JPH11511968A - 抗原提示細胞上にて抗原密度を増加させる方法 - Google Patents
抗原提示細胞上にて抗原密度を増加させる方法Info
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Abstract
(57)【要約】
細胞表面上においてペプチドの形態の抗原を提示する方法を開示する。該方法は、ＭＨＣクラスＩ経路関連成分（例えば、ＴＡＰ蛋白質またはプロテアゾーム阻害剤またはその成分）の細胞中の活性を阻害して細胞に抗原性ペプチドを接触させることにより効能のある抗原提示細胞を生成することを含む。本発明の抗原提示細胞は癌または病原体（例えば、バクテリアまたはウイルス）の感染の処置または予防法において哺乳類に投与することができる。所望であれば、抗原提示細胞を用いることにより、インビボのＣＴＬ増殖を刺激し、そしてその結果の細胞を次に治療法において哺乳類に投与することができる。
Description
【発明の詳細な説明】
抗原提示細胞上にて抗原密度を増加させる方法
発明の背景
本発明は、細胞上における抗原提示（presentation）に関する。
細胞毒性CD8+Tリンパ球（CTL）は、主要組織適合抗原複合体（MHC）クラスＩ
分子に関連して、内因性のプロセスを受けたウイルス、バクテリアまたは細胞蛋
白質に由来するペプチドを認識する（Zinkernagel et al.，Advanced Immunol．
27：51-180，1979）。CTLエピトープは、８−10の長さのアミノ酸からなり、細
胞質において内因性合成された蛋白質から生じ、新たに合成されたMHCクラスＩ
分子と関連する（associate）小胞体に入り、そして続いてCD8+T細胞への提示の
ために細胞表面に移行される（translocate）（Townsend et al.，Annu．Rev．I
mmunol．７：601-624；Monaco，Cell 54：777-785，1992；Yewdell et al.，Adv
．in Immunol．52：1-123，1992）。
遺伝学上の分析は、MHCクラスＩにより制限された抗原のプロセシング並びに
提示の経路の解明に重要な投割を果たしてきた。抗原提示欠損ヒトおよびマウス
細胞系の研究は、抗原プロセシングに関連した運搬体（TAP）蛋白質の要件であ
る、小胞体へのペプチドの輸送を証明したが、但し小胞体とMHCクラスＩ分子と
の対合はクラスＩアッセンブリーに必要不可欠である（Townsend et al.，Eur．
J．Immunogenetics 19：45-55，1993）。RMA細胞、即ちローシャーウイルス誘導
リンパ腫であるC57BL/6(H-2b)起源に由来する細胞系の変異導入、並びにMHCクラ
スＩ発現の損失の選択は、減じられたレベルにおいて細胞表面MHCクラスＩ分子
を発現する変異細胞系RMA-Sの単離に通じた。この細胞系は、TAP蛋白質TAP-2の
発現が欠損しており、内因性プロセスされたMHCクラスＩにより制限された抗原
をCD8+T細胞上に提示することができない（Ljunggren et al.，J．Exp．Med．
al.，J．Immunol．145：52-58，1990；およびCerundolo et al.，Nature 345：4
49-456，1990）。
MHCクラスＩ経路による抗原の提示は、TAP蛋白質に加えて、幾つかのMHCクラ
スＩ経路関連蛋白質により仲介される。例えば、低分子量蛋白質LMP2およびLMP7
は、プロテアゾームのサブユニットとして機能するが、プロテアゾームはMHCク
ラスＩ分子に関連したペプチドを生じさせるために細胞蛋白質を分解すると考え
られている複数触媒（multicatalytic）プロテイナーゼ複合体である。一度生成
されたら、該ペプチドは、ヒートショック蛋白質（HSP；例えば、gp96，HSP90、
およびHSP70）と対合し、プロテアゾーム（proteasome）から発生期のMHC分子へ
のペプチドの輸送を補助するシャペロンとして作用する。
発明の概要
出願人は、MHC結合ペプチドエピトープの形態の抗原が細胞への接触に先立ち
細胞中のMHCクラスＩ経路関連成分（例えば、TAP蛋白質またはプロテアゾーム）
の活性を阻害することにより細胞上に提示されうることを発見した。この方法に
従い生成された細胞は、インビトロまたはインビボにおいて免疫応答を刺激する
のに有用な、効能のある（potent）抗原提示細胞である。
従って、一つの側面において、本発明は細胞と接触した抗原（例えば、ペプチ
ドの形態の抗原）の提示を変更する方法を特徴とし；該方法は、抗原（例えば、
ペプチド）が細胞と接触するのに先立ち細胞内のMHCクラスＩ経路関連成分の活
性を阻害するのを伴う。MHCクラスＩ経路関連成分の活性の阻害は、MHC経路関連
蛋白質の発現を阻害するかまたはMHC経路関連成分が天然の生物学上の機能を実
行する能力を阻害する成分（即ち、阻害剤）を細胞に接触させることにより、達
成できる。所望であれば、MHC経路関連成分の発現阻害は、MHCクラスＩ経路関連
蛋白質の翻訳を阻害することにより、容易に達成できる。例えば、翻訳は、MHC
クラスＩ経路関連蛋白質をコードするmRNAのすべてまたは一部に相補なアンチセ
ンス（AS）オリゴヌクレオチドを細胞内に導入するか、またはMHCクラスＩ経路
関連蛋白質をコードするmRNAのすべてまたは一部に相補なRNAをコードするアン
チセンス遺伝子を細胞内で発現させることにより阻害することができる。本発明
の他の態様において、MHC経路関連蛋白質の活性の阻害は、MHCクラスＩ経路関連
蛋白質に結合して該蛋白質の機能を阻害する、おとりの（decoy）RNAを細胞内に
導入することを含む。
本発明のさらに他の態様において、阻害は、MHCクラスＩ経路関連蛋白質をコ
ードするmRNAを特異的に分断するリボザイムを細胞内に導入し、それにより、MH
CクラスＩ経路関連蛋白質の翻訳を阻害することにより達成される。さらに他の
方法において、MHC経路関連成分の活性は、プロテアゾーム阻害剤、例えばLLnL
，MG115，MG132，CEP690，CEP1508，CEP1612，CEP1513，またはラクタシスチン
を細胞に接触させることにより阻害される。これらの阻害剤すべては当業界にお
いて公知である（例えば、Hughes et al.，1996，J．Exp．Med．183：1569-1576
；Rock et al.，1994，Cell 78：761-771；Yang et al.，1996，J．Exp．Med．1
83：1545-1552；Harding et al.，1995，J．Immunol．22：1767-1775；およびFe
nteany et al.，Science 268：726-731を参照されたい）。付加的な成分は、仮
想阻害剤の活性を公知のプロテアゾーム阻害剤の活性と比較することにより、プ
ロテアゾーム阻害剤として容易に同定されうる。
クラスＩ抗原プロセシング経路のひとつまたはそれ以上の成分の機能の阻害は
、内在性ペプチド負荷（loading）の欠損を細胞にもたらす。内在性ペプチド抗
原の細胞への接触は、空のクラスＩ分子の負荷をもたらし、且つ増加した抗原密
度（天然MHCクラスＩ抗原提示経路を用いることにより得られる抗原密度に対し
て）を有する抗原提示細胞の効率よい生成法である。
好ましくは、MHCクラスＩ経路関連成分は蛋白質であり、例えばTAP蛋白質（例
えば、TAP-1またはTAP-2）である。他の好ましいMHCクラスＩ経路関連蛋白質は
限定されないが、LMP2，LMP7，gp96，HSP90，およびHSP70を含む。所望であれば
、ASオリゴヌクレオチド、AS遺伝子、おとりの（decoy）RNAs、プロテアゾーム
阻害剤、および／またはリボザイムを使用することにより、MHCクラスＩ経路関
連成分（例えば、TAP-1とLMP7）の組み合わせの発現を阻害することができる。M
HCクラスＩ経路関連蛋白質をコードする遺伝子はクローン化および配列決定され
ている（例えば、Trowsdale et al.，1990，Nature 348：741-748，GenBank Acc
ession No．X57522；Bahram et al.，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．88：10094
-10098，GenBank Accession No．M74447；Monaco et al.，1990，Science 250：
1723-1726，GenBank Accession No．M55637；およびYang et al.，1992，J．Bio
l．
Chem．267：11669-11672，GenBank Acccssion No．M90459を参照されたい）。
マウスTAP-2に対する好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、以下
の配列を含むオリゴヌクレオチドを包含する：
５’AGGGCCTCAGGTAGGACAGCGCCAT３’（配列番号１）および
５’GCAGCAGGATATTGGCATTGAAAGG３’（配列番号２）。ヒトTAP-1に対する好ま
しいアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、以下の配列を含むオリゴヌクレオ
チトを包含する
５’CGAGAAGCTCAGCCATTTAGGG３’（配列番号３）、
５’CACAGCCTCCTTCTGGTTGAGTGTCTT３’（配列番号４）、および
５’ATCATCCAGGATAAGTACACACGGTTT３’（配列番号５）。
これらのＡＳオリゴヌクレオチドは、ヒトTAP-1のヌクレオチド43-25，1428-1
402，および2214-2188に相補である。ヒトTAP-2に対する好ましいアンチセンス
オリゴヌクレオチドはヌクレオチド117-92に相補であって、配列５’TCTCAGGTCA
GGGAGCGGCATGG３’（配列番号６）を有する。これらのオリゴヌクレオチドの一
部、またはこれらの配列を含むより長いオリゴヌクレオチドも本発明において使
用できる。
抗原提示細胞表面上に天然において提示されるあらゆる抗原性ペプチドが、本
発明において使用できる。好ましくは、抗原は病原体、例えばバクテリアまたは
ウイルスにより天然において発現される蛋白質の一部を含むポリペプチドである
。所望であれば、抗原は腫瘍特異的抗原でありうる（即ち、非腫瘍細胞に比して
腫瘍細胞にて優先的に発現または存在する抗原）。腫瘍特異的抗原と共に生成さ
