JPH09504168A

JPH09504168A - 遺伝子療法によって免疫応答を抑制する方法

Info

Publication number: JPH09504168A
Application number: JP7508295A
Authority: JP
Inventors: アール．バーバー，ジャック; エフ．ワーナー，ジョン; ジェイ．ジョリー，ダグラス; ジェイ．イルウィン，マイケル; ダブリュ．，ジュニアダベンスキー，トーマス; イー．イバネツ，カルロス
Original assignee: チロンビアジーン，インコーポレイティド
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1994-09-02
Publication date: 1997-04-28
Also published as: EP0716710A1; DE69426303D1; ATE197609T1; WO1995006744A2; DE69426303T2; WO1995006744A3; EP0716710B1; AU7830794A; CA2158934A1

Abstract

(57)【要約】多価組換えベクター構造体で形質転換された動物の組織細胞を提供する。このベクター構造体は、治療タンパク質；および（ａ） MHC抗原提示を阻害できる第二タンパク質もしくはその活性部分、（ｂ） MHC抗原提示を阻害できるアンチセンスメッセージまたは（ｃ） MHC抗原提示を阻害できるリボザイムを発現する。このような多価構造体を含有する医薬組成物も提供する。上記の形質転換された組織細胞は、免疫応答を抑制する方法にとって特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子療法によって免疫応答を抑制する方法技術分野本発明は一般に遺伝子療法の技術分野に関し、さらに詳しくはリンパ球が、異質遺伝子を発現する組織を認識してその組織を破壊するのを防止する方法に関する。発明の背景ヒトの生活現象と疾患の性質は、特異的遺伝子の機能と機能不全によって決まる。したがって、正常な成長、発育、恒常性、生殖、免疫性、および代謝を行うには特定の遺伝子産物が必要である。欠陥遺伝子の遺伝によって起こる多くの遺伝疾患は、正常な遺伝子産物の産生不全を起こし、例えばサラセミア、フェニルケトン尿症、レッシュ・ナイハン症候群、重症複合免疫不全症（SCID）、血友病ＡとＢ、のう胞性線維症、ジュシエンヌ筋ジストロフィー、遺伝性気腫および家族性高コレステロール血症になる（Mulliganら、Science、260巻、926頁、1993 年；Andersonら、Science、256巻、808頁、1992年；Friedmannら、Science、244 巻、1275頁、1989年）。遺伝疾患では遺伝子産物がなくなるけれども、糖尿病および下垂体機能低下症のような内分泌腺疾患はそれぞれ、充分のレベルの適正なホルモンのインスリンとヒト成長ホルモンを遺伝子が産生できないことによって起こる。体細胞遺伝子療法は、この種の障害の強力な治療法である。この治療法では正常な組換え遺伝子が体細胞中に導入されて、新しいタンパク質また欠損タンパク質が患者の細胞内で産生される。例えばサラセミアはヘモグロビンの産生に関与する遺伝子の異常によって起こる。正常なヘモグロビン遺伝子を赤血球前駆細胞に導入すると正常なレベルのヘモグロビンが発現される。正常な代謝機能がこのように再構成されると、個体が必須遺伝子産物を合成できないのを克服して疾患の経過を逆転させることが期待される。その上この遺伝子は、多因性、多因子および後天性の疾患の過程を変えるのにも使用できる。本質的に、体細胞遺伝子療法は、タンパク質分子およびRNA分子に対する医薬送達系として作用する。組換え遺伝子の一つの送達方法はDNAによる遺伝子の転移またはトランスフェクションである。トランスフェクションは、培養細胞を各種の形態のDNAに暴露して行われ、細胞にこれらの分子を吸収させ次いでそれらがコードする産物を発現させる。物理的および化学的な取り込み方法のプロトコルには、リン酸カルシウム沈澱法；無傷の標的細胞内へのDNAの直接顕微注射法（Williamsら、PNAS、8 8巻、2726頁、1991年）；およびエレクトロポレーション（この場合、導電性溶液中に浮遊させた細胞を非常に強い電界に暴露して、細胞膜を一時的に分極させて遺伝子の大きさの巨大分子を入れる）がある。他の方法としては、DNAリガンド遺伝子の転移（この場合、DNAは特定細胞の受容体に結合する糖タンパク質に結合され、例えばDNAは、肝細胞上のアシアログリコプロテインの受容体に結合するアシアログリコプロテインに結合される）（Liangら、J.Clin.Invest.，91 巻、1241頁、1993年）；不活性化されたアデノウイルス粒子に結合されたDNA（C ottenら、PNAS、89巻、6094頁、1992年）；粒子に捕捉されたDNAによる粒子衝撃：重要な種々の遺伝子を含有する組換えプラスミドを包括するリポソーム(Nabel ら、PNAS、89巻、5157頁、1992年；国際特許願公開WO 93／00051号)；およびスフェロプラストの融合（この場合、組換えプラスミドを含有するイー・コリ(E．coli)がその細胞外壁を除去され、ポリエチレングリコールを用いて哺乳類の細胞に融合される）（Clineら、J.Pharmac.Ther.，29巻、69頁、19 85年、およびFriedmannら、Science、244巻、1275頁、1989年）がある。これらの方法による、培養細胞内での組換え遺伝子の発現は、短命であって、その効率は、染色体中に安定な取り込みを行える適切な受容細胞内で約１％である。核酸を動物の細胞に送達するその外の方法はウイルスによって遺伝子を転移（ transfer）または形質導入（transduction）する方法である。この方法は、標的集団中の事実上あらゆる細胞に感染できるウイルスベクターを用いることによって、転移の効率を大きく増大させる。ウイルス形質導入法は、ウイルスが、選択された特定の細胞侵入法を利用するので効率が高いことが報告されている（Clin eら、Pharmac.Ther.，29巻、69頁、1985年）。多くのウイルス類はベクター構造体を投与するのに利用できる。これらのウイルスとしては、例えばポリオウイルス(Evansら、Nature、339巻、385頁、1989年；Sabinら、J．of Biol.Standardiz ation、１巻、115頁、1973年)、ライノウイルス（Arnoldら、J.Cell.Biochem.， L401、1990年）；カナリア痘ウイルスまたはワクシニアウイルスのようなポックスウイルス(Fisher-Hochら、PNAS、86巻、317頁、1989年；Flexnerら、Ann.N.Y. Acad.Sci.，569巻、86頁、1989年；Flexnerら、Vaccine、８巻、17頁、1990年) 、SV40（Mulliganら、Nature、277巻、108頁、1979年；Madzakら、J.Gen.Vir.， 73巻、1533頁、1992年）、インフルエンザウイルス(Luytjesら、Cell、59巻、11 07頁、1989年；McMichealら、The New England Journal of Medicine、309巻、1 3頁、1983年；およびYapら、Nature、273巻、238頁、1978年)、アデノウイルス( Berknerら、Biotechniques、6巻、616頁、1988年およびRosenfeldら、Science、 252巻、431 頁、1991年)、アデノ随伴ウイルス（Samulskiら、Journal of Viology、63巻、3 822頁、1989年およびMendelsonら、Virology、166巻、154頁、1988年）、ヘルペスウイルス(Kitら、Adv.Exp.Med.Biol.，215巻、219頁、1989年)、HIV（Buchsch acherら、J.Vir.，66巻、2731頁、1992年；EPO 386,882号）、はしかウイルス(E PO 440,219号)、シンドビスウイルス(Xiongら、Science、234巻、1188頁、1989 年)、ならびにコロナウイルス(Hemreら、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，121巻、190 頁、1966年)がある。形質導入に用いられる多くのDNAウイルスには次のような多くの問題点がある。すなわち、疾病の発生または所望のタンパク質の抑制をもたらす他のウイルスタンパク質の産生；ベクターが宿主内で制御不能に複製する性能とこのような制御できない複製の病原の制御；ウイルス血症をもたらすことがある野生型ウイルスの存在；およびこれらの系における発現の一過性である。したがってこれらの難点のために、ウイルス、癌、寄生生物、遺伝子などの細菌以外のものが原因の疾患の治療における、DNAウイルスに基づいたウイルスベクターの用途が著しく制限されている。比較した結果、RNA含有ウイルスが体細胞遺伝子療法に対して有望であることが分かっている。これらのベクターのいくつか（例えばレトロウイルスのベクター）は重要なRNA遺伝子をDNAに変換し次にこの配列を宿主ゲノム中に組込む。これらのウイルスは容易に処理されて複製不全になり、その結果新しいコンピテントウイルス粒子を生成できなくなる。組換え遺伝子を転移させる物理的方法とは大きく異なり、ウイルスは、標的細胞中への高度に有効な侵入、宿主ゲノムへの安定な組込み（所望の場合）、導入される遺伝子配列に対する予測可能な保存構造、広い宿主の範囲および低い毒性を提供する。体細胞遺伝子療法の主な難点は、組換え遺伝子を異なる体細胞部位に導入し、遺伝子発現の安定で適正な調節を行うことである。体細胞遺伝子療法の標的として多くの体細胞部位が考えられるが、腺維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、角化細胞、甲状腺ろ胞細胞、および造血前駆細胞ならびになんらかの方式で病原状態になる各種細胞型が挙げられる。現在、骨髄細胞、肝細胞およびＴリンパ球が臨床試験の対象である（Ledleyら、Growth Gen．and Hor.，８巻、１頁、1992年）。例えば、レッシュ・ナイハン症候群に関与しているヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子を含有している組換えレトロウイルスベクターが骨髄細胞中に転移されている。HRPT活性を適切なレベルに再構成すると、遺伝子転移が培養物の上記特異的代謝不全を修正できることが証明されている（ Millerら、Science、225巻、630頁、1984年およびGruberら、Science、230巻、1 057頁、1985年）。多数の他の疾患が遺伝子療法で治療するよう提案されているが、これらの疾患としては、非遺伝疾患のみならず、アデニンデアミナーゼ不全症、のう胞性線維症、α₁−抗トリプシン不全症、ゴーシェ症候群がある。骨髄細胞は、生体外で容易に接近可能で操作することができるので有望である。それ故、幹細胞の離散集団(discrete population)が形質転換されると、造血が保持されそして骨髄誘導要素の全体が理論的に補充される。しかしこの方法の欠点は、異物として感知される導入タンパク質に対して免疫応答が起こることである。その結果、先に述べた方法の副作用または欠点なしで、遺伝子転移の後に起こる免疫応答を抑制する方法に対する要望が当該技術分野にある。本発明はこの要望を満たしさらに他の関連する利点を提供する。発明の要約本発明は、重要な治療タンパク質をコードする配列および抗原提示経路の阻害に関与する配列を含有する多価組換えウイルスで、動物の選択された細胞を形質転換する方法を提供するものである。本発明の一つの態様で、治療タンパク質、およびMHC抗原提示を阻害できる第二のタンパク質またはこの第二タンパク質の活性部分を発現する多価組換えベクター構造体で、動物の組織細胞を形質転換することを含んでなり、その結果、治療タンパク質に対する免疫応答が抑制される、動物内で免疫応答を抑制する方法が提供される。本発明の他の態様で、動物から組織細胞を取り出し、その組織細胞を、治療タンパク質およびMHC抗原提示を阻害できる第二タンパク質または第二タンパク質の活性部分を発現する多価組換えベクター構造体で形質転換し、次いでその形質転換された組織細胞を動物に内植し、その結果、該組織細胞に対する免疫応答が抑制されることによって、動物内で免疫応答を抑制する方法が提供される。本発明の一つの実施態様で、該多価組換えベクター構造体は、HCMV由来のタンパク質H301ようなβ₂−ミクログロブリンを捕捉することができるタンパク質の発現を指令する。他の実施態様で、該組換えベクター構造体は、MHCクラスＩ重鎖分子を細胞内で捕捉できるタンパク質例えばE3／19Kの発現を指令する。本発明の関連する態様で、該多価組換えベクター構造体は治療タンパク質およびMHC抗原提示を阻害できるアンチセンスメッセージを発現する。種々の実施態様で、該多価組換えベクター構造体は治療タンパク質、およびMHCクラスＩ重鎖転写物、β₂−ミクログロブリン転写物またはPSF-1輸送タンパク質転写物の保存領域を捕捉するアンチセンスメッセージを発現する。本発明の他の態様で、該多価組換えベクター構造体は、治療タンパク質を発現し、そしてMHC抗原提示を阻害できるリボザイムを転写する。各種の実施態様で、該リボザイムは、MHCクラスＩ重鎖転写物、β₂−ミクログロブリン転写物またはPSF-1輸送タンパク質転写物の保存領域を開裂することができる。本発明の好ましい実施態様で、多価組換えベクター構造体は、因子VIII、因子 IX、ヘモグロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、α₁−抗トリプシン、ジストロフィン、のう胞性腺維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター、グルコセレブロシダーゼおよびLDLに対する肝臓受容体からなる群から選択される少なくとも一つの治療タンパク質を発現する。上記の各種態様で、該多価組換えベクター構造体は、トガウイルス株、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、パルボウイルス科、ヘルペスウイルス科、パラミクソウイルス科およびコロナウイルス科のウイルスからなる群から選択される組換えウイルスによって運ばれる。好ましい実施態様で、該多価組換えベクター構造体は組換えウイルスベクター構造体である。特に好ましい構造体としては組換えレトロウイルスベクター構造体がある。本発明で用いるのに適切な組織細胞としては、腺維芽細胞、骨髄細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、神経細胞、肝細胞、ろ胞細胞、造血前駆細胞、およびリンパ球がある。上記の各一般態様で、該多価組換えベクター構造体は生体内または生体外で投与できる。本発明のさらに他の関連態様で、多価組換えベクター構造体で形質転換された組織細胞、および生理的に許容可能な担体または希釈剤を含有する医薬組成物が提供される。本発明のこれらの態様と他の態様は以下の詳細な説明によって明らかになるであろう。発明の詳細な説明組織細胞の“形質転換”とは、当該技術分野の当業者が知っている各種の手段のいずれかで組織細胞の形質導入または形質移入（transfection）を行うことを意味し、そして形質転換された組織細胞は、形質転換される前の組織細胞に比べて追加のポリヌクレオチドを発現する。 “内植（implanting）”は組織細胞を受給者か動物内に挿入もしくは移植を行いそしてその組織細胞の少なくとも一部分は内植後生育可能であることを意味する。この内植組織は類似の機能または異なる機能の組織内に入れることができる。例えば一つの動物から組織細胞を取り出し、次いで、その組織細胞は他の動物に“内植する”前に多価組換えベクター構造体で形質転換される。 “多価組換えベクター構造体”または“ベクター構造体”は、重要な配列または遺伝子を発現できる構造体を意味する。タンパク質を発現するには、ベクター構造体はプロモーターエレメントを含有していなければならずそしてポリアデニル化を指令するシグナルをもっている。その上、このベクター構造体は、転写されるときに重要な配列または遺伝子に作動可能に連結されて、翻訳開始配列として作用する配列をもっている方が好ましい。ベクター構造体は好ましくは、ネオマイシン、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン、フレオマイシン（phleomycin ）、ヒスチジノールまたはジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）のような選択可能マーカー、ならびに１個以上の制限部位および翻訳開始配列を含有している。さらに、ベクター構造体がレトロウイルス粒子を作るのに使用される場合、ベクター構造体は、使用されるレトロウイルスに適切なレトロウイルスパッケージングシグナルとLTRを、これらがまだ存在していないならば、含有させねばならない。またこのベクター構造体は、他のウイルスベクターと組合わせて用いるか、または下記のような細胞または組織の中に物理的に挿入することができる。以下に述べるように、多価組換えベクター構造体は重要な治療タンパク質の少なくとも一つをコードする配列を含有している。また該ベクター構造体は、タンパク質もしくはタンパク質の活性部分、アンチセンスメッセージまたはリボザイムをコードする配列も含有している。このような配列は、形質転換された組織細胞に対する、クラスＩ制限Ｔ細胞の免疫応答を抑制するため、MHC抗原の提示を阻害するよう設計される。一般に、本願で述べる多価組換えベクター構造体は、強力なプロモーターを有するプラスミド、およびプロモーターの下流に重要なDNA配列を挿入するのに用いる適正な制限部位を選択することによって調製される。上記のように、該ベクター構造体は選別のために利用する抗生物質耐性をコードする遺伝子および停止とポリアデニル化のシグナルをもっている。追加のエレメントとしては、エンハンサー、ならびに機能性のスプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位を有するイントロンがある。多価組換えベクター構造体を構築する場合、二つのタンパク質が発現されているときには二つのプロモーターが必要である。というのは一つのプロモーターでは第二の遺伝子の充分なレベルの遺伝子発現が保証されないからである。特に、ベクター構造体がアンチセンスメッセージまたはリボザイムを発現する場合には第二のプロモーターは必要でない。特定の実施態様では、内部リボソーム結合部位（IRBS）または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSVTK)のプロモーターが、重要な第二遺伝子の遺伝子発現のレベルを高めるため、第二遺伝子と連結して配置されている（実施例７参照）。要約すると、 IRBSについては、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質の上流非翻訳領域はビシストロンメッセージ(bicistronic message）の内部係合(internal engagement)を保持することが報告されている(Jacejakら、Nature、353巻、90頁、1991年)。この配列は小さくて約300個の塩基対なので、ベクター中に容易に組込むことができ、マルチシストロンメッセージ（そのシストロンはこの配列から始まる）から多数の遺伝子を発現させる。該組換えベクター構造体がウイルスによって運ばれる場合、このような構造体は、当該技術分野で公知の方法を用いて、プロモーターおよびスプライシングとポリアデニル化のシグナルを有するウイルスの配列を、重要な所望の遺伝子を含有するプラスミドに挿入することによって製造される。重要な遺伝子を含有する組換えウイルスベクターは、標的の組織細胞中に形質導入された後、高いコピー数で複製できる。多価組換えベクター構造体を製造した後、ベクターで形質転換された細胞の、重要な遺伝子を発現する性能および／またはMHC提示のダウンレギュレーションを評価することが好ましい。一般に、これらの評価は、ウェスタンブロット法、 FACS分析法または当該技術分野の当業者にとって公知の他の方法で実施することができる。好ましい実施態様で多価組換えベクター構造体はレトロウイルスによって運ばれる。レトロウイルスは、一般に非溶菌性の一本鎖のプラス鎖ゲノムを有するRN Aウイルスである。レトロウイルスは、感染するとそのRNAをDNAに逆転写し、プロウイルスを形成し、そのプロウイルスは宿主細胞のゲノム中に挿入される。本発明に用いるレトロウイルス構造体の製造については、標題が“Recombinant Re troviruses”という特許願（1990年9月21日に出願された米国特許願第07／586,603号）に詳細に記載されている。なおこの特許願は本願に援用するものである。レトロウイルスのゲノムは、概念的に二つの部分に分けることができる。“トランス作用”部分はウイルスの構造タンパク質をコードする領域で構成され、コアコートタンパク質を合成するための群特異的抗原(gag)遺伝子；逆転写酵素とインテグラーゼ酵素を合成するためのポル(pol)遺伝子；およびエンベロープ(env)の糖タンパク質類を合成するためのエンベロープ遺伝子を含有している。“シス作用”タンパク質は、最終的にウイルス粒子中にパッケージされるゲノムの領域で構成されている。これらの領域は、パッケージングシグナル、プロモーターとポリアデニル化部位を有する長末端反復部(LTR)およびDNA複製のための二つの開始部位を含有している。クローン化プロウイルスの内部または“トランス作用”部は、重要な遺伝子で置換されて“ベクター構造体”を生成する。ベクター構造体を、ウイルスパッケージングタンパク質が存在している細胞中に入れると（米国特許願第07／800,921号参照）、転写されたRNAはウイルス粒子としてパッケージされ、一方そのウイルス粒子は細胞から出芽しない。これらの粒子は組織細胞に形質導入するのに用いられ、ベクター構造体を細胞ゲノム中に組込むことができる。そのベクター構造体はその遺伝子産物を発現できるが、このベクター構造体を運ぶウイルスは、ウイルスゲノムのトランス作用部がないので複製不全である。複製コンピテント感染性レトロウイルスの存在を検出するのに各種の検定法を利用できる。一つの好ましい検定法は、実施例９に記載した広域S⁺L^-検定法である。好ましいレトロウイルスのベクターとしては、マウス白血病の、両種性ベクターまたはキセノトロピックベクターまたはVsVgプソイド型ベクターがある（国際特許願公開第WO 92／14829号参照。なおこの出願は本願に援用するものである）。また組換えベクター構造体は、以下のような各種のウイルスキャリヤーとともに発育させ利用することができる。そのウイルスとしては例えばポリオウイルス (Evansら、Nature、339巻、385頁、1989年およびSabinら、J．of Biol.Standard ization、１巻、115頁、1973年)(ATCC VR-58)；ライノウイルス(Arnoldら、J.Ce ll.Biochem.，L401、1990年)(ATCC VR-1110)；ポックスウイルス類、例えばカナリア痘ウイルスもしくはワクシニアウイルス(Fischer-Hochら、PNAS、86巻、317 頁、1989年；Flexnerら、Ann.N.Y.Acad.Sci.，569巻、86頁、1989年；Flexnerら、Vaccine、８巻、17頁、1990年；米国特許第4,603,112号と同第4,769,330号；国際特許願公開第WO 89／01973号)(ATCC VR-111；ATCC VR-2010)；SV40(Mulliga nら、Nature、277巻、108頁、1979年)(ATCC VR-305)、（Madzakら、J.Gen.Vir. ，73巻、1533頁、1992年）；インフルエンザウイルス(Luytjesら、Cell、59巻、 1107頁、1989年；McMichealら、The New England Journal of Medicine、309巻、13頁、1983年；およびYapら、Nature、273巻、238頁、1978年)(ATCC VR-797) ；アデノウイルス(Berknerら、Biotechniques、６巻、616頁、1988年およびRose nfieldら、Science、252巻、431頁、1991年)(ATCC VR-1)；パルボウイルス例えばアデノ随伴ウイルス(Samulskiら、J.Vir.，63巻、3822頁、1989年およびMende lsonら、Virology、166巻、154頁、1988年)(ATCC VR-645)；単純ヘルペスウイルス(Kitら、Adv.Exp.Med.Biol.，215巻、219頁、1989年)(ATCC VR-977；ATCC VR- 260)；HIV（EPO第386,882号、Buchschacherら、J.Vir.，66巻、2731頁、1992年）；はしかウイルス(EPO第440,219号)(ATCC VR-24)；シンドビスウイルス(Xiong ら、Science、234巻、1188頁、1989年)(ATCC VR-68)；およびコロナウイルス(Ha mreら、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，121巻、190頁、1966年)(ATCC VR-740)がある。上記のウイルスキャリヤーは、重要な治療遺伝子、およびMHC抗原の提示を阻害できるタンパク質、アンチセンスメッセージまたはリボザイムを発現するよう修飾する必要がある。多価ベクター構造体が製造されたならば、生体外と生体内での導入の両者を含む各種の経路を通じて温血動物に投与される。より具体的に述べると、生体内導入の場合、治療タンパク質をコードする配列ならびにMHC抗原提示を阻害できる第二タンパク質もしくはそのタンパク質の活性部分、アンチセンスメッセージまたはリボザイム配列をコードする配列を含有する裸のDNAまたは多価組換えベクター構造体を、筋肉、脳、肝臓、皮膚、脾臓または血液を含む組織の間質空隙に注射できる（国際特許願公開第WO 90／11092号参照）。投与は、静脈注射を行うかまたは身体の空洞部にカテーテルで直接注入してもよい（国際特許願公開第WO 93／00051号参照）。ベクター構造体を生体内投与する他の代表的な例としては、各種の物理的方法による形質移入法例えばリポフェクション(lipofection)(Fe lgnerら、PNAS、84巻、7413頁、1989年)；ミクロプロジェクタイル・ボンバードメント法(microprojectile bombardment)(Williamsら、PNAS、88巻、2726頁、19 91年)；リポソーム法（Wangら、PNAS、84巻、7851頁、1987年）；リン酸カルシウム法（Dubenskyら、PNAS、81巻、7529頁、1984年）； DNAリガンド複合体法（Wuら、J．of Biol.Chem.，264巻、16985頁、1989年；Cottonら、PNAS、89巻、 6094頁、1992年）がある。上記のようにベクター構造体はワクシニア、シンドビスまたはコロナのようなウイルスで運ぶことができる。さらに、直接注射によって、レトロウイルスのベクターを通じてベクター構造体を投与する方法は、標題が“Recombinant Retroviruses”である米国特許願第07／586,603号に一層詳細に記載されている。なおこの出願は本願に援用するものである。さらに、生体外の方法が用いられ、この方法では細胞を動物から取り出し、多価組換えベクター構造体で形質転換させ、次いで動物内に入れる。形質転換することができる細胞としては、限定されないが、腺維芽細胞、内皮細胞、肝細胞、上皮細胞、リンパ球、角化細胞、甲状腺ろ胞細胞および骨髄細胞がある。多価組換えベクター構造体を生体外で組織細胞中に導入するのに上記ウイルスキャリヤーのいずれかを利用できることは明らかであろう。物理的および化学的な取り込み法のプロトコルとしては、リン酸カルシウム沈澱法、無傷の標的細胞へのDNA の直接顕微注射法、およびエレクトロポレーション法（この場合、導電性溶液中に浮遊させた細胞を強い電場に暴露し細胞膜を一時的に分極させて巨大分子を侵入させる）がある。他の適切な方法としては、リガンドに結合させたDNA；不活性化アデノウイルスに結合させたDNA（Cottonら、PNAS、89巻、6094頁、1992年）；粒子に結合させたDNAによる衝撃；組換えベクター構造体を包括しているリポソーム；およびスフェロプラスト融合法〔この場合、組換えウイルスベクター構造体を含有しているイー・コリ(E．coli)の細胞外壁をはぎとり、次いでポリエチレングリコールを用いて動物の細胞に融合させてウイルスの形質導入を行う (Clineら、Pharmac.Ther.，29巻、69頁、1985年およびFriedmannら、Science、2 44巻、1275頁1989年)〕を利用する方法がある。生体内と生体外の方法では、組織細胞が、少なくとも一つの治療タンパク質をコードする配列、およびMHC抗原提示を阻害できる第二タンパク質もしくは第二タンパク質の活性部分、アンチセンスメッセージまたはリボザイムをコードする配列を含有する多価組換えベクター構造体で形質転換される。以下により詳細に考察するように、多価組換えベクター構造体は、１個以上の治療タンパク質に加えて、２個以上のタンパク質（またはその活性タンパク質）、アンチセンスメッセージまたはリボザイムをコードしてもよい。生体外の場合、形質転換された細胞を試験動物に移植し次いで実施例14に記載されているようにして遺伝子発現を監視する。あるいは、形質転換された細胞は、実施例16に記載されているようにしてヒト組織培養系を用いて生体外で試験してもよい。プロトコルは選択される組織細胞によって変わる。要約すると、その配列が発現するとMHC クラスＩの提示を阻害する配列を有する多価組換えベクター構造体を用いて組織細胞を形質転換する。10⁵〜10⁹個の組織細胞を形質転換することが好ましい。その細胞を培養し、その形質転換細胞を抗生物質耐性で選択する。細胞は、遺伝子の発現について、ウェスタンブロット法およびFCAS分析法または他の手段で検定する。例えば以下により詳細に述べるように、形質転換された骨髄細胞を２〜３ ×10⁷個、静脈投与によって動物に内植する。形質転換された細胞の生体内発現は、利用される治療タンパク質に対して適切な方法で検出できる。この点について、免疫応答が成功裡に充分抑制されていることは、該タンパク質が継続的に産生されることで示される。先に考察したように、本発明は、動物内でのクラスＩの被制限細胞の免疫応答を抑制するために、治療タンパク質をコードする配列およびMHC抗原提示を阻害できる配列を挿入するのに適した方法と組成物を提供するものである。要約すると、CTLは、CD８、細胞間接着性分子−１(ICAM-1)、ICAM-2(Singer，Science、2 55巻、1671頁、1992年；Rao，Crit.Rev.Immunol.