CN117700553A - 靶向c-MET的纳米抗体、药物偶联物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了靶向c‑MET的纳米抗体、药物偶联物及其用途。具体地，本发明提供了一类抗c‑MET的特异性纳米抗体。本发明还提供了基于该纳米抗体构建的药物偶联物。本发明的纳米抗体分子量小，能够快速渗透肿瘤组织；同时具备高内吞活性，具有更好的毒素递送能力，能够用于c‑MET相关疾病治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及靶向c-MET的纳米抗体、药物偶联物及其用途。
背景技术
纳米抗体(nanobody,Nb)，即重链单域抗体VHH(variabledomain of heavy chainof heavy-chainantibody)，该类抗体只包含一个重链可变区(VHH)和CH2，CH3区，相比于其他抗体，轻链天然缺失。纳米抗体晶体直径2.5nm，长4nm，是自然存在的可以和抗原结合的最小片段。
抗体药物偶联物(antibody-drug conjugates,ADC)是通过特定的连接子将靶标特异性的单克隆抗体与高杀伤性的细胞毒小分子药物偶联起来的靶向生物药剂，以单克隆抗体为载体将小分子细胞毒性药物以靶向方式高效地运输至目标肿瘤细胞中。与化疗药物相比，ADC能P够更精确的识别病变细胞，降低对正常细胞的杀伤，扩大了治疗窗口。与传统的抗体或抗体片段相比，ADC由于携带了高活性的细胞毒药物从而增强了治疗效果。
目前，由c-MET介导的肿瘤疾病发生的治疗方式有1)小分子激酶抑制剂，如克唑替尼(辉瑞)和卡博替尼(Exelixis)等分别获批用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)和甲状腺髓样癌；2)c-MET抗体；3)c-MET抗体药物偶联物。传统的小分子抑制剂存在耐药性问题，明显缩短了患者的响应时间；针对c-MET的抗体药物研发目前还没有任何一款c-MET单抗获批上市。仍需要不断开发用于治疗肿瘤疾病的c-MET抗体和相应ADC，克服现有技术的限制性，例如在提高结合能力和内吞能力的基础上增加肿瘤组织的穿透性以及克服耐药和减少不良反应等。
因此，本领域需要开发一种具备高结合和内吞能力、低不良反应的抗c-MET抗体。
发明内容
本发明的目的就是提供靶向c-MET的纳米抗体、药物偶联物及其用途。
在本发明的第一方面，提供了一种抗c-MET的纳米抗体，所述纳米抗体的VHH链的互补决定区CDR选自下组：
(1)SEQ ID NO:3所示的CDR1，
SEQ ID NO:4所示的CDR2，和
SEQ ID NO:5所示的CDR3；
和，
(2)SEQ ID NO:6所示的CDR1，
SEQ ID NO:7所示的CDR2，和
SEQ ID NO:8所示的CDR3。
在另一优选例中，所述的纳米抗体VHH链的CDR区包含与上述序列中任一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％的序列相似性的氨基酸序列。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留c-MET结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-3个，较佳地为1-2个，更佳地为1个。
在另一优选例中，所述纳米抗体的VHH链还包括框架区(FR)。
在另一优选例中，所述的CDR1、CDR2和CDR3由VHH链的框架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。
在另一优选例中，所述的框架区FR为人源、鼠源、兔源或骆驼源的。
在另一优选例中，所述的纳米抗体结合人源、鼠源或猴源的c-MET。
在另一优选例中，所述的纳米抗体在表达c-MET抗原的细胞中能够发生内吞。
在另一优选例中，所述纳米抗体的VHH链具有与SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列同源性≥85％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、或≥99％的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述纳米抗体的VHH链具有一条或多条如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述纳米抗体包括单体、二价体(二价抗体)、四价体(四价抗体)、和/或多价体(多价抗体)。
在另一优选例中，所述纳米抗体的VHH链的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或其组合。
在另一优选例中，所述的纳米抗体阻断MET和HGF的结合。
在另一优选例中，所述的纳米抗体包含抗体的Fc段，较佳地为IgG的Fc段，更佳地为人IgG的Fc段。
在另一优选例中，所述的纳米抗体具有与SEQ ID NO:9或10所示的氨基酸序列同源性≥85％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、或≥99％的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的纳米抗体序列如SEQ ID NO:9或10所示。
在本发明的第二方面，提供了一种纳米抗体融合蛋白，所述纳米抗体融合蛋白从N端到C端具有如式I所示的结构：
Z1-Z2-L-Z3(式I)
式中，
Z1为如本发明第一方面所述的抗c-MET纳米抗体的VHH链；
Z2为免疫球蛋白的Fc段；
L为接头序列；
Z3为免疫调节分子部分。
在另一优选例中，所述的免疫调节分子为免疫激活分子，如细胞因子。
在本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：本发明第一方面所述的抗c-MET的纳米抗体、本发明第二方面所述的纳米抗体融合蛋白、或其组合。
在另一优选例中，所述多核苷酸包括DNA、RNA或cDNA。
在本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合。
在另一优选例中，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒。
在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第四方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、噬菌体、或其组合。
在本发明的第六方面，提供了一种产生抗c-MET纳米抗体的方法，包括步骤：
(a)在适合产生纳米抗体的条件下，培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从而获得含有所述抗c-MET纳米抗体的培养物；以及
(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗c-MET纳米抗体；和
(c)任选地，纯化和/或修饰步骤(b)中获得的抗c-MET纳米抗体。
