DE69735376T2 - Fusionsproteine, die stressproteine beinhalten, zum hervorrufen einer immunantwort - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Influenza verursachenden Viren wurden willkürlich als Influenza Typ A, B und C bezeichnet. Diese Typen definieren bezüglich der Antigeneigenschaften verschiedene Viren. Jeder Typ hat einige unterschiedliche Subtypen. Viren innerhalb eines Typs sind in dem Sinne genetisch kompatibel, dass mit zwei verschiedenen Subtypen infizierte Zellen gemischte Viren zusammensetzen können, welche Komponenten von beiden Subtypen enthalten. Influenzaviren werden als Orthomyxoviren klassifiziert. Die Viren bilden Partikel zwischen 80 und 120 nm Durchmesser. Influenzaviren sind umhüllte Viren, das heißt, ihre äußere Oberfläche ist von der Wirtszellmembran abgeleitet. In die Hülle eingefügt und aus ihr hervorragend sind zwei bedeutende viral codierte Proteine, Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA). Influenzaviren sind Minusstrang-RNA-Viren, welche ein Genom enthalten, das aus 8 RNA-Segmenten mit nicht-Messenger-RNA-Polarität aufgebaut ist. Die genomischen RNA-Segmente sind in RNP-Komplexen mit viral codiertem Nucleoprotein (NP) zusammengesetzt. Der Infektion einer Wirtszellen folgend werden genomische RNA-Segmente zuerst in RNAs mit einer Messenger-RNA-Polarität transkribiert, welche später revers transkribiert werden, um genomische RNA zu erzeugen. Den Transkriptaseaktivitäten, welche für diese Schritte verantwortlich sind, fehlt die Fähigkeit zum Korrekturlesen. Fehler, welche während der Transkription und der reversen Transkription gemacht werden, werden deshalb nicht repariert, was zu einer hohen Frequenz von Mutationen des viralen Genoms führt. Während alle viralen Gene dem gleichen Mutationsprozess unterliegen, unterliegen insbesondere die Gene für die externen Proteine HA und NA starken Selektionsprozessen, welche ihre Evolution in Richtung von mutierten Formen treiben, welche der immunologischen Entdeckung in ihren Wirten entgehen. Wirte schließen nicht nur Menschen, sondern auch Tiere wie Huhn, Truthahn, Schwein und Pferd ein.
  • Influenza war traditionell eine der führenden Ursachen für den Tod von Menschen. Die klinischen Zeichen der Influenza sind variabel und reichen von der asymptomatischen bis zur tödlichen Infektion. Typischerweise setzt die Erkrankung schnell ein und macht bettlägerig und wird fast ausnahmslos von Husten, Unwohlsein, Kopfschmerzen und Muskelschmerzen begleitet. Schnupfen, Halsschmerz und weniger häufig substernaler Schmerz zeigen ebenfalls an, dass der Hauptsitz der Infektion das Atmungssystem ist. Typischerweise herrschen jedoch Fieber und systemische Symptome vor. Die Erholung ist typischerweise schnell. Die Schwere der Erkrankung ist größtenteils vom Wirt abhängig und steht in Beziehung mit dem Alter, dem physiologischen Zustand und vorangehender Immunisierung durch Infektion oder Immunisierung. Eine schwere Komplikation ist die Lungenentzündung. Beeinträchtigte Individuen sind anfällig dafür sekundäre Infektionen mit bakteriellen Krankheitserregern zu erleiden, welche Lungenentzündungen verursachen. Die meisten Patienten, welche in Folge einer Influenza sterben, sterben mit einer bakteriellen Lungenentzündung. Geringgradige Antigenvariationen in den Influenzavirustypen A und B treten jährlich auf, was regionale Epidemien verursacht. Die jährliche Todesrate aus solchen jährlichen Epidemien kann alleine in den Vereinigten Staaten 20000 erreichen. In variablen Abständen zwischen 10 und 30 Jahren treten globale Pandemien mit Zahlen von Todesopfern auf, die jene der jährlichen Epidemien weit übertreffen. Diese Pandemien werden wahrscheinlich durch eine genetische Umordnung von Komponenten aus menschlichen und tierischen Influenza A-Viren, was zu einem neuen Virus mit einer für die menschliche Erfahrung völlig fremden Oberflächenstruktur führt, verursacht. Die Zahl an Todesopfern der Pandemie von 1918-19 betrug etwa 500000 getötete Amerikaner. (Als allgemeine Quelle: Joshua Lederberg, Encyclopedia of Microbiology, 2 (D-L) (1992): 505-520, Academic Press Inc., San Diego, CA 92101).
  • Zur Zeit zugelassene Impfstoffe schließen inaktiviertes aufgereinigtes Virus ein. Die Impfstoffe sind trivalent und schließen repräsentative Stämme der zwei vorherrschenden A-Subtypen H3N2 und H1Ni und einen einzelnen Typ B-Stamm ein. Attenuierte Lebendvirusimpfstoffe wurden auch mit einigem Erfolg verwendet, insbesondere in der früheren Sowjetunion. HA und NA enthaltende Untereinheiten-Impfstoffe (Split Flu Vaccine; Connaught Lab.) wurden entwickelt. Diese Impfstoffe sind nicht vollständig wirksam zur Bereitstellung einer schützenden Immunität. Es ist im Allgemeinen akzeptiert, dass Influenzaimpfstoffe eine schützende Immunität hauptsächliche durch die Auslösung von Antikörperantworten gegen die viralen Oberflächenproteine HA und NA erzeugen. Dies könnte erklären, warum die Impfstoffe nur unvollständig wirksam sind; sie sind anfällig für die anhaltende Variation der Antigeneigenschaften bei diesen Oberflächenproteinen.
  • Die Suche nach Unterschieden zwischen Tumorzellen und normalen Zellen hat zur Isolierung und Charakterisierung einer Menge von sogenannten tumorassoziierten Antigenen geführt (Henderson R. A. und Finn O. J., Advances in Immunology, 62 (1996): 217-256). Diese Antigene werden von Tumorzellen exprimiert, aber überhaupt nicht oder nicht in großen Mengen von voll differenzierten Zellen. Die diese Tumorantigene codierenden Sequenzen sind entweder von Viren abgeleitet oder normalerweise im Genom des Wirts vorhanden. Ein Beispiel für ein von Viren abgeleitetes, tumorassoziiertes Antigen ist das transformierende Protein E7 des menschlichen Papillomavirus, welches in den meisten Cervixtumoren des Menschen vorhanden ist. Ein typisches aus dem Genom des Wirtes abgeleitetes, tumorassoziiertes Antigen ist gp 100, auch bezeichnet als pMel-17, welches in vielen menschlichen Melanomen exprimiert wird. Während von tumorassoziierte Antigenen bekannt ist, dass sie eine Immunantwort des Wirts auslösen, ist die Antwort typischerweise nicht ausreichend, um therapeutisch wirksam zu sein. Es besteht ein Bedarf für Ansätze zur Anregung dieser Antwort.
  • Unter Verwendung von monospezifischen cytotoxischen T-Lymphocyten (CTL)-Clonen wurde die Expression von wenigstens fünf tumorassoziierten Antigenen, bezeichnet als A, B, C, D und E, in P815-Mastocytomtumorzellen der Maus aufgezeigt. Eines dieser Antigene, bezeichnet als P1A, exprimiert ein einzelnes Epitop, welches von CTL-Clonen erkannt wird. Unter Verwendung eines molekularen Ansatzes wurde das Gen für P1A cloniert und von ihm wurde herausgefunden, dass es nicht mutiertes Gen ist, welches in normalen Zellen vorhanden ist, aber nur in transformierten Zellen transkribiert und translatiert wird (Van den Eynde et al., J. Exp. Med. 173 (1991): 1373). Weiterhin war es durch Untersuchung von Varianten von P815-Zellen, welche die Expression des P1A- Antigens verloren hatten, möglich die Sequenz des MHC-Klasse I (Ld)-restringierten minimalen CTL-Epitops von P1A zu identifizieren (Lethe et al., Eur. J. Immunol. 22 (1992): 2283).
  • Barios et al., Eur. J. Immunol. (22 (1992): 1365-1372) offenbart ein Konjugat von einem Peptid und einem Hitzeschockprotein, wobei das Konjugat durch Vermischen zweier Proteine in der Anwesenheit von Glutaraldehyd, einem quervernetzenden Wirkstoff, gemäß Standardvorgehensweisen hergestellt wurde.
  • Srivastava und Udono, Current Opin. Immunol. (6 (1994): 728-232) offenbart nicht-kovalente Komplexe von HSPs und Antigenen, welche aus Tumoren isoliert wurden.
  • WO 94/29459 (Young) offenbart ein Fusionsprotein, welches HSP70 und ein HIV-Antigen enthält.
  • WO 95/24923 (Srivastava et al.) offenbart Stressprotein-Peptid-Komplexe.
  • WO 94/03208 (Cohen et al.) offenbart verschiedene Kombinationen eines ein T-Zell-Epitop enthaltenden Fragmentes des menschlichen hsp60-Proteins und eines schwach immunogenen Antigens, nämlich eines Polysaccharids.
  • WO 97/06821 betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Auslösung einer Immunantwort in einem Individuum, wobei dem Individuum wenigstens ein Hitzeschockprotein in Kombination mit einem oder mehreren definierten Zielantigenen verabreicht wird.
  • WO 97/26910 offenbart eine Zusammensetzung umfassend Tumorzellen, in welche ein ein Hitzeschockprotein codierendes Gen eingefügt wurde, oder Tumorantigene, welche an ein Hitzeschockprotein gebunden waren. Es wird beachtet werden, dass dieses Dokument kein Fusionsprotein offenbart.
  • Somit besteht ein Bedarf für wirksamere Impfstoffe gegen mit Viren und Tumoren assoziierte Antigene.
  • Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird ein wie in Anspruch 1 definiertes Fusionsprotein bereitgestellt.
  • Das Stressprotein zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel ein mycobakterielles Stressprotein (zum Beispiel hsp65, hsp71) oder ein Stressprotein, welches eine Aminosäuresequenz hat, die zur Aminosäuresequenz des mycobakteriellen Stressproteins ausreichend homolog ist, um die Immunantwort gegen das Antigen in dem Säuger, an den es verabreicht wird, auszulösen. Der Impfstoff zur Auslösung einer zellvermittelten cytolytischen Immunantwort gegen ein Antigen in einem Säuger kann auch ein Polynucleotid umfassen, welches ein Antigen und eine Stressproteinsequenz in einem Säuger codiert und deren Expression steuert. Das Polynucleotid kann das Antigen und das Stressprotein als ein Fusionsprotein exprimieren.
  • In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Impfstoff zur Auslösung einer zellvermittelten cytolytischen Immunantwort gegen ein Antigen eines Influenzavirus in einem Säuger, umfassend ein Polynucleotid, welches die Expression des Antigens des Influenzavirus und eines Stressproteins in einem Säuger steuert. Das Antigen des Influenzavirus, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, schließt zum Beispiel Hämagglutinin, Nucleoprotein, Neuraminidase, M1, M2, PB1, PB2, PA und eine Kombination davon ein.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch wie in Anspruch 15 definierte Zusammensetzungen, umfassend ein Stressprotein und ein Antigen eines Influenzavirus. In einer Ausführungsform ist die Zusammensetzung ein Fusionsprotein (pET65MP/NP-B und pET65M/NP-D), umfassend ein an ein Antigen des Influenzavirus fusioniertes Stressprotein.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der Zusammensetzungen zur Vorbeugung oder Behandlung von Influenzavirus in einem Säuger.
  • Ein Impfstoff zur Auslösung einer zellvermittelten cytolytischen Immunantwort gegen ein tumorassoziiertes Antigen in einem Säuger wird auch offenbart, worin der Impfstoff ein tumorassoziiertes Antigen verbunden mit dem gesamten oder einem Teil eines Stressproteins oder dem gesamten oder einem Teil eines Proteins, welches eine Aminosäuresequenz hat, die zur Aminosäuresequenz des Stressproteins ausreichend homolog ist, um die Immunantwort gegen das Antigen auszulösen, umfasst. Das Antigen, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, umfasst jegliches tumorassoziierte Antigen eines Säugers, einschließlich jener, welche zur Zeit im Fachgebiet bekannt sind. Es schließt auch Fragmente dieser Antigene ein, welche ein CTL-Epitop enthalten.
  • Weiterhin wird der Impfstoff zur Auslösung einer zellvermittelten cytolytischen Immunantwort gegen ein tumorassoziiertes Antigen in einem Säuger offenbart, welcher ein Polynucleotid ist, das in einer exprimierbaren Form Sequenzen enthält, welche ein tumorassoziiertes Antigen und das gesamte oder einen Teil eines Stressproteins oder das gesamte oder einen Teil eines Proteins, welches eine Aminosäuresequenz hat, welche ausreichend homolog zu der Aminosäuresequenz des Stressproteins ist, um die Immunantwort gegen das Antigen auszulösen, codieren.
  • Auch wird der Impfstoff zur Auslösung einer zellvermittelten cytolytischen Immunantwort gegen ein tumorassoziiertes Antigen in einem Säuger offenbart, welcher auch ein Polynucleotid sein kann, welches ein rekombinantes Fusionsprotein codiert, welches ein tumorassoziiertes Antigen und das gesamte oder einen Teil eines Stressproteins oder das gesamte oder einen Teil eines Proteins, welches eine Aminosäuresequenz hat, welche ausreichend homolog zur Aminosäuresequenz des Stressproteins ist, um die Immunantwort gegen das Antigen auszulösen, einschließt.
  • Es werden auch Impfstoffe zur Unterdrückung allergischer Immunantworten gegen natürliche oder künstliche Antigene (Allergene) in einem Säuger offenbart, worin die Impfstoffe ein Allergen und das gesamte oder einen Teil eines Stressproteins oder das gesamte oder einen Teil eines Proteins, welches eine Aminosäuresequenz hat, welche ausreichend homolog zur Aminosäuresequenz des Stressproteins ist, um die allergischen Antworten zu unterdrücken, einschließt. Jedes Allergen, gleichgültig ob es peptidartig ist oder nicht, kann verwendet werden.
