. 또한 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 또는 기타 전달 장치와 같은 기타 약제학적으로 허용가능한 제제 용액을 포함하여 최종 사용자에게 유용한 기타 재료를 포함할 수 있다. 키트는 또한 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편(또는 그 접합체)으로 미리 채워진 전달 장치를 제공할 수 있다.

상기 구성요소 외에, 대상 키트는 본 발명의 대상 방법을 실시하기 위한 (특정 실시예) 지침서(즉, 본 명세서에 기술된 바와 같이 오스테오폰틴 관련 장애를 치료하기 위한 지침서)를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 지침은 다양한 형태로 대상 키트에 존재할 수 있으며, 그 중 하나 이상이 키트에 포함될 수 있다. 이러한 지침의 한 가지 형태는 적절한 매체 또는 인쇄물에 정보를 인쇄하는 것으로 예를 들면, 키트 포장, 내부 패키지 등에 정보가 인쇄된 종이를 포함하는 것이다. 이러한 지침서의 또 다른 형태는 정보가 기록된 컴퓨터 판독 가능 매체, 예를 들어 디스켓, CD(Compact Disk), DVD, 블루레이, 플래시 드라이브 등이다. 이러한 지침서의 또 다른 형태는 인터넷을 통해 원격 사이트의 정보에 액세스하는 데 사용할 수 있는 웹사이트 주소이다.

사용

본 명세서에 기술된 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편(또는 그 접합체)은 염증, 심장비대증, 심근섬유증, 흑색종, 교모세포종, 난소암, 유방암 및 폐암과 같은 오스테오폰틴을 과발현하는 암과 같은 상승된 수준의 오스테오폰틴 또는 그 트롬빈 절단 단편과 관련된 임의의 질병 또는 장애를 비롯한 오스테오폰틴 관련 질환을 치료하는 데 유용하다.

특히, 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편(또는 그 접합체)은 예를 들어 악성 흑색점, 악성 흑자형 흑색종, 표재성 확산 흑색종, 선단 흑색종, 점막 흑색종, 결절성 흑색종, 폴립성 흑색종 및 섬유조직형성 흑색종을 포함하나 이에 제한되지 않는 흑색종 치료에 유용하다. 흑색종 세포는 게놈 DNA 서열의 변화(돌연변이)를 포함할 수 있으며, 이는 흑색종 세포에 의해 암호화된 단백질이 환자 신체의 다른 부분과 다르다는 것을 의미한다. 예를 들어, 세포로의 신호 성장에 관여하는 단백질인 B-RAF는 돌연변이를 가질 수 있다. 특히, 항-오스테오폰틴 항체 또는 그 항원-결합 단편(또는 그 접합체)은 V600E 돌연변이 또는 V600K 돌연변이를 포함하는 흑색종을 제한 없이 포함하는 B-RAF-돌연변이 흑색종을 치료하는데 사용될 수 있다. 항-오스테오폰틴 항체(또는 그 항원-결합 단편)는 전이성 흑색종을 비롯한 모든 단계의 흑색종을 치료하는 데 사용할 수 있다.

실시예

하기 실시예는 당해 기술 분야의 당업자에게 본 발명을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되는 것으로, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 범위를 제한하기 위한 것이 아니며 아래의 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내기 위한 것이 아니다. 사용된 숫자(예: 양, 온도 등)의 정확성을 보장하기 위해 시도했으나, 일부 실험 오류 및 편차도 고려되어야 한다. 달리 언급하지 않는 한, 부(part)는 중량부이며, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이며, 압력은 대기압 또는 대략 대기압이다.

본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시한 것과 같이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다,

본 발명은 본 발명자에 의해 발견되거나 또는 제안된 특정 실시예와 관련하여 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 방식을 포함하는 것으로 설명되어 있다. 본 개시 내용에 비추어, 본 발명의 의도된 범위를 벗어나지 않으면서 예시된 특정 실시 예에서 다수의 변형 및 변경이 이루어질 수 있음을 당해 기술 분야의 당업자라면 인지할 것이다. 예를 들어, 코돈 중복성(codon redundancy)으로 인해, 단백질 서열에 영향을 미치지 않으면서도 기본 DNA 서열이 달라질 수 있다. 또한, 생물학적 기능 동등성을 고려하여, 종류 또는 양 측면에서 생물학적 작용에 영향을 미치지 않으면서 단백질 구조에 변화를 가할 수 있다. 이러한 수정들 모두 첨부된 청구항의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.

실시예 1:

오스테오폰틴의 트롬빈 절단으로 흑색종 성장 및 진행 향상

오스테오폰틴(Osteopontin: OPN)은 광범위한 인테그린에 결합하는 고도로 보존된 RGD 도메인을 가진 모세포 다기능 단백질이다. 트롬빈은 OPN을 2개의 단편으로 절단한다. 즉, 새로운 인테그린 결합 부위를 갖는 OPN-R과 화학주성을 향상시키는 C-말단 단편(CTF)이다(도 1). C-말단에 SVVYGLR(서열번호 3)이 있는 OPN-R은 인테그린 α4βi 및 α9βi에 결합한다. 트롬빈 절단 부위의 아르기닌을 알라닌(R153A)으로 돌연변이시키면 OPN이 트롬빈 절단에 내성을 갖게 된다. Nemoto et al(J. Bone Mineral Res.2001)은 B16 흑색종의 성장이 OPN이 없는 마우스(OPN 녹아웃[KO] 마우스)에서 억제된다고 보고한 바 있다. 단, 암 진행에서 OPN의 중요성에 대한 광범위한 연구에도 불구하고 OPN의 트롬빈 절단의 기능은 알려져 있지 않다.

염증성 장애 및 암의 병리학에서 OPN의 트롬빈 절단의 기능을 더 이해하기 위해 실험 마우스 모델에서 Arg153Ala 돌연변이를 OPN 유전자에 도입함으로써 OPN의 트롬빈 절단 부위를 폐기하였다. 트롬빈 절단에 내성인 OPN을 갖는 마우스는 Arg153을 Ala로 대체하여 생성하였다(OPNR153A; OPN 노크인 [KI]). 마우스의 옆구리에 B16 흑색종 세포를 피하 접종하고 종양 성장을 모니터링하고 희생 후 종양 중량을 측정하였다. 전이 모델에서, 마우스에 꼬리 정맥을 통해 B16 흑색종 세포를 정맥내 주사하고 희생 후 결절의 수를 육안으로 계수하고 멜라닌 함량을 결정함으로써 폐의 흑색종의 양을 측정하였다(멜라닌은 폐의 흑색종 세포의 양을 측정하기 위해 허용된 측정 수단임). 일부 마우스에는 트롬빈 억제제인 다비가트란 에텍실레이트가 함유된 음식을 먹였다.

강력한 종양 성장이 야생형(WT) 마우스에서 관찰되었으나, OPN 녹아웃(KO) 및 OPNR153A-KI 마우스 모두에서 종양 성장은 장기간에 걸친 양이나 희생 시 체중으로 모니터링했을 때 거의 동일한 정도로 억제되었다(도 2A-2B). 전이 모델에서 WT 마우스는 OPN KI 마우스보다 폐에 더 많은 종양 결절이 있었고 폐에 더 많은 멜라닌이 있었다(도 3A-3B).