れる抗原提示細胞は癌（例えば、悪性腫瘍、カルシノーマまたはサルコーマ）を
処置または予防する方法により哺乳類に投与できる。
本明細書に記載されたあらゆる方法により生成された細胞も、本発明の範囲内
にある。そのような細胞は、MHCクラスＩ経路関連蛋白質（例えば、TAP蛋白質）
の発現を減じるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むことができる。さらに、
あるいは別法において、本発明の細胞はMHCクラスＩ経路関連蛋白質をコードす
るmRNAのすべてまたは一部に相補のRNA（即ち、アンチセンスRNA）をコードする
アンチセンス遺伝子を含むことができ、そのアンチセンスRNAはmRNAの翻訳を阻
害する。また、本発明に包含されるのは、MHCクラスＩ経路関連蛋白質に結合し
て該蛋白質の機能を阻害するおとりのRNAを含む細胞である。さらに、本発明は
、MHCクラスＩ経路関連蛋白質をコードするmRNAを特異的に分断するリボザイム
を含む細胞を包含し、そしてそれによりMHCクラスＩ経路関連蛋白質の翻訳を阻
害する。本発明は、プロテアゾーム阻害剤並びに抗原性ペプチドを細胞に接触さ
せることにより生成された抗原提示細胞をも含む。
さまざまな細胞が本発明において使用されうる。好ましくは、細胞はヒトまた
はマウス細胞のような哺乳類細胞である。細胞は初期（primary）細胞であるか
、または確立された細胞系の細胞でありうる。好ましくは、細胞は以下のひとつ
である：Ｔリンパ球（例えば、RNA細胞）、Ｂリンパ球、粘着性または非粘着性
スプレノサイト（splenocyte）、粘着性または非粘着性末梢血単核細胞（PBMC）
、樹状突起細胞（例えば、結腸由来の樹状突起細胞、ランゲルハンス樹状突起細
胞、小胞樹状突起細胞、または前駆体由来の細胞）、マクロファージ、胸腺腫細
胞（例えば、EL4細胞）または繊維芽細胞。所望であれば、本発明において、細
胞を組み合わせて使用することができる。例えば、MHCクラスＩ経路関連成分の
活性は、粘着性および非粘着性PBMCの混合物中において阻害されうる。
本発明の細胞は、例えば哺乳類の病原体（例えば、バクテリアまたはウイルス
）感染または癌を処置または予防する方法において哺乳類に投与することができ
る。
そのような細胞は、薬学上受容可能な賦形剤と化合された場合に、細胞が接触す
る抗原を含む蛋白質（例えば、バクテリアの毒素）に対するワクチンを提供する
。従って、そのようなワクチンは癌または病原体感染（例えば、細胞内病原体感
染）の処置に使用することができる。
一つの態様において、本発明の細胞は、細胞毒性Ｔリンパ球（CTL）のインビ
トロの増殖を刺激するための方法において、Ｔリンパ球への接触を許容する。即
ち、本発明は、細胞中においてMHCクラスＩ経路関連成分（例えば、TAP蛋白質ま
たはプロテアゾーム）の活性を阻害し、該細胞を抗原と接触させることにより抗
原提示細胞を生成し、そしてインビトロにてＴリンパ球に抗原提示細胞を接触さ
せることにより細胞毒性Ｔリンパ球を生成することにより生成されたCTLを包含
する。そのようなCTLは、治療方法（例えば、病原体による感染を処置するかま
たは予防するための、あるいは癌、例えば悪性腫瘍を処置または予防するための
）において哺乳類に投与することができる。
MHCクラスＩ「経路関連（pathway-associated）」成分は、MHCクラスＩ分子と
対合して細胞表面上において抗原をプロセスまたは提示する機能を有するあらゆ
る成分（例えば、蛋白質または蛋白質複合体）を意味する。MHCクラスＩ経路関
連成分の例は26Sプロテアゾームおよび20Sプロテアゾームを包含し；プロテアゾ
ーム成分、例えばLMP蛋白質（例えば、LMP2およびLMP7）も包含される。さらに
、用語MHCクラスＩ経路関連成分は、さまざまなMHCクラスＩ経路関連蛋白質、例
えばTAP蛋白質（例えば、TAP-1およびTAP-2）およびヒートショック蛋白質（例
えば、gp96，HSP70，およびHSP90）を包含する。
「TAP蛋白質」は、Momburg et al.、例えば（Momburg et al.，1994，Curr．O
pin．Immunol．6：32-37）に記載されたとおりの、抗原性ペプチドを転移させる
ATP結合MHCによりコードされたあらゆるポリペプチドを意味する。好ましくは、
TAP蛋白質をコードする遺伝子は、以前に報告されたヒトまたはマウスTAP-1また
はTAP-2遺伝子に少なくとも80％、より好ましくは90％、そしてもっとも好まし
くは100％の配列相同性を有する（例えば、Trowsdale，Bahram，Monaco，and Ya
ng et al.，前出）。
「おとりの（decoy）」RNAは、MHCクラスＩ経路関連蛋白質に特異的に結合し
て該蛋白質がその正常な細胞の相手方により相互作用を受けることを阻害または
妨害し、それによりMHCクラスＩ細胞表面発現を減じるRNA分子を意味する。その
ようなおとりのRNA分子は、以前記載されたSelexの選択法、例えば（Doudna et
al.，1995，Proc．Natl．Acad．Sci．92：2355-2359を参照されたい）により単
離および同定することができる。
本発明は、幾つかの利点を提供する。例えば、所望であれば、MHCクラスＩ経
路関連成分の活性の阻害は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはプロテアゾ
ーム阻害剤を用いる迅速且つ瞬間的な様式において達成されるうる。プロテアゾ
ーム阻害剤の使用は、増加した密度の抗原を有する抗原提示細胞を生成するため
の特に便利な方法である。蛋白質発現の長時間の阻害を望む場合、アンチセンス
遺伝子は本発明における使用に特に適している。本発明は、あらゆるハプロタイ
プの細胞における抗原提示の操作手段も提供する。さらに、本発明は、初期細胞
を利用することができ；そのような細胞は患者またはドナーから得られて本発明
の方法を用いてインビトロにて操作され、そして次に患者に投与される。
本発明の他の特徴および利点は以下の好ましい態様の記載並びに請求の範囲か
ら明らかとなる。
以下は本明細書において用いられる略語である。
ＡＰＣ 抗原提示細胞
ＡＳ アンチセンス
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
ＣＴＬ 細胞毒性Tリンパ球
ＦＡＣＳ 蛍光活性化細胞分類（sorting）
ＦＣＳ 胎児ウシ血清
ＦＩＴＣ フルオレセイン イソチオシアネート
ＬＭＰ 低分子量蛋白質
ＮＰ 核蛋白質
ｎｔ ヌクレオチド
ＯＶＡ オバルブミン
ＰＢＭＣ 末梢血単核細胞
ＴＡＰ 抗原プロセシングに関連した運搬体
詳細な説明
最初に図面を記載する。図面
図１Ａ−Ｆは、TAP-2 ASオリゴヌクレオチドで処理したRMA細胞中のMHCクラス
Ｉ発現を表すFACSによる一連のグラフである。図１Ａは、アイソタイプの対照抗
体を用いて得られたグラフである。図１Ｂは、未処理RMA細胞を表すグラフであ
る。図１Ｃは、AS-1で処理したRMA細胞を表すグラフである。図１Ｄは、AS-2で
処理したRMA細胞を表すグラフである。図１Ｅは、AS-3で処理したRMA細胞を表す
グラフである。図１Ｆは、AS-4で処理したRMA細胞を表すグラフである。
図２Ａ−Ｆは、RMA細胞中のMHCクラスＩ発現に対する温度の効果を示すFACSに
よる一連のグラフである。図２Ａは、37℃においてインキュベートしたRMA-S細
胞上におけるMHCクラスＩ発現を表すグラフである。図２Ｂは、28℃においてイ
ンキュベートしたRMA-S細胞上におけるMHCクラスＩ発現を表すグラフである。図
２Ｃは、37℃においてインキュベートした未処理RMAで得られたグラフである。
図２Ｄは、28℃においてインキュベートした未処理RMAで得られたグラフである
。図２Ｅは、37℃においてAS-1で処理されたRMA細胞を表すグラフである。図２
Ｆは、28℃においてインキュベートされたAS-1処理RMA細胞を表すグラフである
。
図３Ａ−Ｆは、MHC制限されたペプチドと共にインキュベートした細胞上のMHC
クラスＩ発現を表す一連のグラフである。図３Ａは、CON-1処理したRMA細胞を表
すグラフである。図３Ｂは、AS-1処理したRMA細胞を表すグラフである。図３Ｃ
は、ハプロタイプのミスマッチペプチドNP（H-2Kd）と共にインキュベートしたA
S-1処理RMA細胞を表すグラフである。図３Ｄは、ハプロタイプのミスマッチペプ
チドNP（H-2Kk）と共にインキュベートしたAS-1処理RMA細胞を表すグラフである
。図３Ｅは、ハプロタイプのミスマッチペプチドNP（H-2Db）と共にインキュベ
ートしたAS-1処理RMA細胞を表すグラフである。図３Ｆは、ハプロタイプのミス
マッチペプチドOVA（H-2Kb）を表すグラフである。
図４Ａ−Ｆは、EL4細胞上のMHCクラスＩ発現を描写する一連のグラフである。
図４Ａは、未処理EL4細胞で得られたグラフである。図４Ｂは、CON-1処理EL4細
胞で得られたグラフである。図４Ｃは、AS-1処理されたEL4細胞で得られたグラ
フである。図４Ｄは、28℃でインキュベートされたAS-1処理EL4細胞で得られた
グラフである。図４Ｅは、ハプロタイプのミスマッチペプチドOVA（H-2Kb）と共
にインキュベートしたAS-1処理EL4細胞で得られたグラフである。図４Ｆは、ハ
プロタイプのミスマッチペプチドNP（H-2Kk）と共にインキュベートしたAS-1処
理EL4細胞で得られたグラフである。
図５Ａ−Ｈは、C57BL/6マウスからのスプレノサイトにおけるMHCクラスＩ発現
を描写する一連のグラフである。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ37℃および28
℃にてインキュベートした未処理の未分画スプレノサイトで得られたグラフであ
る。図５Ｃおよび図５Ｄは、それぞれ37℃および28℃にてインキュベートしたAS
-1処理の未分画スプレノサイトで得られたグラフである。図５Ｅおよび図５Ｆは
、それぞれ37℃および28℃にてインキュベートしたAS-1処理の粘着性細胞で得ら
れたグラフである。図５Ｇおよび図５Ｈは、それぞれ37℃および28℃にてインキ
ュベートしたAS-1処理の非粘着性細胞で得られたグラフである。
図６は、エフェクター：標的比の範囲にわたってOVA特異的CTL応答を表すヒス
トグラムである。バー１は、ハプロタイプのマッチしたOVAペプチドと共にイン
キュベートしたCON-1処理RMA細胞を表す。バー２は、ハプロタイプのミスマッチ
