CN110381990A - 马的瘙痒症的治疗 - Google Patents
马的瘙痒症的治疗 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110381990A CN110381990A CN201880016752.3A CN201880016752A CN110381990A CN 110381990 A CN110381990 A CN 110381990A CN 201880016752 A CN201880016752 A CN 201880016752A CN 110381990 A CN110381990 A CN 110381990A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- acid sequence
- eil
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 title claims abstract description 317
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 title claims abstract description 207
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 72
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 135
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 claims abstract description 128
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 claims abstract description 123
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 113
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 95
- 230000001823 pruritic effect Effects 0.000 claims abstract description 74
- 206010012434 Dermatitis allergic Diseases 0.000 claims abstract description 72
- 206010027654 Allergic conditions Diseases 0.000 claims abstract description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 380
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 claims description 298
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 255
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 254
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 254
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 254
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 211
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 211
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 187
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 174
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 135
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 135
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 claims description 95
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 92
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims description 92
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 80
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 66
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 claims description 56
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 claims description 51
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 51
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 50
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 claims description 47
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 40
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 32
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 27
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 208000028990 Skin injury Diseases 0.000 claims description 24
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 24
- 208000002474 Tinea Diseases 0.000 claims description 23
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 23
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 22
- 206010012504 Dermatophytosis Diseases 0.000 claims description 21
- 241001460074 Microsporum distortum Species 0.000 claims description 21
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 21
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 claims description 21
- 241001534160 Escherichia virus Qbeta Species 0.000 claims description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 20
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 20
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 17
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 claims description 16
- 101000960972 Equus caballus Interleukin-5 Proteins 0.000 claims description 16
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 claims description 16
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 claims description 16
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 16
- 208000006877 Insect Bites and Stings Diseases 0.000 claims description 15
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 14
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 12
- 208000000884 Airway Obstruction Diseases 0.000 claims description 11
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 11
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 11
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 claims description 10
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims description 10
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 claims description 10
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 claims description 10
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 claims description 9
- 230000036428 airway hyperreactivity Effects 0.000 claims description 8
- 208000002352 blister Diseases 0.000 claims description 8
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 7
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 claims description 6
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 claims description 6
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 claims description 5
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 claims description 5
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 5
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 claims description 5
- 230000007803 itching Effects 0.000 claims description 4
- 238000007790 scraping Methods 0.000 claims description 4
- 206010063409 Acarodermatitis Diseases 0.000 claims description 3
- 241000447727 Scabies Species 0.000 claims description 3
- 230000006651 lactation Effects 0.000 claims description 3
- 208000005687 scabies Diseases 0.000 claims description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 102
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 13
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 164
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 120
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 97
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 69
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 63
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 52
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 52
- 101710181613 Interleukin-31 Proteins 0.000 description 41
- 102100021596 Interleukin-31 Human genes 0.000 description 41
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 37
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 36
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 36
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 35
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 32
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 32
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 31
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 30
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 29
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 29
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 28
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 28
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 28
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 28
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 28
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 25
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 25
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 24
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 24
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 23
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 23
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 22
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 22
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 22
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 206010016936 Folliculitis Diseases 0.000 description 21
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 21
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 21
- 238000011160 research Methods 0.000 description 21
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 20
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 20
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 20
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 19
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 19
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 18
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 17
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 16
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 16
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 15
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 15
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 14
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 14
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 13
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 13
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 12
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 12
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 12
- WCMOHMXWOOBVMZ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)propanoylamino]hexanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)CCN1C(=O)C=CC1=O WCMOHMXWOOBVMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 11
- -1 poloxamer polyol Chemical class 0.000 description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 11
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 description 11
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 10
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 10
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 10
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 10
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 10
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 10
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 10
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 10
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 9
- 230000036074 healthy skin Effects 0.000 description 9
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 9
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 9
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 9
- 241000256135 Chironomus thummi Species 0.000 description 8
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 8
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 8
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 101001043822 Mus musculus Interleukin-31 Proteins 0.000 description 7
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 7
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 7
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 6
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 6
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 5
- 241000134316 Culicoides <genus> Species 0.000 description 5
- 206010014025 Ear swelling Diseases 0.000 description 5
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 5
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000934064 Acarus siro Species 0.000 description 4
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 4
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 4
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 4
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 4
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 4
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 4
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 4
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 4
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 4
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 4
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000143 2-carboxyethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 241001672158 Acinetobacter phage AP205 Species 0.000 description 3
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 3
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 3
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 3
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 3
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 101000756628 Mus musculus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 3
- 244000207667 Rumex vesicarius Species 0.000 description 3
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 3
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 3
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N anhydrous guanidine Natural products NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 3
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 230000035617 depilation Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 3
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 3
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- HCXJFMDOHDNDCC-UHFFFAOYSA-N 5-$l^{1}-oxidanyl-3,4-dihydropyrrol-2-one Chemical group O=C1CCC(=O)[N]1 HCXJFMDOHDNDCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 241000219496 Alnus Species 0.000 description 2
- 241000219495 Betulaceae Species 0.000 description 2
- 208000003014 Bites and Stings Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 241000256054 Culex <genus> Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 208000001840 Dandruff Diseases 0.000 description 2
- 241000238713 Dermatophagoides farinae Species 0.000 description 2
- 241000238740 Dermatophagoides pteronyssinus Species 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010014950 Eosinophilia Diseases 0.000 description 2
- 241000283070 Equus zebra Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 2
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 108010070503 PAR-2 Receptor Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000018402 Protease-activated receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 238000001604 Rao's score test Methods 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000021501 Rumex crispus Nutrition 0.000 description 2
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 2
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 241001494139 Stomoxys Species 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000893966 Trichophyton verrucosum Species 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 241000132125 Tyrophagus Species 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 2
- 229940074608 allergen extract Drugs 0.000 description 2
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229910021502 aluminium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 2