OPN의 트롬빈 절단 역할은 특정 경구 트롬빈 억제제인 다비가트란 에텍실레이트(Dabigatran etexilate, DE)로 마우스를 치료함으로써 확인되었다. DE로 처리된 야생형 마우스(WT)에서 옆구리의 종양 성장(도 4A-4B)은 OPN-KI 마우스에서 발견되는 것과 동일한 수준으로 감소하였다. 유사하게, 전이 모델에서, WT 마우스의 전이는 OPN-KI 및 OPN-KO 마우스에서 발견된 것과 동일한 수준으로 감소하였다(도 5A-5B).

OPN의 트롬빈 절단이 다른 암에서 중요하다는 것을 입증하기 위해 Id8 세포(난소 암종)가 복강 내 주사된 난소 암종 모델을 사용하였다. 체중 증가가 종양의 성장을 나타내므로 마우스의 무게를 측정하였다. OPN-KI 마우스에서 Id8 난소 암종 종양의 성장은 WT 마우스에서와 비교하여 유의미하게 감소하였다.

본원의 데이터는 암 생물학에서 OPN의 트롬빈 절단의 중요성에 대한 최초의 증명을 제공한다. OPN KI 마우스는 OPN의 부재와 동일한 B16 종양 성장 감소를 보여주었으며, 이는 숙주 OPN의 트롬빈 절단이 생체내 흑색종 성장에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 또한, Id8 난소 암종 성장은 WT 마우스에 비해 OPN KI 마우스에서 억제되었다. 트롬빈 억제제인 다비가트란 에텍실레이트를 사용한 치료는 피하 이식 및 전이 모델 모두에서 B16 흑색종의 성장을 OPN이 없는 마우스 또는 트롬빈에 의해 절단될 수 없는 OPN이 있는 마우스에서 관찰된 것과 유사한 수준으로 감소시켰다.

실시예 2:

치료용 단클론 항체

OPN-KI 마우스를 사용한 흑색종 및 난소 암종 연구(실시예 1)의 결과는 OPN 절단의 차단 및/또는 OPN 단편의 차단이 흑색종 및 기타 암에 대한 치료적 개입의 가능성이 있음을 나타낸다. 다음 표적에 대해 다양한 형식(mAB, 이중특이성, 삼중특이성, 나노바디 등)의 단클론 항체를 생성하였다.

OPN-FL: OPN의 절단을 차단하는 항체:

인간 OPN 또는 트롬빈 음이온 결합 엑소사이트(exosites) 1 및 2에 결합하는 OPN 서열의 SVVGLR(서열번호 1) 또는 SKSKKF(서열번호 2)에 대한 항체.

OPN-R: 인간 OPN에서 노출된 SVVYGLR(서열번호 3)에 대한 항체를 사용하여 OPN-R에 대한 인테그린 결합을 차단하는 항체

OPN-CTF: CTF 다량체화를 차단하는 인간 OPN에서 SKSKKFRR(서열번호 4) 서열을 차단하는 항체

발명의 적용

흑색종 및 기타 암은 단독 요법으로 또는 표준 요법과 함께 항체로 치료할 수 있다. OPN 트롬빈 절단 부위(SVVYGLRSKSKF, 서열번호 9), OPN-R SVVYGLR(서열번호 3) 인테그린 결합 모티프 및 OPN-CTF 영역 SKSKKFRRPD(서열번호 10)의 기능적 차단을 위한 단클론 항체를 생성함으로써 치료 효과를 얻을 수 있으며, 이는 암의 CTF 다량체화와 관련이 있다. 트롬빈에 있는 OPN의 결합 부위인 엑소사이트 1 및 2를 표적으로 하는 항체는 트롬빈에 의한 OPN 절단을 감소시키는 데에도 유용할 수 있다. 트롬빈 결합 엑소사이트 1과 2에 특이적으로 결합하지만 트롬빈 응고 촉진 활성을 방해하지 않는 펩티드도 유용할 수 있다.

항체는 트롬빈 억제제 또는 다른 항응고제를 사용하는 경우, 출혈 위험의 부작용 없이 OPN 절단 예방의 유익한 효과를 달성하는 데 유용하다.

실시예 3:

오스테오폰틴의 트롬빈 절단을 억제하는 단일클론 항체의 생산

본 실시예의 목표는 전장 오스테오폰틴(OPN-FL)에 결합하고 트롬빈에 의한 그 절단을 차단하는 단클론 항체(Mab)를 확인하는 것이었다. 도 7은 토끼, 래트, 마우스, 인간, 붉은털원숭이, 사이노몰구스 및 돼지에서 트롬빈 절단 부위 주위의 OPN 단백질 서열의 정렬을 나타낸다. 토끼 단클론 항체를 개발하기 위해 토끼에서 항체를 생성하는 데 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 공유 결합된 펩티드 항원 YGLRSKS(서열 번호 11, 굵은 글씨체의 아미노산은 트롬빈에 의해 절단됨)를 사용하였다. 펩티드 항원은 용해도를 증가시키기 위해 폴리에틸렌 글리콜과 Ahx(PEGH-YGLRSKS-Ahx-C)에 의해 연결된 C-말단 Cys가 있는 6-아미노헥산산(Ahx) 링커로 변형하였다. 트롬빈 절단 부위 주변의 OPN 서열이 마우스 및 인간 서열: YRLKRSKS(서열번호 47, 굵게 표시된 아미노산은 트롬빈에 의해 절단됨)과 다르기 때문에 토끼를 선택하였다. 펩티드 항원에 결합하는 항체를 생산하는 세포는 중쇄 및 경쇄 cDNA가 클로닝되어 토끼 IgG를 발현하는 발현 벡터에 삽입되었다. 그런 다음 이러한 발현 벡터를 HEK293F 세포에 형질감염시키고 배지를 분석하였다. 그런 다음 항체 스크리닝을 사용하여 마우스, 래트 및 인간 OPN과 반응하는 항체를 생성하는 클론을 식별하였다.

OPN 항원 펩티드에 대해 직접 ELISA를 사용하여 토끼 단클론 클론을 스크리닝하였다(도 8). 35개의 양성(표시됨)이 확인되었다. 항-OPN IgG를 생성하는 클론을 확인하기 위한 분석을 위해, 30분 동안 비오틴으로 표지된 OPN 항원 펩티드를 첨가하기 전에 96웰 플레이트를 2 μg/mL 아비딘으로 밤새 코팅하였다. 그런 다음 클론의 상청액을 1:50으로 희석한 후 10³배로 희석한 HRP로 표지된 항-토끼 IgG Fc로 검출하였다. HRP용 기질을 첨가하고 색상을 측정하였다.

클론 상청액(clone supernatants)에서 IgG의 농도를 결정하기 위해 96웰 플레이트를 2 μg/mL 항-토끼 IgG로 밤새 코팅하였다. 그런 다음 클론의 상청액을 1:50으로 희석한 후 10³배로 희석한 HRP로 표지된 항-토끼 IgG Fc로 검출하였다. HRP용 기질을 첨가하고 색상을 측정하였다. 클론 상청액의 IgG 농도는 토끼 IgG의 표준 희석 곡선으로부터 계산되었다.