ペプチドNP（H-2Kk）と共にインキュベートしたAS-1処理RMA細胞を表す。バー３
は、ハプロタイプのマッチしたOVAペプチド（H-2Kb）と共にインキュベートした
AS-1処理RMA細胞を表す。バー４は、ハプロタイプのマッチしたOVAペプチドと共
にインキュベートした未処理RMA細胞を表す。バー５は、ハプロタイプのマッチ
したOVAペプチドと共にインキュベートしたTAP-2欠損RMA-S細胞を表す。
図７は、C57BL/6マウスからの抗原提示スプレノサイトにより誘導された、OVA
特異的CTL応答を表すヒストグラムである。バー１は、ハプロタイプのマッチし
たOVAペプチドと共にインキュベートしたAS-1処理粘着性スプレノサイトで得ら
れた応答を表す。バー２は、ハプロタイプのマッチしたOVAペプチドと共にイン
キュベートしたAS-1処理非粘着性スプレノサイトで得られた応答を表す。バー３
は、ハプロタイプのマッチしたOVAペプチドと共にインキュベートしたCON-1処理
未分画スプレノサイトで得られた応答を表す。バー４は、ハプロタイプのミスマ
ッチしたNP（H-2Kk）ペプチドと共にインキュベートしたAS-1処理未分画スプレ
ノサイトで得られた結果を表す。バー５は、ハプロタイプのマッチしたOVAペプ
チドと共にインキュベートしたAS-1処理未分画スプレノサイトで得られた応答を
表す。
図８Ａ−Ｂは、ハプロタイプのマッチしたOVAペプチドと共にインキュベート
したAS-1処理スプレノサイト（バー１）またはハプロタイプのマッチしたOVAペ
プチドと共にインキュベートした酸処理スプレノサイト（バー２）で得られたCT
L応答を表すヒストグラムの対である。図８Ａは、応答物 刺激剤の比４：１に
おけるCTL応答を表すヒストグラムである。図８Ｂは、応答物 刺激剤の比８：
１におけるCTL応答を表すヒストグラムである。
図９は、PBS（レーン１）、EL4細胞（レーン２）、OVA遺伝子でトランスフェ
クトされたE.G7細胞（レーン３）、ハプロタイプのマッチしたOVAペプチドと共
にインキュベートしたAS-1処理粘着性スプレノサイト（レーン４）、ハプロタイ
プのミスマッチNPペプチドと共にインキュベートしたAS-1処理粘着性スプレノサ
イト（レーン５）、ハプロタイプのマッチしたOVAペプチドと共にインキュベー
トしたCON-１処理粘着性スプレノサイト（レーン６）、ハプロタイプのマッチし
たOVAペプチドと共にインキュベートした酸処理粘着性スプレノサイト（レーン
７）、ハプロタイプのミスマッチしたNPペプチドと共にインキュベートした酸処
理粘着性スプレノサイト（レーン８）、ハプロタイプのマッチしたOVAペプチド
と共にインキュベートしたAS-1処理RMA細胞（レーン９）、またはハプロタイプ
のミスマッチしたNPペプチドと共にインキュベートしたAS-1処理RMA細胞（レー
ン10）と共に接種したマウスでインビボにおいて得られたCTL応答のグラフによ
る表現である。
図１０Ａ−Ｂは、それぞれ、10日および35日における腫瘍サイズを表すヒスト
グラムの対であり、C57BL/6マウスを腫瘍原投薬量の生存E.G7-OVA細胞にて誘発
した。図面中の各々のドットにより示されたマウスは、PBS（バー１）、EL4細胞
（バー２）、E.G7-OVA細胞（バー３）、ハプロタイプのマッチしたOVAペプチド
と共にインキュベートしたAS-1処理粘着性スプレノサイト（バー４）、ハプロタ
イプのミスマッチしたNPペプチドと共にインキュベートしたAS-1処理粘着性スプ
レノサイト（バー５）、またはハプロタイプのマッチしたOVAペプチドと共にイ
ンキュベートしたAS-1処理RMA細胞（バー６）で接種した。
図１１Ａ−Ｂは、プロテアゾーム阻害剤処理し且つペプチドでパルスした樹状
細胞を用いた初期CTLの誘導を模式的に表すグラフの対である。これらのグラフ
は、プロテアゾーム阻害剤処理し且つペプチドでパルスした樹状細胞を刺激剤と
して用いることにより生成されたCTLの細胞毒性を表す。CTL標的はHCVペプチド
（図１１Ａ）またはEBVペプチド（図１１Ｂ）でパルスしたT2細胞であった。CTL
アッセイは示されたエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比にて実施した。
今、本発明のさまざまなパラメーター並びに以下の実際の実施例において用い
た材料および方法の詳細な記載を続ける。
アンチセンスオリゴヌクレオチド：本発明において有用なオリゴヌクレオチド
はDNAを合成するための慣用法を用いて実施することができる。一般に、本発明
に使用されるASオリゴヌクレオチドは、MHCクラスＩ経路関連蛋白質のmRNAを脱
安定化する（destabilize）ものである。開始コドンを含む領域（即ち、コーデ
ィング配列のヌクレオチド１から25のすべてまたは一部）に相補なASオリゴヌク
レオチドは一般に適切な脱安定化剤（destabilizers）である。好ましくは、AS
オリゴヌクレオチドは、二次構造を予測するための慣用法に基づき複合体二次構
造を形成しないと予測されるmRNAの領域に相補である。本明細書に記載された実
験においては、MULFOLDコンピュータープログラム（Jaeger et al.，1989，Proc
．Natl．Acad．Sci．86：7706-7710）を利用してTAP-2のmRNAの二次構造を特徴
付けた。
好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドを予測する別の方法として、気まま
に（arbitrarily）選択したオリゴヌクレオチドを容易に試験してよい。好まし
いASオリゴヌクレオチドの例は表１に提供される。好ましくは、ASオリゴヌクレ
オチトは15から40ヌクレオチドの長さ；より好ましくは、オリゴヌクレオチドは
20から30（例えば、25）ヌクレオチドの長さである。一般に、GC含有量50から60
％を有し且つ３連続以上のグアニンを有さないオリゴヌクレオチドは、二次構造
形成を阻害するがASオリゴヌクレオチドとTAPのmRNAの間の安定なハイブリダイ
ズの形成を許容するのに好ましい。
所望であれは、ASオリゴヌクレオチドは修飾ヌクレオチドを用いて合成するこ
とができる（例えば、ASオリゴヌクレオチドのインビボ半減期を増大させるため
に）。例えば、ホスホロチオエート誘導体等の修飾ヌクレオチドを用いてよい。
便宜上、商業上の供給源（例えば、Oligos Ets.，Wilsonville，OR）により製造
されたASオリゴヌクレオチドを本発明において用いてよい。培養細胞に添加され
るオリゴヌクレオチドは血清不含培地中の無菌の100μM溶液として便利に保存す
ることができる。
以下に要約された実際の実施例において用いられた４つのASオリゴヌクレオチ
ド（AS-1，AS-2，AS-3，およびAS-4）は、ホスホロチオエート誘導体として合成
された。AS-1はマウスTAP-2のmRNAのヌクレオチド１-25に相補であり、且つ配列
５’AGGGCCTCAGGTAGGACAGCGCCAT３’（配列番号１）を有する。AS-2はTAP-2のヌ
クレオチド815-790に相補であり、且つ配列５’GCAGCAGGATATTGGCATTGAAAGG３’
（配列番号２）を有する。AS-3はTAP-2のヌクレオチド1,088-1,063に相補であり
、且つ配列５’GTCTACATCGCTCCA GGGCCTCCTT３’（配列番号７）を有する。AS-4
はTAP-2のヌクレオチド1,427-1,402に相補であり、且つ配列５’ACGAAAAGGAGACG
TCTTGGAATTC３’（配列番号８）を有する。以下の実際の実施例は対照としてオ
リゴヌクレオチトCON-1を用いたが、これはTAP-2のmRNAのヌクレオチド１-25と
同一である。配列５’TACCGCGACAGGATGGACTCCGGGA３’（配列番号９）により、C
ON-1はAS-1と同じヌクレオチド内容物を有する。
アンチセンス遺伝構築物：細胞中におけるMHCクラスＩ経路関連蛋白質コーデ
ィング遺伝子の発現は、該細胞中へのアンチセンス遺伝構築物（例えば、プラス
ミド）の導入により阻害することもできる。そのようなアンチセンス遺伝構築物
は、プロモーターに機能するように連結し且つ遺伝子発現によりMHCクラスＩ経
路関
連蛋白質の天然に生じるmRNAのすべてまたは一部に相補な転写物を生成するよう
に配置されたMHCクラスＩ経路関連蛋白質（例えば、TAP-1）の遺伝子（アンチセ
ンス遺伝子）のすべてまたは一部を含む。実際は、MHCクラスＩ経路関連蛋白質
をコードする天然遺伝子に関して、そのようなアンチセンス遺伝子を「逆」方向
にしてプロモーターに隣接して配置させる。アンチセンス遺伝子がmRNAの一部に
相補な転写物を生成する場合、特に有用な転写物はASオリゴヌクレオチドとして
使用可能な配列のすべてまたは一部を包含するものである（例えば、表１に示す
配列）。
さまざまなベクターがアンチセンスの遺伝構築物の構築に適している。好まし
くは、ベクターは哺乳類細胞における効率良い発現のための強いプロモーターを
有するレトロウイルスベクター（例えば、N2ベクター（Armentano et al.，1987
，J．Virol．61：1647-1650））である。所望であれば、アンチセンス遺伝子の
発現を指示するプロモーターは細胞または組織特異的プロモーターであってよい
。アンチセンス遺伝子をコードするそのようなレトロウイルスベクターは、脂質
仲介トランスフェクション法において細胞に到達させうる（例えば、5-20μgのD
NAおよび20-50μgの脂質を用いて）。所望であれば、遺伝構築物が組換えのため
の配列を含むようにデザインして、遺伝構築物のすべてまたは一部が哺乳類のゲ
ノムに取り込まれるようにして、MHCクラスＩ経路関連蛋白質の発現が阻害され
るようにしてよい。アンチセンス遺伝子の哺乳類細胞ゲノムへの取り込みは、該
アンチセンス遺伝子が細胞において安定に発現されるという利点を提供し、よっ
て、アンチセンス核酸の繰り返しの投与の必要性が減じられる。アンチセンス遺
伝子のそのような取り込みは、本発明が造血幹細胞上に抗原を提示するために用
いられる場合に特に望まれる（例えば、HIV感染を処置する方法において造血細
胞にてHIV抗原を発現させるため）。治療法において細胞中で遺伝子を発現させ
るためのさまざまな方法は公知であり、本発明の実施においてアンチセンス遺伝
子を発現させるために容易に適合されうる（例えば、引用により編入される米国
特許第5,399,346号を参照されたい）。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への導入：当業界において公知の方法