，10巻、495頁、1991年）、白血球機能抗原−１(LFA-1)(Altmannら、Nature、338巻、521頁、1989年）、B7／B BI分子(Freemanら、J.Immunol.，143巻、2714頁、1989年）、LFA-3または他の細胞接着性分子のごとき補助分子とともに、セルフMHC分子中でプロセスペプチド( processed pepti de)を表示することで特異的に活性化される。MHCクラスＩ分子に関連して抗原のペプチドが提示されるとCTLが活性化する。治療タンパク質およびMHC抗原提示を阻害すると考えられる産物を発現できる特異的な配列を転移して安定に取り込むと、CD8⁺ CTLのようなＴ細胞の活性化が遮断されるので、治療タンパク質を発現する細胞に対して指令される免疫応答が防止される。標準のCTL検定法を用いてこの応答を検出する。なおこの検定法は実施例13でより詳細に説明する。有効な MHC抗原提示を抑制するためその機能が阻害される、抗原提示経路のコンポーネントとしては、45kdのMHCクラスＩ重鎖、β₂−ミクログロブリン、プロテアーゼ類のようなプロセシング酵素類、補助分子類（先に考察したような）、シャペロン類、およびPSF1のような輸送タンパク質がある。本発明の一つの態様で、重要な治療タンパク質、およびMHCクラスＩ抗原提示を阻害できるタンパク質もしくはそのタンパク質の活性部分を発現を指令する多価ベクター構造体が提供される。本発明において、タンパク質の“活性部分”とは、生物活性を得るために保有していなければならないタンパク質のフラグメントのことである。このようなフラグメントすなわち活性ドメインは、そのタンパク質の配列からヌクレオチドの配列を系統的に取り出し、得られた組換えベクター構造体で標的細胞を形質転換し、次いでFACS分析法または他の免疫学的検定法、例えばCTL検定法を用いて、細胞表面のMHCクラスＩ提示を測定することによって容易に同定することができる。これらのフラグメントは、全タンパク質をコードする配列の大きさがウイルスキャリヤーの容量を超える場合、特に有用である。あるいは、MHC抗原提示インヒビタータンパク質の活性ドメインは酵素で消化することができ、そしてその活性タンパク質は生化学的な方法で精製できる。例えば該タンパク質の活性部分を遮断するモノクローナル抗体を用いて、開裂されたタンパク質の活性部分を単離し精製することができる（Harlowら、Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring s Harbor、1988年）。一つの実施態様で、組換えベクター構造体は、細胞内で新しく合成されたMHC クラスＩ分子に結合するタンパク質もしくはタンパク質の活性部分の発現を指令する。この結合によって、MHCクラスＩ分子が小胞体から移動するのを防止されて、末端のグリコシル化が阻害される。これによって、これら分子の細胞表面への輸送が遮断され、CTLによる細胞の認識と溶解が防止される。例えば、Ｅ３遺伝子の産物の一つを用いて、MHCクラスＩ分子の形質転換細胞への輸送を阻害することができる。さらに具体的に述べると、Ｅ３は19kDのトランスメンブラン糖タンパク質のE3／19Kをコードし、これはアデノウイルス２のゲノムのＥ３領域から転写される。本発明において、多価組換えウイルスベクター構造体は、直接もしくは間接に投与され、そして治療タンパク質をコードする遺伝子とE3／19K の配列を含有し、発現されると治療タンパク質とE3／19Kタンパク質を産生する。E3／19Kタンパク質は、治療タンパク質のペプチドを捕捉したMHC分子を含むMH CクラスＩ表面分子の表面発現を阻害する。結局該ベクターで形質転換された細胞は、それらが産生する治療タンパク質に対する免疫応答を回避する。この点で代表的な多価組換えベクター構造体の構築について実施例７で述べる。本発明の他の実施態様で、多価組換えベクター構造体は、治療タンパク質、およびβ₂−ミクログロブリンを捕捉できるタンパク質もしくはタンパク質の活性部分の発現を指令する。MHCクラスＩ分子を細胞表面に輸送して抗原を提示するには、β₂−ミクログロブリンとの会合が必要である。このように、β₂−ミクログロブリンを捕捉してそのグロブリンがMHCクラスＩと会合するのを阻害するタンパク質は、MHCクラスＩ抗原の提示を間接的に阻害する。適切なタンパク質としてはH301遺伝子産物がある。要約すると、このH301遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)から得られるが、MHCクラスＩ分子の重鎖のβ₂−ミクログロブリン結合部位に対して配列相同性を有する糖タンパク質をコードしている（Br owneら、Nature、347巻、770頁、1990年）。H301はβ₂−ミクログロブリンを捕捉し、その結果、MHCクラスＩ分子の成熟を防止し、そして形質転換細胞を細胞障害性Ｔ細胞が認識できないようにして、MHCクラスＩで制限される免疫監視を回避する。 MHCクラスＩ抗原提示を阻害またはダウンレギュレートする機能を有する、まだ考察していない他のタンパク質も、同定して本発明で利用することができる。このようなタンパク質、特に哺乳類の病原体由来のタンパク質（およびその活性部分）を同定するために、MHCクラスＩ抗原提示を阻害できると考えられるタンパク質もしくはその活性部分を発現する組換えベクター構造体で、BCのごときテスター細胞系を形質転換する。該候補的タンパク質をコードする配列を有するテスター細胞系とこのような配列をもっていないテスター細胞系を、CTL検定法でスティミュレーター（stimulator）および／または標的と比較した。形質転換されたテスター細胞の場合は細胞の溶解が減少するということは、該候補的タンパク質がMHCの提示を阻害できることを示している。 MHCクラスＩの表面発現のダウンレギュレーションを測定する別の方法はFACS 分析法による方法である。より具体的に述べると細胞系は、該候補的タンパク質をコードする組換えベクター構造体で形質転換される。薬剤セレクションとエクスパンション（drug selection and expansion）を行った後、MHCクラスＩの発現についてFACS法で分析し、非形質転換細胞と比較する。MHCクラスＩの細胞表面の発現が減少するのは、候補的タンパク質がMHCの提示を阻害できることを示す（例えば実施例１２参照）。本発明の他の態様で、少なくとも一つの治療タンパク質の発現を指令し、また MHCクラスＩ抗原提示を阻害できるアンチセンスメッセージも転写する多価ベクター構造体が提供される。要約すると、該タンパク質のコーディング配列または、“センス”配列に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを“ アンチセンス”と呼ぶ。アンチセンスRNA配列は、相補的mRNA配列とハイブリッドを形成して翻訳を停止することによって、遺伝子発現のレギュレーターとして機能する（Mizunoら、PNAS、81巻、1966頁、1984年；Heywoodら、Nucleic Acids Res.，14巻、6771頁、1986年）。標的転写物の全配列またはその一部分を含有するアンチセンス分子は、合成して（Ferrettiら、PNAS、83巻、599頁、1986年）、ベクター構造体中に入れ、次いで有効に細胞中に導入して遺伝子の発現を阻害させることができる(Izantら、Cell、36巻、1007頁、1984年)。さらに、逆の配向でクローン化されたDNAからアンチセンスRNA（asRNA）が合成されると、構成asRNAの発現が正常細胞の機能を阻害しないで時間が経過しても安定である。本発明の実施態様で、多価組換えベクター構造体は、重要な治療遺伝子、およびMHCクラスＩ転写物の保存領域に結合して細胞表面の発現とMHCクラスＩ抗原提示とを阻害するアンチセンスメッセージを転写する。またかような保存領域は、 DNA配列データバンク（例えばGenbank）で入手できる各種のクラスのMHC遺伝子（例えばHLAのＡ，ＢおよびＣ）を示す配列を、コンピュータを利用して比較し同定することができる。保存配列はそのヌクレオチド配列の相同性についてコンピュータを利用して並べて同定される。その保存領域は、MHCクラスＩ遺伝子型間の100塩基対当りの不適正部分（ mismatch）が50％未満好ましくは20％未満の配列である。本発明の他の態様で、多価組換えベクター構造体は、治療タンパク質、および β₂−ミクログロブリン転写物への結合に関与するアンチセンスメッセージを発現する。この結合によって、β₂−ミクログロブリンタンパク質の翻訳が防止され、そのため細胞表面発現に必要なMHCクラスＩ分子複合体の適正な組立てが阻害される。好ましい実施態様で、β₂−ミクログロブリンのヌクレオチド配列は、逆配向でベクター構造体中にクローン化される。適正なアンチセンスの配向は制限酵素分析法で測定される。本発明のさらに他の実施態様では、多価組換えベクター構造体が、治療タンパク質、およびPSF1転写物すなわち一つのペプチド輸送タンパク質の捕捉に関与するアンチセンスメッセージを転写する。このタンパク質はMHCクラスＩ分子を有効に組立てるのに必要であるから、PSF1転写物に対するアンチセンスメッセージは、プロセス（processed）抗原ペプチドフラグメントが小胞体（ER）まで輸送されてβ₂−ミクログロブリンおよびMHCクラスＩ分子の複合体と会合するのを遮断する。好ましい実施態様で、PSF1のヌクレオチド配列を調製し、ベクター構造体中に逆配向で挿入し次いで制限酵素分析法で測定する。上記のように、抗原提示に関与する他のタンパク質の配列も、同定して、抗原提示経路を阻害するアンチセンスメッセージを転写できる多価組換えベクター構造体を設計するのに使用できる。さらに具体的に述べると、該タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を検査し、その同定された配列を用いて適切なアンチセンスメッセージを合成する。標的メッセージの出発配列の上流またはこの配列に近接した部分に相補的な配列を用いることが好ましい。このことによって、アンチセンス配列がmRNAに結合され、該タンパク質の重要部分の翻訳が防止される。このような分子の例は、ICAM-1，ICAM-2，LF A-1，LFA-3およびB7／BBIである。MHCクラスＩの発現または抗原の提示のダウンレギュレーションはそれぞれ、実施例13と15に記載されているようにFACS分析法またはCTL検定法によって、またはMHCクラスＩ提示を阻害できるタンパク質について先に述べたような他の手段によって検定することができる。本発明の他の態様で、少なくとも一つの治療タンパク質、およびMHC抗原提示経路のコンポーネントの酵素による開裂に関与するリボザイムを転写する多価組換えベクター構造体で、動物の選択された細胞を形質転換することによって動物内で免疫応答を抑制する方法が提供される。要約すると、リボザイムは、他のRN A分子を消化するのに用いられる、酵素活性を有するRNA分子である。リボザイムは、所望の標的分子内の潜在的開裂部位に対して酵素を正確に配置できる領域が両側に隣接している、保存配列に対して高度に特異的な開裂領域を有する短いRN A分子で構成されている。リボザイムは特定の遺伝子の発現と活性化を阻害する高度に順応性がある手段を提供する（Haseloffら、Nature、334巻、585頁、1988 年）。遺伝子の転写された配列が分かっている場合は、カスタムリボザイムを設計できる。具体的にいえば、リボザイムは、まず特定の標的RNA配列を選び、リボザイムのコーディング配列の開始部と終末部に相補的配列を結合することによって、設計することができる。次にこのリボザイム産生遺伝子のユニットは組換えベクター構造体中に挿入して細胞組織を形質転換するのに用いることができる。発現されると、標的遺伝子は相補的な結合と開裂によって中和され、永久的な不活性化を保証する。その上、リボザイムは、酵素活性をもっているので、二つ以上の標的を破壊できる。本発明の一つの実施態様で、特定のリボザイムを含有する多価組換えベクター構造体を用いてMHCクラスＩ分子の保存領域の転写物を開裂し、抗原提示を阻害する。本発明の他の実施態様で、多価組換えベクター構造体は、治療タンパク質、およびβ₂−ミクログロブリン転写物の酵素開裂に関与するリボザイムをコードしている。具体的に述べると、β₂−ミクログロブリンメッセージの配列に相補的な隣接領域を有するリボザイムは転写物を開裂するので、タンパク質の翻訳およびMHCクラスＩ分子複合体の適正な組立てを防止する。このことによって、MHCクラスＩ複合体の細胞表面への輸送が阻害され、その結果、抗原の提示が防止される。本発明のさらに他の実施態様で、多価組換えベクター構造体は、治療タンパク質、およびPSF1転写物の酵素開裂に関与してMHCクラスＩ分子の細胞表面発現を抑制し抗原の提示を防止するリボザイムをコードしている。さらに具体的に述べると、PSF1メッセージの配列に相補的な隣接領域を有するよう設計されたリボザイムは転写物を開裂しペプチドのERへの輸送を阻害し、その結果、MHCクラスＩ複合体の組立ておよび抗原提示を防止する。上記のように、抗原提示に関与する他のタンパク質の配列を同定し、MHC抗原提示を阻害するリボザイムを転写できる組換えベクター構造体を設計するのに用いることができる。MHCクラスＩの発現または抗原の提示のダウンレギュレーションはそれぞれ、実施例13と15に記載されているようにFACS分析法またはCTL検定法によって、またはMHCクラスＩ提示を阻害できるタンパク質について先に述べたような他の手段によって検定できる。上記のように、本発明の多価組換えベクター構造体は、MHC抗原提示を阻害できる二つ以上のタンパク質、アンチセンスメッセージまたはリボザイムを発現または転写して、免疫応答抑制の効率を高めることができる。発現が起こると、その遺伝子産物は、二つの異なる経路を通じて単一のコンポーネント攻撃するかまたは同じかもしくは異なる経路を通じて二つの異なるコンポーネントを攻撃することによってMHC抗原の提示に対する干渉度を増大する。多価組換えベクター構造体を構築するには二つのプロモーターが必要である。というのは、一つのプロモーターでは第二遺伝子の適切なレベルの遺伝子発現を保証できないからである。重要な第二遺伝子とともに配置されている内部リボザイム結合部位（IRBS）プロモーターまたは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSVTK)プロモーターのような第二プロモーターは、第二遺伝子の遺伝子発現のレベルを高める。好ましい実施態様で、本発明の多価ベクター構造体は、少なくとも一つの治療タンパク質に加えて、下記のコンポーネントの少なくとも二つをいずれかの組合わせで発現または転写する。すなわち（ａ）タンパク質E3／19KもしくはH301またはその活性部分；（ｂ）MHCクラスＩ重鎖、β₂−ミクログロブリンまたはPSF1 輸送タンパク質の保存領域の転写物を捕捉するアンチセンスメッセージ；および（ｃ）上記（ｂ）に列挙したタンパク質類の転写物を開裂するリボザイムである。さらに、本願に記載されているような二つのタンパク質もしくはそれらタンパク質の活性部分、二つのアンチセンスメッセージ、または二つのリボザイムを発現する多価組換えベクター構造体が提供される。関連する実施態様で、多数の特定の組合わせを、少なくとも一つの治療タンパク質をコードする配列とともに利用して多価組換えベクター構造体を作ることができる。