도 9는 항원 펩티드, 마우스 OPN-FL 및 인간 OPN-FL에 대한 직접 ELISA에서 토끼 단클론 항체를 스크리닝한 결과를 보여준다. 인간 또는 마우스의 OPN-FL에 결합된 클론이 확인되었다. 추가 조사를 위해 4개의 클론(A2, A6, E5 및 G7)을 선택하였다. 펩티드 항원 결합 분석에서 이들 4개의 클론에 대한 EC₅₀이 결정되었다(도 10). 정제된 항-OPN IgG에 대한 EC₅₀을 결정하기 위해, 30분 동안 비오틴으로 표지된 OPN 항원 펩티드를 첨가하기 전에 96웰 플레이트를 2 ug/mL 아비딘으로 밤새 코팅하였다. 그런 다음 선택된 클론의 상등액에 있는 IgG를 단백질 A/G 세파로스 비드에 결합하고 용출하여 정제하였다. 정제된 IgG는 10³배로 희석된 HRP로 표지된 항-토끼 IgG Fc로 검출하기 전에 연속적으로 희석하였다. HRP용 기질을 첨가하고 색상을 측정하였다.

도 11은 OPN 항원 펩티드에 대한 결합을 위한 4개의 클론에 대한 EC₅₀ 값을 나타낸다. 도 10의 데이터에 기반하여, EC₅₀ 값을 프리즘 그래프패드(Prism Graphpad)를 사용하여 4개 매개변수 적합 방정식으로 계산하였다. EC₅₀ 값은 A2 클론의 경우 2.6 ng/mL, A6 클론의 경우 3.2 ng/mL, E5 클론의 경우 4.0 ng/mL, 그리고 G7 클론의 경우 93.2 ng/mL 였다.

마우스 OPN-FL에 대한 직접 결합 ELISA에서 4개의 클론에 대한 ECso 값이 결정되었으며(도 12), A2, A6 및 E5를 포함한 모든 클론이 마우스 OPN-FL에 결합하는 것으로 나타났다. PBS 완충액 중 염소 다클론 항-마우스 오스테오폰틴 IgG(2 ug/ml)(R&D 시스템, Minneapolis, MN)를 96-웰 ELISA 플레이트에 코팅하고 PBS 중 1% BSA로 1시간 동안 비특이적 결합 부위를 차단하였다. 재조합 마우스 오스테오폰틴 단백질(R&D 시스템, Minneapolis, MN)을 PBS 중 1% BSA로 희석하고(200ng/ml에서 시작하여 희석) 2시간 동안 인큐베이션하였다. PBS 중 0.05% Tween 20으로 세척한 후, 샘플을 1% BSA가 포함된 PBS 중 정제된 항체 A2, A6, E5, G7 또는 IgG 대조군(500ng/ml)과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS 중 0.05% Tween 20으로 세척한 후, 샘플을 1% BSA가 포함된 PBS 중 퍼옥시다제-접합 염소 항-토끼 IgG 항체(100ng/ml)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 테트라메틸벤지딘 기질을 10분 동안 배양한 후 정지액(Stop Solution)을 첨가하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

또한, 인간 OPN-FL에 대한 직접 결합 ELISA에서 4개의 클론에 대한 ECso 값이 결정되었으며, 4개의 클론 모두 인간 OPN-FL에 결합하는 것으로 나타났다(도 13. 96-웰 ELISA 플레이트에 PBS 완충액에 녹인 마우스 단클론 항-인간 오스테오폰틴 항체(4 ㎍/ml)(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 1시간 동안 PBS에 녹인 1% BSA로 비특이적 결합 부위를 차단하였다. 재조합 인간 오스테오폰틴 단백질(GST-OPN-his, 사내 정제)을 PBS 중 1% BSA로 희석하고(200ng/ml에서 시작하여 희석) 2시간 동안 인큐베이션하였다. PBS 중 0.05% Tween 20으로 세척한 후, 샘플을 1% BSA가 포함된 PBS 중 정제된 항체 A2, A6, E5, G7 또는 IgG 대조군(500ng/ml)과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS 중 0.05% Tween 20으로 세척한 후, 샘플을 1% BSA가 포함된 PBS 중 퍼옥시다제-접합 염소 항-토끼 IgG 항체(100ng/ml)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 테트라메틸벤지딘 기질을 10분 동안 배양한 후 정지액(Stop Solution)을 첨가하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

다음으로, 인간 OPN-FL의 트롬빈 절단을 억제하는 4개의 클론으로부터 생성된 단일 항체의 능력은 OPN-R에 대한 특정 ELISA에서 절단 산물 중 하나인 OPN-R의 생성 억제를 검출함으로써 확인되었다. 4개의 클론 모두 인간 OPN-FL의 트롬빈 절단을 억제하는 것으로 나타났다(도 14). 재조합 인간 오스테오폰틴 단백질(3.2 uM, 사내 정제)을 정제된 항체 A2, A6, E5, G7 또는 IgG 대조군과 함께 또는 단독으로 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 인간 트롬빈(32 nM)(R&D Systems)을 샘플에 첨가하고 37°C에서 10분 동안 인큐베이션한 다음 PPACK을 4.8uM까지 추가하였다. 샘플을 PBS 중 1% BSA로 1/300 희석하고 생성된 OPN-R을 OPN-R 특이적 ELISA로 측정하였다.

인간 OPN-R ELISA:

96-웰 ELISA 플레이트에 PBS 완충액에 녹인 마우스 단클론 항-인간 오스테오폰틴 항체(4 ㎍/ml)(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 1시간 동안 PBS에 녹인 1% BSA로 비특이적 결합 부위를 차단하였다. 재조합 인간 OPN-R 단백질(GST-OPN-R, Myles et al, 2003 JBC))을 PBS 중 1% BSA(200ng/ml에서 시작하여 묽게 희석)로 표준으로 희석하였다. 트롬빈 절단 산물의 표준 및 샘플(1/300 희석으로 시작하여 더 묽게 희석)을 2시간 동안 인큐베이션하였다. PBS 중 0.05% Tween 20으로 세척한 후, 샘플을 1% BSA가 포함된 PBS 중 비오틴화(Biotinylated) 토끼 다클론성 항-OPN-R 항체(500ng/ml) (Sharif et al, 2009 A+R)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 샘플을 1% BSA가 포함된 PBS에서 퍼옥시다제-접합된 스트렙타비딘(100ng/ml)과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 테트라메틸벤지딘 기질을 10분 동안 배양한 후 정지액(Stop Solution)을 첨가하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 샘플에서 생성된 OPN-R의 양을 OPN-R ELISA의 OPN-R 표준으로부터 계산한 다음 다른 농도에서 각 항체 클론의 트롬빈 절단 억제를 계산하여 그래프로 나타내었다. 도 15는 인간 OPN-FL의 절단을 억제함에 있어서 4개의 클론에 대한 억제율(%): A2의 경우 82%; A6의 경우 95.4%; E5의 경우 77.2%, G7의 경우 60.1%임을 보여준다.