在本发明的第七方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：
(a)如本发明第一方面所述的抗c-MET纳米抗体；和
(b)所述纳米抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、或其组合。
在另一优选例中，所述免疫偶联物为抗体药物偶联物。
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
在另一优选例中，所述的可检测标记物为化学标记、生物标记、或其组合。
在另一优选例中，所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物。
在另一优选例中，所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。
在另一优选例中，所述的药物为小分子药物、生物因子、或其组合。
在另一优选例中，所述的药物为细胞毒性药物(毒素)。
在另一优选例中，所述的细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、或其组合。
在另一优选例中，特别有用的细胞毒性药物的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containing drugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))、长春花生物碱(vinca alkaloids)、或其组合。
在另一优选例中，所述的毒素选自下组：耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素、或其组合。
在另一优选例中，所述的毒素为MMAE。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述可检测标记物包括放射性核素，所述的放射性核素包括：
(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188、或其组合；和/或
(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133 Yb-169、Yb-177、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、病毒外壳蛋白(VLP)、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的如本发明第一方面所述的抗c-MET纳米抗体。所述多价是指，在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的如本发明第一方面所述的抗c-MET纳米抗体。
在另一优选例中，所述免疫偶联物具有如下分子式所示：
其中：
nAb是如本发明第一方面所述的抗c-MET的纳米抗体；
LU为化学键或连接子；
D是药物；
p为所述抗体-药物偶联物中的药物平均偶联数量，并且p是选自1～10的值。
在另一优选例中，p为2～6，优选为3～4，更优选为3.8～4.0。
在另一优选例中，所述的LU为马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸(MC-Val-Cit)接头。
在本发明的第八方面，提供了一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包含本发明第一方面所述的抗c-MET纳米抗体。
在另一优选例中，所述多特异性抗体包含重链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区来源于IgG的Fc段，优选地为人IgG的Fc段。
在本发明的第九方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明第一方面所述的纳米抗体、如本发明第二方面所述的纳米抗体融合蛋白、如本发明第八方面所述的多特异性抗体的序列；和
(ii)协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签和HA标签
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合于c-MET蛋白。
在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，含有：
(i)如本发明第一方面所述的抗c-MET纳米抗体、或如本发明第二方面所述的融合蛋白、或如本发明第七方面所述的免疫偶联物、或如本发明第八方面所述的多特异性抗体、或如本发明第九方面所述的重组蛋白、或其组合；和
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：结肠癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌、间皮瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢生殖细胞癌、甲状腺癌、胃癌、食管癌、肺癌(如肺腺癌和非小细胞肺癌)、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)、恶性脑胶质瘤、肝癌、膀胱癌、子宫内膜癌、宫颈癌、白血病、骨髓癌、骨肉瘤、血管肉瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述的癌症选自下组：肺癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肾癌、胃癌等。
在另一优选例中，所述的免疫偶联物的偶联部分为药物、毒素、和/或治疗用同位素。
在另一优选例中，所述的药物组合物中还含有其他的治疗免疫系统疾病或肿瘤疾病的药物。
在另一优选例中，所述其他的治疗免疫系统疾病或肿瘤疾病的药物选自下组：布地奈德、氟替卡松、倍氯米松、糠酸莫米松、沙丁胺醇、茶碱、福莫特罗、噻托溴铵、柳氮磺胺吡啶、甲氨蝶呤、环磷酰胺、氟尿嘧啶、博来霉素、阿那曲唑、或其组合。
在本发明的第十一方面，提供了一种活性成分的用途，所述的活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的抗c-MET纳米抗体、或如本发明第二方面所述的融合蛋白、或如本发明第七方面所述的免疫偶联物、或如本发明第八方面所述的多特异性抗体、或如本发明第九方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方面所述的药物组合物、或其组合，所述活性成分用于(a)制备检测试剂、检测板或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗疾病的药物。
在另一优选例中，所述检测试剂、检测板或试剂盒用于：
(1)检测样品中的c-MET蛋白；和/或
(2)检测表达c-MET蛋白的肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述的检测试剂、检测板或试剂盒用于诊断c-MET相关疾病。