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- LWQQLNNNIPYSNX-UROSTWAQSA-N calcipotriol Chemical compound C1([C@H](O)/C=C/[C@@H](C)[C@@H]2[C@]3(CCCC(/[C@@H]3CC2)=C\C=C\2C([C@@H](O)C[C@H](O)C/2)=C)C)CC1 LWQQLNNNIPYSNX-UROSTWAQSA-N 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 208000002551 irritable bowel syndrome Diseases 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- CUXQLKLUPGTTKL-UHFFFAOYSA-M microcosmic salt Chemical compound [NH4+].[Na+].OP([O-])([O-])=O CUXQLKLUPGTTKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000006748 scratching Methods 0.000 description 2
- 230000002393 scratching effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 2
- PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N sulfanyl Chemical class [SH] PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 2
- 238000006177 thiolation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 230000007501 viral attachment Effects 0.000 description 2
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWWVBNODQCWBAZ-WHFBIAKZSA-N (2r)-2-amino-3-[(2r)-2-carboxy-2-(methylamino)ethyl]sulfanylpropanoic acid Chemical group CN[C@H](C(O)=O)CSC[C@H](N)C(O)=O QWWVBNODQCWBAZ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DIYPCWKHSODVAP-UHFFFAOYSA-N 1-[3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1=CC=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=C1 DIYPCWKHSODVAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CULQNACJHGHAER-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[(2-iodoacetyl)amino]benzoyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1=CC=C(NC(=O)CI)C=C1 CULQNACJHGHAER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASNTZYQMIUCEBV-UHFFFAOYSA-N 2,5-dioxo-1-[6-[3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoylamino]hexanoyloxy]pyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 ASNTZYQMIUCEBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QEDXSHCYPROEOK-UHFFFAOYSA-N 3-phosphanylpropanoic acid Chemical class OC(=O)CCP QEDXSHCYPROEOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000006409 Acacia auriculiformis Species 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 102000005869 Activating Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010005254 Activating Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241001295693 Culicoides nubeculosus Species 0.000 description 1
- 241000857301 Culicoides obsoletus Species 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 1
- 101000756631 Equus caballus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000599939 Equus caballus Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 101001033250 Equus caballus Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 101001002710 Equus caballus Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000599065 Equus caballus Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 208000035874 Excoriation Diseases 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000586302 Homo sapiens Oncostatin-M-specific receptor subunit beta Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035154 Hyperesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000699667 Mus spretus Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061876 Obstruction Diseases 0.000 description 1
- 102100030098 Oncostatin-M-specific receptor subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 206010033733 Papule Diseases 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 244000137827 Rumex acetosa Species 0.000 description 1
- 235000015807 Rumex acetosa ssp. acetosa Nutrition 0.000 description 1
- 235000015447 Rumex acetosa ssp. alpestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000015448 Rumex acetosa ssp. ambiguus Nutrition 0.000 description 1
- 235000015437 Rumex acetosa ssp. arifolius Nutrition 0.000 description 1
- 235000015436 Rumex acetosa ssp. lapponicus Nutrition 0.000 description 1
- 235000015441 Rumex acetosa ssp. pseudoxyria Nutrition 0.000 description 1
- 235000015439 Rumex acetosa ssp. thyrsiflorus Nutrition 0.000 description 1
- 235000002905 Rumex vesicarius Nutrition 0.000 description 1
- 108700031620 S-acetylthiorphan Proteins 0.000 description 1
- 241000134399 Simulium sp. Species 0.000 description 1
- 206010070835 Skin sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000255626 Tabanus <genus> Species 0.000 description 1
- GUGOEEXESWIERI-UHFFFAOYSA-N Terfenadine Chemical compound C1=CC(C(C)(C)C)=CC=C1C(O)CCCN1CCC(C(O)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)CC1 GUGOEEXESWIERI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000219422 Urtica Species 0.000 description 1
- 235000009108 Urtica dioica Nutrition 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 1
- 239000013567 aeroallergen Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000009285 allergic inflammation Effects 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 description 1
- 239000004411 aluminium Substances 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 159000000013 aluminium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910000329 aluminium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001387 anti-histamine Effects 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000746 body region Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 229960002882 calcipotriol Drugs 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- DXHPZXWIPWDXHJ-UHFFFAOYSA-N carbon monosulfide Chemical compound [S+]#[C-] DXHPZXWIPWDXHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 1
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003694 hair properties Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940100602 interleukin-5 Drugs 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003040 nociceptive effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000004714 phosphonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 229960003471 retinol Drugs 0.000 description 1
- 235000020944 retinol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011607 retinol Substances 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000370 skin sensitisation Toxicity 0.000 description 1
- MKNJJMHQBYVHRS-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[11-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)undecanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCCCCCCCCN1C(=O)C=CC1=O MKNJJMHQBYVHRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- MIDXXTLMKGZDPV-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[6-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)hexanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCCCN1C(=O)C=CC1=O MIDXXTLMKGZDPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- RAOIDOHSFRTOEL-UHFFFAOYSA-N tetrahydrothiophene Chemical compound C1CCSC1 RAOIDOHSFRTOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000009732 tufting Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/04—Antipruritics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5409—IL-5
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及用于预防或治疗选自马科哺乳动物(优选马)的瘙痒病症或过敏性病症的病症或疾病的组合物、免疫原性或疫苗组合物以及药物组合物。此外，本发明提供了预防或治疗马科哺乳动物(优选马)的瘙痒症、优选与瘙痒病症相关的瘙痒症或过敏性皮炎等过敏性病症的方法。
Description
技术领域
本发明涉及用于预防或治疗选自马科哺乳动物、优选马的瘙痒病症或过敏性病症的病症或疾病的组合物、免疫原性或疫苗组合物和药物组合物。此外，本发明提供了预防或治疗马科哺乳动物(优选马)的瘙痒病症、优选与瘙痒病症相关的瘙痒症或过敏性皮炎等过敏性病症的方法。
相关技术
瘙痒症状和过敏症状常见于马(S.D.White,Equine vet.Educ.(2015)27(3)156-166)。瘙痒症介导的皮肤瘙痒例如在临床上表现为皮炎表型并且可能是过敏源。对过敏性皮炎的发展知之甚少。涉及的潜在因素很多。虽然潜在的原因是过敏原，但抗组胺药效果甚微，且既不能治愈也不能缓解瘙痒和皮炎(S.D.White,Equine vet.Educ.(2015)27(3)156-166)。潜在的过敏原因可以是环境来源的，例如来自树木、草、花粉、霉菌、真菌、尘螨、灰尘、皮屑、饲料(粮草)螨虫和昆虫的过敏原，但也有来自食物中成分的过敏原。此外，遗传易感性被认为有利于瘙痒症引起的过敏性皮炎(Yu&Rosychuk 2013,Equine Dermatology,Veterinary Clincis of North America:Equine Practice)。
马中最具特征性的疾病显示为瘙痒症的特征与过敏性皮炎相结合，被称为昆虫叮咬高敏症(IBH)，也称为“甜痒”或“夏季湿疹”。其是马科哺乳动物、特别是马中最常见的过敏性皮肤病，并且表现为由在世界各地发现的库蠓(Culicoides)属的昆虫叮咬引起的慢性复发性季节性过敏性皮炎。各种研究表明IBH与针对来自库蠓的唾液腺蛋白的IgE介导的反应有关。IBH的临床症状源于对食血昆虫叮咬的高敏反应引起的强烈瘙痒。该疾病最初的特征在于许多丘疹、簇绒毛发、感觉过敏和皮肤过敏，然后是刮擦(scratching)和摩擦(rubbing)。这种自我创伤(self trauma)导致局部脱发和表皮脱落，导致继发感染的持续存在。如果疾病进展并变成慢性，可能导致纤维化，表皮组织肥大，明显的角化过度和苔藓化，可见皮肤增厚、鳞屑、横脊和褶皱的形成(Schaffartzik A.,et al.,Vet ImmunolImmunopathol,2012,147:113–126)。通常，由其他过敏原引起的过敏表现出类似的皮炎临床症状(Yu&Rosychuk 2013,Equine Dermatology,Veterinary Clincis of NorthAmerica:Equine Practice)。
白细胞介素-31(IL-31)优先由活化的Th2 CD4+细胞分泌，也可从肥大细胞和巨噬细胞分泌(Dillon等,Nat Immunol 2004；5:752-60)。Th2细胞在I型过敏反应中起关键作用，而且最近也与代表免疫细胞和瘙痒感觉神经之间神经免疫串扰的“缺失连接”(missinglink)联系起来。IL-31属于pgl30/IL-6细胞因子家族，并与由IL-31受体A(IL-31RA)和制瘤素M受体β(OSMRβ)亚基组成的异二聚体受体复合物结合(Dillon等,2004Nat Immunol2004；5:752-60；Bilsborough等,J Allergy Clin Immunol.2006 117(2)；418-25)。配体结合后，IL-31受体复合物激活Janus激酶信号转导和转录激活因子(JAK-STAT)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途径(Zhang等，2008)。IL-31可直接结合由一小部分背根神经节(DRG)的小型伤害性神经元表达的受体，表明该细胞因子可直接激活外周神经中的瘙痒信号(Mizuno等,2009；Sonkoly等,2006)。此外，该受体存在于多种其他细胞上，例如角质形成细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞(Kasraie等，2011；Kasraie等，2010；Zhang等，2008)。
过表达IL-31的转基因小鼠出现严重的瘙痒、脱毛和皮肤损伤，伴随着炎症细胞向皮肤的浸润增加(Dillon等，2004)。已知IL-31的皮内注射诱导鼠皮肤中的瘙痒(刮擦)(Zhang等，2008，Cevikba 2013)。患有特应性皮炎(AD)的患者具有皮肤归巢CD45RO+记忆皮肤淋巴细胞相关抗原(CLA)阳性T细胞，其表达IL-31并且几乎只在真皮中发现Th2细胞。大约60％的Th2细胞对IL-31呈阳性，而在其他免疫或驻留的皮肤细胞如角质形成细胞、内皮细胞和成纤维细胞中未发现IL-31mRNA。除Th2细胞外，IL-31的唯一其他来源是成熟的树突细胞，尽管它们与Th2细胞相比产生显著更低的水平(约100倍)(Ferdac Cevikbas,J ClinAllergy 2013)。AD患者皮肤损伤中IL-31mRNA的水平显著高于健康患者的损伤(Sonkoly等,J Allergy Clin Immunol 2006；117:411-7)。用于治疗AD人类患者瘙痒的抗人IL-31抗体(Bristol-Myres Squibb)于2012年进入临床试验(www.ClinicalTrials.gov:NCT01614756)，以及用于治疗狗的AD的单克隆抗犬IL-31抗体最近进入市场(Gonzales等,Vet Dermatol 2013；24:48-e12；Michels等,Vet Dermatol 2016；27:478-e129)。
IL-31诱导的瘙痒不依赖于肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒或蛋白酶激活受体-2(PAR-2)介导的瘙痒。因此，似乎IL-31介导的瘙痒与I型机制没有直接关联，然而，I型过敏事件可以进一步增加瘙痒，因为人和犬AD病变中IL-4和IL-13mRNA的表达与IL-31mRNA水平相关(Nei等,J.Allergy Clin.Immunol.2006；118,930-937)。与此一致，表明IL-31可能促进过敏性炎症(Chattopadhyay等,J Biol Chem 2007；282:3014-26；Wai等,Immunology2007；122,532-541)。
目前用于解决马科哺乳动物、特别是马的瘙痒病症或过敏性病症和疾病的治疗包括例如糖皮质激素或其他全身施用的类固醇。由于诸如这些糖皮质激素的毒性副作用的缺点(特别是在长期治疗中)，对于马科哺乳动物、特别是马的所述病症和疾病的替代治疗选择存在未满足的需求。
发明内容
来自皮炎影响的皮肤损伤的马的皮肤活组织检查令人惊讶地显示马IL-31mRNA在来自患有瘙痒性皮炎的部位的皮肤损伤中表达，而在健康的马皮肤样品中完全不存在。这是第一次在马的瘙痒性皮肤损伤中除通常存在于所述损伤中的嗜酸性粒细胞外检测到马IL-31，因此这是第一次表明马IL-31在马的过敏性瘙痒病理中的主要作用。此外，令人惊讶地发现，将包含与核心颗粒(优选病毒样颗粒)连接的马白细胞介素-31抗原的本发明组合物施用于马不仅导致自身抗体的强烈诱导，而且更进一步地，本发明的组合物可有效预防和治疗马科哺乳动物、优选马的选自瘙痒病症或过敏性病症的病症或疾病，特别是对预防和治疗瘙痒症和瘙痒相关性皮炎有效。后者通过用受瘙痒性过敏性皮炎影响冰岛马的体内研究证明。本发明组合物的有效性令人惊讶地不依赖于引起所述瘙痒或瘙痒相关性皮炎的可能的过敏性引发物，无论其来自树木、草、花粉、尘螨、昆虫等的过敏原。
因此，由多种过敏原引起的受瘙痒或瘙痒相关性皮炎影响的马的疫苗接种与含有与CMV-VLP连接的eIL-31抗原的本发明组合物不仅导致平均皮肤损伤评分显著降低，而且特别导致与用本发明组合物治疗前的季节中确定的所述评分相比，平均瘙痒评分显著降低。当根据本发明的优选组合疫苗，即包含与CMV-VLP连接的eIL-31抗原的组合物和包含与CMV-VLP连接的eIL-5抗原的组合物用于治疗受瘙痒或由多种过敏原引起的瘙痒相关性皮炎影响的马时，发现了相同的令人惊讶的结果。由于许多马通常不仅对单一过敏原过敏，而且对多种过敏原有反应(也由于不同过敏原的交叉反应)，因此非常需要不依赖于过敏原的治疗以有效地解决由所述过敏性病症或疾病引起的常见瘙痒表型。
因此，在第一方面，本发明提供了一种组合物，其包含：(a)具有至少一个第一连接位点的核心颗粒；(b)具有至少一个第二连接位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是马白细胞介素-31抗原(eIL-31抗原)，其中所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQID NO：1的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：1有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、又进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；其中(a)和(b)通过所述至少一个第一连接位点和所述至少一个第二连接位点经由至少一个非肽共价键连接；用于预防或治疗选自马科哺乳动物的、优选马的瘙痒病症或过敏性病症的病症或疾病的方法，其中优选将有效量的所述组合物施用于所述马科哺乳动物，优选施用于所述马。
在一个优选的实施方案中，所述病症或疾病是马科哺乳动物的瘙痒，优选马的瘙痒。在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒症是与过敏性皮炎相关的瘙痒症或与特应性皮炎相关的瘙痒症。在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒症是与过敏性皮炎相关的瘙痒症。在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒症是与特应性皮炎相关的瘙痒症。在进一步优选的实施方案中，所述病症或疾病不是预防或治疗马科哺乳动物的、优选马的昆虫叮咬高敏症(IBH)。在进一步优选的实施方案中，所述病症或疾病是预防或治疗马科哺乳动物的、优选马的昆虫叮咬高敏症(IBH)。
在另一方面，本发明提供一种组合物，其包含：(a)具有至少一个第一连接位点的核心颗粒；(b)具有至少一个第二连接位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是马白细胞介素-31抗原(eIL-31抗原)，其中所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：1有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、又进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；其中(a)和(b)通过所述至少一个第一连接位点和所述至少一个第二连接位点经由至少一个非肽共价键连接；用于预防或治疗马科哺乳动物、优选马的瘙痒症的方法，其中优选所述瘙痒症与瘙痒病症或过敏性病症有关，并且其中又进一步优选地，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病、瘙痒症、过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病、复发性荨麻疹、疱疹、炎性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺病和由自身免疫引起的炎症过程，并且其中优选地，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、瘙痒症、过敏性皮炎和复发性荨麻疹，并且其中优选将有效量的所述组合物施用于所述马科哺乳动物，优选地施用于所述马。在一个优选的实施方案中，所述瘙痒症是与过敏性皮炎相关的瘙痒症或与特应性皮炎相关的瘙痒症。在优选的实施方案中，所述病症或疾病是与过敏性皮炎相关的瘙痒症。在另一个优选的实施方案中，所述病症或疾病是与特应性皮炎相关的瘙痒症。在一个优选的实施方案中，所述病症或疾病不是预防或治疗马科哺乳动物、优选马的昆虫叮咬高敏症(IBH)。在一个优选的实施方案中，所述病症或疾病是预防或治疗马科哺乳动物、优选马的昆虫叮咬高敏症(IBH)。
在又一方面，本发明提供了包含第一组合物和第二组合物的组合物，其中所述第一组合物包含：(a)具有至少一个第一连接位点的第一核心颗粒；(b)具有至少一个第二连接位点的至少一种第一抗原，其中所述至少一种第一抗原是马白细胞介素-31抗原(eIL-31抗原)，其中所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：1有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、又进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一连接位点和所述至少一个第二连接位点经由至少一个非肽共价键连接；并且其中所述第二组合物包含：(c)具有至少一个第一连接位点的第二核心颗粒；(d)具有至少一个第二连接位点的至少一种第二抗原，其中所述至少一种第二抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质或与SEQID NO：6有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、又进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；并且其中(c)和(d)通过所述至少一个第一连接位点和所述至少一个第二连接位点经由至少一个非肽共价键连接，并且其中任选地所述第一种或所述第二种组合物还包含佐剂。在另一方面，本发明提供了用作药物的所述本发明的组合物。
在又一方面，本发明提供了包含第一组合物和第二组合物的试剂盒，其中所述第一组合物包含：(a)具有至少一个第一连接位点的第一核心颗粒；(b)具有至少一个第二连接位点的至少一种第一抗原，其中所述至少一种第一抗原是马白细胞介素-31抗原(eIL-31抗原)，其中所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：1有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、又进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一连接位点和所述至少一个第二连接位点经由至少一个非肽共价键连接；并且其中所述第二组合物包含：(c)具有至少一个第一连接位点的第二核心颗粒；(d)具有至少一个第二连接位点的至少一种第二抗原，其中所述至少一种第二抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质或与SEQID NO：6有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、又进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；并且其中(c)和(d)通过所述至少一个第一连接位点和所述至少一个第二连接位点经由至少一个非肽共价键连接，并且其中任选地所述第一种或所述组合物还包含佐剂。在另一方面，本发明提供了用作药物的所述本发明的试剂盒。