  • Weiterhin wird der Impfstoff zur Unterdrückung allergischer Immunantworten gegen natürliche oder künstliche Antigene (Allergene) in einem Säuger offenbart, worin ein Allergen chemisch an das gesamte oder einen Teil eines Stressproteins oder das gesamte oder einen Teil eines Proteins, welches eine Aminosäuresequenz hat, welche ausreichend homolog zur Aminosäuresequenz des Stressproteins ist, um die allergischen Antworten zu unterdrücken, konjugiert ist.
  • In einer anderen offenbarten, aber nicht beanspruchten Ausführungsform ist der Impfstoff zur Unterdrückung allergischer Immunantworten gegen natürliche oder künstliche Antigene (Allergene) in einem Säuger ein rekombinantes Fusionsprotein, welches ein Allergen und das gesamte oder einen Teil eines Stressproteins oder das gesamte oder einen Teil eines Proteins, welches eine Aminosäuresequenz hat, welche ausreichend homolog zur Aminosäuresequenz des Stressproteins ist, um die allergischen Antworten zu unterdrücken, einschließt.
  • In einer weiteren offenbarten, aber nicht beanspruchten Ausführungsform ist der Impfstoff zur Unterdrückung allergischer Immunantworten gegen natürliche oder künstliche Antigene (Allergene) in einem Säuger ein Polynucleotid, welches Sequenzen in exprimierbarer Form enthält, welche ein peptidartiges Allergen und das gesamte oder einen Teil eines Stressproteins oder das gesamte oder einen Teil eines Proteins, welches eine Aminosäuresequenz hat, welche ausreichend homolog zur Aminosäuresequenz des Stressproteins ist, um die allergischen Antworten zu unterdrücken, codieren.
  • In noch einer weiteren offenbarten, aber nicht beanspruchten Ausführungsform kann der Impfstoff zur Unterdrückung allergischer Immunantworten gegen natürliche oder künstliche Antigene (Allergene) in einem Säuger auch ein Polynucleotid sein, welches ein rekombinantes Fusionsprotein codiert, welches ein peptidartiges Allergen und das gesamte oder einen Teil eines Stressproteins oder das gesamte oder einen Teil eines Proteins, welches eine Aminosäuresequenz hat, welche ausreichend homolog zur Aminosäuresequenz des Stressproteins ist, um die allergischen Antworten zu unterdrücken, einschließt.
  • Es wird auch eine Zusammensetzung zur Unterdrückung einer Th2-Antwort gegen ein Antigen in einem Säuger offenbart, umfassend das Antigen und das gesamte oder einen Teil eines Stressproteins oder das gesamte oder einen Teil eines Proteins, welches eine Aminosäuresequenz hat, welche ausreichend homolog zur Aminosäuresequenz des Stressproteins ist, um die Th2-Antwort gegen das Antigen zu unterdrücken. Die Zusammensetzung kann ein Impfstoff, Konjugat oder Fusionsprotein sein.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Die 1 ist ein Graph des Verhältnisses von Effektor : Zielzelle gegen den Prozentanteil spezifischer Zelllyse, welcher eine cytolytische T-Zell (CTL)-Antwort in Mäusen gegen ein Gemisch, umfassend Nucleoprotein (NP)-Peptid und Hitzeschockprotein 70 (hsp70) zeigt.
  • Die 2 ist ein Graph des Verhältnisses von Effektor : Zielzelle gegen den Prozentanteil spezifischer Zelllyse, welcher eine CTL-Antwort in Mäusen gegen eine Zusammensetzung, umfassend ein chemisches Konjugat eines NP-Peptids und hsp70, zeigt.
  • Die 3 ist eine schematische Darstellung des Vektors pET65MP.
  • Die 4A ist eine schematische Darstellung des Vektors pET65MP/NP-B.
  • Die 4B ist eine schematische Darstellung des Vektors pET65MP/NP-D.
  • Die 5A-5B sind Graphen des Verhältnisses von Effektor: Zielzelle gegen den Prozentanteil spezifischer Zelllyse, welche eine CTL-Antwort in Mäusen gegen das hsp-NP-Fusionsprotein hsp65-NP.B zeigen, wobei die Effektorzellen in der Abwesenheit von IL-2 (5A) und in der Anwesenheit von IL-2 (5B) restimuliert wurden.
  • Die 6A-6B sind Graphen des Verhältnisses von Effektor: Zielzelle gegen den Prozentanteil spezifischer Zelllyse, welche eine CTL-Antwort in Mäusen gegen das hsp-NP-Fusionsprotein hsp65-NP.D zeigen, wobei die Effektorzellen in der Abwesenheit von IL-2 (6A) und in der Anwesenheit von IL-2 (6B) restimuliert wurden.
  • Die 7A-7B sind Graphen des Verhältnisses von Effektor : Zielzelle gegen den Prozentanteil spezifischer Zelllyse, welche eine CTL-Antwort in BALB/c-Mäusen zeigen, welche mit einem hsp-P1A-Fusionsprotein immunisiert wurden.
  • Die 8A-8B sind Graphen des Verhältnisses von Effektor : Zielzelle gegen den Prozentanteil spezifischer Zelllyse, welche eine CTL-Antwort in DBA/2 (H-2d)-Mäusen zeigen, welche mit einem hsp-P1A-Fusionsprotein immunisiert wurden.
  • Die 9 ist eine Balkengraphik, welche zeigt, dass die Immunisierung mit dem hsp-tumorassoziierten Antigen, hsp71-P1A, zur Stimulation von CTL-Aktivität führt, welche gegen Zellen gerichtet ist, die relevante MHC-Klasse I-restringierte Epitope präsentieren.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Anmeldung offenbart Impfstoffe und Zusammensetzungen, welche eine Immunantwort gegen ein Antigen in einem Säuger (zum Beispiel einem Menschen) auslösen, umfassend ein Antigen (eines oder mehrere) und das gesamte oder einen Teil eines Stressproteins oder eines Hitzeschockproteins (eines oder mehrere) oder das gesamte oder einen Teil eines Proteins, welches eine Aminosäuresequenz hat, welche ausreichend homolog zum Stressprotein ist, um die Immunantwort gegen das Antigen auszulösen. Insbesondere werden Impfstoffe und Zusammensetzungen offenbart, welche eine zellvermittelte Immunantwort in einem Säuger auslösen, umfassend ein Antigen ( eines oder mehrere) und das gesamte oder einen Teil eines Stressproteins (eines oder mehrere) oder das gesamte oder einen Teil eines Proteins, welches eine Aminosäuresequenz hat, welche ausreichend homolog zum Stressprotein ist, um eine Immunantwort gegen das Antigen auszulösen.
  • Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen, welche eine Immunantwort gegen ein Influenzavirus in einem Säuger auslösen, umfassend ein Antigen des Influenzavirus und das gesamte oder einen Teil eines Stressproteins oder das gesamte oder einen Teil eines Proteins, welches eine Aminosäuresequenz hat, welche ausreichend homolog zur Aminosäuresequenz des Stressproteins ist, um eine Immunantwort gegen das Antigen auszulösen wie dies in Anspruch 1 definiert ist. Wie hier beschrieben, sind bei Verwendung in Säugern Zusammensetzungen, umfassend ein Influenzaantigen (zum Beispiel CTL-Epitope einschließende NP-Sequenzen) und wenigstens ein Stressprotein in der Form eines Fusionsproteins, welches Influenzaantigen und Stressproteinsequenzen enthält, wirksam zur Stimulation spezifischer Immunantworten (zum Beispiel cytolytische T-Zell (CTL)-Antwort, T-Helferzell-Antwort, B-Zell-Antwort) gegen das Influenzaantigen. Zum Beispiel kann, wie in den Beispielen gezeigt, die Immunisierung eines Wirts (Wirbeltier wie ein Säuger) mit den hier beschriebenen Impfstoffen zur Stimulation spezifischer CTL-Aktivität führen, welche gegen Zellen gerichtet ist, die das Influenzaantigen (zum Beispiel NP) präsentieren.
  • Impfstoffe, welche eine zellvermittelte Immunantwort gegen tumorassoziierte Antigene auslösen, umfassend ein tumorassoziiertes Antigen, geeignet zur Immunisierung gegen einen vorbestehenden Tumor einer bestimmten Art oder zur Vorbeugung der Entwicklung eines solchen Tumors, und das gesamte oder einen Teil eines Stressproteins oder das gesamte oder einen Teil eines Proteins, welches eine Aminosäuresequenz hat, welche ausreichend homolog zur Aminosäuresequenz des Stressproteins ist, um die Immunantwort gegen das Antigen auszulösen, werden auch offenbart. Analog zur vorherigen Ausführungsform können Impfstoffe, umfassend wenigstens ein tumorassoziiertes Antigen und ein Stressprotein in der Form von Fusionsproteinen, enthaltend tumorassoziiertes Antigen und Stressproteinsequenzen, zellvermittelte cytolytische Immunantworten gegen das tumorassoziierte Antigen in Säugern stimulieren. Wie in den Beispielen gezeigt, löst ein Impfstoff dieser Art, ein ein minimales P1A-Mastocytomantigen und ein Stressprotein enthaltendes Fusionsprotein, eine zellvermittelte cytolytische Antwort gegen das P1A-Antigen präsentierende Zellen aus. Darüber hinaus sind Säuger, welche mit dem Impfstoff immunisiert worden sind, immun gegen eine nachfolgende Konfrontation mit das P1A-Antigen exprimierenden Tumorzellen.
  • In der vorliegenden Erfindung ist die Zusammensetzung aus zwei Teilen zusammengesetzt: einem Stressprotein und einem Antigen, gegen welches eine Immunantwort erwünscht ist. Die zwei Teile bilden eine einzelne Einheit. Die Konjugation kann durch rekombinante Techniken erreicht werden. Wenn rekombinante Techniken verwendet werden, um die zwei Teile zur verknüpfen oder zu verbinden, ist das Ergebnis ein rekombinantes Fusionsprotein, welches das Stressprotein und das Antigen in einem einzelnen Molekül einschließt. Dies macht es möglich, im Herstellungsprozess des Impfstoffs ein einzelnes rekombinantes Molekül herzustellen und zu reinigen. Das Stressprotein kann an jedes Influenzaantigen, gegen welches die zellvermittelte cytolytische Immunantwort erwünscht ist, oder an einen Teil des Antigens, welcher ausreichend ist, um eine Immunantwort in einem Individuum, an das es verabreicht wird, auszulösen, konjugiert werden.
  • Wie hier definiert, schließt der Begriff „Impfstoff" Zusammensetzungen ein, welche als ein prophylaktischer oder therapeutischer Impfstoff verwendet werden können. In einer Ausführungsform besteht die Impfstoffzusammensetzung aus einer oder mehreren Nucleinsäuren, welche das Antigen und das Stressprotein codieren. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der Zusammensetzungen, welche Nucleinsäuren sind, die ein Stressprotein und/oder das Antigen codieren, zur Vorbeugung oder Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustandes, welche/welcher mit dem Vorhandensein von Influenzavirus assoziiert ist oder dadurch verursacht wird. Zum Beispiel können die hier beschriebenen Zusammensetzungen verwendet werden, um eine Immunantwort gegen ein Influenzavirus in einem nicht mit dem Virus infizierten Säuger auszulösen. Zusätzlich können die Impfstoffe oder Zusammensetzungen, welche hier beschrieben sind, verwendet werden, um eine Immunantwort in einem Säuger, welcher mit einem Influenzavirus infiziert ist, auszulösen und können zu einer Linderung oder Beseitigung des durch den infizierenden Influenzavirus verursachten Erkrankungszustandes in dem Säuger führen. Wie hier verwendet, bedeutet „Auslösung einer Immunantwort" eine verstärkte Immunantwort (mehr als nicht nachweisbar oder mehr als zuvor) oder eine Antwort, welche derjenigen, die durch Immunisierung unter vergleichbaren Bedingungen mit dem Antigen alleine erreicht werden kann, überlegen ist.
  • Wie hier beschrieben, ist ein Antigen (eines oder mehrere pro Stressprotein) bevorzugt peptidartig, das heißt, es ist ein Protein, Polypeptid oder Peptid. In Anwendungen, in welchen Antigen und Stressprotein zusammengemischt oder chemisch verknüpft werden, kann das Antigen auch ein Kohlenhydrat, Lipid, Glycolipid oder ein organisches oder anorganisches Molekül sein. Wie hier verwendet, schließt ein „Antigen" Peptide oder Polypeptide ein, welche wenigstens ein CTL-Epitop umfassen. Ein CTL-Epitop ist als entweder ein Klasse I-restringiertes T-Zell-Epitop oder als ein Klasse II-restringiertes T-Zell-Epitop definiert. Das Antigen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann isoliert, aufgereinigt (im Wesentlichen rein), chemisch synthetisiert oder rekombinant hergestellt sein. Andere in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen nützliche geeignete Antigene können durch den Fachmann bestimmt werden.
  • In der Ausführungsform, in welcher der Impfstoff oder die Zusammensetzung eine zellvermittelte cytolytische Immunantwort gegen ein Influenzavirus auslösen, schließen Antigene des Influenzavirus Peptide oder Polypeptide ein, welche wenigstens ein B-Zell- und/oder T-Zell- (zum Beispiel T-Helferzelle, cytolytische T-Zelle) Epitop umfassen. Zum Beispiel schließt ein Antigen des Influenzavirus Hämagglutinin (HA, zum Beispiel HA1, HA7), Nucleoprotein (zum Beispiel NP wie NP-b und NP-D, beschrieben in den Beispielen), Neuraminidase (NA), M1, M2 PB1, PB3 und PA ein, ist aber nicht darauf beschränkt. Andere Antigene eines Influenzavirus, welche in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden können, können durch den Durchschnittsfachmann bestimmt werden.