在另一优选例中，所述的检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测。
在另一优选例中，所述疾病为c-MET相关疾病。
在另一优选例中，所述疾病包括癌症。
在另一优选例中，所述的癌症包括实体瘤、血液癌。
在另一优选例中，所述癌症选自下组：结肠癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌、间皮瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢生殖细胞癌、甲状腺癌、胃癌、食管癌、肺癌(如肺腺癌和非小细胞肺癌)、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)、恶性脑胶质瘤、肝癌、膀胱癌、子宫内膜癌、宫颈癌、白血病、骨髓癌、骨肉瘤、血管肉瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述的癌症选自下组：肺癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肾癌、胃癌等。
在本发明的第十二方面，提供了一种检测样品中c-MET蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与如本发明第一方面所述的抗c-MET纳米抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在c-MET蛋白。
在本发明的第十三方面，提供了一种c-MET蛋白检测试剂，所述的检测试剂包含：
(i)本发明第一方面所述的抗c-MET纳米抗体、或本发明第七方面所述的免疫偶联物、或本发明第九方面所述的重组蛋白；以及
(ii)检测学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的免疫偶联物的偶联部分为诊断用同位素。
在另一优选例中，所述的检测学上可接受的载体为无毒的、惰性的水性载体介质。
在另一优选例中，所述的检测试剂为选自下组的一种或多种试剂：同位素示踪剂、造影剂、流式检测试剂、细胞免疫荧光检测试剂、纳米磁粒和显像剂。
在另一优选例中，所述的检测试剂用于体内检测。
在另一优选例中，所述的检测试剂的剂型为液态或粉状(如水剂、针剂、冻干粉、片剂、含服剂、吸雾剂)。
在本发明的第十四方面，提供了一种c-MET蛋白的检测试剂盒，所述试剂盒含有本发明第七方面所述的免疫偶联物或本发明第十三方面所述的检测试剂，以及说明书
在另一优选例中，所述的说明书记载，所述的试剂盒用于非侵入性地检测待测对象的c-MET的表达。
在本发明的第十五方面，提供了一种治疗与c-MET相关的疾病的方法，所述方法包括，给需要的对象施用本发明第一方面所述的抗c-MET纳米抗体、或本发明第七方面所述的免疫偶联物、或本发明第九方面所述的重组蛋白、或本发明第十方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如鼠、兔)、非人灵长类动物(如猴)。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1A-1D显示了ELISA检测的抗体结合活性。
图2A-2D显示了流式细胞术检测的抗体对CHO-K1-MET细胞表面抗原的结合活性。
图3显示了c-MET纳米抗体对NCI-H1975细胞的结合活性。
图4A-4B分别显示了抗体在CHO-K1-MET、NCI-H1975细胞中内吞活性检测结果。
图5显示了KY301-09、KY301-39抗体阻断MET与HGF结合。
图6A-6C分别显示了KY301-09、KY301-39抗体对人源、鼠源和猴源c-MET抗原的结合能力。
图7A-7D显示了c-MET ADC主要为DAR4产物。
图8A-8H显示了c-MET ADC对多种肿瘤细胞的体外杀伤活性。
图9A-9B显示了c-MET ADC在异种移植HCT116结肠癌的小鼠模型中的体内抗肿瘤效果及小鼠体重变化情况。
图9C-9D显示了c-MET ADC在异种移植NCI-H1975肺腺癌的小鼠模型中的体内抗肿瘤效果及小鼠体重变化情况。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种抗c-MET的纳米抗体及其药物偶联物。本发明的纳米抗体分子量小，能够快速渗透肿瘤组织；同时具备高内吞活性，具有更好的毒素递送能力。本发明的纳米抗体药物偶联物DAR值均一、产物DAR4分子纯度高。在此基础上，完成了本发明。
术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”的成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。
如本文所用，术语“治疗有效量”，是指对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本领域的普通技术人员应该理解，所述的“治疗有效量”可随着药物组合物的形式、给药途径、所用药物的辅料、疾病的严重程度以及与其他药物联合用药等情况的不同而有所不同。
c-MET
c-MET基因位于人类7号染色体(7Q21-Q31)上，包括21个外显子和20个内含子，并编码一个大约120kda的蛋白质。翻译后的产物被加工成异二聚体，由α链和β链通过二硫键连接组成，分为胞外域、跨膜螺旋结构域和胞内域。胞外域包含3个不同的功能区：一个SEMA结构域、二硫键的胱氨酸富集域(PSI)、4个免疫球蛋白区域(IPT)。胞内域的主要作用是发生自身磷酸化活化下游信号，起到正向调节酪氨酸激酶催化活性的作用。
c-MET是肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)的配体，在正常情况下，HGF和c-MET的结合可以介导胚胎发生、组织再生、创面愈合、神经和肌肉的形成等。然而，在癌细胞中异常的HGF/c-MET通路的激活(与c-MET基因突变、过度表达和扩增密切相关)会刺激PI3K/AKT、Ras/MAPK、JAK/STAT、SRC、Wnt/β-catenin等众多下游信号通路，从而促使肿瘤形成、侵袭性生长和转移。
c-MET蛋白的异常活化可通过多种机制发生，主要包含：MET外显子14跳跃突变、MET扩增和MET蛋白过表达等，这些途径涉及到肿瘤的增殖、迁移和侵袭，也是肿瘤细胞向远处转移的重要因素。c-MET蛋白的异常调节在多种实体瘤(肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、皮肤癌、大肠癌等)中均有发生。
纳米抗体
如本文所用，术语“本发明的抗c-MET纳米抗体”、“抗c-MET纳米抗体”可互换使用，均指本发明第一方面的特异性识别和结合于c-MET(包括人MET)的纳米抗体，特别优选的是VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的纳米抗体。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“纳米抗体nanobody”、“VHH”具有相同的含义，指单克隆抗体重链的可变区。纳米抗体(VHH)是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(VHH)。
