CN116209469A - 癌症联合疗法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了使用抗凝血剂与B‑Raf抑制剂和/或丝裂原活化蛋白激酶(MEK)抑制剂联合疗法治疗癌症的方法。所述抗凝血剂可以是凝血酶的直接抑制剂或凝血酶的间接抑制剂，例如因子Xa、因子XIa或其他凝血因子的抑制剂。

Description

癌症联合疗法

关于联邦政府赞助的研究或发展的声明

本发明是在美国国立卫生研究院授予的合同HL057530的政府资助下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

背景技术

癌症是全球死亡的主要原因。黑色素瘤是最具侵袭性的皮肤癌。如果及早发现和治疗，几乎可以治愈，但如果未及早发现和治疗，癌症可能会发展并扩散到身体的其他部位，从而导致疾病难以治疗，甚至致命。虽然黑色素瘤不是最常见的皮肤癌，但因其死亡的人数最多。标准的治疗方法是通过手术切除肿瘤和周围外观正常的皮肤区域。有时手术后会进行其他治疗，例如免疫疗法、化疗、放疗或这些治疗的组合。化疗和免疫疗法也用于治疗晚期或复发性黑色素瘤。即使患者接受目前最好的治疗，死亡率和发病率仍然存在，患者将受益于黑色素瘤的新疗法。

骨桥蛋白(OPN)是一种广泛表达的非胶原基质细胞蛋白，是35个癌症微阵列数据集中20个5％表达率最高的基因之一(Atai等人(2011)《免疫学》132，39-48)。OPN与促进乳腺癌、肺癌和卵巢癌、胶质母细胞瘤(GBM)和恶性黑色素瘤的侵袭性和转移性进展有关(Chiodoni等人(2010)《癌症和转移评论》29，295-307；Kothari等人(2016)《临床医学杂志》5(4):39；Lamort等人(2019)《细胞》，8(8):815；McAllister等人(2008)，《细胞》133，994-1005；Shevde和Samant(2014)《国际基质生物学学会杂志》37，131-141；Zhao等人(2018)《细胞死亡及疾病》9，356)。OPN表达水平与肿瘤分期相关(Coppola等人(2004)《临床癌症研究》10，184-190)，并且原发性黑色素瘤中OPN表达增加预示了无复发生存期降低(Conway等人(2009)《临床癌症研究》15，6939-6946)。综上所述，OPN水平较高与癌症晚期和预后较差有关(Lamort等人，同上)。

除了作为骨基质成分外，OPN还由成纤维细胞、造血细胞和免疫细胞表达(Clemente等人(2016)《免疫学研究杂志》2016，7675437；Sodek等人(2000)《口腔生物医学与医学鉴定性评论》11，279-303)，其表达在癌症和感染等炎症状态下明显上调(Lund等人(2009)《细胞通讯与信号》3，311-322；Uede(2011)《国际病理学杂志》61，265-280)。释放后，OPN具有多效性细胞因子和趋化因子样功能(Uede，同上；Wang和Denhardt(2008)《细胞因子和生长因子综述》19，333-345)。它促进白细胞存活和分化，并调节白细胞粘附、迁移和贩运(Grassinger等人(2009)《血液》114，49-59；Lund等人(2009)《细胞通讯与信号》3，311-322；Sharif等人(2009)《关节炎和风湿病》60，2902-2912；Weiss等人(2001)《实验医学杂志》194，1219-1229)。它调节IL-17的产生，并已确定为一些免疫介导疾病的关键角色(Rittling和Singh(2015)《牙科研究杂志》94，1638-1645)。来自宿主和/或癌症的OPN可能影响细胞的增殖、存活、抗药性和干细胞样行为，并在肿瘤微环境中以自分泌和旁分泌的方式充当细胞串扰的重要介质(Lamort等人，同上；McAllister等人(2008)《细胞》133，994-1005；Shevde和Samant(2014)，同上)。B16鼠黑色素瘤细胞在缺乏OPN(OPN-KO，Spp^-/-)的小鼠体内受到抑制，表明肿瘤生长依赖于OPN的存在(Kale等人(2014)《致癌基因》33，2295-2306；Kale等人(2015)《致癌基因》34，5408-5410；Kumar等人(2013)《公共科学图书馆·综合》(PLoS One)8，e69116；Nemoto等人(2001)《骨与矿物研究杂志》16，652-659)。

目前仍需要更好的方法来治疗OPN相关的癌症，如黑色素瘤。

发明内容

本发明公开了使用抗凝血剂与B-Raf抑制剂和/或丝裂原活化蛋白激酶(MEK)抑制剂联合疗法治疗癌症的方法。所述抗凝血剂可以是凝血酶的直接抑制剂或凝血酶的间接抑制剂，例如因子Xa、因子XIa或其他凝血因子的抑制剂。

一方面，本发明提供了治疗骨桥蛋白(OPN)相关癌症的方法，所述方法包括向有需要受试者联合给予治疗有效用量的抗凝血剂与治疗有效剂量的B-Raf抑制剂和/或治疗有效用量的MEK抑制剂。

在某些实施例中，本发明所述方法用于治疗黑色素瘤。例如，黑色素瘤可以是B-RAF突变黑色素瘤，包括但不限于包含V600E突变或V600K突变的黑色素瘤。在某些实施例中，所述黑色素瘤是转移性黑素瘤。

在某些实施例中，所述抗凝血剂是直接凝血酶抑制剂。示例性凝血酶抑制剂包括但不限于达比加群酯、阿加曲班、伊诺加群、美拉加群、希美加群、水蛭素、比伐卢定、来匹卢定和地西卢定。

在其他实施例中，所述抗抗凝血剂是因子Xa抑制剂。示例性因子Xa抑制剂包括但不限于利伐沙班(拜瑞妥)、阿哌沙班(艾乐妥)、贝曲沙班、达瑞沙班(YM150)、依度沙班(里先安)、奥米沙班、利他沙班(TAK-442)、艾立沙班、安替斯塔辛、华法林、肝素和磺达肝癸钠。

在其他实施例中，所述抗凝血剂是因子XIa抑制剂。示例性因子XIa抑制剂包括但不限于BMS-262084((2S,3R)-1-[4-(叔丁基氨基甲酰基)哌嗪-1-羰基]-3-[3-(二氨基亚甲基氨基)丙基]-4-氮杂环丁酮-2-羧酸)、BMS-724296、BMS-654457(2-[3-[(2S,4R)-6-甲脒基-4-甲基-4-苯基-2,3-二氢-1H-喹啉-2-基]-5-(3-甲基丁酰氨基)苯基]-5-邻甲酰胺苯甲酸)、BMS-986177((9R,13S)-13-[4-[5-氯代-2-(4-氯三唑-1-基)苯基]-6-氧嘧啶-1-基]-3-(二氟甲基-9-甲基-3,4,7,15-四氮三环[12.3.1.02,6]十八-1(18),2(6),4,14,16-戊烷-8-酮)、EP-7041((2S,3R)-3-([2-氨基吡啶-4-基]甲基)-1-([{1R}-1-环己基乙基]氨基甲酰)-4-氮杂环丁酮-2-羧酸)、基于酮精氨酸的拟肽物、clavatadine抑制剂、芳基硼酸抑制剂和含环状精氨酸的酮噻唑拟肽物。

示例性B-Raf抑制剂包括但不限于达拉非尼、维莫非尼、索拉非尼、LGX818、GDC-0879和PLX-4720。

示例性MEK抑制剂包括但不限于曲美替尼、考比替尼、比尼替尼、司美替尼和PD-325901。

在某些实施例中，所述抗凝血剂、所述B-Raf抑制剂或所述MEK抑制剂根据每日给药方案给药或间歇给药。

在足以产生至少部分肿瘤反应时间段内，或更优选地在产生完全肿瘤反应的时间段内，向受试者给予多个周期的治疗。在某些实施例中，所述时间段至少为6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1.5年、2年或更长时间。

所述抗凝血剂或B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂和其他可选的抑制剂可通过任何适当的给药方式给药。在某些实施例中，所述抗凝血剂或所述B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂经口、静脉或局部给药。

在某些实施例中，所述方法进一步包括给予其他抗癌治疗剂。示例性抗癌治疗剂包括但不限于化疗剂、免疫治疗剂、生物治疗剂、激素治疗剂、促凋亡剂、血管生成抑制剂、光敏剂、放射增敏剂和放射性同位素。

附图说明

与附图一起阅读可更好地理解下述具体实施方式。需要强调的是，按照惯例，附图的各种特征并非按比例绘制。相反，为清楚起见，可以扩大或缩小各种特征的尺寸。附图包括以下各图。

图1A-1D：在侧腹模型中，OPN-KO和OPN-KI中的B16肿瘤生长速度比WT小鼠慢。图1A.凝血酶和羧肽酶N或B2的OPN切割及其功能调节模型。OPN-FL＝OPN-全长(SEQ ID NO:5)；OPN-R＝OPN-Arg(SEQ ID NO:6)；OPN-L＝OPN-Leu(SEQ ID NO:8)。DC＝树突细胞。图1B.通过SDS-PAGE分析大肠杆菌产生GST-OPN和GST-OPN_R153A的凝血酶治疗(10nM)的时间过程。FL＝全长，NTF＝N端片段，CTF＝C端片段(SEQ ID NO:7)。图1C.WT、OPN-KI和OPN-KO小鼠B16肿瘤体积增长的每日测定。图1D.处死后B16肿瘤重量。所有数据均显示为平均值±SEM。采用单因素方差分析，然后使用Tukey多项比较试验计算统计学意义。

图2A-2C：在转移模型中，B16肿瘤在OPN-KO和OPN-KI中的肿瘤负荷低于WT小鼠。图2A.肿瘤静脉注射后13天处死小鼠的肺部。图2B.可见转移性肺结节的数量。图2C.肺部黑色素含量。所有数据均显示为平均值±SEM。采用单因素方差分析，然后使用Tukey多项比较试验计算统计学意义。

图3A-3H：WT小鼠中的凝血酶抑制表型复制OPN-KI表型。图3A.每日测定植入WT小鼠侧腹的B16肿瘤生长，这些小鼠分别喂食含DE的饲料(开放符号)或对照饲料(封闭符号)。图3B.处死后OPN-KI小鼠中的B16肿瘤重量，这些小鼠分别喂食含DE的饲料(开放符号)或对照饲料(封闭符号)。图3C.处死后B16肿瘤体积。图3D.处死后B16肿瘤重量。图3E.根据处死时收集的血液测定aPTT。在图3A–3E中，数据显示为平均值±SEM。比较饲料中含有DE或不含有DE的每个基因型，通过学生t检验计算统计显著性。图3F.用DE治疗的WT小鼠中aPTT延长与肿瘤重量的相关性。图3G.在转移模型中，喂食DE或对照饲料的WT和OPN-KI小鼠接种后13天处死小鼠的肺部可见结节数。图3H.接种后13天肺黑色素含量。在图3G和3H中，数据显示为平均值±SEM。采用单因素方差分析，然后使用Tukey多项比较试验计算统计学意义。

图4A-4G：在WT小鼠的肿瘤和血浆中可以检测到OPN切割产物，及其对B16细胞的影响。在肿瘤植入前(图4A)、处死后(图4B)和肿瘤裂解物中(图4C)，在小鼠血浆中通过ELISA测定OPN-FL、OPN-R和OPN-L。确定OPN片段对B16细胞粘附(图4D)、生长(图4E)、迁移(图4F)和凋亡(图4G)的影响。数据显示为平均值±SEM。采用单因素方差分析，然后使用Tukey多项比较试验计算统计学意义。OPN-FL＝全长OPN，OPN-R＝OPN-Arg，OPN-L＝OPN-Leu，OPN-CTF＝OPN-C端片段。下标RAA表示在该OPN片段中用RAA替换RGD序列。

图5A-5D：OPN-KI和OPN-KO小鼠的B16肿瘤中含有更多的巨噬细胞。图5A.WT、OPN-KI和OPN-KO小鼠肿瘤切片的H&E染色。图5B.用抗F4/80抗体染色的WT、OPN-KI和OPN-KO小鼠肿瘤切片。图5C.用抗CD3抗体染色的WT、OPN-KI和OPN-KO小鼠肿瘤切片。图5D.通过流式细胞术测定OPN-KI、OPN-KO和WT小鼠肿瘤中存在的F4/80⁺细胞百分比。所有数据均显示为平均值±SEM。采用单因素方差分析，然后使用Tukey多项比较试验计算统计学意义。

图6A-6G：氯膦酸盐消耗巨噬细胞逆转OPN-KI小鼠的B16肿瘤抑制表型。图6A.WT小鼠用氯膦酸盐(开放符号)或对照(封闭符号)脂质体处理以及处死后测量的肿瘤体积。图6B.OPN-KI小鼠用氯膦酸盐或对照脂质体处理以及处死后测量的肿瘤体积。图6C.WT或OPN-KI小鼠用氯膦酸盐或对照脂质体处理以及处死后测量的肿瘤重量。图6D.WT或OPN-KI小鼠用氯膦酸盐或对照脂质体处理以及处死后测量的肿瘤重量。图6E.在接种B16细胞后14天，在用氯膦酸盐或对照脂质体处理的WT或OPN-KI小鼠骨髓中测定F4/80⁺细胞百分比。图6F.在用氯膦酸盐或对照脂质体处理的WT或OPN-KI小鼠肿瘤中测定F4/80⁺细胞百分比。图6G.在接种B16细胞后14天，在用氯膦酸盐或对照脂质体处理的WT或OPN-KI小鼠血液中测定F4/80⁺细胞百分比。所有数据均显示为平均值±SEM。采用单因素方差分析，然后使用Tukey多项比较试验计算统计学意义。

图7A-7D：免疫缺陷小鼠的B16生长不受OPN状态影响。图7A.在侧腹模型中，每日测定NOG-WT(蓝色圆圈)、NOG-OPN-KI(绿色三角形)和NOG-OPN-KO(红色方形)小鼠的B16肿瘤体积生长。图7B.在侧腹模型中，NOG-WT、NOG-OPN-KI和NOG-OPN-KO小鼠处死后的B16肿瘤重量。图7C.肿瘤静脉注射后13天处死小鼠肺中可见转移性肺结节的数量。图7D.肺黑色素含量。所有数据均显示为平均值±SEM。采用单因素方差分析，然后使用Tukey多项比较试验计算统计学意义。

图8A-8J：OPN-KI和OPN-KO小鼠中肿瘤的巨噬细胞与WT小鼠相比的变化。通过流式细胞术测定WT、OPN-KI和OPN-KO小鼠侧腹模型肿瘤样品中的浸润巨噬细胞(图8A)、M1巨噬细胞(图8B)、M2巨噬细胞(图8C和8D)、具有新表型的巨噬细胞(图8E)、中性粒细胞(图8F)、B细胞(图8G)和T细胞(图8H)。所有数据均显示为平均值±SEM。采用单因素方差分析，然后使用Tukey多项比较试验计算统计学意义。RAW细胞对OPN片段的反应产生PGE₂(图8I)。数据显示为平均值±SEM。采用单因素方差分析，然后使用Tukey事后检验计算统计学意义。**：p<0.01与OPN-R，***：p<0.001与OPN-R，****：p<0.001与OPN-R，+：p<0.05与OPN-R_RAA。下标RAA表示在该OPN片段中用RAA替换RGD序列。OPN的凝血酶+/-CPN/CPB2切割模型及其对巨噬细胞、肿瘤生长和转移的影响。(图8J)。切割OPN片段影响肿瘤中巨噬细胞的浸润和组成，在WT小鼠中维持促肿瘤的M2巨噬细胞(绿色细胞)。在OPN KO或抗凝血酶OPN-KI小鼠中不存在这些OPN片段，导致M2巨噬细胞减少，并由不同活化表型(红色细胞)的巨噬细胞取代，引起肿瘤抑制。