を用いることにより、ASオリゴヌクレオチドを細胞中に導入してよい。例えば、
非毒性カチオン脂質（例えば、LIPOFECTIN（商標名）（1:1（w/w）DOTMA：DOPE
））を用いることにより、ASオリゴヌクレオチドまたは遺伝子を細胞に導入して
よい。以下の実際の実施例においては、腫瘍細胞（対数期）またはスプレノサイ
トを最初に２回Opti-MEM培地（GIBCO，Grand Island，NY）中で洗浄した。細胞
の成長を支持する他の培養用培地をOpti-MEMと代えることができる。次に、細胞
をOpti-MEM培地中に懸濁して５-10×106細胞/mlの濃度にし、次に細胞を24ウエ
ルまたは６ウエルのプレートに加えた。LIPOFECTIN（1:1（w/w）DOTMA：DOPE）
を用いてChiang et al.の方法に従い（1991，J．Biol．Chem．266：18162-18171
）、オリゴヌクレオチドを細胞に到達させた。オリゴヌクレオチドおよびLIPOFE
CTIN（商標名）（1:1（w/w）DOTMA：DOPE））を所望の濃度においてOpti-MEM培
地に加え、そして12×75mmポリスチレンチューブ中で室温において20分間混合し
た。その結果のオリゴヌクレオチド−カチオン脂質複合体を細胞に加えて、最終
濃度400nMオリゴヌクレオチドおよび15μg/mlのLIPOFECTIN（商標名）（1:1（w/
w）DOTMA：DOPE））を達成して、細胞を37℃にて６-８時間インキュベートした
。一般に、オリゴヌクレオチド濃度は200-800、好ましくは200-500nMが適してい
る。10-40μg/mlのカチオン脂質濃度が一般には適切である。所望であれば、DNA
とカチオン脂質複合体を細胞と共に６時間以上（例えば、24から48時間）インキ
ュベートして複合体形成を促進してよい。
以下の実施例において、インキュベート後に細胞を洗浄して、次に28℃におい
て24-48時間インキュベートした。次に、細胞をフローサイトメトリーによりMHC
クラスＩ発現に関してアッセイしたか；別法により、細胞をCTL応答の誘導のた
めの刺激剤として用いた。所望であれば、他の非脂質に基づく方法を用いてASオ
リゴヌクレオチドまたは遺伝子を細胞に導入してよい。例えば、エレクトロポレ
ーションが適切であり；別法として、高濃度（例えば、4-30μM）のオリゴヌク
レオチドと共に細胞をインキュベートすることもASオオリゴヌクレオチドの細胞
への導入に有用である。もちろん、これらの方法の組み合わせも使用することが
できる。
リボザイム：MHCクラスＩ経路関連蛋白質の細胞内発現の阻害は、MHCクラスＩ
経路関連蛋白質をコードするmRNAを分断するようにデザインされたリボザイムを
細胞に導入して達成することもできる。例えば、ハンマーヘッドリボザイムは、
リボザイムのハンマーヘッドの周辺のアームがMHCクラスＩ経路関連蛋白質をコ
ードするmRNAの一部に相補であるように慣用法を用いて構築できる。リボザイム
の例えばレトロウイルスからの発現は、RNA触媒並びに標的RNA配列の分断に通じ
る（例えば、Sullenger and Cech，1993，Science 262：1566-1569を参照された
い）。好ましくは、周辺アームは15-25ヌクレオチドの長さである。所望であれ
は、リボザイムは、好ましいASオリゴヌクレオチドに対応する配列を含む周辺ア
ームを有するハンマーヘッドリボザイムを含むようにデザインできる。一般に、
周辺アームはMHCクラスＩ経路関連蛋白質をコードするmRNAの５’のほとんどの
領域に相補であることが好ましい。
おとりのRNAs：おとりのRNAは細胞中におけるMHCクラスＩ経路関連蛋白質の発
現（即ち、機能）の阻害に用いることができる。通常はRNAsに結合しない蛋白質
のおとりRNAsを同定する方法は記載されている（例えば、Doudna et al.，1995
，Proc．Natl．Acad．Sci．2355-2359を参照されたい）。簡単に言えば、標的の
MHCクラスＩ経路関連蛋白質を結合する能力に基づいて、おとりのRNAsを最初に
選択する。この方法において、予め選択された配列を周辺に有する約40のランダ
ムヌクレオチド（各々の位置において等モルのＡ，Ｇ，Ｃ，およびＵを有する）
を有するRNAオリゴヌクレオチドの貯蔵物を標的MHCクラスＩ経路関連蛋白質（例
えば、TAP-1）と共にインキュベートする。MHCクラスＩ経路関連蛋白質を結合す
るRNAsを単離して（例えば、蛋白質／RNA複合体の免疫沈殿により）、そして増
幅する（例えば、cDNA合成および転写のための予め選択された周辺配列に相補な
プライマーを用いて）。好ましくは、選択の続くサイクル（例えば、10サイクル
）はその結果のRNAを用いて実施する。RNA分子の初期貯蔵物は完全にランダムな
配列を含むので、すべての可能性のあるおとりRNAsをこの方法によりスクリーン
する。この方法により選択されたおとりのRNAsは細胞に導入することができ（例
えは、レトロウイルスベクターからRNAを発現させることにより）、そしてMHCク
ラ
スＩ分子の細胞表面の発現は本明細書に記載されるとおりに測定できる。
プロテアゾーム（proteasome）阻害剤：さまざまなプロテアゾーム阻害剤が当
業界において公知であり、本発明において使用できる。好ましい阻害剤は、MHC
分子上にペプチドを提示する過程の間に通常は分解される蛋白質を分解する20S
または26Sプロテアゾームの能力を阻害（または妨害）するものとして同定され
た化合物である（Rock et al.，1994，Cell 78：781-771；Orino et al.，1991
；Goldberg et al.，1992；Hershko and Ciechanover，1992；Rechsteiner et a
l.，1993を参照されたい）。好ましくは、プロテアゾーム阻害剤はSuc-Leu-Leu-
Val-Tyr-AMC（配列番号１０）の加水分解の競合阻害剤である（Rock et al.，19
94，Cell 78：761-771）。好ましい阻害剤の例はペプチドアルデヒド
およびMG132：N-Cbz-L-Leu-L-Leu-Leu-H
を含む。
他の好ましいプロテアゾーム阻害剤は以下を含む
ラクタシスチン：
CEP690，CEP1508，CEP1612，CEP1513，およびCEP1612：
CEP1601も含まれる。
プロテアゾーム阻害剤を本発明に用いる際、阻害剤は典型的には1.0μMから50
μMの濃度において細胞に接触させる。MG132は、特に可能性のある阻害剤であり
、そして即ち100nMから1,000nM、好ましくは500nMから800nMのように低い濃度に
おいて用いることができる。本発明において使用されるプロテアゾーム阻害剤は
、本明細書に記載されるとおり、細胞が抗原性ペプチドと接触する前に30から12
0分間細胞と接触したままにさせられる。随意には、細胞を抗原性ペプチドと接
触させるのに先立ち、細胞を洗浄することができる（例えば、細胞培養培地を用
いて）。
細胞系：本発明を用いることにより、ヒトまたは他の哺乳類（例えば、マウス
）に由来するさまざまな細胞上に抗原を提示することができる。一般に、MHCク
ラスＩ分子またはHLA抗原決定基が相対的に高いレベルで発現される細胞（例え
ば、マクロファージ）は、MHC分子またはHLA抗原決定基が相対的に低いレベルで
発現される細胞より好ましい。細胞は初期細胞でありうるか、または確立された
細胞系の細胞であってよい。一般に、飲食作用が活性な細胞は、飲食細胞をあま
り示
さない細胞に比して、より効率よくASオリゴヌクレオチトまたはAS遺伝子を取り
込む。特に有用な細胞は、初期マクロファージ、未成熟樹状細胞、およびマクロ
ファージ由来の細胞系の細胞を含む。以下の実際の実施例において使用したRMA
およびRMA-S細胞はC57BL/6（H-2b）を起源とするローシャー白血病ウイルス誘導
Ｔリンパ腫RBL-5に由来する（Ljunggren et al.，1985，J．Exp．Med．162：174
5-1759）。実際の実施例は初期細胞およびEL4細胞（C57BL/6，H-2b，胸腺腫）も
用いた。
本発明において用いた細胞は、標準法、例えばFreshneyに記載された方法（19
87，Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Techniques，2nd ed．Alan
R．Liss，Inc.，New York，NY）に従い、培養物中に維持することができる。以
下の実施例において、すべての細胞は、10％ウシ胎児血清（FCS）、10mM Hepes
，２mM L-グルタミン、および１mMピルビン酸ナトリウムを付加したDMEM中に維
持された。E.G7-OVA細胞は400μg/ml G418（GIBCO，Grand Island，NY）を付加
した培地中に維持した。
細胞の酸処理：以下に要約したあるいくつかの実施例において、本発明の細胞
は、最初に酸処理（即ち、洗浄）し、次にペプチドで処理して細胞表面上の抗原
密度を増加させた細胞と比較した。これらの実施例において、RMA細胞またはス
プレノサイト（２×107細胞）を照射し、洗浄し、そして次に、25mM Hepes／５
％ FCSを付加して濃縮HClによりpH3.0に調整したRPMI 1640 ５ml中にゆっくりと
懸濁した（Current Protocols in Immunology，Coligan et al.，eds．John Wil
ey & Sons，Inc．New York，NYを参照されたい）。酸処理した細胞を遠心分離し
て、直後に10％ FCSおよび所望のペプチド10μMを付加したIMDM培地に懸濁した
。そのような比較は本発明を実施するために必要ではないが、本発明に従い生成
された細胞と酸処理法により生成した細胞の比較は、本発明の細胞（即ち、細胞
上の抗原密度）の効能の便利な指標を提供する。
抗原性ペプチド：本発明の実施においては、慣用法を用いることにより、ペプ
チドと共にインキュベートした細胞にハプロタイプがマッチしたかまたはミスマ
ッチしたペプチド（即ち、抗原またはCTLエピトープ）を予測、同定、および／
ま
たは製造することができる（例えば、Engelhard，1994，Current Opinion in Im
munology 6：13-23を参照されたい）。一般に、６から15アミノ酸、好ましくは
８から10アミノ酸の長さのペプチドは抗原として適している。さまざまな免疫応
答において提示された抗原の例は表２に提供され；さらなる例は当業界において