如本文所用，术语“重链抗体”指仅含有重链的抗体。在骆驼科动物血液中发现有一部分抗体是缺失轻链的“重链抗体”。本发明的重链抗体包含重链可变区(VHH)和重链恒定区CH2和CH3。本发明的重链抗体可以是分离自动物的(如骆驼源的)天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体；或者可以是使用本发明的纳米抗体(VHH)与重链恒定区重组获得的重组抗体。本发明重链抗体可以包含来源于例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区，较佳地来源于IgG1的恒定区。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。CDR的分区方法目前有多种，包括IMGT法、Kabat法、Chothia法、VBASE2法等。在一种实施方式中，本发明所提及的CDR分区方法均使用IMGT法。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
在本发明中，术语“本发明重组蛋白”、“本发明融合蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合c-MET蛋白的多肽，例如具有本发明纳米抗体VHH链的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
本发明抗体的重链可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有c-MET蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含纳米抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明纳米抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
| 最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
| Ala(A) | Val；Leu；Ile | Val |
| Arg(R) | Lys；Gln；Asn | Lys |
| Asn(N) | Gln；His；Lys；Arg | Gln |
| Asp(D) | Glu | Glu |
| Cys(C) | Ser | Ser |
| Gln(Q) | Asn | Asn |
| Glu(E) | Asp | Asp |
| Gly(G) | Pro；Ala | Ala |
| His(H) | Asn；Gln；Lys；Arg | Arg |
| Ile(I) | Leu；Val；Met；Ala；Phe | Leu |
| Leu(L) | Ile；Val；Met；Ala；Phe | Ile |
| Lys(K) | Arg；Gln；Asn | Arg |
| Met(M) | Leu；Phe；Ile | Leu |
| Phe(F) | Leu；Val；Ile；Ala；Tyr | Leu |
| Pro(P) | Ala | Ala |
| Ser(S) | Thr | Thr |
| Thr(T) | Ser | Ser |
| Trp(W) | Tyr；Phe | Tyr |
| Tyr(Y) | Trp；Phe；Thr；Ser | Phe |
| Val(V) | Ile；Leu；Met；Phe；Ala | Leu |
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
免疫偶联物
本发明还提供了基于本发明抗体的免疫偶联物(ADC)，例如纳米抗体偶联药物(nanobody-drug conjugate，NDC)。
典型地，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外，所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。
本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。
抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)，稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。
纳米抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。
在一种实施方式中，本发明的ADC使用马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸(MC-Val-Cit)接头。
药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。
有用的药物类别包括，例如，抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containingdrugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))和长春花生物碱(vinca alkaloids)。
在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。
通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。
本发明还提供了制备ADC的方法，可进一步地包括：将抗体与药物-接头化合物，在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。
在某些实施方式中，本发明方法包括：在足以形成抗体-接头偶联物的条件下，将抗体与接头化合物进行结合。在这些实施方式中，本发明方法还进一步地包括：在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下，将抗体接头偶联物与药物部分进行结合。
本发明提供的纳米抗体制备的ADC具有均一的药物抗体比(DAR)。在一些实施方式中，其药物抗体比在2～4范围内，例如2～2.5、2.5～3、3～3.2、3.2～3.4、3.4～3.6、3.6～3.8、3.8～4。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合c-MET蛋白分子，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的纳米抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
对于ADC而言，由于本发明提供的纳米抗体-药物偶联物可以靶向瞄准特殊的细胞群体，与细胞表面特异蛋白(抗原)结合，从而通过结合物内吞或药物渗入使得药物以活性形式释放到细胞内，因此，本发明的纳米抗体-药物偶联物可以用于治疗目标疾病，上面提到的抗体-药物偶联物可以以治疗有效量，通过合适的途径给予受试者(例如人)。需要治疗的受试者可以是有风险，或怀疑患有与特定抗原的活性或表达量有关病症的患者。这样的患者可以通过常规体检来鉴定。