图9A-9I：WT、OPN-KI和OPN-KO小鼠血浆中的碱性磷酸酶(图9A)、ALT(图9B)、AST(图9C)、BUN(图9D)、BUN/肌酐比值(图9E)、胆固醇(图9F)、肌酸酐(图9G)、乳酸脱氢酶(LDH；图9H)和总胆红素(图9I)水平。采用方差分析，然后使用Bonferroni事后检验分析数据，显示组间无差异。

图10A-10H：WT、OPN-KI和OPN-KO小鼠的血细胞计数。WBC(图10A)、淋巴细胞(图10B)、单核细胞(图10C)、中性粒细胞(图10D)、血小板(图10E)、RBC(图10F)、网织红细胞(图10G)的数量和血红蛋白水平(Hgb：图10H)。采用方差分析，然后使用Bonferroni事后检验分析数据，显示组间无差异。

图11A-11D：接种不同数量细胞的雄性(实线符号)和雌性(开放符号)WT(蓝色圆圈)和OPN-KI(绿色三角形)小鼠中B16生长的比较。(图11A)2×10⁶个细胞、(图11B)1×10⁶个细胞、(图11C)0.5×10⁶个细胞、(图11D)雄性(实线符号)和雌性(开放符号)WT(蓝色圆圈)和OPN-KI(绿色三角形)小鼠处死后B16肿瘤的重量。采用方差分析，然后使用Tukey事后检验分析数据，显示组间无差异。

图12：与同种型对照相比，使用特异性抗体通过流式细胞术在B16和RAW细胞上表达α9β1和α4β1整合素。

图13A-13F：接种不同数量的NOG小鼠中B16肿瘤生长的比较。在分别接种0.5×10⁶、1×10⁶和2×10⁶个B16细胞后，NOG-WT(图13D)、NOG-OPN-KI(图13E)和NOG-OPN-KO(图13F)小鼠中B16肿瘤的生长率(图13A-13C；WT蓝色圆圈，NOG-OPN-KI绿色三角形，和NOG-OPN-KO红色方形)以及处死后B16肿瘤的重量。采用方差分析，然后使用Tukey事后检验分析数据，显示组间无差异。

图14A-14D：雄性和雌性NOG小鼠中B16生长的比较。雄性(封闭符号)或雌性(开放符号)NOG-WT(图14A)、NOG-OPN-KI(图14B)和NOG-OPN-KO(图14C)小鼠中B16肿瘤的生长率以及雄性(封闭符号)或雌性(开放符号)NOG-WT、NOG-OPN-KI和NOG-OPN-KO小鼠处死后B16肿瘤的重量(图14D)。

图15：RAW细胞与不同OPN片段的粘附情况。

图16：显示了靶向载体的构造。在WT线(顶线)中显示了小鼠5号染色体的Spp1基因序列(核苷酸104、834、137～104、900、066)。构建了两个质粒，一个具有5'同源臂(外显子1-4)和3'同源臂(外显子5和6)。外显子5含有氨基酸153的密码子，该密码子从Arg突变为Ala(R153A；红色箭头)。然后将这两个序列与两侧有LoxP位点(底线，靶向载体)的Neo盒一起插入到靶向载体LoxNwCD中。ATG：起始密码子；DTA：白喉毒素。

图17A-17B：图17A.显示引物位置的重组等位基因图。图17B.通过PCR筛选鉴定突变R153A基因(浅灰色字母)的纯合子小鼠。

图18A-18C：用于分析F4/80⁺细胞(图18A)、肿瘤浸润巨噬细胞(图18B)以及B和T细胞(图18C)的门控策略。

具体实施方式

本发明公开了使用抗凝血剂与B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂联合疗法治疗癌症的方法。所述抗凝血剂可以是凝血酶的直接抑制剂或凝血酶的间接抑制剂，例如因子Xa、因子XIa或其他凝血因子的抑制剂。

在描述使用抗凝血剂与B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂联合疗法治疗癌症的方法之前，应理解本发明不限于所述的特定方法或合成物，因此可能会有所不同。还应理解的是，本发明使用的术语仅用于描述特定实施例，而非加以限制，因为本发明的范围仅由所附权利要求进行限制。

在提供数值范围的情况下，应理解的是，除非上下文另有明确规定，否则本发明包括此范围上限和下限之间的每个居中值(近似到下限的十分之一)。在所述范围内的任何所述值或居中值与在所述范围内的任何其他所述值或居中值之间的每个较小的范围均包含在本发明中。这些较小范围的上限和下限可独立包括在该范围内或排除在该范围外，并且在较小范围内包括任何一个限值、两个限值或两个限值都不包括的每个范围也包含在本发明中，但受规定范围内任何具体排除限值的限制。如果规定范围包括一个或两个限值，本发明还包括排除这些任一或两个限值的范围。

除非另有说明，否则本发明所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域普通技术人员公知的相同含义。虽然在本发明的实践或测试可使用与潜在和优选方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但一些潜在和优选方法和材料描述如下。本发明提及的所有出版物通过引用成为本发明的一部分，以公开和描述与引用的出版物相关的方法和/或材料。应该理解的是，如果存在矛盾，本发明取代了已纳入出版物的任何公开内容。

在阅读本发明后，本领域的技术人员可明显看出，本文所述的各个实施例具有离散组成部分和特征，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，可与任何其他几个实施例的特征随意分离或组合。可按所列举事件的顺序或按逻辑上可行的任何其他顺序执行所列举的任何方法。

值得注意的是，在本发明和所附权利要求中，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一种(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”也包括复数指称对象。因此，例如，提及“一种抑制剂”包括多种此类抑制剂，提及“所述癌细胞”包括对本领域技术人员已知的一种或多种癌细胞物及其等同物，例如，癌细胞、肿瘤细胞、赘生性细胞和恶性细胞。

当提及多肽时，“分离”是指所提及的分子与自然界中发现该分子的整个生物体分离和离散，或者在基本上不存在相同类型的其他生物大分子的情况下存在。就多核苷酸而言，术语“分离”是指一个核酸分子完全或部分缺乏自然界中与之相关的序列；或一个序列，因为它存在于自然界中，但具有与之相关的异源序列；或从染色体上分离出来的分子。

本发明中的术语“B-Raf抑制剂”是指抑制B-Raf活性和/或B-Raf表达的任何分子(例如，小分子抑制剂、蛋白、肽、拟肽、核酸、寡核苷酸、抗体或其片段)。抑制可以是完全抑制或部分抑制(即，抑制剂阻断了所有活性、某些活性或大多数活性)。B-Raf抑制剂包括但不限于抗B-Raf抗体、B-Raf丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制剂、B-Raf表达的反义抑制剂、抗B-Raf核酶、抗B-Raf siRNA和内源性B-Raf抑制剂。示例性B-Raf抑制剂包括但不限于达拉非尼、维莫非尼、索拉非尼、LGX818、GDC-0879和PLX-4720。

本发明中的术语“MEK抑制剂”是指抑制MEK活性和/或MEK表达的任何分子(例如，小分子抑制剂、蛋白、肽、拟肽、核酸、寡核苷酸、抗体或其片段)。抑制可以是完全抑制或部分抑制(即，抑制剂阻断了所有活性、某些活性或大多数活性)。MEK抑制剂包括但不限于抗MEK抗体、MEK丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制剂、MEK表达的反义抑制剂、抗MEK核酶、抗MEKsiRNA和内源性MEK抑制剂。示例性MEK抑制剂包括但不限于曲美替尼、考比替尼、比尼替尼、司美替尼和PD-325901。

本发明中的术语“凝血酶抑制剂”是指抑制凝血酶活性和/或凝血酶表达的任何分子(例如，小分子抑制剂、蛋白、肽、拟肽、核酸、寡核苷酸、抗体或其片段)。抑制可以是完全抑制或部分抑制(即，抑制剂阻断了所有活性、某些活性或大多数活性)。凝血酶抑制剂包括但不限于抗凝血酶抗体、凝血酶表达的反义抑制剂、抗凝血酶核酶、抗凝血酶siRNA和内源性凝血酶抑制剂。示例性凝血酶抑制剂包括但不限于达比加群酯、阿加曲班、伊诺加群、美拉加群、希美加群、水蛭素、比伐卢定、来匹卢定和地西卢定。

本发明中的术语“因子Xa抑制剂”是指抑制因子Xa活性和/或因子Xa表达的任何分子(例如，小分子抑制剂、蛋白、肽、拟肽、核酸、寡核苷酸、抗体或其片段)。抑制可以是完全抑制或部分抑制(即，抑制剂阻断了所有活性、某些活性或大多数活性)。因子Xa抑制剂包括但不限于抗因子Xa抗体、因子Xa表达的反义抑制剂、抗因子Xa核酶、抗因子Xa siRNA和内源性因子Xa抑制剂。示例性因子Xa剂抑制包括但不限于利伐沙班(拜瑞妥)、阿哌沙班(艾乐妥)、贝曲沙班、达瑞沙班(YM150)、依度沙班(里先安)、奥米沙班、利他沙班(TAK-442)、艾立沙班、安替斯塔辛、华法林、肝素和磺达肝癸钠。

本发明中的术语“因子XIa抑制剂”是指抑制因子XIa活性和/或因子XIa表达的任何分子(例如，小分子抑制剂、蛋白、肽、拟肽、核酸、寡核苷酸、抗体或其片段)。抑制可以是完全抑制或部分抑制(即，抑制剂阻断了所有活性、某些活性或大多数活性)。因子XIa抑制剂包括但不限于抗因子XIa抗体、因子XIa表达的反义抑制剂、抗因子XIa核酶、抗因子XIasiRNA和内源性因子XIa抑制剂。示例性因子XIa抑制剂包括但不限于BMS-262084((2S,3R)-1-[4-(叔丁基氨基甲酰基)哌嗪-1-羰基]-3-[3-(二氨基亚甲基氨基)丙基]-4-氮杂环丁酮-2-羧酸)、BMS-724296、BMS-654457(2-[3-[(2S,4R)-6-甲脒基-4-甲基-4-苯基-2,3-二氢-1H-喹啉-2-基]-5-(3-甲基丁酰氨基)苯基]-5-邻甲酰胺苯甲酸)、BMS-986177((9R,13S)-13-[4-[5-氯代-2-(4-氯三唑-1-基)苯基]-6-氧嘧啶-1-基]-3-(二氟甲基-9-甲基-3,4,7,15-四氮三环[12.3.1.02,6]十八-1(18),2(6),4,14,16-戊烷-8-酮)、EP-7041((2S,3R)-3-([2-氨基吡啶-4-基]甲基)-1-([{1R}-1-环己基乙基]氨基甲酰)-4-氮杂环丁酮-2-羧酸)、基于酮精氨酸的拟肽物抑制剂、clavatadine、芳基硼酸抑制剂和含环状精氨酸的酮噻唑拟肽物抑制剂。有关因子XIa抑制剂的其他说明，请参见Rami等人(2016)《治疗专利专家观点》26(3):323-345、Quan等人(2018)《医药化学杂志》61，17:7425-7447、Wong等人(2021)《血栓形成和止血的研究与实践》5(4):e12524、Wong等人(2015)《血栓与溶栓杂志》，40(4):416-23以及Gómez-Outes等人(2011)《心血管疾病的治疗进展》5(1):33-59；这些出版物通过本发明的引用，成为本发明的一部分。

本发明中的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”“治疗(treat)”等通常是指达到预期的药理学和/或生理学效果。效果可以具有预防性，即完全或部分预防疾病或症状，和/或具有治疗性，即部分或完全稳定或治愈疾病和/或疾病产生的副作用。术语“治疗”包含对哺乳动物(特别是人类)疾病的任何治疗，包括：(a)防止疾病和/或症状发生在可能易患疾病或症状但尚未确诊患有该疾病或症状的受试者中；(b)抑制疾病和/或症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病症状，即使疾病和/或症状消退。需要治疗的受试者包括已经患有疾病的受试者(例如，癌症受试者)以及需要预防的受试者(例如，由于患癌症的遗传倾向而增加癌症易感性的受试者，怀疑在环境中接触致癌物的受试者，有复发风险的受试者等)。

术语“肿瘤”、“癌症”和“瘤形成”可交替使用，是指生长、增殖或存活大于正常对应细胞的生长、增殖或存活的细胞或细胞群，例如，细胞增殖、过度增殖或分化障碍。通常，生长不受控制。术语“恶性肿瘤”是指对附近组织的侵占。术语“转移”或继发性、复发性或复发肿瘤、癌症或瘤形成是指肿瘤、癌症或瘤形成向受试者体内其他部位、位置或区域的扩散或播散，其中这些部位、位置或区域与原发性肿瘤或癌症不同。瘤形成、肿瘤和癌症包括良性、恶性、转移性和非转移性类型，包括任何阶段(I、II、III、IV或V)或分级(G1、G2、G3等)的瘤形成、肿瘤或癌症，或正在发展、恶化、稳定或缓解的瘤形成、肿瘤、癌症或转移。具体地，术语“肿瘤”、“癌症”和“瘤形成”包括癌，例如鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞癌、未分化癌、大细胞癌和小细胞癌，包括癌症，例如但不限于头颈部癌症、皮肤癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、周围神经瘤、胶质母细胞瘤、肾上腺皮质癌、艾滋病相关淋巴瘤、肛门癌、膀胱癌、脑膜瘤、胶质瘤、星形细胞瘤、宫颈癌、慢性骨髓增生性病变、结肠癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因氏肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道类肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、下咽癌、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、喉癌、白血病、唇癌、口腔癌、肝癌、男性乳腺癌、恶性间皮细胞瘤、成神经管细胞瘤、梅克尔细胞癌、转移性鳞状颈细胞癌、多发性骨髓瘤和其他浆细胞肿瘤、蕈样真菌病和塞扎里综合征、骨髓增生异常综合征、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、口咽癌、骨癌(其中包括骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤)、鼻窦癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜胚细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、小肠癌、软组织肉瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、松果体母细胞瘤、睾丸癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、威尔姆氏瘤和其他儿童肾脏肿瘤。

具体地，术语“黑色素瘤”包括任何阶段的任何类型的黑色素瘤，包括转移性黑色素瘤。例如，术语“黑色素瘤”包括但不限于恶性雀斑样痣、恶性雀斑样黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤、粘膜黑色素瘤、结节性黑色素瘤、息肉样黑色素瘤和促纤维增生性黑色素瘤。黑色素瘤可能包括基因DNA序列的变化(突变)，这意味着黑色素瘤细胞编码的蛋白质与患者身体其他部位的蛋白质不同。例如，参与向细胞发出生长信号的蛋白质B-RAF可能会发生突变。因此，该术语还包括B-RAF突变的黑色素瘤，包括但不限于包含V600E突变或V600K突变的黑色素瘤。

本发明中的术语“OPN相关癌症”是指任何与骨桥蛋白超表达或骨桥蛋白活性过度或依赖于骨桥蛋白切割片段相关的任何癌症。OPN相关癌症包括但不限于黑色素瘤、乳腺癌、肺癌(例如肺腺癌、肺鳞状细胞癌、非小细胞肺癌)、卵巢癌、胶质母细胞瘤、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、膀胱癌、宫颈癌、食管癌、胃癌、头颈癌、肾癌(例如肾脏癌、肾乳头状细胞癌)、肝癌、胰腺癌(例如胰腺导管癌)、前列腺癌、直肠癌(例如结直肠腺癌)、肉瘤、睾丸生殖细胞癌、胸腺瘤、甲状腺癌和子宫癌。

“抗肿瘤活性”是指细胞增殖速率降低，因此现有肿瘤或治疗期间出现的肿瘤的生长速率降低，和/或破坏现有瘤形成(肿瘤)细胞或新形成的赘生性细胞，从而在治疗期间减小肿瘤的整体大小。这种活性可以使用动物模型评估。