在又一方面，本发明提供了包含第一组合物和第二组合物的组合物，其中所述第一组合物包含：(a)具有至少一个第一连接位点的第一核心颗粒；(b)具有至少一个第二连接位点的至少一种第一抗原，其中所述至少一种第一抗原是马白细胞介素-31抗原(eIL-31抗原)，其中所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：1有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、又进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一连接位点和所述至少一个第二连接位点经由至少一个非肽共价键连接；并且其中所述第二组合物包含：(c)具有至少一个第一连接位点的第二核心颗粒；(d)具有至少一个第二连接位点的至少一种第二抗原，其中所述至少一种第二抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质或与SEQID NO：6有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、又进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；并且其中(c)和(d)通过所述至少一个第一连接位点和所述至少一个第二连接位点经由至少一个非肽共价键连接；用于预防或治疗选自马科哺乳动物的、优选马的瘙痒病症或过敏性病症的病症或疾病的方法，其中优选将有效量的所述组合物施用于所述马科哺乳动物，优选施用于所述马。优选地，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病、瘙痒症、过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病、复发性荨麻疹、疱疹、炎性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺病和由自身免疫引起的炎症过程，并且其中优选地，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、瘙痒症、过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病和复发性荨麻疹，并且其中优选地，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、瘙痒症、过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)和复发性荨麻疹，并且其中进一步优选地，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、瘙痒症、过敏性皮炎和复发性荨麻疹。
在又一方面，本发明提供了包含第一组合物和第二组合物的组合物，其中所述第一组合物包含：(a)具有至少一个第一连接位点的第一核心颗粒；(b)具有至少一个第二连接位点的至少一种第一抗原，其中所述至少一种第一抗原是马白细胞介素-31抗原(eIL-31抗原)，其中所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：1有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、又进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一连接位点和所述至少一个第二连接位点经由至少一个非肽共价键连接；并且其中所述第二组合物包含：(c)具有至少一个第一连接位点的第二核心颗粒；(d)具有至少一个第二连接位点的至少一种第二抗原，其中所述至少一种第二抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质或与SEQID NO：6有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、又进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；并且其中(c)和(d)通过所述至少一个第一连接位点和所述至少一个第二连接位点经由至少一个非肽共价键连接；用于预防或治疗马科哺乳动物、优选马的瘙痒症的方法，其中优选所述瘙痒症与瘙痒病症或过敏性病症有关，并且其中又进一步优选地，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病、瘙痒症、过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病、复发性荨麻疹、疱疹、炎性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺病和由自身免疫引起的炎症过程，并且其中优选地，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、瘙痒症、过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病和复发性荨麻疹，并且其中优选地，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、瘙痒症、过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)和复发性荨麻疹，并且其中进一步优选地，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、瘙痒症、过敏性皮炎和复发性荨麻疹，并且其中优选将有效量的所述组合物施用于所述马科哺乳动物，优选施用于所述马。在一个优选的实施方案中，所述瘙痒是与过敏性皮炎相关的瘙痒症或与特应性皮炎相关的瘙痒症。在一个优选的实施方案中，所述病症或疾病是马科哺乳动物的瘙痒症，优选马的瘙痒症。在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒症是与过敏性皮炎相关的瘙痒症或与特应性皮炎相关的瘙痒症。在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒症是与过敏性皮炎相关的瘙痒症。在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒症是与特应性皮炎相关的瘙痒症。在一个优选的实施方案中，所述病症或疾病不是预防或治疗马科哺乳动物、优选马的昆虫叮咬高敏症(IBH)。在一个优选的实施方案中，所述病症或疾病是预防或治疗马科哺乳动物、优选马的昆虫叮咬高敏症(IBH)。
在又一方面，本发明提供了包含第一组合物和第二组合物的试剂盒，其中所述第一组合物包含：(a)具有至少一个第一连接位点的第一核心颗粒；(b)具有至少一个第二连接位点的至少一种第一抗原，其中所述至少一种第一抗原是马白细胞介素-31抗原(eIL-31抗原)，其中所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：1有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、又进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一连接位点和所述至少一个第二连接位点经由至少一个非肽共价键连接；并且其中所述第二组合物包含：(c)具有至少一个第一连接位点的第二核心颗粒；(d)具有至少一个第二连接位点的至少一种第二抗原，其中所述至少一种第二抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质或与SEQID NO：6有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、又进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；并且其中(c)和(d)通过所述至少一个第一连接位点和所述至少一个第二连接位点经由至少一个非肽共价键连接；用于预防或治疗马科哺乳动物、优选马的瘙痒症的方法，其中优选所述瘙痒症与瘙痒病症或过敏性病症有关，并且其中又进一步优选地，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病、瘙痒症、过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病、复发性荨麻疹、疱疹、炎性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺病和由自身免疫引起的炎症过程，并且其中优选地，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、瘙痒症、过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病和复发性荨麻疹，并且其中优选地，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、瘙痒症、过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)和复发性荨麻疹，并且其中进一步优选地，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、瘙痒症、过敏性皮炎和复发性荨麻疹，并且其中优选将有效量的所述组合物施用于所述马科哺乳动物，优选施用于所述马。在一个优选的实施方案中，所述瘙痒是与过敏性皮炎相关的瘙痒症或与特应性皮炎相关的瘙痒症。在一个优选的实施方案中，所述病症或疾病是马科哺乳动物的瘙痒症，优选马的瘙痒症。在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒症是与过敏性皮炎相关的瘙痒症或与特应性皮炎相关的瘙痒症。在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒症是与过敏性皮炎相关的瘙痒症。在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒症是与特应性皮炎相关的瘙痒症。在一个优选的实施方案中，所述病症或疾病不是预防或治疗马科哺乳动物、优选马的昆虫叮咬高敏症(IBH)。在一个优选的实施方案中，所述病症或疾病是预防或治疗马科哺乳动物、优选马的昆虫叮咬高敏症(IBH)。
本发明的试剂盒允许将所述第一组合物和所述第二组合物分别施用于所述马科哺乳动物，优选分别施用于所述马，其中优选地，所述第一组合物和所述第二组合物的所述分别施用是在不同时间点施用所述第一组合物和第二组合物，即顺序发生而非同时发生；和/或其中所述第一组合物和所述第二组合物的所述分别施用是在所述马科哺乳动物的不同位置，优选在所述马的不同位置，例如在不同的淋巴结处，施用所述第一组合物和所述第二组合物；和/或其中所述第一组合物和所述第二组合物的所述分别给药是用不同量施用所述第一组合物和所述第二组合物，通常以不同有效量的所述第一组合物和所述第二组合物施用。因此，通常且优选地，所述本发明的试剂盒用于根据本发明的组合治疗。
在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含所述第一组合物和所述第二组合物，以及药学上可接受的载体。
在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含所述第一组合物和所述第二组合物，以及药学上可接受的载体；用于预防或治疗马科哺乳动物、优选马的瘙痒症的方法，其中优选地，所述瘙痒症与瘙痒病症或过敏性病症相关。
在另一方面，本发明提供预防或治疗选自马科哺乳动物、优选马的瘙痒病症或过敏性病症的病症或疾病的方法，其中所述方法包括将本发明的组合物或本发明的药物组合物施用于马科哺乳动物，优选施用于马。
另一方面，本发明提供预防或治疗马科哺乳动物、优选马的瘙痒症的方法，其中优选所述瘙痒症与瘙痒病症或过敏性病症相关，其中所述方法包括将本发明的组合物或本发明的药物组合物施用于马科哺乳动物，优选施用于马。
另一方面，本发明提供本发明的组合物或所述本发明的药物组合物在制备用于预防或治疗选自马科哺乳动物、优选马的瘙痒病症或过敏性病症的病症或疾病的药物中的用途，其中通常且优选将有效量的所述本发明的组合物或所述本发明的药物组合物施用于马科哺乳动物，优选施用于马。
另一方面，本发明提供本发明的组合物或所述本发明的药物组合物在制备用于预防或治疗马科哺乳动物、优选马的瘙痒症的药物中的用途，其中优选所述瘙痒症与瘙痒病症或过敏性病症相关，其中通常且优选将有效量的所述本发明的组合物或所述本发明的药物组合物施用于马科哺乳动物，优选施用于马。
随着本说明书的继续，本发明的其他方面和实施例将变得显而易见。
附图说明
图1A：受瘙痒和过敏性皮炎病症影响的两种不同冰岛马的皮肤穿刺活检；每匹马两次活检，一次来自患有皮炎/荨麻疹的病变，一次来自健康的皮肤部位。总RNA分离，然后使用马IL-31(eIL-31)和马β-肌动蛋白(eβactin)的特异性引物进行PCR。泳道1为皮炎病变马1，泳道2为皮炎和荨麻疹病变马2，泳道3为健康皮肤马1，泳道4为健康皮肤马2。第a行为eIL-31mRNA，第b行为eβactin mRNA。
图1B：eIL-31mRNA水平，显示为eβactin管家基因的mille表达，来自瘙痒病变部位的皮肤活检组织(1)，来自相同马的匹配的健康皮肤(2)和来自健康马的健康皮肤(3)，n＝3，nd：无法检测到。
图1C：云斑库蠓(Culicoides nubeculosus，Cul n)或新奇库蠓(Culicoidesobsoletus，Cul o)过敏原的体外eIL-31表达刺激来自受IBH影响的马(1)和健康马(2)的外周血单核细胞(PBMC)。显示了相对于eβactin水平的eIL-31表达水平的百分比。
图2A：SDS-PAGE重折叠的重组eIL-31-C-His。将来自包涵体制备和纯化的各个阶段的样品应用于4-12％Bis-Tris凝胶(NuPAGE，Novex，Invitrogen Life Technologies)并在还原条件下运行。蛋白质用考马斯蓝染色。泳道M，尺寸标记(参见Blue，预染色，NuPAGE，Novex，Invitrogen Life Technologies)，泳道1，裂解液(样品A)，泳道2，可溶性级分(样品B)，泳道3，溶解的包涵体(样品C)，泳道4，从Ni-NTA柱洗脱的eIL-31单体(eIL-31，m)(样品E)。
图2B：重折叠的重组eIL-31-C-His的正确结构。如上所述将蛋白质重折叠并浓缩。将等分试样在4-12％Bis-Tris凝胶(NuPAGE，Novex，Invitrogen Life Technologies)上分离，并在天然条件下运行(+SDS，无DTT，不加热)。蛋白质用考马斯蓝染色。泳道M，尺寸标记(参见Blue，预染色，NuPAGE，Novex，Invitrogen Life Technologies)，泳道1，来自Ni-NTA柱的合并的洗脱液，泳道2，重折叠的eIL-31-C-His。
图2C：重组重折叠的马eIL-31-C-His的生物活性。注射部位瘙痒的次数。柱1，eIL-5-C-His对照，柱2，eIL-31-C-His。
图3A：用NiNTA纯化eIL-5-C-His的SDS-PAGE分析。将来自包涵体制备和纯化的各个阶段的样品应用于4-12％Bis-Tris凝胶(NuPAGE，Novex，Invitrogen LifeTechnologies)并在还原条件下运行。蛋白质用考马斯蓝染色。泳道M，尺寸标记(参见Blue，预染色，NuPAGE，Novex，Invitrogen Life Technologies)，泳道1，裂解液(样品A)，泳道2，可溶性级分(样品B)，泳道3，溶解的包涵体(样品C)，泳道4，流过(未结合的材料，样品D)，泳道5，合并的来自Ni-NTA柱的eIL-5单体(eIL-5，m)洗脱液(样品E)。
图3B：SDS-PAGE重折叠的重组eIL-5-C-His。如上所述将蛋白质重折叠并浓缩。将等分试样在4-12％Bis-Tris凝胶(NuPAGE，Novex，Invitrogen Life Technologies)上分离，并在天然条件下运行(+SDS，无DTT，不加热)。用考马斯蓝染色蛋白质：eIL-5单体(eIL-5，m)，eIL-5二聚体(eIL-5，d)。泳道M，尺寸标记(参见Blue，预染色，NuPAGE，Novex，Invitrogen Life Technologies)，泳道1，合并的来自Ni-NTA柱的变性洗脱液，泳道2，重折叠和富含同源二聚体的eIL-5-C-His。
图3C：重折叠的重组eIL-5-C-His的正确结构。与PBS缓冲液(虚线)相比，重折叠和同源二聚体富集eIL-5-C-His的圆二色(CD)光谱。通过远紫外(UV)CD光谱测量的反映α-螺旋和β-折叠的IL-5-C-His的二级结构。
图3D：重折叠的重组eIL-5-C-His的正确结构。富含同型二聚体的eIL-5-C-His可以通过市售的抗eIL-5抗体检测。将抗His抗体包被的ELISA板与重组表达和重折叠的同型二聚体富集的eIL-5一起孵育，并通过市售的抗马IL-5抗体(R&D Systems，UK)检测。
图4A：eIL-31-C-His-Qβ的偶联反应的分析。通过SDS-PAGE。用考马斯蓝染色蛋白质：eIL-31单体(eIL-31，m)，eIL-31二聚体(eIL-31，d)，Qβ单体(Qβ，m)偶联(c)。泳道M，尺寸标记(参见Blue，预染色，NuPAGE，Novex，Invitrogen Life Technologies)，泳道1，用化学交联剂SMPH衍生化后的Qβ-VLP，泳道2，TCEP活化的eIL-31-C-His，泳道3，eIL-31-C-His-Qβ偶联反应。
图4B：eIL-31-C-His-Qβ的偶联反应的分析。通过蛋白质印迹。用α-His抗体染色：eIL-31单体(eIL-31，m)，eIL-31二聚体(eIL-31，d)，偶联(c)。泳道M，尺寸标记(参见Blue，预染色，NuPAGE，Novex，Invitrogen Life Technologies)，泳道1，用化学交联剂SMPH衍生化后的Qβ-VLP，泳道2，TCEP活化的eIL-31-C-His，泳道3，eIL-31-C-His-Qβ偶联反应。
图4C：eIL-31-C-His-CMVtt830的偶联反应的分析。通过SDS-PAGE。用考马斯蓝染色蛋白质：eIL-31单体(eIL-31，m)，CMVtt830单体(CMV，m)，偶联(c)。泳道M，尺寸标记(参见Blue，预染色，NuPAGE，Novex，Invitrogen Life Technologies)，泳道1，TCEP活化的eIL-31-C-His，泳道2，用化学交联剂SMPH衍生化后的CMVtt830-VLP，泳道3，eIL-31-C-His-CMVtt830偶联反应。
图4D：eIL-31-C-His-CMVtt830的偶联反应分析。通过蛋白质印迹。用α-His抗体染色：eIL-31单体(eIL-31，m)，eIL-31二聚体(eIL-31，d)，偶联(c)。泳道M，尺寸标记(参见Blue，预染色，NuPAGE，Novex，Invitrogen Life Technologies)，泳道1，TCEP活化的eIL-31-C-His，泳道2，用化学交联剂SMPH衍生化后的CMVtt830-VLP，泳道3，eIL-31-C-His-CMVtt830偶联反应。
图5A：来自血清的马中抗体滴度的ELISA。收集免疫前(1，第0天)和用eIL-31-C-His-CMVtt830疫苗第二次接种后(2，第41天)的马的血清。Y轴显示OD50抗IL-31IgG抗体滴度。
图5B：来自血清的马中抗体滴度的ELISA。收集免疫前和用eIL-5-C-His-Qβ和eIL-31-C-His-Qβ疫苗第二次接种后(第42、93和118天)的马的血清。针对eIL-5和eIL-31的抗体分析血清。马在-62和-40天通过eIL-5-C-His-Qβ免疫，并在第0天和第19天通过eIL-31-C-His-Qβ免疫。数据显示为血清的OD50值减去免疫前的值。黑色圆圈表示抗IL-5抗体滴度且灰色圆圈表示抗IL-31抗体滴度。
图5C：来自血清的马中抗体滴度的ELISA。收集免疫前和用eIL-5-C-His-CMVtt830和eIL-31-C-His-CMVtt830疫苗第二次接种后(第28天后数天)的马的血清。针对eIL-5和eIL-31的抗体分析血清。在第0、28和105天通过eIL-5-C-His-CMVtt830和eIL-31-C-His-CMVtt830对马进行免疫接种。数据显示为血清的OD50值减去免疫前的值。空心圆表示抗eIL-5抗体滴度和实心圆表示抗eIL-31抗体滴度。Y轴显示OD50抗eIL-5/或抗eIL-31IgG抗体滴度。
图5D：来自血清的马中抗体滴度的ELISA。免疫前和用eIL-31-C-His-CMVtt830和eIL-31-C-His-CMVtt830疫苗第二次接种后(第42天)的马的血清，该马在同一天但在不同身体部位接种了两种疫苗。针对eIL-5和eIL-31的抗体分析血清。在第0天和第28天，通过eIL-5-C-His-CMVtt830(左侧)和eIL-31-C-His-CMVtt830(右侧)免疫马。数据显示为血清的OD50值减去免疫前的值。空心圆表示抗eIL-5抗体滴度且实心圆表示抗eIL-31抗体滴度。Y轴显示OD50抗-eIL-5/或抗-eIL-31IgG抗体滴度，x-轴，1，免疫前第0天、第2天，第2次接种后第42天，n＝3。
图5E：来自血清的马中抗体滴度的ELISA。免疫前和对已在前一年使用eIL-5-C-His-CMVtt830接种之中用eIL-5-C-His-CMVtt830疫苗第二次接种后(第42天)的血清。针对eIL-31的抗体分析血清。在第0天和第28天，用eIL-31-C-His-CMVtt830对马进行了免疫。数据显示为血清的OD50值减去免疫前的值。Y轴显示OD50抗IL-31IgG抗体滴度，x轴，1，免疫前血清第0天、第2天，第2次接种后第42天，n＝2。
图5F：使用eIL-5-CMVtt830和eIL-31-CMVtt830组合接种后血液中的嗜酸性粒细胞水平(y轴，x10E09细胞/L)的降低。X轴显示天数，箭头表示疫苗注射。
图5G：使用eIL-5-CMVtt830和eIL-31-CMVtt830组合接种后逐季减少皮肤病变评分(y轴)过程。X轴显示天数，箭头表示疫苗注射。
图5H：使用eIL-5-CMVtt830和eIL-31-CMVtt830组合接种后逐季减少瘙痒评分(y轴)过程。X轴显示天数，箭头表示疫苗注射。
图5I：与未处理的前一季(1)相比，通过使用eIL-5-CMVtt830和eIL-31-CMVtt830组合接种的治疗季节(2)的平均瘙痒评分(y轴)降低。
图5J：与未治疗的前一季(1)相比，通过使用eIL-31-CMVtt830接种疫苗在治疗季节(2)中平均皮肤损伤评分(y轴)降低。
图5K：与未治疗的前一季(1)相比，通过使用eIL-31-CMVtt830接种疫苗在治疗季节(2)中平均瘙痒评分(y轴)降低。
图6A：eIL-5-C-His-Qβ的偶联反应的分析。通过SDS-PAGE。用考马斯蓝染色蛋白质：eIL-5单体(eIL-5，m)，eIL-5二聚体(eIL-5，d)，Qβ单体(Qβ，m)偶联(c)。泳道M，尺寸标记(参见Blue，预染色，NuPAGE，Novex，Invitrogen Life Technologies)，泳道1，用化学交联剂SMPH衍生化后的Qβ-VLP，泳道2，TCEP活化的eIL-5-C-His，泳道3，eIL-5-C-His-Qβ偶联反应。
图6B：eIL-5-C-His-Qβ的偶联反应的分析。通过蛋白质印迹。用α-His抗体染色：eIL-5单体(eIL-5，m)，eIL-5二聚体(eIL-5，d)，偶联(c)。泳道M，尺寸标记(参见Blue，预染色，NuPAGE，Novex，Invitrogen Life Technologies)，泳道1，用化学交联剂SMPH衍生化后的Qβ-VLP，泳道2，TCEP活化的eIL-5-C-His，泳道3，eIL-5-C-His-Qβ偶联反应。
图6C：eIL-5-C-His-CMVtt830的偶联反应分析。通过SDS-PAGE。用考马斯蓝染色蛋白质：eIL-5单体(eIL-5，m)，eIL-5二聚体(eIL-5，d)，CMV(CMV，m)，偶联(c)。泳道M，尺寸标记(参见Blue，预染色，NuPAGE，Novex，Invitrogen Life Technologies)，泳道1，用化学交联剂SMPH衍生化后的CMVtt830-VLP，泳道2，TCEP活化的eIL-5-C-His，泳道3，eIL-5-C-His-CMVtt830偶联反应。
图6D：eIL-5-C-His-CMVtt830的偶联反应分析。通过蛋白质印迹。用α-His抗体染色：eIL-5单体(eIL-5，m)，eIL-5二聚体(eIL-5，d)，偶联(c)。泳道M，尺寸标记(参见Blue，预染色，NuPAGE，Novex，Invitrogen Life Technologies)，泳道1，用化学交联剂SMPH衍生化后的CMVtt830-VLP，泳道2，TCEP活化的eIL-5-C-His，泳道3，eIL-5-C-His-CMVtt830偶联反应。
图7A：在双盲安慰剂对照随机研究中通过eIL-5-C-His-Qβ有效降低IBH疾病参数。抗体滴度的时间过程。在注射后的数个时间点收集血液样品(用箭头指示疫苗注射)并分析血清的抗QβIgG抗体。来自接种马(黑线)和安慰剂马(灰线)的数据时间点1为2015年1月1日、时间点2为2015年3月20日、时间点3为2015年4月3日、时间点4为2015年4月30日、时间点5为2015年5月28日、时间点6为2015年6月25日、时间点7为2015年7月30日、时间点8是2015年8月27日、时间点9是2015年9月30日的血清。
图7B：在双盲安慰剂对照随机研究中通过eIL-5-C-His-Qβ有效降低IBH疾病参数。抗体滴度的时间过程。在注射后的数个时间点收集血液样品(用箭头指示疫苗注射)并分析血清的抗eIL-5IgG自身抗体。来自接种马(黑线)和安慰剂马(灰线)的数据时间点1为2015年1月1日、时间点2为2015年3月20日、时间点3为2015年4月3日、时间点4为2015年4月30日、时间点5为2015年5月28日、时间点6为2015年6月25日、时间点7为2015年7月30日、时间点8是2015年8月27日、时间点9是2015年9月30日的血清。
图7C：在双盲安慰剂对照随机研究中，eIL-5-C-His-CMVtt830有效降低IBH疾病参数。平均抗体滴度的时间过程(+/-SEM)。在注射后的数个时间点收集血液样品(用箭头指示疫苗注射)并分析血清的抗CMV IgG抗体。来自接种马(黑线)和安慰剂马(灰线)的数据时间点1是2016年1月、时间点2是2016年3月初、时间点3是2016年3月底、时间点4是2016年4月、时间点5是2016年5月、时间点6是2016年6月、时间点7是2016年7月、时间点8是2016年8月、时间点9是2016年9月、时间点10是2016年10月的血清。
图7D：在双盲安慰剂对照随机研究中，eIL-5-C-His-CMVtt830有效降低IBH疾病参数。平均抗体滴度的时间过程(+/-SEM)。在注射后的数个时间点收集血液样品(用箭头指示疫苗注射)并分析血清的抗eIL-5IgG自身抗体。来自接种马(黑线)和安慰剂马(灰线)的数据时间点1是2016年1月、时间点2是2016年3月初、时间点3是2016年3月底、时间点4是2016年4月、时间点5是2016年5月、时间点6是2016年6月、时间点7是2016年7月、时间点8是2016年8月、时间点9是2016年9月、时间点10是2016年10月的血清。
图7E：血液中疾病症状与嗜酸性粒细胞水平的相关性。在血液中测量12只甜痒(sweet itch)影响的马的嗜酸性粒细胞水平，并在该季节中针对IBH病变的疾病症状评分进行印迹。相关精度由R2＝0.9227表示，p<0.0001，n＝12。
图7F：在双盲安慰剂对照随机研究和随访研究中，通过eIL-5-C-His-Qβ有效降低IBH疾病参数。与治疗前一年相比，eIL-5-C-His-Qβ接种马(V)和安慰剂马(P)中临床评分改善百分比达到50％(黑条)或75％(灰条)。V1包括在第一个治疗年接种疫苗的马(在双盲安慰剂对照随机研究中n＝6)，V2包括在第一年治疗和随访年中不管是两次(第一次和随访年)还是一次(随访年)接种疫苗的所有的马(总数：n＝10；n＝6在第一年和随访年接种疫苗，n＝4在随访年接种疫苗)。图包括所有马，n＝10，与抗体滴度无关：ITT＝治疗意图。
图7G：在双盲安慰剂对照随机研究中，eIL-5-C-His-CMVtt830有效降低IBH疾病参数。损伤评分的时间过程在预评估年(虚线)和治疗年(连续线)期间的数个时间点评估损伤评分，接种马显示为黑线且安慰剂马显示为灰线。数据时间点1是2016年1月，时间点2是2016年3月初，时间点3是2016年3月底，时间点4是2016年4月，时间点5是2016年5月，时间点6是2016年6月，时间点7是2016年7月，时间点8是2016年8月，时间点9为2016年9月，时间点10为2016年10月。
图7H：在双盲安慰剂对照随机研究中，eIL-5-C-His-CMVtt830有效降低IBH疾病参数。接种eIL-5-CMVtt830的马(V)和安慰剂马(P)中临床评分相对于治疗年和预评估年提高50％(黑条)或75％(灰条)百分比。图包括所有马，n＝34，与抗体滴度无关：ITT＝治疗意图。
图8A：来自血清的小鼠中抗体滴度的ELISA。收集10只小鼠的免疫前和单独接种mIL-5-C-His-Qβ疫苗(黑色圆圈)或单独接种mIL-31-C-His-CMVtt830疫苗(灰色圆圈)后第41天每个的血清。针对eIL-5(黑色圆圈)和eIL-31(灰色圆圈)的抗体分析血清。在第0、14和28天对小鼠进行免疫。数据为显示血清的OD50值。接种mIL-5-C-His-Qβ的小鼠的抗IL-5抗体滴度显示为黑色圆圈和接种mIL-31-C-His-CMVtt830的小鼠的抗IL-31抗体滴度显示为灰色圆圈。
图8B：来自血清的小鼠中抗体滴度的ELISA。收集5只小鼠的免疫前和接种mIL-5-C-His-Qβ/mIL-31-C-His-CMVtt830组合疫苗后第41天后的血清。针对eIL-5(黑色圆圈)和eIL-31(灰色圆圈)的抗体分析血清。在第0、14和28天对小鼠进行免疫。数据显示血清的OD50值。抗IL-5抗体滴度显示为黑色圆圈和抗IL-31抗体滴度显示为灰色圆圈。
图8C：小鼠IL-31mRNA水平，显示为在接种mIL-31-CMV和ova攻击(1)、接种CMV VLP和ova攻击(2)、接种mIL-5-Qβ和mIL-31-CMVtt830组合和ova攻击(3)、以及接种CMV VLP和PBS对照攻击(4)的ova致敏小鼠中的小鼠βactin管家基因(y轴)的mille表达。显示平均值±SEM，n＝6。
图8D：来自血清的小鼠中抗ova IgG抗体滴度的ELISA。免疫前和在ova致敏小鼠且另外接种mIL-31-CMV和ova攻击(1)、接种CMV VLP和ova攻击(2)、接种mIL-5-Qβ和mIL-31-CMVtt830组合和ova攻击(3)、以及接种CMV VLP和PBS对照攻击(4)的实验终点(过敏性皮炎模型第22天)的血清。数据显示为血清的OD50值减去免疫前的值，平均值±SEM，n＝6。Y轴显示OD50抗ova IgG抗体滴度。
图8E：来自血清的小鼠中抗ova IgE抗体滴度的ELISA。免疫前和在ova致敏小鼠且另外接种mIL-31-CMV和ova攻击(1)、接种CMV VLP和ova攻击(2)、接种mIL-5-Qβ和mIL-31-CMVtt830组合和ova攻击(3)、以及接种CMV VLP和PBS对照攻击(4)的实验终点(过敏性皮炎模型第22天)的血清。数据显示血清的OD50值减去免疫前的值，平均值±SEM，n＝6。Y轴显示OD50抗ova IgE抗体滴度。
图8F：在第17、18、19、20、21和22天(x轴)显示的对左耳皮肤的ova攻击后耳厚度(y轴)增加的百分比。第1组单独用mIL-31-C-His-CMVtt830接种并进行ova攻击(实心圆圈)；第2组针对CMVtt830 VLP接种和ova攻击(三角)；第3组接种mIL-5C-His-Qβ和mIL-31-C-His-CMVtt830的组合以及ova攻击(方形)；第4组接种CMVtt830 VLP和PBS对照攻击(虚线)。平均值+/-SEM，n＝6只小鼠。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
病毒样颗粒(VLP)：如本文所用，术语“病毒样颗粒(VLP)”是指非复制性或非感染性，优选非复制性和非感染性的病毒颗粒，或指非复制性或非感染性的，优选非复制性和非感染性的类似于病毒颗粒的结构，优选病毒衣壳。如本文所用，术语“非复制性”是指不能复制VLP所包含的基因组。如本文所用，术语“非感染性”是指不能进入宿主细胞。根据本发明的病毒样颗粒是非复制性和非感染性的，因为它缺乏全部或部分病毒基因组或基因组功能。根据本发明的病毒样颗粒可含有与其基因组不同的核酸。重组产生的病毒样颗粒通常含有宿主细胞衍生的RNA。根据本发明的病毒样颗粒的典型和优选实施方案是由本发明多肽组成的病毒衣壳。病毒样颗粒通常是由病毒外壳蛋白组成的大分子组装体，其通常每个病毒样颗粒包含60、120、180、240、300、360或超过360个蛋白亚基。通常且优选地，这些亚基的相互作用导致形成具有固有重复组织的病毒衣壳或病毒衣壳样结构。病毒样颗粒的一个特征是其子单元的高度有序和重复排列。
RNA噬菌体的病毒样颗粒：如本文所用，术语“RNA噬菌体的病毒样颗粒”是指病毒样颗粒，其包含、或优选基本上由或由一种RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段组成。此外，RNA噬菌体的病毒样颗粒类似于RNA噬菌体的结构，是非复制性和/或非感染性的，并且至少缺少编码RNA噬菌体复制机制的一种或多种基因，并且通常也是缺少编码负责病毒附着或进入宿主的一种或多种蛋白质的一种或多种基因。还包括RNA噬菌体的病毒样颗粒，其中上述一种或多种基因仍然存在但是无活性，因此也导致RNA噬菌体的非复制性和/或非感染性病毒样颗粒。衍生自RNA噬菌体的优选VLP表现出二十面体对称性并且由180个亚单位(单体)组成。使病毒样颗粒的RNA噬菌体非复制和/或非感染性的优选方法是通过物理、化学灭活，例如UV照射、甲醛处理，通常并优选通过遗传操作。