例えば、多価組換えベクター構造体は、MHCクラスＩ重鎖、β₂−ミクログロブリンまたはPSF1輸送タンパク質の保存領域に対するアンチセンスメッセージまたはリボザイムメッセージと組合わせてE3／19KまたはH301を発現する遺伝子で構成されている。本発明において、重要な配列としては、限定されないが、次のような疾患に関与する配列がある。すなわちサラセミア、フェニルケトン尿症、レッシュ・ナイハン症候群、重症複合免疫不全症（SCID）、血友病ＡとＢ、のう胞性線維症、ジュシエンヌ筋ジストロフィー、遺伝性気腫、家族性高コレステロール血症、ゴーシェ病、および癌とウイルス疾患のよううな各種の後天性疾患である。これらの遺伝子は、ヘモグロビンの成分、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホロリボシルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、因子VIIIと因子IX、のう胞性線維症貫膜コンダクタンスレギュレーター、ジストロフィン、α₁−抗トリプシン、低密度リポタンパク質(LDL)に対する肝臓受容体、およびグルコセレブロシダーゼをそれぞれコードする。ウイルスの複製を阻害するトランスドミナント(transdominant)変異ウイルスタンパク質；適切なタンパク質または分子を捕捉して病勢の悪化を阻害する突然変異体、非ヒトまたは合成のリガンド；および前駆薬剤を活性化して細胞を排除する、前駆薬剤を活性化する酵素（例えばHSVTK)をコードする配列も本発明で用いることができる。ベクターによる技術で輸送されるとき、患者／動物の免疫系によって異物として認識される治療タンパク質は、本質的に、本願に記載の多価組換えベクター構造体に有利に利用できる。本発明の他の態様で、上記の多価組換えベクター構造体、または該ベクター構造体を保有する組換えウイルス例えばレトロウィルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、はしかウイルス、コロナウイルスおよびシンドビスウイルスの組換えウイルスのうちの一つを、医薬として許容できる担体または希釈剤と組合わせて含有する医薬組成物が提供される。この組成物は、液体溶液として、または投与する前に再構成して溶液にする固形物（例えば凍結乾燥された固形物）として製造することができる。さらにこの組成物は、注射、経口、鼻腔内、直腸内の投与に適した担体もしくは希釈剤、または担体に対し適切な他の手段によって製造することができる。ベクター構造体を保有するものは、配合する前に、0.25％〜25％好ましくは約５％〜20％の範囲の濃度まで精製する。次に、組成物を調製した後、ベクター構造体を保有する組換えウイルスは、１投与当り約10ng〜１μｇの物質で構成されており、共精製（ copurify）されたコンタミナントとして存在する物質の量の約10倍である。この組成物は下記のように配合される水溶液0.1〜1.0mlで製造することが好ましい。医薬として許容できる担体または希釈剤は、採用される投与量と濃度で受容者に対して非毒性の担体または希釈剤である。注射用溶液に用いる担体または希釈剤の代表例は、水；好ましくは生理的pHに緩衝され（例えばリン酸緩衝食塩水またはトリス緩衝食塩水）、そしてマンニトール、トレハロース、ラクトース、デキストロース、グリセリンおよびエタノールのうちの一つ以上、ならびにヒト血清アルブミン(HSA)のようなポリペプチドまたはタンパク質を含有する等張溶液である。一つの適切な組成物は、10mg／mlのマンニトール、１mg／mlのHSA、2 0mMのトリスpH＝7.2および150mMのNaCl中に、ベクター構造体を保有する組換えウイルスを含有している。この場合、ベクター構造体を保有する組換えウイルスは約10ng〜１μｇの物質であるから、高分子量の物質の合計量の１％未満であり、水を含む全物質の１／100,000未満である。この組成物は一般に、−70℃にて少なくとも６箇月間安定である。実質的に等しい投与量の多価組換えベクター構造体を調製できることは明らかである。この点について、ベクター構造体は１投与当り100ng〜100μｇの物質で構成されており、共精製されたコンタミナントとして存在している量の 10倍である。同様に、内植用の形質転換細胞は１投与当り10⁶〜10¹¹個の細胞で構成されている。本発明の組成物は、静脈（i.v.）、皮下（s.c.）または筋肉内（i.m.）の注射を含む上記のような各種の経路で投与することができる。この点について、投与のモードは、特定の治療用途および利用される生体外で形質転換された細胞（利用される場合）によって左右されることは明らかである。ベクター構造体を保有する組換えウイルスについて、通常用いられる個々の投与量は10⁶〜10¹⁰c.f.u. である（例えばHT1080細胞上で滴定されるネオマイシン耐性のコロニー形成単位）。これらの組成物は、１〜４週間の間隔で３回もしくは４回（少なくとも最初には）投与する。その後のブースター投与は６〜12箇月後に１〜２回およびその後は一年に１回行う。使用される投与量は、治療される症状の重症度、治療タンパク質の作用機序、個体の体重および投与の経路を含む各種の因子の影響をうけることは、当該技術分野の当業者にとって明らかであろう。下記の実施例は例示するために提供するものであり、本発明を限定するものではない。実施例実施例１マウスレトロウィルスのプロベクターDNAの製造Ａ．レトロウィルスの骨格KT-3Bの製造 pUC31プラスミド中のＮ２ベクター（Armentanoら、J.Vir.，61巻、1647頁、19 87年；Eglitasら、Science，230巻、1395頁、1985年）由来のgag配列を含有する、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)の５′長末端反復(LTR)のEcoRＩ−EcoR Ｉフラグメントを、プラスミドSK⁺（Stratagene社，米国，カリフォルニア州，サンディエゴ）に連結する。得られた構造体をN2R5と呼ぶ。このN2R5構造体を、生体外での部位特異的突然変異誘発法によって変異させて、ATG出発コドンを、gagの発現を防止するATTに変える。この突然変異を誘発されたフラグメントは、長さが200 塩基対（bp）であり、両側にPstＩ制限部位が隣接している。このPstＩ−PstＩ突然変異フラグメントをSK⁺プラスミドから精製し、次にプラスミドpU31中のN2M oMLV5′LTRのPstＩ部位に挿入して、その変異していない200bpのフラグメントを置換する。プラスミドpU31はpUC19(Stratagene社，米国，カリフォルニア州，サンディエゴ)から誘導され、このpUC19は、ポリリンカーのEcoRＩとSacＩの部位の間に追加の制限部位：XhoＩ，BgIII，BssHIIおよびNcoＩの制限部位が挿入されている。この構造体はpU31／N2R5gMと呼ぶ。Ｎ２由来で、1.0キロ塩基（Kb）のMoMLV3′LTRのEcoRＩ−EcoRＩフラグメントをプラスミドSK⁺中にクローン化してN2R3^-と呼称する構造体を得る。この構造体から1.0KbのClaＩ−HindIIIフラグメントを精製する。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を駆動するSV40初期プロモーターを含有する、PAFVXMレトロウィルスベクター（Krieglerら、Cell，38巻、483頁、1984年；St.Louisら、PNAS，85巻、3150頁、1988年）由来のClaＩ−Cl aＩ優性選択可能マーカー遺伝子のフラグメントをプラスミドSK⁺中にクローン化する。1.3KbのClaＩ−BstBＩ遺伝子フラグメントを上記SK⁺プラスミドから精製する。別の選択可能マーカーのフレオマイシン耐性(Mulsantら、Som.C exから入手できる）を用いて、レトロウィルス骨格KT-3Cを作り、すでにネオマイシン耐性である遺伝子で細胞を形質転換するのに使用する。プラスミドpUT507(Mulsantら、Som.Cell and Mol.Gen.,14巻、243頁、1 988年)をNdeＩで消化し、その両端をクレノーポリメラーゼで平滑にする。この試料をさらにHpaＩで消化し、フラグメントの混合物にClaＩリンカーを連結し、次いでその試料をさらにClaＩで消化する。過剰のClaＩリンカーをClaＩで消化して除去し、次いでRSVLTRとフレオマイシン耐性遺伝子を有する1.2KbのClaＩフラグメントを、アガロースゲル電気泳動法と続いてGene Clean（Bio101，米国，カリフォルニア州，サンディエゴ）を用いる精製を行って単離した。このフラグメントを、1.3KbのClaＩ−BstBＩネオマイシン耐性フラグメントの代わりに用いて骨格KT-3Cを得る。重要な遺伝子を含有するXhoＩ−ClaＩフラグメントと1.0Kb MoMLV3′LTRのCla Ｉ−HindIIIフラグメントをpUC31／N2R5gMプラスミドのXhoＩ−HindIII部位に挿入する３部分連結によって、発現ベクターを構築する。次に、1.3KbのClaＩ−Bs tBＩneo遺伝子または1.2KbのClaＩフレオマイシンフラグメントを、センス配向( sense orientation)で、このプラスミドのClaＩ部位に挿入する。実施例２Ａ．E3／19K遺伝子のKT-3B中へのクローン化ｉ．アデノウイルスの単離と精製アデノウイルスの単離と精製については、Greenら、Methods in Enzymology， 58巻、425頁、1979年に報告されている。具体的に述べると、５ｌのHela細胞（３〜６×10⁵細胞／ml）に、100〜500プラーク形成単位(pfu)／mlのアデノウイルス２型（Ad２）のビリオン(ATCC VR-846)を感染させる。37℃で30〜40時間インキュベートした後、細胞を氷上に置き、４℃にて230ｇで20分間遠心分離にかけて収穫し、次いでトリス−HCl緩衝液pH8.1中に再浮遊させる。ペレットを音波処理で機械的に破砕し、トリクロロトリフルオロエタン中でホモジナイズし、次いで1000ｇで10分間遠心分離を行う。上部の水性層を取り出して10mlのCsCl (1.43ｇ／cm³)に重層し、SW27ローターで１時間、20,000rpmで遠心分離する。オパール色に光るアデノウイルスバンドを取り出し、CsClで1.34ｇ／cm³に調節し、さらにTi50ローターを用い、30,000rpmで16〜20時間遠心分離する。該勾配液の中央に目視できるウイルスのバンドを取出し、アデノウイルスのDNAの精製を行うまで４℃で保存する。 ii．アデノウイルスDNAの単離と精製アデノウイルスのバンドを、プロテアーゼとともに37℃で１時間インキュベートしてタンパク質を消化する。４℃で10分間、7,800ｇで遠心分離を行った後、粒子を、室温で30分間、５％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)中で可溶化し、次いで同容積のフェノールで抽出する。上部水性層を取り出し、フェノールで再び抽出し、エーテルで３回抽出し、次にトリス緩衝液中に24時間透析する。ウイルス Ad2DNAをエタノール中に沈澱させ、エタノール中で洗浄し、次いでトリス−EDTA 緩衝液pH8.1中に再び浮遊させる。約0.5mgのウイルスAd2DNAを、1.0Ｌの細胞中に産生されたウイルスから単離する。 iii．E3／19K遺伝子の単離ウイルスAd2DNAをEcoRＩ（New England Biolabs社，米国，マサチューセッツ州，ベバリー）で消化し、次いで１％アガロースゲル上の電気泳動で分離した。得られた2.7KbのAd2EcoRＩ Dフラグメントは、Ad２コオーディネート領域(coord inate region)75.9〜83.4中に位置し、E3／19K遺伝子(Herisseら、Nucleic Acid s Research，８巻、2173頁、1980年；Cladarasら、Virology，140巻、28頁、198 5年)を含有しているが、電気泳動で溶出させ、フェノールで抽出し、エタノールで沈澱させ、次いでトリス−EDTA(pH8.1)に溶解する。 iv．E3／19K遺伝子のKT-3Bへのクローン化 E3／19K遺伝子を、PUC1813のEcoRＩ部位の中にクローン化する。PUC1813は、K ayら、Nucleic Acids Research，15巻、2778頁、1987年およびGrayら、PNAS，80 巻、5842頁、1983年に記載されているのとほとんど同様にして製造する。E3／19 KをEcoRＩによる消化で検索し、単離したフラグメントを、ホスファターゼで処理したpSP73プラスミド(Promega社，米国，ウイスコンシン州，マディソン)のEc oRＩ部位中にクローン化する。この構造体をSP-E3／19Kと呼ぶ。SP-E3／19KcDNA の配向は、適正な制限酵素による消化とDNAの配列決定を利用して確認する。センス配向で、cDNAの５′末端は、pSP73ポリリンカーのXho部位に隣接し、そしてその３′末端はClaＩ部位に隣接している。センス配向またはアンチセンス配向にE3／19KcDNAを含有するXhoＩ−ClaＩフラグメントをSP-E3／19K構造体から検索し次いでKT-3Bレトロウィルス骨格のXhoＩ−ClaＩ部位中にクローン化する。この構造体をKT-3B／E3／19Kと呼ぶ。Ｂ．PCRで増幅したE3／19K遺伝子のKT-3Bへのクローン化ｉ．E3／19K遺伝子のPCRによる増幅アミノ末端のシグナル配列、これに続く内側の（intraluminal）ドメインおよび小胞体（ER）内にE3／19Kタンパク質を埋包させるカルボキシ末端の細胞質テールを有するAd2DNAE3／19K遺伝子が、ウイルスヌクレオチドの28,812と29,288 の間に位置している。ウイルスゲノムのDNAからのAd2E3／19K遺伝子の単離は、以下に示すプライマーの対を用いPCR増幅によって達成される。この前進プライマーはAd２ヌクレオチド配列28,812〜28,835に相当する。この逆プライマーはAd２ヌクレオチド配列29,241〜29,213に相当する。 Ad２相補配列に加えて、両方のプライマーは、PCTアンプリコン産物を酵素で有効に消化するため、それらの５′末端に５個のヌクレオチドの“緩衝配列”を含有している。前進プライマー中のこの配列にはXhoＩ認識部位が続き、そして逆プライマー中のこの配列にはClaＩ認識部位が続く。したがって５′から３′ への方向に、E3／19K遺伝子の両側にXhoＩとClaＩの認識部位が隣接されている。Ad2DNA由来のE31／19K遺伝子の増幅は下記のPCRサイクルプロトコルで達成される。 ii． PCRで増幅されたE3／19K遺伝子のKT-3Bへの連結長さが約780bpのSK-E3／1 9K構造体由来からE3／19K遺伝子を、実施例２Biに記載されているようにして、取り出し、１％アガロース／TBEゲル電気泳動法で単離する。次にXhoＩ−ClaＩE3／19KフラグメントをKT-3Bレトロウィルス骨格に連結する。この構造体をKT-3B／E3／19Kと呼ぶ。DH5α細菌株をK T-3B／E3／19K構造体で形質転換することによってこの構造体を増幅する。具体的に述べると、該細菌を、1〜100ngの連結反応混合物DNAで形質転換する。その形質転換された細菌細胞を、アンピシリンを含有するLBプレート上にプレートする。これらのプレートを一夜37℃でインキュベートし、細菌のコロニーを選択し、そのコロニーからDNAを調製する。そのDNAをXhoＩとClaＩで消化する。E3／19 K遺伝子を含有するプラスミドについて予想されるエンドヌクレアーゼ制限開裂フラグメントの大きさは780bpと1300bpである。