公知である（例えば、Engelhard，前出を参照されたい）。細胞表面上における
これらのあらゆるペプチドの提示により、CTL応答をインビトロまたはインビボ
において刺激するのに該細胞が用いられる。以下に記載された実施例において、
チキンのオバルブミンのアミノ酸257-264 SIINFEKL（H-2Kb）（配列番号１１）
に対応する合成ペプチドをハプロタイプ−マッチペプチドとして用いた。さらに
、インフルエンザ核蛋白質のCTLエピトープに対応する合成ペプチド：アミノ酸5
0-57 SDYEGRLI（H-2Kk）（配列番号１２）、アミノ酸147-155 TYQRTRALV（H-2Dd
）（配列番号１３）、およびアミノ酸366-374 ASNENMETM（H-2Db）（配列番号１
４）（Engelhard，1994，前出）も使用した。これらのペプチドはブロックされ
ていない（即ち、遊離の）アミノおよびカルボキシル末端を有し、そして商業上
の供給者（例えば、Research Genetics，Birmingham，AL）により製造される。
これらのペプチドは血清不含IMDMに溶解して−20℃において保存した。所望であ
れば、他の標準細胞培養培地をペプチドの調製に用いてよい。一般に、ASで処理
した細胞は、抗原ペプチドで該細胞を「パルス」するのに先立ち、照射する。５
-100μM、奸ましくは５-20μM（例えば、10μM）のペプチド濃度が、ペプチドに
よる細胞のパルスに適している。ペプチドによる細胞のパルスのためには、培地
中にて28℃において１から24時間（例えば、４時間）、好ましくは６から12時間
のインキュベーション時間が適している。
OVA特異的CTLのインビトロにおける誘導：本発明の細胞を用いることにより、
インビトロにてCTL応答を刺激することができる。以下に提供される実施例にお
いては、天然のC57BL/6メスの引退した育種家のマウスから得たスプレノサイト
を最初に塩化アンモニウムTrisバッファー（pH7.2）で３分間37℃において処理
して、赤血球細胞のサンプルを枯渇した。次に、細胞を、10％ FCS，２mM L-グ
ルタミン、100IU/ml ペニシリン、100mg/mlストレプトマイシン、5×10-5M β-
メルカプトエタノール、および１mM ピルビン酸ナトリウムを付加したRPMI 1640
に懸濁した。次に、37℃における２回の90分ラウンドの粘着により、サンプルを
粘着性細胞のために富裕にした。未分画スプレノサイト、粘着性細胞、および非
粘着性細胞は個別にオリゴヌクレオチド−カチオン脂質複合体で処理して、CTL
応答の誘導のための刺激剤細胞を生じさせた。Ｂ細胞は、抗Ｉｇコートプレート
上に広げることにより、非粘着性集団（ＢおよびＴ細胞）から分離した。Ｂ細胞
の分離後に残った細胞集団は、FACS分析によれば、少なくとも80％のＴリンパ球
からなった。この細胞集団を応答物（responder）のＴ細胞として用いた。
以下の実施例において、腫瘍細胞系およびスプレノサイトは、上記のとおりに
オリゴヌクレオチドおよびLIPOFECTIN（商標名）（1:1（w/w）DOTMA：DOPE）で
処理して、洗浄して、そして次に20-24時間28℃においてインキュベートした。
細胞を洗浄し、10％ FCS付加IMDMに懸濁し、そして7,500ラッド（RMAまたはRMA-
S細胞に関して）または3,000ラッド（スプレノサイトに関して）にて照射した。
次に、細胞を１回洗浄し、CTL誘導の刺激剤として用いる前に、10％ FCS，１mM
ピルビン酸ナトリウム，100IU/ml ペニシリン、100mg/mlストレプトマイシン、5
×10-5M β-メルカプトエタノール、および10μM OVAペプチド（または対照ペプ
チド）を付加したRPMI 1640中にて、４時間、28℃において前培養した。一般に
は、５-100μM、好ましくは５-20μMの抗原ペプチド濃度が適している。
C57BL/6膵臓から単離した天然Ｔ細胞を５×106細胞/mlにおいて完全IMDM培地
に懸濁して、インビトロにおける初期OVA特異的CTL誘導の応答物として用いた。
一定数のＴ細胞（５×105細胞/100μl）を、５日間37℃において刺激剤（100μl
中）と共にさまざまな応答物対刺激剤（R/S）比において96ウエルのＵ底組織培
養プ
レート中において培養した。エフェクターは、フィコール、タイプ400、および
ジアトリゾエートナトリウムを1.083の密度で含むHISTOPAQUE（商標名）1083（S
igma，St．Lｏuis，MO）勾配上の５日間の培養後に回収した。
細胞毒性アッセイ：抗原提示細胞が特定のCTL応答を刺激する可能性は、エフ
ェクター細胞が標的細胞を溶解する可能性をアッセイすることにより測定できる
。他の共通に用いられる細胞毒性アッセイを、以下の実施例において用いたユー
ロピウム放出アッセイに代えて用いてよい。ここで、５-10×106の標的細胞をユ
ーロピウムジエチレントリアミン５酢酸で20分間４℃において標識した。何回か
の洗浄後、104のユーロピウム標識標的物および50：１から6.25：１の範囲のエ
フェクター：標的物比のエフェクター細胞の連続希釈物を、10％熱不活性化FCS
を含むRPMI200μl中にて96ウエルのＵ底プレート中においてインキュベートした
。プレートは500×gにて３分間遠心分離して、次に37℃にて５％CO2中において
４時間インキュベートした。上清の50μlアリコートを回収して、時間分解蛍光
（time resolved fluorescence）によりユーロピウム放出を測定した（Volgmann
et al.，J．Immunol．Methods 119：45-51，1989）。ユーロピウムの自発放出
は25％未満であったし、３分割培養物の平均の標準誤差は５％未満であった。
フローサイトメトリー分析：MHCクラスＩ分子の細胞表面の発現は、適切な抗
体により染色した細胞のフローサイトメトリーにより検出することができる。以
下の実際の実施例は、以下のモノクローナル抗体：精製された抗マウスH-2Db（
クローン28-8.6）、FITC配合抗マウスH-2Kb（クローンAF6-88.5）、FITC配合抗
マウスH-2Kk（クローンAF3-12.1）、およびFITC配合抗マウスH-2Kd（SF1-1.1）
を用いた。これらのすべての抗体は市販されている（例えば、Pharmingen，San
Diego，CA）。ヒトのHLA抗原決定基の細胞表面発現を検出する抗体も市販されて
いる（例えば、Becton-Dickinson）。実施例も、ロバの抗マウスIgG(H+L)のFITC
配合F(ab')2断片を用いた（Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove
，PA）。
以下の実際の実施例においては、約106の細胞を３％ウシ血清アルブミン（BSA
）含有PBS中にて適切な濃度の一次抗体と共に、30分間、４℃においてインキュ
ベ
ートした。細胞を洗浄して、必要であれば、二次抗体と共に、氷上で、30分間イ
ンキュベートし、次に３％BSA含有PBSで洗浄してこれに懸濁した。対照として、
細胞はアイソタイプの抗体で染色した。MHCクラスＩの発現はFACScan蛍光活性化
セルソーター（Becton Dickinson & Co.，Mountain View，CA）上で分析した。
マウス：以下の実際の実施例は、ジャクソンラボラトリー（Bar Harbor，ME）
から得た５から７週齢のC57BL/6マウス(H-2b)を用いた。生きた腫瘍細胞をマウ
スに注射した場合、これらのマウスは本発明の細胞が腫瘍形成からの保護を提供
する能力をアッセイするのに有用な腫瘍形成の動物モデルを提供した。他のハプ
ロタイプのマウスも本発明の実施に使用してよい。例えば、BALB/cマウスはH-2d
バックグラウンドを提供し、CBAマウスはH-2kバックグラウンドを提供する。
以下の実際の実施例は本発明の例示のために提供され、限定するためのもので
はない。実施例Ｉ：TAP-2アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたTAP-2機能の阻害
MHCクラスＩ経路関連蛋白質に対するASオリゴヌクレオチドが遺伝子機能を阻
害して生物学上関連のある表現型を細胞において生じうることを証明するために
、我々は、TAP-2のASオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたRMA細胞の表現
型を同定した。最初の実験において、ASオリゴヌクレオチドであるAS-1，AS-2，
AS-3およびAS-4を、上記の脂質介在トランスフェクト法を用い、別々にRMA細胞
に導入した。次に、フローサイトメトリーを用いることにより、処理細胞上にて
MHCクラスＩ分子の細胞表面発現を示すグラフを生じさせた。陰性対照として、R
MA細胞をアイソタイプ抗体で染色し（図１Ａ）；FITC標識抗体を陽性対照として
用いた（図１Ｂ）。本明細書に要約されたデータは、AS-1またはAS-2で処理した
RMA細胞の約30％がMHCクラスＩの細胞表面発現における減少を示したとの証拠を
提供する（それぞれ、図１Ｃおよび１Ｄ）。対照的に、AS-3またはAS-4で処理し
たRMA細胞は、これらの実験においてMHCクラスＩ発現の減少を示さなかったこと
から、それらはTAP-2のRNAを脱安定化しないことが示唆される（それぞれ図１Ｅ
および１Ｆ）。即ち、この実施例は、AS-1およびAS-2がMHCクラスＩ分子の細胞
表面発現を阻害できることを示す。
TAP-2のASオリゴヌクレオチドが生物学上関連のある様式においてTAP-2遺伝子
の発現を阻害できることのさらなる証拠を提供するために、TAP-2のASオリゴヌ
クレオチドで処理した細胞を、RMA-S細胞、TAP-2発現を欠損しており即ちMHCク
ラスＩ発現を欠損する変異細胞系と比較した。以前に報告されたとおり、RMA-S
細胞を37℃において生育させる場合には、MHCクラスＩ分子の細胞表面発現は本
質的に検出不可能である（図２Ａ）（Ljunggren et al.，1990，Nature 346：47
6-480）。しかしながら、MHCクラスＩ発現は温度を低下させてRMA-S細胞を生育
させることにより該細胞中に復帰させることができる（図２Ｂ）。変異細胞系に
おけるMHC発現とは対照的に、野生型RMA細胞上のMHCクラスＩ分子の発現は２つ
の温度で異ならない（図２Ｃおよび２Ｄ）。本明細書に提供されたデータから、
TAP-2アンチセンスオリゴヌクレオチド処理した野生型RMA細胞はTAP-2欠損RMA-S