当用本发明的纳米抗体-药物偶联物治疗时，可以通过本领域常规的方法进行递送。例如，它可以通过使用脂质体，水凝胶，环糊精，生物可降解的纳米胶囊，或生物粘附性微球被引入到细胞中。或者，所述核酸或载体可在本地通过直接注射或通过使用输注泵递送。
标记的纳米抗体
在本发明的一个优选例中，所述纳米抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，抗c-MET的纳米抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的纳米抗体。
本发明的抗c-MET纳米抗体具有很好的特异性，很高的效价。
检测方法
本发明还涉及检测c-MET蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中c-MET蛋白的水平。
本
在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。
试剂盒
本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明还提供了用于检测c-MET水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别c-MET蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
应用
如上所述，本发明的纳米抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与c-MET相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对c-MET的临床诊断和靶向治疗。
本发明的主要优点包括：
1)本发明纳米抗体结构更小，只有一个重链可变区，仅15KD，融合FC后的纳米抗体分子量约为80KD，约为传统抗体分子量(150KD)的一半。因此，纳米抗体可以识别抗原隐藏表位，具有更好的结合特异性、组织穿透性和低免疫原性；同时，纳米抗体具有更高的稳定性，更容易改造和优化，适合大规模生产。
2)DAR分布更加均一：传统抗体分子共具有四对二硫键，偶联毒素后DAR的分布范围为0-8。本发明在纳米抗体的基础上进行了FC端的融合改造，两条重链间共具有两对二硫键，通过还原二硫键进行毒素偶联后DAR的分布范围为0-4，更为均一。且本发明纳米抗体DAR4产物占比更高，DAR4产物纯度>90％。
3)本发明的c-MET纳米抗体具备高特异性和高内吞活性是ADC发挥药效的关键环节。恒瑞医药的c-MET抗体在肿瘤细胞中2h时最大内吞率为53％。在相同时间内，本发明的c-MET纳米抗体在肿瘤细胞中的内吞率均在70％以上。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。MET-BMK2序列来自于再生元专利US11,142,578B，MET-BMK4是已上市药物Amivantamab-vmjw中的MET部分单抗。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1.抗c-MET的纳米抗体的制备方法
使用c-MET抗原免疫羊驼，提取羊驼外周淋巴血中的总RNA，通过RT-PCR获取cDNA，以cDNA为模板扩增目的片段，将目的片段与噬菌粒载体经过酶切后连接，电转至TG1感受态后再经过辅助噬菌体侵染包装后得到噬菌体文库；使用c-MET蛋白从噬菌体展示库中淘选抗c-MET的纳米抗体，通过ELISA筛选阳性单克隆抗体，对其进行测序后即可进行表达纯化及验证。
用于活性检测的抗体通常与人IgG FC区域进行融合表达，在此，选用人IgG1 FC。
实施例2.抗原抗体结合实验(ELISA)
本发明利用酶联免疫吸附的方法检测抗c-MET纳米抗体与c-MET抗原的结合能力。
实验具体步骤：
1.包被抗原(hMET-His)：用PBS稀释抗原至1μg/mL，向酶标板中加入稀释好的100μL/孔的抗原，4℃孵育过夜。
2.洗涤：每孔加入300μL的0.05％ PBST，用洗板机洗3次。
3.封闭：每孔加入300μL的含3％ BSA的PBS，37℃封闭2h。
4.洗涤：每孔加入300μL的0.05％ PBST，用洗板机洗3次。
5.一抗孵育：抗体用含1％ BSA的PBS进行稀释，抗体最大浓度为2μg/mL，再4倍梯度稀释成8个浓度，每孔加入100μL，室温孵育1h。
6.洗涤：每孔加入300μL的0.05％ PBST，用洗板机洗3次。
7.孵育二抗：每孔加入100μL二抗(1：10000稀释)，37℃孵育30min。
8.洗涤：每孔加入300μL的0.05％ PBST，用洗板机洗4次。
9.每孔加入100μL的TMB，25℃避光显色5-10min。
10.终止：每孔加入50μL的TMB显色终止液终止反应。
11.检测：使用TECAN酶标仪在450nm读板。
12.数据处理：使用GraphPad Prism软件拟合抗体浓度及OD450，获得四参数拟合曲线，计算EC50。
实验结果如图1A-1D和表1所示：MET-BMK2为c-MET靶点的阳性对照抗体，和人c-MET抗原结合较强。通过抗原抗体结合活性强弱的比较，排除了EC50≥0.10μg/mL的抗体，如KY301-06、KY301-08、KY301-10、KY301-11、KY301-15、KY301-20、KY301-27、KY301-28、KY301-29、KY301-30、KY301-33、KY301-34。筛选到的c-MET抗体均具有较强的结合活性，如KY301-02、KY301-04、KY301-05、KY301-07、KY301-09、KY301-12、KY301-13、KY301-14、KY301-16、KY301-17、KY301-18、KY301-19、KY301-21、KY301-22、KY301-23、KY301-24、KY301-25、KY301-26、KY301-31、KY301-32、KY301-36、KY301-37、KY301-39、KY301-40。
表1抗c-MET抗体与MET抗原结合的EC50值
| c-MET抗体 | EC50(μg/mL) | c-MET抗体 | EC50(μg/mL) |
| KY301-02 | 0.0046 | KY301-22 | 0.0066 |
| KY301-04 | 0.0035 | KY301-23 | 0.0022 |
| KY301-05 | 0.0061 | KY301-24 | 0.0073 |
| KY301-06 | 0.64 | KY301-25 | 0.02 |
| KY301-07 | 0.023 | KY301-26 | 0.029 |
| KY301-08 | 0.72 | KY301-27 | 0.19 |
| KY301-09 | 0.0058 | KY301-28 | 0.68 |
| KY301-10 | 0.75 | KY301-29 | 0.10 |
| KY301-11 | 0.35 | KY301-30 | 5.53 |