Ｃ．合成E3／19K遺伝子のKT-3B中へのクローン化ｉ．E3／19K遺伝子DNAの合成合成DNAの化学合成についてはすでに報告されている（Caruthersら、Methods in Enzymology，211巻、３頁、1992年）。E3／19K遺伝子をコードする配列は、P CRプライマーとして５′と３′のリミットを用いそして同じXhoＩとClaＩのリンカーを末端に保持して、Applied Biosystems Inc.社のDNA合成器モデル392(米国，カリフォルニア州，フォスター・シティ)を用いホスホトリエステル法で合成する。長さが約14〜40個のヌクレオチドの短いオリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動法で精製し、次いで連結して一本鎖のDNA分子を製造する（Ferrettiら、PNAS，83巻、599頁、1986年）。 ii．E3／19K遺伝子DNAの配列決定上記DNAを増幅するため、フラグメントをバクテリオファージベクターのM13mp 18とM13mp19（GIBCO社，メリーランド州，ガーサーズバーグ）中にクローン化する。各フラグメントのヌクレオチド配列を、一本鎖のM13mp18とM13mp19の組換えファージDNAを鋳型として用いおよび選択したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてジデオキシ法によって決定した。これによって、該遺伝子の同一性と構造の完全性を確認する。 iii．合成されたE3／19K遺伝子のKT-3Bへの連結実施例2Biiにさきに記載されているようにして、E3／19K遺伝子をKT-3Bまたは KT-3Cのベクターに連結する。実施例３ MHC保存領域のアンチセンス配列のKT-3CへのクローニングＡ．KT-3CneoαMHCの組み立て MHCクラスＩ対立遺伝子CW３のcDNAクローン(Zemmour et al.，Tissue Antigen s 39：249，1992)を、ヒトMHC（HLA）の異なるハプロタイプに渡って保存されている、KT-3Bバックボーンベクターのネオマイシン耐性遺伝子の非翻訳領域へ挿入するための、特定の配列の増幅のためのPCR反応の鋳型として用いる。 MHCクラスＩ対立遺伝子CW3cDNAを、以下のプライマー対を用い、147から1075 までのヌクレオチド配列に渡って増幅する。 MHC CW3cDNAのヌクレオチド配列147から166までに対応する前向きのプライマー MHC CW3cDNAのヌクレオチド配列1075から1056までに対応する逆向きのプライマー MHCクラスＩ対立遺伝子CW３に相補的な配列に加えて、両プライマーはそれらの５′末端に、PCRアンプリコン産物の効果的な酵素消化のための５個のヌクレオチドから成る「バッファー配列」を含んでいる。両プライマー共に、このバッファー配列の後にはHincII認識配列がある。上記のプライマーによるMHCアンプリコンの産生は、２Bi節で述べたPCRプロトコールを用いて行う。このプロトコールは、Ventポリメラーゼ（New England Biolabs，Bever ly，MA）を用いることにより修正し、さらに、3.5分間の伸長時間のかわりに１分間の伸長時間を含むことにより修正を行う。Ventポリメラーゼは、ブラント末端のあるアンプリコンを産生する。その代わりに、前向きおよび逆向きのプライマーは、MHC CW3の相補配列のみを含めばよい。 MHC CW3cDNAの950塩基対のアンプリコン産物を、Gene Clean(Bio101，San Die go，CA)で精製し、HincIIで消化する。消化されたフラグメントである938塩基対を１％アガロース／TBEゲル電気泳動で単離し、Gene Cleanで精製する。このMHC CW3cDNAの938塩基対フラグメントをネオマイシン耐性遺伝子の３′非翻訳領域に、アンチセンス方向に挿入する。特に、pBluescriptIISK⁺（pSK⁺）プラスミド(Stratagene，San Diego，CA)のヌクレオチド配列番号676のHincII認識配列は、HincIIおよびKpnＩによる消化で除去される。KpnＩの３′末端をT4DNA ポリメラーゼでブラント化し、ブラント末端を連結する。このプラスミドをpSKd lHIIと呼ぶ。実施例１Ａで述べたように、pAFVXNまたはレトロウィルスベクター PUC507からの1.3KbのClaＩ−ClaＩ優性選択マーカー遺伝子フラグメントをpSKdl HIIのClaＩ部位へクローニングする。このプラスミドをpSKdlHII／SVneoと呼ぶM HC CW3cDNAの938塩基対フラグメントを、ネオマイシン耐性遺伝子の３′の非翻訳領域に局在する、pSKdlHII／SVneoのHincII部位へ、アンチセンス方向に挿入する。制限エンドヌクレアーゼによる消化および配列分析により、MHC CW3cDNA938塩基対フラグメントがネオマイシン遺伝子内にアンチセンス方向に存在していることが確認される。このクローンをpSKdlHII／SV neo／αMHCと呼ぶ。 KT3B／SVneo／αMHCの組み立ては、ClaＩの2.2KbのSVneoMHCフラグメントおよびN2R3^-からの1.0KbのMoMLV3′LTR ClaＩ−HindIIIフラグメントを、実施例１で述べたように、pUC31／N2R5g^MプラスミドのClaＩ部位とHindIII部位との間に挿入することによる、３点での連結を以て完了する。Ｂ．KT3C／SVneo／VARNA／αMHCの組み立て MHC CW3アンチセンスRNAの高いレベルの表現は、この配列をAd2 VARNA1プロモーターの下流に挿入することにより達成される。Ad2VARNAプロモーター−MHCアンチセンスcDNAをRNAポリメラーゼIII(polIII)発現カセットとして組み立て、次にKT-3BまたはＣバックボーンに挿入する。このpolIII発現カセットにおいては、Ad2 VARNA1プロモーターの後にアンチセンスαMHCcDNAが続き、その後にpolII I共通終止コドンが続く。二本鎖の−30／＋70 Ad2 VARNA1 プロモーターは化学的に合成し（Railey et al．MOL.Cell.Biol．８：1147，1988）、５′末端にXhoＩを含み、３′末端に、 BglII部位を含む。 VARNA1プロモーター、前向きの鎖 VARNA1プロモーター、逆向きの鎖 XhoＩ付着末端およびBglII付着末端を持つ二本鎖VARNA1プロモーターを作成するために、等量の一本鎖を10mM MgCl₂中にて混合し、95℃で５分間加熱し、徐々に室温に冷却して鎖をアニールさせる。 pSKdlHII／SVneo／αMHCプラスミドからの、ヌクレオチド配列653から854までの、MHCクラスＩ対立遺伝子CW３フラグメントを、以下のプライマー対を用いて増幅する。ヌクレオチド配列653から680までに対応する前向きのプライマーヌクレオチド配列854から827までに対応する逆向きのプライマー MHCクラスＩ対立遺伝子CW３に相補的な配列に加えて、両プライマーはそれらの５′末端に、PCRアンプリコン産物の効果的な酵素消化のための５個のヌクレオチドから成る「バッファー配列」を含む。バッファー配列の後には、前向きのプライマーにおいてはAvrII認識配列が、逆向きのプライマーにおいてはBglII認識配列が続き、それによりpolIII発現カセットにおいてAd2 VARNA1プロモーターに対しアンチセンス方向への挿入が可能となる。前文に議論したプライマーを用いた、MHCアンプリコンの産生は、3.5分間の伸長時間の代わりに0.5分間の伸長時間を含むように修正した、実施例２Biで述べたPCRプロトコールを用いて行う。 MHC CW3cDNAの232塩基対のアンプリコン産物をGene Clean(Bio101，San Diego ，CA)を用いて精製し、AvrIIおよびBglIIで消化し、２％NuSeive−１％アガロース／TBE ゲル電気泳動により単離する。次に211 塩基対のバンドをゲルから切り出し、DNAをGene Cleanを用いて精製する。二本鎖の、polIII共通終止コドンは化学的に合成し(Geiduschek et al.，Annu .Rev.Biochem．57：873，1988)、５′末端にAvrII部位を含み、３′末端に、Cla Ｉ部位を含んでいる。 polIII停止コドンの前向きプライマー polIII停止コドンの逆向きプライマー AvrIIおよびClaＩ付着末端をもつ二本鎖polIII翻訳終止コドンを作成するために、等量の一本鎖を10mM MgCl₂中にて混合し、95℃で５分間加熱し、徐々に室温に冷却して鎖をアニールさせる。 αMHCクラスＩ対立遺伝子CW３アンチセンス鎖のためのpolIII発現カセットは、XhoＩ−BglIIAd2 VARNA1ロモーターフラグメント、およびBglII−AvrIIαMHC CW3 フラグメント、およびAvrII−ClaＩ転写終止フラグメントを、pSKII^-のXho Ｉ部位とClaＩ部位との間にクローン化することによる、４点での連結で組み立てる。この構造物をpSK／VARNA／αMHCと呼ぶ。 KT3B／SVneo／VARNA／αMHCの組み立ては、二段階の連結により完了する。第一段階は、XhoＩ−Cla−Ｉ VARNA／αMHCフラグメントおよびN2R3^-からの1.0Kb のMoMLV3′LTR ClaＩ−HindIIIフラグメントを、実施例１に述べたようにpUC31 ／N2R5g^MプラスミドのXhoＩ部位とHindIII部位との間に挿入することによる、３点での連結である。この構造物をKT3B／VARNA／αMHCと呼ぶ。第二の連結段階においては、KT3B／VARNA／αMHCのClaＩ部位に、1.3KbのClaＩ−B stBＩ SVneoフラグメントを挿入する。この構造物をKT3B／SVneo／VARNA／αMHC と呼ぶ。実施例４ MHCクラスＩのＨ鎖の保存領域を切断するリボザイムのKT-3BへのクローニングＡ．pSK／VARNA／MHCHRBZの組み立て形質導入された細胞において、MHCクラスＩの発現を効果的に阻害するために、MHCクラスＩ対立遺伝子に対するターゲット特性を持つヘアピンリボザイムを、KT3B／SVneoベクターに挿入する。このリボザイムは、Ad2VARNA1プロモーターから高レベルに発現される。MHCヘアピンリボザイム（HRBZ）を、実施例３に述べたpolIIIpSK／VARNA／αMHC発現カセットに挿入する。 HRBZとMHCクラスＩ対立遺伝子CW３とは、以下に示す相同な配列を有する。 HRBZは、AGTCというヘアピン基質モチーフのＡ残基が、ターゲット配列に含まれた後に切断するように設計されている。切断に続いてHRBZはリサイクルされ、別のMHCクラスＩ RNA分子とハイブリダイズし、切断することができる。二本鎖HRBZは、先に定義したように(Hampel et al.，Nucleic Acids Research 18：299，1990)、４個の塩基からなる「テトラループ」３および引き伸ばされたヘリックス４を含んでおり、上記のMHCクラスＩと相同な配列に対する特異性を有し、化学的に合成され、５′末端にBglII部位を含み、３′末端にAvrII部位を含む。 MHC HRBZ、センス鎖 MHC HRBZ、アンチセンス鎖 BglII付着末端およびAvrII付着末端を持つ二本鎖MHCクラスＩ特異HRBZを形成するために、等量の一本鎖を10mM MgCl₂中で混合し、95℃で５分間加熱し、徐々に室温に冷却して鎖をアニールさせる。 MHC HRBZのためのpolIII発現カセットは、BglII付着末端およびAvrII付着末端を持つ化学的に合成した二本鎖MHCクラスＩ特異HRBZを、SglIIおよびAvrIIで消化しCIAPで処理したpSK／VARNA／αMHC配列、すなわちαMHC配列が除去されている発現ベクターに連結することにより組み立てる。このプラスミドをpSK／VARNA ／MHCHRBZと呼び、Ad2 VARNA1プロモーターおよびそれに続くMHC HRBZおよびさらにそれに続くpolIII共通終止コドン配列を含む。polIII発現成分には、XhoＩ認識部位およびClaＩ認識部位が隣接する。Ｂ．KT3B／SVneo／VARNA／MHCHRBZの組み立て KT3B／SVneo／VARNA／MHCHRBZの組み立ては、二段階の連結により完了する。第一段階は、XhoＩ−ClaＩ VARNA／MHCHRBZフラグメントおよびN2R3^-からの1.0K bのMoMLV3′LTR ClaＩ−HindIIIフラグメントを、実施例１に述べたpUC31／N2R5 g^M プラスミドのXhoＩ部位とHindIII部位との間に挿入する、３点での連結である。この構造物をKT3B／VARNA／MHCHRBZと呼ぶ。第二段階では、 1.3KbのClaＩ−BstBＩSVneoフラグメントをKT3B／VARNA／MHCHRBZのClaＩ部位に連結する。この構造物をKT3B／SVneo／VARNA／MHCHRBZと呼ぶ。実施例５ PSF1アンチセンスcDNAのクローニングＡ．KT3C／SVneo／αPSF1の組み立て PSF1のcDNAクローン(Spies et al.，Nature 351：323，1991；Spies et al.， Nature 348：744，1990)を、KT-3Bバックボーンベクターのネオマイシン耐性遺伝子の非翻訳領域へ挿入するための、特定配列の増幅のためのPCR反応における鋳型として用いる。PSF1cDNAを、91から1124の間のヌクレオチド配列に渡り、以下のプライマー対を用いて増幅する。ヌクレオチド配列91から111までに対応する前向きのプライマーヌクレオチド配列1124から1105に対応する逆向きのプライマー PSF1に相補的な配列に加えて、両プライマーはそれらの５′末端に、PCRアンプリコン産物の効果的な酵素消化のための、５個のヌクレオチドから成る「バッファー配列」を含む。両プライマーにおいて、バッファー配列の後にはHincII認識部位が続く。上記のプライマーを持つPSF1アンプリコンの産生は、実施例２Bi で述べたPCRプロトコールを用いて行う。このプロトコールを、Ventポリメラーゼ（New England Biolabs，Beverly，MA）を用いることによって修正し、3.5分間の伸長時間の代わりに１分間の伸長時間を含むことでさらに修正する。Ventポリメラーゼはブラント末端を持つアンプリコンを産生する。Ｂ．KT3B／SVneo／VARNA／αPSF1の組み立て PSF1アンチセンスの高いレベルの発現は、この配列をAd2 VARNA1プロモーターの下流に挿入することにより達成される。Ad2 VARNAプロモーター−PSF1アンチセンスcDNAは、まずpolIII発現カセットとして組み立て、次にKT-3Bバックボーンに挿入する。このpolIII発現カセットにおいては、Ad2 VARNA1プロモーターの後にPSF1cDNAが続き、その後にpolIII共通終止シグナルが続く。 PSF1cDNAの91から309までのヌクレオチド配列を、以下のプライマー対を用いたPCR反応において増幅する。ヌクレオチド配列91から111に対応する前向きのプライマーヌクレオチド配列309から288に対応する逆向きのプライマー PSF1に相補的な配列に加えて、両プライマーはそれらの５′末端に、PCRアンプリコン産物の効果的な酵素消化のために、５個のヌクレオチドから成る「バッファー配列」を含む。バッファー配列の後には、前向きのプライマーにおいては AvrII認識部位が続き、逆向のプライマーにおいてはBglII認識部位が続いており、そのことにより、RNAポリメラーゼIII発現カセットにおいて、Ad2 VARNA1プロモーターに対してアンチセンス方向の挿入が可能となる。