細胞に匹敵する表現型を提示することを示す。この実施例において、AS-1処理し
たRMA細胞の50-55％は37℃におけるMHCクラスＩ発現の低下を示さなかった（図
２Ｅ）。TAP-2欠損RMA-S細胞の場合のように、AS-1処理RMA細胞におけるMHCクラ
スＩ発現の復帰は細胞を28℃において生育させることにより復帰する（図２Ｆ）
。従って、これらのデータは、TAP-2のASオリゴヌクレオチドを用いることによ
りRMA細胞表面上のMHCクラスＩ分子の発現を阻害できることの証拠を提供する。
またさらに別のアッセイにおいて、我々は、RMA-S細胞上のMHCクラスＩ発現の
場合のように、MHCハプロタイプのマッチしたペプチドと細胞を接触させること
により、AS-1処理したRMA細胞上のMHCクラスＩ発現が復帰可能であることを示し
た。この実施例において、37℃において生育させ且つAS-1処理されたRMA細胞上
のMHCクラスＩ発現は約40％減少した（図３Ｂ）。対照ASオリゴヌクレオチドで
あるCON-1はMHC発現に効果がなかった（図３Ａ）。AS-1処理RMA細胞とハプロタ
イプのミスマッチペプチド（H-2Kd）（図３Ｃ）または（H-2Kk）（図３Ｄ）のイ
ンキュベーションは、MHCクラスＩ発現を復帰させなかった。対照的に、AS-1処
理RMA細胞とハプロタイプのマッチしたペプチドNP（H-2Db）（図３Ｅ）またはNP
（H-2Kb）（図３Ｆ）のインキュベーションは、MHCクラスＩ発現を復帰させた。
要約すると、上記のデータは、TAP-2のASオリゴヌクレオチドによるRMA細胞の処
理はRMA-S細胞の表現型と極めて類似している細胞であるTAP-2変異細胞系の表現
型を提供することを示す。実施例II：EL4細胞上のMHCクラスＩ発現を阻害するためのTAP-2のASオリゴヌク レオチトの使用
この実際の実施例は、ASオリゴヌクレオチドを使用することにより、C57BL/6
（H-2b）の確立された胸腺腫細胞系であるEL4細胞の表面上におけるMHCクラスＩ
発現を阻害することができるとの証拠を提供する。EL4へのAS-1処理は30から60
％の細胞におけるMHCクラスＩ発現の減少をもたらした（図４Ｃと図４Ａを比較
されたい）。対照的に、EL4へのCON-1（対照オリゴヌクレオチド）処理はMHCク
ラスＩ発現に影響しなかった（図４Ｂと図４Ａを比較されたい）。さらに、この
実施例は、AS-1処理EL4細胞上におけるMHCクラスＩ分子の細胞表面発現が細胞を
28℃にインキュベートすることにより復帰できたことを示す（図４Ｄ）。MHCク
ラスＩ発現は細胞をハプロタイプのマッチしたペプチドOVA H-2Kbで処理するこ
とによっても復帰できたのに対して（図４Ｅ）、細胞のハプロタイプミスマッチ
ペプチドNP H-2Kk処理はMHCクラスＩ発現を復帰させなかった（図４Ｆ）。要約
すると、これらのデータは、TAP-2 ASオリゴヌクレオチドは第２の細胞種上にお
いてMHCクラスＩ発現を阻害できることを示す。実施例III：初期細胞上においてMHC発現を阻害するためのTAP-2アンチセンスオ リゴヌクレオチドの使用
以下のデータは、ASオリゴヌクレオチドを使用することにより初期細胞の表面
上においてMHC発現を阻害できるとの証拠を提供する。この実施例においては、
スプレノサイトをC57BL/6マウスから単離して37℃または28℃においてインキュ
ベートした（それぞれ、図５Ａおよび５Ｂ）。37℃においてAS-1処理されたC57B
L/6細胞の約30％はMHCクラスＩ発現の低下を示した（図５Ｃ）。RMA細胞およびE
L4細胞上におけるMHC発現に関する場合のように、MHCクラスＩの発現は細胞を28
℃において生育させることにより復帰できた（図５Ｄ）。
AS-1が他よりもスプレノサイトにおいてより効率よくMHC発現を阻害するか否
かを決定するために、上記のとおりに、スプレノサイトのサンプルを粘着性およ
び非粘着性集団に分画した。粘着性集団は主に抗原提示細胞例えば単球／マクロ
ファージおよび樹状細胞からなった。非粘着性集団はＴおよびＢリンパ球からな
った。粘着性集団の50％以上の細胞はAS-1処理された場合にMHCクラスＩ発現の
低下を示した（図５Ｅ）。他のAS-1処理細胞およびRMA-S細胞上におけるMHC発現
に関する場合のように、これらのAS-1処理粘着性細胞を28℃にてインキュベート
することにより、それら細胞中において細胞表面のMHC発現を復帰させることが
できた（図５Ｆ）。非粘着性細胞上におけるMHCクラスＩ発現もAS-1により阻害
されたが、低パーセンテージの細胞は影響された（図５Ｇ）。これらAS-1処理さ
れた非粘着性細胞の28℃におけるインキュベーションもMHCクラスＩ発現にを復
帰させた（図５Ｈ）。粘着性細胞対非粘着性細胞のTAP-2の阻害の違いはASオリ
ゴヌクレオチドの取り込み能力の違いに起因すると考えられ、粘着性分画におけ
る細胞はより飲食作用が強く、即ち非粘着性細胞よりも多くのASオリゴヌクレオ
チドを取り込むらしい。これらの実験は、AS-1処理初期スプレノサイトおよび特
に粘着性細胞が、TAP-2発現能力を欠損した細胞に匹敵する表現型を表すことを
示す。これらの結果は、哺乳類（例えば、ヒト）から単離した初期細胞を操作す
ることにより効能のある抗原提示細胞とすることが可能であることも示す。事実
、我々は、ヒト前駆体由来樹状細胞を配列番号３、４、５および６を有するTAP-
1またはTAP-2 ASオリゴヌクレオチドで処理した場合に、MHC発現の小さなダウン
制御も観察した。実施例IV：インビトロにおいてCTL応答を誘導するためのAS-1オリゴヌクレオチ ド処理RMA細胞の使用
以下の実施例は、TAP ASオリゴヌクレオチド処理して次にハプロタイプのマッ
チしたペプチドとインキュベートした細胞がインビトロのCTL応答の効能のある
刺激剤として作用することを示す。この実施例においては、スプレノサイトをAS
-1処理して次に上記のとおりオバルブミン（OVA）ペプチドと28℃においてイン
キュベートした。これらの細胞は応答物：刺激剤比４：１において、刺激剤とし
て用いた。その結果のエフェクター細胞は、次に、OVAペプチドを発現する標的
細胞の溶解能力に関してアッセイした。この場合、標的細胞はE.G7-OVA細胞であ
っ
たが、これはOVA遺伝子をトランスフェクトしたEL4細胞である。これらのアッセ
イは４つの異なるエフェクター：標的細胞比にて実施した。陽性対照として、TA
P-2欠損RMA-S細胞をハプロタイプのマッチしたOVAペプチドとインキュベートし
て次に刺激剤として用いた。各エフェクター：標的比において、ハプロタイプの
マッチしたOVAペプチドとインキュベートしたAS-1処理RMA細胞は効能のあるCTL
応答を刺激したが（図６、バー３）、RMA-S細胞により生じた応答に匹敵した（
図６、バー５）。対照的に、（ａ）対照オリゴヌクレオチドCON-1およびOVAペプ
チドで処理したRMA細胞（図６、バー１）、（ｂ）AS-1およびインフルエンザ核
蛋白質ペプチドで処理したRMA細胞（図６、バー２）、または（ｃ）OVAペプチド
で処理したがASオリゴヌクレオチドでは処理しなかったRMA細胞によっては何らC
TLが誘導されなかった。さらなる対照として、EL4細胞を標的物として用いたが
、CTL活性は検出されなかった。要約すれば、この実施例は、本発明がインビト
ロにおけるCTL応答誘導のための効率よい方法を提供することを示す。実施例Ｖ：インビトロにおいてCTL応答を誘導するためのASオリゴヌクレオチド 処理された初期スプレノサイトの使用
以下の実施例は、ASオリゴヌクレオチド処理された初期スプレノサイトもCTL
応答の効能のある刺激剤として作用することを示す。ここで、スプレノサイトは
AS-1で処理して次にOVAペプチドとインキュベートした。刺激されたCTLは、次に
、４つの異なるエフェクター：標的物の比においてE.G7-OVA細胞を溶解する能力
に関してアッセイした。さらに、スプレノサイトの粘着性および非粘着性画分を
CTL刺激能力に関してアッセイした。AS-1処理してハプロタイプのマッチしたOVA
ペプチドとインキュベートした粘着性スプレノサイトは効能のあるCTL刺激剤で
あった（図７、バー１）。未分画スプレノサイトおよびAS-1およびOVAペプチド
で処理した非粘着性スプレノサイトもCTL応答を刺激することができた（図７、
それぞれバー５および２）。対照的に、（ａ）対照オリゴヌクレオチドCON-1お
よびOVAペプチド、または（ｂ）AS-1およびインフルエンザ核蛋白質ペプチドで
処理したスプレノサイトは顕著な刺激を示さなかった（図７、それぞれバー３お
よび４）。即ち、これらの実験は、初期細胞が本発明において使用されてインビ
トロにて
CTL応答を誘導する抗原提示細胞を生成することが可能であるとの証拠を提供す
る。実施例VI：ASオリゴヌクレオチト処理細胞と酸処理細胞の比較
細胞表面上において抗原密度を増加させるための以前に記載された方法は、MH
CクラスＩ分子に結合させた非活性化（resident）のペプチドを除去するための
マイルドな酸洗浄を用いる。この非活性化ペプチドは次に好ましい抗原性ペプチ
ドにより置換される（Langlade-Demoyen et al.，International Immunology 6
：1759-1766，1994）。これらの酸処理細胞はインビトロにおいて初期CTL応答を
刺激することができる。上記のとおりに調製された酸処理細胞を用いて、我々は
TAP ASオリゴヌクレオチド処理細胞の抗原提示能力の比較評価を行った。これら
の実験は、２つの異なる応答物：刺激剤比において実施された：（ａ）８：１（
6.125×104のスプレノサイトと混合した５×105天然Ｔ細胞）、および（ｂ）４
：１（1.25×105のスプレノサイトと混合した５×105天然Ｔ細胞）。エフェクタ
ー：標的細胞の比は12.5：１から50：１の範囲であった。他の実施例におけると
おり、標的細胞はE.G7-OVA細胞であったが該細胞はOVAペプチドを発現する。応
答物：刺激剤比４：１において、AS-1処理細胞はCTL応答の刺激に関して、酸処
理細胞より効果的かあるいは同等であった（図８Ａ）。応答物：刺激剤比８：１
において、酸処理細胞はCTL応答刺激能力の低下を示した（図８Ｂ、バー２）の
に対して、AS-1処理細胞は効能のある刺激剤のままであった（図８Ｂ、バー１）
。全体で、これらのデータは、TAP-2アンチセンスオリゴヌクレオチド処理され
た細胞がCTL応答刺激において酸処理細胞よりも効果的であるとの証拠を提供し