  • In dem Fall, in dem der Impfstoff oder die Zusammensetzung eine zellvermittelte cytolytische Immunantwort gegen ein tumorassoziiertes Antigen auslöst, schließen Antigene MAGE1, MAGE3, BAGE und GAGE ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Diese Proteine werden normalerweise im Hoden exprimiert. Eine ektope Expression führt zu einer Vielfalt von Tumoren einschließlich Melanomen. Auch in dieser Liste eingeschlossen sind die Differenzierungsantigene der Melanocyten Tyrosinase, MART-1/MELAN-1 und gp 100/pMel17 genauso wie mit Tyrosinase verwandtes Protein pg75 und MUM-1, welche alle mit Melanomen assoziiert sind. Andere nützliche tumorassoziierte Antigene sind HER2/neu, welches in Brust- und Eierstocktumoren gefunden wird, MUC-1, welches in Epithelzelltumoren gefunden wird, und menschliche Papillomvirusproteine E6 und E7, welche stark mit Cervixtumoren assoziiert sind. Zusätzliche Antigene schließen GnT-V, Beta-Catenin, CDK4 und p15 ein. All diese tumorassoziierten Antigene werden durch T-Zellen erkannt (Wang R.-F. und Rosenberg S. A., Journal of Leukocyte Biology, 60 (1996): 296-309; Houghton A. N., J. Exp. Med. 180 (1994): 1-4; Henderson R. A. und Finn O. J., Advances of Immunology 62: 217-256).
  • Die wichtigen Akteure in der allergischen (atopischen) und asthmatischen Erkrankung sind IgE und lokale Entzündungsreaktionen, welche durch die Infiltration von Eosinophilen dominiert werden. Hyperreaktivität der Lunge gegen nichtspezifische Reize aufgrund chronischer Entzündung ist die moderne Definition von Asthma. Diese Entzündung kann durch abnorme allergische Antworten gegen natürliche oder künstliche Antigene, vermittelt durch IgE, verursacht sein und führt zu einer chronischen zellulären Infiltration von granulären Zellen, welche als Eosinophile bezeichnet werden. Von der Freisetzung von Mediatoren aus ansässigen Mastzellen und rekrutierten Basophilen und Eosinophilen wird angenommen, dass sie die Ursache für die Entzündung und die nachfolgende Hyperreaktivität ist. Im Menschen sowie in anderen Spezies erzeugt jede Entzündungsreaktion eine lokale Hyperreaktivität. Bei Asthma ist die Entzündung jedoch chronisch, was, sofern nicht angemessen behandelt, zu einer lebensbedrohenden Hyperreaktivität führt. Die aktuelle Behandlung schließt die Verwendung von Corticosteroiden zur Verminderung der Entzündung und von Bronchodilatatoren wie Albuterol (Betaagonisten) zur schnellen symptomatischen Erleichterung ein.
  • In Menschen wie in Mäusen wurden zwei verschiedene Muster der Cytokinsekretion bei CD4+-T-Helferzellclonen definiert (del Prete G., Allergy 47 (1992): 450-455). Menschliche Typ 1-Helfer (Th1)-, aber nicht Typ 2-Helfer (Th2)-Zellen erzeugen Interleukin-2 (IL-2), gamma-Interferon und Tumornekrosefaktor beta. Th2-Zellen, aber nicht Th1-Zellen sezernieren IL-4 und IL-5, aber nicht IL-2 oder gamma-Interferon. Andere Cytokine wie IL-3, IL-6, GM-CSF oder Tumornekrosefaktor Alpha werden sowohl von Th1- als auch von Th2-Zellen erzeugt. Die verschiedenen Cytokinmuster sind mit verschiedenen Funktionen assoziiert. Im Allgemeinen stellen Th2-Zellen eine ausgezeichnete Helferfunktion für die Antikörperproduktion der B-Zellen, insbesondere der IgE-Klasse, bereit. Th1-Zellen sind für die verzögerten Hypersensitivitätsreaktionen verantwortlich und sind cytolytisch für autologe antigenpräsentierende Zellen, einschließlich B-Zellen. Die meisten allergen- oder helminthantigen-spezifischen menschlichen CD4+-T-Zellclone zeigen einen Th2-Phänotyp, während die meisten für bakterielle Antigene spezifischen Clone ein Th1-Profil zeigen. Allergenspezifische Th2-Zellen scheinen eine entscheidende Rolle in der Atopie zu spielen. Diese Zellen lösen die IgE-Erzeugung über IL-4 aus und begünstigen die Proliferation, Differenzierung und Aktivierung von Eosinophilen über IL-5. Zusätzlich sind von Th2 abgeleitetes IL-3, IL-4 und IL-13 Wachstumsfaktoren für Mastzellen, die wenigstens in vitro synergistisch wirken. Es gibt Belege, dass allergenspezifische Th2-Zellen in von allergischer Entzündung betroffenen Geweben, wie die bronchiale Schleimhaut von Menschen mit allergischem Asthma, selektiv angereichert werden.
  • Mit der zunehmenden Verwendung von Antibiotika in früher Kindheit in der entwickelten Welt steigen die Inzidenz und die Todesfälle aufgrund von (allergischem) Asthma an. Die folgende Diskussion verwendet diese Information, welche die erhöhte Inzidenz und Schwere von allergischen Reaktionen mit einem Mangel von Exposition und T-Zell-Gedächtnis für bakterielle Proteine einschließlich Stressproteinen verknüpft, um die Ansicht zu unterstützen, dass die willentliche Exposition gegenüber bakteriellen Antigenen einschließlich Stressproteinen allergische Antworten dämpfen wird.
  • Viele Wissenschaftler glauben, dass die Entwicklung von Resistenz gegen oder Empfindlichkeit auf Umweltantigene von der Art des während früher Begegnungen mit Antigenen im Säuglingsalter und in der frühen Kindheit erzeugten immunologischen Gedächtnisses abhängt (Holt P. G., Toxicol Lett. 86: 205-210). Dieser Vorgang scheint durch Antigen gesteuert zu sein. Die Auswahl erfolgt auf spezifische Th1- gegen Th2-artige Gedächtniszellen in individuellen Immunantworten auf inhalierte Antigene, ein Vorgang welcher in den regionalen Lymphknoten erfolgt, welche die leitenden Atemwege ableiten. Diese Auswahl scheint durch eine Vielfalt von durch antigenspezifische CD4+- und CD8+-T-Zellen erzeugten Cytokinen reguliert zu werden. Dieser Auswahlvorgang der T-Zellen kann theoretisch durch infektiöse Erreger beeinflusst werden: Infektionen in der Schleimhaut der Luftwege können lokale Gewebe- (Alveolar-) Makrophagen mobilisieren und aktivieren, welche zu den regionalen Lymphknoten wandern und Th2-inhibitorische Cytokine wie IL-12 und alpha-Interferon sezernieren. Zusätzlich können sie die gamma-Interferon-Spiegel im Milieu durch Aktivierung natürlicher Killerzellen steigern. Das Endergebnis ist die Erzeugung von CTLs (welche überwiegend CD8+-Zellen sind). Gamma-Interferon hemmt die Erzeugung von Th2-Zellen und deshalb die Erzeugung von IL-4 und IL-5, Cytokine, welche entscheidend für die Erzeugung von humoralen (IgE) und zellulären (Eosinophile, Basophile und Mastzellen) allergischen Antworten sind (Anderson G. P. und Coyle A. J., Trends Pharmacol. Sci. 15 (1995): 324-332; Stam W. B., van Oosterhout A. J. und Nijkamp F. P., Life Sci. 53 (19939): 1921-1934).
  • In Säugern wurde von Stressproteinen gezeigt, dass sie humorale genauso wie zelluläre Immunantworten auslösen. Wie hier in den Beispielen gezeigt, werden zellvermittelte cytolytische Immunantworten wesentlich verstärkt, wenn lösliches Antigen, welches mit einem Stressprotein gemischt, chemisch konjugiert oder daran fusioniert ist, einem Säuger verabreicht wird. Diese Antworten gründen im Wesentlichen auf CD8+-T-Zellen. Deshalb ergibt ein Vergleich der CD4+-Antworten gegen die Antigene selbst mit denen mit Stressproteinen gemischten oder an sie gekoppelten das vorhergesagte Profil: mit Stressproteinen gemischte oder an sie geknüpfte lösliche Antigene liefern einen hohen Anteil von CTLs (hauptsächlich CD8+-T-Zellen), welche ein Maß für die Stimulation des vorher beschriebenen Th1-Weges sind, weil diese CTLs als Ergebnis der Anregung von antigenspezifischen T-Zellen des Th1-Typs entstanden sind. Diese Th1-Zellen erzeugen gamma-Interferon, welches als Cytokin Th2-Zellen hemmt. Deshalb sind die Th2-Cytokine IL-4 und IL-5 nicht mehr länger verfügbar, um die Erzeugung von IgE und Eosinophilen zu unterstützen. Mit abnehmenden Titern von IgE wird die direkte antigene Stimulation von Mastzellen und basophilen Zellen abnehmen. Zudem wird die verminderte Erzeugung von IL-5 zu einer verminderten Erzeugung, Differenzierung und Aktivierung von Eosinophilen führen. Dieses Muster wird eine verringerte Entzündung des betroffenen Gewebes bedingen und zu weniger hyperreaktiven (asthmatischen) Ereignissen führen.
  • Deshalb sollte die Verabreichung von Gemischen bekannter allergener Antigene (Allergene) und Stressproteine oder von Zusammensetzungen, welche an Stressproteine chemisch verknüpfte oder mit ihnen verbundene Allergene enthalten, das Th1 zu Th2-Verhältnis in atopischen Patienten beeinflussen, was ein eher normales Gleichgewicht wiederherstellt und zu verminderter Allergie oder vermindertem Asthma führt. In solchen Zusammensetzungen verwendete Stressproteine sind bevorzugt bakterieller oder mykoplasmischer Herkunft. Allergene, welche in Allergen-Stressprotein-Fusionsproteinen verwendet werden, sind notwendigerweise peptidartig; nicht-peptidartige Allergene können in Konjugaten verwendet werden, welche ein Allergen und ein Stressprotein oder Gemische von Allergen und Stressprotein enthalten. Nicht-eingrenzende Beispiele für Allergene schließen Fel d 1 (Katze); Amb a 1 (Antigen E), Amb a 2 (Antigen K) (Ambrosiapflanze); Der f 2, Der p 1, Der p 9, Der f 1 (Milben); Bla g 1, Bla g 2 (Schabe); Bet v 1 (Birke); Rat n 1 (Ratte); Cha o 1 (Japanische Zypresse); Hev b 5 (Latex); gp40 (Bergzeder) ein. Für eine einigermaßen vollständige Liste von Allergenen bis zur Zeit der Veröffentlichung siehe King T. P. et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 105 (1994): 224-233.
  • Wenn kovalent verbundenes oder zusammengemischtes Allergen und Stressprotein enthaltende Zusammensetzungen über einen geeigneten Applikationsweg, wie subkutane oder intramuskuläre Injektion oder sogar durch Inhalation an einen wegen Hypersensitivitätsreaktionen behandlungsbedürftigen Patienten verabreicht werden, sollten sie eine Verringerung der allergischen Symptome, zum Beispiel gemessen durch den klassischen Hyperreaktivitätstest bei Asthma, erzeugen. Nach der Behandlung wird der Patient weniger nicht-spezifische Reaktivität zeigen. Bei Asthmatikern oder in Tiermodellen des Asthmas wird die Hyperreaktivität durch Bestimmung der Dosen von inhaliertem Methacholin, welche eine bronchokonstriktive Antwort erzeugen, gemessen. Säuger mit chronisch entzündlichen Zuständen, welche zu einer Hyperreaktivität führen, werden eine größere Empfindlichkeit gegenüber einer Konfrontation mit Methacholin zeigen. Sie werden bei geringeren Dosen eine Bronchokonstriktion haben als „normale" Säuger. Nach Behandlung mit der geeigneten, Stressprotein enthaltenden Zusammensetzung würde die Dosis-Antwort auf Methacholin sich nach weniger empfindlich verschieben.
  • Jegliches geeignete Stressprotein (Hitzeschockprotein (hsp)) kann in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden. Zum Beispiel kann, wie in den Beispielen beschrieben, hsp65 und/oder hsp71 verwendet werden. Wenden wir uns nun den Stressproteinen im Allgemeinen zu. Zellen reagieren auf einen Stressor (typischerweise Hitzeschockbehandlung) durch Verstärkung der Expression einer Gruppe von Genen, welche üblicherweise als Stress- oder Hitzeschockgene bezeichnet werden. Die Hitzeschockbehandlung schließt die Exposition von Zellen oder Organismen gegenüber Temperaturen ein, die ein bis mehrere Grad Celsius über Temperaturen liegen, an welche die Zellen angepasst sind. In Koordination mit der Induktion solcher Gene steigen die Spiegel entsprechender Stressproteine in gestressten Zellen an. Wie hier verwendet, ist ein „Stressprotein", auch bekannt als ein „Hitzeschockprotein" oder „Hsp", ein Protein, welches durch ein Stressgen codiert wird und deshalb beim Kontakt oder bei Exposition des Organismus mit dem Stressor typischerweise in wesentlich größeren Mengen erzeugt wird. Ein „Stressgen", auch bekannt als „Hitzeschockgen", wird hier als ein Gen verwendet, welches aufgrund des Kontaktes oder der Exposition eines Organismus (welcher das Gen enthält) mit einem Stressor wie Hitzeschock oder Glucoseentzug oder -zugabe, aktiviert wird. „Stressgen" schließt auch homologe Gene in den bekannten Stressgenfamilien ein, sowie bestimmte Gene in den Hsp70- und Hsp90-Stressgenfamilien. Jeder der Begriffe Stressgen und Stressprotein kann, wie in der vorliegenden Spezifikation verwendet, den anderen einschließen, sofern der Zusammenhang dies nicht anders anzeigt.
  • Die Stressproteine können isolierte Stressproteine sein, was bedeutet, dass die Stressproteine ausgewählt und von der Wirtszelle, in welcher sie erzeugt worden sind, abgetrennt wurden. Solch eine Isolation kann wie hier beschrieben und unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Standardverfahren der Proteinisolierung durchgeführt werden (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Das isolierte Stressprotein kann auch weiter in Übereinstimmung mit den Verfahren, insbesondere dem Detergensaufreinigungsverfahren, gereinigt (im Wesentlichen rein) werden.