上記のプライマーを持つPSF1アンプリコンの産生は、実施例２Biで述べ、3.5分間の伸長時間の代わりに0.5分間の伸長時間を含むように修正したPCRプロトコールを用いて行う。 MHC CW3ScDNAの240塩基対のアンプリコン産物を、Gene Clean(B io101，San Diego，CA)で精製し、AvrIIおよびBglIIで消化し、２％NuSieve−１％アガロース／TBEゲル電気泳動により単離する。次に、211塩基対のバンドをゲルより切り出し、Gene Cleanで精製する。 KT3B／SVneo／VARNA／αPSF1の組み立ては、二段階の連結により完了する。第一段階は、XhoＩ−ClaＩ VARNA／αPSF1フラグメント、およびN2R3^-からの1.0Kb のMoMLV3′LTR ClaＩ−HindIIIフラグメントを、実施例１に述べたpUC31／N2R5g^M プラスミドのXhoＩ部位とHindIII部位との間に挿入する、３点での連結である。第二の連結段階においては、1.3KbのClaＩ−BstBＩ SVneoフラグメントを、KT 3B／VARNA／αPSF1のClaＩ部位に連結する。この構築物をKT3B／SVneo／VARNA／ αPSF1と呼ぶ。実施例６ PSF1の保存領域を切断するリボザイムのKT-3BへのクローニングＡ．pSK／VARNA／PSF1HRBZの組み立て形質導入された細胞におけるPSF1の発現を効果的に阻害するために、PSF1RNA に対するターゲット特異性を持つヘアピンリボザイムを、KT3B／SVneoベクターに挿入する。リボザイムは、Ad2 VARNA1プロモーターから高いレベルで発現される。PSF1ヘアピンリボザイム（HRBZ）を、実施例３に述べたpolIIIpSK/VARNA／ αMHC発現カセットに挿入する。次いで、PSF1 HRBZ-polIII発現カセットをKT3B ／SVneoバックボーンベクターに挿入する。 HRBZおよびPSF1RNAは、以下に示す相同な配列を有する。 TRBZは、TGTCヘアピン基質モチーフのＴ残基がターゲット配列に含まれた後に切断するよう設計されている。切断に続いてHRBZはリサイクルされ、他のPSF1RNA分子にハイブリダイズし切断する。二本鎖HRBZは、先に定義したように(Hampel et al.，Nucleic Acids Research 18：299，1990)、４個の塩基から成る「テトラループ」３および引き伸ばされたヘリックス４を含んでおり、上記のPSF1に相同な配列に対し特異性を有し、化学的に合成され、５′末端にBglII部位を含み、３′末端にAvrII部位を含む。 PSF1 HRBZ、センス鎖 PSF1 HRBZ、アンチセンス鎖 BglII付着末端およびAvrII付着末端を持つ、PSF1に特異的な二本鎖HRBZを作成するために、等量の一本鎖を10mM MgCl₂中で混合し、95℃で５分間加熱し、徐々に室温に冷却して鎖をアニールさせる。 PSF1 HRBZのためのpolIII発現カセットは、BglII付着部位およびAvrII付着部位を持つ化学的に合成したPSF1に特異的な二本鎖HRBZの、BglIIおよびAvrIIで消化しCIAPで処理したpSK／VARNA／αMHC配列すなわちαMHCがゲルにより除去精製されているpolIII発現ベクターへの連結により組み立てる。このプラスミドをpS K／VARNA／PSF1HRBZと呼び、Ad2VARNA1プロモーターを含み、その後にPSF1HRBZ が続き、さらにその後にpolIII共通終止コドンが続く。polIII発現成分には、Xh oＩ認識部位およびClaＩ認識部位が隣接する。Ｂ．KT3B／SVneo／VARNA／PSF1HRBZの組み立て KT3B／SVneo／VARNA／MHCHRBZの組み立ては、二段階の連結により行う。第一段階は、XhoＩ−ClaＩ VARNA／PSF1HRBZフラグメントおよびN2R3^-からの1.0Kbの MoMLV3′LTR ClaＩ−HindIIIフラグメントを、実施例１に述べたようにpUC31／N 2R5g^M プラスミドのXhoＩ部位およびHindIII部位へ挿入する、３点での連結である。この構造物をKT3B／／VARNA／PSF1HRBZと呼ぶ。第二の連結段階においては、1.3KbのClaＩ−BstBＩ SVneoフラグメントをKT3B／VARNA／PSF1HRBZのClaＩ部位に連結する。この構造物をKT3B／SVneo／VARNA／PSF1HRBZと呼ぶ。実施例７多価組換えレトロウィルスベクターKT3B-GC／E3／19Kの組み立てゴーシェ病は、酵素グルコセレブロシダーゼの欠損を特徴とする遺伝病である。この酵素欠損は、体内の全細胞のリソゾーム中にグルコセレブロシドの蓄積を引き起こす。しかしながら、この病気の表現型は、この病気の非常に希な神経症型を除けば、マクロファージにおいてのみ現れる。この病気は通常、肝臓およびひ臓の肥大を引き起こし、骨中にも障害を起こすことがある。（Beutler et al. ，Science 256：794，1992；Scriver et al.，The Metabolic Basis of Inherit ed Disease，6th ed.，２：1677）。この型の治療は、欠損している細胞酵素を供給する単一遺伝子置換療法の一例である。ｉ．KT3B-GCの組み立て cDNAをコードしている配列の５′にXhoＩ制限酵素部位を含み、cDNAをコードしている配列の３′にClaＩ制限酵素部位を含んでいるグルコセレブロシダーゼ（GC）cDNAクローンをまず生成する。このクローンは、pMFG-GC(Ohashi et al.，PNAS 89：11332，1992，Nolta et al. ，Blood，75：787，1991)を、NcoＩ（New England Biolabs，Beverly，MA）を用いて消化し、VentDNAポリメラーゼ（New England Biolabs，Beverly，MA）によりブラント化し、さらにXhoＩリンカーに連結することにより生成する。次にこのプラスミドをBamHＩ（New England Biolabs，Beverly，MA）で消化し、VentDN Aポリメラーゼでブラント化し、さらにClaＩリンカーに連結する。次いでこのフラグメントをXhoＩおよびClaＩ消化し、XhoＩ−ClaＩGCフラグメントおよび1.0K bのMoMLV3′LTR ClaＩ−HindIIIフラグメントを、実施例１のpUC31／N2R5g^M プラスミドのXhoＩ部位に挿入する、３部分の連結で連結する。この構造物をKT3B- GCと呼ぶ。 ii．KT3-GC／E3／19Kの組み立て 87，Gorman et al.，Mol.Cell.Bio．２：1044，1982；Jang et al.，J.，Virol ．63：1651，1989）は、脳心筋炎ウイルスEMCV（ATCC No．VR-129B）の５′非翻訳領域の、IRBSを含む、ウイルスゲノムの260から848までのヌクレオチドを含む。EMCVの260から827までのヌクレオチドを、PCR法により、pBS-ECATから、以下のプライマー対を用い増幅する。 IRBSとBstBＩエンドヌクレアーゼ部位とを含む前向きのプライマー IRBSとSalＩエンドヌクレアーゼ部位とを含む逆向きのプライマー前向きのプライマーおよび逆向きのプライマーを用いた増幅から得られるアンプリコンは、５個の塩基対から成る「バッファー配列」の内側において、BstBＩ認識部位およびSalＩ認識部位に隣接する。PCR増幅の後、アンプリコンをSalＩで消化し、あらかじめXhoＩで消化した実施例２のプラスミドKT3B-E3／19Kに連結する。連結の後、直鎖化したプラスミドをBstBＩおよびClaＩで消化し、E3／1 9K配列に連結したIRBS配列を含んでいるBstBＩ−ClaＩフラグメントを放出する。このBstBＩ−ClaＩフラグメントをあらかじめClaＩで消化したKT3B-GC構造物に連結する。このプラスミドはKT3B-GC／E3／19Kとして知られている。 iii． KT3B-GC／E3／19K／αMHCの組み立てレトロウィルスベクターKT3B-GC／E3／19Kの変形体は、GC配列およびE3／19K 配列の両方を含むように組み立てることができるが、さらに、実施例２および実施例３で述べた３個のクラスＩMHC対立遺伝子であるＡ２およびCW３およびＢ27 の間の保存領域に対して特異的なアンチセンス配列を含むことができる。このベクターは、KT3B-GC／E3／19K／αMHCとして知られており、E3／19K配列の３′末端にMHCアンチセンス配列を取り込み、キメラ分子を発現するように設計されている。このレトロウィルスベクターKT3B-GC／E3／19K／αMHCは、MHCアンチセンス配列を含んでいる、ClaＩで消化したPCR増幅産物を、KT3B-GC／E3／19KベクターのClaＩ部位へ連結することにより組み立てることができる。さらに明確には、MHCクラスＩ対立遺伝子CW３のcDNAクローン(Zemmour et al.，Tissue Antigen s 39：249，1992)を、ヌクレオチド653から854に渡り、以下のプライマーを用いて、PCR法により増幅する。 αMHCの前向きのプライマー αMHCの逆向きのプライマー ClaＩで消化した増幅産物を、あらかじめ部分的に消化したKT3B-／GC／E3／19 Kベクターへ、アンチセンス方向に挿入するために、プライマー対はClaＩ制限酵素部位に隣接している。ClaＩフラグメントを逆方向に置くことにより、このベクターは転写に際し負のアンチセンス鎖を発現することができる。 iv．KT3B-GC／αMHCの組み立て MHCクラスＩを抑制することができるGCレトロウィルスのもう一つの例は、先に述べた３個のMHCクラスＩ対立遺伝子の間の保存領域に特異的な同じアンチセンス配列を含む、KT3B-GC／αMHC構造物である。この例では、MHCアンチセンス配列は、ネオマイシン選択マーカーを含む完全なKT-3Bバックボーンという情況において、治療用遺伝子の３′末端に取り込まれるように設計されている。さらに明確には、実施例１に述べたClaＩ−BstBＩネオマイシン遺伝子フラグメントを、ClaＩおよび子ウシ小腸アルカリ性フォスファターゼを用いてあらかじめ消化処理した前述のKT3B-GC構造物へ、センス方向に挿入する。いったん一つのクローンを制限酵素分析により選択してから、KT3B-GC／E3／19K αMHCの組み立ての項で述べたMHCクラスＩ保存配列を含んでいる、ClaＩで消化した同じPCR増幅産物を、ClaＩおよび子ウシアルカリ性フォスファターゼ（CIAP）を用いてあらかじめ消化処理したKT3B-GC／Neoベクターに連結し、KT3B-GC／αMHC発現ベクターを作成する。実施例８多価組み換えレトロウィルスベクターKT3B-GC／E3／19Kを用いたパッケージング細胞系DAの形質導入Ａ．プラスミドDNAのトランスフェクション５ｘlO⁵個の293 2-3細胞(293細胞ATCC No．CRL 1573，WO 92／05266に由来する細胞系)を、６cmの組織培養皿に、集密状態の約50％に播種する。翌日、トランスフェクションの４時間前に培地を４mlの新鮮培地と交換する。標準的なリン酸カルシウムとDNAとの共沈殿は、10.0μｇのKT3B-GC／E3／19Kプラスミドおよび10.0μｇのMLP Gプラスミドを、２Ｍ CaCl₂溶液と共に混合し、１倍のHepes緩衝塩類溶液、pH6.9を加え、室温で15分間インキュベートすることにより行う。リン酸カルシウムとDNAとの共沈殿物を、293 2-3細胞に移し、次いでそれらを５％CO₂中で、37℃で一晩インキュベートする。翌朝、一倍のPBS溶液、pH7.0で細胞を３回洗浄する。新鮮培地を細胞に加え、10％CO₂中で、37℃で一晩インキュベートする。翌日、細胞を除いて培地を集め、0.45μのフィルターを通す。この上清を、パッケージング細胞および腫瘍細胞に形質導入するために用いる。他のベクターのための一時的なベクター上清は、同様の方法で生成する。Ｂ．パッケージング細胞系の形質導入 DA細胞（D 17細胞ATCC No.183，WO 92／05266に由来する異種指向性細胞系）を、10cmの培養皿当たり５ｘ10⁵個播種する。約0.5mlの新しく採集した293 2-3 上清（または、−70℃に保存しておいた上清）を、DA細胞に加える。翌日、これらの細胞にフレオマイシンを加え、薬剤耐性のあるプールを一週間に渡って生成する。この細胞のプールを96ウェルプレートのウェル当たり一個の細胞となるよう希釈クローン化する。24クローンを24ウェルプレートに広げ、次に６ウェルプレートに広げ、その時点での細胞上清を採集し、力価を測定する。ベクター産生のためDAクローンを選択し、DA-GC／E3／19Kベクターと呼ぶ。ベクター上清は、ポリブレンまたはプロタミン・硫酸を含んでいる通常培地で培養したDA-GC／E3／19Kクローンの10cmの集密状態のプレートから採集する。代わりに、ベクター上清をバイオリアクターまたはローラーボトルより収穫し、使用する前にプロセスし、さらに精製することもできる。薬剤耐性マーカーのないベクター、またはパッケージング細胞系の中にすでにマーカーを持っているベクターのためには、安定して形質導入されたクローンの選択を、産生された293 2-3上清による細胞の形質導入の一日ないし二日後に、形質導入されたDA細胞の希釈クローニングにより行わねばならない。希釈クローンは、逆転写PCRとして知られている、メッセンジャーRNAの逆転写およびそれに続くポリメラーゼ連鎖反応法によるcDNAメッセージの増幅を用いてグルコセレブロシダーゼの発現およびE3／19Kの発現の有無についてスクリーニングする。逆転写PCR用の商業用のキットは、Invitrogen Corp．(San Diego，Ca)から入手できる。逆転写PCRは、少なくとも10日間増殖させたクローンについて行うべきであり、安定して形質転換したクローンの正当な数を見出だすためには、約50個ないし100個のクローンをスクリーニングする必要があると考えられる。逆転写PCR を行うためには、増幅すべき各々のメッセージに特異的なプライマーが必要になる。グルコセレブロシダーゼのための521塩基対産物およびE3／19Kメッセージスクリーニングのための401塩基対産物を増幅するために設計されたプライマーは以下の通りである。グルコセレブロシダーゼのためのスクリーニング用プライマー E3／19Kのためのスクリーニングプライマー実施例９複製コンピテントレトロウイルスの検出延長されたＳ⁺Ｌ^-分析は、興味の対象となる細胞系の上清に、感染力のある複製コンピテントなウイルスが存在するかどうかを決定する。この分析は、感染力のあるレトロウイルスが指示細胞系MiCl₁（ATCC CCL 64.1）にフォーカスを産生するという実験観察にもとづくものである。MiCl₁細胞系は、マウス肉腫ウイルス(MSV)で形質導入したMvlLuミンク細胞系(ATCC CCL 64)に由来する。これは、マウス肉腫プロウイルスを含んでいる、非産生かつ非形質転換性復帰クローンであり、肉腫を形成することで（Ｓ⁺）MSVゲノムの存在を示し、白血病を引き起こさないことで（Ｌ⁺）複製コンピテントウイルスの不在を示す。MiCl₁細胞の複製コンピテントレトロウイルスによる感染は、MSVゲノムを「活性化」し、「形質転換」の引き金を引き、結果としてフォーカスを形成する。複製コンピテントレトロウイルスの存在を調べるため、上清を細胞系から取り、0.45μのフィルターを通していかなる細胞も除去する。