CMV的病毒样颗粒：术语“CMV的病毒样颗粒”或CMV VLP是指病毒样颗粒，其包含、或优选基本上由、或优选由至少一种CMV多肽组成。优选地，CMV的病毒样颗粒包含所述CMV多肽作为主要、甚至更优选作为衣壳结构的唯一蛋白质组分。通常且优选地，CMV的病毒样颗粒类似于CMV衣壳的结构。CMV的病毒样颗粒是非繁殖和/或非感染性的，并且至少缺少编码CMV复制机制的一种或多种基因，并且通常也缺少编码负责病毒附着或进入宿主的一种或多种蛋白质的一种或多种基因。该定义还包括病毒样颗粒，其中上述一个或多个基因仍然存在但是无活性。使CMV非复制性和/或非感染性的病毒样颗粒的优选方法是通过物理或化学灭活，例如UV照射、甲醛处理。优选地，CMV的VLP缺少编码CMV复制机制的一种或多种基因，并且还缺少编码负责病毒附着或进入宿主的一种或多种蛋白质的一种或多种基因。再次更优选地，通过重组基因技术获得非复制型和/或非感染性病毒样颗粒。根据本发明的重组产生的CMV病毒样颗粒通常且优选不包含病毒基因组。包含一种以上多肽的病毒样颗粒，通常称为镶嵌VLP，也包括在本发明中。因此，在一个实施方案中，根据本发明的病毒样颗粒包含至少两种不同种类的多肽，其中至少一种所述多肽种类是CMV多肽。优选地，CMV的VLP是由CMV外壳蛋白组成的大分子组装体，其通常每VLP包含180个外壳蛋白亚基。通常且优选地，如本文所用的CMV的VLP包含至少一种CMV多肽、基本上由至少一种CMV多肽组成、或可替选地由至少一种CMV多肽组成，所述CMV多肽包含或优选由(i)CMV衣壳蛋白的氨基酸序列；或(ii)突变的氨基酸序列，其中待突变的氨基酸序列是CMV衣壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、再更优选至少99％序列同一性。
抗原：如本文所用，术语“抗原”是指如果由MHC分子呈递，则能够被抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子。如本文所用，术语“抗原”也指T细胞表位。抗原还能够被免疫系统识别和/或能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B-和/或T-淋巴细胞的活化。然而，这可能要求至少在某些情况下，抗原含有Th细胞表位或与Th细胞表位连接和/或在佐剂中给予。抗原可具有一个或多个表位(B-和T-表位)。上面提到的具体反应是指抗原优选通常以高选择性方式与其相应的抗体或TCR反应，而不是与其他抗原引起的大量其他抗体或TCR反应。如果没有另外说明，本文所用的术语“抗原”不是指包含在本发明组合物、免疫原性或疫苗组合物和/或药物组合物中的核心颗粒或病毒样颗粒。
衣壳蛋白：术语“衣壳蛋白”是指病毒蛋白，优选病毒天然衣壳的亚基，优选RNA噬菌体或植物病毒的亚基，其能够掺入病毒衣壳或VLP中。术语衣壳蛋白包括天然存在的衣壳蛋白以及重组表达的衣壳蛋白。进一步包括衣壳蛋白的突变体和片段，其中所述突变体和片段保留形成VLP的能力。
多肽：本文所用的术语“多肽”是指由氨基酸单体组成的聚合物，其通过肽键(也称为酰胺键)线性连接。术语多肽是指连续的氨基酸链，并不涉及产物的特定长度。因此，肽和蛋白质包括在多肽的定义内。
黄瓜花叶病毒(CMV)多肽：本文所用的术语“黄瓜花叶病毒(CMV)多肽”是指包含或优选由以下组成的多肽：(i)黄瓜花叶病毒(CMV)衣壳蛋白的氨基酸序列，或(ii)突变氨基酸序列，其中待突变的氨基酸序列是CMV衣壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列，即所述外壳CMV的蛋白质，显示出至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、再次更优选至少99％的序列同一性。通常且优选地，CMV多肽在通过自组装表达时能够形成CMV的病毒样颗粒。
黄瓜花叶病毒(CMV)的衣壳蛋白(CP)：如本文所用，术语“黄瓜花叶病毒(CMV)的衣壳蛋白(CP)”是指天然存在的黄瓜花叶病毒的衣壳蛋白。由于黄瓜花叶病毒的宿主范围非常广泛，已知许多不同的CMV菌株和分离株，并且所述菌株和分离株的衣壳蛋白的序列已经确定，因此，也已被本领域技术人员已知。CMV的所述衣壳蛋白(CP)的序列描述于可从诸如Genbank、www.dpyweb.net或www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/的已知数据库中检索和查询。实例描述于EP申请号14189897.3中。CMV衣壳蛋白的其他实例提供在SEQ ID NO：15-17中。值得注意的是，这些菌株和分离株在不同蛋白质结构域具有高度相似的衣壳蛋白序列，包括衣壳蛋白的N-末端。特别是，98.1％的完全测序的CMV分离株在其衣壳蛋白序列的前28个氨基酸内共享超过85％的序列同一性，并且仍然有79.5％的所有完全测序的CMV分离株在第一个中具有超过90％的序列同一性。它们的衣壳蛋白序列有28个氨基酸。
通常且优选地，用于本发明的CMV的衣壳蛋白在通过自组装表达时能够形成CMV的病毒样颗粒。优选地，用于本发明的CMV的衣壳蛋白在通过在大肠杆菌中自组装而表达时能够形成CMV的病毒样颗粒。
黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的病毒样颗粒(VLP)：如本文所用，术语“黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的病毒样颗粒(VLP)”是指CMV的VLP，其是修饰的CMV。例如，其包含，或优选基本上由，或优选由至少一种修饰的CMV多肽组成，其中所述修饰的CMV多肽包含、或优选由CMV多肽和辅助性T细胞表位组成。通常且优选地，所述辅助性T细胞表位(i)与所述CMV多肽的N末端融合，(ii)与所述CMV多肽的C末端融合，(iii)取代所述CMV多肽的连续氨基酸的区域，其中所述CMV多肽的连续氨基酸的所述被取代区域与辅助性T细胞表位之间的序列同一性为至少15％，优选至少20％，或(iv)取代所述CMV多肽N末端区域，并且其中所述被取代的所述CMV多肽的N-末端区域由5-15个连续氨基酸组成。优选地，所述辅助性T细胞表位取代所述CMV多肽的N-末端区域，并且其中所述取代的所述CMV多肽的N-末端区域由5-15个连续氨基酸、优选9-14个连续氨基酸、更优选11至13个连续氨基酸、最优选11、12或13个连续氨基酸组成。优选地，本发明的CMV的所述修饰的VLP是CMV的重组修饰的VLP。
修饰的CMV多肽：如本文所用的术语“修饰的CMV多肽”是指如本文所定义的修饰的CMV多肽，所述修饰的CMV多肽包含或优选由CMV多肽和辅助性T细胞表位组成。通常，修饰的CMV多肽能够在通过自组装表达时形成CMV的病毒样颗粒。优选地，修饰的CMV多肽是重组修饰的CMV多肽，并且在通过在大肠杆菌中自组装表达时能够形成CMV的病毒样颗粒。
CMV多肽的N-末端区域：如本文所用，术语“CMV多肽的N-末端区域”是指所述CMV多肽的N-末端，特别是指CMV衣壳蛋白的N-末端，或所述CMV多肽或所述CMV的衣壳蛋白的N-末端区域但从所述CMV多肽或CMV的衣壳蛋白的N-末端的第二个氨基酸开始(如果所述CMV多肽或所述衣壳蛋白包含N-末端甲硫氨酸残基)。优选地，在所述CMV多肽或所述衣壳蛋白包含N-末端甲硫氨酸残基的情况下，从实际观点来看，编码起始密码子的甲硫氨酸通常将被删除并添加到Th细胞表位的N-末端。进一步优选地，可以任选地在起始甲硫氨酸和Th细胞表位之间插入一个、两个或三个另外的氨基酸，优选一个氨基酸，用于克隆目的。本文所用的术语“CMV多肽或CMV衣壳蛋白的突变氨基酸序列的N-末端区域”是指所述CMV多肽或所述CMV的衣壳蛋白的所述突变氨基酸序列的N-末端，或指所述CMV多肽或所述CMV的衣壳蛋白的突变氨基酸序列的N-末端区域但从所述CMV多肽或者CMV的衣壳蛋白的所述突变氨基酸序列的N-末端的第二个氨基酸开始(如果所述突变的氨基酸序列包含N-末端甲硫氨酸残基)。优选地，在所述CMV多肽或所述衣壳蛋白包含N-末端甲硫氨酸残基的情况下，从实际观点来看，编码起始密码子的甲硫氨酸通常将被删除并添加到Th细胞表位的N-末端。进一步优选地，可以任选地在起始甲硫氨酸和Th细胞表位之间插入一个、两个或三个另外的氨基酸，优选一个氨基酸，用于克隆目的。
重组多肽：在本发明的上下文中，术语“重组多肽”是指通过包括至少一个重组DNA技术步骤的方法获得的多肽。通常且优选地，在原核表达系统中产生重组多肽。对于技术人员显而易见的是，在原核表达系统如大肠杆菌中表达的重组产生的多肽可包含N-末端甲硫氨酸残基。在重组多肽成熟过程中，通常在表达宿主中从重组多肽上切下N-末端甲硫氨酸残基。然而，N-末端甲硫氨酸的裂解可能是不完全的。因此，重组多肽的制备物可以包含具有和不具有N-末端甲硫氨酸残基的其他方面相同的多肽的混合物。通常且优选地，重组多肽的制剂包含少于10％、更优选少于5％、还更优选少于1％的具有N-末端甲硫氨酸残基的重组多肽。
重组CMV多肽：术语“重组CMV多肽”是指如上定义的CMV多肽，其通过包括至少一个重组DNA技术步骤的方法获得。通常且优选地，重组CMV多肽的制剂包含少于10％、更优选少于5％、还更优选少于1％的具有N-末端甲硫氨酸残基的重组CMV多肽。因此，本发明的重组病毒样颗粒可以包含具有和不具有N-末端甲硫氨酸残基的其他相同的重组多肽。
重组修饰的CMV多肽：术语“重组修饰的CMV多肽”是指如上定义的修饰的CMV多肽，其通过包括至少一个重组DNA技术步骤的方法获得。通常且优选地，重组修饰的CMV多肽的制剂包含少于10％、更优选少于5％、还更优选少于1％的具有N-末端甲硫氨酸残基的重组修饰的CMV多肽。因此，本发明的重组病毒样颗粒可以包含具有和不具有N-末端甲硫氨酸残基的其他相同的重组多肽。
重组病毒样颗粒：在本发明的上下文中，术语“重组病毒样颗粒”是指病毒样颗粒(VLP)，其通过包括至少一个重组DNA技术步骤的方法获得。通常并且优选地，通过在宿主中，优选在细菌细胞中表达重组病毒衣壳蛋白，获得重组VLP。通常且优选地，重组病毒样颗粒包含至少一种重组多肽，优选重组CMV多肽或重组修饰的CMV多肽。最优选地，重组病毒样颗粒由重组CMV多肽或重组修饰的CMV多肽组成或由其组成。因此，如果在本发明的上下文中，本发明的重组VLP的定义是参照包含N-末端甲硫氨酸残基的特定氨基酸序列实现的，则这些本发明的重组VLP的范围包括由所述特定氨基酸形成的VLP。没有所述N-末端甲硫氨酸残基的序列也是如此，即使通常如本文所示的少量，由所述特定氨基酸序列与所述N-末端甲硫氨酸形成的VLP。此外，如果参考包含N-末端甲硫氨酸残基的特定氨基酸序列实现本发明的重组VLP的定义，则包含含有所述N-末端甲硫氨酸残基的氨基酸序列和缺少N-末端甲硫氨酸残基的氨基酸序列也都包括在本发明的范围内。
突变的氨基酸序列：术语“突变的氨基酸序列”是指通过将一组确定的突变引入待突变的氨基酸序列而获得的氨基酸序列。在本发明的上下文中，所述待突变的氨基酸序列通常且优选是CMV衣壳蛋白的氨基酸序列。因此，突变的氨基酸序列与CMV的衣壳蛋白的氨基酸序列在至少一个氨基酸残基上不同，其中所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示至少90％的序列同一性。通常且优选地，所述突变的氨基酸序列和待突变的所述氨基酸序列显示出至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。优选地，所述突变的氨基酸序列和所述待突变的序列在至多11、10、9、8、7、6、4、3、2或1个氨基酸残基上不同，其中进一步优选地，所述差异选自插入、缺失和氨基酸交换。优选地，突变的氨基酸序列与CMV的衣壳蛋白的氨基酸序列在至少一个氨基酸上不同，其中优选地，所述差异是氨基酸交换。
对应于残基......的位置：对应于另一氨基酸序列的给定残基的氨基酸序列上的位置可通过序列比对来鉴定，通常且优选通过使用BLASTP算法，最优选使用标准设置。典型和首选标准设置为：预期阈值(expect threshold)：10；字号(word size)：3；查询范围内的最大匹配数(max matches in a query range)：0；矩阵(matrix)：BLOSUM62；间隔成本(gapcosts)：存在11，扩展1；成分调整(compositional adjustments)：条件成分得分矩阵调整(conditional compositional score matrix adjustment)。
序列同一性：基于两个序列的比对确定两个给定氨基酸序列的序列同一性。用于确定序列同一性的算法可供技术人员使用。优选地，使用公众可获得的计算机同源程序，例如“BLAST”程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)或“CLUSTALW”(http:// www.genome.jp/tools/clustalw/)确定两个氨基酸序列的序列同一性，特此优选地通过NCBI主页http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上提供的“BLAST”程序，使用其中提供的默认设置。典型和首选标准设置为：预期阈值(expect threshold)：10；字号(wordsize)：3；查询范围内的最大匹配数(max matches in a query range)：0；矩阵(matrix)：BLOSUM62；间隔成本(gap costs)：存在11，扩展1；成分调整(compositionaladjustments)：条件成分得分矩阵调整(conditional compositional score matrixadjustment)。
氨基酸交换：术语氨基酸交换是指氨基酸序列中给定氨基酸残基被具有不同化学结构的任何其他氨基酸残基交换，优选被另一个蛋白质氨基酸残基交换。因此，与插入或缺失氨基酸相反，氨基酸交换不改变所述氨基酸序列的氨基酸总数。在本发明的上下文中非常优选的是所述氨基酸序列的氨基酸残基被赖氨酸残基或半胱氨酸残基突变。
表位：术语表位是指抗原、优选多肽的连续或不连续部分，其中所述部分可以在MHC分子的环境下被抗体或T细胞受体特异性结合。关于抗体，特异性结合排除非特异性结合，但不一定排除交叉反应性。表位通常包含空间构象的5-20个氨基酸，其对于抗原位点是独特的。
辅助性T(Th)细胞表位：如本文所用的术语“辅助性T(Th)细胞表位”是指能够被辅助Th细胞识别的表位。在另一个优选的实施方案中，所述辅助性T细胞表位是通用辅助性T细胞表位。
通用Th细胞表位：如本文所用的术语“通用Th细胞表位”是指能够结合至少一种、优选多于一种MHC II类分子的Th细胞表位。确定肽序列是否是通用Th细胞表位的最简单方法是测量肽结合个体MHC II类分子的能力。这可以通过肽与已知Th细胞表位肽与MHC II类分子的结合竞争的能力来测量。代表性选择的HLA-DR分子描述于例如Alexander J等，Immunity(1994)1:751-761。Th细胞表位对MHC II类分子的亲和力应至少为10-5M。确定Th细胞表位“通用性”的另一种更繁琐但也更相关的方法是证明大部分人(>30％)在免疫接种后产生可测量的T细胞应答，并在一个月后用含有在IFA中形成的Th细胞表位的蛋白质的加强。存在于不同个体中的代表性MHC II类分子集合在Panina-Bordignon P等，Eur JImmunol(1989)19:2237-2242中给出。因此，本文所用的术语“通用Th细胞表位”优选是指Th细胞表位，其在免疫和加强后(一个月后用含有在IFA中形成的Th细胞表位的蛋白质)在超过30％的所选个体中产生可测量的T细胞应答，如Panina-Bordignon P等，Eur J Immunol(1989)19:2237-2242中所述。此外，并且再次进一步优选地，如本文所用的术语“通用Th细胞表位”优选是指能够结合至少一个、优选至少两个、甚至更优选至少三个选自DR1、DR2w2b、DR3、DR4w4、DR4w14、DR5、DR7、DR52a、DRw53、DR2w2a的DR等位基因的Th细胞表位；优选地选自DR1、DR2w2b、DR4w4、DR4w14、DR5、DR7、DRw53、DR2w2a且亲和力至少为500nM的Th细胞表位(如Alexander J等，Immunity(1994)1:751-761和本文引用的参考文献中所述)；用于评价所述亲和力的优选结合试验是Sette A等，J Immunol(1989)142:35-40所述的结合试验。在甚至更优选的方式中，如本文所用的术语“通用Th细胞表位”是指能够结合至少一个、优选至少两个、甚至更优选至少三个选自DR1、DR2w2b、DR4w4、DR4w14、DR5、DR7、DRw53、DR2w2a且亲和力至少为500nM的DR等位基因的Th细胞表位(如Alexander J等，Immunity(1994)1:751-761和本文引用的参考文献中所述)；用于评价所述亲和力的优选结合试验是Sette A等，J Immunol(1989)142:35-40所述的结合试验。
本领域技术人员描述了通用Th细胞表位，例如Alexander J等，Immunity(1994)1:751-761，Panina-Bordignon P等，Eur J Immunol(1989)19:2237-2242，J Immunol(1997)159:1362-1373，和Valmori D等，J Immunol(1992)149:717-721。
佐剂：本文所用的术语“佐剂”是指免疫应答的非特异性刺激物或允许在宿主中产生贮库的物质，当分别与本发明的疫苗和药物组合物组合时，可以提供更强的免疫反应。优选的佐剂是完全和不完全弗氏佐剂、含铝佐剂(优选氢氧化铝)和修饰的胞壁酰二肽。进一步优选的佐剂是矿物凝胶，例如氢氧化铝，表面活性物质，例如溶血卵磷脂、泊洛沙姆多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔血蓝蛋白、二硝基苯酚，和人佐剂，例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。这些佐剂也是本领域熟知的。可以与本发明的组合物一起施用的其他佐剂包括但不限于单磷酰脂质免疫调节剂、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005、铝盐(明矾)、MF-59、OM-174、OM-197、OM-294和病毒体佐剂技术。佐剂也可包含这些物质的混合物。病毒样颗粒通常被描述为佐剂。然而，在本申请的上下文中使用的术语“佐剂”是指不是本发明的病毒样颗粒的佐剂。相反，“佐剂”涉及本发明组合物、疫苗或药物组合物的另外的不同组分。
术语“过敏性病症”在本文中定义为由免疫系统和体外异物之间的相互作用引起的病症或疾病。这种外来物质被称为“过敏原”。常见的过敏原包括空气过敏原，如花粉、灰尘、霉菌、尘螨蛋白、昆虫叮咬注入的唾液等。过敏性病症的实例包括但不限于以下：过敏性皮炎、夏季湿疹、复发性荨麻疹、瘙痒、疱疹、炎性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺病和由自身免疫引起的炎症过程，如肠易激综合征(IBS)。
术语“瘙痒病症”在本文中定义为以强烈的瘙痒感觉为特征的疾病或病症，其产生摩擦或划伤皮肤以获得缓解的冲动。瘙痒病症的实例包括但不限于以下：特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病、瘙痒症、过敏性皮炎、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病和复发性荨麻疹。
有效量：如本文所用，术语“有效量”是指活性成分(通常且优选是根据本发明的组合物)的量，当施用于马科哺乳动物(优选为马)时足以产生有益或所需的结果。有效量可以按一次或多次施用、应用或剂量给药。有效量的组合物或者药物组合物将是实现该选择结果的量，并且这种量可以由本领域技术人员根据常规确定。优选地，如本文所用，术语“有效量”是指产生与预防或治疗马科哺乳动物(优选为马)的选自瘙痒病症或过敏性病症的病症或疾病相关的一个或多个参数的客观测量变化的量。再次进一步优选地，与预防或治疗选自瘙痒病症或过敏性病症的病症或疾病相关的所述一个或多个参数是皮肤损伤的水平或严重程度等级或瘙痒水平。再次进一步优选地，所述皮肤损伤的水平或严重程度等级的降低通过症状损伤评分测试来确定，并且所述瘙痒水平的降低通过瘙痒评分测试来确定。有效量可以根据特定的马科哺乳动物(优选马)和受治疗的病症、马科哺乳动物(优选马)的体重和年龄、疾病的严重程度、所选择的特定组成、可以遵循给药方案、给药时间、给药方式等而变化，所有这些都可以由本领域普通技术人员容易地确定，而无需过多的实验。
联合治疗(combinatory treatment)：如本文所用，本文可互换使用的术语“联合治疗”或“联合疫苗接种”是指根据本发明的治疗，其中使用至少两种，通常且优选恰好两种不同的本发明组合物。其中所述不同的本发明组合物作为单独的实体施用，而不是作为包含所述至少两种不同的本发明组合物的组合的，通常且优选的药物组合物来施用。然而，使用所述至少两种，通常且优选恰好两种不同的本发明组合物作为单独的实体，并不排除所述至少两种，通常优选恰好两种不同的本发明组合物的应用，通常且优选同时和/或在同一位置给药，通常且优选在相同的给药和注射部位给药。
组合治疗(Combination treatment)：如本文所用，术语“组合治疗”或“组合疫苗接种”在本文中可互换使用，是指根据本发明的治疗，其中使用至少两种，通常且优选恰好两种不同的本发明组合物。并且其中所述不同的本发明组合物作为一个实体施用，通常且优选地，包含和组合在一种药物中，作为一种包含根据本发明的所述至少两种不同的本发明组合物的组合物的药物。
治疗：如本文所用，术语“治疗”或“处理”是指预防和/或治疗。在一个实施方案中，术语“治疗”或“处理”是指治疗性治疗。在另一个实施方案中，术语“治疗”或“处理”是指预防性治疗。通常且优选地，需要治疗的马科哺乳动物，优选马，包括已经患有该疾病的那些以及要预防该疾病的那些。因此，优选地，根据本发明的术语“治疗”或“处理”疾病、病症或障碍包括预防或防止疾病、病症或障碍(即，导致症状不发展)；抑制疾病、病症或障碍(即，阻止或抑制症状的发展；和/或缓解疾病，病症或障碍(即，引起症状消退)。如将理解的，由于最终的诱导事件可能是未知的或潜在的，因此并不总是能够区分“预防”和“抑制”疾病、病症或障碍。因此，术语“预防”将被理解为构成一种“治疗”，其包括“预防”和“抑制”。术语“治疗”因此包括“预防”。
本文所用的术语“预防”是指预防或延迟由疾病或病症引起的疾病或病症和/或症状的发作的手段。
连接位点，第一：如本文所用，短语“第一连接位点”是指天然存在于病毒样颗粒或人工添加到病毒样颗粒的元件，并且第二连接位点可以连接。第一附着位点优选为蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢产物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯基甲基磺酰氟)，或化学反应性基团，如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酰基或其组合。作为第一连接位点的化学反应性基团的优选实施方案是氨基酸残基的氨基，优选赖氨酸残基。第一连接位点通常位于表面上，并且优选地位于VLP的外表面上。多个第一连接位点存在于表面上，优选地存在于VLP的外表面上，通常是重复配置。在优选的实施方案中，第一连接位点通过至少一个共价键，优选通过至少一个肽键与VLP缔合。在进一步优选的实施方案中，第一连接位点与VLP天然存在。或者，在优选的实施方案中，将第一连接位点人工添加到VLP中。在一个非常优选的实施方案中，所述第一连接位点是所述VLP多肽的氨基酸序列的赖氨酸残基的氨基。
连接位点，第二：如本文所用，短语“第二连接位点”是指天然存在于或人工添加至抗原并且第一连接位点可与之连接的元件。抗原的第二附着位点优选为蛋白质、多肽、肽、氨基酸、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物，次级代谢产物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、地高辛、金属离子、苯甲基磺酰氟)，或化学反应性基团，例如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酰基或它们的组合。作为第二附着位点的化学反应性基团的优选实施方案是巯基，优选氨基酸半胱氨酸的巯基，最优选半胱氨酸残基的巯基。因此，术语“具有至少一个第二连接位点的抗原”是指包含抗原和至少一个第二连接位点的构建体。然而，特别是对于非天然存在于抗原内的第二连接位点，这种构建体通常且优选还包含“接头”。在另一个优选的实施方案中，第二连接位点通过至少一个共价键，优选通过至少一个肽键与抗原结合。在进一步的实施方案中，第二连接位点天然存在于抗原内。在另一个进一步优选的实施方案中，第二连接位点通过接头人工添加至抗原，其中所述接头包含半胱氨酸或由半胱氨酸组成。优选地，接头通过肽键与抗原融合。
连接：如本文所用，术语“连接”是指所有可能的方式，优选化学相互作用，通过所述方式，至少一个第一连接部位和至少一个第二连接部位连接在一起。化学相互作用包括共价和非共价相互作用。非共价相互作用的典型实例是离子相互作用、疏水相互作用或氢键，而共价相互作用例如基于共价键，例如酯、醚、磷酸酯、碳-磷键、碳-硫键，例如硫醚或酰亚胺键。在某些优选的实施方案中，第一连接位点和第二连接位点通过至少一个共价键连接，优选通过至少一个非肽键连接，甚至更优选通过非肽键连接。然而，如本文所用，术语“连接”不仅应指代至少一个第一连接位点和至少一个第二连接位点的直接连接，而且还可替代且优选地，指间接连接至少一个第一连接位点。第一连接位点和至少一个第二连接位点通过中间分子，并且因此通常且优选通过使用至少一个，优选一个异双功能交联剂。在其他优选的实施方案中，第一连接位点和第二连接位点通过至少一个共价键连接，优选通过至少一个肽键连接，甚至更优选仅通过肽键连接。
接头：如本文所用，“接头”或者将第二连接位点与抗原结合，或者已经包含、基本上由或由第二连接位点组成。优选地，如本文所用，“接头”已经包含第二连接位点，通常且优选地，但不是必须地，作为一个氨基酸残基，优选作为半胱氨酸残基。优选的接头是氨基酸接头，即含有至少一个氨基酸残基的接头。术语氨基酸接头并不意味着这种接头仅由氨基酸残基组成。然而，仅由氨基酸残基组成的接头是本发明的优选实施方案。接头的氨基酸残基优选由天然存在的氨基酸或本领域已知的非天然氨基酸、全L或全D或其混合物组成。根据本发明的接头的进一步优选的实施方案是包含巯基或半胱氨酸残基的分子，因此这些分子也包括在本发明内。接头与抗原的结合优选通过至少一个共价键，更优选通过至少一个肽键。
马科哺乳动物：如本文所用，“马科哺乳动物”是包括在马科动物中的哺乳动物，包括马、小马、驴(ass或donkey)和斑马。优选地，如本文所用，术语“马科哺乳动物”是指马、小马、驴和斑马。再次更优选地，如本文所用，术语“马科哺乳动物”是指马。
在此公开了本发明的几个方面；本文进一步提及的实施例和优选实施例分别适用于本文公开的本发明的每个和任何方面，即使没有明确提及。
我们现在惊奇地发现在来自受皮炎影响的皮肤损伤的马的皮肤活组织检查中，马IL-31mRNA在皮肤病变中伴有瘙痒伴皮炎的部位表达，而在健康的马皮肤样本中则完全不存在。因此，诱导强自身抗体滴度的本发明组合物可有效预防和治疗选自马科哺乳动物(优选马)的瘙痒症状或过敏性疾病，特别地，对预防和治疗瘙痒及瘙痒相关性皮炎有效。本发明组合物的有效性不依赖于可能的过敏性触发因素，例如来自树木、草、花粉、霉菌、真菌、尘螨、灰尘、皮屑、饲料(发酵剂)螨虫、昆虫或食物中的组分的过敏原。
因此，由多种过敏原引起的受瘙痒或瘙痒相关性皮炎影响的马的疫苗接种与含有与CMV-VLP连接的eIL-31抗原的本发明组合物不仅导致平均皮肤损伤评分显著降低，而且特别导致与用本发明组合物治疗前的季节中确定的所述评分相比，平均瘙痒评分显著降低。当根据本发明的组合疫苗，即包含与CMV-VLP连接的eIL-31抗原的组合物和包含与CMV-VLP连接的eIL-5抗原的组合物用于治疗受瘙痒或由多种过敏原引起的瘙痒相关性皮炎影响的马时，发现了相同的令人惊讶的结果。
因此，在第一方面，本发明提供了一种组合物，其包含：(a)具有至少一个第一连接位点的核心颗粒；(b)具有至少一个第二连接位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是马白细胞介素-31抗原(eIL-31抗原)，其中所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQID NO：1的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：1有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、又进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；其中(a)和(b)通过所述至少一个第一连接位点和所述至少一个第二连接位点经由至少一个非肽共价键连接；用于预防或治疗选自马科哺乳动物的、优选马的瘙痒病症或过敏性病症的病症或疾病的方法，其中优选将有效量的所述组合物施用于所述马科哺乳动物，优选施用于所述马。在一个优选的实施方案中，所述病症或疾病是马科哺乳动物的瘙痒，优选马的瘙痒。在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒症是与过敏性皮炎相关的瘙痒症或与特应性皮炎相关的瘙痒症。在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒症是与过敏性皮炎相关的瘙痒症。在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒症是与特应性皮炎相关的瘙痒症。在进一步优选的实施方案中，所述病症或疾病不是预防或治疗马科哺乳动物的、优选马的昆虫叮咬高敏症(IBH)。在进一步优选的实施方案中，所述病症或疾病是预防或治疗马科哺乳动物的、优选马的昆虫叮咬高敏症(IBH)。
在另一方面，本发明提供了包含第一组合物和第二组合物的组合物，其中所述第一组合物包含：(a)具有至少一个第一连接位点的第一核心颗粒；(b)具有至少一个第二连接位点的至少一种第一抗原，其中所述至少一种第一抗原是马白细胞介素-31抗原(eIL-31抗原)，其中所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：1有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、又进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一连接位点和所述至少一个第二连接位点经由至少一个非肽共价键连接；并且其中所述第二组合物包含：(c)具有至少一个第一连接位点的第二核心颗粒；(d)具有至少一个第二连接位点的至少一种第二抗原，其中所述至少一种第二抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质或与SEQID NO：6有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、又进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；并且其中(c)和(d)通过所述至少一个第一连接位点和所述至少一个第二连接位点经由至少一个非肽共价键连接，并且其中任选地所述第一种或所述第二种组合物还包含佐剂。在另一方面，本发明提供了用作药物的所述本发明的组合物。
因此，本发明提供了用于所有瘙痒病症或所有过敏性病症的本发明组合物，其不依赖于过敏性触发因素。而且，该组合物因此单独或作为附加的联合或组合治疗用于本发明的方法。
在优选的实施方案中，所述eIL-31抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5的氨基酸序列的蛋白质。在进一步优选的实施方案中，所述eIL-31抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。在进一步优选的实施方案中，所述eIL-31抗原包含或优选是具有SEQ IDNO：1的氨基序列的蛋白质。在进一步优选的实施方案中，所述eIL-31抗原包含或优选是具有SEQ ID NO：2的氨基序列的蛋白质。在进一步优选的实施方案中，所述eIL-31抗原包含或优选是具有SEQ ID NO：3的氨基序列的蛋白质。在进一步优选的实施方案中，所述eIL-31抗原包含或优选是具有SEQ ID NO：4的氨基序列的蛋白质。在进一步优选的实施方案中，所述eIL-31抗原包含或优选是具有SEQ ID NO：5的氨基序列的蛋白质。