또한 OPN-R에 대한 특이적 ELISA에서 절단 산물 중 하나인 OPN-R의 생성을 결정함으로써 4개의 클론에 대한 마우스 OPN-FL의 트롬빈 절단 억제를 평가하였다. 4개의 클론 모두 인간 OPN-FL의 트롬빈 절단을 억제하는 것으로 나타났다(도 16). 재조합 마우스 오스테오폰틴 단백질(R&D Systems)(2 um)을 정제된 항체 A2, A6, E5, G7 또는 IgG 대조군(2 um)과 함께 또는 단독으로 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 인간 트롬빈(20 nM)(R&D Systems)을 샘플에 첨가하고 37°C에서 10분 동안 인큐베이션한 다음 PPACK을 4.7 uM까지 추가하였다. 샘플을 PBS 중 1% BSA로 1/100 또는 1/30 희석하고 생성된 OPN-R을 OPN-R 특이적 ELISA로 측정하였다.

마우스 OPN-R ELISA:

PBS 완충액 중 염소 다클론 항-마우스 오스테오폰틴 IgG(4 ug/ml)(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 96-웰 ELISA 플레이트에 코팅하고 PBS 중 1% BSA로 1시간 동안 비특이적 결합 부위를 차단하였다. 트롬빈 절단 산물의 샘플(1/30 또는 1/100 희석으로 시작하여 더 묽게 희석)을 2시간 동안 인큐베이션하였다. PBS 중 0.05% Tween 20으로 세척한 후, 샘플을 1 % BSA가 포함된 PBS 중 비오틴화(Biotinylated) 토끼 다클론성 항-OPN-R 항체(2 ug/ml) (Sharif et al, 2009 A+R)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 샘플을 1% BSA가 포함된 PBS에서 퍼옥시다제-접합된 스트렙타비딘(100ng/ml)과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 테트라메틸벤지딘 기질을 10분 동안 배양한 후 정지액(Stop Solution)을 첨가하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 샘플에서 생성된 OPN-R의 양을 OPN-R ELISA의 OPN-R 표준으로부터 계산한 다음 다른 농도에서 각 항체 클론의 트롬빈 절단 억제를 계산하여 그래프로 나타내었다.

클론의 염기 서열을 분석하였다(sequencing). A2, A6, E5, 및 G7 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 핵산 서열, 그리고 이들의 CDR 서열을 분석하였으며 서열 목록의 서열 번호 13-46에 나타나 있다.