一日目に、ウェル当たり（調べる試料当たり一ウェル）１ｘ10⁵個のMvlLu細胞を、２mlのDMEMおよび10 ％FBSおよび８μｇ／mlのポリブレン中にて、６ウェルプレートに播種する。ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールのため、MvlLu細胞を別の６ウェルプレートに、同じ方法で播種する。この細胞を、10％CO₂下において、37℃で一晩インキュベートする。二日目に、1.0mlの試料上清をMvlLu細胞に加える。ネガティブコントロールプレートには、1.0mlの培地を加えてインキュベートする。ポジティブコントロールは、ポジティブコントロールウェル中の細胞に加えるMAウイルス（Miller et al.，Molec.and Cell Biol.,５：431，1985）が３段階の希釈(各々1.0mlの培地中に、200フォーカス形成単位(ffu)または20ff uまたは２ffu)から成る。この細胞を一晩培養する。三日目に、培地を吸引し、3 .0mlの新鮮なDMEMおよび10％FBSを細胞に加える。この細胞を集密状態まで増殖させ、６日目および10日目に１：10に分割し、いかなる複製コンピテントレトロウイルスも増幅させる。13日目に、MvlLu細胞の培地を吸引し、2.0mlのDMEMおよび10％FBSを細胞に加える。さらに、ウェル当たり１ｘ10⁵個のMiCl₁細胞を、2.0 mlのDMEMおよび10％FBSおよび８μｇのポリブレン中に播種する。14日目に、Mvl Lu細胞の上清をMiCl₁細胞の対応するウェルに移し、10％CO₂下で、37℃で一晩インキュベートする。15日目に、培地を吸引し、3.0mlの新鮮なDMEMおよび10％FBS を細胞に加える。21日目に、単層の細胞層上で、細胞のフォーカス形成（単層上に重なって増殖し付着したまま残る、集合した屈折性のある細胞として見える）を調べる。もしMiCl₁上にフォーカスが現れれば、その試料には複製コンピテントレトロウイルスが混入しているものとする。実施例10 E3／19Kレトロウイルスベクターによる細胞系の形質誘導以下の、ヒトおよびマウスの、接着性のある細胞系を、４μｇ／mlのポリブレンと共に10cmの皿当たり５ｘ10⁵個播種するHT 1080(ATCC No.CCL 121)，Hela(AT CC No.CCL2)，BC10ME(Patek et al. ，Cell.Immuno．72：113，1982，ATCC No.TIB85)，HIV-I IIIBenvを発現しているBC10MEであるBCenv，(Warner et al.，AIDS Res.and Human Retroviruses７： 645，1991)、南カリフォルニア大学、Gunther Dennertより入手したＬ33，L33en v．翌日、DA E3／19K プールから得た1.0mlの濾過上清を、各々の細胞培養プレートに加える。翌日、フレオマイシンを、すべての細胞培養物に加える。すでにネオマイシン耐性である細胞系については、KT−3Cバックボーン（フレオマイシン耐性）内のE3／19Kを用いる。293 2−3のための、またはDAに由来する細胞系からの一時的な上清を使用することができる。選別が完了し、遺伝子発現を調べるために十分な細胞数を生じるまで、培養物を維持する。形質導入した細胞系を、各々HT1080-E3／19K，Hela-E3／19K，BC10ME-E3／19K，L33-E3／19K，L33env- E3／19Kと呼ぶ。 EBVで形質転換した細胞系（BLCL）および他の浮遊細胞系は、照射した産生者細胞系であるDE−E3／19Kと共に培養することにより形質導入される。特に、照射した（10,000rads）産生者細胞系は、４μｇ／mlのポリブレンを含む増殖培地において、６cmの皿当たり、５ｘ10⁵個の細胞を播種する。２から24時間にわたって細胞を接着させた後、10⁶個の浮遊細胞を加える。２日ないし３日後、浮遊細胞を移し、遠沈し、１mg／mlのフレオマイシンを含む増殖培地に再浮遊させ、丸底型96ウェルプレートの10ウェルに播種する。培養物を24ウェルプレートに拡張し、次にＴ−25フラスコに拡張する。実施例11 多価組み換えレトロウイルスベクター構造物KT3B-GC／E3／19KにおけるE3／19 Kの発現Ａ．E3／19Kのウエスタンブロット分析放射線免疫沈降検定法（RIPA）用ライゼートをE3／19Kの発現の分析のために選択した培養物から作成する。RIPAライゼートは、集密状態の細胞プレートから調製する。まず培地を細胞から吸引する。細胞を含んでいる培養皿の大きさに応じて、100ないし500μｌの氷冷したRIPA溶菌緩衝液（10mM Tris，p H7.4；１％Nonidet P40（Calbiochem，San Diego，CA）；0.1％SDS；150mM NaC ）を、細胞に加える。マイクロピペットを用いて細胞をプレートより剥がし、混合物を微小遠沈管に移す。遠沈管を５分間遠心して細胞の残骸を沈殿させ、上清を別の試験管に移す。上清を、10％SDS−PAGEゲルにて電気泳動し、蛋白質のバンドをCAPS緩衝液中にImmobilon膜（Aldrich，Milwaukee，WI）（10mM CAPS，pH 11.0；10％メタノール）に、10ないし60ボルトで２ないし18時間にわたり移動させる。この膜を、CAPS緩衝液から、５％Blotto（５％脱脂粉乳；50mM Tris，pH7 .4；150mM NaCl；0.02％アジ化ナトリウム；0.05％ Tween20）に移し、E3／19K に対するマウスモノクローナル抗体(Severinsson et al.，J.Cell Biol．101：5 40，1985)でプローブする。膜に結合した抗体を、¹²⁵Ｉ−プロテインＡを用いて検出する。実施例12 非形質導入細胞に比較してクラスＩの発現レベルが減少していることを証明するためのE3／19K−ベクターで形質導入した細胞のFACS分析 E3／19K−ベクターで形質導入した細胞系を、FACS分析により、MHCクラスＩ分子の発現について検定する。非形質導入細胞についても、MHCクラスＩ分子の発現について分析し、E3／19Kで形質導入した細胞と比較し、MHCクラスＩ分子の発現におよぼす形質導入の効果を測定する。マウス細胞系である、L33-E3／19K，L33env-E3／19K，L33，L33env，BC10ME， BCenv，BCenv-E3／19Kについて、細胞表面上のＨ− ２^d分子の発現を調べる。ほぼ集密状態に近く増殖した細胞を、Versence処理により培養皿から除去し、冷却した（４℃）PBSに１％のBSAおよび0.02％のアジ化ナトリウムを加えたもの（洗浄緩衝液）を用いて、200xgの遠心により２回洗浄する。２ｘ10⁶個の細胞を、微小遠沈管に入れ、200xgで遠心して沈殿させ、上清を除去する。細胞のペレットを、Ｈ−２Ｄ^dに特異的なMab34-2-12s（50μｌ）の、１対100に希釈した精製抗体、ATCC No.HB87）中に再浮遊させ、４℃で30分間、時々混合しながらインキュベートする。抗体で標識された細胞を、１mlの洗浄緩衝液（４℃）で２回洗浄し、遠心して上清を除去する。細胞を、ビオチニル化したヤギ抗マウスκ型Ｌ鎖Mab(Amersham，Arlington Heights，IL)(50μｌの、１対100に希釈した精製抗体）に再浮遊させ、４℃で30分間インキュベートする。細胞を洗浄し、50μｌのアビジンを結合したFITC（Pierce，Rockford，IL）に再浮遊させ、４℃で30分間インキュベートする。細胞を、もう一度洗浄し、１ml の洗浄緩衝液に再浮遊させ、FACStar Analyzer（Becton Dickinson，Los Angele s，C）で分析するまで氷冷しておく。形質導入した細胞の平均蛍光強度を、非形質導入細胞の平均蛍光強度と比較し、表面MHCクラスＩ分子の発現におよぼすE3 ／19K蛋白質の効果を測定する。実施例13 マウス CTL分析 Balb／ｃマウスに、10⁷個の、照射した(10,000ads)BCenv細胞を注入する。７日後に、ひ臓を取り出し、単一細胞の浮遊物となるまで分散させ、３ｘ10⁶／ml のひ臓細胞を、６ｘ10⁴／mlの照射したBCenvまたはBCenv-E3／19K細胞と共に、Ｔ−25フラスコ中において、37℃で７日間、in vitroで培養する。培地は、RPMI 1640および、５％の熱失活させたウシ胎児血清(FBS)および、１mMピルビン酸および、50μｇ／mlのゲンタマイシンおよび、10^-5Ｍ２−メルカプトエタノールから成る。７日後にエフェクター細胞を採取し、種々のエフェクター対ターゲット細胞比を用い、96ウェルのマイクロタイタープレートにおいて、標準的な４時間ないし６時間の分析法により検定する。この分析は、100μCiのNa₂ ⁵¹Cr₄ を用いて、37℃で１時間標識した（Amersham，Arlington Heights Illinois）ターゲット細胞(BCまたは、BCenv，Warner et al.，AIDS Res.and Human Retrovir uses７：645，1991または、BCenv E3／19K)を、ウェル当たり1.0ｘ10⁴個、ウェル当たりの最終全容量を200μｌとして使用する。インキュベーションの後、100 μｌの培地を取り、WALLACガンマスペクトロメーター(Gaithersburg，MD.)で分析する。自然放出（SR）は、ターゲットに培地を加えたものから１分当たりのカウント(CPM)として測定し、最大放出（MR）は、ターゲットに１Ｍ HClを加えたものから測定する。ターゲット細胞の溶解のパーセントを、次のように算出する。〔エフェクター細胞＋ターゲットCPM)−(SR)〕／〔(MR)−(SR)〕ｘ100ターゲットの自然放出値は、典型的にはMRの10％ないし30％である。興味の対象となる遺伝子（リボザイム、E3／19K、アンチセンス等）で形質導入した腫瘍細胞を、ポジティブコントロールである非形質導入細胞系と比較して、HIVに特異的なCTL の誘導および検出の減少を証明するために、この分析法における誘導者および／またはターゲット細胞として用いる。実施例14 Ｅ３−ベクターの形質導入によりクラスＩ分子の細胞表面上での発現が減少する際、BALB／ｃマウスによるL33env細胞の腫瘍拒絶反応は阻害される。 L33env細胞は、遺伝子治療を施した形質転換細胞のモデルとして用いられている。遺伝子治療を施した細胞は、外来蛋白質を産生し、それにより、CTLによる排除のための可能なターゲットとなる。生きているＬ33腫瘍細胞を注入されたBALB／ｃマウスは、注入後３週間以内に、カリパス測定により検出し得る固形腫瘍を形成することが示されている。しかしながら、生きているL33env 形質転換腫瘍細胞(HIV−Ｉ_IIIBエンベロープ蛋白質の発現について形質導入し、選択したＬ33細胞)を注入されたBALB／ｃマウスは、Ｈ−２Ｄ^dという環境の中の HIV ENVを認識し、腫瘍細胞を拒絶し、15週間後までは腫瘍は現れない(Warner e t al.，AODS Res.and Human Retroviruses７：645，1991)。E3／19KベクターによるL33env細胞の形質転換は、MHCクラスＩ分子の細胞表面上の発現を減少させ、それによりこれらの細胞は、免疫監視機構を逃れることができ、腫瘍を形成する。L33env腫瘍は、MHCクラスＩ分子の細胞表面上の発現が、細胞のE19遺伝子との同時形質導入により減少していたことを示す。このことは、示適免疫系の排除機構を妨げる。三つの腫瘍細胞系、すなわちＬ33および、L33envおよび、L33env E3／19Kを、 10％FBSを含むDMEM中で増殖させる。腫瘍細胞を冷却した（４℃）PBSで穏やかにすずき、verseneで処理してプレートから細胞を剥がす。細胞をプレートから吸引した後、単一細胞の浮遊物を滅菌したプラスチック管に入れる。細胞の浮遊物を滅菌したPBS（４℃）で２回洗浄し、数えた後、PBSに再浮遊させ、10⁷細胞／m lとする。BALB／ｃマウス（４週ないし６週令）に、10⁶個の生きている肝腫瘍細胞(0.1ml)を皮下注射し、腫瘍形成および腫瘍排除を査定する。異なるマウスに、異なる腫瘍細胞系を注射する。Ｌ33細胞を注射したマウスは、腫瘍形成のポジティブコントロール用の動物であり、それに対し、L33envを注射されたマウスは、ネガティブコントロールであって、envに特異的なCTL応答により、腫瘍細胞を拒絶する。E3／19Kで形質転換したL33env細胞を注射されたマウス群を、L33env細胞におけるE3／19Kの発現の、マウスのこれらの腫瘍細胞に対する免疫応答に及ぼす効果を示すために検査する。実施例15 非形質導入細胞に比較して、MHCクラスＩの発現レベルが減少することを示すための、E3／19K−ベクターで形質導入したヒト細胞のFACS分析 E3／19Kベクターで形質導入した細胞系を、クラスＩ分子の発現について、FAC S分析により検定する。非形質導入細胞を、クラスＩ分子の発現について分析し、E3／19Kで形質導入した細胞と比較し、形質導入が持つクラスＩ分子の発現に対する効果を測定する。二つのヒト細胞系である、JY−E3／19Kおよび、JY^-について、細胞表面上のHL A-A2分子の発現を検定する。10⁶細胞／mlまで増殖した浮遊細胞を、ピペットを用いて培養フラスコより取り、冷却した（４℃）、PBSに１％BSAおよび0.02％アジ化ナトリウムを加えたもの（洗浄緩衝液）を用いて、200xgの遠心により、２回洗浄する。200万個（２ｘ10⁶）の細胞を微小遠沈管に入れ、200xgで沈殿させ、上清を除去する。細胞のペレットを、HLA-A2に特異的なMab BB7.2（50μｌの１対100に希釈した精製抗体、ATCC No.HB82）と共に再浮遊させ、４℃で30分間、時々混合しながら、抗体とインキュベートする。抗体で標識された細胞を１ml の洗浄緩衝液（４℃）で、２回洗浄する。上清を除去するに先立ち、細胞を、ビオチニル化したラット抗マウスκ型Ｌ鎖のMab(50μｌの、１対100に希釈した精製抗体) と共に再浮遊させ、４℃で30分間インキュベートする。細胞を洗浄し、 50μｌのアビジンと結合させたFITCと共に再浮遊させ、４℃で30分間インキュベートする。細胞をもう一度洗浄し、１mlの洗浄緩衝液に再浮遊させ、FACStar Analyzerで分析するまで氷の上に保持する。形質導入した細胞の平均蛍光強度を、非形質導入細胞の平均蛍光強度と比較し、E3／19K蛋白質の、表面MHCクラスＩ分子の発現に対する効果を測定する。実施例16 HLA-A2に制限されEBVに特異的なヒトCTL系による、E3／19Kで形質導入したか、もしくは形質導入していない、EBVで形質転換したヒトJY細胞に対する免疫応答の測定 EBVで形質転換した自己の細胞を誘導者として用いた供与者の血液試料から増殖したヒトCTL系は、HLA-A2に制限され、EBV蛋白質に特異的であることが示されてきた。これらのCTL系は、EBVで形質転換した自己の細胞により増殖されており、JYターゲット細胞（HLA-A2^-およびJYで形質転換した）を溶解することができる。クロム放出分析は、これらのCYL系と、E3／I9K遺伝子であらかじめ形質転換されているか、または形質導入されていないJYターゲット細胞とを用いて行う。 E3／19Kで形質転換されたJYターゲット細胞を、この細胞の認識および溶解が、非形質転換JYターゲット細胞と比較して減少していることを証明するために用いる。これらの結果は、MHCクラスＩの表面での発現を減少させる作因を用いた細胞の形質転換が、in vitroにおけるヒト細胞のモデル系における、MHCクラスＩに制限された細胞性免疫応答をも減少させることを示す。