在另一个优选的实施方案中，所述病症或疾病是预防或治疗马科哺乳动物、优选马的昆虫叮咬高敏症(IBH)。
在优选的实施方案中，所述组合物还包含：(c)具有至少一个第一连接位点的第二核心颗粒；(d)具有至少一个第二连接位点的至少一种第二抗原，其中所述至少一种第二抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ IDNO：6的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：6有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、又进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；并且其中(c)和(d)通过所述至少一个第一连接位点和所述至少一个第二连接位点经由至少一个非肽共价键连接。
在另一个优选的实施方案中，所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的蛋白质。在进一步优选的实施方案中，所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的氨基酸序列的蛋白质。在进一步优选的实施方案中，所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的蛋白质。在进一步优选的实施方案中，所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：6的氨基序列的蛋白质。在另一个优选的实施方案中，所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的蛋白质。在进一步优选的实施方案中，所述eIL-5抗原包含或优选是具有SEQ ID NO：8的氨基序列的蛋白质。在进一步优选的实施方案中，所述eIL-5抗原包含或优选是具有SEQ ID NO：9的氨基序列的蛋白质。在进一步优选的实施方案中，所述eIL-5抗原包含或优选是具有SEQID NO：10的氨基序列的蛋白质。
在另一个优选的实施方案中，与根据本发明的所述至少一种eIL-31抗原连接的所述核心颗粒或所述第一核心颗粒分别与连接至所述至少一种eIL-5抗原的所述第二核心颗粒(如果存在于本发明)相同。
在另一个优选的实施方案中，与根据本发明的所述至少一种eIL-31抗原连接的所述核心颗粒或所述第一核心颗粒分别与连接至所述至少一种eIL-5抗原的所述第二核心颗粒(如果存在于本发明)不同。
在下文中，如果所述“核心颗粒”的实施方案被定义并且仅指代所述“核心颗粒”的实施方案，则它应指代所述核心颗粒或所述第一核心颗粒或所述第二核心颗粒。通常且优选地，它应分别指代所述核心颗粒或所述第一核心颗粒。
在进一步优选的实施方案中，所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)，优选重组VLP。在又一个优选的实施方案中，所述VLP衍生自植物病毒或噬菌体，并且其中优选地，所述噬菌体是RNA噬菌体。
因此，在另一个优选的实施方案中，所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)，并且其中所述VLP衍生自RNA噬菌体。
进一步优选的是作为本发明核心颗粒的RNA噬菌体的重组VLP。在进一步优选的实施方案中，所述VLP包含RNA噬菌体的重组衣壳蛋白，基本上由RNA噬菌体的重组衣壳蛋白组成，或者由RNA噬菌体的重组衣壳蛋白组成，并且其中优选地，所述VLP包含RNA噬菌体Qβ或RNA噬菌体AP205的重组衣壳蛋白，基本上由RNA噬菌体Qβ或RNA噬菌体AP205的重组衣壳蛋白组成，或者由RNA噬菌体Qβ或RNA噬菌体AP205的重组衣壳蛋白组成，并且其中进一步优选地，所述VLP包含RNA噬菌体Qβ的重组衣壳蛋白，基本上由RNA噬菌体Qβ的重组衣壳蛋白组成，或者由RNA噬菌体Qβ的重组衣壳蛋白组成。
在进一步优选的实施方案中，所述VLP包含、基本上由或由重组衣壳蛋白组成，所述重组衣壳蛋白包含或优选由选自以下的氨基酸序列组成：(a)SEQ ID NO：24的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25的混合物；或(c)SEQ ID NO：26。在一个非常优选的实施方案中，所述VLP是RNA噬菌体Qβ的VLP。在进一步优选的实施方案中，所述VLP包含RNA噬菌体Qβ的重组衣壳蛋白，基本上由RNA噬菌体Qβ的重组衣壳蛋白组成，或者由RNA噬菌体Qβ的重组衣壳蛋白组成。同样在另一个优选的实施方案中，所述VLP包含重组衣壳蛋白，基本上由重组衣壳蛋白组成或由重组衣壳蛋白组成，所述重组衣壳蛋白包含SEQ ID NO：24或优选由SEQ ID NO：24组成。
在另一个优选的实施方案中，所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)，其中所述VLP是RNA噬菌体Qβ的VLP，并且所述VLP包含RNA噬菌体Qβ的重组衣壳蛋白，基本上由RNA噬菌体Qβ的重组衣壳蛋白组成，或者由RNA噬菌体Qβ的重组衣壳蛋白组成，并且其中所述重组衣壳蛋白包含SEQ ID NO：24或优选由SEQ ID NO：24组成。
在一个实施方案中，所述VLP不是RNA噬菌体的VLP，优选地，所述VLP不是RNA噬菌体的重组VLP。在一个实施方案中，所述病毒样颗粒不是RNA-噬菌体Qβ的病毒样颗粒。
在进一步优选的实施方案中，所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)，并且其中所述VLP衍生自植物病毒。在另一个优选的实施方案中，所述VLP是重组VLP，并且其中优选地，所述重组VLP衍生自植物病毒。在另一个优选的实施方案中，所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的VLP。
在优选的实施方案中，所述VLP是修饰的VLP，其包含至少一种修饰的VLP多肽，基本上由至少一种修饰的VLP多肽组成，或者由至少一种修饰的VLP多肽组成，其中所述修饰的VLP多肽包含或优选由以下组成：(a)VLP多肽，和(b)辅助性T细胞表位，其中所述VLP多肽包含或优选由以下组成：(i)病毒衣壳蛋白的氨基酸序列，优选植物病毒衣壳蛋白的氨基酸序列；或(ii)突变的氨基酸序列，其中待突变的氨基酸序列是所述病毒衣壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述病毒的衣壳蛋白显示出至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、又更优选至少99％的序列同一性。
在优选的实施方案中，所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的VLP，其中所述CMV的修饰的VLP包含至少一种修饰的CMV多肽，基本上由至少一种修饰的CMV多肽组成，或者由至少一种修饰的CMV多肽组成，其中所述修饰的CMV多肽包含或优选由以下组成：(a)CMV多肽，和(b)辅助性T细胞表位；并且其中所述CMV多肽包含或优选由以下组成：(i)CMV衣壳蛋白的氨基酸序列；或(ii)突变氨基酸序列，其中待突变的氨基酸序列是CMV衣壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变氨基酸序列和所述CMV衣壳蛋白至少显示出至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、又更优选至少99％的序列同一性。
在优选的实施方案中，所述CMV多肽包含CMV衣壳蛋白的氨基酸序列，优选由CMV衣壳蛋白的氨基酸序列组成。在另一个优选的实施方案中，所述CMV多肽包含突变的氨基酸序列，优选由突变的氨基酸序列组成，其中待突变的氨基酸序列是CMV的衣壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述CMV的衣壳蛋白显示出至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、又更优选至少99％的序列同一性。通常且优选地，所述突变的氨基酸序列和待突变的所述氨基酸序列在至少1个和至多11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个氨基酸残基上不同，并且其中优选地，这些不同选自(i)插入，(ii)缺失，(iii)氨基酸交换，以及(iv)(i)至(iii)的任何组合。
在另一个优选的实施方案中，所述CMV多肽包含或优选由以下组成：(i)(a)CMV衣壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：15或优选由SEQ ID NO：15组成，或(b)与SEQ ID NO：15具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、再更优选至少90％，进一步再更优选至少95％、更进一步优选至少98％并且再次进一步更优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列；或(ii)突变的氨基酸序列，其中所述待突变的氨基酸序列是如权利要求(i)中定义的所述氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示至少为95％、优选至少98％、更优选至少99％的序列同一性。
在另一个优选的实施方案中，所述CMV多肽包含或优选由以下组成：(a)CMV衣壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：15，或优选由SEQ ID NO：15组成，或(b)与SEQ ID NO：15具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、再更优选至少90％、进一步再更优选至少95％、还进一步更优选优选至少98％，又更进一步优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，所述CMV多肽包含或优选由以下组成：(i)(a)CMV衣壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：27，或(b)包含氨基酸序列区(region)的CMV衣壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列区与SEQ ID NO：27具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、再更优选至少90％、再更进一步优选至少95％、又再更进一步优选至少98％、还又再更进一步优选至少99％的序列同一性；或(ii)突变的氨基酸序列，其中所述待突变的氨基酸序列是如权利要求(i)中定义的所述氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示出至少为95％、优选至少98％、更优选至少99％的序列同一性。
在进一步优选的实施方案中，所述CMV多肽包含或优选由以下组成：(a)CMV衣壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：27，或(b)包含氨基酸序列区的CMV衣壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列区与SEQ ID NO：27具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、再更优选至少90％、再更进一步优选至少95％、又再更进一步优选至少98％、还又再更进一步优选至少99％的序列同一性。
在另一个优选的实施方案中，所述CMV多肽包含或优选由以下组成：(i)(a)CMV衣壳蛋白的氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：15或优选由SEQ ID NO：15组成，或(b)与SEQ ID NO：15具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、再更优选至少90％、再更进一步优选至少95％、又再更进一步优选至少98％、还又再更进一步优选至少99％的序列同一性的氨基酸序列；并且其中所述(a)或(b)中定义的氨基序列包含SEQ IDNO：27；或其中所述(a)或(b)中定义的氨基酸序列包含氨基酸序列区，其中所述氨基酸序列区与SEQ ID NO：27具有至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、再更优选至少90％、再更进一步优选至少95％、又再更进一步优选至少98％、还又再更进一步优选至少99％的序列同一性；或(ii)突变的氨基酸序列，其中所述待突变的氨基酸序列是如权利要求(i)中定义的所述氨基酸序列，并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示出至少为98％、优选至少为99％的序列同一性。
在另一个优选的实施方案中，所述CMV多肽包含或优选由以下组成：(a)CMV衣壳蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：15或优选由SEQ ID NO：15组成，或(b)与SEQ ID NO：15的序列同一性至少为90％的氨基酸序列；并且其中如所述权利要求(a)或(b)中定义的所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：27；或其中如所述权利要求(a)或(b)中定义的所述氨基序列包含氨基酸序列区，其中所述氨基酸序列区与SEQ ID NO：27具有至少90％的序列同一性。
在另一个优选的实施方案中，所述辅助性T细胞表位取代所述CMV多肽的N-末端区域。在另一个优选的实施方案中，所替换的所述N-末端区域的氨基酸数等于或低于所述辅助性T细胞表位所包含的氨基酸数。
在另一个非常优选的实施方案中，所述辅助性T细胞表位取代所述CMV多肽的N末端区域，并且其中所述N末端区域的氨基酸数量等于或低于组成所述辅助性T细胞表位的氨基酸数量。通常且优选地，所述CMV多肽的所述被取代的N-末端区域由5至15个连续氨基酸组成，优选9至14个连续氨基酸组成，更优选11至13个连续氨基酸组成。
在另一个非常优选的实施方案中，所述CMV多肽的所述N-末端区域对应于SEQ IDNO：15的氨基酸2-12。
在另一个非常优选的实施方案中，所述辅助性T细胞表位是通用辅助性T细胞表位。在另一个优选的实施方案中，所述辅助性T细胞表位由至多20个氨基酸组成。
在一个非常优选的实施方案中，所述Th细胞表位是PADRE序列。在进一步非常优选的实施方案中，所述Th细胞表位包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：19的氨基酸序列组成。在另一个非常优选的实施方案中，所述Th细胞表位是PADRE序列，并且其中所述Th细胞表位包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：19的氨基酸序列组成。
在另一个优选的实施方案中，所述辅助性T细胞表位衍生自人疫苗。在一个非常优选的实施方案中，所述Th细胞表位来自破伤风毒素。在进一步非常优选的实施方案中，所述Th细胞表位具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：18的氨基酸序列组成。在另一个非常优选的实施方案中，所述Th细胞表位来自破伤风毒素，并且其中所述Th细胞表位具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：18的氨基酸序列组成。
在一个非常优选的实施方案中，所述Th细胞表位是PADRE序列，并且其中所述Th细胞表位包含由SEQ ID NO：19的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：19的氨基酸序列组成；或其中所述Th细胞表位来源于破伤风毒素，并且其中所述Th细胞表位具有由SEQ ID NO：18的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：18的氨基酸序列组成。
在一个非常优选的实施方案中，所述CMV多肽包含CMV衣壳蛋白的氨基酸序列或优选由CMV衣壳蛋白的氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：15或与SEQ IDNO：15具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列或优选由SEQ ID NO：15或与SEQ ID NO：15具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列组成；并且其中所述氨基序列包含SEQ ID NO：27，并且其中所述辅助性T细胞表位取代所述CMV多肽的N末端区域，并且其中所述CMV多肽的被取代的N末端区域由11至13个连续氨基酸组成，优选由11个连续氨基酸组成，并且其中进一步优选地，所述CMV多肽的所述N-末端区域对应于SEQ ID NO：15的氨基酸2-12。
在另一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成。在另一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：21的氨基酸序列组成。
在一个非常优选的实施方案中，所述第一连接位点和所述第二连接位点通过至少一个共价非肽键连接。在另一个非常优选的实施方案中，所述第一连接位点包含或优选是氨基，优选赖氨酸的氨基。在另一个非常优选的实施方案中，所述第二连接位点包含或优选是巯基，优选半胱氨酸的巯基。
在一个非常优选的实施方案中，所述至少一个第一连接位点是氨基，优选赖氨酸残基的氨基，并且所述至少一个第二连接位点是巯基，优选半胱氨酸残基的巯基或已经化学连接至本发明的至少一种抗原的巯基。在进一步优选的实施方案中，所述仅一种第二连接位点通过至少一个非肽共价键与所述第一连接位点关联(association)，导致所述抗原与所述经修饰的病毒样颗粒的单一且均匀的结合，其中所述与所述第一连接位点关联的仅一种第二连接位点是巯基，并且其中所述抗原和所述经修饰的病毒样颗粒通过所述关联相互作用以形成有序和重复的抗原阵列。
在本发明的一个优选实施方案中，抗原通过化学交联与修饰的VLP连接，通常且优选通过使用异双功能交联剂。在优选的实施方案中，异双功能交联剂含有可与优选的第一连接位点反应、优选与氨基反应、更优选与修饰的VLP的赖氨酸残基的氨基反应的官能团，和可以与优选的第二连接位点(即巯基，优选是抗原固有的或人工添加到抗原中的半胱氨酸残基)反应的另外的官能团，并任选地还可通过还原反应进行反应。一些异双功能交联剂是本领域已知的。这些包括优选的交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、Sulfo-KMUS SVSB、SIA和其他交联剂，可从例如Pierce Chemical Company获得，并且具有一个对氨基具有反应性的官能团和一个对巯基具有反应性的官能团。上述交联剂在与氨基反应后全部导致形成酰胺键并且在与巯基反应后全部导致形成硫醚键。适用于本发明实践的另一类交联剂的特征在于在偶联时在抗原和修饰的VLP之间引入二硫键。属于该类的优选交联剂包括例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。
通过使用根据上述优选方法的异双功能交联剂将抗原与修饰的VLP连接，允许以定向方式将抗原偶联至修饰的VLP。将抗原与修饰的VLP连接的其他方法包括使用碳二亚胺EDC和NHS将抗原与修饰的VLP交联的方法。抗原也可以首先通过与例如SATA、SATP或亚氨基四氢噻吩反应而硫醇化。如果需要，抗原脱保护后，可以与修饰的VLP按如下偶联。在分离过量的硫醇化试剂后，抗原与修饰的VLP反应，所述修饰的VLP预先用包含半胱氨酸反应性部分的异双功能交联剂活化，因此显示至少一个或几个对半胱氨酸残基具有反应性的官能团，硫醇化抗原可以与该半胱氨酸残基反应，如上所述。任选地，在反应混合物中包含少量还原剂。在进一步的方法中，使用同型双功能交联剂如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(Pierce)或其他已知的具有对修饰的VLP的胺基或羧基具有反应性的官能团的同型双功能交联剂，将抗原与修饰的VLP连接。
在本发明非常优选的实施方案中，抗原通过半胱氨酸残基连接至修饰的病毒样颗粒的赖氨酸残基连接，所述半胱氨酸残基已被添加到抗原的N-末端或C-末端，或抗原内的天然半胱氨酸残基。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物还包含接头，其中所述接头将所述抗原与所述第二连接位点相关联，并且其中优选所述接头包含所述第二连接位点或者由所述第二连接位点组成。
在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)，优选重组VLP，并且所述eIL-31抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：1有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、再进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述eIL-31抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质或与SEQID NO：1有至少95％、优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：1的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：2的氨基序列的蛋白质。
在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述核心颗粒是根据本发明的经修饰的VLP，优选重组修饰的VLP，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：1具有至少90％、优选至少92％、更优选至少95％、再更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述eIL-31抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：1具有至少95％、优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：1的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：2的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：3的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ IDNO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：4的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：5的氨基序列的蛋白质。
在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述核心颗粒是VLP，优选重组VLP，其中所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的VLP，其中所述CMV的修饰的VLP包含至少一种修饰的CMV多肽，或基本上由至少一种修饰的CMV多肽组成或者由至少一种修饰的CMV多肽组成，其中所述修饰的CMV多肽包含或优选由以下组成：(a)CMV多肽和(b)辅助性T细胞表位；并且其中所述CMV多肽包含或优选由以下组成：(i)CMV衣壳蛋白的氨基酸序列；或(ii)突变氨基酸序列，其中待突变的氨基酸序列是CMV衣壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变氨基酸序列和所述CMV衣壳蛋白显示至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、再更优选至少99％的序列同一性，并且其中所述eIL-31抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：1有至少90％、优选至少92％、更优选至少95％、再更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述eIL-31抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：1有至少95％、优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：1的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：2的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：3的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ IDNO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：4的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：5的氨基序列的蛋白质。
在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述核心颗粒是VLP，优选重组VLP，其中所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的VLP，其中所述CMV的修饰的VLP包含至少一种经修饰的CMV多肽组成，基本上由至少一种经修饰的CMV多肽组成或可替选地由至少一种经修饰的CMV多肽组成，并且其中所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ IDNO：1的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：1有至少90％、优选至少92％、更优选至少95％、再更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述eIL-31抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：1有至少95％、优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ IDNO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：1的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：2的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：3的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：4的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：5的氨基序列的蛋白质。
在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述核心颗粒是VLP，优选重组VLP，其中所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的VLP，其中所述CMV的修饰的VLP包含至少一种经修饰的CMV多肽，基本上由至少一种经修饰的CMV多肽组成，或者由至少一种经修饰的CMV多肽组成，并且其中所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，优选由SEQ IDNO：21的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：1有至少90％、优选至少92％、更优选至少95％、再更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：21的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：21的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：1的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：21的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：2的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQID NO：3的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：4的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-31抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：5的氨基序列的蛋白质。
在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述第二核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)，优选重组VLP，并且所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：6具有至少90％、优选至少92％、更优选至少95％、再更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个优选实施方案中，所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ IDNO：6有至少95％、优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ IDNO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：6的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：7的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：8的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ IDNO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：9的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：10的氨基序列的蛋白质。
在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述第二核心颗粒是根据本发明的经修饰的VLP，优选重组经修饰的VLP，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：6具有至少90％、优选至少92％、更优选至少95％、再更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：6有至少95％、优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：6的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：7的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：8的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ IDNO：9的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：10的氨基序列的蛋白质。