抗凝血剂(例如凝血酶、因子Xa、因子XIa或其他凝结因子抑制剂)、B-Raf抑制剂或MEK抑制剂的“治疗有效剂量或用量”是指当抗凝血剂与B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂联合给药时，给药量会带来积极的治疗反应，例如抗肿瘤活性，如本发明所述。

本发明中的术语“肿瘤反应”是指所有可测量病变的减少或消除。肿瘤反应标准基于WHO报告标准[WHO抵消出版物，48-世界卫生组织，瑞士日内瓦，(1979)]。理想情况下，应在每次评估时测量所有单维或双维可测量的病变。当任何器官出现多个病变时，可能无法进行此类测量，在这种情况下，应选择多达6个代表性病变(如有)。

本发明中的术语“完全缓解”(CR)是指通过间隔至少4周的2次评估确定所有临床上可检测到的恶性疾病完全消失。

本发明中的术语“部分缓解”(PR)是指所有可测量疾病的最长垂直直径的乘积总和较基线减少50％或更多，而可评价疾病没有进展，并且通过间隔至少4周的至少2次连续评估确定没有发现新病变的证据。评估应显示溶解性病变的大小部分减小、溶解性病变再钙化或原始细胞病变密度降低。

“基本纯化”通常是指分离物质(抗体、化合物、药物、多核苷酸、蛋白质、多肽)，使该物质占其所在样品的多数百分比。通常在样品中，基本纯化成分包括样品的50％，优选80％-85％，更优选90-95％。纯化目标物质的技术在本领域众所周知，包括(例如)离子交换色谱法、亲和色谱法和根据密度的沉降。

术语“接受者”、“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本发明中可交替使用，是指任何需要诊断、治疗或疗法的哺乳动物受试者，特别是人类。就治疗而言，“哺乳动物”是指任何归类为哺乳动物的动物，包括人类、家畜和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，例如狗、马、猫、牛、绵羊、山羊、猪等。优选地，哺乳动物为人。

“可药用赋形剂或载体”是指可选择性包括在本发明的合成物中并且不会对患者造成显著不良毒理效应的赋形剂。

“可药用盐”包括但不限于氨基酸盐、用无机酸制备的盐(例如，氯化物、硫酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、溴酸盐和硝酸盐)，或由上述任何一种相应的无机酸形式制备的盐(例如，盐酸盐等)，或用有机酸制备的盐(例如，苹果酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、乙基琥珀酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、苯酸盐、抗坏血酸盐、对甲苯磺酰胺、棕榈酸盐、水杨酸盐和硬脂酸盐，以及丙酸酯月桂硫酸酯、葡庚糖酸盐和乳糖醛酸盐)。同样，含有可药用阳离子的盐包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂和铵(包括取代铵)。

本发明所讨论的出版物仅供在本发明申请提交日期之前公开之用。本发明的任何内容均不应解释为承认由于先前的发明，本发明无权先于此出版物发表。此外，提供的出版日期可能与需要单独确认的实际出版日期不同。

治疗癌症的联合疗法

本发明基于发现治疗OPN相关癌症的新型治疗方法。所述方法利用抗凝血剂(即直接或间接凝血酶抑制剂)与B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂的联合给药。在不受特定理论约束的情况下，OPN与促进多种类型癌症的侵袭性和转移性进展有关。OPN的超表达与癌症进展和预后不良有关。凝血酶在体内切割OPN以调节OPN功能。OPN的凝血酶切割片段对癌症生物学具有显著的病理生理影响，对肿瘤细胞粘附、趋化性和细胞凋亡以及宿主抗肿瘤免疫反应产生影响(见示例1)。OPN切割片段水平升高会促进肿瘤生长和转移。因此，抗凝血剂(即直接或间接凝血酶抑制剂)可用于治疗OPN相关癌症。

目前，使用B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂治疗一些OPN相关癌症。在OPN相关癌症治疗中加入直接或间接凝血酶抑制剂可能会改善预后。因此，抗凝血剂与B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂的联合疗法可用于治疗OPN失调的各种癌症。

可用于治疗OPN相关癌症的抗凝血剂示例包括但不限于凝血酶抑制剂，包括但不限于达比加群酯、阿加曲班、伊诺加群、美拉加群、希美加群、水蛭素、比伐卢定、来匹卢定和地西卢定；因子Xa抑制剂包括但不限于利伐沙班(拜瑞妥)、阿哌沙班(艾乐妥)、贝曲沙班、达瑞沙班(YM150)、依度沙班(里先安)、奥米沙班、利他沙班(TAK-442)、艾立沙班、安替斯塔辛、华法林、肝素和磺达肝癸钠；因子XIa抑制剂包括但不限于BMS-262084((2S,3R)-1-[4-(叔丁基氨基甲酰基)哌嗪-1-羰基]-3-[3-(二氨基亚甲基氨基)丙基]-4-氮杂环丁酮-2-羧酸)、BMS-724296、BMS-654457(2-[3-[(2S,4R)-6-甲脒基-4-甲基-4-苯基-2,3-二氢-1H-喹啉-2-基]-5-(3-甲基丁酰氨基)苯基]-5-邻甲酰胺苯甲酸)、BMS-986177((9R,13S)-13-[4-[5-氯代-2-(4-氯三唑-1-基)苯基]-6-氧嘧啶-1-基]-3-(二氟甲基-9-甲基-3,4,7,15-四氮三环[12.3.1.02,6]十八-1(18),2(6),4,14,16-戊烷-8-酮)、EP-7041((2S,3R)-3-([2-氨基吡啶-4-基]甲基)-1-([{1R}-1-环己基乙基]氨基甲酰)-4-氮杂环丁酮-2-羧酸)、基于酮精氨酸的拟肽物抑制剂、clavatadine抑制剂、芳基硼酸抑制剂和含环状精氨酸的酮噻唑拟肽物抑制剂。

可用于治疗OPN相关癌症的B-Raf抑制剂示例包括但不限于达拉非尼、维莫非尼、索拉非尼、LGX818、GDC-0879和PLX-4720。

可用于治疗OPN相关癌症的MEK抑制剂示例包括但不限于曲美替尼、考比替尼、比尼替尼、司美替尼和PD-325901。

虽然本发明的方法是针对现有肿瘤的治疗，但人们认识到，这些方法可能有助于预防在治疗和转移期间产生的进一步肿瘤生长。

药物合成物

抗凝血剂、B-Raf抑制剂和MEK抑制剂可配制成可选包含一种或多种可药用赋形剂的药物合成物。示例性赋形剂包括但不限于碳水化合物、无机盐、抗菌剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲液、酸、碱及其组合。适用于可注射合成物的赋形剂包括水、醇、多元醇、丙三醇、植物油、磷脂和表面活性剂。碳水化合物，如糖、衍生糖，如醛醇、醛酸、酯化糖和/或糖聚合物，可作为赋形剂存在。特定碳水化合物赋形剂包括(例如)单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖类，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醛，如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨醇(葡萄糖醇)、吡喃糖山梨糖醇、肌醇等。赋形剂还可以包括无机盐或缓冲液，如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠及其组合。

合成物还可以包括用于预防或阻止微生物生长的抗微生物剂。适用于本发明的抗微生物剂的非限制性示例包括苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞及其组合。

合成物中也可能存在抗氧化剂。抗氧化剂用于防止氧化，从而防止抗凝血剂、B-Raf抑制剂和MEK抑制剂或制剂的其他成分的退化。适用于本发明的抗氧化剂包括(例如)抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基苯甲醚、丁基羟基甲苯、次磷酸、硫代甘油、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠及其组合。

表面活性剂可以作为赋形剂存在。示例性表面活性剂包括：聚山梨醇，如“吐温20”和“吐温80”，普朗尼克类，如F68和F88(BASF，新泽西州芒特奥利夫)；脱水山梨糖醇酯；脂质，如磷脂质，如卵磷脂和其他磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺(虽然优选不是脂质体形式)、脂肪酸和脂肪酯；类固醇，如胆固醇；螯合剂，如EDTA；锌等合适的阳离子。

酸或碱可以作为赋形剂存在于合成物中。可使用的非限制性酸的示例包括选自以下的酸：盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸及其组合。适用碱的示例包括但不限于选自以下的碱：氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、乙酸铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、富美酸钾及其组合。

合成物中抗凝血剂、B-Raf抑制剂或MEK抑制剂的量(例如，包含在药物递送系统中时)将取决于许多因素，但当合成物为单位剂型或容器(例如，小瓶)时，最佳剂量为治疗有效剂量。治疗有效剂量可以通过重复给予增加量的合成物在实验中确定，以确定产生临床所需终点的用量。

合成物中任何单独赋形剂的用量将根据赋形剂的性质和功能以及合成物的特殊需求而变化。通常，任何单独赋形剂的最佳用量通过常规实验确定，即通过制备含有不同赋形剂用量的合成物(范围从低到高)，检查稳定性和其他参数，然后确定达到最佳性能且不会产生明显不良反应的范围。然而，一般来说，赋形剂将以约1％至约99％(按重量计)的用量存在于合成物中，优选地，约5％至约98％(按重量计)，更优选地，约15％至约95％(按重量计)的赋形剂，最优选的浓度低于30％(按重量计)。上述药用赋形剂和其他赋形剂的说明见《雷明顿：药学科学与实践》，第19版，Williams&Williams，(1995)，《医生桌上参考手册》，第52版，医疗经济，新泽西州蒙特韦尔，(1998)，以及Kibbe,A.H.，《药用辅料手册》，第3版，美国药学协会，华盛顿特区，2000。

合成物包括所有类型的制剂，特别是适合注射的制剂，例如，在使用前用溶剂复溶的粉末或冻干粉，以及可用于注射的溶液或悬浮液，在使用前与载体结合的干燥不溶性合成物，以及在给药前用于稀释的乳剂和液体浓缩物。在注射前复溶固体合成物的适当稀释剂示例包括注射用抑菌水、5％葡萄糖水、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、生理盐水、无菌水、去离子水及其组合。关于液体药物合成物，预想了溶液和悬浮液。其他优选合成物包括经口腔、眼部和局部递送的合成物。

本发明所述的药物制剂也可以装在注射器、植入装置等中，具体取决于预期的递送模式和用途。优选地，本发明所述包含抗凝血剂、B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂的合成物为单位剂型，即以预测量或预包装形式包装适合单剂量的偶联物或合成物用量。

本发明的合成物可选包括一种或多种其他药剂，例如，用于治疗癌症的其他药物或用于治疗受试者的症状或疾病的其他药物。复合制剂可以包括抗凝血剂、B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂，以及一种或多种用于治疗癌症的其他药物，例如但不限于化疗剂、免疫治疗剂、生物治疗剂、促凋亡剂、血管生成抑制剂、光活性剂、放射增敏药物和放射性同位素。或者，此类药剂可以包含在独立合成物中，与含有抗凝血剂、B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂的合成物分开，并且与包含抗凝血剂、B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂的合成物同时、之前或之后共同给药。

给药

将给予至少一个治疗有效剂量的抗凝血剂与B-Raf抑制剂和/或丝裂原活化蛋白激酶(MEK)抑制剂。每种药剂的“治疗有效剂量或用量”是指当与其他药剂联合给药时，在治疗个体癌症方面，特别是OPN相关癌症方面，产生积极治疗反应。

OPN相关癌症包括但不限于黑色素瘤、乳腺癌、肺癌(例如肺腺癌、肺鳞状细胞癌、非小细胞肺癌)、卵巢癌、胶质母细胞瘤、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、膀胱癌、宫颈癌、食管癌、胃癌、头颈癌、肾癌(例如肾脏癌、肾乳头状细胞癌)、肝癌、胰腺癌(例如胰腺导管癌)、前列腺癌、直肠癌(例如结直肠腺癌)、肉瘤、睾丸生殖细胞癌、胸腺瘤、甲状腺癌和子宫癌。

如本发明所述，特别相关的是提供抗肿瘤作用的药剂用量。“积极治疗反应”是指接受本发明联合治疗的个体表现出正在接受治疗的个体的癌症的一种或多种症状的改善。因此，例如，“积极治疗反应”是与联合疗法相关的疾病的改善，和/或与联合疗法相关的一种或多种疾病症状的改善。因此，例如，积极治疗反应是指疾病的以下一种或多种改善：(1)肿瘤大小缩小；(2)癌细胞数量减少；(3)抑制(即在一定程度上减缓，优选停止)肿瘤生长；(4)抑制(即在一定程度上减缓，优选停止)癌细胞向外周器官浸润；(5)抑制(即在一定程度上减缓，优选停止)肿瘤转移；(6)与癌症相关的一种或多种症状在一定程度上得到缓解。此类治疗反应可根据改善的程度进一步表征。因此，例如，改善可以表征为完全缓解。“完全缓解”是指通过体检、实验室、核和影像学研究(即CT(计算机断层扫描)和/或MRI(磁共振成像))以及其他非侵入性程序对入选研究时的所有初始异常或阳性部位进行重复检查，确认所有可测量或可评价疾病的所有症状和体征消失。或者，疾病的改善可归类为部分缓解。“部分缓解”是指所有可测量病变的垂直直径的乘积总和较治疗前相比减少50％以上(对于仅具有可评价缓解的患者，部分缓解不适用)。

在某些实施例中，每种抗凝血剂与B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂的多个治疗有效剂量将根据每日给药方案给药或间歇给药。例如，治疗有效剂量的给药频率可以是每周一天、每周两天、每周三天、每周四天或每周五天等。“间歇”给药是指治疗有效剂量的给药频率可以是(例如)每隔一天、每隔两天、每隔三天等。例如，在某些实施例中，抗凝血剂与B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂的给药频率为每周两次或每周三次，持续较长一段时间，如1、2、3、4、5、6、7、8……10……15……24周等。“每周两次(twice-weekly)”或“每周两次(twotimes per week)”是指在7天内向受试者给予相关药剂的两个治疗有效剂量，从给药第一周的第1天起，剂量之间的时间间隔最短为72小时，最长为96小时。“每周三次(thriceweekly)”或“每周三次(three times per week)”是指在7天向受试者给予三个治疗有效剂量，剂量之间的间隔时间最短为48小时，最长为72小时。在本发明中，这种类型的剂量被称为“间歇”疗法。根据本发明所述方法，受试者可以接受一个或多个周期的间歇疗法(即，每周两次或每周三次给予治疗有效剂量)，直至达到预期的治疗反应。所述药剂可通过下文所述的任何可接受给药途径给药。

抗凝剂可以在B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂之前、同时或之后给药。如果与B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂同时给药，则抗凝血剂可以在相同或不同合成物中给药。因此，三种药剂或三种药剂中的两种可通过同时疗法向个体给药。“同时疗法”是指向人类受试者给药，使这些物质组合在接受治疗的受试者中产生治疗效果。例如，根据特定给药方案，可以通过给予至少一个治疗有效剂量的药物合成物(包含抗凝血剂)和至少一个治疗有效剂量的药物合成物(包含至少一种B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂)来实现同时疗法。同样，B-Raf抑制剂或MEK抑制剂可以在含有抗凝血剂的相同药物合成物中给药或在单独药物合成物中给药。所述单独药物合成物可以同时(即同一时间)或不同时(即按顺序，在同一天或在不同天)给药，只要这些物质组合在接受治疗的受试者中产生治疗效果即可。

在某些实施例中，在B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂给药之前，短暂进行抗凝血剂给药，并在使用B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂治疗停用后持续一段短暂时间，以确保在使用B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂治疗期间，受试者的抗凝血水平足够。例如，所述抗凝血剂可以在第一剂B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂前一周开始给药，并在向受试者进行最后一剂B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂给药后持续一周。