  • In Bakterien sind die vorherrschenden Stressproteine Proteine mit molekularen Größen von etwa 70 bzw. 60 kDa, welche als Hsp70 bzw. Hsp60 bezeichnet werden. Diese und andere spezifische Stressproteine und die sie codierenden Gene werden nachstehend weiter diskutiert. In Bakterien stellen Hsp70 und Hsp60 basierend auf dem Färbemuster unter Verwendung der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und des Farbstoffes Coomassie-Blau typischerweise 1-3 % der Zellproteine dar, akkumulieren aber zu Spiegeln von einer Höhe bis zu 25 % unter stressreichen Bedingungen. Stressproteine scheinen an wichtigen zellulären Vorgängen wie Proteinsynthese, intrazellulärem Trafficking und dem Aufbau und Abbau von Proteinkomplexen beteiligt zu sein. Es scheint, dass die erhöhten Mengen von während dem Stress synthetisierten Stressproteinen hauptsächlich zur Minimierung der Folgen der ausgelösten Entfaltung von Proteinen dienen. Tatsächlich bietet die Präexposition von Zellen gegenüber leicht stressvollen Bedingungen, welche die Synthese von Stressproteinen auslösen, den Zellen einen Schutz vor den schädlichen Auswirkungen eines nachfolgenden extremeren Stresses.
  • Die Hauptstressproteine scheinen in jedem bisher untersuchten Organismus und Gewebetyp exprimiert zu werden. Auch scheint es, dass Stressproteine die am stärksten konservierte, bis heute identifizierte Gruppe von Proteinen darstellen. Zum Beispiel zeigen Hsp90 und Hsp70, wenn Stressproteine in stark verschiedenen Organismen verglichen werden, 50 % oder größere Identität auf der Aminosäureebene und teilen viele Ähnlichkeiten auf nicht-identischen Positionen.
  • Die die Stressproteine codierenden Gene können in einer einzelnen Kopie oder in vielfachen nicht-identischen Kopien im Genom einer Zelle oder eines Organismus vorliegen. Zum Beispiel wurde vom menschlichen Genom gezeigt, dass es wenigstens eine Kopie eines Hsp100-Gens, wenigstens zwei verschiedene Hsp90-Gene, bis zu zehn Hsp70-Gene, von denen wenigstens einige nicht-identische Kopien sind, einige T-Komplex-Gene (Tcp-Gene) und wenigstens ein das verwandte mitochondriale Protein Hsp60 codierendes Gen genauso wie wenigstens drei Kopien von kleinen Hsp-Genen, welche Proteine im Bereich der molekularen Größe von 20-30 kDa codieren, enthält. In den meisten Gruppen von Stressgenen gibt es wenigstens ein Gen, dessen Expressionsniveau relativ hoch ist und welches entweder gänzlich konstitutiv oder nur leicht durch Hitzeschock induzierbar ist. Weiterhin schließen einige Gruppen von Stressgenen Mitglieder ein, welche nicht durch Hitze, sondern durch andere Auslöser wie erhöhte Calciumspiegel und so weiter hochreguliert werden.
  • Die Stressproteine, insbesondere Hsp70, Hsp60, Hsp20-30 und HspIO sind unter den Hauptdeterminanten, welche vom Wirtsimmunsystem in der Immunantwort gegen Infektionen durch Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium leprae erkannt werden (Young R. A., und Elliott T. J., Stress Proteins, Infection, And Immune Surveillance, Cell 50 (1989): 5-8). Weiterhin erkennen einige arthritogene T-Zellen der Ratte Hsp60-Epitope (Van Eden W., Thole J., van der Zee R., Noordzij A., van Embden J., Hensen E. und Cohen I., Nature 331 (1988): 171-173). Es tragen jedoch auch Individuen, einschließlich gesunder Individuen, ohne eine Vorgeschichte einer mycobakteriellen Infektion oder einer Autoimmunerkrankung T-Zellen, welche sowohl bakterielle als auch menschliche Hsp60-Epitope erkennen; ein beachtenswerter Anteil von T-Zellen in gesunden Individuen, welche durch die Expression des Gamma-Delta-T-Zellrezeptors gekennzeichnet sind, erkennen sowohl eigene als auch fremde Stressproteine (O'Brien R., Happ M., Dallas A., Palmer E. Kubo R. und Born W., Cell 57 (1989): 664-674). So besitzen Individuen, sogar gesunde Individuen, T-Zellpopulationen, welche Epitope sowohl fremder als auch eigener Stressproteine erkennen.
  • Dieses System der Erkennung von Epitopen von Stressproteinen bildet ein „frühes Abwehrsystem" gegen eindringende Organismen. Das System könnte durch häufige Stimulation durch Bakterien und Viren, welche die Wirtszellen veranlassen ihre eigenen Stressgene hochzuregulieren, aufrecherhalten werden. Die Anwesenheit autoreaktiver T-Zellen ist jedoch vereinbar mit einer normalen Gesundheit und verursacht keine Autoimmunerkrankung, dies zeigt auch die Sicherheit von Stressproteinen in einem Individuum. Die Sicherheit von Stressproteinen wird zusätzlich durch den Erfolg und die relative Sicherheit von BCG (Bacille Calmette Guerin, einem Stamm von Mycobacterium bovis)-Impfungen gezeigt, welche einen Immunantwort gegen Stressproteine auslösen, die auch gegenüber Mycobacterium tuberculosis Schutz bietet.
  • Stressgene und Stressproteine zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind jene, welche im Fachgebiet wohl bekannt sind, und schließen zum Beispiel Hsp100-200, Hsp100, Hsp90, Lon, Hsp70, Hsp60, TF55, Hsp40, FKBPs, Cyclophiline, Hsp20-30, C1pP, GrpE, HspIO, Ubiquitin, Calnexin und Proteindisulfidisomerasen (Macario A. J. L., Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25 (1995): 59-70; Parsell D. A., & Lindquist S., Ann. Rev. Genet. 27 (1993): 437-496; US-Patent Nr. 5,232,833 (Sanders et al.) ein. Eine besondere Gruppe von Stressproteinen schließt Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp20-30 und Ubiquitin, mehr bevorzugt Hsp70 und Hsp60 ein.
  • Ein Stressprotein in den erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen ist bevorzugt ausgewählt aus extrazellulär antigenpräsentierenden Stressproteinen oder aus Stressproteinen, welche prozessiert und die resultierenden Peptidfragmente auf der Oberfläche der Zelle präsentiert werden, so dass es ein extrazellulär antigenpräsentierendes Protein ist. Zusätzlich ist ein ausgewähltes Stressgen oder Stressprotein zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt so ausgewählt, dass das Stressgen oder Stressprotein in wenigstens einer Expressionsform, bevorzugt einem Bakterium oder einem Menschen, in der Folge einer oder mehrerer Arten von Stress nicht-reguliert ist. Weiter bevorzugt sind die ausgewählten Stressgene oder Stressproteine in Menschen nicht-reguliert, auch nicht durch Stressoren wie diejenigen, die vorstehend beschrieben wurden, oder durch Transformation.
  • Beispiele für Hsp100-200 schließen Grp170 (für durch Glucose reguliertes Protein) ein, Grp170 sitzt im Lumen des ER, im prä-Golgi-Kompartiment und könnte eine Rolle in der Faltung und Zusammenlagerung von Immunglobulinen spielen.
  • Beispiele für Hsp100 schließen Säuger-Hsp110, Hefe-Hsp104, c1pA, c1pB, c1pC, c1pX und c1pY ein. Hefe-Hsp104 und E. coli-c1pA bilden hexamere und E. coli -c1pB tetramere Partikel, deren Zusammenbau die Bindung von Adeninnucleotid zu benötigen scheint. C1p-Protease bildet ein 750 kDa Heterooligomer, welches aus C1pP (eine proteolytische Untereinheit) und aus C1pA zusammengesetzt ist. C1pB-Y sind strukturell mit C1pA verwandt, obwohl sie ungleich C1pA mit C1pP nicht zu komplexieren scheinen.
  • Beispiele für Hsp90 schließen HtpG in E. coli, Hsp83 und Hsc83 in Hefe und Hsp90α, Hsp90β und Grp94 im Menschen ein. Hsp90 bindet Gruppen von Proteinen, wobei die Proteine typischerweise zelluläre regulatorische Moleküle wie Steroidhormonrezeptoren (zum Beispiel Glucocorticoide, Östrogen, Progesteron und Testosteron), Transkriptionsfaktoren und Proteinkinasen sind, welche eine Rolle in Signaltransduktionsmechanismen spielen. Hsp90-Proteine sind auch bei der Bildung von großen, reichlich vorhandenen Proteinkomplexen beteiligt, welche andere Stressproteine einschließen.
  • Lon ist ein tetrameres Protein, welches als ATP-abhängige Protease wirkt, die nicht-arteigene Proteine in E. coli abbaut.
  • Beispiele für Hsp70 schließen Hsp72 und Hsp73 aus Säugerzellen, DnaK aus Bakterien, insbesondere Mycobakterien wie Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium bovis (wie Bacille Calmette Guerin), DnaK aus Escherichia coli, Hefe und anderen Prokaryonten und BiP und Grp78 ein.
  • Hsp70 ist fähig ATP sowie entfaltete Polypeptide und Peptide spezifisch zu binden und sich dadurch an der Faltung und Entfaltung von Proteinen sowie am Zusammenbau und Abbau von Proteinkomplexen zu beteiligen.
  • Beispiele für Hsp60 schließen Hsp65 aus Mycobakterien ein. Bakterielles Hsp60 auch allgemein bekannt als GroEL, wie GroEL aus E. coli. Hsp60 bildet große homooligomere Komplexe und scheint eine Schlüsselrolle in der Faltung von Proteinen zu spielen. Homologe von Hsp60 sind in eukaryontischen Mitochondrien und Chloroplasten vorhanden.
  • Beispiele für TF55 schließen Tcp1, TRiC und Thermosom ein. Die Proteine treten typischerweise im Cytoplasma von Eukaryonten und einigen Archaebakterien auf und bilden vielgliedrige Ringe und fördern die Faltung von Proteinen. Sie sind auch schwach homolog zu Hsp60.
  • Beispiele für Hsp40 schließen DnaJ aus Prokaryonten wie E. coli und Mycobakterien und HSJ1, HDJ1 und Hsp40 ein. Hsp40 spielt als ein molekulares Chaperon unter anderen zellulären Aktivitäten eine Rolle in der Proteinsynthese, Thermotoleranz und DNA-Replikation.
  • Beispiele für FKBPs schließen FKBP12, FKBP13, FKBP25 und FKBP59, Fpr1 und Nep1 ein. Die Proteine haben typischerweise eine Peptidyl-Prolyl-Isomeraseaktivität und interagieren mit Immunsuppressiva wie FK506 und Rapamycin. Die Proteine werden typischerweise im Cytoplasma und im endoplasmatischen Retikulum gefunden.
  • Beispiele für Cyclophilin schließen die Cyclophiline A, B und C ein. Die Proteine haben eine Peptidyl-Prolyl-Isomeraseaktivität und interagieren mit dem Immunsuppressivum Cyclosporin A. Das Protein Cyclosporin A bindet Calcineurin (eine Proteinphosphatase). Beispiele für Hsp20-30 schließen α-Crystallin ein und Hsp20-30 wird auch als kleines Hsp bezeichnet. Hsp20-30 wird typischerweise in großen homooligomeren Komplexen oder möglicherweise auch heterooligomeren Komplexen gefunden, wobei ein Organismus oder eine Zellart verschiedene Arten von kleinen Hsps exprimiert. Hsp20-30 interagiert mit Strukturen des Cytoskeletts und könnte eine regulatorische Rolle in der Polymerisierung/Depolymerisierung von Aktin spielen. Hsp20-30 wird unter Stress oder Exposition von ruhenden Zellen mit Wachstumsfaktoren schnell phosphoryliert.
  • C1pP ist eine Protease von E. coli, welche am Abbau von abnormen Proteinen beteiligt ist. Homologe von C1pP werden in Chloroplasten gefunden. C1pP bildet einen heterooligomeren Komplex mit C1pA.
  • GrpE ist ein Protein von E. coli von etwa 20 kDa, das sowohl an der Rettung von durch Stress beschädigten Proteinen als auch am Abbau von beschädigten Proteinen beteiligt ist. GrpE spielt eine Rolle in der Regulation der Expression von Stressgenen in E. coli. Beispiele für HspIO schließen GroES und CpnIO ein. HspIO wird typischerweise in E. coli und in Mitochondrien und Chloroplasten eukaryontischer Zellen gefunden. HspIO bildet einen siebengliedrigen Ring, welcher mit Hsp60-Oligomeren assoziiert. HspIO ist auch an der Faltung von Proteinen beteiligt.
  • Von Ubiquitin wurde herausgefunden, dass es Proteine in Koordination mit der proteolytischen Entfernung der Proteine durch ATP-abhängige cytosolische Proteasen bindet.
  • In bestimmten Ausführungsformen werden die erfindungsgemäßen Stressproteine aus Enterobakterien, Mycobakterien (insbesondere M. leprae, M. tuberculosis und M. bovis), E. coli, Hefe, Drosophila, Wirbeltieren, Vögeln, Hühnern, Säugern, Ratten, Mäusen, Primaten oder Menschen gewonnen.
  • Die Stressproteine können die Form von sauren oder basischen Salzen oder eine neutrale Form haben. Zusätzlich können individuelle Aminosäurereste durch Oxidation oder Reduktion verändert werden. Aufgrund der Degeneration des Codes können zum Beispiel beachtenswerte Variationen in Nucleotidsequenzen, welche die gleiche Aminosäuresequenz codieren, bestehen. Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine können auch Fragmente von Stressproteinen enthalten, welche von Stressproteinen erhalten wurden, vorausgesetzt dass solche Fragmente die an der Verstärkung der Immunantwort gegen das gewählte Antigen beteiligten Konformationsepitope einschließen. Fragmente von Stressproteinen können durch Fragmentation unter Verwendung von Proteanen oder durch rekombinante Verfahren wie die Expression eines Teils einer ein Stressprotein codierenden Nucleotidsequenz (entweder alleine oder als Fusionen mit einem anderen Protein) erhalten werden. Peptide könne auch durch solche Verfahren oder durch chemische Synthese hergestellt werden. Das Stressprotein wird an ein zweites Protein fusioniert, welches ein Stressprotein sein kann oder auch nicht. Die Stressproteine können an bestimmten Loci durch eine Vielfalt von bekannten Verfahren eingeführte Mutationen einschließen (siehe zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Drinkwater und Klinedinst, PNAS 83 (1986): 3402-3406; Liao und Wise, Gene 88 (1990): 107-111; Horwitz et al., Genome 3 (1989): 112-117).