在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述第二核心颗粒是VLP，优选重组VLP，其中所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的VLP，其中所述CMV的修饰的VLP包含至少一种修饰的CMV多肽，基本上由至少一种修饰的CMV多肽组成，或者由至少一种修饰的CMV多肽组成，其中所述修饰的CMV多肽包含或优选由以下组成：(a)CMV多肽和(b)辅助性T细胞表位；并且其中所述CMV多肽包含或优选由以下组成：(i)CMV衣壳蛋白的氨基酸序列；或(ii)突变氨基酸序列，其中待突变的氨基酸序列是CMV衣壳蛋白的氨基酸序列，并且其中所述突变氨基酸序列和所述CMV衣壳蛋白显示出至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、再更优选至少99％的序列同一性，并且其中所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：6有至少90％、优选至少92％、更优选至少95％、再更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：6有至少95％、优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：6的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：7的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：8的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ IDNO：9的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：10的氨基序列的蛋白质。
在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述第二核心颗粒是VLP，优选重组VLP，其中所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的VLP，其中所述CMV的修饰的VLP包含至少一种经修饰的CMV多肽，基本上由至少一种经修饰的CMV多肽组成，或者由至少一种经修饰的CMV多肽组成，并且其中所述经修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：6具有至少90％、优选至少92％、更优选至少95％、再更优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述eIL-5抗原包含或优选是具有选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：6有至少95％、优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：6的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：7的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：8的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ IDNO：9的氨基序列的蛋白质。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成，并且所述eIL-5抗原包含或优选为具有SEQ ID NO：10的氨基序列的蛋白质。
在优选的实施方案中，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病、瘙痒症、过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病、复发性荨麻疹、疱疹、炎性气道疾病、反复发作气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺病和由自身免疫引起的炎症过程。
在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒病症选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病、瘙痒症、过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病和复发性荨麻疹；其中所述过敏性病症选自过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)、复发性荨麻疹、瘙痒、痉挛、炎性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺病和由自身免疫引起的炎症过程。
在又一个优选的实施方案中，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病、瘙痒症、过敏性皮炎、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病、复发性荨麻疹、疱疹、炎性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺病和由自身免疫引起的炎症过程。
在又一个优选的实施方案中，所述瘙痒病症选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病、瘙痒症、过敏性皮炎、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病和复发性荨麻疹；其中所述过敏性病症选自过敏性皮炎、复发性荨麻疹、瘙痒、痉挛、炎性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺病和由自身免疫引起的炎症过程。
在又一个优选的实施方案中，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病、瘙痒症、过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病和复发性荨麻疹。
在又一个优选的实施方案中，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病、瘙痒症、过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)和复发性荨麻疹。
在优选的实施方案中，所述瘙痒病症选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病、瘙痒症、过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病和复发性荨麻疹；其中所述过敏性病症选自过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)、复发性荨麻疹和瘙痒症。
在一个优选的实施方案中，所述瘙痒病症选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病、瘙痒症、过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)和复发性荨麻疹；其中所述过敏性病症选自过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)、复发性荨麻疹和瘙痒症。
在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病、瘙痒症、过敏性皮炎、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病和复发性荨麻疹。
在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒病症选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病、瘙痒症、过敏性皮炎、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病和复发性荨麻疹；其中所述过敏性病症选自过敏性皮炎、复发性荨麻疹和瘙痒症。
在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、瘙痒症、过敏性皮炎、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病和复发性荨麻疹。
在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、瘙痒症、过敏性皮炎和复发性荨麻疹。
在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒病症选自特应性皮炎、湿疹、瘙痒症、过敏性皮炎、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病和复发性荨麻疹；其中所述过敏性病症选自过敏性皮炎、复发性荨麻疹和瘙痒症。
在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、瘙痒症、过敏性皮炎、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病和复发性荨麻疹。
在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、瘙痒症、过敏性皮炎和复发性荨麻疹。
在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒病症选自特应性皮炎、瘙痒症、过敏性皮炎、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病和复发性荨麻疹；其中所述过敏性病症选自过敏性皮炎、复发性荨麻疹和瘙痒症。
在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒病症选自特应性皮炎、瘙痒症、过敏性皮炎和复发性荨麻疹；其中所述过敏性病症选自过敏性皮炎、复发性荨麻疹和瘙痒症。
在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒病症或所述过敏性病症是特应性皮炎。在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒病症或所述过敏性病症是瘙痒症。在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒病症或所述过敏性病症是过敏性皮炎。在进一步优选的实施方案中，所述瘙痒病症或所述过敏性病症是复发性荨麻疹。
在又一个优选实施方案中，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病、瘙痒症、过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病、复发性荨麻疹、疱疹、炎性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺病和由自身免疫引起的炎症过程，并且其中优选地，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、瘙痒症、过敏性皮炎、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病、和复发性荨麻疹。
在另一个优选实施方案中，与施用所述组合物之前的所述瘙痒病症或所述过敏性病症相关的所述至少一个参数或症状相比，所述组合物的所述施用降低了与所述瘙痒病症或所述过敏性病症相关的至少一个参数或症状，并且其中优选地，所述与所述瘙痒病症或所述过敏性病症相关的至少一个参数或症状是皮肤损伤的水平或严重等级或瘙痒水平，并且其中进一步优选地，所述皮肤损伤的水平或严重等级的降低通过症状损伤评分测试确定并且所述瘙痒水平的降低通过瘙痒评分测试来确定，其中进一步优选地，所述瘙痒水平的降低通过所述马科哺乳动物、优选所述马的身体的至少一个部位的刮擦的减少来确定，并且其中通常和优选地，所述症状损伤评分测试和所述瘙痒评分测试如实施例7和实施例8所述进行。
在进一步优选的实施方案中，与施用所述组合物之前的所述瘙痒病症或所述过敏性病症相关的所述至少一个参数或症状相比，所述组合物的所述施用降低了与所述瘙痒病症或所述过敏性病症相关的至少一个参数或症状，其中所述与所述瘙痒病症或所述过敏性病症相关的至少一个参数或症状是皮肤损伤的水平或严重程度以及瘙痒水平，并且其中优选地，所述皮肤损伤的水平或严重程度的降低通过症状损伤评分测试确定并且所述瘙痒水平的降低是通过瘙痒评分测试确定的，其中进一步优选地，所述瘙痒水平的所述降低通过所述马科哺乳动物、优选所述马的身体的至少一个部位的刮擦的减少来确定，并且其中通常和优选地，所述症状损伤评分测试和所述瘙痒评分测试如实施例7和实施例8所述进行。
实施例
用于本发明的优选核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)，特别是重组VLP。在一个优选的实施方案中，VLP是RNA噬菌体Qβ的VLP，其中RNA噬菌体Qβ的VLP包含重组衣壳蛋白，优选由重组衣壳蛋白组成，所述重组衣壳蛋白包含SEQ ID NO：24，优选由SEQ ID NO：24组成。这种优选的RNA噬菌体的病毒样颗粒，特别是RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒公开在WO 02/056905中，其公开内容通过引用整体并入本文。特别地，WO 02/056905的实施例18包含RNA噬菌体Qβ的VLP颗粒的制备的详细描述。对于本发明的具体实例，已经使用了由SEQ ID NO：24的重组衣壳蛋白组成的RNA噬菌体Qβ的VLP。在另一个优选的实施方案中，VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的VLP，特别是CMV的修饰的VLP，其中辅助性T细胞表位取代CMV多肽的N-末端区域。在一个非常优选的实施方案中，VLP是包含SEQ ID NO：20的修饰的CMV多肽的CMVtt830，或包含SEQ ID NO：21的修饰的CMV多肽的CMV-Npadr，优选包含SEQ ID NO：20的修饰的CMV多肽的CMVtt830，如本文所述和WO 2016/062720中公开的。特别地，WO 2016/062720的实施例1至6包含了SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21的修饰的CMV多肽的VLP颗粒的制备的详细描述。
实施例1
来自受皮炎影响的皮肤损伤和健康皮肤的马的皮肤穿刺活检取样，RNA分离和eIL-31特异性PCR
A.来自受皮炎影响的皮肤损伤和健康皮肤的马的皮肤穿刺活检取样
来自受瘙痒和过敏性皮炎病症影响的马的损伤和健康皮肤的2和6mm穿刺活检。
B.皮肤活组织检查的RNA分离和cDNA转录
将皮肤活组织检查物储存在4℃的溶液(Qiagen)中，并使用-Micro Kit(Invitrogen)分离总RNA，包括DNase I处理和灭活。使用逆转录系统(Promega)将RNA转录成cDNA，并通过PCR扩增eIL-31mRNA水平和管家βactin基因，并通过qPCR定量。
C.马IL-31和βactin PCR和qPCR
PCR：使用eIL-31的基因特异性引物(正向引物：AACAAAGAGAAGGGAGTGC–SEQ IDNO：11；反向引物：GCTGAGCTGTTGATGTTGC–SEQ ID NO：12)和eβactin的基因特异性引物(正向引物：CCAGCACGATGAAGATCAAG–SEQ ID NO：13；反向引物：GTGGACAATGAGGCCAGAAT–SEQ IDNO：14)在皮肤活组织检查中扩增eIL-31eβactin。使用Q5热启动聚合酶(NEB)进行PCR，循环30”98℃，35x[10”98℃，20”60℃，30”72℃]，2’72℃。
qPCR：使用eIL-31的基因特异性引物(正向引物：AACAAAGAGAAGGGAGTGC–SEQ IDNO：11；反向引物：GCTGAGCTGTTGATGTTGC–SEQ ID NO：12)和eβactin的基因特异性引物(正向引物：CCAGCACGATGAAGATCAAG–SEQ ID NO：13；反向引物：GTGGACAATGAGGCCAGAAT–SEQ IDNO：14)在皮肤活组织检查中扩增eIL-31eβactin。使用FastStart Universal SYBR GreenMaster(Roche)进行PCR。
发现马IL-31mRNA在来自马中具有瘙痒症伴随的过敏性皮炎的部位的皮肤损伤中表达(图1A，第a行，泳道1和2)，而在健康的马皮肤样品中不存在(图1A，第a行，泳道3和4)。在所有样品中扩增对照mRNA βactin(图1A，第b行，泳道1-4行)。通常，在受(过敏性)皮炎影响的马的皮肤损伤中，基本上所有皮肤层中都存在高含量的嗜酸性粒细胞。后者与人或其他驯养哺乳动物(例如狗)中的皮肤损伤(其中嗜酸性粒细胞不参与皮肤病理学)形成对比。因此，马IL-31mRNA在来自马中伴有瘙痒症的过敏性皮炎部位的皮肤损伤中的显著表达强烈地表明马IL-31参与瘙痒症伴随的过敏性皮炎。
马IL-31mRNA相对于来自皮肤活组织检查的管家基因βactin的表达显示，仅从瘙痒皮肤病变中提取的样品确实表达了马IL-31mRNA，而在来自相同马的相应的健康皮肤样品中未检测到eIL-31，并且在没有患瘙痒的马的健康皮肤中也不存在(图1B)。
实施例2
通过从过敏的马中分离的PBMC体外刺激T细胞
A.体外刺激测定
通过体外刺激测定定量受过敏性皮炎影响的马和健康马的血液中的Th细胞亚群中的马IL-31水平。采集来自受IBH影响的马或健康马的血液，并通过Ficoll分离PBMC。
分别使用过敏原提取物和/或重组过敏原进行抗原摄取，且伴刀豆球蛋白A(ConA)作为阳性对照。阴性对照为仅培养基。在刺激物存在下培养PBMC 24和48小时。
或者，使用单克隆抗马CD14抗体(克隆105)和次级山羊抗小鼠包被微珠，根据制造商的标准方案通过磁分离(MACS技术，Miltenyi Biotec GmbH，Bergisch-Gladbach，德国)分离马单核细胞。然后在LS柱(Miltenyi Biotec)上分离细胞，并在重组马IL-4和GM-CSF存在下通过培养CD14+单核细胞3天诱导分化成MoDC，如(Moyo等，2013)中所述。为使其成熟，根据Moyo等(2013)的描述，将树突细胞暴露于包含1μg/ml LPS(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里，美国)、1μg/ml前列腺素E2(Enzo Life Sciences，埃克塞特，英国)、20ng/ml的马肿瘤坏死因子-α、10ng/ml的马IL-1β、20ng/ml的马IL-6和100ng/ml的马IFN-γ(均来自R&DSystems，阿宾顿，英国)的成熟混合物中过夜。分别使用过敏原提取物和/或重组过敏原进行抗原摄取，并且破伤风类毒素肽作为阳性对照。将T细胞与载有抗原的APC共培养24小时。
B.PBMC细胞的RNA分离和cDNA转录
使用 RNA XS试剂盒(Macherrey-Nagel)从PBMC细胞中分离总RNA，包括DNase I处理和灭活。使用逆转录系统(Promega)将RNA转录成cDNA，并通过qPCR定量eIL-31mRNA水平和管家βactin基因拷贝数。
C.马IL-31RNA定量
通过qPCR从细胞提取物的mRNA水平定量由Th2细胞产生的马IL-31的水平。
qPCR：使用eIL-31的基因特异性引物(正向引物：AACAAAGAGAAGGGAGTGC–SEQ IDNO：11；反向引物：GCTGAGCTGTTGATGTTGC–SEQ ID NO：12)和eβactin的基因特异性引物(正向引物：CCAGCACGATGAAGATCAAG–SEQ ID NO：13；反向引物：GTGGACAATGAGGCCAGAAT–SEQ IDNO：14)在皮肤活组织检查中扩增eIL-31eβactin。使用FastStart Universal SYBR GreenMaster(Roche)进行PCR。
在库蠓(Culicoides)过敏原刺激的来自受IBH影响的马和健康的非IBH马的PBMC中的eIL-31mRNA相对于管家基因eβactin的表达(图1C)。受IBH影响的马在过敏原刺激后相对于培养基刺激后的马中的IL-31表达增加，而在健康马中培养基和过敏原的刺激相当。
通过流式细胞术对IL-31进行细胞内细胞因子染色
通过流式细胞术在蛋白质水平上定量Th2细胞中的胞内马IL-31水平。
实施例3
马IL-31(eIL-31)的克隆、表达和纯化
A.克隆eIL-31-C-His并在大肠杆菌中表达为包涵体
编码成熟eIL-31(SEQ ID NO：1)的DNA序列通过基因合成产生。
另外，在C末端添加接头(GGC)。将该插入物侧接5'NdeI和3'XhoI，并整合到pET42b(+)中，在框架内含有六聚His标签(以便于纯化)和终止密码子。该构建体称为pET42b-eIL-31(SEQ ID NO：22)。通过DNA测序确认克隆程序的准确性(fidelity)。将构建体pET42b-eIL-31(SEQ ID NO：22)转化到大肠杆菌菌株BL21-DE3中。在大肠杆菌中表达的重组蛋白质称为eIL-31-C-His(SEQ ID NO：2)。
在BL21-DE3细胞中进行来自克隆pET42b-eIL31-C-His的eIL-31-C-His的更大规模的表达。为此目的，将含有pET42b-eIL31-C-His的克隆BL21-DE3细胞在含有50mg/L卡那霉素的180ml LB中培养过夜。用该培养物接种含有50mg/L卡那霉素的10L LB。使培养物生长至光密度OD600nm为0.7，并通过加入10ml 1.0M的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)原液诱导表达4小时。重组eIL-31-C-His以不溶形式表达并位于诱导细胞的包涵体部分中。以流动方式证实了eIL-31-C-His的表达。诱导后进行4小时的培养，并在4℃以4200×g离心10分钟。使用ultraturex(800rpm)将沉淀用重悬浮缓冲液(100mM Tris/HCl pH 8.0，4℃，1mMEDTA)(3ml/g的细胞)重悬浮。将重悬浮的细胞收集在Falcon管中并在液氮中休克冷冻(shock freeze)并在-20℃下储存过夜。将重悬浮的细胞在室温下解冻并通过细胞裂解器或dounce匀浆器和超声波仪打开细胞(用于凝胶分析的50μl样品：样品A＝裂解物，50μl)。加入0.5体积的冷triton缓冲液(60mM EDTA，1.5M NaCl，用NaOH调节pH至7.0，然后加入6％(v/v)Triton-X-100)并在4℃下搅拌30分钟。此后，将裂解物在48000x g和4℃下离心30分钟(50μl样品用于凝胶分析：样品B＝可溶性级分，50ml)。将包涵体用ultraturrax重悬于洗涤缓冲液(100mM Tris/HCl pH 8.0，4℃，20mM EDTA)中，并在48000×g和4℃下离心10分钟。将该洗涤步骤重复四次以除去triton-x 100，最后将包涵体储存在-20℃。将包涵体在室温下解冻，使用ultraturex通过重悬浮于溶解缓冲液(6M GdmCl，20mM Immidazol，100mMTris-HCl，pH8，室温)(20ml/g的包涵体)溶解，并在室温下搅拌1-2小时。将溶解的包涵体在15℃以平均100000×g超离心30分钟(50μl样品用于凝胶分析：样品C＝溶解的包涵体50μl)。
B.eIL-31-C-His的纯化和重折叠
通过His-标签，利用Ni-NTA树脂(Ni-NTA Sepharose 6Fast Flow，Amersham，CatNo 17-5318-01或Ni-NTA Sepharose SUperflow,Quiagen,CatNo 1018142)柱，用溶解缓冲液作为结合缓冲液A并且通过缓冲液B(6M GdmCl，100mM NaH2PO4,10mM TrisHCl，pH4.5)洗脱，来纯化蛋白质(50μl样品用于凝胶分析：样品D＝流过NiNTA；50μL，样品E＝峰NiNTA 50μl)。通过SDS-PAGE分析纯化。合并来自洗脱步骤的含有eIL-31-C-His的级分，并使用8kDa截留膜在室温下相对于6M GdmCl、100mM NaH2PO4、10mM Tris，pH 8.0透析2小时。
用6M盐酸胍从洗涤剂洗涤后的包涵体中提取不溶性eIL-31-C-His。通过SDS-PAGE(图2A)分析不同的洗涤步骤：裂解物(图2A，泳道1)，可溶性级分(图2A，泳道2)，溶解的包涵体(图2A，泳道3)。通过金属螯合亲和层析纯化溶解的蛋白质，并通过SDS-PAGE分析(图2A，泳道4，合并的级分洗脱液)。发现重组eIL-31-C-His通过该方法高度富集。通过在非还原条件下进行的SDS-PAGE评估天然蛋白质(图2B，泳道1)，并且主要发现单体蛋白质。将变性的蛋白质进行如下所述的重折叠程序，并任选通过尺寸排阻色谱法进一步纯化。
为了重新折叠eIL-31-C-His，通过以下缓冲液依次透析蛋白质：缓冲液1(2M尿素，50mM NaH2PO4，5mM还原的谷胱甘肽，0.5mM氧化的谷胱甘肽，0.5M精氨酸，10％甘油)，缓冲液2(50mM NaH2PO4，5mM还原的谷胱甘肽，0.5mM氧化的谷胱甘肽，0.5M精氨酸，10％甘油)，缓冲液3a(50mM NaH2PO4，0.5M精氨酸，10％甘油)，缓冲液3b(50mM NaH2PO4，10％甘油)，缓冲液4(PBS)。任选地，通过离心过滤器(Amicon，Ultrafree-15Millipore，10kDa截止值)浓缩重折叠的蛋白质，并在HiLoad 26/600Superdex 75制备级(GE Healthcare，CatNo 28-9893-34)上使用PBS缓冲液进行纯化。合并洗脱的级分并通过非还原性SDS-PAGE(具有SDS，无DTT，不加热样品)分析。通过UV-VIS或Bradford测定法测量蛋白质浓度。
通过在非还原条件下进行的SDS-PAGE评估纯化的重组eIL-31-C-His在重折叠后形成二聚体的能力(图2B，泳道2)。通过约33kDa的分子量判断，表明eIL-31-C-His部分地存在于二聚体结构中。
C.重组重折叠的马eIL-31-C-His的生物活性
将eIL-31-C-His皮下注射到马的颈部。发痒被定义为在注射部位(颈部)发痒≥5秒。从注射后1小时开始，每小时的刮擦/发痒次数总共计数5小时。将注射eIL-31-C-His后的发痒与注射eIL-5-C-His的对照组进行比较。相比于对照组，针对eIL-31-C-His记录的发痒数量增加(图2C)。
实施例4
马白细胞介素-5(eIL-5)的克隆、表达和纯化
A.克隆eIL-5-C-His并在大肠杆菌中表达为包涵体
通过基因合成产生编码成熟eIL-5(成熟白细胞介素-5，马；UniProt O02699)的DNA序列。SEQ ID NO：6。
另外，在C末端添加接头(GGC)。将该插入物侧接5'NdeI和3'XhoI，并整合到pET42b(+)中，在框架内含有六聚His标签(以便于纯化)和终止密码子。该构建体称为pET42b-eIL-5(SEQ ID NO：23)。通过DNA测序确认克隆程序的准确性(fidelity)。将构建体pET42b-eIL-5(SEQ ID NO：23)转化到大肠杆菌菌株BL21-DE3中。在大肠杆菌中表达的重组蛋白质称为eIL-5-C-His(SEQ ID NO：7)。类似地，已经制备了SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEG IDNO：10，它们都包含含有接头的半胱氨酸残基和(除了SEQ ID NO：10)His标签，其中SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10包含接头(GGC)和(SEQ ID NO：10除外)在C-末端的His-标签。SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9，特别是SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8在本文中可互换地称为“eIL-5-C-His”。此外，当在实施例部分和描述的图中提及eIL-5-C-His时，已经使用了这些eIL-5-C-His重组蛋白中的一种，在各种实施例中，在重复的实验中甚至使用了一种以上或全部。非常优选使用的eIL-5-C-His是SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。在BL21-DE3细胞中进行来自克隆pET42b-eIL5-C-His的eIL-5-C-His的更大规模的表达。为此目的，将含有pET42b-eIL-5-C-His的克隆BL21-DE3细胞在含有50mg/L卡那霉素的180ml LB中培养过夜。用该培养物接种含有50mg/L卡那霉素的10L LB。使培养物生长至光密度OD600nm为0.7，并通过加入10ml 1.0M的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)原液诱导表达4小时。重组eIL-5-C-His以不溶形式表达并位于诱导细胞的包涵体部分中。以流动方式证实了eIL-5-C-His的表达。诱导后进行4小时的培养，并在4℃以4200×g离心10分钟。使用ultraturex(800rpm)将沉淀用重悬浮缓冲液(100mM Tris/HCl pH 8.0，4℃，1mM EDTA)(3ml/g的细胞)重悬浮。将重悬浮的细胞收集在Falcon管中并在液氮中休克冷冻(shockfreeze)并在-20℃下储存过夜。将重悬浮的细胞在室温下解冻并通过细胞裂解器或dounce匀浆器和超声波仪打开细胞(用于凝胶分析的50μl样品：样品A＝裂解物，50μl)。加入0.5体积的冷triton缓冲液(60mM EDTA，1.5M NaCl，用NaOH调节pH至7.0，然后加入6％(v/v)Triton-X-100)并在4℃下搅拌30分钟。此后，将裂解物在48000x g和4℃下离心30分钟(50μl样品用于凝胶分析：样品B＝可溶性级分，50ml)。将包涵体用ultraturrax重悬于洗涤缓冲液(100mM Tris/HCl pH8.0，4℃，20mM EDTA)中，并在48000×g和4℃下离心10分钟。将该洗涤步骤重复四次以除去triton-x 100，最后将包涵体储存在-20℃。将包涵体在室温下解冻，使用ultraturex通过重悬浮于溶解缓冲液(6M GdmCl，20mM Immidazol，100mM Tris-HCl pH 8，室温)(20ml/g的包涵体)溶解，并在室温下搅拌1-2小时。将溶解的包涵体在15℃以平均100000×g超离心30分钟(50μl样品用于凝胶分析：样品C＝溶解的包涵体50μl)。
B.eIL-5-C-His的纯化和重折叠
通过His-标签，利用Ni-NTA树脂(Ni-NTA Sepharose 6Fast Flow,Amersham,CatNo 17-5318-01或Ni-NTA Sepharose SUperflow,Quiagen,CatNo 1018142)柱，用溶解缓冲液作为结合缓冲液A并通过缓冲液B(6M GdmCl，100mM NaH2PO4，10mM TrisHCl，pH 4.5)洗脱，来纯化蛋白质(50μl用于凝胶分析的样品：样品D＝流过NiNTA；50μl，样品E＝峰值NiNTA 50μl)。通过SDS-PAGE分析纯化。合并来自洗脱步骤的含有eIL-5-C-His的级分，并使用10kDa截留膜在室温下相对于6M GdmCl、100mM NaH2PO4、10mM Tris，pH 8.0透析2小时。
用6M盐酸胍从洗涤剂洗涤后的包涵体中提取不溶性eIL-5-C-His。通过SDS-PAGE(图1)分析不同的洗涤步骤：裂解物(图3A，泳道1)，可溶性级分(图3A，泳道2)，溶解的包涵体(图3A，泳道3)。通过金属螯合亲和层析纯化溶解的蛋白质，并通过SDS-PAGE分析(图3A，泳道4，流过，泳道5，合并的级分洗脱液)。发现重组eIL-5-C-His通过该方法高度富集。通过在非还原条件下(具有SDS，无DTT，不加热样品)进行SDS-PAGE(图3B)评估天然蛋白质(图3B，泳道1)，并且主要发现单体蛋白质。将变性的蛋白质进行如下所述的重折叠程序，并任选通过尺寸排阻色谱法进一步纯化。
