AT504685B1

AT504685B1 - Fusionsproteine

Info

Publication number: AT504685B1
Application number: AT0210106A
Authority: AT
Original assignee: Protaffin Biotechnologie Ag
Priority date: 2006-12-20
Filing date: 2006-12-20
Publication date: 2009-01-15
Also published as: US20120052043A1; WO2008074047A1; EP2126091A1; AT504685A1

Description

2 AT 504 685 B1

Die Erfindung betrifft neue Fusionsproteine zur Erzeugung einer T-Zellen-Reaktivität in Chemo-kinen, wobei ein zusätzlicher Schutz bei entzündlichen Erkrankungen etabliert wird. Weiters betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung dieses Fusionsproteins und seine Verwendung zu therapeutischen Zwecken, insbesondere auf dem Gebiet der Entzündungen.

Vertebraten besitzen die Fähigkeit, eine Immunantwort als Verteidigung gegen Pathogene aus der Umgebung sowie gegen aberrante Zellen, wie Tumorzellen, die sich innerlich entwickeln, zu etablieren. Dies kann in Form einer angeborenen Immunität geschehen, welche durch NK-Zellen, Neutrophile und Zellen mit Monozyten/Makrophagen-Abstammung vermittelt wird, oder in Form einer erworbenen oder aktiven Immunität gegen spezifische Antigene, welche durch Lymphozyten vermittelt wird. Aktive Immunantworten können eine humorale Antwort sein, welche die Produktion spezifischer Antikörper mit sich bringt, die dazu dienen, der systemischen Zirkulation ausgesetzte Antigene zu neutralisieren und ihre Aufnahme durch Phagozyten-Zellen zu unterstützen, und eine Zellantwort, die für die Erkennung infizierter oder aberranter Zellen innerhalb des Körpers notwendig ist. Häufig führt diese immunogene Antwort zu Erkrankungen und Störungen, die dem Organismus selbst Schaden zufügen. Solche Störungen sind mit der Erkennung von Selbst-Proteinen und Zellen als fremd verbunden und lösen somit einen Angriff solcher Zellen oder Zellproteine aus. Zu den allgemeinen Autoimmunerkrankungen zählen beispielsweise Psoriasis, rheumatoide Arthritis, Lupus, Diabetes und andere, auf dem Gebiet bekannte Krankheiten.

Die Pathogenese einer Autoimmunerkrankung kann mit einer abnormen Regulierung autoreaktiver T-Zellen beginnen, die entweder eine Folge einer „bystander“-Aktivierung oder einer molekularen Nachahmung (mimicry) ist. Beispielsweise kann eine Virusinfektion oder die Einwirkung eines Superantigens eine ausreichende Costimulierung liefern, die zu einer Aktivierung einiger autoreaktiver T-Zellen mit geringer Affinität führt, die der Thymus-Selektion entgehen. Eine abnorme Niederregulierung solcher autoreaktiver Reaktionen kann zu einer Expansion pathogener T-Zellen führen, die das Organ infiltrieren, in welchem sich das erkannte Antigen befindet. Eine lokale Entzündung und die direkte Zerstörung von Wirtszellen lösen eine Antigen-Freisetzung, Aufnahme durch APCs und die Präsentation an spezifische T-Zellen aus und liefern so ein positives Feedback, das die Autoimmunität verschlimmert. Gleichzeitig können normalerweise kryptische, Organ-assoziierte Antigene im Zusammenhang mit der Aktivierung professioneller Antigen-präsentierender Zellen und Antigen-Freisetzung exponiert werden, was zu einer Aktivierung von T-Zellen, die für diese anderen Selbst-Antigene spezifisch sind, führt. Insbesondere unter Bedingungen, die ein gesamtes Th1/Th2-Ungleichgewicht begünstigen, kann die Verwendung zusätzlicher Spezifitäten die Krankheit beschleunigen. Es wird weithin angenommen, dass, während Th1-Cytokine, wie IFN-kappa, zur Pathogenese der Autoimmunität beitragen, die Th2-Cytokine, wie IL-4 und IL-10, die Aktivität pathogener Th1-Zellen unterdrücken können.