SEQUENCE LISTING <110> The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University <120> THERAPEUTIC ANTIBODIES AGAINST OSTEOPONTIN <130> STAN-1658 (S19-253) <150> 62/884,818 <151> 2019-08-09 <160> 47 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> osteopontin epitope <400> 1 Ser Val Val Gly Leu Arg 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> osteopontin epitope <400> 2 Ser Lys Ser Lys Lys Phe 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> osteopontin epitope <400> 3 Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> osteopontin epitope <400> 4 Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> immunogenic peptide <400> 5 Ser Leu Ala Tyr Gly Leu Arg 1 5 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> immunogenic peptide <400> 6 Ser Leu Ala Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Arg Ser Phe Gln Val Ser 1 5 10 15 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> immunogenic peptide <400> 7 Ser Lys Ser Arg Ser Phe Gln Val Ser 1 5 <210> 8 <211> 314 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <308> NCBI/NP_001035147 <309> 2019-06-18 <313> (1)..(314) <400> 8 Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala 1 5 10 15 Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu 20 25 30 Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro 35 40 45 Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Asn Ala Val Ser Ser Glu 50 55 60 Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln Glu Thr Leu Pro Ser Lys Ser Asn Glu 65 70 75 80 Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp His 85 90 95 Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val Asp 100 105 110 Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Glu 115 120 125 Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr Glu 130 135 140 Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly 145 150 155 160 Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg 165 170 175 Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr Ser His 180 185 190 Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val Ala 195 200 205 Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Gly Lys Asp Ser 210 215 220 Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu Thr His Ser His 225 230 235 240 Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Glu Ser Asn Glu 245 250 255 His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys Val Ser Arg Glu 260 265 270 Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met Leu Val Val Asp 275 280 285 Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe Arg Ile Ser His 290 295 300 Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn 305 310 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> osteopontin thrombin cleavage site <400> 9 Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OPN-CTF region <400> 10 Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg Pro Asp 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> immunogenic peptide <400> 11 Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser 1 5 <210> 12 <400> 12 000 <210> 13 <211> 1386 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> clone encoding A2 monoclonal antibody heavy chain 3 <220> <221> CDS <222> (1)..(1383) <400> 13 atg gag act ggg ctg cgc tgg ctt ctc ctg gtc gct gtg ctc aaa ggt 48 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt cag tcg gtg aag gag tcc gag gga ggt ctc ttc aag cca 96 Val Gln Cys Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro 20 25 30 acg gat acc ctg aca ctc acc tgc aaa gcc tct gga ttc acc gtc agt 144 Thr Asp Thr Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser 35 40 45 agt tac gac atg ggc tgg ctc cgc cag gct cca ggg aac ggg ctt gaa 192 Ser Tyr Asp Met Gly Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu 50 55 60 tct atc gga gcc att ggt agt gat ggt agt gag tac tat gtg agc tgg 240 Ser Ile Gly Ala Ile Gly Ser Asp Gly Ser Glu Tyr Tyr Val Ser Trp 65 70 75 80 gcg aga ggc cga acc gcc atc acc aga aac acc aac cag aac acg gtg 288 Ala Arg Gly Arg Thr Ala Ile Thr Arg Asn Thr Asn Gln Asn Thr Val 85 90 95 act ctg aaa atg acc agt ctg aca gcc gcg gac acg gcc acc tat ttc 336 Thr Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 100 105 110 tgt gcg aga gac tca cac tat agc tat ggc tat gat tat gat atc tgg 384 Cys Ala Arg Asp Ser His Tyr Ser Tyr Gly Tyr Asp Tyr Asp Ile Trp 115 120 125 ggc cca ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca ggg caa cct aag gct cca 432 Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro 130 135 140 tca gtc ttc cca ctg gcc ccc tgc tgc ggg gac aca ccc agc tcc acg 480 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr 145 150 155 160 gtc acc ctg ggt tgt ctt gtg aag gga tac ctc ccg gaa ccc gtg acc 528 Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 gtg acc tgg aac tcc ggc acc ctg acc aat gga gtg cgg acc ttc ccg 576 Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro 180 185 190 agc gtc agg cag tcc tcc ggg ttg tac agc ttg tct agc gtg gtg tcc 624 Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser 195 200 205 gtg acg tcg tca agc cag cct gtg act tgc aat gtg gcc cat ccg gcc 672 Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala 210 215 220 acc aac acc aag gtc gac aag acc gtg gcg cct tcc acc tgt tcc aag 720 Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys 225 230 235 240 ccc act tgc ccg ccg cct gag ctc ctg gga gga ccg tcc gtg ttc atc 768 Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile 245 250 255 ttc cct cca aaa ccc aag gat acc ctg atg att agc cgc act ccc gaa 816 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 260 265 270 gtc act tgc gtg gtc gtg gac gtg tcg cag gac gat cct gag gtg cag 864 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln 275 280 285 ttc act tgg tac atc aac aac gaa caa gtc cgg aca gct aga cca ccg 912 Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro 290 295 300 ctg cgc gag cag cag ttc aac tca act atc cgg gtg gtg tcc acc ctg 960 Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu 305 310 315 320 ccg atc gcg cat cag gat tgg ctg cgg ggg aag gag ttc aag tgc aaa 1008 Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys 325 330 335 gtc cac aac aag gcc ctg ccc gcc ccc atc gaa aag acc atc tcc aag 1056 Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 340 345 350 gct cgg ggc cag cct ctg gag ccc aaa gtg tac acc atg ggc ccg cct 1104 Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro 355 360 365 cgc gag gag ctc tcc tca cgc tcg gtg tcg ctg act tgc atg att aac 1152 Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn 370 375 380 ggc ttc tac cct tcc gac atc tcc gtg gaa tgg gag aag aac gga aaa 1200 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys 385 390 395 400 gcc gaa gat aac tac aag acc acg ccc gcc gtg ctg gac tcc gac gga 1248 Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly 405 410 415 agc tat ttc ctg tac tcc aag ctc tcc gtc ccc act tcg gaa tgg cag 1296 Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln 420 425 430 agg ggg gac gtg ttc act tgc tcc gtg atg cac gag gca ctc cac aac 1344 Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 435 440 445 cac tac acc caa aag agc att tcg cgg tca cct ggc aag taa 1386 His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 14 <211> 461 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro 20 25 30 Thr Asp Thr Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser 35 40 45 Ser Tyr Asp Met Gly Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu 50 55 60 Ser Ile Gly Ala Ile Gly Ser Asp Gly Ser Glu Tyr Tyr Val Ser Trp 65 70 75 80 Ala 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tgg tac gac gct ttc ggc gga ggg acc 384 Gly Thr Tyr Tyr Val Thr Gly Trp Tyr Asp Ala Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 gag gtg gtg gtc aaa ggt gat cca gtt gca cct act gtc ctc atc ttc 432 Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe 130 135 140 cca cca gct gct gat cag gtg gca act gga aca gtc acc atc gtg tgc 480 Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys 145 150 155 160 gtg gct aac aag tac ttc ccg gac gtg acc gtg acc tgg gaa gtc gac 528 Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp 165 170 175 gga acc act cag acc act ggt atc gag aac agc aag acg ccc cag aac 576 Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn 180 185 190 tcc gcc gat tgt act tat aac ctg tcc tcc aca ctg acc ctc acc tcg 624 Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser 195 200 205 acc cag tac aat tcc cac aag gag tac act tgc aaa gtc acc cag gga 672 Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly 210 215 220 acc act tca gtg gtg cag agc ttc aac cgg ggg gat tgc tga 714 Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys 225 230 235 <210> 16 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro 20 25 30 Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser 35 40 45 Gln Ser Ile Tyr Ser Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 50 55 60 Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 100 105 110 Gly Thr Tyr Tyr Val Thr Gly Trp Tyr Asp Ala Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe 130 135 140 Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys 145 150 155 160 Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val 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gga aaa 1200 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys 385 390 395 400 gcc gaa gat aac tac aag acc acg ccc gcc gtg ctg gac tcc gac gga 1248 Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly 405 410 415 agc tat ttc ctg tac tcc aag ctc tcc gtc ccc act tcg gaa tgg cag 1296 Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln 420 425 430 agg ggg gac gtg ttc act tgc tcc gtg atg cac gag gca ctc cac aac 1344 Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 435 440 445 cac tac acc caa aag agc att tcg cgg tca cct ggc aag taa 1386 His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 18 <211> 461 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro 20 25 30 Thr Asp Thr Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser 35 40 45 Ser Tyr Asp Met Gly Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu 50 55 60 Ser Ile Gly Ala Ile Gly Ser Asp Gly Ser Glu Tyr Tyr Val Ser Trp 65 70 75 80 Ala Arg Gly Arg Thr Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Gln