  • Der Begriff „ausreichend homolog zu der Aminosäuresequenz des Stressproteins" bedeutet, dass die Aminosäuresequenz des Proteins oder Polypeptids im Allgemeinen wenigstens eine 40%ige Identität mit der Aminosäuresequenz des Stressproteins aufweisen wird; in einigen Fällen zeigt die Aminosäuresequenz eines funktionellen Äquivalents eine annähernd 50%ige Identität mit der Aminosäuresequenz des Stressproteins.
  • Verfahren zur Identifizierung eines betrachteten Gens oder Proteins als Stressgen oder Stressprotein sind im Fachgebiet wohl bekannt. Zum Beispiel erlaubt die Konservierung von Genen und Proteinen einer bestimmten Gruppe von Stressproteinen den Vergleich der Nucleotid- oder Aminosäuresequenz des betrachteten Gens/Proteins mit wohl bekannten Stressgenen wie DnaK, GroEL oder DnaJ zum Beispiel durch Nucleinsäurehybridisierung oder Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenzierung gefolgt durch Vergleichsanalysen am Computer (Voellmy R. et al., PNAS 82 (1985): 4949-4953). Alternativ kann ein Test verwendet werden, um essentielle strukturelle Eigenschaften und/oder funktionelle Eigenschaften eines ausgewählten Stressproteins zu identifizieren und/oder zwischen ihnen zu unterscheiden. Es kann zum Beispiel eine Expressionsgenbank unter Verwendung von anti-Hsp-Antikörpern und anderen im Fachgebiet wohl bekannten Tests durchmustert werden (Antikörper: A Laboratory Manual, Harlow und Lane (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Zusätzlich kann die biologische Aktivität einer gegebenen Stressproteingruppe ausgenützt werden (Guidon P. T. und Hightower L. E., Biochem. 25 (1986): 3231-3239). Zum Beispiel ist Hsp70 zur spezifischen Bindung von ATP genauso wie von ungefalteten Polypeptiden und Peptiden beim Zusammenbau von Proteinkomplexen fähig. Somit zeigt das Mischen eines betrachteten Proteins mit einer Probe, umfassend geeignete Polypeptide, Peptide oder ATP, gefolgt von der Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit der Erzeugung von Protein-Protein- oder Protein-Nucleinsäure-Komplexen die scheinbare Anwesenheit oder Abwesenheit eines Hsp70-Gens oder -Proteins, dessen Anwesenheit oder Abwesenheit unter Nutzung anderer Tests wie antikörperbasierter Tests bestätigt werden kann.
  • Eine wirksame Dosierung der Stressproteine zur Auslösung spezifischer zellulärer und humoraler Immunität gegen Stressproteine oder gegen an die Stressproteine konjugierte Substanzen wie Proteine oder Oligosaccharide liegt abhängig von dem Individuum, dem das Stressprotein verabreicht wird, im Bereich von 0,1 bis zu 1000 μg hsp pro Injektion (Lussow A. R. et al., Eur. J. Immun. 21 (1991): 2297-2302; Barrios C. et al., Eur. J. Immun. 22 (1992): 1365-1372). Die geeignete Dosierung des Stressproteins für jedes Individuum wird durch Berücksichtigung von zum Beispiel des bestimmten verabreichten Stressproteins, der Art des Individuums, dem das Stressprotein verabreicht wird, dem Alter und der Größe des Individuums, der behandelten oder vorzubeugenden Erkrankung und der Schwere der Erkrankung bestimmt. Der Fachmann wird unter Anwendung von nicht mehr als Routineversuchen fähig sein, die einem Individuum zu verabreichende, geeignete Dosierung zu bestimmen.
  • Das Stressprotein, der Teil eines Stressproteins, das funktionelle Äquivalent eines Stressproteins und das dem Stressprotein hinzugemischte oder daran fusionierte oder konjugierte Antigen, die in dem Impfstoff vorhanden sind, können unter Verwendung bekannter Verfahren hergestellt oder erhalten werden. Zum Beispiel kann das Stressprotein und/oder das Antigen von Influenzavirus aus einer Quelle, in der es in der Natur vorkommt, erhalten (isoliert) werden, es kann durch Clonierung und Expression eines das gewünschte Stressprotein oder Antigen codierenden Gens hergestellt werden oder es kann chemisch oder mechanisch synthetisiert werden.
  • Die hier beschriebenen Zusammensetzungen können verwendet werden, um eine Immunantwort gegen einen Vielfalt von Pathogenen (zum Beispiel Bakterien, Viren, Parasiten) auszulösen. Die Zusammensetzung, umfassend ein Antigen des Influenzavirus und das gesamte oder einen Teil eines oder mehrerer Stressproteine oder das gesamte oder einen Teil eines Proteins, welches eine Aminosäuresequenz hat, welche ausreichend homolog zur Aminosäuresequenz des Stressproteins ist, um die Immunantwort gegen das Antigen auszulösen, kann verwendet werden, um eine Immunantwort gegen ein Influenzavirus in einem gegenüber einem Influenzavirus anfälligen Wirbeltier (zum Beispiel Säuger, Geflügel) auszulösen. Zum Beispiel können die Zusammensetzungen verwendet werden, um eine Immunantwort gegen ein Influenzavirus in Primaten (zum Beispiel Menschen), Pferden, Schweinen, Truthähnen und Hühnern auszulösen.
  • Die hier beschriebenen Zusammensetzungen können einem Wirt in einer Vielfalt von Arten verabreicht werden. Die Verabreichungsrouten schließen intradermale, transdermale (zum Beispiel Polymere mit langsamer Freisetzung), intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, orale, epidurale und intranasale Routen ein. Jede andere günstige Verabreichungsroute kann verwendet werden, zum Beispiel Infusion oder Bolusinjektion oder Absorption durch epitheliale oder mukokutane Auskleidungen. Zusätzlich können die hier beschriebenen Zusammensetzungen zusammen mit anderen Komponenten oder biologisch aktiven Stoffen (zum Beispiel Alaun), pharmazeutisch akzeptablen grenzflächenaktiven Mitteln (zum Beispiel Glyceriden), Excipienten (zum Beispiel Lactose), Trägern, Verdünnungsmitteln und Vehikeln verabreicht werden.
  • Weiterhin können das Stressprotein und/oder peptidartige Antigen durch in vivo-Expression von Polynucleotiden, welche ein solches codieren, in ein Individuum, welches ein Säuger ist, verabreicht werden. Das heißt, dass ein Vektor verwendet werden kann, um (eine) ein Antigen und ein Stressprotein codierende Nucleinsäure(n) oder eine Nucleinsäure, welche ein Antigen- und Stressproteinsequenzen enthaltendes Fusionsprotein codiert, zuzuführen. Zum Beispiel können das Stressprotein und/oder das Antigen einem Wirt (Säuger) unter Verwendung lebender Vektoren verabreicht werden, wobei die Stressprotein- und Antigen-Nucleinsäuresequenzen enthaltenden lebenden Vektoren unter Bedingungen verabreicht werden, bei welchen das Antigen und/oder das Stressprotein in vivo exprimiert werden. Zum Beispiel kann einem Säuger in Kombination mit einem Stressprotein in Form eines Proteins oder Peptids oder in Kombination mit einem Vektor, welcher ein Stressprotein codiert und in vivo exprimiert, ein Vektor injiziert werden, welcher ein Antigen codiert und in vivo exprimiert. Alternativ kann einem Wirt in Kombination mit einem Antigen in Form eines Peptids oder Proteins oder in Kombination mit einem Vektor, welcher ein Antigen codiert und in vivo exprimiert, ein Vektor injiziert werden, welcher ein Stressprotein codiert und in vivo exprimiert. Ein einzelner Vektor, welcher die ein Protein- (Peptid-) Antigen codierenden Sequenzen enthält, kann auch für die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden.
  • Einige Expressionsvektorsysteme sind kommerziell erhältlich oder können entsprechend rekombinanter DNA- und Zellkulturtechniken reproduziert werden. Zum Beispiel können Vektorsysteme wie die Hefe- oder Vacciniavirus-Expressionsysteme oder Virusvektoren verwendet werden (Kaufman R. J., A J. of Meth. in Cell and Molec. Biol., 2 (1990): 221-236). Andere Techniken unter Verwendung von nackten Plasmide oder DNA oder von clonierten, in mit einem Zielfindungsmechanismus versehene Liposomen oder Erythrocyten-Ghosts eingehüllten Genen können verwendet werden, um Polynucleotide des Stressproteins und/oder Antigens in den Wirt einzuführen (Freidman T., Science 244 (199): 1275-1281; Rabinovich N. R. et al., Science 265 (1994): 1401-1404). Die Erstellung von Expressionsvektoren und der Transfer von Vektoren und Nucleinsäuren in verschiedene Wirtszellen kann unter Verwendung von Genmanipulationstechniken, wie in Handbüchern wie Molecular Cloning und Current Protocols in Molecular Biology beschrieben, welche hier durch Bezugnahme einbezogen werden, oder unter Verwendung kommerziell erhältlicher Kits erreicht werden (Sambrook J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, 1989; Ausubel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, 1989)).
  • Die Menge von Stressprotein und/oder Antigen in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ist eine Menge, welche eine wirksame immunstimulatorische Antwort im Wirt (Wirbeltier wie ein Säuger) erzeugt. Eine wirksame Menge ist solch eine Menge, dass, wenn sie verabreicht wird, sie zu einer verstärkten Immunantwort im Vergleich zu der Immunantwort, wenn sie nicht verabreicht wird, führt. Das heißt, dass eine wirksame Menge eine Menge ist, welche eine stärker ausgeprägte Immunantwort bereitstellt, als ähnliche Mengen des Antigens oder der Stressproteine alleine. Zusätzlich wird die dem Wirt verabreichte Menge des Stressproteins und/oder Antigens abhängig von einer Vielfalt von Faktoren, einschließlich des verwendeten Antigens, der Größe, des Alters, des Körpergewichts, der allgemeinen Gesundheit, des Geschlechts und der Ernährung des Wirts und des Zeitpunkts der Verabreichung, der Dauer oder bestimmten Eigenschaften des Influenzavirus, variieren. Die Anpassung und Veränderung von etablierten Dosisbereichen liegen klar in den Fähigkeiten des Fachmanns. Zum Beispiel kann die Menge des Stressproteins und Antigens zwischen 100 μg bis zu etwa 1 g liegen, bevorzugt von etwa 1 mg bis zu 1 g und von etwa 1 mg bis zu etwa 100 mg.
  • Die vorliegende Erfindung lehrt, dass das Vorhandensein eines Stressproteins die zellvermittelte cytolytische Antwort auf ein Antigen außerordentlich stimuliert. Obwohl tumorassoziierte Antigene identifiziert worden sind, sind die Immunantworten gegen diese Antigene alleine therapeutisch nicht wirksam. Die Verstärkung der zellulären Antwort gegen diese Antigene durch die Mitverabreichung eines Stressproteins, entweder in einem Gemisch oder verknüpft mit Antigen, ist nützlich bei der Krebstherapie. Diese Erwartung wird durch die in den Beispielen ausführlich beschriebene Beobachtung, dass eine erfindungsgemäße Zusammensetzung einen Säuger gegen eine nachfolgende Konfrontation mit einem Tumor immunisiert, unterstützt. Es wird vorhergesagt, dass die Verstärkung der zellvermittelten cytolytischen Antwort gegen ein Antigen zu der Herabregulierung einer vorbestehenden (Th2-vermittelten) humoralen Antwort gegen das gleiche Antigen führt. Schließlich wird von der T-Zell vermittelten Immunität auch angenommen, dass sie bei Säugern ein wichtiges Element in der Abwehr des Wirts gegen durch Viren, Protozoen und bestimmte intrazelluläre Bakterien wie Mycobakterien verursachte Infektionen ist. Wie in den Beispielen gezeigt, sind Zusammensetzungen (Gemische, Konjugate und Fusionsproteine), welche ein Stressprotein und ein Antigen eines Influenzavirus einschließen, wirksam bei der Auslösung einer beträchtlichen, zellvermittelten cytolytischen Immunantwort gegen das virale Antigen exprimierende Säugerzellen.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele, welche in keiner Weise als eingrenzend beabsichtigt sind und von welchen die Beispiele 1-3 und 5-6 außerhalb des Umfangs der beanspruchten Erfindung liegen, veranschaulicht.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Isolierung rekombinanter Stressproteine
  • A. Rekombinantes mycobakterielles Hsp70.
  • Das Plasmid Y3111 enthält ein M. tuberculosis-Hsp70-Gen, welches funktionell zwischen Expressionskontrollsequenzen eingefügt ist (Mehlert A. und Young D. B., Mol. Microbiol. 3 (1989): 125-130). Der E. coli-Stamm CG2027 (erhalten von C. Georgopoulos, Universität Genf, Schweiz), welcher ein gekürztes Hsp70-Gen enthält, wurde mit dem Plasmid Y3111 durch Standardverfahren transformiert (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)).
  • Das Plasmid Y3111 enthaltende Bakterien wurden in 100 Mikrogramm/ml Ampicillin enthaltendem 2xYT-Medium (20 g Trypton, 10 g Hefeextrakt, 10 g NaCl pro Liter) bei 37 °C unter Schütteln (250 UpM) übernacht gezüchtet. Eine 10%ige Glycerinstammlösung wurde aus dieser Kultur hergestellt und bei –70°C gelagert. Einige abgeschabte Stücke der gefrorenen Glycerinstammlösung wurden verwendet, um eine große Kultur anzuimpfen, welche wie zuvor für etwa 48 Stunden inkubiert wurde. Als die optische Dichte bei 590 nm 2,5 bis 3,5 erreichte, wurden die Zellen durch Zentrifugation gewonnen.