Hitzeschockproteine (Hsp's) gehören zur großen Chaperon-Protein-Familie. Sie sind ubiquitäre, hoch konservierte Proteine mit signifikanten Interspezies-Homologien, die bei verschiedenen Zellprozessen eine wichtige Rolle spielen. Sie sind immundominante Stress-Proteine, die unter zellulärem Stress hinaufreguliert werden. Diese einzigartigen Qualitäten der Hsp's (evolutionäre Konservierung, Immundominanz und Aufwärtsregulierung unter Stress) haben die Hsp's zu attraktiven Anwärtern als Ziele für Immuntherapie und Vakzine gemacht (Puge Yung G.L., 2003, Inflamm, res., 443-451). Tatsächlich wird zur Zeit die Rolle der Immunreaktivität auf Hsp's bei verschiedenen Krankheitsmodellen, wie Infektionskrankheiten und Autoimmunerkrankungen, vorgeschlagen. Die meisten Beweise für die Rolle von Hsp's bei der Immunregulierung von entzündlichen Erkrankungen stammen von Modellen chronischer Arthritis. Es wurde gezeigt, dass eine Immunisierung mit Hsp10, Hsp60 und Hsp70 bei praktisch allen Modellen experimenteller Arthritis einen Schutz verleihen kann. Beim Modell einer Adjuvans-Arthritis spielt die Immunreaktivität auf Hsp's eine Rolle sowohl bei der Induktion der Krankheit als auch beim Schutz vor der Krankheit. Einerseits wurde gezeigt, dass eine Adjuvans-Arthritis mittels eines T-Zellen-Klons induziert werden kann, der für mykobakterielle Hsp60 180-188 spezifisch ist. Anderseits 3 AT 504 685 B1 zeigten spätere Studien, dass eine Vorimmunisierung mit mykobakteriellem Hsp60 wirksam gegen eine Induktion der Krankheit schützen kann. Es zeigte sich jedoch, dass nach einer Immunisierung mit Hsp60 mehrere Epitope vom Immunsystem erkannt wurden. Interessanterweise zeigte es sich, dass nur ein Epitop (Hsp60 AS256-270) von acht Epitopen einen Schutz induzieren konnte (Anderson S. et al., J. Exp. Med., 1995, S. 943-952). Dieser Schutz beruhte auf der Induktion kreuzreaktiver T-Zellen. Während der letzten Jahre wurde klar, dass die Immunreaktivität auf Hsp's auch eine wesentliche Rolle bei humaner chronischer Arthritis, nämlich juveniler idiopathischer Arthritis (JIA) und rheumatoider Arthritis (RA) spielt. Erstens wurde eine vermehrte Expression von Hsp60 bei Zellen der synovialen Auskleidung von Individuen mit JIA und RA nachgewiesen. Zweitens wurde bei beiden Erkrankungen eine T-Zell-Reaktivität auf sowohl Selbst- als auch Nicht-Selbst Hsp60 festgestellt. In ähnlicher Weise wurde eine Immunreaktivität auf andere Hsp's, wie Hsp70 und DnaJ, bei Individuen mit JIA und RA nachgewiesen. Die Behandlungsstrategien für viele Erkrankungen sind eher auf eine Erleichterung der Symptome der Krankheit als auf eine Lösung der Ursache der problematischen Symptome gerichtet. Im Fall entzündlicher Erkrankungen sind beispielsweise die meisten Behandlungen auf eine Erleichterung der Entzündung im Allgemeinen gerichtet, wie z.B. durch Verwendung steroider oder nicht-steroider entzündungshemmender Mittel.

Eine Entzündung tritt oft als Ergebnis einer Immunantwort auf. Obwohl eine Immunantwort und die daraus folgende entzündliche Reaktion im Allgemeinen von Vorteil für ein Individuum sind, beispielsweise wo es sich um eine Reaktion auf eine bakterielle Infektion handelt, führen in manchen Fällen eine Immunantwort und eine entzündliche Reaktion zu schädlichen Folgen. Besonders Patienten mit einer Autoimmunerkrankung, wie rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus erythematosus u. dgl., leiden oft an schweren und in manchen Fällen generalisierten Gewebeschäden. Obwohl die Verabreichung eines Steroiden Arzneimittels beispielsweise die Schwere der Immunantwort bei diesen Patienten verringern kann, kann die Langzeitverwendung solcher Arzneimittel zu negativen Auswirkungen führen. Weiters verringert die Verwendung solcher Arzneimittel im Allgemeinen die Fähigkeit eines Individuums, eine Immunantwort hervorzubringen, was das Individuum für Kurzzeit-Infektionen empfänglich macht, die schwere Folgen haben können.