Asn Thr Val 85 90 95 Thr Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 100 105 110 Cys Ala Arg Asp Ser His Tyr Ser Tyr Gly Tyr Asp Tyr Asp Ile Trp 115 120 125 Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr 145 150 155 160 Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro 180 185 190 Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser 195 200 205 Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala 210 215 220 Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys 225 230 235 240 Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile 245 250 255 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 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act tac tac tgt caa 336 Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 100 105 110 ggc act tat tat gtc act ggt tgg tac gac gct ttc ggc gga ggg acc 384 Gly Thr Tyr Tyr Val Thr Gly Trp Tyr Asp Ala Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 gag gtg gtg gtc aaa ggt gat cca gtt gca cct act gtc ctc atc ttc 432 Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe 130 135 140 cca cca gct gct gat cag gtg gca act gga aca gtc acc atc gtg tgc 480 Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys 145 150 155 160 gtg gct aac aag tac ttc ccg gac gtg acc gtg acc tgg gaa gtc gac 528 Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp 165 170 175 gga acc act cag acc act ggt atc gag aac agc aag acg ccc cag aac 576 Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn 180 185 190 tcc gcc gat tgt act tat aac ctg tcc tcc aca ctg acc ctc acc tcg 624 Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser 195 200 205 acc cag tac aat tcc cac aag gag tac act tgc aaa gtc acc cag gga 672 Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly 210 215 220 acc act tca gtg gtg cag agc ttc aac cgg ggg gat tgc tga 714 Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys 225 230 235 <210> 20 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro 20 25 30 Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser 35 40 45 Gln Ser Ile Tyr Ser Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 50 55 60 Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 100 105 110 Gly Thr Tyr Tyr Val Thr Gly Trp Tyr Asp Ala Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe 130 135 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Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255 aag gat acc ctg atg att agc cgc act ccc gaa gtc act tgc gtg gtc 816 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270 gtg gac gtg tcg cag gac gat cct gag gtg cag ttc act tgg tac atc 864 Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile 275 280 285 aac aac gaa caa gtc cgg aca gct aga cca ccg ctg cgc gag cag cag 912 Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln 290 295 300 ttc aac tca act atc cgg gtg gtg tcc acc ctg ccg atc gcg cat cag 960 Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln 305 310 315 320 gat tgg ctg cgg ggg aag gag ttc aag tgc aaa gtc cac aac aag gcc 1008 Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala 325 330 335 ctg ccc gcc ccc atc gaa aag acc atc tcc aag gct cgg ggc cag cct 1056 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro 340 345 350 ctg gag ccc aaa gtg tac acc atg ggc ccg cct cgc gag gag ctc tcc 1104 Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser 355 360 365 tca cgc tcg gtg tcg ctg act tgc atg att aac ggc ttc tac cct tcc 1152 Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380 gac atc tcc gtg gaa tgg gag aag aac gga aaa gcc gaa gat aac tac 1200 Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr 385 390 395 400 aag acc acg ccc gcc gtg ctg gac tcc gac gga agc tat ttc ctg tac 1248 Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr 405 410 415 tcc aag ctc tcc gtc ccc act tcg gaa tgg cag agg ggg gac gtg ttc 1296 Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe 420 425 430 act tgc tcc gtg atg cac gag gca ctc cac aac cac tac acc caa aag 1344 Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445 agc att tcg cgg tca cct ggc aag taa 1371 Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 22 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> The 'Xaa' at location 18 stands for Gln, or His. <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> The 'Xaa' at location 20 stands for Lys, Arg, Thr, Met, Glu, Gly, Ala, Val, Gln, Pro, Leu, Trp, or Ser. <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Xaa Cys Xaa Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro 20 25 30 Thr Ala Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser 35 40 45 Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Tyr Leu Ser Ser Asp Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp 65 70 75 80 Ala Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val 85 90 95 Thr Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 100 105 110 Cys Ala Arg Gly Asp Asn Thr Ala Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu 115 120 125 Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu 130 135 140 Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys 145 150 155 160 Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser 165 170 175 Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser 180 185 190 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser 195 200 205 Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val 210 215 220 Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro 225 230 235 240 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270 Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile 275 280 285 Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln 290 295 300 Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln 305 310 315 320 Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala 325 330 335 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro 340 345 350 Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser 355 360 365 Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380 Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr 385 390 395 400 Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr 405 410 415 Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe 420 425 430 Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445 Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 23 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> clone encoding E5 monoclonal antibody light chain 3 <220> <221> CDS <222> (1)..(708) <400> 23 atg gac acg agg gcc ccc act cag ctg ctg ggg ctc ctg ctg ctc tgg 48 Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 ctc cca ggt gcc aca ttt gct caa gtg ctg acc cag act cca tcc tcc 96 Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser 20 25 30 gtg tct gca gct gtg gga ggc aca gtc acc atc aat tgc cag tcc agt 144 Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser 35 40 45 cag agt gtt tat aag aac aac gac tta gcc tgg tat cag cag aaa cta 192 Gln Ser Val Tyr Lys Asn Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu 50 55 60 ggg cag cct ccc aag ctc ctg atc tat ttt gca tcc act ctg gca tct 240 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Leu Ala Ser 65 70 75 80 ggg gtc cca tcg cgg ttc aaa ggc agt gga tct ggg aca cag ttc act 288 Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr 85 90 95 ctc acc atc agc gac ctg gag tgt gac gat gct gcc act tat tac tgt 336 Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 gca ggc ggt tat agt ggt cct gtt ggt gct ttc ggc gga ggg acc gag 384 Ala Gly Gly Tyr Ser Gly Pro Val Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu 115 120 125 gtg gtg gtc aag agt gat cca gtt gca cct act gtc ctc atc ttc cca 432 Val Val Val Lys Ser Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro 130 135 140 cca gct gct gat cag gtg gca act gga aca gtc acc atc gtg tgc gtg 480 Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val 145 150 155 160 gct aac aag tac ttc ccg gac gtg acc gtg acc tgg gaa gtc gac gga 528 Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly 165 170 175 acc act cag acc act ggt atc gag aac agc aag acg ccc cag aac tcc 576 Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser 180 185 190 gcc gat tgt act tat aac ctg tcc tcc aca ctg acc ctc acc tcg acc 624 Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr 195 200 205 cag tac aat tcc cac aag gag tac act tgc aaa gtc acc cag gga acc 672 Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr 210 215 220 act tca gtg gtg cag agc ttc aac cgg ggg gat tgc tga 711 Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys 225 230 235 <210> 24 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser 20 25 30 Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser 35 40 45 Gln Ser Val Tyr Lys Asn Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu 50 55 60 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Leu Ala Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr 85 90 95 Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 Ala Gly Gly Tyr Ser Gly Pro Val Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu 115 120 125 Val Val Val Lys Ser Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val 145 150 155 160 Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly 165 170 175 Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser 180 185 190 Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr 195 200 205 Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr 210 215 220 Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys 225 230 235 <210> 25 <211> 1383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> clone encoding G7 monoclonal antibody heavy chain 1 <220> <221> CDS <222> (1)..