在其他实施例中，包含药剂(如抗凝血剂、B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂)的药物合成物是缓释制剂，或使用缓释装置给药的制剂。此类装置在本领域众所周知，并且包括(例如)透皮贴剂和微型植入泵，这些装置可以随着时间的推移以连续、稳态的方式以各种剂量提供药物递送，实现非缓释药物组合物的缓释效果。

给药前的药物制剂剂型可以是液体溶液或悬浮液，但也可以采取另一种剂型，例如糖浆、乳脂、软膏、片剂、胶囊、粉末、凝胶、基质、栓剂等。根据本领域已知的任何医学上可接受的方法，包含抗凝血剂、B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂的药物合成物可以使用相同或不同的给药途径给药。合适的给药途径包括胃肠外给药，例如皮下(SC)、腹膜内(IP)、肌内(IM)、静脉(IV)或输注、口腔和肺、鼻、局部、经皮和栓剂。当合成物通过肺部递送给药时，调整治疗有效剂量，使体内循环血液中的药剂(如抗凝血剂与B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂)的可溶性水平相当于通过胃肠外给药(例如，SC、IP、IM或IV)的治疗有效剂量获得的水平。在某些实施例中，包含抗凝血剂与B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂的药物合成物通过IM或SC注射给药，特别是通过IM或SC注射局部给药到癌症治疗方案中使用的治疗剂或药剂给药的区域。在某些情况下，可将合成物直接给药到肿瘤或癌细胞中。可通过局部导管灌注或病灶内直接注射给药。在黑色素瘤的情况下，抗凝血剂与B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂可以局部给药，例如，贴剂、凝胶或软膏。

在另一实施例中，包含抗凝血剂、B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂的药物合成物预防性给药，例如，防止癌症进展或组织中转移。这种预防性使用对于因环境接触致癌物或患癌症的遗传倾向而有患癌症高风险的受试者具有特殊价值。

影响各种给药合成物的相应用量的因素包括但不限于给药模式、给药频率(即每日或间歇给药，如每周两次或三次)、接受治疗的特定疾病、疾病的严重程度、病史、个体是否正在接受另一种治疗剂的同时治疗以及接受治疗的个体的年龄、身高、体重、健康状况和身体状况。一般来说，随着接受治疗的受试者体重的增加，优选较高剂量的药物。

在某些实施例中，治疗癌症患者的方法包括使用抗凝血剂联合B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂的治疗周期，随后进入休息期，在休息期不进行抗凝血剂、B-Raf抑制剂或MEK抑制剂给药，以便患者可以从药剂的不良作用中“恢复”。多剂量的抗凝血剂联合B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂可以根据每日给药方案给药或间歇给药，随后进入休息期。例如，给药方案之间的休息期可以是1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周或更长时间或两者之间的任何时间。此后，可以给予新的给药方案以达到预期的组合效果。

如果按照上述给药方案接受治疗的受试者表现出部分缓解，或在长时间缓解后复发，则可能需要后续疗程的同步治疗以实现疾病的完全缓解。因此，在第一个治疗期的休息期后，受试者可以接受一个或多个额外的治疗期，包括抗凝血疗法联合B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂。治疗期之间的这段休息期在本发明中称为停药期。应认识到，停药时间的长短取决于与这些治疗剂同时治疗的任何先前治疗期所达到的肿瘤反应程度(即完全缓解与部分缓解)。

此外，用抗凝血剂与B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂治疗可以与任何其他癌症药物治疗联合使用，例如但不限于手术、放疗、化疗、激素治疗、免疫疗法或分子靶向或生物治疗。可采用这些其他药物治疗方法与抗凝血剂联合B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂的任何组合有效治疗受试者的癌症。

例如，使用抗凝血剂联合B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂的治疗可与使用一种或多种化疗剂的化疗相结合，例如但不限于必除癌、阿霉素、氟尿嘧啶、安吖啶、天冬酰胺酶、蒽环类药物、阿扎胞苷、咪唑硫嘌呤、必可舒、博莱霉素、白消安、争光霉素、伊立替康、喜树碱、卡铂、卡莫司汀、柔红霉素、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、更生霉素、阿糖孢苷、赛德萨、环磷酰胺、环磷酰胺、达卡巴嗪、达克霉素、多西他赛、多柔比星、道诺霉素、表柔比星、门冬酰胺酶、表阿霉素、依托泊苷、氟达拉滨、氟二氧嘧啶、氟达拉滨、吉西他滨、健择、拓扑替康、羟脲、羟基脲、去甲氧柔红霉素、去甲氧正定霉素、异环磷酰胺、异环磷酰胺、伊立替康、兰快舒、瘤可宁、克拉立平、甲基苄肼、氮芥、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、光神霉素、突变霉素、马勒兰、阿托胞苷、诺维本、喷司他丁、诺消灵、长春新碱、奥沙利铂、紫杉醇、伯尔定、喷司他丁、顺氯氨铂、光辉霉素、丙卡巴肼、巯基嘌呤、雷替曲塞、泰素帝、紫杉酚、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓优得、托泊替康、戊柔比星、长春花碱、依托泊甙、长春碱、长春地辛、长春酸碱、长春瑞滨、VP-16和威猛。

在另一示例中，使用抗凝血剂联合B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂的治疗可与使用一种或多种分子抑制剂或单克隆抗体的靶向治疗相结合，例如但不限于酪氨酸激酶抑制剂，如甲磺酸伊马替尼(格列卫，又称STI-571)、吉非替尼(易瑞沙，又称ZD1839)、埃罗替尼(作为埃罗替尼销售)、索拉非尼(多吉美)、舒尼替尼(索坦)、达沙替尼(施达赛)、拉帕替尼(泰立沙)、尼罗替尼(达希纳)和硼替佐米(万珂)；Janus激酶抑制剂，如托法替尼；ALK抑制剂，如克唑替尼；Bcl-2抑制剂，如奥巴克拉和棉酚；PARP抑制剂，如尼拉帕利和奥拉帕利；PI3K抑制剂，如哌立福辛；VEGF受体2抑制剂，如阿帕替尼；AN-152(AEZS-108)阿霉素与[D-Lys(6)]-LHRH相连；CDK抑制剂，如PD-0332991和LEE011；Hsp90抑制剂，如盐霉素；小分子药物偶联物，如文他福利特；丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，如替西罗莫司(驮瑞塞尔)、依维莫司(飞尼妥)、维莫非尼(佐博伏)、曲美替尼(迈吉宁)和达拉菲尼(泰菲乐)；C试剂盒抑制剂，如伊马替尼、达沙替尼和尼罗替尼；NRAS抑制剂，如比美替尼；以及单克隆抗体，如利妥昔单抗(商品名为美罗华(MabThera或Rituxan))、曲妥单抗(赫塞汀)、阿仑单抗、西妥昔单抗(商品名为爱必妥)、帕尼单抗、贝伐单抗(商品名为安维汀)和伊匹单抗(易普利姆玛)。

在另一示例中，使用抗凝血剂联合B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂的治疗可与免疫疗法相结合，包括但不限于使用以下任何一种方式：癌症疫苗(例如，E75 HER2衍生多肽疫苗、nelipepimut-S(NeuVax)、Sipuleucel-T)、抗体治疗(例如，曲妥单抗、Ado-曲妥珠单抗、阿仑单抗、伊匹单抗、奥法木单抗、纳武利尤单抗、帕博利珠单抗或利妥昔单抗)、细胞因子治疗(例如，干扰素，包括I型(IFNα和IFNβ)、II型(IFNγ)和III型(IFNλ)以及白介素，包括白细胞介素-2(IL-2))、辅助免疫化疗(例如，云芝多糖-K)、过继性T-细胞疗法、溶瘤病毒疗法以及免疫检查点阻断疗法(例如，伊匹单抗、帕博利珠单抗、纳武利尤单抗)。

在另一示例中，使用抗凝血剂联合B-Raf抑制剂和/或MEK抑制剂的治疗可与利用放射性同位素的放疗相结合，包括但不限于碘-131、锶-89、钐-153和镭-223。此外，放疗可与放射增敏药物联合使用，例如但不限于顺铂、尼莫拉唑和西妥昔单抗。

本发明非限制方面示例

上述发明主题的各个方面(包括实施例)可以单独或与一个或多个其他方面或实施例相结合而受益。在不限制上述描述的情况下，下文提供了本发明编号1-21的某些非限制性方面。在阅读本发明后，本领域的技术人员可明显看出，每个独立编号的方面可以与前面或后面的任何独立编号的方面一起使用或组合。这旨在为所有此类方面的组合提供支持，并不限于下文明确提供的方面组合：

1.一种治疗骨桥蛋白(OPN)相关癌症的方法，所述方法包括向有需要受试者联合给予治疗有效用量的抗凝血剂与治疗有效用量的B-Raf抑制剂或丝裂原活化蛋白激酶(MEK)抑制剂。

2.根据方面1所述的方法，其中，所述抗凝血剂是一种直接凝血酶抑制剂。

3.根据方面2所述的方法，其中，所述凝血酶抑制剂选自达比加群酯、阿加曲班、伊诺加群、美拉加群、希美加群、水蛭素、比伐卢定、来匹卢定和地西卢定。

4.根据方面1-3中任一项所述的方法，其中，所述B-Raf抑制剂选自达拉非尼、维莫非尼、索拉非尼、LGX818、GDC-0879和PLX-4720。

5.根据方面1-4中任一项所述的方法，其中，所述抗凝血剂与治疗有效剂量的B-Raf和治疗有效剂量的MEK抑制剂联合给药。

6.根据方面1-5中任一项所述的方法，其中，所述MEK抑制剂选自包含曲美替尼、考比替尼、比尼替尼、司美替尼和PD-325901的组。

7.根据方面1-6中任一项所述的方法，其中，所述抗凝血剂、所述B-Raf抑制剂或所述MEK抑制剂根据每日给药方案给药或间歇给药。

8.根据方面1-7中任一项所述的方法，其中，在足以产生至少部分肿瘤反应的时间段内，对受试者进行多个周期的治疗。

9.根据方面8所述的方法，其中，所述时间段至少为6个月。

10.根据方面9所述的方法，其中，所述时间段至少为12个月。

11.根据方面8-10中任一项所述的方法，其中，实现完全肿瘤反应。

12.根据方面1-11中任一项所述的方法，其中，所述抗凝血剂或所述B-Raf抑制剂经口、静脉或局部给药。

13.根据方面1-12中任一项所述的方法，其中，所述OPN相关癌症为黑色素瘤。

14.根据方面13所述的方法，其中，所述黑色素瘤是B-RAF突变黑色素瘤。

15.根据方面14所述的方法，其中，所述B-RAF突变黑色素瘤包括V600E突变或V600K突变。

16.根据方面13-15中任一项所述的方法，其中，所述黑色素瘤为转移性。

17.根据方面1-16中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人类。

18.根据方面1-17中任一项所述的方法，其中，所述抗凝血剂是因子Xa抑制剂。

19.根据方面18所述的方法，其中，所述因子Xa抑制剂选自利伐沙班(拜瑞妥)、阿哌沙班(艾乐妥)、贝曲沙班、达瑞沙班(YM150)、依度沙班(里先安)、奥米沙班、利他沙班(TAK-442)、艾立沙班、安替斯塔辛、华法林、肝素和磺达肝癸钠。

20.根据方面1-17中任一项所述的方法，其中，所述抗凝血剂是因子XIa抑制剂。

21.根据权利20所述的方法，其中，所述因子XIa抑制剂选自BMS-262084((2S,3R)-1-[4-(叔丁基氨基甲酰基)哌嗪-1-羰基]-3-[3-(二氨基亚甲基氨基)丙基]-4-氮杂环丁酮-2-羧酸)、BMS-724296、BMS-654457(2-[3-[(2S,4R)-6-甲脒基-4-甲基-4-苯基-2,3-二氢-1H-喹啉-2-基]-5-(3-甲基丁酰氨基)苯基]-5-邻甲酰胺苯甲酸)、BMS-986177((9R,13S)-13-[4-[5-氯代-2-(4-氯三唑-1-基)苯基]-6-氧嘧啶-1-基]-3-(二氟甲基-9-甲基-3,4,7,15-四氮三环[12.3.1.02,6]十八-1(18),2(6),4,14,16-戊烷-8-酮)、EP-7041((2S,3R)-3-([2-氨基吡啶-4-基]甲基)-1-([{1R}-1-环己基乙基]氨基甲酰)-4-氮杂环丁酮-2-羧酸)、基于酮精氨酸的拟肽物、clavatadine、芳基硼酸和含环状精氨酸的酮噻唑拟肽物。

22.根据方面1-21中任一项所述的方法，其中，进一步包括给予其他抗癌治疗剂。

23.根据方面22所述的方法，其中，所述其他抗癌治疗剂是化疗剂、免疫治疗剂、生物治疗剂、激素治疗剂、促凋亡剂、血管生成抑制剂、光敏剂、放射增敏剂和放射性同位素。

对于本领域普通技术人员，显而易见的是，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可在本发明中进行各种更改和修改。

实验

为了向本领域的普通技术人员完整公开和说明如何进行和使用本发明，提出了以下示例，这些示例不会限制发明人所认为的发明范围，也不表示以下实验是全部或唯一进行的实验。我们努力确保所用数字的准确性(例如，数量、温度等)，但应考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份，分子量为重量平均分子量，温度为摄氏温度，压力为大气压或接近大气压。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过本发明的引用，成为本发明的一部分，就像各个出版物或专利申请均具体、单独表明通过本发明的引用，成为本发明的一部分。

本发明已根据发明人发现或提出的特定实施例进行了描述，这些实施例构成了本发明的优选实施方式。本领域技术人员应理解，根据本发明的内容，在不脱离本发明预期范围的情况下，可以对示例的特定实施例进行大量的修改和变更。例如，由于密码子冗余，可以在不影响蛋白质序列的情况下对潜在的DNA序列进行更改。此外，由于生物功能等效性的考虑，可以在不影响生物作用的种类或数量的情况下对蛋白质结构进行更改。所有此类修改应包括在本发明所附权利要求的范围内。

示例1

阻断骨桥蛋白的凝血酶切割抑制B16肿瘤生长和转移

凝血酶在体外切割OPN以调节OPN功能。OPN包含多个保守功能结构域，包括与多个整合素结合的RGD序列、变体CD44(vCD44)结合结构域和硫酸乙酰肝素结合结构域。RGD序列的C端是一个保守凝血酶切割位点(在人类Arg¹⁶⁸和小鼠Arg¹⁵³处)，当切割时，在新C末端暴露出α4β1和α9β1整合素的先前隐式整合素结合位点，SVVYGLR(SEQ ID NO:4，Yokosaki等人，1999)。当OPN-R中的C端精氨酸被羧肽酶N(CPN)或羧肽酶B2(CPB2，也称为凝血酶活化纤维蛋白溶解抑制剂，TAFI)切割时，与破坏的全长OPN(OPN-FL)相比，凝血酶切割的OPN-Arg(OPN-R)具有增强的α4β1依赖性细胞结合活性(Leung和Morser，2018)。第二次切割将OPN-R转化为OPN-Leu(OPN-L)，这表明凝血酶和CPN或CPB2对OPN-FL的顺序切割代表了OPN细胞粘附活性的顺序上调和下调(Myles等人，2003)(图1A)。最后，我们证明了C端OPN片段(OPN-CTF)获得了对树突状细胞(DC)的新构象依赖性趋化活性(Shao等人，2014)。