  • Die nachfolgenden Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Die Zellsedimente wurden in 3 ml Lysepuffer pro Gramm resuspendiert. Die Zusammensetzung des Lysepuffers war 10 mM Tris-HCl, 2 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA), 5 mM beta-Mercaptoethanol, 10 Mikrogramm/ml Aprotinin, 10 Mikrogramm/ml Leupeptin und 1 Mikrogramm/ml Pepstatin. Lysozym wurde der Zellsuspension zu einer Endkonzentration von 0,14 mg/ml zugefügt. Die Suspension wurde dann bei –70 °C eingefroren.
  • Die Zellsuspension wurde aufgetaut und die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen. Die Ultraschallpräparate wurden einer Zentrifugation bei 17000 UpM über 30 Minuten (JA-17 Rotor, Beckmann) unterzogen. Festes (NH4)2SO4 wurde der Lösung im Überstand hinzugefügt, bis diese Lösung zu 65 % mit (NH4)SO4 gesättigt war. Nach einer Inkubation über 30 Minuten wurde das Gemisch wie zuvor zentrifugiert. Das Sediment wurde in Q SEPHAROSE-Puffer A gelöst. Dieser Lösung wurden 10 Mikrogramm/ml Aprotinin, 10 Mikrogramm/ml Leupeptin und 1 Mikrogramm/ml Pepstatin hinzugefügt und die Lösung wurde übernacht gegen das 65-fache Volumen von Q SEPHAROSE-Puffer A dialysiert. Der Q SEPHAROSE-Puffer A enthielt 30 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 5 mM beta-Mercaptoethanol. Die dialysierte Lösung wurde durch Zentrifugation, wie vorstehend beschrieben, geklärt.
  • Die dialysierte Lösung wurde auf eine mit Q SEPHAROSE-Puffer A äquilibrierte Q SEPHAROSE-Säule (Pharmacia) aufgetragen. Die Säule wurde mit dem 2-fachen Volumen des gleichen Puffers gewaschen. Die Elution erfolgte mit einem 0 bis 600 mM-NaCl-Gradienten. Die Fraktionen wurden mit SDS-PAGE und Färbung mit Coomassie-Blau auf die Anwesenheit eines vorwiegenden Polypeptids mit 71 kDa (das heißt, das rekombinante Hsp70-Protein aus M. tuberculosis) hin getestet. Das Polypeptid enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und der Pool wurde durch Zugabe von festem (NH4)2SO4 auf eine Sättigung von 65 % gebracht. Das Gemisch wurde, wie zuvor beschrieben, zentrifugiert, das Sediment wurde in ATP-Startpuffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 15 mM beta-Mercaptoethanol und 0,1 mM EDTA) gelöst und die sich ergebende Proteinlösung wurde übernacht gegen ein 65-faches Volumen des gleichen Puffers dialysiert und durch Zentrifugation geklärt.
  • Die dialysierte Proteinlösung wurden dann auf eine in ATP-Startpuffer äquilibrierte ATP-Agarose-Säule (Fluka) aufgetragen. Die Säule wurde mit einem Säulenvolumen von ATP-Startpuffer mit 1 M NaCl gewaschen. Die Elution wurde mit mit 10 mM ATP ergänztem ATP-Startpuffer erreicht. Das Eluat wurde mit (NH4)2SO4 auf 65% Sättigung gebracht und ausgefälltes Protein wurde, wie zuvor beschrieben, gewonnen. Das Zentrifugationssediment wurde in Blue SEPHAROSE-Puffer (30 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl2, 5 mM beta-Mercaptoethanol) gelöst und gegen das 200-fache Volumen des Puffers dialysiert.
  • Die dialysierte Proteinlösung aus dem letzten Schritt wurde auf eine mit Blue SEPHAROSE-Puffer äquilibrierte Blue SEPHAROSE-Säule (Pharmacia) aufgetragen. Die Säule wurde mit dem 1,5-fachen Säulenvolumen des gleichen Puffers gewaschen. Der Durchlauf und die Fraktionen wurden als ungeteilter Pool gesammelt.
  • Die Reinheit der letzten Präparation wurde durch eine SDS-PAGE und Coomassie-Blau-Färbung, durch eine Western-Blot-Untersuchung (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982); (siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory press, NY (1989)) unter Verwendung von für mycobakterielles Hsp70 bzw. Hsp70 von E. coli spezifischen monoclonalen Antikörpern aus der Maus und durch Tests der ATPase-Aktivität untersucht. Basierend auf dem Färbemuster der Präparation in mit Coomassie-Blau gefärbten Gelen sind Präparationen typischer Weise zu mehr als 90 % rein und bevorzugt zu mehr als 95 % rein und enthielten weniger als 1 % von Hsp60 aus E. coli und kein nachweisbares Hsp70 aus E. coli.
  • B. Mycobakterielles Hsp60
  • Das Plasmid RIB1300 enthält ein Hsp60-Gen aus M. bovis-BCG, welches funktionell zwischen Expressionskontrollsequenzen eingefügt ist (Thole J. E. R. et al., J. Exp. Med. 178 (1993): 343-348). Der E, coli-Stamm M1546 wurde mit dem Plasmid RIB1300 (Thole J. E. R. vorstehend) unter Verwendung von Standardverfahren transformiert (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)).
  • Ein Inokulum der das Plasmid RIB1300 enthaltenden Bakterien wurde bis zur Sättigung in 200 Mikrogramm/ml Ampicillin enthaltendem NCZYM-Medium (10 g N-Z Amin A, 5 g Bacto-Hefeextrakt, 1 g Casaminosäuren, 5 g NaCl, 2 g (NH4)2SO4-7 H2O pro Liter) bei 28°C und unter Schütteln gezüchtet. Diese Kultur wurde verwendet, um eine größere Kultur zu inokulieren, welche unter den gleichen Bedingungen wie die Inokulumkultur gezüchtet wurde, bis die optische Dichte der Kultur zwischen 0,3 bis 0,6 bei einer optischen Dichte von 590 nm lag. Die Produktion des rekombinanten Proteins wurde durch schnelles Anheben der Temperatur der Kultur auf 42°C durch Inkubation in einem heißen Wasserbad ausgelöst. Die Kultur wurde über 3 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Die Bakterien wurden dann durch Zentrifugation gewonnen und im 6-fachen Volumen Lysepuffer bezogen auf das Gewicht des bakteriellen Sediments resuspendiert. Der Lysepuffer enthielt 10 mM Tris-HCL (pH 8,0), 10 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA), 0,1 mM PMSF und 0,1 % RIVM BA (0,104 g 4-Aminobenzamidin-2HCl, 0,066 g epsilon-Aminocapronsäure pro 50 ml). Lysozym wurde zu einer Konzentration von 0,1 mg/ml hinzugegeben und die Suspension bei –70 °C gefroren.
  • Die bakterielle Suspension wurde aufgetaut und auf 4°C gesetzt. Die nachfolgenden Arbeitsschritte fanden bei dieser Temperatur statt. Die vollständige Lyse der Bakterien wurde durch Ultraschallbehandlung erreicht. Das Ultraschallpräparat wurde bei 17000 UpM über 30 Minuten in einem JA-17-Rotor (Beckman) zentrifugiert. Gesättigtes (NH4)2SO4 wurde der Lösung im Überstand hinzugefügt, bis eine Sättigung von 20 % erreicht wurde. Ausfällungen wurden durch Zentrifugation (siehe vorstehend) entfernt und wurden verworfen. Die Lösung im Überstand wurde durch die Zugabe von gesättigtem (NH4)2SO4 auf eine Sättigung von 55 % gebracht. Das sich aus der nachfolgenden Zentrifugation ergebende Sediment wurde in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 15 mM beta-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA) gelöst. Die Proteinlösung in TE wurde dann gegen ein 50-faches Volumen TE-Puffer dialysiert.
  • Nach Zentrifugation (wie vorstehend) zur Entfernung von ausgefälltem Material wurde die dialysierte Proteinlösung auf eine DEAE SEPHAROSE (Pharmacia)-Säule aufgetragen. Nach Waschen mit TE-Puffer wurden die Proteine mit einem 0-300 mM NaCl-Gradienten in TE-Puffer eluiert. Fraktionen, die ein Hsp60 aus M. bovis-BCG (tatsächliches scheinbares Molekulargewicht gleich 65 kDa) enthielten, wurden durch SDS-PAGE und Coomassie-Blau-Färbung identifiziert und wurden vereinigt. 10 Mikrogramm/ml Aprotinin, 10 Mikrogramm/ml Leupeptin und 1 Mikrogramm/ml Pepstatin wurden dem Pool hinzugefügt, welcher dann in einer Amicon-Zelle unter Verwendung einer YM30-Membran aufkonzentriert wurde.
  • Der konzentrierte Pool wurde auf eine mit S200-Puffer (10 mM Na2HPO4, (pH 6,8), 150 mM NaCl und 15 mM beta-Mercaptoethanol) äquilibrierte S-200 SEPHACRYL (Pharmacia)-Säule aufgetragen. Die Elution fand mit dem gleichen Puffer statt. Fraktionen wurden wie zuvor auf die Anwesenheit von mycobakteriellem Hsp60 getestet und positive Fraktionen, welche in hohem Maße gereinigtes Protein enthielten, wurden vereinigt und übernacht gegen NAP-Puffer (10 mM Na2HPO4 (pH 6,8), 15 mM beta-Mercaptoethanol) dialysiert.
  • Der dialysierte Pool wurden auf eine in HAP-Puffer äquilibrierte Hydroxyapatit (Bio-Rad; Bio-Gel HTP Gel)-Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit dem 3-fachen Säulenvolumen von 1 mM MgCl2 und 15 mM beta-Mercaptoethanol und dann mit 1 mM Na2HPO4 (pH 6,8) und 15 mM beta-Mercaptoethanol gewaschen. Protein wurde mit einem 10-60 mM-Phosphatgradienten eluiert. Fraktionen wurden wie zuvor getestet und positive Fraktionen wurden vereinigt, konzentriert und mittels Gelfiltration durch PD10 in 0,85 % NaCl gewechselt. Die Reinheit des mycobakteriellen Hsp60 wurde durch SDS-PAGE und Coomassie-Blau-Färbung sowie durch eine Untersuchung mit Western-Blot unter Verwendung von für Hsp70 und Hsp60 aus E. coli spezifischen Antikörpern untersucht. Präparationen waren typischer Weise zu mehr als 90 % rein und enthielten jeweils nicht mehr als 0,5 % von Hsp60 aus E, coli bzw. 0,1-0,2 % von Hsp70 aus E. coli.
  • Hsp-Präparationen können entweder durch Affinitätschromatographie auf DetoxiGel-Harzen, Zugabe von Polymyxin B oder (am wenigsten bevorzugt) durch Extraktion mit Detergentien wie Triton® X-114 pyrogenfrei gemacht werden.
  • Beispiel 2: CTL-Antwort auf eine Zusammensetzung, umfassend ein Gemisch eines NP-Peptides mit Hsp70
  • a. Prägaration von Hsp70 und NP-Peptid
  • Hsp70, hier Hsp71 aus M. tuberculosis, wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, präpariert. NP-Peptid (hier als NP.B bezeichnet; Motal U. M. A. et al., Eur. J. Immunol. 25 (1995): 1121-1124 und die dortigen Quellen) mit der Aminosäuresequenz VQLASNENMETM (SEQ ID NO: 1), entsprechend den Resten 363-374 im kompletten NP und ein bekanntes CTL-Epitop (H-2b-restringiert) enthaltend, wurde synthetisch (0,25 mM Größenmaßstab) auf einem Applied Biosystems Modell 431A-Peptidsyntheseautomaten unter Verwendung von Fmoc(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl) als alpha-Amino-Schutzgruppe und HMP (Wang)-Harz als festem Träger hergestellt. Alle Aminosäure- und Synthesechemikalien wurden von Applied Biosystems erworben.
  • NP.B wurde durch Inkubation des NP.B-Harzes über 3 Stunden unter kontinuierlichem Schütteln in 2 ml eines durch die Kombination von 10 ml Trifluoressigsäure, 0,5 ml Wasser, 0,75 g kristallinem Phenol, 0,25 ml Ethandithiol und 0,5 ml Thioanisol hergestellten Gemisches von dem Träger abgespalten und die die Seitenketten schützenden Gruppen wurden entfernt. Die Spaltungsmischung wurde in 40 ml eiskalten Diethylether filtriert. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation bei 5000 × g über 8 Minuten gewonnen. Der Ether wurde dekantiert und das Sediment wurde dreimal durch Resuspension in kaltem Diethylether, gefolgt von Zentrifugation gewaschen. Nach dem letzten Waschen wurde das Sediment luftgetrocknet, in destilliertem Wasser aufgenommen und lyophilisiert.
  • b. Immunisierung von Mäusen und Präparation von Effektorzellen
  • NP.B-Peptid wurde in einem kleinem Volumen von Dulbecco's PBS (DPBS; 2,7 mM KH2PO4, 4,3 mM Na2HPO4, 2,7 mM KCl, 0,137 M NaCl) gelöst. Anteile von 1,89, 18,9 bzw. 189 Mikrogramm des Peptids NP.B wurden mit Anteilen von 100 Mikrogramm von Hsp71 in DPBS gemischt, um Zusammensetzungen mit einem molaren Verhältnis von Peptid : Hsp von 1, 10 bzw. 100 zu erhalten. Gruppen von vier weiblichen Mäusen des Stammes C57BL/6 wurden entweder nicht-immunisiert belassen (Kontrolle) oder es wurden ihnen subkutan in den Nacken die drei verschiedenen NP.B-Hsp71-Gemische injiziert. Nach sieben Tagen wurden die Mäuse durch Genickbruch euthanasiert und ihre Milzen entfernt. Von vereinigten Milzen wurden Einzelzellsuspensionen präpariert und einmal in „komplettem Medium", was mit 10 % fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 50 μM 2-Mercaptoethanol und 50 μg/ml Genatmycinsulfat ergänztes RPMI-1640 war, gewaschen. Lymphoide Zellen wurden durch Züchtung von 25 × 106 lebensfähigen Zellen mit NP.B-Peptid bei einer 0,1 μmolaren Konzentration über fünf Tage restimuliert. Die Kulturen wurden in aufrechten 25 cm2-Kolben mit 10 ml komplettem Medium bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Kulturen (Effektorzellen) wurden dann in dem nachstehend beschriebenen CTL-Aktivitätstest verwendet.