Obwohl immunogene Peptide, insbesondere von Peptiden, die von Hitzeschockproteinen stammen, über eine T-Zell-vermittelte Immunantwort wirken, zu einer vermehrten Expression von pro-entzündlichen Cytokinen, wie Interferon-gamma führen, was zu einer gesteigerten Expression entzündungshemmender Cytokine, wie lnterleukin-10, führt, ist es ein Nachteil der Verwendung dieser Peptide, dass die Immunantwort - und damit die beabsichtigte therapeutische Wirkung - infolge der Notwendigkeit, den T-Zell-Reaktionsmechanismus einzuschalten, verzögert ist.

Somit besteht ein Bedarf an Zusammensetzungen und Methoden, die geeignet sind, eine Immunantwort, die zu einem Langzeitschutz führt, spezifisch zu modulieren und zusätzlich Mittel vorzusehen, um bei entzündlichen Erkrankungen sofort eine therapeutische Wirkung zu induzieren.

In der WO 0236611 A2 werden Peptide geoffenbart, die von Hitzeschock-Proteinen abgeleitet sind und dazu verwendet werden können, um eine Immunantwort in einem Säugetier zu modulieren. Diese Peptide können zusätzlich an deren N- oder C-Terminus einen oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste aufweisen.

Barrios C et al. (Clin Exp Immunol. 98(2) (1994), 229-33) befassen sich mit der Verwendung von Hitzeschock-Proteinen als Carrier-Moleküle. Dabei wurden synthetische Peptide kovalent an Hitzeschock-Proteine konjugiert und Mäusen verabreicht. 4 AT 504 685 B1

Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein System vorzusehen, bei welchem die breite und lang anhaltende therapeutische Wirkung von Hsp abstammender Peptide für die Behandlung entzündlicher Erkrankungen durch eine sofortige Therapie ergänzt wird.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine T-Zell-Reaktivität in dominant-negativ mutierten Chemokinen konstruiert werden - d.h. „knocked-in“ Glycosaminoglykan-Bindung und „knocked-out“ GPCR-Aktivität - wobei ein zusätzlicher, wie ein adaptiver Schutz auf Immunitäts-Basis, bei entzündlichen Erkrankungen etabliert wird.

Die vorliegende Erfindung sieht ein Fusionsprotein vor, das mindestens ein Chemokin oder ein Derivat oder Fragment davon, und mindestens ein von einem Chaperon abstammendes Peptid umfasst, wobei das Chemokin in Richtung auf eine erhöhte GAG-Bindungsaffinität im Vergleich zur GAG-Bindungsaffinität eines entsprechenden Wildtyp-Proteins modifiziert ist. Vorzugsweise sind die Chaperone T-Zell-Epitope von Hitzeschockproteinen, die vorzugsweise von Hsp65 und Dnajl stammen. Das Chemokin ist ein modifiziertes Chemokin mit vermehrter GAG-Bindungsaffinität und, gegebenenfalls, einer „knocked-out“ oder niederregulierten weiteren biologischen Aktivität im Vergleich zum Wildtyp-Chemokin-Protein. Die vorliegende Erfindung umfasst weiters ein isoliertes Polynukleinsäure-Molekül, das für das Fusionsprotein codiert, und einen Fusionsprotein-Expressionsvektor. Für therapeutische Zwecke sind auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Fusionsprotein gemäß der Erfindung oder eine Polynukleinsäure oder einen Vektor und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst, von der vorliegenden Erfindung vorgesehen.

Das Chemokin oder Derivat oder Fragment davon, welches Teil des Fusionsproteins gemäß der Erfindung ist, kann jedes auf dem Gebiet bekannte Chemokin sein.