我们创建了针对OPN-R和OPN-L的ELISA，并证明了炎症性关节炎患者的关节液中OPN-R和OPN-L的水平显著升高，这表明这些切割发生在体内(Sharif等人，2009)。由于过去无法具体测量凝血酶切割的OPN片段，OPN的凝血酶切割在癌症生物学中的作用在很大程度上被忽视了。我们证明了GBM和非GBM恶性胶质瘤患者的脑脊液(CSF)中的OPN-R和OPN-L显著增加(Yamaguchi等人，2013)。OPN和切割片段促进U87 MG细胞(人GBM细胞系)的运动性和粘附性，并赋予细胞凋亡抗性，因此切割的OPN片段可以促进GBM发展。

为了确定OPN凝血酶切割在体内的作用，我们创造了一种抗凝血酶切割的OPN_R153A敲入(OPN-KI)小鼠，并发现B16鼠黑色素瘤的生长和转移在这些小鼠中受到严重抑制。

结果

抑制OPN-KO和OPN-KI小鼠中的B16肿瘤生长

为了确认凝血酶切割位点的突变会使产生的OPN具有凝血酶抗性，我们表达了一种突变的OPN(OPN_R153A)，凝血酶切割位点的精氨酸(R)在大肠杆菌中突变为丙氨酸(A)(R153A)，并证明了它对凝血酶切割具有抗性(图1B)。OPN-KI(OPN_R153A)小鼠与OPN-KO小鼠相似，在激发前具有生育能力并且身体健康，在CBC、肝功能和肾功能中未观察到任何表型变化(图9和10)。

根据先前的报告，即与WT小鼠相比，OPN-KO中鼠黑色素瘤B16肿瘤的生长受到抑制(Nemoto等人，2001；Ohyama等人，2004)，我们测试了在OPN-KI小鼠中是否观察到相同的表型。B16肿瘤在OPN-KO或OPN-KI小鼠中受到抑制(图1C)。2周后，OPN-KI小鼠(平均值2.7±0.4g，n＝23)和OPN-KO小鼠(平均值3.0±0.7g，n＝19)中的肿瘤重量低于WT小鼠(平均值5.1±0.5，n＝22；OPN-KI与WT p＝0.0032和OPN-KO与WT p＝0.0187)(图1D)。雄性和雌性小鼠的结果比较显示，OPN-KI小鼠与WT小鼠的肿瘤大小减小在性别之间没有差异(图11)。同样，改变接种的B16细胞数量并没有消除OPN-KI小鼠与WT小鼠肿瘤大小的差异(图11)。OPN-KO和OPN-KI小鼠的肿瘤生长或体重没有差异。综上所述，抗凝血酶OPN-KI小鼠在B16黑色素瘤肿瘤模型中表型复制OPN-KO小鼠，其肿瘤也小于WT小鼠。

OPN-KI小鼠中B16转移的抑制与OPN-KO小鼠相似

除了原发性肿瘤外，与血源性肺转移模型中的WT小鼠相比，OPN-KO小鼠也表现出肿瘤转移减少(Nemoto等人，2001)。我们重复该模型以评估OPN-KI小鼠是否表现出相似的表型。处死后，临床检查显示，与WT小鼠相比，OPN-KI和OPN-KO小鼠的肿瘤负荷均降低(图2A)。通过计数转移性肺结节进行的定量显示，OPN-KI小鼠(1.4±0.7/肺，n＝5)和OPN-KO小鼠(1.5±0.4/肺，n＝10)的肿瘤负担降低与WT小鼠(15.8±5.1/肺，n＝6；OPN-KI与WT：p＝0.0061；OPN-KO与WT：p＝0.0016；图2B)相当。肺黑色素含量的测定表明，OPN-KI小鼠(1.6±0.2μg/mg肺组织，n＝5)和OPN-KO小鼠(1.82±0.11μg/mg肺组织，n＝10)低于WT小鼠(3.2±0.3μg/mg肺组织，n＝6，OPN-KI与WT：p＝<0.0001；OPN-KO与WT：p＝<0.0001；图2C)。转移性肺结节的数量和黑色素含量减少的程度相当，这表明B16细胞离开脉管系统并在血管外室中建立肿瘤的过程以及这些肿瘤的生长都受到预防OPN凝血酶切割的抑制。

WT小鼠凝血酶的抑制表型复制OPN-KI表型

由于B16肿瘤生长和转移在抗凝血酶OPN-KI小鼠中受到抑制，与OPN-KO小鼠相似，我们研究了通过用口服凝血酶抑制剂抑制凝血酶来阻断OPN切割是否也会减小WT小鼠的肿瘤大小。从B16接种前4天直至处死，用口服活性凝血酶抑制剂达比加群酯(DE)(将其混合到饲料或匹配的对照饲料中)治疗小鼠(Sparkenbaugh等人，2014)。用DE治疗的WT小鼠显示出肿瘤抑制(图3A)与在OPN-KI小鼠中观察到肿瘤抑制相似，无论KI小鼠是否接受DE治疗(图3B)。用DE治疗的WT小鼠处死后的肿瘤体积较低(1.0±0.2cm³；n＝14与2.5±0.4cm³；p＝0.0017；n＝21；图3C)。OPN-KI的肿瘤体积在接受和不接受DE治疗的情况下相似(0.73±0.3cm³；n＝10与0.77±0.5cm³，p＝0.9999；n＝7；图3C)，也与接受DE治疗的WT结果相似。在DE治疗的WT小鼠中观察到的肿瘤重量(1.0±0.2g与2.5±0.4g，p＝0.0018)与在OPN-KI小鼠中发现的肿瘤重量相似(0.8±0.9与0.73±0.9；p＝0.9716；图3D)。我们通过测量活化部分凝血活酶时间(aPTT)确认了这种给药方案阻断凝血酶活性(图3E)，并注意到抗凝作用增加的趋势与肿瘤重量呈负相关(图3F，R＝-0.37)。因此，WT小鼠中凝血酶的抑制概括了抗凝血酶OPN-KI表型。用DE治疗的OPN-KI小鼠并没有进一步减少B16肿瘤的重量和体积，这表明除了预防OPN切割之外，凝血酶抑制没有其他作用。

我们还使用肺转移模型重复了DE实验。与对照WT小鼠相比，用DE治疗的小鼠表现出更少的转移性结节/肺和更低的黑色素含量(图3G、3H)。而DE治疗对OPN-KI(图3A)和OPN-KO小鼠的局部肿瘤生长没有影响，与未治疗的OPN-KI或OPN-KO小鼠相比，用DE治疗的OPN-KI或OPN-KO小鼠分别表现出更少的肺转移和更低的黑色素含量趋势(图3G、3H)。

检测WT小鼠B16肿瘤和血浆中的OPN切割产物

我们评估了WT小鼠在肿瘤植入前后的OPN切割产物。WT小鼠(223.5±11.3ng/ml)和OPN-KI小鼠(170.6±34.2ng/ml；p＝0.1668)的总OPN血浆水平相似，OPN-KO小鼠血浆中不含有可检测的OPN。在肿瘤植入前，在所有基因型中均未检测到OPN切割产物。在B16肿瘤植入后14天，WT小鼠和OPN-KI小鼠的总OPN血浆水平升高。我们在WT小鼠中检测到低水平的凝血酶切割产物OPN-R和OPN-L，但在OPN-KI小鼠中未检测到(图4B)。在肿瘤裂解物中，WT小鼠样品中的总OPN比OPN-KI小鼠高约4倍(4.5±0.32ng/mg与1.0±0.35ng/mg，p＝<0.0001)，在OPN-KO小鼠的肿瘤中未检测到肿瘤裂解物。此外，在WT肿瘤裂解物中，有>80％的OPN切割成OPN-R和OPN-L(图4C)。相比之下，在OPN-KI小鼠的肿瘤裂解物中未检测到OPN-R和OPN-L。这些数据表明，OPN的凝血酶切割产物在WT小鼠B16肿瘤和血浆中存在，并具有局部修饰肿瘤和宿主全身反应的潜力。

B16细胞没有表达OPN，但表达OPN结合整合素

B16细胞没有可检测的OPN mRNA表达(Nemoto等人，2001)。我们确认在B16细胞条件培养基中，通过ELISA检测不到OPN。因此，与WT小鼠相比，B16细胞不产生OPN，并且OPN-KO和OPN-KI小鼠中B16肿瘤生长的抑制是由于宿主OPN的凝血酶切割。凝血酶切割的OPN显示了整合素α4β1和α9β1的隐式整合素结合位点(Yokosaki等人，1999)，我们通过FACS证明了B16细胞在细胞表面表达α4β1和α9β1整合素(图12)。我们假设凝血酶切割的OPN片段可能通过α9β1和α4β1整合素直接调节B16肿瘤生长和转移。

OPN片段对B16细胞的影响

我们用不同的凝血酶切割的OPN片段处理B16肿瘤细胞，包括OPN-R、OPN-L和OPN-CTF(Shao等人，2014)。与牛血清白蛋白(BSA)相比，所有不同的OPN片段均增加了细胞粘附(图4D)。然而，与OPN-FL相比，OPN-R有显著增加(约3.5倍)，证实了OPN凝血酶切割的重要性。与OPN-R相比，OPN-L和OPN-R_RAA(OPN-R中的RGD序列已突变为RAA)的粘附性降低，表明OPN-R C端的RGD和凝血酶切割暴露整合素结合位点(SVVYGLR)在细胞粘附中起重要作用，与显示a4和b1整合素的报告结果一致(Cardones等人，2003；Katagiri等人，1996)。OPN切割片段没有增加B16细胞增殖(图4E)。

OPN增强趋化作用(Hayashi等人，2007)，因此我们测试了不同OPN片段对B16细胞迁移的影响。与BSA相比，OPN-FL、OPN-R和OPN-R_RAA的迁移都增加了(图4F)。与OPN-FL相比，只有OPN-R中的趋化作用显著增加(约3.5倍)，但在OPN-R_RAA或OPN-L中没有显著增加，再次表明RGD和OPN-R中C端的切割暴露的SVVYGLR(SEQ ID NO:4)在增加细胞迁移中发挥作用。有趣的是，没有RGD或SVVYGLR序列(SEQ ID NO:4)的OPN-CTF也显示出与OPN-FL相当的细胞迁移增加，这表明OPN-CTF具有功能活性，并且可能与B16细胞上的不同受体独立相互作用。

我们还研究了OPN及其片段对B16细胞凋亡的影响。与BSA相比，OPN-FL、OPN-R和OPN-L将细胞凋亡减少约3倍，而OPN-CTF、OPN-FL_RAA、OPN-R_RAA和OPN-L_RAA没有抗凋亡作用，表明OPN在仅由RGD位点介导的B16细胞中赋予保护性抗凋亡作用，并且不受凝血酶切割的影响(图4G)。因此，OPN-KI小鼠中的B16肿瘤抑制并不是由于OPN_R153A中抗凋亡作用的丧失而导致肿瘤细胞凋亡增加。

综上所述，凝血酶切割的OPN产物对B16肿瘤细胞粘附和趋化性的影响较小。鉴于剧烈的体内表型，我们假设凝血酶切割片段也调节宿主抗肿瘤免疫反应以促进肿瘤生长和转移。

OPN-KO和OPN-KI小鼠的B16肿瘤中含有更多的巨噬细胞

组织学检查未显示来自不同小鼠基因型的B16肿瘤之间存在显著差异(图5A)。在免疫组织学研究中，由抗CD3抗体确定的T细胞数量在不同小鼠基因型上生长的B16肿瘤之间没有差异(图5B)。然而，免疫组织学研究和流式细胞术分析显示，OPN-KO和OPN-KI肿瘤中的F4/80⁺细胞明显多于WT小鼠(图5C、5D)，这表明肿瘤抑制的表型可能部分通过巨噬细胞反应的调节介导。

氯膦酸盐消耗巨噬细胞逆转OPN-KI小鼠的B16肿瘤抑制表型

由于WT小鼠肿瘤中的巨噬细胞较少，我们通过用氯膦酸盐消耗吞噬细胞来研究OPN-KI小鼠中的肿瘤抑制是否由吞噬细胞介导(Van Rooijen和Sanders，1994)。氯膦酸盐治疗没有改变WT小鼠的B16肿瘤生长。在OPN-KI小鼠中，巨噬细胞消耗增加了B16肿瘤体积(氯膦酸钠与对照：2.88±0.2cm³；n＝10与1.0±0.25cm³，p＝<0.0001；n＝11)与WT相似(氯膦酸盐与对照：3.1±0.15cm³；n＝13与3.15±0.2cm³，p＝9930；n＝14；图6A、6B)和肿瘤重量(氯膦酸盐与对照：2.25±0.23g与1.0±0.26g，p＝<0.003)，与WT小鼠中发现的水平相似(氯膦酸盐与对照：2.8±0.09g与2.8±0.14g，p＝>0.9999；图6C)。与对照组相比，用氯膦酸盐处理的WT和OPN-KI小鼠的骨髓和肿瘤区室中的F4/80⁺细胞群(巨噬细胞标志物)均减少，而血液中F4/80⁺细胞的数量不受影响(图6D-6F)。这表明OPN-KI小鼠的肿瘤抑制是由于肿瘤中的巨噬细胞增加。尽管WT小鼠中巨噬细胞被氯膦酸盐消耗，但肿瘤大小没有增加。

免疫缺陷NOG-OPN-KO和NOG-OPN-KI小鼠B16肿瘤抑制表型缺失

我们在严重免疫缺陷的NOD/Shi-scid/IL-2Rγ^null(NOG)小鼠中生成OPN-KO和OPN-KI小鼠，分别产生NOG-OPN-KO和NOG-OPN-KI小鼠(Ito等人，2002)。这些小鼠缺乏T细胞、B细胞、NK细胞，并表现出巨噬细胞和树突状细胞的功能障碍。如果凝血酶切割的OPN片段调节宿主抗肿瘤免疫反应，我们预计OPN-KO和OPN-KI小鼠的肿瘤抑制表型在其NOG小鼠中丢失。我们在B16肿瘤和转移模型中测试了这些小鼠。

即使我们对B16接种物的大小用滴定法测量，NOG对照小鼠NOG-OPN-KO和NOG-OPN-KI之间的B16肿瘤大小或重量没有差异(图7A、7B、图13)。我们也没有发现性别特异性差异(图14)。在肺转移模型中，NOG对照小鼠NOG-OPN-KO和NOG-OPN-KI小鼠之间的转移性肺结节或黑色素含量没有差异(图7C、7D)。综上所述，OPN-KI小鼠的肿瘤抑制需要完整的免疫系统。

综上所述，关于氯膦酸消耗巨噬细胞的影响以及NOG免疫缺陷小鼠的数据表明，OPN-KI和OPN-KO小鼠中B16肿瘤生长和转移的抑制是由于增加F4/80+肿瘤相关巨噬细胞(TAM)介导的宿主抗肿瘤免疫反应的增强。

OPN-KO和OPN-KI小鼠的B16肿瘤中含有更多的巨噬细胞

为了定位这种免疫作用，我们通过荧光活化细胞分类(FACS)和/或组织学评估了B16肿瘤的B细胞和T细胞浸润，发现在不同小鼠基因型上生长的B16肿瘤之间没有显著差异(图7E、7F)。相比之下，免疫组织学和流式细胞术分析显示，OPN-KO和OPN-KI肿瘤中的巨噬细胞(F4/80⁺)明显多于WT小鼠(图5B、5C)。因此，OPN-KI小鼠中的肿瘤抑制可能由巨噬细胞介导。