(1380) <400> 25 atg gag act ggg ctg cgc tgg ctt ctc ctg gtc gct gtg ctc aaa ggt 48 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt cag tcg gtg aag gag tcc gag gga ggt ctc ttc aag cca 96 Val Gln Cys Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro 20 25 30 acg gat acc ctg aca ctc acc tgc aca gtc tct gga ttc tcc ctc agt 144 Thr Asp Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser 35 40 45 agt tat gga gtg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aac ggg ctg gag 192 Ser Tyr Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu 50 55 60 tgg atc gga ttc att gac aag tat gga cgc aca cac tac gcg agc tgg 240 Trp Ile Gly Phe Ile Asp Lys Tyr Gly Arg Thr His Tyr Ala Ser Trp 65 70 75 80 gcg aaa agc cga tcc acc atc acc aga aat acc aac gag aac acg gtg 288 Ala Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Glu Asn Thr Val 85 90 95 act ctg aaa atg acc agt ctg aca gcc gcg gac acg gcc acc ttt ttg 336 Thr Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Phe Leu 100 105 110 tgt gcg aga gat gac tat cgt cct gct tat ggt ttc gac atc tgg ggc 384 Cys Ala Arg Asp Asp Tyr Arg Pro Ala Tyr Gly Phe Asp Ile Trp Gly 115 120 125 cca ggc acc ctg gtc acc gtc tcc tca ggg caa cct aag gct cca tca 432 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser 130 135 140 gtc ttc cca ctg gcc ccc tgc tgc ggg gac aca ccc agc tcc acg gtc 480 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val 145 150 155 160 acc ctg ggt tgt ctt gtg aag gga tac ctc ccg gaa ccc gtg acc gtg 528 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 acc tgg aac tcc ggc acc ctg acc aat gga gtg cgg acc ttc ccg agc 576 Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser 180 185 190 gtc agg cag tcc tcc ggg ttg tac agc ttg tct agc gtg gtg tcc gtg 624 Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val 195 200 205 acg tcg tca agc cag cct gtg act tgc aat gtg gcc cat ccg gcc acc 672 Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr 210 215 220 aac acc aag gtc gac aag acc gtg gcg cct tcc acc tgt tcc aag ccc 720 Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro 225 230 235 240 act tgc ccg ccg cct gag ctc ctg gga gga ccg tcc gtg ttc atc ttc 768 Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe 245 250 255 cct cca aaa ccc aag gat acc ctg atg att agc cgc act ccc gaa gtc 816 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 260 265 270 act tgc gtg gtc gtg gac gtg tcg cag gac gat cct gag gtg cag ttc 864 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe 275 280 285 act tgg tac atc aac aac gaa caa gtc cgg aca gct aga cca ccg ctg 912 Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu 290 295 300 cgc gag cag cag ttc aac tca act atc cgg gtg gtg tcc acc ctg ccg 960 Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro 305 310 315 320 atc gcg cat cag gat tgg ctg cgg ggg aag gag ttc aag tgc aaa gtc 1008 Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val 325 330 335 cac aac aag gcc ctg ccc gcc ccc atc gaa aag acc atc tcc aag gct 1056 His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 340 345 350 cgg ggc cag cct ctg gag ccc aaa gtg tac acc atg ggc ccg cct cgc 1104 Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg 355 360 365 gag gag ctc tcc tca cgc tcg gtg tcg ctg act tgc atg att aac ggc 1152 Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly 370 375 380 ttc tac cct tcc gac atc tcc gtg gaa tgg gag aag aac gga aaa gcc 1200 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala 385 390 395 400 gaa gat aac tac aag acc acg ccc gcc gtg ctg gac tcc gac gga agc 1248 Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 405 410 415 tat ttc ctg tac tcc aag ctc tcc gtc ccc act tcg gaa tgg cag agg 1296 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg 420 425 430 ggg gac gtg ttc act tgc tcc gtg atg cac gag gca ctc cac aac cac 1344 Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 435 440 445 tac acc caa aag agc att tcg cgg tca cct ggc aag taa 1383 Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 26 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro 20 25 30 Thr Asp Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser 35 40 45 Ser Tyr Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Phe Ile Asp Lys Tyr Gly Arg Thr His Tyr Ala Ser Trp 65 70 75 80 Ala Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Glu Asn Thr Val 85 90 95 Thr Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Phe Leu 100 105 110 Cys Ala Arg Asp Asp Tyr Arg Pro Ala Tyr Gly Phe Asp Ile Trp Gly 115 120 125 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val 145 150 155 160 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser 180 185 190 Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val 195 200 205 Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr 210 215 220 Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro 225 230 235 240 Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe 245 250 255 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 260 265 270 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe 275 280 285 Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu 290 295 300 Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro 305 310 315 320 Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val 325 330 335 His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 340 345 350 Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg 355 360 365 Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly 370 375 380 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala 385 390 395 400 Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 405 410 415 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg 420 425 430 Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 435 440 445 Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 27 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> clone encoding G7 monoclonal antibody light chain 1 <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <400> 27 atg gac acg agg gcc ccc act cag ctg ctg ggg ctc ctg ctg ctc tgg 48 Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 ctc cca ggt gcc aca ttt gcc caa gtg ctg acc cag act gca tcg ccc 96 Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro 20 25 30 gtg tct gca gct gtg gga agc aca gtc acc atc aat tgc cag gcc agt 144 Val Ser Ala Ala Val Gly Ser Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser 35 40 45 cag agt gtt tat aat aac aac tgg tta tcc tgg ttt cag cag aaa cca 192 Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Trp Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro 50 55 60 ggg cag cct ccc aag caa ctg ata tat ggt gca tcc act ctg cca tct 240 Gly Gln Pro Pro Lys Gln Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Pro Ser 65 70 75 80 ggg gtc tca tcg cgg ttc aaa ggc agt gga tct ggg aca cag ttc act 288 Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr 85 90 95 ctc acc atc agc gac gtg cag tgt gac gat gct gcc act tac tac tgt 336 Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 ctg ggc ggt tat cat tgg agt act gct gat tgt aat gtt ttc ggc gga 384 Leu Gly Gly Tyr His Trp Ser Thr Ala Asp Cys Asn Val Phe Gly Gly 115 120 125 ggg acc gag gtg gtg gtc aaa ggt gat cca gtt gca cct act gtc ctc 432 Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu 130 135 140 atc ttc cca cca gct gct gat cag gtg gca act gga aca gtc acc atc 480 Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile 145 150 155 160 gtg tgc gtg gct aac aag tac ttc ccg gac gtg acc gtg acc tgg gaa 528 Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu 165 170 175 gtc gac gga acc act cag acc act ggt atc gag aac agc aag acg ccc 576 Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro 180 185 190 cag aac tcc gcc gat tgt act tat aac ctg tcc tcc aca ctg acc ctc 624 Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 195 200 205 acc tcg acc cag tac aat tcc cac aag gag tac act tgc aaa gtc acc 672 Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr 210 215 220 cag gga acc act tca gtg gtg cag agc ttc aac cgg ggg gat tgc tga 720 Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys 225 230 235 <210> 28 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro 20 25 30 Val Ser Ala Ala Val Gly Ser Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser 35 40 45 Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Trp Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Pro Pro Lys Gln Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Pro Ser 65 70 75 80 Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr 85 90 95 Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 Leu Gly Gly Tyr His Trp Ser Thr Ala Asp Cys Asn Val Phe Gly Gly 115 120 125 Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu 130 135 140 Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile 145 150 155 160 Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu 165 170 175 Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro 180 185 190 Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 195 200 205 Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr 210 215 220 Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly 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35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of E5 monoclonal antibody <400> 35 Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 of E5 monoclonal antibody <400> 36 Trp Ile Gly Tyr Leu Ser Ser Asp Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp 1 5 10 15 Ala <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 of E5 monoclonal antibody <400> 37 Ala Arg Gly Asp Asn Thr Ala Asp Ile 1 5 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of E5 monoclonal antibody <400> 38 Gln Ser Val Tyr Lys Asn Asn Asp Leu Ala 1 5 10 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 of E5 monoclonal antibody <400> 39 Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 of E5 monoclonal antibody <400> 40 Ala Gly Gly Tyr Ser Gly Pro Val Gly Ala 1 5 10 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of G7 monoclonal antibody <400> 41 Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Gly Val Ser 1 5 <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 of G7 monoclonal antibody <400> 42 Trp Ile Gly Phe Ile Asp Lys Tyr Gly Arg Thr His Tyr Ala Ser Trp 1 5 10 15 Ala <210> 43 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 of G7 monoclonal antibody <400> 43 Ala Arg Asp Asp Tyr Arg Pro Ala Tyr Gly Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of G7 monoclonal antibody <400> 44 Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 of G7 monoclonal antibody <400> 45 Gln Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Pro Ser 1 5 10 <210> 46 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 of G7 monoclonal antibody <400> 46 Leu Gly Gly Tyr His Trp Ser Thr Ala Asp Cys Asn Val 1 5 10 <210> 47 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> immunogenic peptide <400> 47 Tyr Arg Leu Lys Arg Ser Lys Ser 1 5