、それにより、本発明の抗原提示細胞が高い抗原密度を有することを示唆する。実施例VII：インビボにおいてCTL応答を生じるためのAS-1処理細胞の使用
我々は、TAP ASオリゴヌクレオチドおよび適切なペプチドで処理した細胞がイ
ンビボにおいてCTL応答を刺激して疾患動物モデルにおいて保護免疫を提供する
ことを発見した。腫瘍細胞および初期スプレノサイトの粘着性画分中の細胞を洗
浄して、AS-1または対照オリゴヌクレオチドおよびLIPOFECTIN（商標名）（1：1
（w/w）DOTMA：DOPE）で上記のとおり処理した。次に、細胞を洗浄して10％FCS
含有IMDMに懸濁して、20,000ラット（E.G7-OVAおよびEL4細胞に関して）、7,500
ラッド（RMA細胞に関して）または3,000ラッド（スプレノサイトに関して）で照
射した。細胞を１回洗浄して、OVAペプチドまたは対照ペプチドNP（H-2Db）と共
に、４時間、28℃において、10％FCSおよび１mMピルビン酸ナトリウムを付加し
たIMDM中でインキュベートした。４時間後、マウスへの注射前に細胞を２回洗浄
してPBSに懸濁した。天然の同系C57BL/6マウスを免疫するために、500μl中の２
×106のAS-1およびOVAペプチド処理したRMA細胞またはスプレノサイトを各マウ
スに注射した。E.G7-OVAおよびEL4細胞はマウスあたり５×106細胞のレベルにお
いて注射した。
７-10日後、免疫したマウスのスプレノサイトを回収し、そしてサンプルは赤
血球を空にした。次に、1.5×107のスプレノサイトを１×106照射E.G7-OVA刺激
剤細胞（20,000ラッド）と共に、6ウエルの組織培養プレート中のウエルあたり
５mlの10％ FCS，１mMピルビン酸ナトリウム、100IU/mlペニシリン、100mg/mlス
トレプトマイシン、および５×10-5M β-メルカプトエタノール付加IMDM中で培
養した。細胞は５日間37℃にて５％CO2中でインキュベートし、そしてエフェク
ターは５日目にHISTOPAQUE（商標名）1083勾配上に回収したが、フィコール、タ
イプ400、および1.083の密度のジアトリゾエートナトリウムを含む（Sigma，St
．Louis，MO）を含んだ。
OVAペプチドとインキュベートしたAS-1処理枯着性スプレノサイトはE.G7-OVA
標的細胞の高レベルの溶解を誘導した（図９、ライン４）。さらに、２×106AS-
1処理粘着性スプレノサイトによる免疫は５×106E.G7-OVA細胞による免疫よりも
効果的であったことから（図９、ライン４と３の比較）、粘着性スプレノサイト
はE.G7-OVAより効能があることが示唆され、そして抗原密度はE.G7-OVA細胞上よ
り粘着性スプレノサイト上の方が高いことが暗示される。ハプロタイプのマッチ
したOVAペプチドとインキュベートしたAS-1処理RMA細胞もCTL応答の強い刺激剤
であった（図９、ライン９）。これらの細胞から生じたCTL応答は、E.G7-OVA細
胞により生じた応答（図９、ライン３）およびOVAペプチドとインキュベートし
た酸処理粘着性スプレノサイトにより生じた応答（図９、ライン７）と同等であ
っ
た。対照オリゴヌクレオチドCON-1で処理して次にOVAペプチドとインキュベート
した粘着性スプレノサイトは弱いCTL応答を生じた（図９、ライン６）。この応
答は、粘着性細胞集団中に高いレベルで存在するマクロファージおよび樹状細胞
の抗原提示能力に起因するらしい。EL4細胞、PBSまたは対照ペプチドNP（H-2Db
）とインキュベートした細胞を免疫したマウスにおいては顕著なCTL応答は検出
されなかった。全体で、これらの実験は、MHCクラスＩ経路関連蛋白質に対するA
Sオリゴヌクレオチドで処理されて次にハプロタイプのマッチした抗原性ペプチ
ドとインキュベートされた細胞は、インビボにおいてCTL応答を刺激するのに用
いることができることを示す。実施例VIII：インビボにおいて免疫保護を提供するためのAS処理細胞の使用
以下のインビボ実験は、本発明の抗原提示細胞が腫瘍攻撃に対しての保護を提
供するとの証拠を提供する。これらの実験においては、C57BL/6マウスを、一度
、２×106照射AS-1処理粘着性スプレノサイトまたはRMA細胞、または５×106のE
.G7-OVAまたはEL4細胞で免疫した。免疫後10日目に、マウスは皮下周辺領域にて
注射された２×107の生きたE.G7-OVA細胞により攻撃され；生きた腫瘍細胞のこ
の投薬量は非免疫マウスにおいて腫瘍を引き起こすことができる。マウスは腫瘍
成長および腫瘍サイズに関して監視されて、直径3.5cmの腫瘍を有するマウスを
犠牲にした。すべての生存固体を攻撃後40日目に犠牲にした。
陰性対照として、マウスを、（ａ）PBS、（ｂ）EL4細胞または（ｃ）AS-1およ
びインフルエンザ核蛋白質（NP）ペプチド処理粘着性スプレノサイトを接種した
。10日以内に、各々の陰性対照群中のマウス全５匹（PBS、EL4細胞、および粘着
性スプレノサイト／AS-1＋NP；図１０Ａ、バー１、２および５）は３から3.5cm
の直径の腫瘍を発生した。対照的に、ハプロタイプのマッチしたOVAペプチドと
インキュベートされた粘着性AS-1処理スプレノサイトで免疫されたマウス全５匹
においては腫瘍攻撃からの保護が明らかであった（図１０Ａ、バー４）。これら
５匹のマウスの内の４匹（図面中ドットにより示される）は35日間の研究の間、
腫瘍攻撃から完全に保護された（図１０Ｂ、バー４）。５番目の保護マウスの腫
瘍はゆっくりと発生して未保護マウスの腫瘍のたった半分のサイズにしかならな
かっ
た。
腫瘍攻撃に対する保護も、ハプロタイプのマッチしたOVAペプチドとインキュ
ベートされたAS-1処理RMA細胞で免疫されたマウスに関して明らかであった（図
１０Ａおよび１０Ｂ、バー６）。これら５匹のマウスのうち２匹は腫瘍形成に対
して完全に保護された。35日目、残りの３匹において発生した腫瘍（図１０Ｂ、
バー６）は実質的に対照マウスの腫瘍より小さかった（図１０Ｂ、バー１、２お
よび５）。インビトロ実験のように、処理された粘着性スプレノサイトはインビ
ボにおいて最も効能のある免疫応答を生じた。これらのデータは、インビトロと
インビボの結果の間の相関の証拠を提供する。この実施例において、E.G7-OVA細
胞が高度に免疫原性であって腫瘍攻撃に対して免疫を誘導することができたとし
ても、２×106AS-1処理粘着性スプレノサイトは再び５×106E.G7-OVA細胞より効
果的であった（図１０Ａおよび１０Ｂのバー３と４を比較されたい）。一般に、
105の生きたE.G7-OVA細胞による１回の免疫、または５×106照射細胞による３回
の免疫は強いCTL応答を引き出して２×107の生きたE.G7-OVA細胞による腫瘍攻撃
からの完全な保護を提供する。要約すれば、これらの実験は、MHCクラスＩの発
現を阻害するASオリゴヌクレオチドで処理されて次にハプロタイプのマッチした
ペプチドとインキュベートした細胞がインビボCTL応答の効能のある刺激剤であ
ることを示す。腫瘍形成のこの動物モデルを用いて、本発明の細胞は腫瘍形成を
阻害または完全に妨害した。実施例IX：抗原提示細胞の生成におけるプロテアゾーム阻害剤の使用
この実施例は、プロテアゾーム阻害剤を用いることにより効能のある抗原提示
細胞の生成においてMHCクラスＩ経路関連成分の活性を阻害できることを示す。
この実施例において、MHCクラスＩ経路関連成分の活性は、2.5-5.0×106の前駆
体樹状細胞を１時間１ml中において24ウエルのプレート中にて700nMの濃度のプ
ロテアゾーム阻害剤MG132（Myogenics，Inc.，Cambridge，MA）と接触させるこ
とにより阻害された。次に該細胞を50μg/mlの濃度の抗原性ペプチドおよびβ2
マイクログロブリン（３μg/ml）に３−６時間接触させて、それにより抗原提示
細胞を生成した。この実施例において、ペプチドはアミノ酸配列CINGVCWTV（配
列
番号１５）を有したが、該配列はＣ型肝炎ウイルス（HCV）のNS3蛋白質のアミノ
酸1077-1085に相当する。その結果の抗原提示細胞をDC/MG132+HCV pepと呼ぶ。
比較のため、HCVペプチドを用いて抗原提示細胞も生成することにより、プロ
テアゾーム阻害剤に暴露されなかった前駆体由来樹状細胞に接触させた。その結
果の細胞をDC+HCV pepと呼ぶ。また、比較のため、前駆体由来樹状細胞をLMP2A
蛋白質のアミノ酸426から434に相当するアミノ酸配列CLGGLLTMV（配列番号１６
）を有するエプスタインバールウイルス（EBV）ペプチドに接触させることによ
り、抗原提示細胞を生成した。上記のとおり、2.5-5.0×106の細胞を用いて、ペ
プチドは50μG/mlにて用いた。その結果の細胞をDC+EBV pepと呼ぶ。各々の場合
において、前駆体由来樹状細胞を３μg/mlのβ2-ミクログロブリン存在下でペプ
チドでパルスした。β2ミクログロブリンは任意であるが、β2ミクログロブリン
を含むのが好ましい。
さまざまな抗原提示細胞（DC/MG132+HCV pep，DC+HCV pep，およびDC＋EBV pe
p）を別々に初期CTL誘導における刺激剤として用いた。CTLを生じさせるために
用いたPBMCはHLA-Ａ2のヒトから得たが、抗原性ペプチドと接触させた前駆体由
来樹状細胞に自己由来であった。CTL誘導は、応答物：刺激剤比10：１において1
0ng/ml IL-7および20 U/ml IL-2存在下においてPBMCに接触させることにより実
施した。細胞を12日間増殖させて12日目にCD8+細胞を選択してIL-2（20 U/ml）
存在下において48時間培養した。14日目、応答物：刺激剤比10：１においてIL-7
およびIL-2の存在下でCD8+芽細胞を再刺激した。細胞培養（37℃）から全部で20
日目後に、CTLの標的細胞溶解能力に関してアッセイした。
CTLアッセイにおいて、標的細胞は、50μg/mlのHLA-A2ペプチド（図１１Ａ）
または50μg/mlのEBVペプチド（図１１Ｂ）でパルスされたT2細胞であった（Sal
ter et al.，Immunogenetics 21：235-246）。MG132およびHCVペプチドと接触さ
せた樹状細胞（DC/MG132+HCV pep）は、MG132と接触させなかった細胞（DC+HCV
pep；図１１Ａ）よりも、HCVペプチドを含んだ標的細胞に対するより効能のある
CTL応答を刺激した。陰性対象細胞（DC+EBV pep）は顕著なCTL応答を刺激しなか
った。望まれるとおり、該細胞により生じたCTL応答は該細胞をパルスするのに
用