| KY301-12 | 0.0041 | KY301-31 | 0.01 |
| KY301-13 | 0.0065 | KY301-32 | 0.015 |
| KY301-14 | 0.012 | KY301-33 | 0.10 |
| KY301-15 | 0.11 | KY301-34 | 5.59 |
| KY301-16 | 0.0032 | KY301-36 | 0.013 |
| KY301-17 | 0.0041 | KY301-37 | 0.012 |
| KY301-18 | 0.0071 | KY301-39 | 0.0085 |
| KY301-19 | 0.0063 | KY301-40 | 0.0057 |
| KY301-20 | 0.11 | MET-BMK2 | 0.0067 |
| KY301-21 | 0.011 |
实施例3.抗c-MET纳米抗体与抗原过表达细胞的结合活性检测
测试c-MET纳米抗体、阳性对照和同型对照与c-MET过表达细胞CHO-K1-MET的结合活性。
实验具体步骤：提前准备好处于对数生长期的待测细胞，用胰酶对其进行消化离心后收集该细胞，用PBS重悬细胞后调整细胞数量至2*106个/mL的浓度。在96孔细胞培养板中加入100μL/孔的细胞悬液，同时加入100μL/孔的c-MET抗体稀释液。抗体最大浓度为20μg/mL，用含1％ BSA的PBS进行4倍梯度稀释，最终形成8个浓度。将细胞悬液和抗体稀释液充分混合后置于4℃避光孵育1h。孵育结束后在4℃、400g条件下离心5分钟并弃去上清。每孔加入200μL的含1％ BSA的PBS，4℃、400g条件下离心5分钟，弃去上清，重复2次。每孔加入PEanti-human IgG Fc Antibody抗体稀释液(1：100稀释)吹打混匀细胞，4℃避光孵育30min。孵育结束后在4℃、400g条件下离心5分钟并弃去上清。每孔加入200μL的含1％ BSA的PBS，4℃、400g条件下离心5分钟，弃去上清，重复2次。最后每孔加入100μL的1％ BSA的PBS重悬细胞，并使用流式细胞仪检测细胞中表达的荧光强度中位值(Median-PE)。使用GraphPadPrism软件拟合抗体浓度及荧光值，获得四参数拟合曲线。
实验结果如图2A-2D所示：c-MET纳米抗体和c-MET过表达细胞CHO-K1-MET具有不同程度的结合活性，对于结合活性相对较弱的抗体进行排除，如KY301-12、KY301-14、KY301-16、KY301-17、KY301-23、KY301-24、KY301-25、KY301-26、KY301-32。筛选到的c-MET抗体与CHO-K1-MET具有较强的结合活性，如KY301-02、KY301-04、KY301-05、KY301-07、KY301-09、KY301-13、KY301-18、KY301-19、KY301-21、KY301-22、KY301-31、KY301-36、KY301-37、KY301-39、KY301-40。
实施例4.抗c-MET纳米抗体与肿瘤细胞的结合活性检测
测试c-MET纳米抗体、阳性对照以及同型对照与肿瘤细胞NCI-H1975(人肺腺癌细胞)的结合活性。
实验具体步骤：提前准备好处于对数生长期的待测细胞，用胰酶对其进行消化离心后收集该细胞，用PBS重悬细胞后调整细胞数量至2*106个/mL的浓度。在96孔细胞培养板中加入100μL/孔的细胞悬液，同时加入100μL/孔的c-MET抗体稀释液。抗体浓度为10μg/mL。将细胞悬液和抗体稀释液充分混合后置于4℃避光孵育1h。孵育结束后在4℃、400g条件下离心5分钟并弃去上清。每孔加入200μL的含1％ BSA的PBS，4℃、400g条件下离心5分钟，弃去上清，重复2次。每孔加入PE anti-human IgG Fc Antibody抗体稀释液(1：100稀释)吹打混匀细胞，4℃避光孵育30min。孵育结束后在4℃、400g条件下离心5分钟并弃去上清。每孔加入200μL的含1％ BSA的PBS，4℃、400g条件下离心5分钟，弃去上清，重复2次。最后每孔加入100μL的1％ BSA的PBS重悬细胞，并使用流式细胞仪检测细胞中表达的荧光强度中位值(Median-PE)。
实验结果如图3所示：c-MET纳米抗体在NCI-H1975细胞中均具有结合活性，且结合能力强于阳性对照抗体。根据结合活性的强弱程度排除KY301-07、KY301-36、KY301-37抗体。保留抗体KY301-02、KY301-04、KY301-05、KY301-09、KY301-13、KY301-18、KY301-19、KY301-21、KY301-22、KY301-31、KY301-39、KY301-40继续进行后续的筛选评价。
实施例5.抗c-MET纳米抗体在细胞中的内吞活性检测
测试c-MET纳米抗体、阳性对照以及同型对照在抗原过表达细胞CHO-K1-MET和肿瘤细胞NCI-H1975中的内吞活性。
实验具体步骤：提前准备好处于对数生长期的待测细胞，用胰酶对其进行消化离心后收集该细胞，用PBS重悬细胞后调整细胞数量至2*106个/mL的浓度。在96孔细胞培养板中分别加入100μL/孔的细胞悬液，同时加入100μL/孔的c-MET抗体稀释液。抗体最大浓度为10μg/mL，用完全培养基进行稀释(每个细胞制作两块相同的板)。将细胞悬液和抗体稀释液充分混合后将两个相同的细胞板进行相同的处理，置于4℃避光孵育1h。孵育结束后在4℃、400g条件下离心5分钟并弃去上清。每孔加入200μL的完全培养基，4℃、400g条件下离心5分钟，弃去上清，重复2次。向所有细胞板加入100μL/孔的完全培养基并吹打混匀细胞，检测内化效率的细胞在37℃下孵育2h，对照细胞在4℃冰箱中进行孵育2h。孵育结束后将所有细胞板在4℃、400g条件下离心5分钟并弃去上清。每孔加入200μL的含1％ BSA的PBS，4℃、400g条件下离心5分钟，弃去上清，重复2次。每孔加入100μL的PE anti-human IgG Fc Antibody抗体稀释液(1：100稀释)，4℃避光孵育30min。孵育结束后在4℃、400g条件下离心5分钟并弃去上清。最后每向每个细胞板加入100μL/孔的1％ BSA的PBS重悬细胞，并使用流式细胞仪检测待测细胞中表达的荧光强度中位值(Medium-PE)。计算：内化率(％)＝[1-(内化细胞Medium-PE)/(对照细胞Medium-PE)]x100％。
实验结果如图4A所示。从内吞率结果分析，c-MET纳米抗体在CHO-K1-MET细胞中均具有不同程度的内吞作用。对于内吞率大于55％的抗体，如KY301-02、KY301-09、KY301-31、KY301-39、KY301-40继续在NCI-H1975细胞中进行内吞评价。结果如图4B，c-MET纳米抗体在NCI-H1975细胞中均具有较强的内吞作用，内吞率都在70％以上。结合抗体在这两种细胞中的内吞情况，选择内吞率相对较高的KY301-09、KY301-39进行后续评价。抗体序列如SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10所示。
实施例6.抗c-MET纳米抗体体外亲和力检测
本实施例中使用表面等离子共振(SPR)技术进行了抗体对c-MET抗原的亲和力检测。
实验具体步骤：