Vorzugsweise ist das Chemokin IL-8, RANTES, SDF-1, l-TAC oder MCP-1 oder ein Derivat oder Fragment davon. Es ist jedoch ein Chemokin-Molekül bevorzugt, welches eine erhöhte Bindungsaffinität zu GAG aufweist und gegebenenfalls auch eine „knocked-out“ oder niederregulierte G-Protein-gekoppelte Rezeptor(G-protein coupled receptor, GPCR)-Aktivität hat. Entsprechend modifizierte Chemokine sind in der WO 05/054285 und in Potzinger et al. (Biochem. Soc. Trans. 34, 435-437 (2006)) beschrieben. Diese Chemokine wurden durch Substitution, Insertion und/oder Deletion mindestens einer Aminosäure modifiziert, um die relative Menge der basischen Aminosäuren in der GAG-Bindungsregion zu erhöhen und/oder um die Menge der massigen („bulky“) und/oder sauren Aminosäuren in der GAG-Bindungsregion zu reduzieren, vorzugsweise an einer Lösungsmittel-exponierten Position. Vorzugsweise ist mindestens eine basische Aminosäure, die aus der Gruppe bestehend aus Arg, Lys und His ausgewählt ist, in diese GAG-Bindungsregion des Chemokins insertiert. Vorzugsweise ist die GAG-Bindungsaffinität eine erhöhte Bindungsaffinität an Chondroitinsulfat, Heparansulfat, Keratan-sulfat und/oder Heparin.

Derivate oder Fragmente gemäß der Erfindung können Chemokine sein, die trunkiert oder modifiziert sind, die jedoch immer noch eine mindestens 5-fach erhöhte GAG-Bindungsaffinität, vorzugsweise eine 10-fach erhöhte GAG-Bindungsaffinität, noch mehr bevorzugt eine 100-fach erhöhte GAG-Bindungsaffinität der Chemokin-Aktivität des nicht-modifizierten Proteins aufweisen.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Chemokin Interleukin 8 (IL-8), worin die Positionen 17, 21, 70 und/oder 71 bei IL-8 durch Arg, Lys, His, Asn und/oder Gin substituiert sind, vorzugsweise alle vier Positionen (17, 21, 70 und 71) durch K substituiert sind.

Das Chemokin-Molekül, wie es im Fusionsprotein verwendet wird, welches eine weitere biologisch aktive Region umfasst, ist modifiziert, wodurch die GPCR-Aktivität des Proteins durch Deletion, Insertion und/oder Substitution, vorzugsweise mit Alanin, einem sterisch und/oder 5 AT 504 685 B1 elektrostatisch ähnlichem Rest, „knocked-out“ oder niederreguliert ist. Im Fall von IL-8 befindet sich diese weitere biologisch aktive Region innerhalb der ersten 10 N-terminalen Aminosäuren, und deshalb sind vorzugsweise die ersten 6 N-terminalen Aminosäuren deletiert.

Am meisten bevorzugt ist eine IL-8-Mutante, die die Struktur IL-8 (Δ6 F17K F21K E70K N71K), IL-8 (Δ6 E70K N71K) oder IL-8 (Δ6 E70R), IL-8 (Δ 6F17R E70R N71K), IL-8 (del6F17RE70KN71R) und IL-8 (Δ 6E70K N71K) umfasst.

Bei einer alternativen Ausführungsform können die Chemokine auch Derivate oder Fragmente von RANTES oder MCP1 sein, wie z.B. in der WO 03/84993, WO 02/28419 oder EP 0828833 beschrieben.

Gemäß der Erfindung umfasst das Fusionsprotein mindestens ein Peptid, das von einem Cha-peron stammt. Chaperone sind große Multisubunit-Proteine, deren primäre Funktion es ist, andere Proteine beim Erreichen der richtigen Faltung zu unterstützen und/oder eine unrichtige Aggregation zu vermeiden. In der Chaperon-Familie sind die Hitzeschockproteine, d.h. Proteine, die als Reaktion auf erhöhte Temperaturen und/oder anderen Zellstress exprimiert werden, wesentliche Mitglieder. Dies wird durch Hitze stark beeinflusst, und daher wirken einige Chaperone, um den durch Fehlfaltung verursachten potentiellen Schaden zu reparieren. Andere Chaperone sind an der Faltung neu erzeugter Proteine beteiligt, während sie aus dem Ribosom extrudiert werden.