  • c. CTL-Aktivitätstest
  • EL4-Zellen (H-2b) wurden als Zielzellen verwendet. Die Zellen wurden über 90 Minuten mit 150 μCi Na2CrO4 und 10 μg NP.B-Peptid pro 106 Zellen inkubiert. Ausgiebigem Waschen zur Entfernung überschüssigen radioaktiven Markers folgend wurden 104 markierte Zielzellen mit den restimulierten Effektorzellen mit verschiedenen Verhältnissen von Effektor : Zielzellen gemeinsam gezüchtet. Nach 4-5 Stunden Inkubation wurden die Kulturplatten über 5 Minuten bei 200 × g zentrifugiert und 100 μl-Anteile der Lösungen im Überstand, welche den von den Zellen freigesetzten radioaktiven Marker enthielten, wurden in Beckman Ready Caps gesammelt. Die Radioaktivität wurde durch Flüssigkeits-Szintillations-Zählung gemessen. Um die spontan freigesetzte und gesamte freisetzbare Radioaktivität zu bestimmen, wurde Lösung im Überstand von Kulturen, welche nur Zielzellen enthielten, oder von durch die Zugabe von Triton® X-100 lysierten Zielzellen gewonnen und die Radioaktivität wie zuvor bestimmt. Die Ergebnisse wurden als Prozentanteil spezifischer Lyse, berechnet auf Basis der folgenden Formel, ausgedrückt: Prozentanteil spezifische Lyse = 100 × (ZpMtest –/ZpMspont)/(ZpMtotal – ZpMspont),wobei ZpMtest die von einer bestimmten Cokultur freigesetzte Radioaktivität ist, ZpMspont die spontan von der Zielzellkultur freigesetzte Radioaktivität ist und ZpMtotal die durch Lyse der Zielzellen mit Triton® X-100 freigesetzte Radioaktivität ist. CTL-Tests wurden in Dreifachansätzen durchgeführt und Durchschnittswerte wurden bereitgestellt.
  • Die Ergebnisse des Experiments werden in 1 gezeigt. Die Kontrollreaktion, das heißt, der Test der Chromfreisetzung einer Cokultur von Zielzellen und von aus nicht-immunisierten Mäusen präparierten Effektorzellen stellt einen Hintergrundwert für die Lyse von etwa 10 % bei einem Verhältnis von Effektor Zielzelle von 100 bereit. Keine Verstärkung der CTL-Aktivität über dem Hintergrund wurde mit Effektorzellen von Mäusen, welche mit 1 : 1 oder 10 : 1 NP.B-Hsp71-Gemischen immunisiert wurden, beobachtet. Eine Stark verstärkte Lyse wurde mit Effektorzellen von mit einem 100 : 1-Gemisch von NP.B-Peptid und Hsp71 immunisierten Mäusen gefunden, was zeigt, dass die Coimmunisierung mit einem Peptid wie NP.B und einem Hsp wie Hsp71 die CTL-Aktivität gegen das Peptid präsentierende Zellen drastisch stimulieren kann. Man beachte, dass, wie im Fachgebiet wohl bekannt ist, die Immunisierung mit NP.B-Peptid in DPBS alleine die CTL-Aktivität nicht stimuliert.
  • Beispiel 3: CTL-Antwort auf eine Zusammensetzung, umfassend ein chemisches Konjugat eines NP-Peptids und Hsp70
  • a. Präparation von Hsp70 und NP-Peptid
  • Hsp71 aus M. tuberculosis wurde, wie in Beispiel 1 beschreiben, präpariert. NP.B-Peptid wurde, wie in Beispiel 2 diskutiert, synthetisiert, außer dass das Peptid einen zusätzlichen aminoterminalen Cysteinrest enthielt und so die Aminosäuresequenz CVQIASNENMETM (SEQ ID NO: 2) hatte.
  • b. Chemische Konjugation des NP.B-Peptids an Hsp70 und Diphtherietoxoid
  • Konjugationen wurden sowohl mit Hsp70 als auch, um einen Standard für Vergleiche der Wirksamkeit spezifischer Stimulation der CTL-Aktivität bereitzustellen, mit dem allgemein verwendeten Trägerprotein Diphtherietoxoid (abgekürzt DT; DT wurde von einer kommerziellen Quelle erhalten) durchgeführt.
  • b.1. Aktivierung des Hsp71 aus M. tuberculosis und des DT-Trägerproteins
  • 9 mg von Hsp71 wurden in 4,5 ml 0,1 M Natriumboratpuffer, pH 8,0 gelöst. Sulfo-MBS (m-Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysulfosuccinimidester) (2,3 mg in 100 μl Dimethylsulfoxamin) wurde dem Protein hinzugefügt und das Reaktionsgemisch wurde über 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der pH-Wert wurde dann auf 6,0 eingestellt und das Reaktionsgemisch wurde übernacht bei 4 °C gegen 1 Liter 20 mM Natriumphosphat und 150 mM NaCl, pH 5,6 dialysiert. DT wurde ähnlich behandelt.
  • b.2. Präparation des NP.B-Peptids für die Konjugation
  • Für jede Konjugationsreaktion wurden 3 mg des Peptids in 100 μl 0,1 M beta-Mercaptoethanol gelöst. Nach 1 Stunde Inkubation, um die Reduktion des Peptids zu erlauben, wurde das Reduktionsmittel durch Trocknung des Reaktionsgemisches in einer SpeedVac-Zentrifuge entfernt. Das Peptid wurde wieder in 0,5 ml destilliertem Wasser aufgelöst, in welches 5 μl-Anteile 1 N NaOH hinzugefügt, wurden bis das Peptid vollständig gelöst war. Für Konjugationsexperimente mit DT wurden 6 mg des Peptids reduziert und dann wieder in 1 ml Wasser gelöst.
  • b.3. Konjugaterzeugung
  • Der pH-Wert der Lösungen der aktivierten Trägerproteine wurde unter Verwendung 0,1 N NaOH auf 6,8 eingestellt. 3 mg aktiviertes Trägerprotein enthaltende Lösung wurde mit 0,5 ml Lösung reduzierten Peptids (oder 1 ml der Lösung reduzierten Peptids zur Präparation von Konjugaten mit DT) über 3 Stunden bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Mischen umgesetzt. Um nicht-umgesetztes Peptid zu entfernen, wurde die sich ergebende, das Konjugat enthaltende Lösung übernacht bei 4°C gegen 1 Liter 20 mM Natriumphosphat und 150 mM NaCl pH 7 dialysiert. Die Proteinkonzentration wurde durch einen BCA-Test bestimmt. Die Effizienz der durch dieses Verfahren erreichten Konjugation wurde in früheren Pilotexperimenten unter Verwendung radioaktiv markierter NP.B-Peptide bestimmt. Es wurde gefunden, dass das Peptid : Protein-Verhältnis 17,5 für das NP.B-hsp71-Konjugat (71.NP) und 10,1 für NP.B-DT (DT.NP) war.
  • c. Immunisierung von Mäusen und Präparation von Effektorzellen
  • Immunisierungen mit 1-100 μg 71.NP- und DT.NP-Konjugaten und die Präparation von Effektorzellen wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt.
  • d. CTL-Aktivitätstest
  • Tests wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt.
  • ERGEBNISSE
  • Die erhaltenen Ergebnisse werden in 2 dargestellt. CTL-Aktivitätstests mit Effektorzellen von mit DPBS oder mit 1 oder 10 μg DT.NP-Konjugat injizierten Mäusen ergaben negative Ergebnisse (niedrigste Linie 2). Nur mit 100 μg DT.NP injizierte Effektorzellen erzeugten messbare (zwischen 5 und 10 % Lyse bei einem Effektor : Zielzell-Verhältnis von 100) CTL-Aktivität, welche mit jener von Effektorzellen aus mit 1 μg 71.NP immunisierten Mäusen vergleichbar war. Tests mit Effektorzellen von mit 10 oder 100 μg 71.NP-Konjugat immunisierten Mäusen zeigten wesentlich größere CTL-Aktivität, das heißt zwischen 15 % und 25 % Zielzelllyse bei einem Effektor : Zielzell-Verhältnis von 100. Dieses Experiment zeigt am Beispiel des NP.B-Peptids und hsp71, dass die Immunisierung mit einem Peptid-Hsp-Konjugat die gegen Zellen, welche das Peptid präsentieren, gerichtete, spezifische CTL-Aktivität stimuliert.
  • Beispiel 4: CTL-Antwort auf eine Zusammensetzung, umfassend ein Hsp-NP-Fusionsprotein
  • a. Präparation von Hsp-NP-Fusionsproteinen
  • a.1. Präparation von Expressionsplasmiden, welche Fusionsproteine codieren, die NP-CTL-Epitope am Carboxyterminus des mycobakteriellen Hsp65 enthalten
  • Plasmide, welche als Teil von Hsp65-Fusionsproteinen NP-Sequenzen aus Influenzaviren einschließlich des N-2b-CTL-Epitops NP.B (siehe vorstehend) oder des H-2d-CTL-Epitops NP.D (Reste 147-155 von NP; Levi R. und Arnon R., Vaccines 14 (1996): 85-92 und dortige Verweise) exprimieren, wurden erstellt.
  • Ein Expressionsvektor, pET65 mp, abgeleitet aus einem Plasmid des pET-Systems (Novagen) und ein komplettes Hsp65-Gen aus M. bovis-BCG und nützliche Restriktionsschnittstellen zum Einfügen von zusätzlichen codierenden Sequenzen am Carboxyterminus des Hsp65-Gens enthaltend, wurde zuvor hergestellt. Eine schematische Darstellung dieses Vektors wird in 3 bereitgestellt.
  • Das Konstrukt pNP/cA, welches den offenen Leserahmen des NP des Influenzavirusstamms A/PR/8/34 unter der Kontrolle des Cytomegalieviruspromotors, bereitgestellt durch das Plasmid pcDNA1 (Invitrogen), enthielt, wurde von Dr. Peter Palese (Abt. für Mikrobiologie, Mount Sinai School of Medicine, New York, N.Y.) erhalten.
  • Zwei Primerpaare zur Amplifikation von die NP.B- und NP.D-Epitope enthaltenden Fragmenten wurden auf einem automatisierten Oligonucleotidsyntheseautomaten synthetisiert und wurden unter Verwendung von Standardverfahren gereinigt. Vorwärts gerichtete Primer enthielten zusätzlich zu geeigneten zu NP-Sequenzen komplementären Sequenzen eine EcoRI-Restriktionsschnittstelle und reverse Primer eine SpeI-Restriktionsschnittstelle. Der vorwärts gerichtete Primer für das NP.D-Fragment hatte die Sequenz 5'-AAAGAAGAATTCAGGCGAATC (SEQ ID NO: 3) und der reverse Primer die Sequenz 5'GTTCCGATCACTAGTCCCACG (SEQ ID NO: 4). Dieses Paar war dazu ausgelegt, ein die NP-Reste 117-200 enthaltendes Fragment zu amplifizieren. Der vorwärts gerichtete Primer für das NP.B-Fragment hatte die Sequenz 5'-CTGCTTGAATTCAGCCAAGTG (SEQ ID NO: 5) und der reverse Primer die Sequenz 5'-CTGTTGACTAGTGTTTCCTCC (SEQ ID NO: 6). Das letzte Primerpaar war dazu ausgelegt, ein die NP-Reste 310-395 enthaltendes Fragment zu erzeugen.
  • Polymerasekettenreaktionen (PCR) wurden unter Verwendung der vorstehenden Primerpaare und von pNP/cA als DNA-Matrize durchgeführt. PCR-Fragmente wurden mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und SpeI doppelt gespalten und unter Verwendung von Routinesubclonierungsverfahren (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring-Harbor Lab., Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) in mit EcoRI/SpeI gespaltenen pET65mp ligiert. Transformationskompetente Zellen des E. coli-Stammes DH5alpha wurden mit den Ligierungsgemischen transformiert und auf 100 μg/ml Ampicillin enthaltenden Agar ausplattiert. Kolonien transformierter Zellen wurden isoliert und die Plasmid-DNA wurde präpariert und durch Restriktionskartierung und Nucleotidsequenzierung auf die Anwesenheit der korrekten hsp65-NP.B- oder -D-Fusionsgensequenz hin untersucht. Hsp65-NP.B (pET65mp/B)- und Hsp65-NP.D (pET65mp/D)-Fusionsproteine codierende korrekte Konstrukte wurden identifiziert und in nachfolgenden, auf die Expression von Fusionsproteinen in Bakterien und ihre Reinigung abzielenden Manipulationen verwendet. Siehe 4A-4B für schematische Darstellungen der Genkonstrukte der Fusionsproteine pET65MP/NP-B bzw. pET65MP/NP-D.