1.抗体的捕获：实验采用1×PBS(含0.05％ Tween 20，pH 7.4)缓冲液作为测试缓冲液，将各抗体用PBS缓冲液稀释至1μg/mL，流速设置为10μL/min，直接捕获到Protein A芯片的测试表面，持续捕获60s，捕获量可达到约400RΜ水平。
2.样品的测试条件：样品共设置8个分析浓度，浓度梯度分别为0nM、7.81nM、15.62nM、31.25nM、62.5nM、125nM、250nM、500nM，样品分析时设置流速为30μL/min，结合时间为120s，解离时间为1200s。
3.再生条件：确定Gly-HCl缓冲液(pH 1.5)作为再生缓冲液，再生时流速设置为30μL/min，再生30s。再生完成后，稳定芯片60s再分析下一个样品。
4.动力学参数测定：实验采用多循环运行，响应信号以分析时间为横坐标，响应值为纵坐标。所得数据通过BIAcore T200分析软件进行拟合，所采用的拟合模型为1:1Langmuir结合模型，确定其结合速率常数、解离速率常数及结合解离常数等动力学常数。结果如表2。
表2抗c-MET纳米抗体与抗原的结合亲和力及动力学常数
实施例7.抗c-MET纳米抗体的配体(HGF)阻断实验(ELISA)
测试c-MET纳米抗体、阳性对照以及同型对照与配体HGF竞争结合hMET抗原的能力。
实验具体步骤：
1.包被抗原：用PBS稀释抗原至1μg/mL，每孔加入100μL，4℃孵育过夜。
2.洗涤：每孔加入300μL的0.05％ PBST，用洗板机洗3次。
3.封闭：每孔加入300μL的含3％ BSA的PBS，37℃封闭2h。
4.洗涤：每孔加入300μL的0.05％ PBST，用洗板机洗3次。
5.一抗和HGF混合孵育：抗体和带HA标签的HGF用含1％ BSA的PBS进行稀释，抗体最大浓度为2μg/mL，再4倍梯度稀释成8个浓度，每孔加入50μL。再向每个孔中加入100μg/mL的HGF-HA，室温孵育1h。
6.洗涤：每孔加入300μL的0.05％ PBST，用洗板机洗3次。
7.孵育二抗：每孔加入100μL抗HA的二抗稀释液(1：10000稀释)，37℃孵育30min。
8.洗涤：每孔加入300μL的0.05％ PBST，用洗板机洗4次。
9.每孔加入100μL的TMB，25℃避光显色5-10min。
10.终止：每孔加入50μL的TMB显色终止液终止反应。
11.检测：使用TECAN酶标仪在450nm读板。
12.数据处理：使用GraphPad Prism软件拟合抗体浓度及OD450，获得四参数拟合曲线。
实验结果如图5所示。与同型对照组相比，KY301-09、KY301-39都具有较强的HGF阻断作用，且阻断能力均强于阳性对照MET-BMK2。
实施例8.抗c-MET纳米抗体与人、鼠、猴抗原种属交叉检测实验(ELISA)
测试c-MET纳米抗体、阳性对照以及同型对照与人、鼠、猴c-MET抗原的结合能力，确定抗原种属交叉情况。
实验具体步骤：
1.包被抗原：用PBS分别稀释人、鼠、猴的c-MET抗原至1μg/mL，每种抗原分别加入100μL、孔到对应的96孔板中，4℃孵育过夜。
2.洗涤：每孔加入300μL的0.05％ PBST，用洗板机洗3次。
3.封闭：每孔加入300μL的含3％ BSA的PBS，37℃封闭2h。
4.洗涤：每孔加入300μL的0.05％ PBST，用洗板机洗3次。
5.一抗孵育：抗体用含1％ BSA的PBS进行稀释，抗体最大浓度为2μg/mL，再4倍梯度稀释成8个浓度，每孔加入50μL。再向每个孔中加入100μg/mL的HGF-HA，室温孵育1h。
6.洗涤：每孔加入300μL的0.05％ PBST，用洗板机洗3次。
7.孵育二抗：每孔加入100μL二抗(1：10000稀释)，37℃孵育30min。
8.洗涤：每孔加入300μL的0.05％ PBST，用洗板机洗4次。
9.每孔加入100μL的TMB，25℃避光显色5-10min。
10.终止：每孔加入50μL的TMB显色终止液终止反应。
11.检测：使用TECAN酶标仪在450nm读板。
12.数据处理：使用GraphPad Prism软件拟合抗体浓度及OD450，获得四参数拟合曲线。
实验结果如图6A-6C和表3所示。KY301-09、KY301-39以及阳性对照抗体MET-BMK2与人和猴的c-MET抗原具有强结合能力，同时，KY301-09还具有对小鼠c-MET抗原的较强结合能力。
表3c-MET抗体与人、鼠、猴源c-MET抗原结合的EC50值
实施例9.抗c-MET纳米抗体偶联毒素Vc-MMAE
抗c-MET纳米抗体偶联毒素Vc-MMAE共有三个主要流程，分别是还原、偶联和纯化。
(1)试剂配制
(2)反应流程
A.还原
固定还原体系、抗体质量，还原剂TCEP的投料当量为8eq，即抗体的物质的量的8倍，EDTA-2Na在还原体系中的终浓度为5mM。根据反应体系计算各成分投料体积，用His-HAc缓冲液补足至体系终体积。将混合好的溶液于37℃金属浴中还原4小时，转速为200rpm。
B.偶联
固定VcMMAE投料当量为9eq，根据VcMMAE储备液浓度计算投料体积，补足DMSO溶剂使其在体系中终浓度为10％，充分混合后缓慢加入还原后的溶液，于4℃金属浴中反应2小时，转速为200rpm。
C.终止
用L-Cysteine溶液终止反应，L-Cysteine投料当量为7eq，根据储备液浓度计算投料体积。
D.纯化
将得到的偶联后的溶液于10000g离心5min，弃去沉淀，重复2-3次，其后转移至10kDa 14mL超滤管中(例如上述产物总体积为40mL，则均分至4个10kDa 14mL超滤管中)，3500g/min离心15min浓缩样品，其后加入含10％ DMSO的His-HAc(30mM，pH 5.5)至14mL，3500g/min离心15min，离心4次。其后加入His-HAc(30mM，pH 5.5)至14mL，3500g/min离心15min，离心16次。取出超滤管中液体，并用1mL His-HAc(30mM，pH 5.5)润洗取出，与前面取出的液体合并，混匀，进行后续检测。
E.ADC浓度和DAR值检测，计算回收率。
检测结果如表4。
表4抗c-MET纳米抗体偶联MMAE产物的DAR值产物含量
| 样品名称 | DAR0 | DAR2 | DAR4 | DAR平均 |
| KY301-09 | 100％ | ND | ND | N/A |
| KY301-09-MMAE | 1.779％ | 6.371％ | 91.850％ | 3.80 |
| KY301-39 | 100％ | ND | ND | N/A |
| KY301-39-MMAE | 1.454％ | 4.607％ | 93.939％ | 3.85 |
DAR分布图见图7A-7D。
实施例10.抗c-MET纳米抗体偶联药物(c-MET ADC)体外细胞活性评价
测试c-MET ADC在多种肿瘤细胞中的体外杀伤能力，包括NCI-H1993(人非小细胞肺癌细胞)、HT29(人结肠癌细胞)、MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)、786-O、NCI-H1975、HCT116、MDA-MB-468(人乳腺癌细胞)、BXPC-3(人原位胰腺腺癌细胞)，细胞活性使用CellTiter-Glo2.0 Cell Viability Assay进行检测。