いた抗原性ペプチドに特異的である。EBVペプチドを含む標的細胞を用いる場合
、EBVペプチドをパルスした樹状細胞（DC+EBV pep）はCTL応答を刺激したが、HC
Vペプチドをパルスした樹状細胞（DC/MG132+HCV pepおよびDC+HCV pep）は顕著
なCTL応答を刺激しなかった（図１１Ｂ）。要約すれば、この実施例は、効能の
ある抗原提示細胞は（ｉ）細胞をプロテアゾーム阻害剤に接触させることにより
MHCクラスＩ経路関連成分を阻害し、そして（ii）該細胞を抗原性ペプチドと接
触させることにより生成できることを示す。そのような細胞を用いることにより
、効能のある抗原に特異的なCTL応答を刺激することができる。使用
本発明は、その表面上に増加した密度の好ましい抗原を生じる細胞を生じさせ
る方法を提供し、そしてそのような細胞を用いることにより効能のあるCTL応答
を刺激することができる。前に要約された比較アッセイは、抗原が本発明の細胞
上に高い密度で存在することを暗示する。一般に、抗原提示細胞上のすべてのペ
プチドの10％以上、好ましくは20％以上を構成する抗原は高い密度で存在すると
考えられる。本発明により生成された抗原提示細胞を用いることにより、インビ
トロおよびインビボにおいてCTL応答を刺激することができる。本発明の抗原提
示細胞を哺乳類に投与するなら、細胞表面抗原に対して細胞介在免疫応答を引き
出すのに該細胞は有用であり、そして即ち該抗原提示細胞は広くさまざまな疾患
状態の処置におけるワクチンまたは治療剤として用いることができる。即ち、本
発明は限定されないが、癌（例えば、悪性腫瘍またはカルシノーマ例えばメラノ
ーマ、乳癌および結腸直腸癌）を処置する方法を含む。また病原体例えばバクテ
リア（例えば、サルモネラ、赤痢菌またはエンテロバクター）またはウイルス（
例えば、ヒト免疫不全ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、
ポリオウイルス、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、または風疹ウイルス）
に感染した哺乳類の処置方法も包含される。
疾患または感染に悩まされる哺乳類の処置において、該哺乳類に投与された細
胞が哺乳類由来である必要はない。即ち、抗原提示細胞はマッチしたドナーまた
はインビトロで生育させた細胞培養物から得ることができる。ハプロタイプをマ
ッ
チさせる方法は当業界において公知である。
処置は、疾患または感染の前または発症時に開始して、疾患または感染が改善
されるまで続けることが好ましい。本発明により生成された細胞またはワクチン
による哺乳類の処置において、ワクチンまたは細胞の最適な投与量は、哺乳類の
体重、疾患の重度およびCTLエピトープの強さ等の因子に依存する。インビトロ
において維持された細胞の投与に先立ち、細胞は一般にPBSで洗浄して培養培地
を除去する。一般に、105から106細胞／ｋｇ体重、好ましくは106から107細胞／
ｋｇ体重の投与量を薬剤上受容可能な賦形剤中にて患者に投与する。抗原提示細
胞は、癌治療において用いられている注入技術を用いて投与することができる（
例えば、Rosenberg et al.，New Eng．J．of Med．319：1676，1988）。特定の
患者に対する最適な投与量および処置養生法は、疾患の兆候に関して患者を監視
してそれに従い処置を適合させることにより、薬学の分野の当業者により容易に
決定されうる。
抗原提示細胞を用いてCTLをインビトロにおいて誘導する場合、CTLに基づく治
療法（例えば、PCT/US91/06441を参照されたい）においてその結果のエフェクタ
ーCTLsを次に哺乳類に投与する。本発明の抗原提示細胞を用いてインビトロにお
いて生成したCTLは薬学上受容可能な賦形剤中にて慣用的注入法（例えば、Rosen
berg et al.，前出）を用いて哺乳類に投与できる。典型的には、109-1010の細
胞を30分間にわたって投与し、必要であれば処置を繰り返す。そのようなCTLに
基づく治療法は他の方法、例えば本発明の抗原提示細胞の直接投与と組み合わせ
てよい。CTLおよび抗原提示細胞は治療を受ける哺乳類の自己由来または異種由
来であってよい。所望であれば、処置はマイトジェン（例えば、フィト−ヘマグ
ルチニン）またはリンホカイン（例えば、IL-2，IL-2および/またはIL-4）の投
与も含むことによりCTL増殖を高めてよい。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．細胞に接触させたペプチドの提示を変更するために、細胞のペプチドへの 接触前に細胞中のＭＨＣクラスＩ経路関連成分の活性を阻害することからなる方 法。 ２．ＭＨＣクラスＩ経路関連成分がＴＡＰ蛋白質である、請求項１記載の方法 。 ３．ＭＨＣクラスＩ経路関連成分がＬＭＰ蛋白質である、請求項１記載の方法 。 ４．ＬＭＰ蛋白質がＬＭＰ２およびＬＭＰ７からなる群から選択される、請求 項３記載の方法。 ５．ＭＨＣクラスＩ経路関連成分が熱ショック蛋白質である、請求項１記載の 方法。 ６．熱ショック蛋白質がｇｐ９６、ＨＳＰ９０およびＨＳＰ７０からなる群か ら選択される、請求項５記載の方法。 ７．ＭＨＣクラスＩ経路関連成分がプロテオゾームである、請求項１記載の方 法。 ８．プロテオゾームが２６Ｓプロテオゾームである、請求項７記載の方法。 ９．プロテオゾームが２０Ｓプロテオゾームである、請求項７記載の方法。 １０．請求項１記載の方法により生成された細胞。 １１．ＭＨＣクラスＩ経路関連蛋白質の発現を減じるアンチセンスオリゴヌク レオチドを含む細胞。 １２．ＭＨＣクラスＩ経路関連蛋白質の発現を減じるアンチセンス遺伝子を含 む細胞。 １３．阻害が、ＭＨＣクラスＩ経路関連蛋白質をコードするｍＲＮＡのすべて または一部に相補なアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入することによ りＭＨＣクラスＩ経路関連蛋白質の翻訳を阻害することからなる、請求項１記載 の方法。 １４．阻害が、ＭＨＣクラスＩ経路関連蛋白質をコードするｍＲＮＡのすべて または一部に相補なＲＮＡをコードするアンチセンス遺伝子を細胞に導入するこ とによりＭＨＣクラスＩ経路関連蛋白質の翻訳を阻害することからなる、請求項 １記載の方法。 １５．病原体に感染した哺乳類に細胞を投与することをさらに含む、請求項１ 記載の方法。 １６．請求項１０記載の細胞および薬学上受容可能な賦形剤を含むワクチン。 １７．ＴＡＰがＴＡＰ−１である、請求項２記載の方法。 １８．ＴＡＰがＴＡＰ−２である、請求項２記載の方法。 １９．細胞がＴリンパ球である、請求項１記載の方法。 ２０．細胞がＲＭＡ細胞である、請求項１記載の方法。 ２１．細胞が粘着性または非粘着性スプレノサイトである、請求項１記載の方 法。 ２２．細胞が粘着性または非粘着性末梢血単核細胞である、請求項１記載の方 法。 ２３．細胞が樹状細胞である、請求項１記載の方法。 ２４．細胞がマクロファージである、請求項１記載の方法。 ２５．細胞が胸腺腫の細胞である、請求項１記載の方法。 ２６．アンチセンスオリゴヌクレオチドが２５から３０ヌクレオチドの長さで あって配列： ５’AGGGCCTCAGGTAGGACAGCGCCAT３’（配列番号１） を含む、請求項１３記載の方法。 ２７．アンチセンスオリゴヌクレオチドが２５から３０ヌクレオチドの長さで あって配列： ５．GCAGCAGGATATTGGCATTGAAAGG３’（配列番号２） を含む、請求項１３記載の方法。 ２８．ペプチドが病原体により天然に発現される蛋白質の一部からなる６から １５のアミノ酸のポリペプチドである、請求項１記載の方法。 ２９．細胞がＢリンパ球である、請求項１球の方法。 ３０．ペプチドが腫瘍特異性抗原である、請求項１記載の方法。 ３１．阻害が、ＭＨＣクラスＩ経路関連蛋白質に結合して該蛋白質の機能を阻 害するあとりのＲＮＡを細胞に導入することからなる、請求項１記載の方法。 ３２．ＭＨＣクラスＩ経路関連蛋白質がＴＡＰ蛋白質およびＬＭＰ蛋白質から なる群から選択される、請求項３１記載の方法。 ３３．阻害が、ＭＨＣクラスＩ経路関連蛋白質をコードするｍＲＮＡを特異的 に分断するリボザイムを細胞に導入してそれによりＭＨＣクラスＩ経路関連蛋白 質の翻訳を阻害することからなる、請求項１記載の方法。 ３４．リボザイムがハンマーヘッドリボザイムである、請求項３３記載の方法 。 ３５．ＭＨＣクラスＩ経路関連成分がＴＡＰ蛋白質およびＬＭＰ蛋白質からな る群から選択される、請求項３３記載の方法。 ３６．阻害が、細胞をプロテアゾーム阻害剤に接触させることからなる、請求 項１記載の方法。 ３７．プロテアゾーム阻害剤がＬＬｎＬ，ＭＧ１１５，ＭＧ１３２，ＣＥＰ６ ９０，ＣＥＰ１５０８，ＣＥＰ１５１３，ＣＥＰ１６１２，およびラクタシスチ ンからなる群から選択される、請求項３６記載の方法。 ３８．プロテアゾーム阻害剤がＭＧ１３２である、請求項３７記載の方法。 ３９．細胞中のＭＨＣクラスＩ経路関連成分の活性を阻害し、 細胞を腫瘍特異的抗原に接触させてそれにより抗原提示細胞を生成し、 そして 抗原提示細胞を哺乳類に投与すること からなる、哺乳類の癌の処置または予防方法。 ４０．ＭＨＣクラスＩ経路関連成分がＴＡＰである、請求項３９記載の方法。 ４１．ＭＨＣクラスＩ経路関連成分がＬＡＰである、請求項３９記載の方法。 ４２．ＭＨＣクラスＩ経路関連成分がプロテアゾームである、請求項３９記載 の方法。 ４３．請求項１０記載の細胞をＴリンパ球に接触させることからなる、Ｔリン パ球のインビトロ増殖を刺激する方法。 ４４．細胞中のＭＨＣクラスＩ経路関連成分の活性を阻害し、 細胞を腫瘍特異的抗原に接触させてそれにより抗原提示細胞を生成し、 そして 抗原提示細胞をＴリンパ球に接触させることにより細胞毒性Ｔリンパ球 を生成すること により生成された細胞毒性Ｔリンパ球。 ４５．ＭＨＣクラスＩ経路関連成分がＴＡＰである、請求項４４記載の方法。 ４６．ＭＨＣクラスＩ経路関連成分がＬＡＰである、請求項４４記載の方法。 ４７．ＭＨＣクラスＩ経路関連成分がプロテアゾームである、請求項４４記載 の方法。 ４８．請求項４４記載の細胞毒性Ｔリンパ球を哺乳類に投与することからなる 、病原体に感染した哺乳類を処置する方法。 ４９．請求項４４記載の細胞毒性Ｔリンパ球を哺乳類に投与することからなる 、哺乳類の癌を処置する方法。 ５０．プロテアゾーム阻害剤がＣＥＰ１６０１である、請求項３６記載の方法 。
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