  • a.2. Expression und Reinigung von Hsp65-NP-Fusionsproteinen
  • Fusionsproteinkonstrukte wurden in den E. coli-Stamm BL21 (DE3; Novagen) transformiert und Fusionsproteine wurden in 6 Liter-Kulturen des letzteren Stammes unter Verwendung eines Protokolls, welches dem vom Hersteller vorgeschlagenen Protokoll sehr ähnlich ist, exprimiert. Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in 10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA und 5 mM beta-Mercaptoethanol, pH 7,5 suspendiert und durch Ultraschallbehandlung lysiert. Nach der Entfernung unlöslichen Materials durch Zentrifugation wurde Ammoniumsulfat bis zu einer 20%igen Sättigung hinzugefügt und ausfallende Proteine wurden durch Zentrifugation gewonnen. Die Anwesenheit von Fusionsprotein im Ammoniumsulfat-Sediment wurde durch SDS-PAGE, gefolgt von einer Coomassie-Blau-Färbung, überprüft. Der gleiche Test wurde verwendet, um alle nachfolgenden Reinigungsschritte zu überwachen. Das Protein wurde wieder in 30 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA und 5 mM beta-Mercaptoethanol, pH 7,5 gelöst und die Lösung wurde erschöpfend gegen den gleichen Puffer dialysiert, bevor sie auf eine im gleichen Puffer äquilibrierte DEAE Sepharose (fast flow, Pharmacia Biotech)-Säule aufgetragen wurde. Die Durchlauffraktion (ungebundenes Protein), welche typischer Weise etwa 90 mg Protein enthielt, wurde gesammelt. Um das Hsp65-NP.B-Fusionsprotein weiter zu reinigen, wurden 60 mg der letzteren Fraktion gegen 10 mM Natriumphosphat, pH 6,8 dialysiert und dann auf eine im gleichen Puffer äquilibrierte Hydroxyapatit (BIORAD)-Säule aufgetragen. Die Elution wurde unter Verwendung eines 0-600 mM-Kaliumphosphatgradienten durchgeführt. Dieses Verfahren ergab eine Ausbeute von nur etwa 5 mg Protein. Die Säule wurde dann weiter mit 4 M Guanidiniumhydrochlorid eluiert, was weitere 15 mg Protein entfernte. Die Fraktionen wurden gegen DPBS dialysiert und unter Verwendung einer Amicon-Ultrafiltrationsvorrichtung konzentriert, bevor sie auf eine Detoxiel-Säule aufgetragen wurden, um den Durchlauf pyrogenfrei zu machen. Um das Hsp65-NP.D-Fusionsprotein weiter zu reinigen, wurde die DEAE Sepharose-Durchlauffraktion gegen 30 mM Natriumacetat, 2 mM EDTA und 5 mM beta-Mercaptoethanol, pH 5,8-7,5 dialysiert und denn auf eine in dem selben Puffer äquilibrierte SP Sepharose (fast flow, Pharmacia Biotech)-Säule aufgetragen. Die Elution erfolgte mit einem 0-600 mM-NaCl-Gradienten. Eluiertes Hsp65-NP.D-Fusionsprotein wurde, wie für das Hsp65-NP.B-Fusionsprotein beschrieben, verarbeitet. Durch diese Verfahren gereinigte Fusionsproteine waren, wie anhand von SDS-PAGE-Gelen geschätzt, zu mehr als 90 % rein und im Wesentlichen pyrogenfrei.
  • b. Immunisierung von Mäusen und Präparation von Effektorzellen
  • Immunisierungen mit DPBS (in 5 & 6 bezeichnet als 0 μg 65-NP) oder 1-100 μg Hsp65-NP.B- oder Hsp65-NP.D-Fusionsproteinen und die Präparation von Effektorzellen wurden, im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt, außer dass C57BL/6-Mäuse in den Experimenten mit Hsp65-NP.B und BALB/c-Mäuse in den Experimenten mit Hsp65-NP.D verwendet wurden. Die in vitro-Restimulation wurde über einen Zeitraum von 7 Tagen entweder in Abwesenheit oder in der Anwesenheit von 3 U/ml rekombinantem menschlichem IL2 (um allgemein die Proliferation von T-Zellen zu stimulieren) durchgeführt.
  • c. CTL-Tests
  • Tests wurden, im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt, außer dass EL4 (H-2b)-Zielzellen in Experimenten mit dem Hsp65-NP.B-Fusionsprotein und P815 (H-2d)-Zielzellen in Experimenten mit dem Hsp65-NP.D-Fusionsprotein verwendet wurden. Um eine zusätzliche Kontrolle für die Spezifität der CTL-Antwort bereitzustellen, wurden Zielzellen entweder mit dem geeigneten NP-Peptid (ausgefüllte Symbole in 5A-5B & 6A-6B) gepulst, mit dem Peptid aus den irrelevanten Resten 49-57, abgeleitet von der Sequenz des HPV16E7-Proteins, (offene Symbole in 5A-5B) gepulst oder nicht gepulst (offene Symbole in 6A-6B).
  • Die Ergebnisse von Experimenten mit dem Hsp65-NP.B-Fusionsprotein (beschriftet als 65-P.b) werden in 5A-5B gezeigt. Die 5A bezieht sich auf eine Experiment, in welchem Effektorzellen in der Abwesenheit von IL2 restimuliert wurden, und 5B bezieht sich auf ein Experiment, in welchem Effektorzellen in der Anwesenheit von IL2 restimuliert wurden. Wie aus 5A offensichtlich wird, führt die Immunisierung mit Hsp65-NP.B-Fusionsprotein zu einer dramatischen Stimulation spezifischer CTL-Aktivität, welche gegen das NP.B-Peptid präsentierende Zielzellen gerichtet ist und etwa im Bereich von 20 bis zu 40 % Lyse der Zielzellen bei einem Verhältnis von Effektor : Zielzellen von 100 liegt. Es wurde im Wesentlichen keine spezifische Lyse mit den Effektorzellen von mit DPBS „immunisierten" Tieren beobachtet. Auch war keine signifikante Lyse von mit E7-Peptid gepulsten Zellen ersichtlich. In dem Experiment mit in der Anwesenheit von IL2 restimulierten Effektorzellen wurden sogar höhere Spiegel der Zielzelllyse mit Effektorzellen von mit dem Hsp65-NP.B-Fusionsprotein immunisierten Mäusen beobachtet. Die Spiegel lagen abhängig von der Dosis des Fusionsproteins im Bereich von etwa 25 bis 60 % bei einem Verhältnis von Effektor : Zielzellen von 100. Diese Werte übersteigen in hohem Maße die bei Effektorzellen von mit DPBS injizierten Mäusen beobachtete Lyse von 10-15 %. Erneut wurde keine wesentliche (höher als mit Effektorzellen von mit DPBS „immunisierten" Mäusen beobachtet) spezifische Lyse von mit E7-Peptid gepulsten Zielzellen beobachtet.
  • Die Ergebnisse von Experimenten mit dem Hsp65-NP.D-Fusionsprotein (beschriftet als 65-NP.D) werden in 6A-6B gezeigt. Im Allgemeinen sind diese Ergebnisse ähnlich zu denen, welche in den Experimenten mit dem Hsp65-NP.B-Fusionsprotein erhalten wurden. Man beachte, dass anders als im vorhergehenden Experiment mit Hsp65-NP.B, eine klare Abhängigkeit von der Dosis von dem in den Immunisierungen verwendeten Hsp65-NP.D-Peptid in diesem Experiment beobachtet wurde. Zusammen zeigen diese Experimente unter Verwendung von Hsp65-NP-Fusionsproteinen als Beispiel, dass Immunisierungen mit einem Hsp-Fremdpeptid/Polypeptid-Fusionsprotein zu einer drastischen Stimulation von CTL- Aktivität führen, welche gegen geeignete Zielzellen gerichtet ist, die Epitope präsentieren, welche in dem Fremdpeptid/Polypeptid-Fusionspartner enthalten sind.
  • Beispiel 5: CTL-Antworten auf ein Hsp-P1A-Fusionsprotein
  • Unter Verwendung von Verfahren, welche denen ähnlich sind, die in den vorangehenden Beispielen verwendet wurden, wurde ein Plasmid erstellt, dass die Expression eines Fusionsgens in E. coli erlaubt, welches die komplette codierende Sequenz des Stressproteins Hsp71 aus M. tuberculosis und an das Carboxylende der Hsp71-Sequenz angefügt vier in Tandemformation angeordnete Kopien einer synthetischen Sequenz enthält, welche ein minimales CTL-Epitop eines tumorassoziierten Antigens P1A codiert (LPYLGWLVP (SEQ ID NO: 7); diese Sequenz wird in diesem Beispiel als P1A bezeichnet). Das Hsp71-P1A-Fusionsprotein (in den 7A, 7B, 8A und 9 als 71-P1A(4) bezeichnet) wurde unter Verwendung von biochemischen Standardverfahren, ähnlich denen, die in dem vorangehenden Beispiel verwendet wurden, exprimiert und gereinigt.
  • BALB/c oder DBA/2 (H-2d)-Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion von Ketaminhydrochlorid anästhesiert. Die Mäuse wurden dann subkutan über den Nacken mit 0, 5, 50 oder 500 μg des Hsp71-P1A-Fusionsproteins immunisiert. Das Immunogen wurde in DPBS ohne Adjuvans verabreicht. Eine Woche später wurden Einzelzellsuspensionen aus vier vereinigten Milzen pro Gruppe präpariert und in vitro über 7 Tage mit dem synthetischen Peptid CKKKLPYLGWLVP (SEQ ID NO: 8) (1 μM) restimuliert. Man beachte, dass die CKKK-Reste hinzugefügt wurden, um die Wasserlöslichkeit des P1A-Nonamers zu verbessern. Restimulierte Effektorzellen wurden dann über 4-5 Stunden zusammen mit 51Cr-markierten Zielzellen gezüchtet. Die Zielzellen waren Zellen von dem das P1A-Antigen exprimierenden Clon P1 (H-2d) des P815-Mastozytoms oder alternativ mit (CKKK) P1A gepulste L1210-Zellen (H-2d) oder als Kontrollzielzellen ungepulste L1210-Zellen bei einem Verhältnis von Effektor : Zielzellen von 100, 33 oder 11 : 1. Die spezifische Lyse der Zielzellen wurde, wie Beispiel 2 beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse dieser Experimente werden in den 7A-7B (BALB/c-Mäuse) und 8A-8B (DBA/2-Mäuse) dargestellt. Die Hintergrundlyse in diesen Experimenten war, wie durch die gegen irrelevante Zielzellen (ungepulste L1210-Zellen) beobachtete lytische Aktivität angezeigt, weniger als 5 %. Restimulierte Zellen von nicht-immunisierten Mäusen (0 μg) zeigten keine lytische Aktivität weder gegen P1-Zielzellen (7A, 8A) noch CKKK (P1A)gepulste L1210-Zellen (7B, 8B). Zellen von Mäusen, welche mit so wenig wie 5 μg des Hsp71-P1A-Fusionsproteins immunisiert worden waren, zeigten eine messbare lytische Aktivität, wobei die maximale Antwort in Zellen von mit 50-500 μg immunisierten Mäusen gesehen wurde.
  • Beispiel 6: Konfrontation von mit Hsp71-P1A-Fusionsprotein immunisierten Mäusen mit einem Tumor
  • Mäuse wurden wie im vorangehenden Beispiel immunisiert, außer dass drei Injektionen in Abständen von zwei Wochen gegeben wurden. Zwei Wochen nach der abschließenden Injektion wurden die Mäuse durch intraperitoneale Injektion mit 1000 lebensfähigen P1-Tumorzellen konfrontiert. Nach 26 Tagen wurden die Mäuse euthanasiert, gewogen und die gesamte Masse des Inhalts des Abdomens wurde zerlegt und gewogen. Die Ergebnisse dieses Experiments werden in 9 gezeigt. Es wurde beobachtet, dass in Mäusen, welchen drei Immunisierungen mit 50 μg Hsp71-P1A-Fusionsprotein gegeben wurden, die Masse des Inhalts des Abdomens, dargestellt als Prozentanteil des gesamten Körpergewichts, wesentlich geringer war als dies in nicht-immunisierten Mäusen (0 μg, P < 0,03) gefunden wurde und ähnlich derjenigen war, welche in Mäusen beobachtet wurde, denen keine Tumorzellen injiziert wurden (Kontrolle).
  • Zusammengenommen zeigen die Experimente in den Beispielen 5 und 6, dass die Immunisierung mit Hsp-tumorassoziiertem Antigen unter Verwendung von Hsp71-P1A als Beispiel zu einer wesentlichen Stimulation der CTL-Aktivität führt, welche gegen Zellen gerichtet ist, die irrelevante MHC Klasse I-restringierte Epitope präsentieren. Weiterhin führt eine solche Immunisierung zur Expression einer relevanten Effektorfunktion, nämlich Immunität gegen eine Konfrontation mit einem Tumor, der das Antigen exprimiert, gegen welches immunisiert wurde.

Claims (19)

  1. Fusionsprotein, umfassend ein Antigen eines Influenzavirus und ein Stressprotein oder ein Fragment davon, mit der Maßgabe, dass solch ein Fragment die Konformations-Epitope enthält, welche in die Verstärkung der Immunantwort auf das Antigen involviert sind, wobei das Fusionsprotein eine Immunantwort gegen das Antigen in einem Säuger auslöst, welchem das Fusionsprotein verabreicht wurde.
  2. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei das Antigen des Influenzavirus Hämagglutinin, Nucleoprotein, Neuraminidase, M1, M2, PB1, PB2 oder PA ist.
  3. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei das Fusionsprotein von Plasmid pET65MP/NP-B, wie in 4A gezeigt, oder Plasmid pET65MP/NP-D, wie in 4B gezeigt, codiert wird.
  4. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei das Stressprotein ein Hsp100-200, ein Hsp100, ein Hsp90, Lon, ein Hsp70, ein Hsp60, TF55, ein Hsp40, ein FKBP, ein Cyclophillin, ein Hsp20-30, C1pP, GrpE, Hsp10, Ubiquitin, Calnexin oder eine Proteindisulfidisomerase ist.
  5. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei das bakterielle Stressprotein ein mycobakterielles Stressprotein ist.
  6. Fusionsprotein nach Anspruch 5, wobei das mycobakterielle Stressprotein Hsp65 ist.
  7. Fusionsprotein nach Anspruch 5, wobei das mycobakterielle Stressprotein Hsp71 ist.
  8. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei das Stressprotein ein Hitzeschockprotein ist.
  9. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei das Antigen mindestens ein B-Zell-Epitop umfasst.
  10. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei das Antigen mindestens ein T-Zell-Epitop umfasst.
  11. Fusionsprotein nach Anspruch 10, wobei das Antigen mindestens ein CTL-Zell-Epitop umfasst.
  12. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei die Immunantwort eine zellvermittelte Immunantwort ist.
  13. Fusionsprotein nach Anspruch 12, wobei die zellvermittelte Immunantwort eine zellvermittelte cytolytische Immunantwort ist.
  14. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei die Immunantwort eine T-Helferzell- oder eine B-Zell-Immunantwort ist.
  15. Zusammensetzung, umfassend das Fusionsprotein nach einem der vorausgehenden Ansprüche und einen pharmazeutisch verträglichen Excipienten oder Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel oder Vehikel.
  16. Polynucleotid, welches das Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 14 codiert.
  17. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Verwendung bei der Auslösung einer Immunantwort in einem Säuger.
  18. Polynucleotid nach Anspruch 16 zur Verwendung bei der Auslösung einer Immunantwort in einem Säuger.
  19. In-vitro-Verwendung des Polynucleotids nach Anspruch 16 zur Herstellung eines Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 14.
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