約１ｘ10⁶個の照射した(10,000rad)JY細胞を、HLA-2Aであり、かつEBV応答を持つことが確認されているヒトから得た１ｘ10⁷個のPBMC細胞と共に、10mlの培地中で、５％CO₂下において、37℃で７日間ないし10日間培養する。培地は、あらかじめCIL増殖に関して選択した５％熱失活ウシ胎児血清および、１mMピルビン酸ナトリウム、および非必須アミノ酸を加えたRPMI 1640から成る。７日間ないし10日間の培養の後、エフェクター細胞を収穫し、ポジティブコントロールとしての⁵¹Crで標識したJY細胞と、⁵¹Crで標識したJY−E3／19Kとを用いて、標準的な４時間ないし６時間のクロム放出分析をおこなう。JY細胞およびJY-E3／1 9K細胞は、300μCiのNa₂ ⁵¹CrO₄を用い、37℃で１時間標識し、洗浄し、数えた後、ウェル当たり４ｘ10³個の細胞を、最終的なウェル当たりの全量を200μｌとして分析に使用する。インキュベーションの後、100μｌの培地を取り、WALLACガンマスペクトロメーターで分析する。自然放出（SR）は、ターゲットに培地を加えたものから１分間当たりのカウント(CPM)として測定し、最大放出（MR）は、ターゲットに１Ｍ HClを加えたものから測定する。ターゲット細胞の溶解のパーセントを、以下のように算出する。〔エフェクター細胞＋ターゲットCPM)−(SR) 〕／〔(MR)−(SR)〕ｘ100ターゲットの自然放出値は、典型的には、MRの10％ないし30％である。興味の対象となる遺伝子（リボザイム、E3／19K、アンチセンス等）ですでに形質導入されているBLCL細胞を、誘導細胞および／またはターゲット細胞として用いて、EBVに特異的なCTLの誘導および検出が、ポジティブコントロールである非形質導入系と比較して減少することが証明される。実施例17 多価グルコセレブロシダーゼレトロウイルスベクターのex-vivo投与多分化能性造血幹細胞CD34＋細胞を、患者の骨髄から、既知の技術として行われる注射器による排出により採取する。代わりとして、患者が誕生以前に診断された場合には、胎児の臍帯血からCD34＋細胞を得てもよい。一般には、局所麻酔を施し、大腿部骨幹穿刺により、または後部腸骨隆線から、20回の骨髄吸引を行う。骨髄吸引物をプールし、ヘパリン硫酸100Ｕ／mlおよび、100μｇ／mlのデオキシリボヌクレアーゼＩを含んでいる、Hepes緩衝液を含むHank^-ｓ液中に浮遊させ、Ficoll勾配により分離する。淡黄膜のある骨髄細胞を集め、CEPRATE^TMLC(CD34)分離システム（Cellpro，Bothell，WA）により洗浄する。洗浄した淡黄膜のある細胞を、引き続き抗CD34モノクローナル抗体で染め、洗浄し、CEPRATE^TMシステムで得たビオチニル化した二次抗体で染色する。この細胞混合部をCEPRATE^TMアビジンカラムに重層する。ビオチンで標識された細胞はカラムに吸着されるが、標識されていない細胞は通過する。カラムを、CEPRATE^TMシステムの使用法に従ってすすぎ、CD34＋細胞を、ゲル層を手で押しつぶすことによるカラムの振とうにより溶出する。CD34＋細胞を精製した後、精製された幹細胞を数え、20％のプールした非熱失活ヒトAB血清(hAB血清)を含んでいる、Iscoveの変形ダルベッコMEM培地IM DM（Irvine Scientific，Santa Ana，CA）中で、１ｘ10⁵細胞／mlの濃度に播種する。 CD34＋細胞を精製した後、いくつかの方法で、精製された幹細胞を形質転換することができる。一つの方法は、実施例10のような、ベクター産生細胞からの培養上清を含むベクターで、精製した幹細胞の集団を形質導入する。第二の方法では、照射したベクター産生細胞を、精製した非接着性のCD34＋細胞集団と共培養する。第三の好ましい方法では、同様の共培養を含むが、しかしながら、精製したCD34＋細胞は、照射したベクター産生細胞との共培養に先立ち、種々のサイトカインであらかじめ刺激し48時間培養しておく。形質導入に先立つ前剌激は、効果的な遺伝子の転移を増加させる（Nolta et al.，Exp.Hematol．20：1065，199 2）。形質導入のレベルの増加は、効果的なレトロウイルスの形質導入に必要な幹細胞の増殖が増すことに起因する。これらの培養物の増殖を剌激することは、また、患者に再注入するための細胞集団の増加をもたらす。 CD34＋細胞の前刺激は、この細胞を、サイトカインと、IL−１および、IL−３およびIL−６および、肥満細胞増殖因子(MGF)を含む増殖因子との組み合わせと共にインキュベートすることにより行う。前刺激は、培地１ml当たり、１−２ｘ 110⁵個のCD34＋細胞を、骨髄刺激培地を含んでいるＴ25組織培養用フラスコにおいて、48時間培養することにより行う。骨髄刺激培地は、30％非熱失hAB血清および、2mM Ｌ−グルタミンおよび、0.1mM ２−メルカプトエタノールおよび、１ μＭヒドロコルチゾンおよび、１％の脱イオンしたウシ血清アルブミンを含むIM DMから成る。骨髄培養に使用したすべての試薬は、正常な骨髄からの、顆粒球および、赤血球および、マクロファージおよび、巨核球のコロニー形成単位の最大数を支持する能力についてスクリーニングされていなければならない。前刺激のための、ヒトのサイトカインと増殖因子（Immunex Corp.，Seattle，WA）との精製した組み合わせ物は、以下に示す濃度において使用する。大腸菌由来のIL−Ｉ α(100Ｕ／ml)、酵母由来のIL−３（５ng／ml），IL−６（50Ｕ／ml）、MGF（50 ng／ml）（Anderson et al.，Cell Growth Differ．２：373，1991）。 CD34＋細胞を前刺激した後、この細胞を、刺激培地の継続的な存在下に治療用の多価GCベクターを発現している、照射したDA由来の産生細胞系の上に共培養することにより形質導入する。DAベクターを産生する細胞系は、まずトリプシン処理し、10,000radで照射し、骨髄刺激培地中に、１−２ｘ10⁵／mlに再播種する。翌日、１−２ｘ10⁵／mlの前刺激したCD34＋細胞を、DAベクター産生細胞系の単層上に加え、次にポリブレン(Sigma，St.Louis，MO)を加えて、最終濃度を４ug ／mlとする。細胞の共培養は、48時間行う必要がある。共培養の後、CD34＋細胞を、接着性のあるDAベクター産生細胞の単層から、培地の強い吹き付けにより採取し、播種して２時間静置し、全ての接着性のある、剥がれたベクター産生細胞を接着させる。細胞を集め、バイアル当たり１ｘ10⁷細胞のアリコートとして、cryo-protectantを用いて、液体窒素中で凍結する。形質転換したCD34＋細胞を、いったん、外来性の作因の存在について調べた後、凍結した形質転換CD34＋細胞を溶解し、１ｘ10⁵／mlの濃度になるように播種し、骨髄刺激培地中で、さらに48時間培養する。形質転換した細胞を集め、２回洗浄して通常の塩類溶液に再浮遊させる。患者へ注射によって戻す、一回の注射当たりの形質転換細胞数は、一回の注射につき、患者一人当たり、最低10⁷ないし10⁸細胞である。注射する部位は、患者の骨髄に直接注射するか、または、末梢血流中に注射する。自己の形質導入した骨髄細胞を受ける患者は部分照射または全身照射し、存在している骨髄細胞集団を枯渇させる。治療の査定は、注入後の異なる時点において、分化した細胞型におけるグルコセレブロシダーゼ活性および発現の長さについて検査することにより行う。発現が減少したり、なくなった時点で、形質転換した自己の細胞を患者に再注射する。先に述べたことから、本文中には、本発明の特定の態様を、説明を目的として述べてきたが、本発明の範囲から逸れることなく種々の変形が可能であることが認められるであろう。従って、本発明は、添付した請求項による以外には制限されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/43 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/14 38/45 9051−4Ｃ 37/54 38/46 9051−4Ｃ 37/48 38/48 9051−4Ｃ 37/52 48/00 9051−4Ｃ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 9051−4Ｃ 37/547 (72)発明者ワーナー，ジョンエフ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92130, サンディエゴ，カーメルクリークロード 12962―137 (72)発明者ジョリー，ダグラスジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92024, ルーカディア，ヒルクレストドライブ 277 (72)発明者イルウィン，マイケルジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92109, サンディエゴ，ダイアモンドストリート＃７ 1944 (72)発明者ダベンスキー，トーマスダブリュ．，ジュニアアメリカ合衆国，カリフォルニア 92014, デルマー，ビアフェリノ 12729 (72)発明者イバネツ，カルロスイー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92129, サンディエゴ，ミルポンドウェイ 13592

Claims

【特許請求の範囲】１．動物内で免疫応答を抑制する方法に使用され、治療タンパク質およびMHC 抗原提示を阻害できる第二タンパク質もしくはその活性部分を発現する多価組換えベクター構造体で形質転換された動物の組織細胞。２．第二タンパク質がβ₂−ミクログロブリンを捕捉できる請求の範囲１記載の細胞。３．第二タンパク質が、MHCクラスＩ重鎖分子を、分子内で捕捉できる請求の範囲１記載の細胞。４．第二タンパク質が、E3／19KもしくはH301またはその活性部分である請求の範囲１記載の細胞。５．動物内で免疫応答を抑制する方法に使用され、治療タンパク質およびMHC 抗原提示を阻害できるアンチセンスメッセージを発現しその結果治療タンパク質を発現する細胞に対する免疫応答が抑制される多価組換えベクター構造体で形質転換された動物の組織細胞。６．アンチセンスメッセージが、MHCクラスＩ重鎖の転写物の保存領域を捕捉する請求の範囲５記載の細胞。７．アンチセンスメッセージがβ₂−ミクログロブリンの転写物を捕捉する請求の範囲５記載の細胞。８．アンチセンスメッセージがPSF1輸送タンパク質の転写物を捕捉する請求の範囲５記載の細胞。９．動物内で免疫応答を抑制する方法に使用され、治療タンパク質およびMHC 抗原提示を阻害できるリボザイムを発現しその結果治療タンパク質を発現する細胞に対する免疫応答が抑制される多価組換えベクター構造体で形質転換された動物の組織細胞。 10．リボザイムが、MHCクラスＩ重鎖の転写物の保存領域を開裂する請求の範囲９記載の細胞。 11．リボザイムがβ₂−ミクログロブリンの転写物を開裂する請求の範囲９記載の細胞。 12．リボザイムがPSF1輸送タンパク質の転写物を開裂する請求の範囲９記載の細胞。 13．多価組換えベクター構造体が、因子IX、ヘモグロビン、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ジストロフィン、のう胞性線維症貫膜コンダクタンスレギュレーターおよびLDLに対する肝臓受容体からなる群から選択される治療タンパク質の発現を指令する請求の範囲第１，５または９に記載の細胞。 14．治療タンパク質が因子VIIIである請求の範囲１，５または９に記載の細胞。 15．治療タンパク質がα₁−抗トリプシンである請求の範囲１，５または９に記載の細胞。 16．治療タンパク質がグルコセレブロシダーゼである請求の範囲１，５または９に記載の細胞。 17．前記多価組換えベクター構造体が、ポリオウイルス、ライノウイルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびはしかウイルスからなる群から選択される組換えウイルスによって運ばれる請求の範囲１，５または９に記載の細胞。 18．前記多価組換えベクター構造体が、トガウイルス科ウイルス、ピコルナウイルス科ウイルス、ポックスウイルス科ウイルス、アデノウイルス科ウイルス、パルボウイルス科ウイルス、ヘルペスウイルス科ウイルス、コロナウイルス科ウイルスおよびパラミクソウイルス科ウイルスからなる群から選択される組換えウイルスで運ばれる請求の範囲１，５または９に記載の細胞。 19．前記多価組換えベクター構造体が組換えコロナウイルスによって運ばれる請求の範囲１，５または９に記載の細胞。 20．前記多価組換えベクター構造体が組換えシンドビスウイルスによって運ばれる請求の範囲１，５または９に記載の細胞。 21．前記多価組換えベクター構造体が組換えウイルスベクター構造体である請求の範囲１，５または９に記載の細胞。 22．前記多価組換えベクター構造体が組換えレトロウイルスベクター構造体である請求の範囲１，５または９に記載の細胞。 23．組織細胞が、線維芽細胞、骨髄細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、神経細胞、肝細胞、甲状腺ろ胞細胞、造血前駆細胞およびリンパ球からなる群から選択される請求の範囲１，５または９に記載の細胞。 24．治療タンパク質およびMHC抗原提示を阻害できる第二タンパク質もしくはその活性部分を発現する多価組換えベクター構造体、ならびに生理的に許容できる担体または希釈剤を含有する医薬組成物。 25．治療タンパク質、およびMHC抗原提示を阻害できる第二タンパク質もしくはその活性部分を含有する多価組換えベクター構造体。 26．治療タンパク質、およびE3／19KおよびH301からなる群から選択される第二タンパク質もしくはその活性部分を含有する多価組換えベクター構造体。 27．治療タンパク質、ならびにMHCクラスＩ重鎖の転写物の保存部分、β₂−ミクログロブリンおよびPSF1からなる群から選択されるタンパク質の転写物に結合するアンチセンスメッセージを含有する多価組換えベクター構造体。 28．治療タンパク質、ならびにMHCクラスＩ重鎖の転写物の保存領域、β₂−ミクロヘモグロビンおよびPSF1からなる群から選択されるタンパク質の転写物を開裂するリボザイムを含有する多価組換えベクター構造体。 29．治療タンパク質が、因子IX、ヘモグロビン、フェニルアラニンヒドロキシダーゼ、アデノシンデアミダーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ジストロフィン、のう胞性線維症貫膜コンダクタンスレギュレーターおよびLDLに対する肝臓受容体からなる群から選択される請求の範囲26 ，27または28に記載の多価組換えベクター構造体。 30．前記治療タンパク質が因子VIIIである請求の範囲26，27または28に記載の多価組換えベクター構造体。 31．治療タンパク質がα₁−抗トリプシンである請求の範囲26，27または28に記載の多価組換えベクター構造体。 32．治療タンパク質がグルコセレブロシダーゼである請求の範囲26，27または 28に記載の多価組換えベクター構造体。 33．多価組換えベクター構造体が多価組換えウイルスベクター構造体である請求の範囲26，27または28に記載の多価組換えベクター構造体。 34．多価組換えベクター構造体が多価組換えレトロウイルスベクター構造体である請求の範囲26，27または28に記載の多価組換えベクター構造体。