Molekulare Chaperone sind auf dem Gebiet wohl bekannt, wobei mehrere Familien derselben charakterisiert sind. Diese Chaperone können beispielsweise p90 Calnexin, die Hsp-Familie, DNA K, DNA J, die Hsp60-Familie, GroEL, ER-assoziierte Chaperone, Hsp90, Hsc70, sHsps, SecA, SecB, Trigger-Faktor, Zebrafisch Hsp47, 70 und 90, Hsp47, GRP94, Cpn10, BiP, GRP78, C1p, FtsH, Ig-invariante Kette, Mitochondrien-Hsp70, EBP, Mitochondrien-m-AAA, Hefe Ydj1, Hsp104, ApoE, Syc, Hip, TriC-Familie, CCT, PapD, Calmodulin usw. sein.

Vorzugsweise sind die Chaperone gemäß der vorliegenden Erfindung T-Zell-Peptide, die von Hitzeschockproteinen stammen, vorzugsweise bakteriellen oder anderen mikrobiellen Ursprungs. Gemäß der vorliegenden Erfindung können T-Zell-Epitope von allen Hitzeschockproteinen, die auf dem Gebiet bekannt sind, verwendet werden. Zu diesen zählen Hsp10, Hsp60, Hsp65, Dnaj, Hsp70; wobei Dnaj und Hsp65 bevorzugt sind. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das T-Zell-Epitop mit der Sequenz ALSTLWNKI (SEQ ID Nr. 1) identisch oder hat zumindest 90 % Identität. Das von einem Chaperon stammende Peptid kann eine Länge von bis zu 50 Aminosäuren, vorzugsweise bis zu 30 Aminosäuren, vorzugsweise bis zu 12 Aminosäuren, vorzugsweise bis zu 10 Aminosäuren, vorzugsweise bis zu 8 Aminosäuren haben. Die Peptide werden auf Basis ihrer HLAfhumanes Leukozyten-Antigen)-Avidität, und daher auf Basis ihrer Fähigkeit, eine T-Zell-Antwort zu induzieren, ausgewählt.

Das Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise ein von einem Chaperon stammendes Peptid; alternativ kann es zwei Chaperon-abgeleitete Peptide enthalten, eines am N- und eines am C-Terminus des Fusionsprotein-Konstrukts.

Gemäß der Erfindung sind das Chemokin und mindestens ein von einem Chaperon stammendes Peptid entweder direkt miteinander oder mit einer Peptid-Linker-Sequenz fusioniert. Die Peptid-Linker-Sequenz ist vorzugsweise 27 Aminosäuren lang, noch mehr bevorzugt 8 Aminosäuren lang, noch mehr bevorzugt 4 Aminosäuren lang.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor, der ein isoliertes DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung, wie oben definiert, umfasst. Der Vektor umfasst alle regulatorischen Elemente, die für eine effiziente Transfektion sowie eine effiziente Expression von Proteinen notwendig sind. Solche Vektoren sind auf dem Gebiet wohlbekannt, und jeder geeignete Vektor kann für diesen Zweck ausgewählt werden. Typischerweise werden von pET 6 AT 504 685 B1 stammende Vektoren zur Subklonierung der Konstrukte verwendet, wie die TOPO-Plasmide, die von Invitrogen zur Verfügung gestellt werden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Anmeldung betrifft eine rekombinante Zelle oder Zelllinie, 5 die mit einem erfindungsgemäßen Vektor, wie oben beschrieben, stabil transferiert wird. Solche rekombinante Zellen sowie jede abstammende Zelle umfassen den Vektor. Dadurch wird eine Zelllinie vorgesehen, welche das modifizierte Protein entweder kontinuierlich oder nach Aktivierung, je nach dem Vektor, exprimiert. io Die gemäß der Erfindung verwendeten Zellen sind vorzugsweise Tierzellen, mehr bevorzugt Säugerzellen. Diese können beispielsweise BSC-1-Zellen, LLC-MK-Zellen, CV-1-Zellen, CHO-Zellen, COS-Zellen, murine Zellen, humane Zellen, HeLa-Zellen, 293-Zellen, VERO-Zellen, MDBK-Zellen, MDCK-Zellen, MDOK-Zellen, CRFK-Zellen, RAF-Zellen, TCMK-Zellen, LLC-PK-Zellen, PK15-Zellen, WI-38-Zellen, MRC-5-Zellen, T-FLY-Zellen, BHK-Zellen, SP2/0-Zellen, 15 NSO. perC6 (humane Retina-Zellen) oder Derivate davon sein.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Protein, eine Polynukleinsäure oder einen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung, wie oben definiert, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst. Natürlich 20 kann die pharmazeutische Zusammensetzung weiters zusätzliche Substanzen, die üblicherweise in pharmazeutischen Zusammensetzungen vorhanden sind, aufweisen, wie Salze, Puffer, Emulgatoren, Farbstoffe usw..