氯膦酸盐消耗巨噬细胞逆转OPN-KI小鼠的B16肿瘤抑制表型

为了测试OPN-KI小鼠中肿瘤抑制是由吞噬细胞介导的假设，我们用氯膦酸盐消耗了这些吞噬细胞(Van Rooijen和Sanders，1994)。氯膦酸盐治疗没有改变WT小鼠的B16肿瘤生长。在OPN-KI小鼠中，巨噬细胞消耗增加了B16肿瘤体积(氯膦酸钠与对照：2.88±0.2cm³，n＝10与1.0±0.25cm³,，n＝11，p＝<0.0001)，与WT相似(氯膦酸与对照：3.1±0.15cm³，n＝13与3.15±0.2cm³,，n＝14，p＝9930；图5D、5E)，并且增加了肿瘤重量(氯膦酸盐与对照：2.25±0.23g与1.0±0.26g，p＝<0.003)，与WT小鼠中发现的水平相似(氯膦酸盐与对照：2.8±0.09g与2.8±0.14g，p＝>0.9999；图5F)。与对照组相比，用氯膦酸盐处理的WT和OPN-KI小鼠的骨髓和肿瘤区室中的F4/80⁺细胞群(巨噬细胞标志物)均减少，而血液中的F4/80⁺细胞数量不受影响(图5G-5I)。这表明OPN-KI小鼠的肿瘤抑制是由于肿瘤中的巨噬细胞增加。尽管WT小鼠中巨噬细胞被氯膦酸盐消耗，但肿瘤大小没有增加。

综上所述，关于氯膦酸消耗巨噬细胞的影响以及NOG免疫缺陷小鼠的数据表明，OPN-KI和OPN-KO小鼠中B16肿瘤生长和转移的抑制是由于增加F4/80⁺肿瘤相关巨噬细胞(TAM)介导的宿主抗肿瘤免疫反应的增强。

与WT小鼠相比，OPN-KI和OPN-KO小鼠肿瘤相关巨噬细胞(TAM)中巨噬细胞表型的 变化

我们分析了不同基因型肿瘤中的浸润巨噬细胞和淋巴细胞。与WT小鼠相比，在OPN-KI和OPN-KO小鼠的肿瘤中，整体肿瘤相关巨噬细胞(TAM)(CD45+F4/80+)增加(WT：CD45+的50.7±1.6％；OPN-KI：66.5±5.9％，p＝0.0168和OPN-KO：58.3±1.1％，p<0.05，每组n＝5，图8A)。定义为EGR2-CD38+巨噬细胞的M1巨噬细胞在数量上没有差异(图8B)。定义为EGR2+CD38-或CD206+CD11b+巨噬细胞的TAM中M2巨噬细胞的比例降低(图8C-8D)，而定义为CD11b+CD11c-CD206+Ly-6G-巨噬细胞的TAM的比例增加(WT：4.7±0.65％，OPN-KI：9.2±1.5％，p＝0.0399和OPN-KO：9.0±1.3％，p＝0.0495，每组n＝5，图8E)。因此，除了OPN-KI和OPN-KO小鼠B16肿瘤中TAM总数的增加外，在这些肿瘤中，M2巨噬细胞已经转变为活化曲线不同的TAM。与WT相比，OPN-KI和OPN-KO小鼠肿瘤中浸润中性粒细胞、B细胞和T细胞的数量没有差异(图8F-8H)。

RAW细胞对不同OPN形式的反应

RAW细胞是一种鼠巨噬细胞系，已用作TAM模型(Kale等人，2014，2015)，我们通过流式细胞术证明了它们可以表达α9β1和α4β1整合素(图12)。我们测试了它们对OPN不同片段的反应。与BSA相比，所有OPN片段都增加了RAW细胞粘附，这些细胞之间没有差异(图15)。我们研究了前列腺素E₂(PGE₂)的产生，因为它是一种介质，据报告可诱导肿瘤血管生成并增强B16细胞生长(Kale等人，2014，2015；Kawahara等人，2015)。与OPN-FL相比，OPN-R和OPN-R_RAA均使RAW细胞中的PGE₂分泌增加了约4.2倍(图8G)，表明凝血酶切割时OPN-R中显示的α9β1和α4β1整合素结合位点介导PGE₂分泌增加。

讨论

在本研究中，我们发现OPN的凝血酶切割在癌症生物学中起着关键的病理生理作用。WT小鼠B16肿瘤内存在广泛的OPN切割，凝血酶切割(OPN-R)和凝血酶-CPN/CPB2双切割(OPN-L)OPN片段的水平占肿瘤样品中总OPN的>80％，这些切割片段在荷瘤小鼠的血浆中可以检测到(图4)。抗凝血酶切割的OPN-KI小鼠对B16肿瘤生长和肺转移均表现出显著抑制，抑制程度与OPN-KO小鼠中观察到的程度相似(图1和2)。因此，OPN-KI在该肿瘤模型中表型复制OPN-KO，表明单独预防OPN的凝血酶切割介导观察到的表型，独立于OPN上的所有其他功能域。KI小鼠中的这种肿瘤抑制表型由免疫介导，因为该表型没有在严重免疫受损的NOG-OPN-KI和NOG-OPN-KO小鼠中复制(图6)。它与肿瘤中F4/80⁺TAM的增加有关，并且氯膦酸盐治疗巨噬细胞消耗逆转了KI小鼠的表型，表明肿瘤抑制表型由巨噬细胞介导(图5)。巨噬细胞活化已大致定义为两种状态-一种是涉及1型辅助性T(Th1)细胞对病原体反应的促炎M1状态，另一种是涉及Th2型反应的“替代激活”M2状态，包括体液免疫和伤口愈合(Gordon，2003)。大量的临床和实验证据支持TAM促进肿瘤启动和进展的观点(Qian和Pollard，2010)，肿瘤中的巨噬细胞从M1偏向M2(Mantovani和Sica，2010)。M2 TAM的数量越多，临床预后越差(Komohara等人，2016)。因此，与M1表型相比，M2表型通常被认为是促肿瘤生长的(Gordon和Martinez，2010；Mills，2012)。另一方面，现在认识到，二进制M1/M2激活状态不足以描述巨噬细胞刺激和反应的更广泛复杂性(Natoli和Monticelli，2014)。不同的刺激导致各种激活程序(转录模块)(Xue等人，2014)，为响应肿瘤微环境中的线索，TAM可以进行动态功能重编(Netea-Maier等人，2018)。我们的研究表明，除了TAM的增加外，巨噬细胞活化表型也发生了显著变化，从WT中的促肿瘤M2表型转变为OPN-KI和OPN-KO小鼠中由CD45⁺F4/80⁺CD11c^-定义的表型(图7)。在转移性乳腺癌模式下，OPN缺乏导致肿瘤抑制，并且与骨髓来源抑制细胞中切换到更具免疫抑制性的细胞亚群有关(Sangaletti等人，2014)。在胶质母细胞瘤模型中，OPN-KO小鼠肿瘤中的M2巨噬细胞减少(Wei等人，2019)。然而，在这些研究中没有研究OPN的凝血酶切割(Mantovani和Sica,2010；Qian和Pollard，2010)。

使用RAW细胞作为TAM的模型，OPN-R明显增强了PGE₂的分泌(图8G)，据报告可增强血管生成和B16肿瘤生长(Kale等人，2014，2015)。COX-1抑制剂抑制血小板中PGE₂的产生可减少B16转移(Lucotti等人，2019)。这种途径在OPN-KI小鼠中被破坏，并可能有助于观察到肿瘤抑制。总的来说，我们的数据显示，OPN-KI小鼠中的肿瘤抑制由增强的宿主抗肿瘤免疫反应介导，该免疫反应由功能调节的TAM增加介导，促肿瘤的M2巨噬细胞减少，并由改变激活状态的巨噬细胞群取代(图8H)。通过OPN-R、OPN-L和/或OPN-CTF直接或间接调节这些TAM的机制，以及OPN-KO和OPN-KI小鼠中CD45⁺F4/80⁺CD11c^-巨噬细胞群增加的功能特征仍有待完全确定。

癌症代表炎症状态，癌细胞表达多种癌症促凝血剂，包括激活凝血级联反应的组织因子(Hisada和Mackman，2019；Kirszberg等人，2009)并导致凝血酶生成。大量文献讨论了凝血激活与癌细胞生物学之间的相互作用(Lima和Monteiro，2013；Ruf等人，2016；Wojtukiewicz等人，2015)。水蛭素是一种肠胃外直接凝血酶抑制剂，可防止B16细胞转移(Niers等人，2009)。Cochrane系统评价显示，肠胃外肝素有益于癌症患者的生存，特别是在局限性小细胞肺癌患者中(Akl等人，2008a；Akl等人，2008b；Akl等人，2008c)，尽管抗凝对癌症患者的生存是否有直接的好处仍有争议(O'Rorke等人，2015)。我们的数据支持OPN的凝血酶切割导致宿主抗肿瘤免疫反应的抑制，癌细胞利用这种机制来提高其存活率。我们发现，达比加群酯是一种直接口服活性抗凝剂(DOAC)，在WT小鼠的局部肿瘤生长和转移中复制了肿瘤抑制表型。有趣的是，利伐沙班是凝血级联反应中靶向因子Xa的DOAC，该药物也证明可以通过阻断TAM中的Xa蛋白酶激活受体2信号传导来促进抗肿瘤免疫(Graf等人，2019)。DOAC现在越来越多地应用于临床，并证明与传统的维生素K拮抗剂华法林相比具有更好的治疗特征(Hakoum等人，2018；Kahale等人，2018；Matar等人，2018)。因此，如果达比加群和其他DOAC的观察结果可以推广到其他癌症，那么可以考虑将达比加群和其他DOAC作为癌症治疗中常规化疗的辅助手段。另一方面，人们也普遍认识到，抗凝后癌症患者出血并发症的发生率较高，可能与肿瘤血管渗漏较多有关(Schuliga，2015)。因此，开发一种有效阻断OPN凝血酶切割而不损害凝血级联反应完整性的药物将代表癌症治疗中的一种新型辅助疗法。

综上所述，这是首次直接证明了凝血酶在体内切割OPN的作用。我们的研究表明，凝血酶切割的OPN片段对癌症生物学有显著的病理生理学影响，并且可能通过增强TAM介导的宿主抗肿瘤免疫反应，为开发癌症治疗的新型治疗剂提供独特的机会。其临床应用可能不仅限于癌症治疗，因为据报告凝血酶切割的OPN可诱导心脏成纤维细胞中胶原蛋白的产生，并可能在心脏纤维化中发挥一定的作用(Herum等人，2020)。

材料和方法

关键资源表

/>

/>

/>

产生表达抗凝血酶骨桥蛋白的小鼠(Spp1^R153A/R153A)

为了在编码骨桥蛋白(OPN；分泌的磷蛋白1，Spp1)的基因中创建R153A敲入点突变，以防止小鼠OPN的凝血酶切割，我们在小鼠胚胎干(ES)细胞中使用同源重组，然后对适当的靶向ES细胞进行囊胚注射(图16)。从Ensembl数据库中检索到位于小鼠5号染色体上的Spp1基因序列(核苷酸104,834,137～104,900,066)并作为参考。小鼠RP23-410M1 BAC DNA用于生成基因靶向载体的同源臂，并使用Southern探针筛选靶向事件。5'同源臂(约5.0kb)和3'同源臂(约2.5kb)均通过PCR生成。R153A点突变(位于3'同源臂的外显子5中)由定点诱变引入。将这些片段依次克隆到LoxNwCD载体中，并通过限制性酶切和末端测序进行确认。

最终载体还包含Neo表达盒两翼的loxP序列(用于ES细胞的阳性选择)和白喉毒素A(DTA)表达盒(用于潜在靶向ES细胞的阴性选择)。通过限制性核酸内切酶消化和末端测序分析确认了最终载体。NotI用于在电穿孔之前对最终载体进行线性化。

通过PCR生成5'和3'外部探针，并通过基因组Southern分析进行测试以筛选ES细胞。在pCR4.0骨架中克隆探针并通过测序进行确认。

NotI线性化的最终载体DNA(30μg)电穿孔为约10⁷个C57BL/6J ES细胞，并用200μg/ml G418选择。选择192个ES细胞克隆进行PCR筛选，并选择5个潜在的靶向克隆进行扩增和进一步分析。在完成胚胎ES克隆扩增后，进行了额外的Southern和PCR/测序确认分析，结果显示正确靶向了两个克隆(E9和F8)并具有单个neo插入。

用克隆E9和F8进行囊胚注射，并产生雄性嵌合体：99％(n＝1)、90％(n＝1)、80％(n＝2)、70％(n＝2)、60％(n＝1)、50％(n＝1)、40％(n＝1)、30％(n＝1)和20％(n＝1)。这些雄性嵌合体与C57BL/6J WT雌性繁殖，以产生通过PCR分析鉴定的杂合子。随后与C57BL/6J小鼠反交产生携带突变Spp1基因的纯合子小鼠，再次使用表1中的引物通过PCR分析鉴定(图17A和17B)。靶向和ES细胞工作由Caliper Discovery Alliances and Services(马里兰州汉诺威)完成。

此后，将纯合C57BL/6J Spp1^R153A/R153A小鼠指定为“OPN-KI”小鼠，而从Jackson实验室(加利福尼亚州萨克拉门托)获得的Spp1^-/-小鼠为“OPN-KO”小鼠。将小鼠安置在斯坦福大学医学院或帕洛阿尔托退伍军人事务医疗保健系统(VAPAHCS)，并按照NIH指南，根据斯坦福大学动物研究委员会或VAPAHCS机构动物护理和使用委员会批准的方案进行实验。将动物随机分配到不同的组，并进行盲法分析。所有实验至少独立重复两次，并考虑所有入选实验的小鼠。

携带OPN-KI和OPN-KO基因的免疫缺陷小鼠：NOG-WT、NOG-OPN-KO和NOG-OPN-KI小鼠(Ito等人，2002)购自实验动物中央研究所(CIEA；日本川崎)，并安置在VAPAHCS的无菌设施中。这些小鼠具有完整的OPN基因(NOG-WT)，缺乏OPN(NOG-OPN-KO)或携带OPN基因中的R153A突变，从而使OPN抗凝血酶(NOG-OPN-KI)。

通过心脏穿刺将血液收集到3.2％的柠檬酸钠中，血液与柠檬酸钠的比例为9:1，从而在植入或未植入肿瘤的小鼠中制备血浆样品。将所有基因型的肿瘤样品在含有完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的RIPA缓冲液(Pierce，加利福尼亚州卡尔斯巴德)中均质化，来制备肿瘤裂解物。蛋白质浓度通过Bio-Rad蛋白质分析(Bio-Rad，加利福尼亚州赫拉克勒斯市)测定。如前文所述制备骨髓细胞(Toda等人，2013)。

临床化学：对12周雄性和雌性WT、OPN-KI和OPN-KO小鼠的血浆进行临床化学分析。通过测量丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的水平来研究肝功能，通过测定血尿素氮(BUN)和肌酐水平来研究肾功能。在这些测量中没有发现基因型之间的差异(图9)。在这些样品中测定乳酸脱氢酶(LDH)、胆红素、胆固醇，结果显示基因型之间也没有差异。

循环血细胞：对5周-26周的雄性和雌性WT、OPN-KI和OPN-KO小鼠进行全血细胞计数(CBC)。在研究的任何细胞类型中，包括红细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、血小板和网织红细胞，基因型之间均未发现差异。图10显示了从12周小鼠中提取的CBC数据。不同基因型的雄性和雌性小鼠之间没有差异，不同年龄的样品也显示基因型之间没有差异。

细胞培养：B16(小鼠黑色素瘤)和RAW(小鼠巨噬细胞)细胞系购自ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯)，并在含有5％胎牛血清(FBS)和青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Gibco LifeTechnologies，俄克拉荷马州兰利)的DMEM(纽约州康宁)中培养。为测定Spp1mRNA，将融合的B16细胞进行胰蛋白酶化，分离RNA并进行RT-PCR，使用含有Spp1基因的质粒作为阳性对照。

蛋白质和试剂：如前所述，制备了不同的OPN重组片段，包括突变形式(Shao等人，2014；Yamaguchi等人，2013)。BSA购自Invitrogen(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。

B16皮下肿瘤接种：将B16细胞培养至汇合，并将2×10⁶个细胞经皮下接种到WT、OPN-KI和OPN-KO小鼠体内。每天监测小鼠的肿瘤生长情况。测量肿瘤大小并使用公式(宽×宽×长)/2计算体积。使用CO₂对动物实施安乐死，并小心分离通过心脏穿刺收集的血液和肿瘤。血液以2500rpm离心20分钟以制备血浆并储存在-80℃。对肿瘤进行称重和测量。部分肿瘤储存在甲醛中，用于免疫组织化学分析，部分冷冻并储存在-80℃，用于制备OPN ELISA的肿瘤裂解物。

达比加群酯(DE)治疗：对WT和OPN-KI小鼠口服DE(Boehringer Ingelheim，康涅狄格州里奇菲尔德)。按照前面描述的方案，DE以28.61g DE/kg的浓度掺入饲料中(Sparkenbaugh等人，2014)。简而言之，在经皮下接种2×10⁶个B16细胞前4天，小鼠被喂食含DE的饲料或匹配的对照饲料。每天监测动物，2周后处死。按上述方法测量并计算肿瘤重量和体积。在血浆制备前用3.8％柠檬酸钠收集血液并测定活化部分凝血活酶时间(aPTT)。

氯膦酸盐消耗吞噬细胞：每隔一天对WT、OPN-KI和OPN-KO小鼠经眶后注射150μl氯膦酸盐(5mg/ml)或对照脂质体(Clodrosome，田纳西州布伦特伍德)，以消耗吞噬细胞(Winkler等人，2010)。2剂氯膦酸盐后，经皮下接种2×10⁶个B16细胞。随后，隔天向小鼠给予氯膦酸盐或对照脂质体，持续2周，直至处死，并按上述方法处理小鼠的肿瘤。

组织学和免疫组织化学：

B16转移模型：将0.5×10⁶个B16细胞通过尾静脉注入小鼠体内。处死后，分离肺，计算两侧表面转移性结节的数量，然后分析左叶黑色素测定。在80℃下，将每只小鼠的肺左叶在1N NaOH/10％DMSO中培养2小时，然后在室温下以12,000rpm离心10分钟。测量上清液在470nm处的吸光度，并与合成黑色素标准品(Sigma，密苏里州圣路易斯)进行比较。过程开始前对肺进行称重，通过肺组织蛋白质分析黑色素含量表达为μg/mg蛋白质。

OPN ELISA：前文已经描述了用于检测总OPN、OPN-R和OPN-L的ELISA(Sharif等人，2009)。

细胞粘附分析：在20nM浓度的包被液中，用BSA或不同OPN片段包被96孔板的孔(Gibco Life Technologies，俄克拉荷马州兰利)，4℃下隔夜培养。用PBS洗涤孔板三次，然后用3％BSA阻断1小时。用含有0.2mM MnCl₂的1X HBSS洗涤细胞三次。将2×10⁶B16或RAW细胞加入孔中，并在37℃下培养1小时。洗涤孔，并用无水乙醇固定细胞20分钟，然后用0.1％结晶紫染色。用PBS反复洗涤细胞，直到看不见紫色，用0.5％Triton X-100裂解并在570nm处测定吸光度。

细胞生长分析：在无血清DMEM的12孔板上接种5×10⁴个B16细胞，沉降1小时。然后在培养基中加入OPN片段或BSA(10nM)。在37℃下培养24小时后，将细胞进行胰蛋白酶化，计数，通过归一化BSA细胞计数计算生长比率。

细胞凋亡分析：在存在BSA或OPN片段(10nM)的情况下，在无血清DMEM中隔夜培养1×10⁵个B16细胞，然后加入20μM喜树碱(Abcam，加利福尼亚州伯林盖姆)。然后将细胞培养4小时，再加入200μl结合缓冲液。将孔板以400g离心5分钟并弃去上清液。将Annexin V FITC染色剂(Cayman chemicals，密西根州安娜堡)添加到细胞中，并在室温黑暗条件下培养10分钟。按上述方法离心细胞，并在每个细胞中加入100μl结合缓冲液，并在485/535nm处测量荧光强度(激发/发射)。将喜树碱处理的细胞与未处理的细胞分开来计算凋亡指数。

细胞迁移分析：将10⁵个B16细胞放在6.5mm Transwell小室的上室中，孔径为8.0μm(Sigma，XX)。在下室充满BSA或各种OPN片段(10nM)之前，在0.2mM MnCl₂(Sigma，密苏里州圣路易斯)存在下，允许细胞沉降，并在37℃下培养24小时。将迁移到下室的细胞离心并在加入10μl CCK-8染色溶液(Dojindo Molecular Technologies公司，马里兰州罗克维尔)的90μl 1X HBSS(Gibco Life Technologies，俄克拉荷马州兰利)中重悬。将细胞培养2小时，然后在450nm处测量吸光度。

PGE₂分析：将5×10⁵个RAW细胞在无血清培养基中与BSA或各种OPN片段(10nM)一起接种到6孔板上。细胞隔夜培养，收集培养基，通过ELISA测定PGE₂(Enzo，纽约州法明代尔)。

白细胞的流式细胞术分析：分离肿瘤，称重并使用相似的重量进行处理。按照制造商说明书，用肿瘤组织解离试剂盒(Miltenyi Biotec)和带加热模块的gentleMACS Octo解离器(Miltenyi Biotec)解离肿瘤。解离后，用40mm过滤器过滤细胞悬液，然后使用ACK裂解缓冲液(Lonza，马里兰州沃克斯维尔)对细胞进行红细胞裂解。加入10倍(体积比)的含血清DMEM培养基来灭活裂解缓冲液。将细胞离心(300rcf，10分钟)，在FACS缓冲液(PBS+1％BSA)中轻轻重悬并计数。用CD16/32Fc阻断抗体阻断Fc 20分钟后，用CD45、CD206、CD11c、CD38、Gr-1、EGR-2、CD3、CD19、CD11b、F4/80、MHC II和Cytox绿色染料的抗体混合物(Jablonski等人，2015；Weichand等人，2017)或CD45、CD3、CD19和Cytox绿色染料的抗体混合物在4℃的黑暗环境中将10⁶个细胞染色30分钟。然后用FACS缓冲液再次洗涤细胞。使用补偿微球(Invitrogen，XX)和用单一抗体染色的样品作为对照。在流式细胞仪(BD LSR II)上分析细胞，并使用FlowJo(BD)进行数据分析。门控策略如图18所示。

参考文献

Akl,E.A.，Barba,M.，Rohilla,S.，Terrenato,I.，Sperati,F.，Muti,P.和Schunemann,H.J.(2008a)。抗凝对癌症患者静脉血栓栓塞的长期治疗。科克伦系统评价数据库，CD006650。

Akl,E.A.，Rohilla,S.，Barba,M.，Sperati,F.，Terrenato,I.，Muti,P.和Schunemann,H.J.(2008b)。抗凝对癌症患者静脉血栓栓塞的初步治疗。科克伦系统评价数据库，CD006649。

Akl,E.A.，van Doormaal,F.F.，Barba,M.，Kamath,G.，Kim,S.Y.，Kuipers,S.，Middeldorp,S.，Yosuico,V.，Dickinson,H.O.和Schunemann,H.J.(2008c)。肠胃外抗凝治疗可延长局限期小细胞肺癌患者的生存期：科克伦系统评价。《实验与临床癌症研究杂志》27，4。

Atai,N.A.，Bansal,M.，Lo,C.，Bosman,J.，Tigchelaar,W.，Bosch,K.S.，Jonker,A.，De Witt Hamer,P.C.，Troost,D.，McCulloch,C.A.等人(2011)。骨桥蛋白在胶质母细胞瘤中表达上调且与中性粒细胞和巨噬细胞浸润相关。《免疫学》132，39-48。

Cardones,A.R.，Murakami,T.和Hwang,S.T.(2003)。CXCR4通过β1整合素增强B16肿瘤细胞对体内外内皮细胞的粘附。《癌症研究》63，6751-6757。

Chiodoni,C.，Colombo,M.P.和Sangaletti,S.(2010)。基质细胞蛋白：从内体內稳态到炎症、癌症和转移。《癌症和转移评论》29，295-307。

Clemente,N.，Raineri,D.，Cappellano,G.，Boggio,E.，Favero,F.，Soluri,M.F.，Dianzani,C.，Comi,C.，Dianzani,U.和Chiocchetti,A.(2016)。骨桥蛋白连接自身免疫性疾病中的先天性免疫和适应性免疫。《免疫学研究杂志》2016，7675437。

Conway,C.，Mitra,A.，Jewell,R.，Randerson-Moor,J.，Lobo,S.，Nsengimana,J.，Edward,S.，Sanders,D.S.，Cook,M.，Powell,B.等人(2009)。DASL检测对石蜡包埋的原发性黑色素瘤基因表达谱分析发现骨桥蛋白表达的增加是无复发生存率降低的预测因素。《临床癌症研究》：美国癌症研究协会官方期刊15，6939-6946。

Coppola,D.，Szabo,M.，Boulware,D.，Muraca,P.，Alsarraj,M.，Chambers,A.F.和Yeatman,T.J.(2004)。多种肿瘤组织学中骨桥蛋白表达与病理分期的相关性研究。《临床癌症研究》：美国癌症研究协会官方期刊10，184-190。

Gordon,S.(2003)。巨噬细胞的替代激活。《自然评论免疫学》3，23-35。

Gordon,S.和Martinez,F.O.(2010)。巨噬细胞的替代激活：机制和功能。《免疫》32，593-604。

Graf,C.，Wilgenbus,P.，Pagel,S.，Pott,J.，Marini,F.，Reyda,S.，Kitano,M.，Macher-Goppinger,S.，Weiler,H.和Ruf,W.(2019)。骨髓细胞合成的凝血因子X可抑制抗肿瘤免疫。《科学免疫学》4。

Grassinger,J.，Haylock,D.N.，Storan,M.J.，Haines,G.O.，Williams,B.，Whitty,G.A.，Vinson,A.R.，Be,C.L.，Li,S.，Sorensen,E.S.等人(2009)。凝血酶裂解的骨桥蛋白通过与α9β1和α4β1整合素的相互作用调节造血干细胞和祖细胞的功能。《血液》114，49-59。

Hakoum,M.B.，Kahale,L.A.，Tsolakian,I.G.，Matar,C.F.，Yosuico,V.E.，Terrenato,I.，Sperati,F.，Barba,M.，Schunemann,H.和Akl,E.A.(2018)。抗凝对癌症患者静脉血栓栓塞的初步治疗。科克伦系统评价数据库1，CD006649。

Hayashi,C.，Rittling,S.，Hayata,T.，Amagasa,T.，Denhardt,D.，Ezura,Y.，Nakashima,K.和Noda,M.(2007)。血清骨桥蛋白(肿瘤骨转移增强子)可促进B16黑色素瘤的细胞迁移。《细胞生物化学杂志》101，979-986。

Herum,K.M.，Romaine,A.，Wang,A.，Melleby,A.O.，Strand,M.E.，Pacheco,J.，Braathen,B.，Duner,P.，Tonnessen,T.，Lunde,I.G.等人(2020)。多配体蛋白聚糖4(Syndecan-4)保护心脏免受凝血酶裂解的骨桥蛋白带来的促纤维化影响。《美国心脏协会期刊》9，e013518。

Hisada,Y.和Mackman,N.(2019)。癌细胞来源的组织因子阳性细胞外囊泡：血栓形成与生存的生物标志物。《当代血液学观点》26，349-356。

Ito,M.，Hiramatsu,H.，Kobayashi,K.，Suzue,K.，Kawahata,M.，Hioki,K.，Ueyama,Y.，Koyanagi,Y.，Sugamura,K.，Tsuji,K.等人(2002)。NOD/SCID/γ(c)(null)小鼠：用于人类细胞移植的优秀受体小鼠模型。《血液》100，3175-3182。

Jablonski,K.A.，Amici,S.A.，Webb,L.M.，Ruiz-Rosado Jde,D.，Popovich,P.G.，Partida-Sanchez,S.和Guerau-de-Arellano,M.(2015)。描述鼠科M1和M2巨噬细胞的新标记物。《公共科学图书馆·综合》(PLoS One)10，e0145342。

Kahale,L.A.，Hakoum,M.B.，Tsolakian,I.G.，Matar,C.F.，Terrenato,I.，Sperati,F.，Barba,M.，Yosuico,V.E.，Schunemann,H.和Akl,E.A.(2018)。抗凝对癌症患者静脉血栓栓塞的长期治疗。科克伦系统评价数据库6，CD006650。

Kale,S.，Raja,R.，Thorat,D.，Soundararajan,G.，Patil,T.V.和Kundu,G.C.(2014)。骨桥蛋白信号传导上调肿瘤相关巨噬细胞中环氧合酶-2的表达，从而通过α9β1整合素促进血管生成和黑色素瘤生长。《致癌基因》33，2295-2306。

Kale,S.，Raja,R.，Thorat,D.，Soundararajan,G.，Patil,T.V.和Kundu,G.C.(2015)。骨桥蛋白信号传导上调肿瘤相关巨噬细胞中环氧合酶-2的表达，从而通过α9β1整合素促进血管生成和黑色素瘤生长。《致癌基因》34，5408-5410。

Katagiri,Y.U.，Murakami,M.，Mori,K.，Iizuka,J.，Hara,T.，Tanaka,K.，Jia,W.Y.，Chambers,A.F.和Uede,T.(1996)。骨桥蛋白的非RGD结构域促进细胞粘附，但不涉及αv整合素。《细胞生物化学杂志》62，123-131。

Kawahara,K.，Hohjoh,H.，Inazumi,T.，Tsuchiya,S.和Sugimoto,Y.(2015)。前列腺素E2诱导的炎症：前列腺素E受体的相关性。《生物化学与生物物理学报》1851，414-421。

Kirszberg,C.，Lima,L.G.，Da Silva de Oliveira,A.，Pickering,W.，Gray,E.，Barrowcliffe,T.W.，Rumjanek,V.M.和Monteiro,R.Q.(2009)。组织因子表达和磷脂酰丝氨酸暴露共同促进黑色素瘤细胞系的高促凝血模式。《黑素瘤研究》19，301-308。

Komohara,Y.，Fujiwara,Y.，Ohnishi,K.和Takeya,M.(2016)。肿瘤相关巨噬细胞：抗癌治疗的潜在治疗靶点。《先进药物输送评论》99，180-185。

Kothari,A.N.，Arffa,M.L.，Chang,V.，Blackwell,R.H.，Syn,W.K.，Zhang,J.，Mi,Z.和Kuo,P.C.(2016)。骨桥蛋白——上皮间质转化的主调节因子。《临床医学杂志》5。

Kumar,S.，Sharma,P.，Kumar,D.，Chakraborty,G.，Gorain,M.和Kundu,G.C.(2013)。基质骨桥蛋白在黑色素瘤进展和转移中的功能特征分析。《公共科学图书馆·综合》(PLoS One)8，e69116。

Lamort,A.S.，Giopanou,I.，Psallidas,I.和Stathopoulos,G.T.(2019)。骨桥蛋白是炎症和癌症之间的联系：聚焦胸部。《细胞》8。

Leung,L.L.K.和Morser,J.(2018)。羧肽酶B2和羧肽酶N在凝血、血栓形成、炎症和先天性免疫之间的信息交互作用。《血栓与凝血杂志》16，1474-1486。

Lima,L.G.和Monteiro,R.Q.(2013)。癌症中凝血功能的激活：对肿瘤进展的影响。

《生物科学报告》33。

Lucotti,S.，Cerutti,C.，Soyer,M.，Gil-Bernabe,A.M.，Gomes,A.L.，Allen,P.D.，Smart,S.，Markelc,B.，Watson,K.，Armstrong,P.C.等人(2019)。阿司匹林通过抑制血小板源性COX-1/血栓素A2阻断转移性血管生态位的形成。《临床研究杂志》129，1845-1862。

Lund,S.A.，Giachelli,C.M.和Scatena,M.(2009)。骨桥蛋白在炎症过程中的作用。《细胞通讯与信号》3，311-322。

Mantovani,A.和Sica,A.(2010)。巨噬细胞、先天性免疫和癌症：平衡性、耐受性和多样性。《当代免疫学观点》22，231-237。

Matar,C.F.，Kahale,L.A.，Hakoum,M.B.，Tsolakian,I.G.，Etxeandia-Ikobaltzeta,I.，Yosuico,V.E.，Terrenato,I.，Sperati,F.，Barba,M.，Schunemann,H.等人(2018)。抗凝治疗用于癌症患者的围手术期血栓预防。科克伦系统评价数据库7，CD009447。

McAllister,S.S.，Gifford,A.M.，Greiner,A.L.，Kelleher,S.P.，Saelzler,M.P.，Ince,T.A.，Reinhardt,F.，Harris,L.N.，Hylander,B.L.，Repasky，E.A.等人(2008)。惰性肿瘤生长的全身内分泌刺激需要骨桥蛋白。《细胞》133，994-1005。

Mills,C.D.(2012)。M1和M2巨噬细胞：健康和疾病的预兆。《免疫学评论》32，463-488。

Myles,T.，Nishimura,T.，Yun,T.H.，Nagashima,M.，Morser,J.，Patterson,A.J.，Pearl,R.G.和Leung,L.L.(2003)。凝血酶激活纤溶抑制物——血管炎症的潜在调节因子。《生物化学杂志》278，51059-51067。

Natoli,G.和Monticelli,S.(2014)。巨噬细胞的激活：聚焦多样性。《免疫》40，175-177。

Nemoto,H.，Rittling,S.R.，Yoshitake,H.，Furuya,K.，Amagasa,T.，Tsuji,K.，Nifuji,A.，Denhardt,D.T.和Noda,M.(2001)。骨桥蛋白缺乏可减少实验性肿瘤细胞向骨和软组织的转移。《骨与矿物研究杂志》16，652-659。

Netea-Maier,R.T.，Smit,J.W.A.和Netea,M.G.(2018)。肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞的代谢变化：相互关系。《癌症快讯》413，102-109。

Niers,T.M.，Bruggemann,L.W.，GL,V.A.N.S.，Liu,R.D.，Versteeg,H.H.，Buller,H.R.，CJ,V.A.N.N.，Reitsma,P.H.，Spek,C.A.和Richel,D.J.(2009)。长期的凝血酶抑制可促进实验性转移小鼠模型中的癌细胞外渗。《血栓与凝血杂志》7，1595-1597。

O'Rorke,M.A.，Murray,L.J.，Hughes,C.M.，Cantwell,M.M.和Cardwell,C.R.(2015)。华法林治疗对乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌和前列腺癌生存率的影响：一项应用临床实际研究数据链的以人群为基础的队列研究。《癌症成因和控制：CCC》26，355-366。

Ohyama,Y.，Nemoto,H.，Rittling,S.，Tsuji,K.，Amagasa,T.，Denhardt,D.T.，Nifuji,A.和Noda,M.(2004)。骨桥蛋白缺乏可抑制植入骨骼的B16黑色素瘤细胞生长及混合培养的破骨细胞生成。《骨与矿物研究杂志》：美国骨与矿物质研究协会官方期刊19，1706-1711。

Qian,B.Z.和Pollard,J.W.(2010)。巨噬细胞多样性可促进肿瘤的进展与转移。《细胞》141，39-51。

Rittling,S.R.和Singh,R.(2015)。骨桥蛋白在免疫介导疾病中的作用。《牙科研究杂志》94，1638-1645。

Ruf,W.，Rothmeier,A.S.和Graf,C.(2016)。癌症治疗中的靶向凝血蛋白——进展和挑战。《血栓形成研究》140增刊1，S1-7。

Sangaletti,S.，Tripodo,C.，Sandri,S.，Torselli,I.，Vitali,C.，Ratti,C.，Botti,L.，Burocchi,A.，Porcasi,R.，Tomirotti,A.等人(2014)。骨桥蛋白在转移生态位中形成免疫抑制。《癌症研究》74，4706-4719。

Schuliga,M.(2015)。凝血剂和纤溶活性蛋白酶在疾病中的炎症作用。《炎症介质》2015，437695。

Shao,Z.，Morser,J.和Leung,L.L.(2014)。骨桥蛋白的凝血酶切割破坏树突状细胞的前趋化序列，通过释放序列的前趋化C端片段对其进行补偿。《生物化学杂志》289，27146-27158。

Sharif,S.A.，Du,X.，Myles,T.，Song,J.J.，Price,E.，Lee,D.M.，Goodman,S.B.，Nagashima,M.，Morser,J.，Robinson,W.H.等人(2009)。骨桥蛋白的凝血酶激活羧肽酶B切割可调节类风湿性关节炎中的中性粒细胞存活和滑膜细胞结合。《关节炎和风湿病》60，2902-2912。

Shevde,L.A.和Samant,R.S.(2014)。骨桥蛋白在癌症病理生理学中的作用。《基质生物学》：国际基质生物学学会杂志37，131-141。

Sodek,J.，Ganss,B.和McKee,M.D.(2000)。骨桥蛋白。《口腔生物医学与医学鉴定性评论》11，279-303。

Sparkenbaugh,E.M.，Chantrathammachart,P.，Mickelson,J.，van Ryn,J.，Hebbel,R.P.，Monroe,D.M.，Mackman,N.，Key,N.S.和Pawlinski,R.(2014)。FXa和凝血酶对镰状细胞病小鼠模型中血管炎症的不同促进作用。《血液》123，1747-1756。

Toda,M.，Shao,Z.，Yamaguchi,K.D.，Takagi,T.，D'Alessandro-Gabazza,C.N.，Taguchi,O.，Salamon,H.，Leung,L.L.，Gabazza,E.C.和Morser,J.(2013)。血栓调节蛋白(TM；CD141)(+)和TM(-)树突状细胞亚群的差异基因表达。《公共科学图书馆·综合》(PLoSOne)8，e72392。

Uede,T.(2011)。骨桥蛋白——顽固性炎症性疾病的内在组织调节因子。《病理学国际》61，265-280。

Van Rooijen,N.和Sanders,A.(1994)。脂质体介导的巨噬细胞耗竭：脂质体的作用机制、制备及应用。《免疫学方法杂志》174，83-93。

Wang,K.X.和Denhardt,D.T.(2008)。骨桥蛋白：在免疫调节和应激反应中的作用。《细胞因子与生长因子评论》19，333-345。

Wei,J.，Marisetty,A.，Schrand,B.，Gabrusiewicz,K.，Hashimoto,Y.，Ott,M.，Grami,Z.，Kong,L.Y.，Ling,X.，Caruso,H.等人(2019)。骨桥蛋白可介导胶质母细胞瘤相关的巨噬细胞浸润并为潜在的治疗靶点。《临床研究杂志》129,137-149。

Weichand,B.，Popp,R.，Dziumbla,S.，Mora,J.，Strack,E.，Elwakeel,E.，Frank,A.C.，Scholich,K.，Pierre,S.，Syed,S.N.等人(2017)。肿瘤相关巨噬细胞上的S1PR1通过NLRP3/IL-1β促进淋巴管生成与转移。《实验医学杂志》214，2695-2713。

Weiss，J.M.，Renkl,A.C.，Maier,C.S.，Kimmig,M.，Liaw,L.，Ahrens,T.，Kon,S.，Maeda,M.，Hotta,H.，Uede,T.等人(2001)。骨桥蛋白通过诱导郎格罕细胞和树突状细胞向淋巴结迁移，参与皮肤接触性超敏反应的发生。《实验医学杂志》194，1219-1229。

Winkler,I.G.，Sims,N.A.，Pettit,A.R.，Barbier,V.，Nowlan,B.，Helwani,F.，Poulton,I.J.，van Rooijen,N.，Alexander,K.A.，Raggatt,L.J.等人(2010)。骨髓巨噬细胞可维持造血干细胞(HSC)生态位且其耗竭可调动HSC。《血液》116，4815-4828。

Wojtukiewicz,M.Z.，Hempel,D.，Sierko,E.，Tucker,S.C.和Honn,K.V.(2015)。蛋白酶激活受体(PAR)——在癌症侵袭和转移中的作用方式及作用。《癌症和转移评论》34，775-796。

Xue,J.，Schmidt,S.V.，Sander,J.，Draffehn,A.，Krebs,W.，Quester,I.，DeNardo,D.，Gohel,T.D.，Emde,M.，Schmidleithner,L.等人(2014)。基于转录组的网络分析揭示人巨噬细胞激活的谱系模型。《免疫》40，274-288。

Yamaguchi,Y.，Shao,Z.，Sharif,S.，Du,X.Y.，Myles,T.，Merchant,M.，Harsh,G.，Glantz,M.，Recht,L.，Morser,J.等人(2013)。骨桥蛋白的凝血酶裂解片段在恶性胶质肿瘤中过度表达并提供具有生存优势的分子生态位。《生物化学杂志》288，3097-3111。

Yokosaki,Y.，Matsuura,N.，Sasaki,T.，Murakami,I.，Schneider,H.，Higashiyama,S.，Saitoh,Y.，Yamakido,M.，Taooka,Y.和Sheppard,D.(1999)。整合素α9β1与骨桥蛋白凝血酶裂解的氨基末端片段中新识别序列(SVVYGLR)的结合。《生物化学杂志》274，36328-36334。

Zhao,H.，Chen,Q.，Alam,A.，Cui,J.，Suen,K.C.，Soo,A.P.，Eguchi,S.，Gu,J.和Ma,D.(2018)。骨桥蛋白在实体器官肿瘤进展中的作用。《细胞死亡及疾病》9，356。

示例2

凝血酶抑制剂和B-RAF抑制剂联合疗法治疗黑色素瘤

在小鼠黑色素瘤模型(B16细胞植入或转移)中，骨桥蛋白(OPN)基因突变的小鼠具有较小的植入肿瘤和较少的转移，使OPN对凝血酶产生抗性(示例1)。这意味着肿瘤生长取决于凝血酶。这一点可以通过用凝血酶抑制剂达比加群酯(DE)治疗WT小鼠得到证实，表明了在DE存在的情况下，WT小鼠的B16肿瘤生长较慢，产生与OPN-KI和OPN-KO小鼠相似的结果。因此，凝血抑制剂(优选直接凝血酶抑制剂，如达比加群酯)与B-Raf抑制剂(如达拉菲尼或维莫非尼)的组合可用于治疗黑色素瘤。达拉菲尼靶向具有突变(V600E/K)的B-Raf基因。

目前，一些黑色素瘤患者接受B-Raf抑制剂达拉非尼和MEK抑制剂曲美替尼的组合治疗。在该组合中添加凝血酶抑制剂也可能改善预后，并将其添加到只接受曲美替尼的黑色素瘤患者的治疗中。此外，可以使用其他抑制因子Xa或因子XIa的直接口服抗凝血剂以及肝素或香豆素来代替凝血酶抑制剂。

序列表

<110> 小利兰·斯坦福大学董事会

退伍军人事务部所代表的美国政府

<120> 癌症联合疗法

<130> STAN-1657WO

<150> 63/059,673

<151> 2020-07-31

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NeoPCRF1寡核苷酸

<220>

<221> 来源

<222> (1)..(28)

<223> 序列是合成的

<400> 1

ggtttccaaa tgtgtcagtt tcatagcc 28

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> StanfordU2 3R寡核苷酸

<220>

<221> 来源

<222> (1)..(28)

<223> 序列是合成的

<400> 2

tctgaaacat agttccctaa gacatcag 28

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> StanfordU2 5cko寡核苷酸

<220>

<221> 来源

<222> (1)..(25)

<223> 序列是合成的

<400> 3

atcatcaatg cttagccaag ccaag 25

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 隐式整合素结合位点

<400> 4

Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg

1 5

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OPN-FL

<400> 5

Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe

1 5 10 15

Arg Arg

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OPN-R

<400> 6

Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg

1 5 10

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OPN-CTF

<400> 7

Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OPN-L

<400> 8

Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu

1 5

Claims (23)

1.一种治疗骨桥蛋白(OPN)相关癌症的方法，所述方法包括向有需要受试者联合给予治疗有效用量的抗凝血剂与治疗有效用量的B-Raf抑制剂或丝裂原活化蛋白激酶(MEK)抑制剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗凝血剂是一种直接凝血酶抑制剂。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述凝血酶抑制剂选自达比加群酯、阿加曲班、伊诺加群、美拉加群、希美加群、水蛭素、比伐卢定、来匹卢定和地西卢定。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述B-Raf抑制剂选自达拉非尼、维莫非尼、索拉非尼、LGX818、GDC-0879和PLX-4720。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述抗凝血剂与治疗有效用量的B-Raf和治疗有效用量的MEK抑制剂联合给药。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述MEK抑制剂选自曲美替尼、考比替尼、比尼替尼、司美替尼和PD-325901。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述抗凝血剂、所述B-Raf抑制剂或所述MEK抑制剂根据每日给药方案给药或间歇给药。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，在足以产生至少部分肿瘤反应的时间段内，对受试者进行多个周期的治疗。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述时间段至少为6个月。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述时间段至少为12个月。

11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中，实现完全肿瘤反应。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述抗凝血剂或所述B-Raf抑制剂经口、静脉或局部给药。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述OPN相关癌症为黑色素瘤。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述黑色素瘤是B-RAF突变黑色素瘤。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述B-RAF突变黑色素瘤包括V600E突变或V600K突变。

16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中，所述黑色素瘤为转移性。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人类。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，所述抗凝血剂是因子Xa抑制剂。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述因子Xa抑制剂选自利伐沙班(拜瑞妥)、阿哌沙班(艾乐妥)、贝曲沙班、达瑞沙班(YM150)、依度沙班(里先安)、奥米沙班、利他沙班(TAK-442)、艾立沙班、安替斯塔辛、华法林、肝素和磺达肝癸钠。

20.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，所述抗凝血剂是因子XIa抑制剂。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述因子XIa抑制剂选自BMS-262084((2S,3R)-1-[4-(叔丁基氨基甲酰基)哌嗪-1-羰基]-3-[3-(二氨基亚甲基氨基)丙基]-4-氮杂环丁酮-2-羧酸)、BMS-724296、BMS-654457(2-[3-[(2S,4R)-6-甲脒基-4-甲基-4-苯基-2,3-二氢-1H-喹啉-2-基]-5-(3-甲基丁酰氨基)苯基]-5-邻甲酰胺苯甲酸)、BMS-986177((9R,13S)-13-[4-[5-氯代-2-(4-氯三唑-1-基)苯基]-6-氧嘧啶-1-基]-3-(二氟甲基-9-甲基-3,4,7,15-四氮三环[12.3.1.02,6]十八-1(18),2(6),4,14,16-戊烷-8-酮)、EP-7041((2S,3R)-3-([2-氨基吡啶-4-基]甲基)-1-([{1R}-1-环己基乙基]氨基甲酰)-4-氮杂环丁酮-2-羧酸)、基于酮精氨酸的拟肽物、clavatadine、芳基硼酸和含环状精氨酸的酮噻唑拟肽物。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，进一步包括给予其他抗癌治疗剂。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述其他抗癌治疗剂是化疗剂、免疫治疗剂、生物治疗剂、激素治疗剂、促凋亡剂、血管生成抑制剂、光敏剂、放射增敏剂和放射性同位素。

Images