实验具体步骤：
1.实验前准备：提前准备好处于对数生长期的待测细胞。
2.细胞铺板(提前一天)：将待测细胞进行消化收集处理，并用完全培养基(RPMI1640+10％FBS+1％P/S)配制成细胞悬液(2,0000/mL)。在96孔黑色透明平底板中加入100μL/孔的细胞悬液。细胞板边缘孔弃用并加入100μL/孔的PBS。将铺好细胞的细胞板放入培养箱，过夜待细胞贴壁。
3.ADC准备：ADC用完全培养基稀释。首孔120μg/mL，再4倍梯度稀释，共6个浓度。
4.孵育ADC：在96孔细胞培养板中加入20μL/孔的ADC稀释液，于37℃，5％CO2培养6天。
5.检测：孵育结束后，向96孔细胞培养板中加入100μL/孔的CellTiter-Glo2.0Reagent检测液，静置15min，待细胞完全裂解。
6.读板：TECAN酶标仪检测待测发光值，根据发光值制作曲线，计算IC50。
实验结果如图8A-8H和表5所示：c-MET ADC在多种肿瘤细胞中均具有较强的体外杀伤能力，且呈剂量依赖关系。以上结果表明，c-MET ADC具有广泛的肿瘤杀伤能力且在低浓度下仍然有效。
表5c-MET ADC在不同肿瘤细胞中的IC50值
实施例11.抗c-MET纳米抗体偶联药物体对NCI-H1975和HCT116免疫缺陷小鼠移植瘤模型的药效学评价
1.c-MET ADC对NCG小鼠异种移植HCT116结肠癌肿瘤模型抗肿瘤药效检测
将表达c-MET的人结肠癌肿瘤细胞HCT116接种于雌性NCG小鼠(购自：江苏集萃药康生物科技股份有限公司，5-6周龄，18-21g，分为溶媒PBS组、KY301-09-MMAE、KY301-39-MMAE的低剂量组(2mg/kg)和高剂量组(6mg/kg)，每组5只。右侧前胁肋部皮下，肿瘤生长至100-150mm3左右时分组，尾静脉注射给予ADC或PBS，每周1次，持续2周。每周2次测量肿瘤体积及体重，记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积的变化与给药时间的关系。
肿瘤体积(V)计算为(长×宽2)/2。
肿瘤生长抑制率(TGI％)用以下公式计算：
肿瘤生长抑制率＝(1-药物处理组肿瘤体积变化/对照组肿瘤体积变化)×100％
试验结果如图9A所示，在Day16，2mg/kg剂量下，肿瘤生长得到明显抑制，KY301-09-MMAE和KY301-39-MMAE的抑瘤率在40％左右，加大剂量情况下(6mg/kg)，ADC对肿瘤体积的抑制作用进一步显著提高，抑瘤率达都在95％以上，整体抑瘤率见表6。上述结果表明，c-MET ADC可以有效地抑制肿瘤的生长，且呈剂量依赖性。小鼠体重变化如图9B所示，与PBS对照组相比，高剂量实验组小鼠体重无下降趋势，体重平稳且略有上升。
表6 c-MET ADC对HCT116异种移植的NCG小鼠的抑瘤率
2.c-MET ADC对NCG小鼠异种移植NCI-H1975肺腺癌肿瘤模型抗肿瘤药效检测
在15只雌性NCG小鼠(购自：江苏集萃药康生物科技股份有限公司，5-6周龄，18-21g)右侧前胁肋部皮下接种表达c-MET的人肺腺癌肿瘤细胞NCI-H1975，待肿瘤生长至100-150mm3左右时，将小鼠随机分成3组，每组5只。尾静脉注射PBS、KY301-09-MMAE、KY301-39-MMAE的低剂量组(2mg/kg)和高剂量组(6mg/kg)每周1次，持续2周。每周2次测量肿瘤体积及体重，记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积的变化与给药时间的关系。试验结果如图9C所示，在低剂量2mg/kg时两种c-MET ADC的肿瘤生长抑制率都在96％以上，整体抑瘤率见表7。上述结果表明，低剂量的c-MET ADC就能极显著地抑制肿瘤的生长。小鼠体重变化如图9D所示，与PBS对照组相比，高剂量实验组小鼠体重趋于平稳。
表7c-MET ADC对NCI-H1975异种移植的NCG小鼠的抑瘤率
表8纳米抗体可变区的氨基酸序列
表9纳米抗体的CDR序列
表10纳米抗体与FC融合序列
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种抗c-MET的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的VHH链的互补决定区CDR选自下组：
(1)SEQ ID NO:3所示的CDR1，
SEQ ID NO:4所示的CDR2，和
SEQ ID NO:5所示的CDR3；
和，
(2)SEQ ID NO:6所示的CDR1，
SEQ ID NO:7所示的CDR2，和
SEQ ID NO:8所示的CDR3。
2.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述抗c-MET纳米抗体的VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。
3.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述的纳米抗体还包含抗体的Fc段，并且所述纳米抗体的序列如SEQ ID NO:9或10所示。
4.一种纳米抗体融合蛋白，其特征在于，所述纳米抗体融合蛋白从N端到C端具有如式I所示的结构：
Z1-Z2-L-Z3 (式I)
式中，
Z1为如权利要求1所述的抗c-MET纳米抗体的VHH链；
Z2为免疫球蛋白的Fc段；
L为接头序列；
Z3为免疫调节分子部分。
5.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：权利要求1所述的抗c-MET的纳米抗体。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求5所述的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求6所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求5所述的多核苷酸。
8.一种产生抗c-MET纳米抗体的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在适合产生纳米抗体的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞，从而获得含有所述抗c-MET纳米抗体的培养物；以及
(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗c-MET纳米抗体；和
(c)任选地，纯化和/或修饰步骤(b)中获得的抗c-MET纳米抗体。
9.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：
(a)如权利要求1所述的抗c-MET纳米抗体；和
(b)所述纳米抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、或其组合。
10.如权利要求9所述的免疫偶联物，其特征在于，所述的药物为毒素，较佳地为MMAE。
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