为了重新折叠eIL-5-C-His，通过以下缓冲液依次透析蛋白质：缓冲液1(2M尿素，50mM NaH2PO4，5mM还原的谷胱甘肽，0.5mM氧化的谷氨酸，0.5M精氨酸，10％甘油)，缓冲液2(50mM NaH2PO4，5mM还原的谷胱甘肽，0.5mM氧化的谷氨酸，0.5M精氨酸，10％甘油)，缓冲液3(50mM NaH2PO4,10％甘油)，缓冲液4(PBS)。任选地，通过离心过滤器(Amicon，Ultrafree-15Millipore，10kDa截止值)浓缩重折叠的蛋白质，并在HiLoad 26/600Superdex 75制备级(GE Healthcare，CatNo 28-9893-34)上使用PBS缓冲液进行纯化。合并洗脱的级分并通过非还原性SDS-PAGE分析。通过UV-VIS或Bradford测定法测量蛋白质浓度。
由于具有生物活性的天然IL-5是二硫键连接的同型二聚体，因此通过在非还原条件下进行SDS-PAGE来评估纯化的重组eIL-5-C-His在重折叠后形成二聚体的能力(图3B，泳道2)。通过约28kDa的分子量判断，eIL-5-C-His在性质上被证明是二聚体，显示了天然三级结构的保守性。
C.富含eIL-5-C-His的重组同型二聚体的结构
测量显示α-螺旋和β-折叠的远UV的CD光谱，以确认正确的二级结构(图3C)。
进行质谱分析(消化的eIL-5-C-His的MALDI/MS/MS，然后通过HPLC)，以确认除了二级结构外的蛋白质的一级、三级和四级结构。通常，IL-5单体通过两个分子间二硫键作为同型二聚体连接，导致两个单体的头接至尾位置。
通过ELISA测试市售抗体与重组eIL-5-C-His结合的能力(图3D)。将Maxisorp 96孔ELISA板(Nunc)用0.5μl的0.5mg/L抗His抗体包被过夜。将板用PBS-Tween 0.1％(v/v)(PBST)洗涤3次，然后用Superblock(Thermo Scientific)在37℃下封闭1小时。将板用PBST洗涤两次，并加入纯化的重组eIL-5-C-His(10mg/L)并孵育1小时。然后将板用PBST洗涤3次，并将抗eIL-5抗体(马IL-5亲和纯化的多克隆抗体，R&D Systems，英国，CatNo AF2470)以1/3稀释从4μl/ml开始滴定并在室温孵育2小时。随后将板用PBST洗涤3次，并与缀合有HRP的次级抗山羊IgG(稀释度1:2000)在室温下孵育30分钟。将板再次用PBS洗涤3次并加入50μl/孔的显影溶液(TMB)。在室温下反应2分钟后，用每孔25μl的5％H2SO4终止ELISA。用Tecan M200分光光度计(Tecan，奥地利)在450nm测量吸光度。
通过圆二色性(CD)光谱法测量重组eIL-5-C-His的适当重折叠，并且能够如所预期地发现大部分的α螺旋以及β折叠(图3C)。通过MALDI/MS/MS进一步证实了两个单体通过两个分子间二硫键连接。质量分数2505、2633和2761m/z的MSMS分数显示典型的二硫化物片段模式32/2/32。两个单体通过2个二硫键桥按照Cys44分子间连接至Cys86而连接(光谱未显示)。此外，在ELISA中可通过市售的抗马IL-5抗体检测重折叠的马IL-5-C-His(图3D)。
实施例5
eIL-31抗原与VLP的偶联，马的免疫以及在患有瘙痒诱发的皮炎的马中的疗效证明
A.将马IL-31-C-His与Qβ的VLP偶联
如WO 02/056905中所述，制备包含SEQ ID NO：24的衣壳蛋白的Q VLP，并与7.5倍摩尔过量的异双功能交联剂琥珀酰亚胺基-6(-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸酯(SMPH)(Pierce)反应。通过PD-10脱盐柱(GE Healthcare)除去未反应的交联剂。将重组、纯化和重折叠的eIL-31-C-His用等摩尔过量的在pH 8.0的PBS中的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)还原1小时，以还原接头中包含的半胱氨酸残基。然后将还原的eIL-31-C-His与衍生化的QVLP以Q单体与eIL-31-C-His蛋白的摩尔比为1:1进行混合，并在22℃下共孵育4小时以允许交联。该反应使用300kDa截留透析膜相对于PBS pH 7.4透析12小时，或者通过尺寸排阻色谱法或使用100kDa MWCO的切向流过滤(tangential flow filtration)除去游离的未偶联的eIL-31-C-His。
分析：SDS-PAGE的考马斯染色(图4A)。通过SDS-PAGE分离Q、eIL-31-C-His和eIL-31-C-His-Q VLP。随后用考马斯蓝(0.025％考马斯亮蓝R-250，40％甲醇，10％乙酸)染色凝胶，并用脱色剂(40％甲醇，10％乙酸)脱色。
用抗His抗体进行Western印迹染色(图4B)。通过SDS-PAGE分离Q、eIL-31-C-His和eIL-31-C-His-Q VLP并电印迹到硝酸纤维素膜上。用PBST中的5％(w/v)BSA粉末将膜封闭1小时，然后与10ml1：800稀释的抗His抗体(Penta-His抗体，无BSA，小鼠单克隆IgG1，CatNo.34660)在PBST中的1％BSA(w/v)粉末中一起孵育。将膜用PBST洗涤15分钟，然后与10ml 1％(w/v)BSA在PBST用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗小鼠IgG抗体中以1:10000的稀释度孵育1小时。将膜在PBS中洗涤15分钟，用ECL(Amersham Pharmacia，瑞典)显影，并暴露于照相胶片。
通过SDS-PAGE和Western印迹分析评估eIL-31-C-His与病毒样颗粒Q的共价化学偶联。偶联反应的考马斯蓝染色凝胶显示出具有对应于与Q共价连接的马IL-31-C-His所预测的分子量条带的出现(图4A)。此外，Western印迹分析显示当用抗His抗体染色时这些条带的共定位(图4B)。
B.eIL31-C-His与CMVtt830 VLP的偶联
如上所述制备CMVtt830 VLP，并与10倍摩尔过量的异双功能交联剂琥珀酰亚胺基-6(-马来酰亚胺基丙酰胺基)-己酸酯(SMPH)(Pierce)反应。通过PD-10脱盐柱(GEHealthcare)除去未反应的交联剂。将重组、纯化和重折叠的eIL-31-C-His用等摩尔过量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)在20mM Na2PO4/2mM EDTA(pH 7.5)中还原1小时，以还原接头中包含的半胱氨酸残基。然后将还原的eIL-31-C-His与衍生化的CMVtt830 VLP以VLP单体与eIL-31-C-His蛋白的摩尔比为1:1进行混合，并在22℃下共孵育4小时以允许交联。该反应使用300kDa截留透析膜相对于20mM Na2PO4/2mM EDTA，pH 7.5透析12小时，或者通过尺寸排阻色谱法或使用100kDa MWCO的切向流过滤除去游离的未偶联的eIL-31-C-His。
分析：SDS-PAGE的考马斯染色(图4C)：通过SDS-PAGE分离eIL-31-C-His、CMVtt830和eIL31-C-His-CMVtt830 VLP。随后用考马斯蓝(0.025％考马斯亮蓝R-250、40％甲醇、10％乙酸)染色凝胶，并用脱色剂(40％甲醇，10％乙酸)脱色。
用抗His抗体进行Western印迹染色(图4D)：通过SDS-PAGE分离eIL-31-C-His、CMVtt830和eIL31-C-His-CMVtt830 VLP，并电印迹到硝酸纤维素膜上。用PBST中的5％(w/v)BSA粉末将膜封闭1小时，然后与10ml 1：1000稀释的抗His抗体(单克隆抗His标签抗体HRPO缀合物，Novagen CatNo.71840)在PBST中的1％BSA(w/v)粉末中一起孵育。用PBST洗涤膜15分钟，然后用ECL(Amersham Pharmacia，瑞典)显影并暴露于照相胶片。
通过SDS-PAGE和Western印迹分析评估eIL31-C-His与CMVtt830VLP的共价化学偶联。偶联反应的考马斯蓝染色凝胶显示出具有对应于分别与CMV-tt830共价连接的马IL31-C-His预测的分子量条带的出现(图4C)。此外，Western印迹分析显示当用抗His抗体染色时这些条带的共定位(图4D)。
C.免疫方案
分别单独使用eIL-31-C-His-VLP处理和疫苗接种的马。为了产生针对马IL-31的自身反应性抗体，在第0、28和101天用1000μl PBS中300μg的eIL-31-C-His-CMVtt830皮下注射于马。在免疫接种之前并且至少在免疫方案的第41天和在第41天后的多个其他时间点对马采血。通过ELISA分析血清(图5A)。
分别使用eIL-5-C-His-VLP/eIL-31-C-His-VLP联合处理(combinatory treatments)和疫苗接种(分开注射)的马。为了产生马IL-5和马IL-31的自身反应性抗体，在第-62和-40天向马皮下注射在1000μl PBS中的eIL5-C-His-Qβ疫苗，并在第0天和第19天向马注射在1000μl PBS中300μg的eIL-31-C-His-Qβ疫苗。在免疫接种之前和第42天或第93和118天对马采血。通过ELISA分析血清(图5B)。
分别使用eIL-5-C-His-VLP/eIL-31-C-His-VLP组合处理(combination treatments)和疫苗接种的马。为了产生马IL-5和马IL-31的自身反应性抗体，在第0、28、105天，同时向马皮下注射eIL-5-C-His-CMVtt830和eIL-31-C-His-CMVtt830(在总共2000μl的20mM Na2PO4/2mM EDTA，pH 7.5中)，每种300μg。在免疫接种之前并且至少在免疫方案的第42天和第84天以及第84天后的多个其他时间点对马采血。通过ELISA分析血清(图5C)。
分别使用eIL-5-C-His-VLP/eIL-31-C-His-VLP联合处理和疫苗接种(分开注射， 同一天但靶向不同的淋巴结)的马。为了产生马IL-5和马IL-31的自身反应性抗体，在第0天和第28天，用eIL-5-C-His-CMVtt830(在左侧身体部位)以及eIL-31-C-His-CMVtt830(在右侧身体部位)按每种300μg(各自在1000μl的20mM Na2PO4/2mM EDTA，pH 7.5中)向马皮下注射。在免疫之前并且至少在免疫方案的第42天和第42天后的多个其他时间点对马采血。通过ELISA分析血清(图5D)。
分别在先用eIL-5-C-His-VLP处理和疫苗接种之后用eIL-31-C-His-VLP处理和免 疫接种的马。为了在先用eIL-5-C-His-CMVtt830疫苗接种的马中产生马IL-31的自身反应性抗体，在第0天和第28天用300μg的eIL-31-C-His-CMVtt830(在1000μl 20mM Na2PO4/2mMEDTA，pH 7.5中)皮下注射马。在免疫之前并且至少在免疫方案的第42天和第42天后的多个其他时间点对马进行采血。通过ELISA分析血清(图5E)。
D.通过ELISA的血清分析：
分别单独使用eIL-31-C-His-VLP处理和疫苗接种的马：将Maxisorp96孔ELISA板(Nunc)用50μl纯化的eIL-31-C-His(5μg/ml)包被过夜。将板用PBST在室温下洗涤三次，该PBST用5％BSA/PBST(Thermo Scientific)封闭2小时。然后将板用PBST洗涤3次，并在Superblock中加入三倍稀释的马血清，并在室温下孵育2小时。随后将板用PBST洗涤3次，并与缀合有HRP的抗马IgG(稀释度1：2000)在室温下孵育30分钟。将板再次用PBS洗涤4次并按50μl/孔加入显影溶液(TMB)。在室温下反应约2分钟后，用每孔25μl的5％H2SO4终止ELISA。利用Tecan M200分光光度计或Tecan Spark(Tecan，奥地利)在450nm测量吸光度。
收集来自仅用eIL-31-C-His-CMVtt830疫苗接种的马的免疫前血清和免疫后第41天的血清并用ELISA进行分析。将马血清印迹为ΔOD50值，其由每种稀释度的OD450值减去相应的幼稚血清稀释度计算。马接种疫苗的结果表明克服了对自身抗原IL-31的免疫耐受性(图5A)。响应峰值的半数最大滴度高于1：1000。
分别用eIL-5-C-His-VLP/eIL-31-C-His-VLP联合处理和疫苗接种的马：Maxisorp96孔ELISA板(Nunc)用50μl纯化的eIL-5-C-His(5μg/ml)或eIL-31-C-His(5μg/ml)包被过夜。将板用PBST在室温下洗涤三次，该PBST用5％BSA/PBST(Thermo Scientific)封闭2小时。然后用PBST洗涤板3次并将三倍稀释的抗原预吸收马血清(对于eIL-31-C-His ELISA：用eIL-5-C-His抗原(5μg/ml)预吸收；对于eIL-5-C-His ELISA：用eIL-31-C-His抗原(5μg/ml)预吸收；在室温下预孵育30分钟)加入Superblock中并在室温下孵育2小时。随后将板用PBST洗涤3次，并与缀合有HRP的抗马IgG(稀释度1：2000)在室温下孵育30分钟。将板再次用PBS洗涤4次并按50μl/孔加入显影溶液(TMB)。在室温下反应约2分钟后，用每孔25μl的5％H2SO4终止ELISA。利用Tecan M200分光光度计或Tecan Spark(Tecan，奥地利)在450nm测量吸光度。
分别收集来自用eIL-5-C-His-Q/eIL-31-C-His-Q疫苗接种的马的免疫前血清和免疫后第42、93或118天的血清，并通过ELISA分析。将马血清印迹为ΔOD50值，其由每种稀释度的OD450值减去相应的幼稚血清稀释度计算。马接种疫苗的结果表明克服了对自身抗原IL-5和IL-31的免疫耐受性(图5B)。响应峰值时的半数最大滴度约为1：1000。
分别用eIL-5-C-His-VLP/eIL-31-C-His-VLP组合处理和疫苗接种的马：Maxisorp96孔ELISA板(Nunc)用50μl纯化的eIL-5-C-His(5μg/ml)或eIL-31-C-His(5μg/ml)包被过夜。将板用PBST在室温下洗涤三次，该PBST用5％BSA/PBST(Thermo Scientific)封闭2小时。然后用PBST洗涤板3次并将三倍稀释的抗原预吸收马血清(对于eIL-31-C-His ELISA：用eIL-5-C-His抗原预吸收(5μg/ml)；对于eIL-5-C-His ELISA：用eIL-31-C-His抗原(5μg/ml)预吸收；在室温下预孵育30分钟)加入Superblock中并在室温下孵育2小时。随后将板用PBST洗涤3次，并与缀合有HRP的抗马IgG(稀释度1：2000)在室温下孵育30分钟。将板再次用PBS洗涤4次并按50μl/孔加入显影溶液(TMB)。在室温下反应约2分钟后，用每孔25μl的5％H2SO4终止ELISA。利用Tecan M200分光光度计或Tecan Spark(Tecan，奥地利)在450nm测量吸光度。
分别收集来自用eIL-5-C-His-CMVtt830/eIL-31-C-His-CMVtt830疫苗接种的马的免疫前血清和免疫后第42、84天和更晚的血清，并通过ELISA分析。将马血清印迹为ΔOD50值，其通过每种稀释度的OD450值减去相应的幼稚血清稀释度计算。马接种疫苗的结果表明克服了对自身抗原IL-5和IL-31的免疫耐受性(图5C)。抗IL-5和抗IL-31两者在峰值时的半数最大滴度约为1：1000。
分别用eIL-5-C-His-VLP/eIL-31-C-His-VLP联合处理(combinatory treatment)和疫苗接种(分开注射，同一天但靶向不同淋巴结)的马：Maxisorp 96孔ELISA板(Nunc)用50μl纯化的eIL-5-C-His(5μg/ml)或eIL-31-C-His(5μg/ml)包被过夜。将板用PBST在室温下洗涤三次，该PBST用5％BSA/PBST(Thermo Scientific)封闭2小时。然后用PBST洗涤板3次并将三倍稀释的抗原预吸收马血清(对于eIL-31-C-His ELISA：用eIL-5-C-His抗原预吸收(5μg/ml)；对于eIL-5-C-His ELISA：用eIL-31-C-His抗原(5μg/ml)预吸收；在室温下预孵育30分钟)加入Superblock中并在室温下孵育2小时。随后将板用PBST洗涤3次，并与缀合有HRP的抗马IgG(稀释度1：2000)在室温下孵育30分钟。将板再次用PBS洗涤4次并按50μl/孔加入显影溶液(TMB)。在室温下反应约2分钟后，用每孔25μl的5％H2SO4终止ELISA。利用Tecan M200分光光度计或Tecan Spark(Tecan，奥地利)在450nm测量吸光度。
收集用eIL-5-C-His-CMVtt830/eIL-31-C-His-CMVtt830接种的三匹马的免疫前血清和免疫后第42天血清，并通过ELISA分析。eIL-5-C-His-CMVtt830/eIL-31-C-His-CMVtt830疫苗接种已分开注射。将疫苗注射到不同的身体部位以靶向分开的淋巴结。通过两次疫苗接种评估抗体滴度，并记录接种疫苗对皮炎病症状、瘙痒症和血液嗜酸性粒细胞增多的影响。将马血清印迹为ΔOD50值，其由每种稀释度的OD450值减去相应的幼稚血清稀释度计算。马(n＝3)中的疫苗接种结果表明克服了对自身抗原eIL-5和eIL-31的免疫耐受性(图5D)。抗eIL-31反应第42天的平均半数最大滴度约为1：1000，抗eIL-5反应第42天的平均半数最大滴度约为1：3000。
分别在先用eIL-5-C-His-VLP处理和疫苗接种之后用eIL-31-C-His-VLP处理和免 疫接种的马：Maxisorp 96孔ELISA板(Nunc)用50μl纯化的eIL-5-C-His(5μg/ml)或eIL-31-C-His(5μg/ml)包被过夜。将板用PBST洗涤三次，该PBST在室温下用5％BSA/PBST(ThermoScientific)封闭2小时。然后将板用PBST洗涤3次，并在Superblock中加入三倍稀释的马血清，并在室温下孵育2小时。随后将板用PBST洗涤3次，并与缀合有HRP的抗马IgG(稀释度1：2000)在室温下孵育30分钟。将板再次用PBS洗涤4次并按50μl/孔加入显影溶液(TMB)。在室温下反应约2分钟后，用每孔25μl的5％H2SO4终止ELISA。利用Tecan M200分光光度计或Tecan Spark(Tecan，奥地利)在450nm测量吸光度。
收集用eIL-31-C-His-CMVtt830接种的两匹马的免疫前血清和免疫后第42天的血清，并通过ELISA分析。这些马在前一年接种了eIL-5-C-His-CMVtt830疫苗。通过两次疫苗接种评估抗体滴度，并记录接种疫苗对皮炎病症状、瘙痒症和血液嗜酸性粒细胞增多的影响。将马血清印迹为ΔOD50值，其由每种稀释度的OD450值减去相应的幼稚血清稀释度计算。马接种疫苗的结果显示，尽管在前一年中使用相同VLP骨架的eIL-5-C-His-CMVtt830疫苗对马进行了疫苗接种，但克服了对自身抗原eIL-31的免疫耐受性(图5E)。抗eIL-31反应第42天的半数最大滴度高于1：2500。
E.体内功效：
案例研究1：eIL-5-C-His-Qβ/eIL-31-C-His-Qβ联合疫苗接种(combinatoryvaccination)。对受瘙痒性过敏性皮炎影响的冰岛马(通过瑞士IDEXX Diavet进行的使用Greer过敏原过敏筛查，对桤木(Alnus)、皱叶酸模(Rumex crispus)、屋尘螨(D.farinae)、食酪螨(Tyrophagus)、粗脚粉螨(Acarus siro)和库蠓(Culicoides)检测为阳性)免疫接种了eIL-5-C-His-Qβ和eIL-31-C-His-Qβ的联合疫苗以评估同时诱导针对IL-5和IL-31的自身抗体的能力。
使用eIL-5-C-His-Qβ/eIL-31-C-His-Qβ联合疫苗(combinatory vaccine)对第一匹马皮下接种两次。在每个疫苗接种日期皮下注射在PBS中的300μg(总体积为1ml)的每种疫苗。在第-62和-40天用1000μl的PBS中的eIL5-C-His-Q疫苗注射马，并第0天和第19天用在1000μl的PBS中的300μg的eIL-31-C-His-Qβ疫苗注射马。通过ELISA分析第42天、第93天和第118天的血清中的抗体滴度。在用eIL-5-C-His-Qβ和eIL-31-C-His-Qβ疫苗联合接种后建立了针对两种细胞因子的抗体滴度(图5B，抗eIL-5抗体，黑色圆圈，抗IL-31抗体，灰色圆圈)。
案例研究2：eIL-5-C-His-CMVtt830/eIL-31-C-His-CMVtt830组合疫苗(combination vaccination)接种。对受瘙痒性过敏性皮炎影响的冰岛马(通过瑞士IDEXXDiavet进行的使用Greer过敏原过敏筛查，对库蚊(Culex)、库蠓(Culicoides)、蚋亚属(Simulium sp.)、螫蝇属(Stomoxys c.)和虻虫(Tabanus)检测为阳性)免疫接种了由eIL-5-C-His-CMVtt830和IL-31-C-His-CMVtt830组成的联合疫苗以评估抗体滴度和接种疫苗对皮炎病症状、瘙痒和血液嗜酸性粒细胞增多的影响。
使用eIL-5-C-His-CMVtt830/eIL-31-C-His-CMVtt830组合疫苗对第一匹马皮下接种三次。每个疫苗接种日期皮下注射在20mM Na2PO4/2mM EDTA(pH 7.5)中的300μg(总体积为2ml)的每种疫苗。在第0天、第28天和第105天注射马。通过ELISA分析血清中针对IL-5和IL-31的抗体滴度(图5C)。在疫苗接种之前和之后，分析血液中的嗜酸性粒细胞计数，并分别通过实施例7和8中描述的症状评分对皮炎损伤和瘙痒进行评分。使用eIL-5-C-His-CMVtt830/eIL-31-C-His-CMVtt830组合疫苗免疫后血液中的嗜酸性粒细胞水平降低(图5F)。与降低的嗜酸性粒细胞水平一致，与第一次测量相比，皮肤损伤评分降低并且损伤评分的过程显示出降低的值(图5G)。与病变评分相似，瘙痒评分的过程在第二次免疫后降低且长时间内不存在瘙痒(图5H)。当比较治疗前季节和治疗季节的平均瘙痒评分时，在疫苗存在下瘙痒显著下降(图5I)。
案例研究3：单独使用eIL-31-C-His-CMVtt830的马。对受瘙痒性过敏性皮炎影响的冰岛马(通过瑞士IDEXX Diavet进行的使用Greer过敏原过敏筛查，对桤木(Alnus)、皱叶酸模(Rumex crispus)、屋尘螨(D.farinae)、食酪螨(Tyrophagus)、粗脚粉螨(Acarussiro)检测为阳性)单独免疫接种IL-31-C-His-CMVtt830以评估抗体滴度和接种疫苗对皮炎病症状、瘙痒症和血液嗜酸性粒细胞增多的影响。
使用eIL-31-C-His-CMVtt830疫苗对第一匹马皮下接种三次。在每个疫苗接种日期皮下注射在20mM Na2PO4/2mM EDTA(pH 7.5)中的300μg(总体积为1ml)的疫苗。在第0天、第28天和第101天注射马。通过ELISA分析血清中针对IL-31的抗体滴度(图5A)。在疫苗接种之前和之后，分析血液中的嗜酸性粒细胞计数，并分别通过实施例7和8中描述的症状评分对皮炎损伤和瘙痒进行评分。与先前未治疗季节相比，在治疗季节使用eIL-31-C-His-CMVtt830疫苗使得平均皮肤损伤评分降低(图5J)。相比之下，当比较治疗前季节和治疗季节的平均瘙痒评分时，在疫苗存在下瘙痒率显著降低(图5K)。
实施例6
eIL-5抗原与不同VLP的偶联，马的免疫以及在IBH易发的马中的功效证明
A.eIL5-C-His与Q的VLP的偶联
如WO 02/056905中所述，制备包含SEQ ID NO：24的衣壳蛋白的Q VLP，并与10倍摩尔过量的异双功能交联剂琥珀酰亚胺基-6(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸酯(SMPH)(Pierce)反应。通过PD-10脱盐柱(GE Healthcare)除去未反应的交联剂。将重组、纯化且重折叠的eIL-5-C-His用等摩尔过量的在pH 8.0PBS中的三(2-羧乙基)磷盐酸盐(TCEP)还原1小时，以还原接头中包含的半胱氨酸残基。然后将还原的eIL-5-C-His与衍生的Q VLP按照Q单体与eIL-5-C-His蛋白的摩尔比为1:2混合，并在22℃下共孵育4小时以允许交联。任选地，该反应使用300kDa截止透析膜将反应物相对于PBS pH 7.4透析12小时，或者通过尺寸排阻色谱法或使用100kDa MWCO的切向流过滤(tangential flow filtration)除去游离的未偶联eIL-5-C-His。
分析：SDS-PAGE的考马斯染色(图6A)：Qβ、eIL5-C-His和eIL5-C-His-QβVLP通过SDS-PAGE分离。随后用考马斯蓝(0.025％考马斯亮蓝R-250，40％甲醇，10％乙酸)染色凝胶，并用脱色剂(40％甲醇，10％乙酸)脱色。
用抗His抗体进行蛋白质印迹染色(图6B)：通过SDS-PAGE分离Qβ、eIL5-C-His和IL5-C-His-Qβ疫苗，并电印迹(electroblot)至硝酸纤维素膜上。用PBST中的5％(w/v)BSA粉末将膜封闭1小时，然后在PBST中的1％BSA(w/v)粉末中与10ml 1:800稀释的抗His抗体(Penta-His抗体，无BSA，小鼠单克隆IgG1，CatNo.34660)一起孵育。将膜用PBST洗涤15分钟，然后与10ml 1％(w/v)BSA在PBST用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗小鼠IgG抗体中以1:10000的稀释度孵育1小时。将膜在PBS中洗涤15分钟，用ECL(Amersham Pharmacia，瑞典)显影，并暴露于照相胶片。
通过SDS-PAGE和Western印迹分析评估eIL5-C-His与病毒样颗粒Qβ的共价化学偶联。偶联反应的考马斯蓝染色凝胶显示出具有对应于与Qβ共价连接的马IL5-C-His所预测的分子量条带的出现(图6A)。此外，Western印迹分析显示当用抗His抗体染色时这些条带的共定位(图6B)。
B.eIL5-C-His与CMVtt830 VLP的偶联
如WO 2016/062720中所述制备包含修饰的CMV多肽(SEQ ID NO：20)的CMVtt830VLP，并与10倍摩尔过量的异双功能交联剂琥珀酰亚胺-6(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)-己酸酯(SMPH)反应(Pierce)。通过PD-10脱盐柱(GE Healthcare)除去未反应的交联剂。用等摩尔过量的PBS中的三(2-羧乙基)磷盐酸盐(TCEP)或pH 7.5的20mM Na2PO4/2mM EDTA将重组、纯化且重折叠的eIL-5-C-His还原1小时以还原接头中含有半胱氨酸残基。然后将还原的eIL-5-C-His与衍生的CMVtt830VLP以VLP单体与eIL-5-C-His蛋白为1:2的摩尔比混合，并在22℃下共孵育4小时以允许交联。任选地，该反应使用300kDa截留透析膜相对于PBSpH7.4或20mM Na2PO4/2mM EDTA，pH 7.5透析12小时，或通过尺寸排阻色谱法或使用100kDaMWCO的切向流过滤除去游离的未偶联的eIL-5-C-His。
分析：SDS-PAGE的考马斯染色(图6C)：通过SDS-PAGE分离CMVtt830、eIL5-C-His、eIL5-C-His-CMVtt830 VLP。随后用考马斯蓝(0.025％考马斯亮蓝R-250，40％甲醇，10％乙酸)染色凝胶，并用脱色剂(40％甲醇，10％乙酸)脱色。
用抗His抗体进行蛋白质印迹染色(图6D)：通过SDS-PAGE分离CMV-tt830、eIL5-C-His、eIL5-C-His-CMVtt830 VLP并电印迹到硝酸纤维素膜上。用PBST中的5％(w/v)BSA粉末将膜封闭1小时，然后与10ml 1:1000稀释的抗His抗体(单克隆抗His标签抗体HRPO缀合物，Novagen CatNo.71840)在PBST中的1％BSA(w/v)粉末中一起孵育。用PBST洗涤膜15分钟，然后用ECL(Amersham Pharmacia，瑞典)显影并暴露于照相胶片。
通过SDS-PAGE和Western印迹分析评估eIL5-C-His与CMVtt830VLP的共价化学偶联。偶联反应的考马斯蓝染色凝胶证明了具有对应于与CMV-tt830共价连接的马IL5-C-His所预测的分子量的条带的出现(图6C)。此外，Western印迹分析显示当用抗His抗体染色时这些条带的共定位(图6D)。
C.免疫方案
马，eIL-5-C-His-Qβ VLP。为了产生针对马IL-5的自身反应性抗体，在第0、21和42天用在1000μl PBS中的300μg的eIL5-C-His-QβVLP(在注射前30分钟与300μl明矾混合)皮下注射马。必要时在第124天给予加强剂。或者，在第0、28、56和84天不含佐剂的1000μl PBS中的300μl的eIL5-C-His-QβVLP皮下注射马。对于第二年治疗的随访，在不存在佐剂的情况下，使用1000μl PBS中的300μg的eIL5-C-His-QβVLP以4周的间隔对马进行皮下增强两次。在免疫之前并且至少在免疫方案的第42天、第56天和第56天后的多个其他时间点对马进行采血。通过ELISA分析血清。通过ELISA分析血清。
马，eIL-5-C-His-CMVtt830。为了产生针对马IL-5的自身反应性抗体，在第0天、第28天、第56天、第84天和第126天用不存在佐剂的400μl PBS中的400μg eIL5-C-His-CMVtt830 VLP皮下注射马。在免疫接种之前以及至少在免疫方案的第56天、第84天以及第84天后的多个其他时间点进行采血。通过ELISA分析血清。通过ELISA分析血清。
D.通过ELISA进行血清分析
将Maxisorp 96孔ELISA板(Nunc)用50μl纯化的eIL-5-C-His、Qβ或纯化的CMVtt830(5μg/ml)包被过夜。将板用在PBS中的Superblock(Thermo Scientific)封闭的PBST在室温下洗涤3次，持续2小时。然后将板用PBST洗涤3次，并将3倍稀释的马血清加入PBS中的Superblock(Thermo Scientific)中，并在室温下孵育2小时。随后将板用PBST洗涤3次，并与缀合有HRP的抗马IgG(稀释度1:2000)在室温下孵育30分钟。将板再次用PBS洗涤4次并按50μl/孔加入显影溶液(TMB)。在室温下反应约2分钟后，用每孔25μl 5％H2SO4终止ELISA。在Tecan M200分光光度计(Tecan，奥地利)上在450nm下测量吸光度。
收集来自使用eIL5-C-His-Q VLP免疫接种马之前和免疫接种后的多个血清，并通过ELISA分析针对eIL-5-C-His的抗体(图7A)和针对QβVLP的抗体(图7B)。已经分析了来自eIL-5-C-His-CMVtt830 VLP免疫接种马之前的血清和免疫接种后多个血清的针对eIL-5-C-His的抗体(图7C)和针对CMVtt830的抗体(图7D)。将马血清印迹为ΔOD50值，其通过每种稀释度的OD450的值减去相应的幼稚血清稀释度来计算。马接种疫苗的结果表明，克服了对自身抗原IL-5的免疫耐受性。响应峰值处的半数最大滴度在1:1000-1:50000的范围内。
E.马的体内功效
关联血液中的嗜酸性粒细胞水平和IBH疾病症状。
收集来自12只受IBH影响的冰岛马的EDTA血液并分析嗜酸性粒细胞水平。在季节期间，即在4月至10月期间评估进一步的疾病症状评分。血液中嗜酸性粒细胞的水平与通过病变症状评分测量的平均疾病症状相关。根据实施例7进行损伤症状评分。实际上，发现病马血液中嗜酸性粒细胞数与IBH病变强度评分之间呈正相关(R2＝0.9227，p<0.0001，n＝12)(图7E)，表明本发明组合物及其在使受IBH影响的马免疫的方法中的应用有益于IBH的治疗。
双盲安慰剂对照随机研究IL-5-C-His-Qβ。为了评估疫苗接种对疾病症状和血液嗜酸性粒细胞增多的影响，将10只受IBH影响的冰岛马纳入一项双盲安慰剂对照随机研究中。在接种疫苗之前的IBH季节(4月至10月)，对所有马匹每两周进行一次症状评分，并从8月开始量化血液嗜酸粒细胞的增多。在接下来的IBH季节开始之前，在第0、21和42天(2月/3月)，6只冰岛马用300μg eIL-5-C-His-Q免疫接种，4只冰岛马接受安慰剂。疫苗在1ml PBS中给药。所有注射均在临用前(注射前约30分钟)与0.3ml明矾预混合(Imject Alum，ThermoScientific，CatNo.77161)。所有马在第124天接受加强免疫接种，并且从3月到10月每月测量抗体滴度和嗜酸性粒细胞计数。此外，每两周对病变评分进行评估。此外，在3月和10月分析了马的健康状况和寄生状况。