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des modifizierten Prote-25 ins, einer Polynukleinsäure oder eines Vektors gemäß der vorliegenden Erfindung, wie oben definiert, bei einem Verfahren zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen.

Gemäß der Erfindung sind die Behandlung aller entzündlichen Erkrankungen hierin mit umfasst, bei welchen eine Infiltration von Leukozyten in eine erkrankte Stelle auftritt, oder Erkrankungen, 30 bei welchen eine Entzündung deutlich auftritt als Folge von aktivem Sauerstoff und verschiedenen Zytokinen, die aus Leukozyten freigesetzt werden. Beispiele für entzündliche Erkrankungen sind rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Osteoarthritis, Asthma, COPD, Multiple Sklerose, ulzeröse Colitis und Morbus Crohn. 35 Wie oben beschrieben kann das modifizierte Protein als Glykosaminoglykan-Antagonist auf Chemokin-Basis wirken (d.h. Wildtyp-chemokine aus GAG-Corezeptoren verdrängen), mit einer unmittelbaren Wirkung bei entzündlichen Reaktionen und durch Induktion einer lang anhaltenden T-Zell-Antwort (mit verzögertem Beginn) infolge des Vorhandenseins des Chaperon-Anteils. 40 Die folgenden Beispiele und Figuren beschreiben die Erfindung mehr im Detail und ohne den Umfang der Erfindung einzuschränken.

Figuren 45 Fig. 1: Aminosäuresequenz des Hsp65-Peptid/PA04-001 -Fusions-Konstrukts („Insert“), SEQ ID Nr. 2.

Fig. 2: Expressionsvektor-Karte. Das Gen des Fusionsproteins („Insert“) wurde unter Verwendung des von Invitrogen zur Verfügung gestellten Topo-Isomerase-Systems in das Expressi-50 onsplasmid subkloniert.

Fig. 3: Expressionsanalyse des Fusionsproteins PA05-015 Beispiele: 55

Claims

7 AT 504 685 B1 Das Fusionsprotein, welches aus einem von Hsp60 stammenden Peptid und der IL-8-Mutante PA04-001 bestand, wurde kloniert (die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins ist in Fig. 1 gezeigt). Um das N-terminale Fusionsprotein mit der Bezeichnung PA05-015 herzustellen, wurde das Gen für das Konstrukt durch PCR-Amplifizierung der cDNA von PA04-001 aus einem bereits bestehenden Plasmid erhalten, wobei ein Vorwärts-Primer, der die bp-Sequenz für das ALLSTLVVNKI Hsp60-abstammende Peptid abdeckt, plus der 5'-Teil des PA04-001-Gens verwendet wurde. Das PCR-Produkt wurde danach in das D-TOPO-Expressionsplasmid subkloniert (vgl. Fig. 2). Nach positiver Sequenzierung des Konstrukts wurde es in BL21(DE3)-Zellen für eine Fusionsprotein-Expression transformiert. Die Protein-Expression erwies sich als genügend hoch für eine Detektion durch Coomassie Blue-Färbung (Fig. 3). Patentansprüche: 1. Fusionsprotein, umfassend (i) mindestens ein Chemokin oder ein Derivat oder Fragment davon und (ii) mindestens ein von einem Chaperon stammendes Peptid, wobei das Chemokin in Richtung auf eine erhöhte GAG-Bindungsaffinität im Vergleich zur GAG-Bindungsaffinität eines entsprechenden Wildtyp-Proteins modifiziert ist.
2. Fusionsprotein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Chaperon ein Hitzeschockprotein ist.
3. Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Chemokin IL-8, RANTES, SDF-1, l-TAC oder MCP2 oder ein Derivat oder Fragment davon ist.
4. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die intrinsische GAG-Bindungsregion durch Substitution, Insertion und/oder Deletion mindestens einer Aminosäure modifiziert ist, um die relative Menge der basischen Aminosäuren in der GAG-Bindungsregion zu erhöhen und/oder die Menge der massigen („bulky“) und/oder sauren Aminosäuren in der GAG-Bindungsregion zu reduzieren, vorzugsweise an einer Lösungsmittel-exponierten Position.
5. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine basische Aminosäure, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arg, Lys und His, in die GAG-Bindungsregion des Chemokins insertiert ist.
6. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die GAG-Bindungsregion eine C-terminale Helix ist.
7. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Positionen 17, 21,70 und/oder 71 in IL-8 durch Arg, Lys, His, Asn und/oder Gin substituiert sind, vorzugsweise alle vier Positionen durch K substituiert sind.
8. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die erhöhte GAG-Bindungsaffinität eine erhöhte Bindungsaffinität zu Heparansulfat, Heparin, Keratansulfat, Chondroitinsulfat und/oder Hyaluronsäure ist.
9. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine weitere biologisch aktive Region modifiziert ist, wodurch die Aktivität des Proteins durch Deletion, Insertion und/oder Substitution, vorzugsweise mit Alanin, einem sterisch und/oder elektrostatisch ähnlichem Rest, inhibiert oder niederreguliert ist.
10. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Chemokin IL-8 ist und die weitere biologisch aktive Region eine GPCR-Aktivierung ist, welche sich innerhalb der ersten 10 N-terminalen Aminosäuren befindet. 8 AT 504 685 B1
11. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Chemokin eine IL-8-Mutante ist, bei welcher die ersten 6 N-terminalen Aminosäuren dele-tiert sind.
12. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Chemokin eine IL-8-Mutante ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IL-8 (Δ6 F17K F21K E70K N71K), IL-8 (Δ6 E70K N71K) oder IL-8 (Δ6 E70R), IL-8 (Δ 6F17R E70R N71K), IL-8 (del6F17RE70KN71R) und IL-8 (Δ 6E70K N71K) ist.
13. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Chaperon ein T-Zell-Epitop eines Hitzeschockproteins ist.
14. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das T-Zell-Epitop vom Hsp65- oder dnajl-Protein stammt.
15. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid mindestens 8 Aminosäuren lang, vorzugsweise mindestens 10 Aminosäuren lang, vorzugsweise mindestens 12 Aminosäuren lang ist.
16. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid eine Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 umfasst.
17. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Chemokin und das von einem Chaperon stammende Peptid ohne Linker fusioniert sind.
18. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Chemokin und das Chaperon über eine Peptid-Linker-Sequenz fusioniert sind.
19. Isoliertes Polynukleinsäure-Molekül, dadurch gekennzeichnet, dass es für ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 18 codiert.
20. Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er ein isoliertes DNA-Molekül nach Anspruch 19 umfasst.
21. Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nukleinsäuresequenz, wie in Fig. 1 gezeigt (SEQ ID Nr. 2) umfasst.
22. Rekombinante Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einem Vektor nach den Ansprüchen 20 oder 21 stabil transferiert ist.
23. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 19, eine Polynukleinsäure nach Anspruch 19 oder einen Vektor nach Anspruch 20 oder 21 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
24. Verwendung des Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 19, einer Polynukleinsäure nach Anspruch 19 oder eines Vektors nach Anspruch 20 oder 21 bei einem Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer entzündlichen Erkrankung.
25. Verwendung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die entzündliche Erkrankung ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Osteoarthritis, Asthma, COPD, Multiple Sklerose, ulzeröse Colitis und Morbus Crohn. Hiezu 1 Blatt Zeichnungen