Claims

오스테오폰틴 또는 그 트롬빈 절단 단편에 특이적으로 결합하는 단리 항체 또는 그 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 그 항원-결합 단편이 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 또는 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 단편에 대한 인테그린 결합을 억제하는 단리 항체 또는 그 항원-결합 단편.
제1항에 있어서, 항체 또는 그 항원-결합 단편이 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3), 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3);을 포함하는 항체 또는 그 항원-결합 단편.
제2항에 있어서, 항체 또는 그 항원-결합 단편이 하기를 포함하는 항체 또는 그 항원-결합 단편:
(a) 서열번호 14 또는 서열번호 18의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14 또는 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄; 및
(b) 서열번호 16 또는 서열번호 20의 아미노산 서열, 또는 서열번호 16 또는 서열번호 20의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄.
제1항에 있어서, 항체 또는 그 항원-결합 단편이 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3), 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3);을 포함하는 항체 또는 그 항원-결합 단편.
제4항에 있어서, 항체 또는 그 항원-결합 단편이 하기를 포함하는 항체 또는 그 항원-결합 단편:
(a) 서열번호 22의 아미노산 서열, 또는 서열번호 22의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄.
(b) 서열번호 24의 아미노산 서열, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄.
제1항에 있어서, 항체 또는 그 항원-결합 단편이 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3), 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3);을 포함하는 항체 또는 그 항원-결합 단편.
제6항에 있어서, 항체 또는 그 항원-결합 단편이 하기를 포함하는 항체 또는 그 항원-결합 단편:
(a) 서열번호 26의 아미노산 서열, 또는 서열번호 26의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄.
(b) 서열번호 28의 아미노산 서열, 또는 서열번호 28의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄.
제1항에 있어서, 오스테오폰틴의 트롬빈 절단 단편이 OPN-R 단편 또는 OPN-CTF 단편인 항체 또는 그 항원-결합 단편.
제8 항에 있어서, 항체가 OPN-R 단편에 대한 인테그린 결합을 억제하는 항체 또는 그 항원-결합 단편.
제1항에 있어서, 항체가 서열번호 8의 참조 서열에 대해 번호가 매겨진 오스테오폰틴의 Arg 168을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 항원-결합 단편.
제1항에 있어서, 항체가 서열번호 1-7, 서열번호 9-12, 및 서열번호 47로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 구성된 오스테오폰틴 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 항원-결합 단편. 또는 그 항원-결합 단편.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 단클론 항체, 다클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 나노바디, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, F_v 단편, 및 scFv 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 그 항원-결합 단편.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 또는 그 항원-결합 단편을 포함하는 오스테오폰틴 관련 장애 치료용 조성물.
제13항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
제14항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체가 크림, 에멀젼, 젤, 리포솜, 나노 입자 및 연고로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
제14항 또는 제15항에 있어서, 항암 치료제를 추가로 포함하는 조성물.
제16항에 있어서, 항암 치료제가 화학요법제, 면역요법제, 생물학적 치료제, 세포자멸사 촉진제, 혈관신생 억제제, 광활성제, 방사선감작제 및 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 오스테오폰틴 관련 장애가 염증, 심장비대증, 심근섬유증, 흑색종, 교모세포종, 난소암, 유방암 또는 폐암인 것인 조성물.
제18항에 있어서, B-Raf 억제제, 미토겐 활성화 단백질 키나제(MEK) 억제제 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 조성물.
오스테오폰틴 관련 장애의 치료 방법으로서, 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항의 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
제20항에 있어서, 항체가 인간화 항체인 방법.
제20항 또는 제21항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 항암 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제22항에 있어서, 항암 치료제가 화학요법제, 면역요법제, 생물학적 치료제, 세포자멸사 촉진제, 혈관신생 억제제, 광활성제, 방사선감작제 및 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 오스테오폰틴 관련 장애가 오스테오폰틴의 과발현과 관련된 염증 또는 암인 것인 방법.
제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 오스테오폰틴 관련 장애가 심장비대증, 심근섬유증, 흑색종, 교모세포종, 난소암, 유방암 또는 폐암인 것인 방법.
제24항에 있어서, B-Raf 억제제, 미토겐 활성화 단백질 키나제(MEK) 억제제 또는 이들의 조합을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제25항에 있어서, B-Raf 억제제가 다브라페닙, 베무라페닙, 소라페닙, LGX818, GDC-0879 및 PLX-4720으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제25항에 있어서, MEK 억제제가 트라메티닙, 코비메티닙, 비니메티닙, 셀루메티닙 및 PD-325901로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 1일 투여 요법에 따라 또는 간헐적으로 투여되는 방법.
제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 치료 주기가 적어도 부분적 종양 반응에 영향을 미치기에 충분한 기간 동안 대상체에게 투여되는 것인 방법.
제30항에 있어서, 기간이 6개월 이상인 방법.
제31항에 있어서, 기간이 12개월 이상인 방법.
제20항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 완전한 종양 반응이 이루어지는 방법.
제20항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 대상체에서 트롬빈 응고촉진 활성을 방해하지 않는 방법.
대상체에서 종양 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 방법으로서, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 또는 그 항원-결합 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제13항 내지 제19항 중 어느 한 항의 조성물 및 암 또는 염증 치료용 키트의 사용 설명서를 포함하는 키트.
제36항에 있어서, 대상체에게 조성물을 투여하기 위한 수단을 추가로 포함하는 키트.
제1항에 있어서, 서열번호 5-7, 서열번호 9-12, 서열번호 47로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 면역원성 펩티드에 대해 대상체에서 면역 반응을 유도하는 단계를 포함하는 항체 생산 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 또는 그 항원-결합 단편, 그리고 항암 치료제, 검출가능한 표지 및 영상화제로 이루어진 군으로부터 선택된 작용제를 포함하는 접합체.
제39항에 있어서, 항암 치료제가 세포독성제, 약물, 독소, 뉴클레아제, 호르몬, 면역조절제, 세포자멸사 촉진제, 혈관신생 억제제, 붕소 화합물, 광활성제 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 접합체.
하기를 포함하는 단리된 핵산:
(a) 서열번호13, 서열번호 17, 서열번호 21 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열;
(b) 서열번호 14, 서열번호 18, 서열번호 22 및 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;
(c) 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 23 및 서열번호 27로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열;
(d) 서열번호 16, 서열번호 20, 서열번호 24 및 서열번호 28로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;
(e) (a) - (d)의 뉴클레오티드 서열에 대해 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
(f) (a) - (e)의 상보체를 포함하는 단리된 핵산.
제41항의 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 핵산.
제1항의 항체 또는 그 항원-결합 단편을 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템으로서, 항체 또는 그 항원-결합 단편이 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3), 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(L2) 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3);을 포함하는 벡터 시스템.
제43항에 있어서, 상기 항체 또는 그 항원 결합 단편이 서열번호 14 또는 서열번호 18의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14 또는 서열번호 18의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 16 또는 서열번호 20의 아미노산 서열, 또는 서열번호 16 또는 서열번호 20의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 벡터 시스템.
제1항의 항체 또는 그 항원-결합 단편을 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템으로서, 항체 또는 그 항원-결합 단편이 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3), 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(L2) 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3);을 포함하는 벡터 시스템.
제45항에 있어서, 항체 또는 그 항원-결합 단편이 서열번호 22의 아미노산 서열 또는 서열번호 22의 아미노산 서열과 80% 이상 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 24의 아미노산 서열 또는 서열번호 24의 아미노산 서열과 80% 이상 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 벡터 시스템.
제1항의 항체 또는 그 항원-결합 단편을 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템으로서, 항체 또는 그 항원-결합 단편이 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2), 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3), 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1), 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(L2) 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3);을 포함하는 벡터 시스템.
제47항에 있어서, 항체 또는 그 항원-결합 단편이 서열번호 26의 아미노산 서열 또는 서열번호 26의 아미노산 서열과 80% 이상 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 28의 아미노산 서열 또는 서열번호 28의 아미노산 서열과 80% 이상 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 벡터 시스템.
제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그 항원-결합 단편이 키메라화되거나 인간화되는 벡터 시스템.
제43항 내지 제49항 중 어느 한 항의 벡터 시스템을 포함하는 숙주 세포.
상기 항체 또는 그 항원-결합 단편을 생산하는 방법으로서:
(a) 항체 또는 그 항원-결합 단편의 생산에 적합한 조건 하에 제50항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 숙주 세포로부터 항체 또는 그 항원-결합 단편을 분리하는 단계를 포함하는 방법.