随访研究IL-5-C-His-Qβ。来自使用IL-5-C-His-Qβ的双盲安慰剂对照随机研究的10匹马在随后的2016季节进行了随访。之前的6只接种疫苗的马在2月和3月间隔四周接受了两次300μg eIL-5-C-His-Qβ的加强免疫。先前的4只安慰剂马在第0、28、56和84天接受300μg eIL-5-C-His-Qβ的主动免疫。在随访年中，所有马的疫苗均在1ml PBS中给药，不含佐剂。从1月和3月到10月，每月测量抗体滴度和嗜酸性粒细胞计数。此外，病变评分每两周至每月评估一次。此外，1月和10月分析了马的健康状况和寄生状况。从4月到10月跟踪病变严重程度。在整个季节中跟踪针对Qβ(图7A)和eIL-5(图7B)的抗体滴度的时间线。从2月开始，以3周的间隔对马进行三次注射接种，然后在最后一次注射后约两个月进行加强免疫。在活跃的马中建立的针对eIL-5的抗体滴度在开始时以巨大的幅度变化，然而在加强后，效力以上的滴度方面变化较小(图7B)。
对于随后的随访季节，该研究是非盲的，并继续进行半交叉研究，所有的马都接种了疫苗。详细的研究方案如下：在随后的IBH季节开始之前，所有安慰剂马在1月开始按每4周一次免疫四次，并且来自上一季的所有疫苗接种的马从2月开始以4周的间隔接受两次加强免疫。在随访年，所有疫苗接种均在没有明矾的情况下进行。
在2014年预评估年、2015年第一年治疗(双盲安慰剂对照随机研究)和2016年第2年治疗(随访研究)中，病变评分分别比较4月至9月或10月的免疫接种的马和安慰剂的马。超过80％的免疫接种的马(V1：第一年研究和V2：第二年研究)在治疗期间的病变评分实现了50％以及更高的改善。甚至接近20％的接种马(V1：第一年研究和V2：第一年和第二年研究)在治疗年期间的病变评分中实现了75％以及更高的改善(图7F)。在安慰剂组中，没有马达到病变评分改善50％或75％(图7F)。因此，eIL-5-C-His-Qβ疫苗对病变严重程度具有有益作用，因此治疗上改善了疾病症状。
双盲安慰剂对照随机研究IL-5-C-His-CMVtt830。为了评估疫苗接种对疾病症状和血液嗜酸性粒细胞增多的影响，将34只IBH影响的冰岛马纳入在一项双盲安慰剂对照随机研究中。在接种疫苗之前的IBH季节(2015年4月至10月)，对所有马匹进行月度症状评分，并在季节的一个时间点量化血液嗜酸粒细胞增多。在接下来的IBH季节开始之前，在第0、28、56和84天(2016年1月至4月)，用400μg eIL-5-C-His-CMVtt830免疫接种18只冰岛马，并且15只冰岛马接受安慰剂。疫苗在不含佐剂的1ml PBS中给药。所有马匹在第126天接受加强免疫接种，并且从1月和3月到2016年10月每月测量抗体滴度、嗜酸性粒细胞计数和病变评分。
在2015年预评估年和2016年治疗年的4月至9月或10月，病变评分将接种过的马与安慰剂马进行比较。与评估前季节(黑色虚线)相比并且与来自同一季节(灰色连续线)的安慰剂治疗的马(灰色虚线)相比，发现eIL-5-C-His-CMVtt830免疫接种马(黑色连续线)的临床评分显著降低(图7G)。与安慰剂治疗的马相比，发现在eIL-5-C-His-CMVtt830免疫接种的马中治疗年和评估前年之间损伤评分的降低在统计学上显著更大。此外，47％和16％的接种马分别在治疗期间达到50％(和更高)和75％(和更高)的病变评分改善(图7H)。在安慰剂组中，没有马达到减少75％的改善，并且只有7％达到损伤评分减少50％的改善(图7H)。因此，IL-5-C-His-CMVtt830疫苗对病变严重程度具有有益作用，因此治疗上改善了疾病症状。
实施例7
皮炎症状病变评分
对于过敏性皮炎症状评分，记录发生病变的位置(尾部、鬃毛、腹部、侧面、面部、耳部、腿部等)。每个位置分为3个部位：上、中、下。根据病变的数量，每个位置分为轻型和强型。取决于受影响的部位数量(上/中/下)以及每个位置发现多少病灶(轻/强)，可以按1到4个分来评分(1分＝一部位受到影响，病变轻微；4分＝三部位都受影响，病变强烈)。
此外，这些位置被分类为6个其他属性：大小(直径)、血液、脱毛、鳞状脱皮、结硬皮和苔藓化/肿胀。对于所有这些属性，也可以评分1到4个点。尺寸分为<0.5cm(1分)，0.5>x>1cm(2分)，1>x>2cm(3分)和>2cm(4分)。血液分为完整的表皮(1分)，轻度(2分)，中度(3分)和严重(4分)。脱毛分为轻度(1分)，中度(2分)，严重(3分)和无毛(4分)。鳞状脱皮分为无(1分)，微小、少数(2分)，适度、中等(3分)和大量、大块(4分)。结硬皮分为无(1分)，微小(2分)，半数(3分)和全部(4分)。苔藓化和/或肿胀分为无(1分)，轻度(2分)，中度(3分)和严重(4分)。
另外，如果鞘或乳房肿胀，可以评分最低5分或最多20分：1级(5分)，2级(10分)，3级(15分)和4级(20分)。
最后将所有分加起来即是过敏性皮炎症状评分。
实施例8
瘙痒评分
评估每匹马巡访期间的瘙痒评分。对身体的不同位置处的轻度、中度和严重刮擦(scratching)进行评分。身体的每个部分都是单独评分的。此外，对轻度、中度和重度的头部摇动强度进行评分。此外，判断整体的不稳定行为，也区分轻、中、重。轻者给出1分，重者2分，严重3分。所有分数相加即为瘙痒得分。
实施例9
小鼠过敏性皮炎模型，小鼠免疫接种，抗体滴度分析，皮肤局部IL-31mRNA表达，抗过敏原IgE和IgG水平，以及在皮肤上过敏原攻击后耳朵肿胀
A.小鼠过敏性皮炎模型(改良特应性行进模型)
小鼠对卵清蛋白(Ova)敏感，卵清蛋白是一种模型过敏原。选择Ova是为了显示库蠓(Culicoides)过敏原的独立性，从而显示出IBH的独立性，突出了一般的过敏性瘙痒现象。为了使小鼠出现过敏性皮炎，在第0天首先用在PBS中的10mg/ml明矾(ThermoScientific)中的1μg Ova(Sigma Aldrich)腹膜内(i.p.)攻击小鼠，然后通过在带状剥离皮肤右耳上用2nmol MC903(Calcipotriol)中的200μg Ova途径进行表皮局部攻击(e.c.)。在第0(＝免疫接种方案的第21天)、2、4、6、8和10天进行局部皮肤致敏。之后，在第17、18、19和20天，通过200μg Ova左耳皮肤攻击小鼠。随后跟踪皮炎和瘙痒发展，根据实施例7和8进行评分，并通过测量耳厚度定量受攻击的左耳的耳肿胀。此外，在第22天通过qPCR在受攻击的耳中定量IL-31mRNA。此外，在第22天通过血清中的抗ova IgG和IgE抗体水平定量对ova的过敏性病症。在过敏性皮炎实验中包括五组小鼠，n＝6只小鼠：第1组用mIL-31-C-His-CMV接种并在左耳上接受ova攻击；第2组用CMVtt830VLP接种，并在左耳接受ova攻击；第3组用mIL-5-C-His-Qβ和mIL-31-C-His-CMVtt830组合接种，并在左耳上接受ova攻击；第4组使用CMVtt830 VLP进行疫苗接种，但在左耳上接受PBS对照攻击。
B.小鼠的疫苗接种
为了在小鼠中产生针对鼠IL-5和/或IL-31的抗体，在第0、14和28天，用25或50μgmIL-5-C-His-QβVLP和mIL-31-C-His-CMVtt830(分别在分别在100μl PBS或20mM Na2PO4/2mM EDTA，pH 7.5中)皮下或静脉内注射C57BL/6或BALB/c小鼠。组合物mIL-5-C-His-QβVLP以Zou,Vaccine 28(2010)3192–3200和本文所述的eIL-5和eIL-31对应物中所述类似的方式制备。分别包含mIL-31(SEQ ID NO：28)和mIL-31-C-His(SEQ ID NO：29)的组合物mIL-31-C-His-CMVtt830以与本文所述的eIL-5和eIL-31对应物类似的方式制备。在免疫前和免疫方案的第41天对小鼠采血。通过ELISA分析血清。
C.抗体滴度分析
将Maxisorp 96孔ELISA板(Nunc)用50μl纯化的mIL-5-C-His或mIL-31-C-His(10μg/ml)包被过夜。将板用Superblock(Thermo Scientific)封闭的PBST在室温下洗涤3次，持续2小时。然后用PBST洗涤板3次，并在Superblock中加入三倍稀释的小鼠或马血清，并在室温下孵育2小时。随后将板用PBST洗涤3次，并与抗小鼠IgG或与HRP缀合的抗马IgG(稀释度1:2000)在室温下孵育30分钟。将板再次用PBS洗涤4次并加入50μl/孔显影溶液(TMB)。在室温下反应约2分钟后，用每孔25μl 5％H2SO4终止ELISA。在Tecan M200或Tecan Spark分光光度计(Tecan，奥地利)上在450nm下测量吸光度。
收集来自用mIL-5-C-His-Qβ和/或mIL-31-C-His-CMVtt830接种的小鼠的免疫前血清和第41天血清，并通过ELISA分析。将小鼠血清印迹为delta OD50(ΔOD 50)值。小鼠接种疫苗的结果表明，克服了对自身抗原IL-5和IL-31的免疫耐受性(图8A和图8B)。用mIL-5-C-His-Qβ接种的小鼠建立了约1:2000的抗IL-5抗体滴度(图8A，黑色圆圈)。用mIL-31-C-His-CMVtt830接种的小鼠建立约1:300的抗IL-5抗体滴度(图8A，灰色圆圈)，并且针对使用mIL-5-C-His-Qβ/mIL-31-C-His-CMVtt830组合疫苗的组合接种的小鼠建立约1:1000的抗IL-5抗体滴度(图8B，黑色圆圈)和约1:200的抗IL-31抗体滴度(图8B，灰色圆圈)。响应峰值时的半数最大滴度约为1：1000。
D.受攻击的耳朵的RNA分离和cDNA转录
将耳皮肤活组织检查物在-80℃下储存在Trizol Reagent(Life Technologies)中，并使用高纯度RNA分离试剂盒(Roche)分离总RNA，包括DNase I处理和灭活。使用逆转录系统(Promega)将RNA转录成cDNA，并通过PCR扩增小鼠IL-31mRNA水平和管家βactin基因，并通过qPCR定量。
E.小鼠IL-31和βactin qPCR
使用针对mIL-31的基因特异性RT2 qPCR Primer Assay(Qiagen)和针对mβactin的基因特异性引物(正向引物：GGCTGTATTCCCCTCCATCG–SEQ ID NO：30，反向引物：CCAGTTGGTAACAATGCCATGT–SEQ ID NO:31)扩增在皮肤活组织检查中的小鼠IL-31(mIL-31)小鼠βactin(mβactin)。使用FastStart Universal SYBR Green Master(Roche)进行PCR。
在用mIL-31-C-His-CMV(第1组)、CMVtt830 VLP(第2组)、mlL-5-C-His-Qβ和mIL-31-C-His-CMVtt830组合(第3组)接种的ova过敏小鼠的ova攻击耳中显示鼠IL-31mRNA表达水平。用PBS对照而不是ova攻击第二次CMVtt830 VLP疫苗接种第4组。已针对mIL-31免疫接种的ova攻击的小鼠组，不管是单独使用mIL-31-C-His-CMVtt830接种第1组还是用mIL-5-Qβ和mIL-31-C-His-CMVtt830组合接种的第3组，在ova攻击耳中显示出低mIL-31mRNA水平；与使用PBS对照攻击的用CMVtt830 VLP接种的第4组的mIL-31mRNA水平相当。相反，具有ova攻击耳的用CMVtt830 VLP接种小鼠的第二组显示出增加的mIL-31mRNA表达。因此，针对mIL-31的疫苗接种有效地降低了皮肤中ova过敏原攻击后mIL-31的表达(图8C)。
E.抗过敏原(Ova)IgE和IgG水平
IgE：将Maxisorp 96孔ELISA板(Nunc)用抗小鼠IgE单克隆抗体(3μg/ml)50μl包被过夜。将板用PBS中的2.5％奶粉封闭的PBST在室温下洗涤3次，持续2小时。然后将板用PBST洗涤3次，并将3倍稀释的小鼠血清加入Superblock中，并在室温下孵育2小时。随后将板用PBST洗涤3次，并在室温下在室温下孵育生物素化的Ova(稀释度1:250)2小时。随后用PBST洗涤板3次，并加入链霉抗生物素蛋白-HRP(Biolegend)。将板再次用PBS洗涤4次并加入50μl/孔显影溶液(TMB)。在室温下反应约2分钟后，用每孔25μl 5％H2SO4终止ELISA。在TecanM200或Tecan Spark分光光度计(Tecan，奥地利)上在450nm下测量吸光度。
IgG：Maxisorp 96孔ELISA板(Nunc)用50μl纯化的Ova(10μg/ml)包被过夜。将板用Superblock(Thermo Scientific)封闭的PBST在室温下洗涤3次，持续2小时。然后将板用PBST洗涤3次，并将3倍稀释的小鼠血清加入Superblock中，并在室温下孵育2小时。随后将板用PBST洗涤3次，并与缀合有HRP的抗鼠IgG(稀释度1:2000)在室温下孵育30分钟。将板再次用PBS洗涤4次并加入50μl/孔显影溶液(TMB)。在室温下反应约2分钟后，用每孔25μl 5％H2SO4终止ELISA。在Tecan M200或Tecan Spark分光光度计(Tecan，奥地利)上在450nm下测量吸光度。
来自ova致敏小鼠的免疫前血清和第22天血清(过敏性皮炎时间线，实验终点)另外用mIL-31-C-His-CMVtt830(第1组)，CMVtt830 VLP(第2组和第4组)或mIL-5-C-His-Qβ和mIL-31-C-His-CMVtt830组合(第3组)接种疫苗收集并通过ELISA分析。第1-3组已经用ova过敏原攻击，第4组在攻击耳上用PBS攻击。抗ova IgG(图8D)和抗ova IgE(图8E)抗体滴度显示对不同组小鼠的ova过敏原的过敏原致敏。所有小鼠组均对ova产生过敏性免疫应答(图8D和8E)。
F.耳的ova过敏原攻击后的耳朵肿胀
在使用i.p注射的ova致敏和小鼠右耳皮肤致敏后，对左耳进行Ova过敏原攻击。通过在第17、18、19、20、21和22天测量耳厚度来量化耳肿胀。显示了与第17天(攻击的第一天)相比耳厚度增加的百分比(图8F)。接受ova攻击的针对CMVtt830 VLP免疫接种的第2组显示出在受攻击的耳朵上耳朵厚度的连续增加(图8F，三角)。受到ova攻击的mIL-31-C-His-CMVtt830(图8F，实心圆圈)单独接种组、以及mIL-5C-His-Qβ和mIL-31-C-His-CMVtt830组合(图8F，方形)接种组被保护免受耳厚度的增加，并且显示与接受PBS对照攻击的CMVtt830VLP(虚线)接种组相当的值。因此，当在皮肤致敏和攻击模型中使用模型过敏原ova时，针对IL-31或IL-5或两者的组合的接种保护小鼠免于过敏原攻击时的耳肿胀。
Claims (15)
1.一种组合物，其包含：
(a)具有至少一个第一连接位点的核心颗粒；以及
(b)具有至少一个第二连接位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是马白细胞介素-31抗原(eIL-31抗原)，其中所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：1有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、又进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；
其中(a)和(b)通过所述至少一个第一连接位点和所述至少一个第二连接位点经由至少一个非肽共价键连接；
所述组合物用于预防或治疗选自马科哺乳动物的、优选马的瘙痒病症或过敏性病症的病症或疾病的方法，其中优选将有效量的所述组合物施用于所述马科哺乳动物，优选施用于所述马。
2.根据权利要求1所述使用的组合物，其中所述病症或疾病不是预防或治疗马科哺乳动物的、优选马的昆虫叮咬高敏症(IBH)。
3.根据前述权利要求中任一项所述使用的组合物，其中所述组合物进一步包含：
(c)具有至少一个第一连接位点的第二核心颗粒；
(d)具有至少一个第二连接位点的至少一种第二抗原，其中所述至少一种第二抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：6有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、又进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；
其中(c)和(d)通过所述至少一个第一连接位点和所述至少一个第二连接位点经由至少一个非肽共价键连接。
4.根据前述权利要求中任一项所述使用的组合物，其中所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5的氨基酸序列的蛋白质。
5.根据权利要求3或4中任一项所述使用的组合物，其中所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10的氨基酸序列的蛋白质。
6.根据前述权利要求中任一项所述使用的组合物，其中所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)，优选重组VLP，并且其中优选地所述第二核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)，优选重组VLP。
7.根据权利要求6所述使用的组合物，其中所述VLP衍生自植物病毒或是RNA噬菌体的VLP，并且其中优选地所述VLP是RNA噬菌体Qβ的VLP，其中所述RNA噬菌体Qβ的VLP包含含有SEQ ID NO：24或优选由SEQ ID NO：24组成的重组衣壳蛋白，或基本上由含有SEQ ID NO：24或优选由SEQ ID NO：24组成的重组衣壳蛋白组成，或可替选地由含有SEQ ID NO：24或优选由SEQ ID NO：24组成的重组衣壳蛋白组成。
8.根据权利要求6或7中任一项所述使用的组合物，其中所述VLP是修饰的VLP，其包含至少一种修饰的VLP多肽，或基本上由至少一种修饰的VLP多肽组成，或可替选地由至少一种修饰的VLP多肽组成，其中所述修饰的VLP多肽包含或优选由以下组成：
(a)VLP多肽，和
(b)辅助性T细胞表位，
其中所述VLP多肽包含或优选由以下组成：
(i)病毒衣壳蛋白的氨基酸序列，优选植物病毒的衣壳蛋白的氨基酸序列；或
(ii)突变的氨基酸序列，其中待突变的所述氨基酸序列是所述病毒衣壳蛋白的氨基酸序列，并且其中，所述突变的氨基酸序列和所述病毒衣壳蛋白显示出至少90％、优选至少95％、进一步优选至少98％、再进一步优选至少99％的序列同一性。
9.根据权利要求6-8中任一项所述使用的组合物，其中所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的VLP，其中所述CMV的修饰的VLP包含至少一种修饰的CMV多肽，或基本上由至少一种修饰的CMV多肽组成，或可替选地由至少一种修饰的CMV多肽组成，其中所述修饰的CMV多肽包含或优选由以下组成：
(a)CMV多肽，和
(b)辅助性T细胞表位；并且
其中所述CMV多肽包含或优选由以下组成：
(i)CMV外壳蛋白的氨基酸序列；或
(ii)突变的氨基酸序列，其中待突变的所述氨基酸序列是CMV衣壳蛋白的氨基酸序列，并且其中，所述突变的氨基酸序列和所述CMV衣壳蛋白显示出至少90％、优选至少95％、进一步优选至少98％、再进一步优选至少99％的序列同一性。
10.根据权利要求9所述使用的组合物，其中所述辅助性T细胞表位取代所述CMV多肽的N末端区域，并且其中所述CMV多肽的所述N末端区域对应于SEQ ID NO：15的氨基酸2-12。
11.根据权利要求9-10中任一项所述使用的组合物，其中所述CMV多肽包含CMV外壳蛋白的氨基酸序列或优选由CMV外壳蛋白的氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列包含SEQID NO：15或与SEQ ID NO：15有至少95％的序列同一性的氨基酸序列，或优选由SEQ ID NO：15或与SEQ ID NO：15有至少95％的序列同一性的氨基酸序列组成；并且其中所述氨基序列包含SEQ ID NO：27，以及其中所述辅助性T细胞表位取代所述CMV多肽的N-末端区域，并且其中所述CMV多肽的所述取代的N-末端区域由11-13个连续氨基酸、优选11个连续氨基酸组成，并且其中进一步优选地，所述CMV多肽的所述N-末端区域对应于SEQ ID NO：15的氨基酸2-12。
12.根据权利要求9-11中任一项所述使用的组合物，其中所述修饰的CMV多肽包含SEQID NO：20或SEQ ID NO：21的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的氨基酸序列组成。
13.根据前述权利要求中任一项所述使用的组合物，其中所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、牛皮癣、硬皮病、瘙痒症、过敏性皮炎、夏季湿疹(IBH)、细菌性毛囊炎、皮肤癣菌病、复发性荨麻疹、疱疹、炎性气道疾病、复发性气道阻塞、气道高反应性、慢性阻塞性肺病和由自身免疫引起的炎症过程，并且其中优选地，所述瘙痒病症或所述过敏性病症选自特应性皮炎、湿疹、瘙痒症、过敏性皮炎和复发性荨麻疹，并且其中进一步优选地，所述病症或疾病是马科哺乳动物、优选马的瘙痒，并且其中又进一步优选地，所述瘙痒症是与过敏性皮炎相关的瘙痒症。
14.根据前述权利要求中任一项所述使用的组合物，其中，与所述施用前的与所述瘙痒病症或与所述过敏性病症相关的至少一种参数或症状相比，所述组合物的所述施用减少与所述瘙痒病症或所述过敏性病症相关的至少一种参数或症状，并且其中优选地，所述至少一种与所述瘙痒病症或所述过敏性病症相关的参数或症状是皮肤损伤的水平或严重等级或瘙痒水平，并且其中进一步优选地，所述皮肤损伤的水平或严重等级的所述减少通过症状损伤评分测试确定，并且所述瘙痒水平的所述减少通过瘙痒评分测试确定，其中进一步优选地，所述瘙痒水平的减少通过所述马科哺乳动物、优选所述马的身体的至少一个位置的刮擦的减少来确定。
15.一种组合物，包含第一组合物和第二组合物，
其中所述第一组合物包含：
(a)具有至少一个第一连接位点的第一核心颗粒；以及
(b)具有至少一个第二连接位点的至少一种第一抗原，其中所述至少一种第一抗原是马白细胞介素-31抗原(eIL-31抗原)，其中所述eIL-31抗原包含或优选为具有选自SEQ IDNO：1的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：1有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、又进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；并且
其中(a)和(b)通过所述至少一个第一连接位点和所述至少一个第二连接位点经由至少一个非肽共价键连接；并且
其中所述第二组合物包含：
(c)具有至少一个第一连接位点的第二核心颗粒；
(d)具有至少一个第二连接位点的至少一种第二抗原，其中所述至少一种第二抗原是马白细胞介素-5抗原(eIL-5抗原)，其中所述eIL-5抗原包含或优选为具有选自SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质或与SEQ ID NO：6有至少90％、优选至少92％、进一步优选至少95％、又进一步优选至少98％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；并且
其中(c)和(d)通过所述至少一个第一连接位点和所述至少一个第二连接位点经由至少一个非肽共价键连接。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP17159644 | 2017-03-07 | ||
| EP17159644.8 | 2017-03-07 | ||
| PCT/EP2018/055644 WO2018162577A1 (en) | 2017-03-07 | 2018-03-07 | Treatment of pruritus in horses |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110381990A true CN110381990A (zh) | 2019-10-25 |
Family
ID=58397991
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201880016752.3A Pending CN110381990A (zh) | 2017-03-07 | 2018-03-07 | 马的瘙痒症的治疗 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11207390B2 (zh) |
| EP (1) | EP3592378A1 (zh) |
| JP (1) | JP7365240B2 (zh) |
| CN (1) | CN110381990A (zh) |
| AU (1) | AU2018231413B2 (zh) |
| CA (1) | CA3054389A1 (zh) |
| WO (1) | WO2018162577A1 (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11433139B2 (en) | 2018-03-16 | 2022-09-06 | Zoetis Services Llc | Peptide vaccines against interleukin-31 |
| BR112020017703A2 (pt) * | 2018-03-16 | 2021-03-09 | Zoetis Services Llc | Anticorpos monoclonais de interleucina-31 para uso veterinário |
| US20210205425A1 (en) * | 2018-05-28 | 2021-07-08 | Evax Ag | Treatment of urticaria |
| WO2021083766A1 (en) | 2019-10-29 | 2021-05-06 | Evax Ag | Treatment of pruritus in horses |
| EP4294462A1 (en) * | 2021-02-22 | 2023-12-27 | Zoetis Services LLC | Horse il-31 induced pruritus model |
| WO2023161528A1 (en) | 2022-02-28 | 2023-08-31 | Tridem Bioscience Gmbh & Co Kg | A CONJUGATE COMPRISING AT LEAST A ß-GLUCAN |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1558775A (zh) * | 2001-11-07 | 2004-12-29 | \ | 用于治疗变应性嗜酸细胞性疾病的展示il-5、il-3或嗜酸细胞活化趋化因子的抗原阵列 |
| WO2016062720A1 (en) * | 2014-10-22 | 2016-04-28 | Saiba Gmbh | Modified virus-like particles of cmv |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7320793B2 (en) * | 2001-01-19 | 2008-01-22 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen array |
| CA2994353A1 (en) * | 2015-09-08 | 2017-03-16 | Universitat Zurich | Treatment of insect bite hypersensitivity |
| WO2018156180A1 (en) * | 2017-02-24 | 2018-08-30 | Kindred Biosciences, Inc. | Anti-il31 antibodies for veterinary use |
-
2018
- 2018-03-07 US US16/491,514 patent/US11207390B2/en active Active
- 2018-03-07 JP JP2019571099A patent/JP7365240B2/ja active Active
- 2018-03-07 CA CA3054389A patent/CA3054389A1/en active Pending
- 2018-03-07 CN CN201880016752.3A patent/CN110381990A/zh active Pending
- 2018-03-07 EP EP18710023.5A patent/EP3592378A1/en active Pending
- 2018-03-07 AU AU2018231413A patent/AU2018231413B2/en active Active
- 2018-03-07 WO PCT/EP2018/055644 patent/WO2018162577A1/en unknown
-
2021
- 2021-11-18 US US17/530,103 patent/US20220168405A1/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1558775A (zh) * | 2001-11-07 | 2004-12-29 | \ | 用于治疗变应性嗜酸细胞性疾病的展示il-5、il-3或嗜酸细胞活化趋化因子的抗原阵列 |
| WO2016062720A1 (en) * | 2014-10-22 | 2016-04-28 | Saiba Gmbh | Modified virus-like particles of cmv |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GINA M. MICHELS ET AL.: "A blinded, randomized, placebo-controlled, dose determination trial of lokivetmab (ZTS-00103289), a caninized, anti-canine IL-31 monoclonal antibody in client owned dogs with atopic dermatitis", 《VET DERMATOL》 * |
| YU ZOU ET AL.: "Combined vaccination against IL-5 and eotaxin blocks eosinophilia in mice", 《VACCINE》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US11207390B2 (en) | 2021-12-28 |
| CA3054389A1 (en) | 2018-09-13 |
| JP7365240B2 (ja) | 2023-10-19 |
| EP3592378A1 (en) | 2020-01-15 |
| US20200016248A1 (en) | 2020-01-16 |
| AU2018231413A1 (en) | 2019-09-12 |
| WO2018162577A1 (en) | 2018-09-13 |
| AU2018231413B2 (en) | 2024-01-04 |
| US20220168405A1 (en) | 2022-06-02 |
| JP2020510700A (ja) | 2020-04-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110381990A (zh) | 马的瘙痒症的治疗 | |
| CN108025050B (zh) | 昆虫叮咬高敏症的治疗 | |
| JP7273214B2 (ja) | イヌアトピー性皮膚炎の治療 | |
| EP1668036A2 (fr) | Procede a haut rendement pour l' obtention d'anticorps humains neutralisant l'activite biologique d'une cytokine humaine | |
| US20210205425A1 (en) | Treatment of urticaria | |
| JPWO2018162577A5 (zh) | ||
| WO2021083766A1 (en) | Treatment of pruritus in horses | |
| NZ787511A (en) | Treatment of canine atopic dermatitis | |
| JP2014204675A (ja) | ペプチド、及びそれを含む医薬組成物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |