JPH09503655A

JPH09503655A - 自己免疫応答の抑制方法

Info

Publication number: JPH09503655A
Application number: JP7508256A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．ジョリー，ダグラス; ジェイ．イルウィン，マイケル; エフ．ワーナー，ジョン; ダブリュ．，ジュニアドゥベンスキー，トーマス; イー．イバネツ，カルロス
Original assignee: チロンビアジーンインコーポレイティド
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1994-09-02
Publication date: 1997-04-15
Also published as: AU7869994A; WO1995006718A3; WO1995006718A2; EP0716692A1; CA2158932A1

Abstract

(57)【要約】 MHC抗原提示を阻止することが出来るａ）タンパク質またはその活性部分を発現する、ｂ）アンチセンスメッセージを転写する、またはｃ）リボザイムを転写する組換えベクター構成体で形質転換された動物の組織細胞が提供される。関連する態様では、この細胞は２種以上のタンパク質、アンチセンスもしくはリボザイム、またはそれらの組合せで形質転換される。

Description

【発明の詳細な説明】自己免疫応答の抑制方法技術分野本発明は一般的に自己免疫の分野に関し、さらに詳しくは、宿主組織のＴ細胞認識を抑制する方法に関するものである。発明の背景自己免疫とは身体自身の組織に対する免疫系の反応を表し、抗体または宿主組織に反応する免疫エフェクターＴ細胞のいずれかの生産を特徴とする。自己免疫に起因する数種の疾病はには、多発硬化症（MS）、リウマチ様関節炎、糖尿病およびブドウ膜炎が含まれる。 MSは視覚神経、頭脳および脊髄中での軸索髄鞘脱落の再発を特徴とする神経系疾患である。世界中で約百万人が冒されるが、発生率は37経度以上に居住する人口中で高い。この進行性疾病は、中枢および末梢神経系の両方中で骨髄鞘の自己破壊を起こす免疫系の欠陥に関連ずけられる。MS患者は、正常な骨髄と類似のアミノ酸を含有するウイルスによる感染に続くこの疾病の発病に遺伝的に感受性がある。MSとヒト白血球抗原（HLA）HLA−DR２との間に強い関連性があり、この遺伝的素質について支持を与える。これらの患者は宿主骨髄を誤って識別するリンパ球を有し、自己免疫応答が起こる。 MSは主として西欧人の血統の55才以下の人が罹る。共通の症状は視野の部分的な欠損および言語、平衡、一般的な運動筋肉神経の整合性の問題を含む。症状は数日または数週後に停止することがあるが、数月または数年後再発する。結局、再発して無能性および無力性が増加する。いくつかの例では、症状は発生から着実に進行し、かなり初期の段階で無能性が現れる。疾患の進行を防止する治療法は知られていないが、プレドニソンのようなコルチコステロイドは再発からの回復を促進することができる。しかし、生じた傷害はそのまま残る。シクロホスホアミドまたはアザチオプリンによる徹底的な治療は慢性進行性活性のMSの進行を阻止するのに役立つが、日和見主義的な感染の可能性が増加する。症状の１つ、痙直はカルシウムの役割を妨害することによって筋肉収縮を弱める薬剤ダンスロレンで治療される。これによって痙縮強度は減少するが、この治療は弱い呼吸機能または心筋疾病を持つ患者には適用することができない。他の薬剤、バクロフェンは脊椎源の痙直を治療するのに最も効果的であった。不幸にも、関連副作用に消化器系統の障害、倦怠、疲労、鎮静、不安定、混乱および幻覚が含まれる。さらに他の薬剤、ジアセパンは痙直を改良するが、有効な投与量によって我慢できない眠気が頻繁に起こる。その他、フェノールまたは無水アルコールの髄腔内注射が１種以上の重要な筋肉中で痙直を選択的に減少させるために使用されてきた。リウマチ様関節炎は関節の滑液膜を特異的に冒す慢性の全身性炎症を特徴とする自己免疫性疾病である。遺伝的に感受性のある個人でウイルス感染すると、抗ウイルス抗体と関節組織抗原との間の交差反応または細胞ゲノム中へのウイルス DNAの組込みによるリンパ球機能の逸脱のいずれかが起こる。この疾病の病理学には、慢性滑膜炎およびパンヌスの形成が含まれる。滑膜炎とは関節の周りの滑液膜の過剰な炎症のことであり、激しい痛みを起こす。一方、パンヌスは結局軟骨、硬骨、靱帯および腱を浸食して繊維性アルカローシスとなる。全人口のリウマチ様関節炎の罹患率は１％−２％であり、女性患者は男性を上回り３：１である。この疾病はいずれの年齢でも始まるが、一般的に発症時の年齢は20才から40才に亘る。リウマチ様関節炎を治療する主要な目的は炎症と痛みの軽減、機能の保存、および奇形の防止である。これらの目標を達成するために、非ステロイド系抗炎症剤、抗マラリア剤、ゴールド・ソルト、コルチコステロイド、メットレキセート、アザチオプリンおよびペニシラミンを含む多くの治療法が使用されてきた。非ステロイド系抗炎症剤にはアスピリン、イブプロフェン、フェノプロフェン、ナプロキセン、トルメチン、フルルビオプロフェン、スリンダック、メクロフェナメートナトリウム、ピロキシカム、ジクロフェナック、およびケトプロフェンが含まれる。しかし、これらの薬剤は胃の潰瘍化、穿孔、または増悪性炎症性腸疾病を誘発し、ある場合には腎臓の毒性となる。抗マラリア剤、プラークニル（ヒドロキシクロロキン硫酸）は非ステロイド系抗炎症剤と比較して毒性が低いので、軽度の症状のリウマチ様関節炎をもつ患者に使用される。しかし、治療患者の25％だけしかもある場合には治療の３−６月後のみにこの薬剤に応答する。副作用には色素性網膜炎、神経病理学、および骨格筋と心筋の筋肉病理学が含まれる。いく人かの患者では、ゴールド・ソルトがリウマチ様関節炎に伴え硬骨浸食を遅らせることが示されている。これら患者の22％は重金属毒と同様の毒性副作用を経験している。毒性は皮膚炎、胃炎、好中球減少症および類亜硝酸塩反応として現れる。コルチコステロイドはリウマチ様関節炎の自然進行を変えることなく、一般的にその即時抗炎症効果のために使用される。不幸なことに、それらは潜在的疾病を隠し、それ故患者および内科医が一般的な支持的治療、物理的治療および整形外科的方法を怠る傾向を助長する。メトトレキセートは、非ステロイド系抗炎症剤およびゴールド・ソルトに応答しないひどいリウマチ様関節炎の患者に投与する。この薬剤は、２から６月間かかるゴールド・ソルトに比較して、２から４週間以内に有利な効果を発揮する。しかし、関連する欠点には、胃の刺激、口内炎、肺炎、繊維症および肝硬変が含まれる。それ故、治療中の個人を監視するために、肝臓の生検を定期的に行う。アザチオプリンはメトトレキセートと同様にひどいリウマチ様関節炎の治療に有効である。しかし、白血球減少症、血小板減少症および日和見主義的な感染によって悪化した免疫抑制を含む激しい毒性の潜在力のために、その使用は制限される。ペニシラミンはまたひどいリウマチ様関節炎を治療するのに有効である。しかし、患者の半分は口腔潰瘍、呈味の喪失、発熱、発疹、血小板減少症、白血球減少症、および形成不全性貧血のような副作用を経験する。重症筋無力症、全身性エリトマーデス、多発筋炎およびグッドパスチャー症候群を含む他の免疫複合体疾病は薬剤によって誘発されるようである。真性糖尿病は循環インシュリンの不在、高い血漿グルカン、および膵性Ｂ細胞の破壊を特徴とする疾病であり、異常代謝および高血糖症が起こる。この疾病は、ケトン症を防止し、高グルカン症を減少させ、高血糖値を低下させるインシュリン注射によって最も高頻度に治療される。この疾病の２つの主要な分類はＩ型すなわちインシュリン依存性真性糖尿病（IDDM）にII型すなわち非インシュリン依存性真性糖尿病（NIDDM）である。IDDMは子供に最も一般に発生する。スカンジナビアでは全糖尿病の20％はIDDMに罹り、南ヨーロッパでは13％、合衆国では８％、日本と中国では１％以下に減少する。ある種のHLAはIDDMと関連してきた。HLA−DR３とHLA−DR４は対照の45％−50 ％に比較して患者の95％に存在する。さらに、抗原HLA−DQ_w3.2はIDDMのDR４患者に存在し、一方、保護遺伝子HLA−DQ3.1はDR４対照に顕著に見出される。抗インシュリン、循環性膵島細胞抗体は糖尿病の発生に続く最初の数週間に患者の85％に検出されている。これらの免疫特性を考慮すると、IDDMは、免疫系が変性膵性Ｂ細胞抗原に対して自己免疫応答を遺伝的に発生しやすくなっている個人の膵性Ｂ細胞への伝染性または毒性環境的な障害に起因すると考えられる。Ｂ細胞の機能に作用する要因には、ムンプスまたはコクサッキＢ４ウイルスのようなウイルスによって起こされる損傷、毒性化学試薬もしくは細胞毒、および感作免疫細胞から放出された抗体が含まれる。持続性高血糖症により浸透圧利尿が起こり、排尿が増加する。この低下した血漿容量によって眩暈感および脱力感が生出され、それがさらにカルシウム減少および筋肉タンパク質の異化によって悪化する。ケトアシドーシスの急性段階では、食欲減退、悪心および嘔吐を生出して脱水および高容量モル濃度を悪化させる。この状況は口腔液の置換を妨害し、血清容量モル濃度が増加するにつれて、患者は意識の減退を経験し最後に昏睡にまで進行する。 II型糖尿病は成人に優勢に起こる。NIDDMはHLAマーカーと関連せず、非ケト性であり、膵島細胞抗体が欠けていて、生命を保持するのインシュリン治療を必要としない。この型の糖尿病の原因は不明であるが、年齢および腹部内蔵肥満のようなインシュリン抵抗性のエンハンサーによって悪化する未知の主要遺伝因子が関与している。遺伝子の影響はさらに疫学的データによって支持されていて、それは40才以上の一卵性双生児が糖尿病を発病した時、第二の双生児は同年中に糖尿病を発病する。合衆国では、全糖尿病の90％以上がII型である。これらの患者は慢性皮膚感染が普通であるが、最初は無症状である。合衆国では推定７百万人が糖尿病を患い、その中560,000人がＩ型糖尿病である。治療には体重を保全するために食物カロリー摂取を調節することが一般的に必要である。他の治療にはスルホニル尿素のような低血糖様薬剤の使用が含まれる。この系中での制限された持続性のために、これらの薬剤はインシュリン放出を改善するためにインシュリン不足性糖尿病患者に連続的に投与しなければならない。ビグアニド類からの薬剤は1950年代に導入されたが、乳酸アシドーシスでの関与のために合衆国では中止された。メトホルミンが1957年以来フランスで使用されてきたが、現在FDAの承認待ちである。この薬剤はスルホニル尿素と共に使用されるが、食欲減退、悪心、嘔吐、腹部不快および下痢を含む多くの副作用がある。インシュリン注射はＩ型および非肥満II型糖尿病に使用される。しかし、皮下注射は門脈内インシュリン分泌の生理学的パターンを再生することができない。それ故、治療には血中グルコース値を絶えず監視し、患者の生涯に亘ってインシュリンを注射する必要がある。ブドウ膜炎は眼の前区または後区中に現れるまたは両方に均等に分布する眼内炎症性疾病である。急性または慢性および肉芽腫性または非肉芽腫性に分類される。前部ブドウ膜炎は体液中の炎症性細胞を特徴とする。肉芽腫性前部ブドウ膜炎では、大きな沈殿および虹彩小結節によって視野が霞み、炎症が起こる。肉芽腫性の前部ブドウ膜炎を起こす疾病には、サルコロイド、結核、梅毒、トキソプラスム症、ホヒト・小柳・原田症候群および交感性眼炎が含まれる。非肉芽腫性前部ブドウ膜炎では、沈殿は小さく、虹彩小結節はない。これは片痛、赤視（redness）、まぶしがり症および視野の減少を起こす。激しい非肉芽腫性前部ブドウ膜炎では、フィブリンが前室中に存在する。非肉芽腫性前部ブドウ膜炎に関連する全身性疾患はHLA−Ｂ27関連症候仙腸骨炎、強直性脊椎炎、ライター症候群、疥癬性潰瘍、潰瘍性大腸炎およびクロン病である。非肉芽腫性前部ブドウ膜炎を起こす他の感染症は単純ヘルペスおよび帯状ヘルペスである。前部ブドウ膜炎では、ガラス体液中に細胞があり、網膜または脈絡膜中に炎症性病変がある。視力減退は斑点、斑状浮腫、網膜の静脈閉塞および関連する眼神経障害を含むガラス煙霧、混濁、炎症性病変のためである。ブドウ膜炎について治療が限られている。前部ブドウ膜炎は局部コルチコステロイドで治療することができ、一方、後部ブドウ膜炎には全身性コルチコステロイド治療が必要である。後部ブドウ膜炎にまたアザチオプリンおよびシクロスポリンによる全身性免疫抑制によって治療することができる。しかし、高い投与量で使用すると、肝毒性および腎毒性が出ることがある。他の副作用には腎臓機能障害、震え、多毛、高血圧および歯肉過形成が含まれる。したがって、当業界では上記の方法に関連する副作用および不利益がなく自己免疫応答を抑制する改良方法が必要である。本発明はこれらの要求を満たすものであり、さらに他の関連する利点を提供する。発明の要約本発明は宿主組織のＴ細胞認識を抑制するためにMHC抗原提示を阻止する方法を提供する。本発明の１つの態様では、細胞に対する自己免疫応答が抑制されるように、MHC抗原提示を阻止することが出来るタンパク質またはタンパク質の活性部分を発現する組換えベクター構成体で動物の組織細胞を形質転換することを含む、動物体内の自己免疫を抑制する方法が提供される。本発明の１つの実施態様では、組換えベクター構成体はＨ301のようなβ₂−ミクログロブリンに結合することの出来るタンパク質の発現を指令する。他の実施態様では、組換えベクター構成体は細胞内でＥ３／ 19ＫのようなMHCクラスＩ重鎖分子に結合することが出来るタンパク質の発現を指令する。本発明の他の態様では、細胞に対する自己免疫応答が抑制されるように、MHC 抗原提示を阻止することが出来るアンチセンスメッセージを転写する組換えベクター構成体で動物の組織細胞を形質転換することを含む、動物体内の自己免疫を抑制する方法が提供される。本発明の種々の実施態様では、組換えベクター構成体はMHCクラスＩ重鎖転写産物の保存性領域、β₂−ミクログロブリン転写産物またはPSF１輸送タンパク質転写物に結合するアンチセンスメッセージを転写する。本発明のさらに他の態様では、細胞に対する自己免疫応答が抑制されるように、MHC抗原提示を阻止することが出来るリボザイムを転写する組換えベクター構成体で動物の組織細胞を形質転換することを含む、動物体内の自己免疫を抑制する方法が提供される。本発明の種々の実施態様では、組換えベクター構成体はMH CクラスＩ重鎖転写産物の保存性領域、β₂−ミクログロブリン転写産物またはPS F１輸送タンパク質転写産物を切断するリボザイムを転写する。本発明のさらに他の態様では、細胞に対する自己免疫応答が抑制されるように、MHC抗原提示を阻止することが出来るタンパク質またはタンパク質の活性部分、およびMHC抗原提示を阻止することが出来るアンチセンスメッセージもしくはリボザイムを発現する組換えベクター構成体で動物の組織細胞を形質転換することを含む、動物体内の自己免疫を抑制する方法が提供される。本発明の関連する態様では、多価組換えベクター構成体は、細胞に対する自己免疫応答が抑制されるように、MH C抗原提示を阻止することが出来るアンチセンスメッセージおよびリボザイムを発現を指令する。本発明の他の関連する態様では、多価組換えベクター構成体は、細胞に対する自己免疫応答が抑制されるように、MHC抗原提示を阻止することが出来る２種以上のタンパク質またはタンパク質の活性部分、２種以上のアンチセンスメッセージ、または２種以上のリボザイムを発現を指令する。本発明の種々の実施態様では、多価組換えベクター構成体は、次のもののいずれもの組合せでの少なくとも２種類を発現または転写する。タンパク質Ｅ３／19 ＫまたはＨ301のタンパク質または活性部分、MHCクラスＩ重鎖の保存性領域、β₂ −ミクログロブリンまたはPSF１輸送タンパク質の転写産物に結合するアンチセンスメッセージ、またはMHCクラスＩ重鎖の保存性領域、β₂−ミクログロブリンまたはPSF１輸送タンパク質の転写産物を切断するリボザイム。好適な実施態様では、組換えベクター構成体は組換えウイルスベクター構成体である。特に好適な実施態様では、組換えベクター構成体は組換えレトロウイルスベクター構成体である。他の実施態様では、組換えベクター構成体はトガウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、パルボウイルス科、ヘルペスウイルス科、パラミクソウイルス科、およびコロナウイルス科よりなる群から選択されるウイルスによって搬送される。簡単に上記した方法では、動物の適切な組織細胞には骨髄神経鞘細胞、滑液膜細胞、膵島細胞、肝細胞および角膜細胞が含まれる。本発明の好適な実施態様では、動物細胞は組換えベクター構成体を直接に注入することによって生体内で形質転換される。本発明のこれらおよび他の態様は以下の詳細な説明によって明らかになる。発明の詳細な説明本発明を説明する先立って、以下に使用する用語の定義を説明することは理解に役立つだろう。以下に使用する「自己免疫応答」とは身体自身の組織の構成要素に対する特異な体液性すなわち細胞仲介性の免疫応答を特徴とする体調のことを表す。本発明の文脈では、自己免疫応答の「抑制」とは免疫応答が減少または防止されるようにMHC抗原提示を妨害することを表す。組織細胞を「形質転換すること」とは当業者によって認知されている種々の手段のいずれかによる、形質転換組織細胞が形質転換の前の組織細胞と比較して追加のポリヌクレオチドを発現するような、組織細胞の形質導入または形質移入のことを表す。「組換えベクター構成体」または「ベクター構成体」とは関心のある配列または遺伝子を発現することが出来る集合体のこと表す。ベクター構成体はプロモータ要素を含んでいなければならず、またポリアデニル化を指令するシグナルを含むことができる。さらに、ベクター構成体は好適には転写される場合、関心のある配列または遺伝子に作用結合しかつ翻訳開始配列として機能する配列を含む。好適には、ベクター構成体はネオマイシン、チミジン、キナーゼ、ヒグロマイシン、プレオマイシン、ヒスチジノール、またはジヒドロフォレートレダクターゼ（DHFR）、ならびに１つ以上の制限部位および翻訳停止配列のような選択可能マーカーを含む。さらに、ベクター構成体がレトロウイルス粒子を調製するのに使用される場合、ベクター構成体はレトロウイルス包装シグナルおよび使用レトロウイルスに適切なLTR_Sを、これらが存在しない場合、含まなければならない。ベクター構成体はまた他のウイルスベクターと組合わせて使用し、または下記のように細胞もしくは組織中に挿入することもできる。上記のように、ベクター構成体はタンパク質もしくはタンパク質の活性部分、アンチセンスメッセージまたはリボザイムをコードする配列を含む。この種の配列は、形質転換組織細胞に対するクラスＩ制限Ｔ細胞の自己免疫を抑制するために、MHC抗原提示を阻止するようにデザインされている。一般的に、本明細書に記載の組換えベクター構成体は強いプロモータおよび関心のあるDNA配列をプロモータの下流に挿入するために適切な制限部位を持つプラスミドを選択することによって調製される。上記のように、ベクター構成体は選択のための抗生物質耐性ならびに停止およびポリアデニル化シグナルをコードする遺伝子を有することができいる。追加の要素はエンハンサーおよび機能性スプライス供与体とアクセプター部位を持つイントロンを含むことができる。多価組換えベクター構成体の構築には、２つのタンパク質が発現される場合、１つのプロモータでは第二の遺伝子の適切な遺伝子発現レベルを確保しないので、２つのプロモータが必要である。特に、ベクター構成体がアンチセンスメッセージまたはリボザイムを発現する場合には、第二のプロモータが必要でない。ある種の実施態様では、内部リボザイム結合部位（IRBS）または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSVTK)プロモータを、第二の遺伝子の遺伝子発現レベルを押上げるために関心のある第二の遺伝子と結合させる。要するに、IRBSに関して、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質の上流の非翻訳領域はバイオシストロンメッセージの内部進入を支持することが分っている。（Jacejak等、Nature、第353巻、第90頁、1991年）。この配列は小さく、約300塩基対であり、そのシストロンがこの配列から始まる多シストロンメッセージからの多重遺伝子を発現させるためにベクター中に容易に組込むまれる。組換えベクター構成体がウイルスによって搬送される場合、この種の構成体はプロモータ、スプライシング、およびオイリアデニル化シグナルを含有するウイルスを関心のある所望の遺伝子を含有するプラスミド中に当業界では公知の方法を使用して挿入することによって調製される。関心のある遺伝子を含有する組換えウイルスベクターは標的組織細胞中への形質導入の後に高いコピー数にまで複製する。組換えベクター構成体の調製に続いて、MHC提示を下方調節するベクター形質転換細胞の能力を検査することが好適である。一般的に、この種の検査はウエステンブッロト法、FACS分析、または当業者によって認知された他の方法によって実施することができる。好適な実施態様では、組換えベクター構成体はレトロウイルスによって搬送される。レトロウイルスは一本鎖ゲノムをもち、非溶菌性であるRNAウイルスである。感染すると、レトロウイルスはそのRNAとDNAに逆転写し、宿主細胞ゲノム中に挿入されるプロウイルスを生成する。本発明で使用するレトロウイルスの調製は名称「組換えレトロウイルス（Recombinant Retroviruses）」(U.S.S.N．、第 07／586,603号公報、1990年９月21日出願)の出願中に極めて詳細に記載され、参考としてここに取込まれている。レトロウイルスのゲノムは概念的に２つの部分に分割することができる。「トランス作用」部分はウイルス構造タンパク質をコードする領域からなり、核コートタンパク質の合成のためのグループ特異性抗原 (gag)遺伝子、逆トランススクリプターゼとインテグラーゼ酵素の合成のためのポル遺伝子、およびエンベロープグリコタンパク質の合成のためのエンベロープ(env)遺伝子を含む。「シス作用」部分はウイルス粒子中に最後に包装されるゲノムの領域からなる。これらの領域は包装シグナル、プロモータとポリアデニル化部位をもつ長ターミナルリピート(LTR)、およびDNA複製のための２つの開始部位を含む。クローン・プロウイルスの内部または「トランス作用」部分は関心のある遺伝子で置換えられ「ベクター構成体」を創成する。ベクター構成体はウイルス包装タンパク質が存在する細胞中に入れられる場合（U.S.S.N.、第07/8 00,921号公報参照）、転写RNAはウイルス粒子として包装され、順に細胞から発芽する。これらの粒子は組織細胞を形質導入するのに使用され、ベクター構成体は細胞ゲノム中に統合することができる。ベクター構成体はその遺伝子細胞物を発現するが、それを搬送するウイルスはウイルス・ゲノムのトランス作用部分が存在しないので、複製に欠陥がある。複製コンピートな感染性レトロウイルスの存在を検出するために、種々のアッセイを使用することができる。１つの好適なアッセイは実施例９に記載の拡大Ｓ⁺Ｌ⁺アッセイである。好適なレトロウイルス・ベクターはマウス白血病両栄養性もしくは異栄養性またはVsVg偽型ベクターである。（WO、第92／14829号公報、参考としてここに取込まれている）。組換えベクター構成体はまた、たとえば、ポリオウイルス(Evans等、nature、第339巻、第385頁、1989年、およびSabin等、J．of Biol.Standardization、第１巻、第115頁、1973年)(ATCC VR-58)、ライノウイルス(Arnold等、J.Cell.Bioc hem.，L401，1990年)(ATCC VR-1110)、ポックスウイルスたとえばカナリア・ポックスウイルスまたはワクシニアウイルス(Fisher-Hoch等、PNAS、第86巻、第31 7頁、1989年;Flexner等、Ann.N.Y.Acad.Sci．、第569巻、第86頁、1989年;Flexner等、Vaccine、第８巻、第17頁、1990年；U.S.、第4,603 ,112号公報、U.S.、第4,769,330号公報；WO、第89／01973)号公報(ATCC VR-111 ，ATCC VR-2010)、SV40（Mulligan等、Nature、第277巻、第108頁、1979年）（A TCC VR-305）、（Madzak等、J.Gen.Vir.、第73巻、第1533頁、1992年）、インフルエンザ・ウイルス(Luytjes等、Cell、第59巻、第1107頁、1989年；McMicheal 等、The New England Jounal of Medicine、第309巻、第13頁、1983年；Yap等、 Nature、第273巻、第238頁、1978年)(ATCC VR-797)、アデノウイルス(Berkner等、Biotechniques、第6巻、第616頁、1988年；Rosenfeld等、Science、第252巻、第431頁、1991年)(ATCC VR-1)、パルボウイルスたとえばアデノ関連ウイルス（S amulski等J.Vir.、第63巻、第3822頁、1989年；Mendelson等、Virology、第166 巻、第154頁、1988年）（ATCC VR-645）、単純ヘルペスウイルス(Kit等、Adv.Ex p.Med.Biol．、第215巻、第219頁、1989年)(ATCC VR-977，ATCC VR-260)、HIV（ EPO、第386,882号公報；Buchschacher等、J.Vir.、第66巻、第2731頁、1992年）、はしかウイルス(EPO、第440,219号公報)(ATCC VR-24)、シンドビスウイルス(X iong等、Science第234巻、第1188頁、1989年)(ATCCVR-68)、およびコロナウイルス(Hamre等、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、第121巻、第190頁、1966年)（ATCC VR-7 40）を含む種々のウイルスキャリヤーと共に開発し利用することができる。上記のウイルスキャリヤーはMHC抗原提示を阻止することができるタンパク質、アンチセンスメッセージまたはリボザイムを発現するように修正する必要があることは当事者には明らかである。ベクター構成体はひとたび調製されると、直接の注射によって生体内を含む種々の経路を経て組織細胞を形質転換するために、温血動物に投与することができる。さらに詳しくは、MHC抗原提示を阻止することが出来るタンパク質、アンチセンスメッセージまたはリボザイム配列をコードする配列を含有する裸のDNAまたは組換えベクター構成体は、筋肉、頭脳、肝臓、皮膚、滑膜細胞、膵島細胞、および角膜細胞を含む組織の間質空間中に直接に注入することができる（WO、第90／11092号公報参照）。ベクター構成体の生体内投与の他の代表的な実例には、リポフェクション法(Felgner等、PNAS 、第84巻、第7413頁、1989年)、マイクロプロジェクション衝撃法（Williams等、PNAS、第88巻、第2726頁、1991年）、リポソム法、（Wang等、PNAS、第84巻、第7851頁、1987年）、カルシウムリン酸塩法（Dubensky等、PNAS、第81巻、第75 29頁、1984年）、DNAリガンド複合体法（Wu等、J．of Biol.Chem.、第264巻、第 16985頁、1989年；Cotten等、PNAS、第89巻、第6094頁、1992年）のような種々の物理的方法による形質導入が含まれる。上記のように、ベクター構成体はワクシニア、シンドビス、またはコロナのようなウイルスによって搬送することができる。さらに、直接的な注射によってレトロウイルスベクターを経てベクター構成体を投与する方法が名称「組換えレトロウイルス（Recombinant Retroviruses ）」(U.S.S.N．、第07／586,603号公報)の出願中に極めて詳細に記載され、参考としてここに取込まれている。上記のように、本発明は宿主の自己免疫応答を抑制するためにMHC抗原提示を阻止するのに適した方法と組成物を提供する。要するに、CTLは、CD８、インエクシセキュラ（inexcellular）接着分子−１（ICAM-１）、ICAM-２（Singer等、 Science、第255巻、第1671頁、1992年、RAO等、Crit.Rev.Immunol．、第10巻、第495頁、1991年）、白血球機能性抗原−１（LFA-１）(Altmann等、Naure、第33 8巻、第521頁、1989年)、B7/BB１分子(Freeman等J.Immunol.、第143巻、第2714 頁、1989年)、LFA−３、または他の細胞接着分子のような補助分子と共にMHC分子自身の文脈中でペプチドの表示によって特異的に活性化される。MHCクラスＩ分子との協同の抗原ペプチドの提示によってCTL活性化が起こる。MHC抗原提示を阻止すると期待される生産物を発現することが出来る特定の配列の輸送し安定な統合することはCD８⁺CTLのようなＴ細胞の活性を妨害し、それ故自己免疫応答を抑制する。標準CTLアッセイは実施例13 に詳細に記載したようにこの応答を検出するのに使用される。抗原提示経路の成分には45KdMHCクラスＩ重鎖、β₂−ミクログロブリン、プロテアーゼのようなプロセミング酵素、補助分子、シャパロンおよびPSF１のような輸送タンパク質が含まれる。本発明の１つの態様では、MHC抗原提示を阻止することが出来るタンパク質またはタンパク質の活性部分を発現を指令するベクター構成体が提供される。本発明では、タンパク質の「活性タンパク質」は生物学的活性のために保有しなければならないタンパク質の断片である。この種の断片すなわち活性ドメインは、タンパク質配列からヌクレオチド配列を系統的に取出し、その結果得られた組換えベクター構成体で標的細胞を形質転換し、FACS分析またはCTLアッセイのような他の免疫学的アッセイを使用して細胞表面上のMHCクラスＩ提示を決定することによって容易に同定することができる。これらの断片は全タンパク質をコードする配列の大きさがウイルスキャリヤーの容量を超える場合特に有用である。その他、MHC抗原提示のインヒビタータンパク質の活性ドメインは酵素的に消化され、活性部分は生物化学的方法で精製することができる。たとえば、切断タンパク質の活性部分を単離し精製するためには、タンパク質の活性部分を妨害するモノクローン抗体を使用することができる（Harlow等、Antibodies：A Laboratory M anual，Cold Springs Harbor，1988年）。１つの実施態様では、組換えベクター構成体は新しく合成されたMHCクラスＩ分子の細胞内で結合するタンパク質またはタンパク質の活性部分の発現を指令する。この結合はMHCクラスＩ分子の小胞体からの移動を防止し、末端グリコシル化を阻止する。Ｔはこれら分子の細胞表面への輸送を妨害し、CTLによる細胞認識および溶菌を防止する。たとえば、Ｅ３遺伝子の生産物の１つはMHCクラスＩ分子の形質転換細胞表面への輸送を阻止するのに使用することができる。さらに詳しくは、Ｅ３は、アデノウイルス２ゲノムのＥ３領域から転写された19kD膜内外グリコタンパク質Ｅ３／19Ｋをコードする。本発明の文脈では、動物はＥ３／ 19Ｋ配列を含有する組換えベクター構成体で直接に注射され、その配列が発現してＥ３／19Ｋタンパク質を生成する。Ｅ３／19Ｋタンパク質がMHCクラスＩ表面分子の表面発現を阻止して、ベクター構成体によって形質転換した細胞は免疫応答を回避する。これに関する代表的な組換えベクター構成体の構築は実施例７に示される。本発明の他の実施態様では、組換えベクター構成体は、β₂−ミクログロブリンに結合することが出来るタンパク質またはタンパク質の活性部分の発現を指令する。抗原提示のためのMHCクラスＩ分子の細胞表面への輸送にはβ₂−ミクログロブリンとの協力が必要である。それ故、β₂−ミクログロブリンと結合してMHC クラスＩとの協力を阻止するタンパク質はMHCクラスＩ抗原提示を間接的に阻止する。適切なタンパク質にＨ301遺伝子産物を含む。要するに、ヒト・サイトメガロウイルス(CMV)から得られるＨ301遺伝子は、MHCクラスＩ分子の重鎖上のβ₂ −ミクログロブリン結合部位に配列相同性をもつグリコタンパク質をコードする（Browne等、Nature、第347巻、第770頁、1990年）。Ｈ301はβ₂−ミクログロブリンに結合し、MHCクラスＩ分子の成熟を防止して、形質転換細胞が細胞毒性Ｔ細胞の非認識性になり、それ故MHCクラスＩ制限免疫監視機構を回避する。 MHCクラスＩ抗原提示を阻止または下方調節するように作用する他のタンパク質（上記していない）もまた本発明の文脈内で同定し使用することができる。この種のタンパク質、特に哺乳動物病原体から誘導されたタンパク質（とその活性部分）を同定するため、MHCクラスＩ抗原提示を阻止することが出来ると疑われるタンパク質またはその活性部分を発現する組換えベクター構成体はBCのような試験細胞株中に形質転換される。候補タンパク質をコードする配列を持つ試験細胞株と持たない試験細胞株はCTLアッセイでスチムレータおよび／または標的に対し比較される。形質転換試験細胞に対応する細胞溶菌性の減少は候補タンパク質がMHC提示を阻止することが出来ることを示す。 MHCクラスＩ表面発現の下方調節を決定する他の方法はFACS分析によるものである。さらに詳しくは、細胞株は候補タンパク質をコードする組換えベクター構成体で形質転換される。薬剤選択と拡大の後、細胞はMHCクラスＩ発現によって分析され、非形質転換細胞のそれと比較される。MHCクラスＩの細胞表面発現の減少は候補タンパク質がMHC提示を阻止することが出来ることを示す（たとえば、実施例12を参照）。本発明の他の態様では、MHCクラスＩ抗原提示を阻止することが出来るアンチセンスメッセージを転写する組換えベクター構成体で動物の組織細胞を形質転換することによって、動物体内の自己免疫応答を抑制する方法が提供される。要するに、タンパク質コードまたは「センス」配列に相補的であるヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドは「アンチセンス」と呼ぶ。アンチセンスRNA配列は相補mRNA配列にハイブリダイジングすることによって遺伝子発現の調節遺伝子として作用する（Mizuno等、PNAS、第81巻、第1966頁、1984年、Heyw ood等、Nuleic Acid Res.、第14巻、第6771頁、1986年）。標的転写産物またはそのいずれかの部分の全ハイブリッド化を含むアンチセンス分子は合成され（Fe rretti等、PNAS、第83巻、第599頁、1986年）、ベクター構成体中に入れられ、遺伝子発現を阻止する細胞中に効果的に導入される（Izant等、Cell、第36巻、第1007頁、1984年）。さらに、逆配位でクローンされたDNAからのアンチセンスR NA（asRNA）の合成は、構成的asRNAの発現が正常細胞機能を妨害しない間、永く安定性を与える。本発明の１つの実施態様では、組換えベクター構成体はMHCクラスＩ転写産物の保存性領域に結合することが出来るアンチセンスメッセージを転写し、それによって細胞表面発現およびMHCクラスＩ抗原提示を阻止する。DNAデータバンク（たとえば、Genbank）で入手できるMHC遺伝子の種々のクラス（たとえば、HLAＡ，Ｂ、及びＣ）を表す配列をコンピュータ支援で比較することよって、この種の保存性領域を確認することができる。保存性領域はヌクレオチド配列の相同性ついてのコンピュータ支援アラインメントによって確認される。保存性領域はMHC クラスＩ遺伝子型間の100塩基対当たり50％未満のミスマッチ、好ましくは20％未満のミスマッチを有する配列である。本発明の他の実施態様では、組換えベクター構成体はβ₂−ミクログロブリン転写産物に結合することの原因であるアンチセンスメッセージを転写する。この結合はβ₂−ミクログロブリンタンパク質の翻訳を防止し、そのことによって細胞表面発現に必要なMHCクラスＩ分子複合体の適正な組立てを阻止する。好適な実施態様では、β₂−ミクログロブリンのヌクレオチド配列は逆配位でベクター構成体中にクローンされる。適正なアンチセンス配位は制限酵素分析によって決定することができる。さらに他の実施態様では、組換えベクター構成体はPSF１転写産物、ペプチド輸送タンパク質に結合することの原因であるアンチセンスメッセージを転写する。このタンパク質はMHCクラスＩ分子の効率的な組立てに必要であるから、PSF１転写産物に対するアンチセンスはβ₂−ミクログロブリンおよびMHCクラスＩ分子複合体との連合の前の加工抗原ペプチド断片の小胞体（ER）への輸送を妨害する。好適な実施態様では、PSF１のヌクレオチド配列は調製され、逆配位でベクター構成体中に挿入され、制限酵素分析で決定される。上記のように、抗原提示に関与する他のタンパク質の配列もまた同定され、MH CクラスＩ抗原提示を阻止するアンチセンスメッセージを転写することができる組換えベクター構成体をデザインするのに使用される。さらに詳しくは、タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は検討され、確認された配列が適切なアンチセンスメッセージを合成するのに使用される。標的メッセージの開始配列の上流または近辺の部分に相補的である配列を使用することは好適である。このことによって、アンチセンス配列はタンパク質の重要な部分の翻訳を防止する mRNAに結合することができる。この種の分子の実例はICAM-１，ICAM-２，LFA-１，LFA-３、およびＢ７／BB1である。実施例13および15またはMHCクラスＩ提示を阻止することが出来るタンパク質について上記した他の手段中に記載したように、MHCクラスＩ発現または抗原提示の下方調節は夫々FACS分析またはCTLアッセイによって検査することができる。本発明の他の態様では、MHC抗原提示に関与する成分の酵素的切断の原因であるリボザイムを転写する組換えベクター好適には動物の選択された細胞を形質導入することによって、動物体内での自己免疫応答を抑制する方法が提供される。要するに、リボザイムは他のRNA分子を消化するのに使用される酵素活性を持つRNA分子である。これらは、所望の標的分子中の潜在的な切断部位に関する酵素を正確に配置する領域によってフランクされる高い保存性の配列特異的な切断ドメインを有する短RNAからなる。それらは特定遺伝子の発現および活性化を阻止する極めて柔軟な道具を提供する（Hase loff等、Nature、第334巻、第585頁、1988年）。遺伝子の転写配列が既知である場合、カスタムリボザイムをデザインすることができる。特に、リボザイムは先ず特定の標的RNA配列を選択し、リボザイムコーディング配列の最初と最後に相補的配列を接続させることによってデザインすることができる。次いでこの遺伝子単位を生成するリボザイムは組換えベクター構成体中に挿入され、組織細胞を形質転換するのに使用される。発現のとき、標的遺伝子は相補的な結合および切断によって中性化され、永久に不活性化が保証される。さらに、リボザイムはその酵素活性にために１つ以上の標的を破壊することが出来る。１つの実施態様では、特定リボザイムを含有するベクター構成体は抗原提示を阻止するためにMHCクラスＩ重鎖分子の保存性領域の転写産物を切断するのに使用される。本発明の他の実施態様では、組換えベクター構成体はβ₂−ミクログロブリン転写産物の酵素的切断の原因であるリボザイムを転写する。特に、β₂ −ミクログロブリンメッセージの配列に相補的であるフラッキング領域を持つリボザイムは転写産物を切断し、そのことによってタンパク質翻訳およびMHCクラスＩ分子複合体の適正な組立てを防止する。これはMHCクラスＩ複合体の細胞表面への輸送を阻止し、抗原提示を防止する。本発明のさらに他の実施態様では、組換えベクター構成体はPSF １転写産物の酵素的切断の原因であるリボザイムを転写し、そのことによってMH CクラスＩ分子の表面発現を抑制し、抗原提示を防止する。さらに詳しくは、PSF １メッセージの配列に相補的であるフランキング領域でデザインされたリボザイムは転写産物を切断しかつペプチドのERへの輸送を阻止して、そのことによって MHCクラスＩ複合体の組立ておよび抗原提示を防止する。上記のように、抗原提示経路に関与する他のタンパク質の配列は同定され、MH C抗原提示を阻止するリボザイムを転写することが出来る組換えベクター構成体をデザインするのに使用されることは当業者には明らかである。MHCクラスＩ発現または抗原提示の下方調整は、実施例13および15またはMHCクラスＩ提示を阻止することが出来るタンパク質およびアンチセンスメッセージについて上記した他の手段中に記載したように、MHCクラスＩ発現または抗原提示の下方調節はFAC S分析またはCTLアッセイによって検査することができる。本発明の他の態様では、多価組換えベクター構成体が提供される。要するに、自己免疫応答を抑制する効率は多価組換えベクター構成体で細胞を形質転換することによって増強することができる。発現するとき、遺伝子生産物は、２つの異なった経路を経て単独の成分を攻撃することによってかまたは同一もしくは異なった経路を経て２つの異なった成分を介してMHC抗原提示の妨害度を増加させる。多価組換えベクター構成体の構築には、１つのプロモータでは第二の遺伝子の遺伝子発現の適切な水準を確保しないので２つのプロモータで必要である。上記のように、内部リボザイム結合部位（IRBS）プロモータまたは関心のある第二の遺伝子に結合された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSVTK)プロモータのような第二のプロモータは第二の遺伝子の遺伝子発現の水準を押上げる。好適な実施態様では、ベクター構成体は以下の成分のいずれの組合せもの少なくとも２つを発現または転写する。（ａ）タンパク質Ｅ３／19ＫまたはＨ301のタンパク質または活性部分、（ｂ）MHCクラスＩ重鎖分子の保存性領域の転写産物、β₂−ミクログロブリンまたはPSF１輸送タンパク質に結合するアンチセンスメッセージ（ｃ）上記（ｂ）に記載したタンパク質の転写産物を切断するリボザイム。さらに、ここに記載した２種のタンパク質および活性部分、２種のアンチセンスメッセージ、または２種のリボザイムを発現する多価組換えベクター構成体は提供される。関連実施態様では、多くの特定の組合せが多価組換えベクター構成体を形成するのに利用される。たとえば、多価組換えベクター構成体は、MHCクラスＩ重鎖の保存性領域、β₂−ミクログロブリン、またはPSF１輸送タンパク質Ｆのためのアンチセンスメッセージまたはリボザイム配列との組合せでＥ３／19ＫまたはＨ 301を発現する遺伝子からなる。本発明の他の態様では、製剤的に許容できる分散剤または希釈剤との組合せで、レトロウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、ワクシノウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス、はしかウイルス、コロナウイルスまたはシンドビスウイルスのようなベクター構成体を保持する上記の組換えベクター構成体の１つまたは組換えウイルスからなる医薬組成物が提供される。組成物は溶液として、または投与前に溶液中に再懸濁させる固体形態（たとえば、凍結乾燥）としてのいずれかで調製することができる。さらに、組成物は注射、経口、経鼻もしくは経直腸の投与または分散剤に適切な他の手段に適した分散剤または希釈剤と共に調製することができる。一般的に、ベクター構成体を保持する組換えウイルスは配合前に、0.25％から 25％、好適には約５％から20％の範囲の濃度にまで精製される。次いで、組成物の調製後、ベクター構成体を保持する組換えウイルスは投与１回分当たり約10ng から１μｇの材料を構成し、この材料量の約10倍が共精製された混入物として存在する。好適には、組成物は下記ように処方される0.1−1.0mlの水溶液に調製される。製剤的に許容される分散剤または希釈剤は使用される投与量および濃度において服用者に無毒であるものである。注射液用の分散剤または希釈剤の代表的な実例には、水、生理学的pHに好適に緩衝され（リン酸塩緩衝食塩水またはトリス緩衝食塩液）、マンニトール、ラクトース、トレハロース、デキストロース、グリセロールおよびエタノールの１つ以上を含有する等張溶液ならびにヒト血清アルブミン(HSA)のようなポリペプチドまたはタンパク質が含まれる。１つの適切な組成物は10mg／mlのマンニトール、１mg／mlのHSA、20mMのTris pH＝7.2および1 50mMのNaCl中のベクター構成体を保有する組換えウイルスを含む。この場合、ベクター構成体を保有する組換えウイルスは約10ngから１μｇの材料を表すから、それは全高分子量材料の１％であり、全材料（水を含む）の１／100,000以下である。この組成は一般的に少なくとも６カ月間−70℃で安定である。組換えベクター構成体の実質的に当量投与量が調製されることが明らかである。この点で、ベクター構成体は投与１回分当たり100ngから100μｇの材料を構成し、この材料量の約10倍が共精製された混入物として存在する。組成物は静脈（i.v.）、皮下（s.c.）、または筋肉（i.m.）注射を含む種々の経路（上記のような）を介して投与される。この点で、投与の方法は特定の治療的用途によって影響されることはあきらかである。ベクター構成体を保有する組換えウイルスについては、通常使用される個人投与量は10⁶から10¹⁰c.f.u．（たとえば、HT1080細胞で測定されたネオマイシン耐性のコロニー形成単位）である。これらの組成物は１から４週の間隔で３から４回の投薬（少なくとも最初は）で投与される。追加注射は6−12カ月後１から２回の投薬として、その後年１回与えられる。以下の実施例は本発明の説明のために提供され、本発明を制限するものではない。実施例実施例１マウス・レトロウイルス・プロベクターDNAの調製Ａ．レトロウイルス・バックボーンKT−３Ｂ pUC31プラスミド中のＮ２ベクター(Armentano等、J.Vir.、第61巻、第1647頁、1987年、Eglitas等、Science、第230巻、第1395頁、1985年)からの、gag配列を含むマロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)５′長末端反復(LTR)EcoR I-EcoR Ｉ断片をプラスミドSK⁺（Stratagene，San Diego，CA）中に連結する。その結果得られた構成体をＮ２Ｒ５と呼ぶ。ATGスタートコドンをgag発現を防止するATT に変える生体内部位特異性突然変異によってＮ２Ｒ５構成体を変異させる。この突然変異誘発性断片は200塩基対(bp)長であり、PstＩ制限部位によってフランクされる。PstＩ-PstＩ突然変異断片をSK⁺プラスミドから精製し、pUC31プラスミド中のN2 MoMLV５′LTR中に挿入し非突然変異200bp断片と置換える。プラスミド pUC31はpUC19（Stratagene，San Diego，CA）から誘導され、そこでは追加の制限部位Xho Ｉ，Bg1 II，BssH IIおよびNcoＩがEcoRＩとポリリンカーのSacＩ部位の間に挿入される。この構成体はpUC31／N2R5gMと呼ぶ。Ｎ２からの1.0キロ塩基（Kb）のMoMLV3′LTR EcoR I-EcoRＩ断片はプラスミドSK⁺中にクローンされ、N2R3^-と呼ぶ構成体が得られた。この構成体から1.0KbのCla I-Hind III断片を精製する。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を駆動する初期プロモータを含む、pAFVXMレトロウイルスベクター（Kriegler等Cell、第38巻、第483頁、1984年、St.Louis等、PNAS、第85巻、第3150頁、1988年）からのCla I-ClaＩ優性選択マーカー遺伝子断片をプラスミドSK⁺中にクローンする。SK⁺プラスミドから１，３kbのCla-I-Bs⁺ＢＩ遺伝子断片を精製する。他の選択マーカー、フレオマイシン耐性(Mulsant等、Som.Cell and Mol.Gen．、第14巻、第243頁、1988年、Cayla，Cedex，FRから入手)を使用して、すでにネオマイシン耐性である細胞に遺伝子を形質転換するのに利用するためのレトロウイルスバックボーンKT−3Cを作成することができる。プラスミドpUT507(Mulsant 等、Som.Cell and Mol.Gen．、第14巻、第243頁、1988年)をNdeＩで消化し、末端をVlenowポリメラーゼＩでブラントする。次いでさらに試料をHpaＩで消化し、Cla リンカーを断片の混合物に連結し、さらに試料をClaＩで消化する。過剰のClaＩリンカーをClaＩ消化によって取除き、RSV LTRおよびフレオマイシン耐性を保持する1.2KbのClaＩ断片をアガロース電気泳動法によって次いでGene Cle an(Bio101，San Diego，CA)を使用する精製によって単離する。この断片を1.3Kb のCla I-Bs⁺ＢＩネオマイシン断片に代わりに使用してバックボーンKT−３Ｃを得る。選択マーカーセットのさらなる修正はPAFVXMからのCla I-ClaＩSV2 Neo 断片を単に使用することである。リボザイム配列のアントセンスをNEO 遺伝子の３− 非翻訳領域中のHWC II S／TE中に挿入することができる。このベクターはKT3Dと呼ぶ。発現ベクターは３部連結反応によって構築され、そこでは関心のある遺伝子を含有するXho I-ClaＩ断片および1.0KbのMoMLV3′LTR Cla I-Hing I II断片をpUC31／N2R5gMプラスミドのXho I-Hind III部位中に挿入する。次いで1 .3KbのCla I-BstBＩNeor遺伝子、または1.2KbのClaＩフレオマイシン、断片をこのプラスミドのClaＩ部位中にセンス配向で挿入する。実施例２Ａ．Ｅ３／19Ｋ遺伝子のKT−３Ｂ中へのクローニングｉアデノウイルスの単離と精製アデノウイルスの単離と精製はGreen等、Methods in Enzymology、第58巻、第 425頁、1979年に記載されている。特に、５のヒーラー細胞（３−６×10⁵細胞／ ml）をアデノウイルス２型（Ad２）ビリオン(ATCC VR−846)のml当たり100−500 プラーク形成単位(pfu)で感染させる。37℃30−40時間のインキュベーションの後、細胞を氷上に入れ、４℃20分間の遠心分離によって集菌し、Tris−HCl緩衝液(pH8.1)中に再懸濁させる。ペッレトを音波処理で破砕し、トリクロロトリフルオロエタン中で均質化した後、1,000ｇで10分間塩賃分離する。上水層を取出し、10mlのCsCl(1.43ｇ／cm³)上に層積し、SW27ローター中で20,000rpmで１時間遠心分離する。乳白光のウイルス・バンドを取出し、CsClで1.34ｇ／cm³に調節し、さらにTiローター中で30,000rpmで16−20時間遠心分離する。勾配の中間にある可視ウイルス・バンドを取出し、アデノウイルスDNAの精製まで４℃で保管する。 ii．アデノウイルスDNAの単離と精製アデノウイルス・バンドを37℃で１時間プロテアーゼとインキュウベートしてタンパク質を消化する。４℃で7,800ｇで10分間遠心分離し、粒子を室温で５％ドデシル硫酸ナトリウム中に30分間で溶解した後、同量のフェノールで抽出する。上水相を取出し、フェノールで再抽出し、エーテルで３回抽出し、Tris緩衝液中で24時間透析する。ウイルスAd2DNAをエタノルで沈殿させ、エタノールで洗浄し、pH8.1のTris−EDTA緩衝液中で再懸濁する。1.0の細胞中に生成したウイルスから約0.5mgのウイルスAd 2DNAが単離される。 iii．Ｅ３／19Ｋ遺伝子の単離ウイルスAd2DNAはEcoRI(New England Biolabs，Beverly，MA)で消化し、１％アガローズゲル上での電気泳動法によって分離する。Ad２の協調領域75.9−83.4 中に位置し、Ｅ３／19Ｋ遺伝子(Herisse等、Nucleic Acids Research、第８巻、第2173頁、1980年、Cladaras等、Virology、第140巻、第28頁、1985年)を含有する2.7KbのAd２ EcoRI D断片は電気泳動法によって溶出し、フェノール抽出し、エタノール沈殿し、Tris−EDTA(pH8.1)中に溶解する。 iv Ｅ３／19Ｋ遺伝子のKT−３Ｂ中へのクローニングＥ３／19Ｋ遺伝子はPUC1813のEcoR I部位中にクローン化される。PUC1813はKa y等、Nucleic Acids Research、第15巻、第2778頁、1987年、Gray等、PNAS、第8 0巻、第5842頁、1983年に実質的に記載されているように調製される。Ｅ３／19 ＫはEcoR I消化によって取出され、単離断片はホスファターゼ処理pSP73 プラスミドのEcoRI部位中にクローン化される（Promega，Madison，WI）。この構成体はSP−Ｅ３／19Ｋと呼称する。SP−Ｅ３／19KcDNAの配向は適切な制限酵素の消化およびDNA配列決定を使用することによって確認される。センス配向において、cDNAの５′末端はpSP73ポリリンカーのXhoＩ部位に隣接し、３′末端はClaＩ部位に隣接する。センスまたはアンチセンス配向中いずれかにＥ３／19KcDNAを含有するXho I-ClaＩ断片はSP−Ｅ３／19Ｋ構成体から取出され、KT−３ＢレトロウイルスバックボーンのXho I-ClaＩ部位中にクローン化される。この構成体をKT−３Ｂ／ｅ３／19Ｋと呼称する。Ｂ．PCR増幅Ｅ３／19Ｋ遺伝子のKT−３Ｂへのクローニングｉ．Ｅ３／19Ｋ遺伝子のPCR増幅アミノ酸末端シグナル配列、次いでＥ３／19Ｋタンパク質をして小胞体（ER）中に自身を包埋せしめる管腔内ドメインおよびカルボキシ末端細胞質テールを含むAd２DNAE３／19Ｋ遺伝子は、ウイルス配列28,812と29,288の間に存在する。ウイルスゲノムDNAからのAd２DNAE３／19Ｋ遺伝子の単離はPCR増幅によって以下のプライマー対を使って行う。順方向プライマーはAd２ヌクレオチド配列28,812−28,835に対応する。（配列番号：）５′− ３′：TATATCTCCAGATGAGGTACATGATTTTAGGCTTG 逆方向プライマーはAd２ヌクレオチド配列29,241−29,213に対応する。（配列番号：）５′− ３′：TATATATCGATTCAAGGCATTTTCTTTTCATCAATAAAAC Ad２相補的配列の外に、両プライマーは、PCTアンプリコン生産物の効率的な酵素消化のための５つのヌクレオチド「緩衝配列」を含有する。順方向プライマー中のこの配列はXhoＩ認識部位によってまた逆方向プライマー中のClaＩ認識部位によって続かれる。それ故、５′から３′の方向では、Ｅ３／19Ｋ遺伝子はXh oＩおよびClaＩ認識部位によってフランクされる。Ｅ３／19Ｋ遺伝子のAd2DNAからの増幅は次のPCRサイクルプロトコールで実施される。 ii．PCR増幅Ｅ３／19Ｋ遺伝子のKT−３Ｂ中への連結 SK-Ｅ３／19Ｋ構成体からのＥ３／19Ｋ遺伝子、約780bp長、は取出され、実施例２Biに記載と同様に１％アガロース／TBEゲル電気泳動法によって単離する。次いで、XhoＩＥ３／19Ｋ断片はKT−３Ｂレトロウイルスバックボーン中に連結する。この構成体はKT−３Ｂ／Ｅ３／19Ｋと呼称する。それはDH５α細菌株をKT −３Ｂ／Ｅ３／19Ｋ構成体で形質転換することによって増幅される。特に、細菌は１−1000ngの連結反応混合物DNAで形質転換される。形質転換された細菌細胞はアンピシリンを含有するLBNAで形質転換される。形質転換された細菌細胞はアンピシリンを含有するLBプレート上にプレートする。プレートは37℃で一夜インキュウベートし、細菌コロニーを選択して、それからDNAを調製する。DNAはXho ＩおよびCla Ｉで消化する。Ｅ３／19Ｋ遺伝子を含有するプラスミドのためのエンドヌクレアーゼ制限切断断片の期待サイズは780と1300bpである。Ｃ．合成Ｅ３／19Ｋ遺伝子のKT−３Ｂへのクローニングｉ．Ｅ３／19Ｋ遺伝子DNAの合成合成DNAの化学合成はすでに記載されている(Caruthers等、Methods in Enzymo logy、第211巻、第３頁、1992年)。Ｅ３／19Ｋ遺伝子をコードする配列は５′と３′リミットとしてPCRプライマーを使用し、末端に同一のXho ＩおよびCla Ｉリンカーを保持するアライド・バイオシステムズ社のDNA合成装置、モデル392(Foster City，CA)を使用してホスホトリエステル法によって合成する。長さ約14−40ヌクレオチドの短いオリゴマヌクレオチドはポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって精製し、相互に連結して一本鎖DNA 分子を形成する（Ferretti等、PNAS、第83巻、第599頁、1986年）。 ii．Ｅ３／19Ｋ遺伝子DNAの配列決定 DNAの増幅のために、断片をバクテリオファージ・ベクターM13mp18およびM13m p19中にクローン化する（GIBCO，Gaithsburg，MD）。各断片のヌクレオチド配列は、テンペレートとして一本鎖の13mp18およびM13mp19組換えファージDNAを使用し、プライマーとして選択された合成オリゴヌクレオチドを使用するジデオキシ法によって決定する。これによって、遺伝子の同一性と構造的完全性が確認される。 iii．Ｅ３／19Ｋ遺伝子のKT−３Ｂ中への連結Ｅ３／19Ｋ遺伝子は、実施例２Biiの記載と同様に、KT−３ＢまたはKT−３Ｃベクター中に連結する。実施例３ MHCの保存性領域のアンチセンス配列のKT−３へのクローニングＡ．KT−3ClneoαMHCの構築 KT−３バックボンベクターのネオマイシン耐性遺伝子の非翻訳領域中に挿入される特定の配列の増幅のためのPCR反応においてテンペレートとしてMHCクラスＩ対立遺伝子CW３（Zemmour等、Tissue Antigens、第39巻、第249頁、1992年）を使用する。次のプライマーを使用してヌクレオチド配列147から1,075の間でMHCクラスＩ対立遺伝子CW1 cDNAを増幅する。順方向プライマーはMHC CW3 cDNAヌクレオチド配列147−166に対応する。（配列番号）５′−３′：TATATGTCGACGGGCTACGTGGACGACACGC 逆方向プライマーはMHC CW3 cDNAヌクレオチド配列1,075−1,056に対応する。（配列番号）５′−３′：TATATGTCGACCATCAGAGCCCTGGGCACTG MHCクラスＩ対立遺伝子CW３相補的配列の外に、両プライマーはPCRアプリコン生産物の効率的酵素消化のために５′末端に５つのヌクレオチド「緩衝配列」を含有する。緩衝配列に両プライマー中のHincII認識配列が続く。上記のプライマーを持つMHCアンプリコンの作成はセクショク２Bi．に記載のPCRプロトコールを使用して行う。このプロトコールはVentポリメラーゼ（New England Biolabs，B everly，MA）によって修正され、さらに3.5分の代わりに１分の伸張時間を含むように修正される。Ventポリメラーゼはブラント末端を持つアンプリコンを作成する。その他、順方向および逆方向プライマーはMHC CW３相補的配列のみを含有することができる。 MHC CW3 cDNA950bpアンプリコン生産物をGene Clean(Bio101,San Diego，CA) で精製し、HincIIで消化する。消化断片、938bpは１％アガロースゲル電気泳動法によって単離し、Gene Cleanで精製する。 MHC CW3 cDNA950bp断片はネオマイシン耐性遺伝子の３′非翻訳領域中にアンチセンス配向で挿入する。特に、pBluescripII SK^C(pSK^C)（Stratagene，San Di ego，CA）プラスミドのHincII認識配列をHincIIおよびKpnIでの消化によって取出す。Kpn I3′末端をＴ 4 DNAポリメラーゼでブラントにし、ブラント末端を連結する。このプラスミドをpSKd1HIIを呼称する。実施例ＩＡに記載のように、pAFVXMレトロウイルスベクターからの1.3Kb Cla I-ClaＩドミナント選択性マーカー遺伝子断片をpSKd1HII のClaＩ部位中に挿入する。このプラスミドをpSKd1HII／SVneoと呼称する。MHC CW3 cDNA950bp断片をネオマイシン耐性遺伝子の３′非翻訳領域中に位置するpSK d1HII／SVneoのHincII部位中アンチセンス配向に挿入する。MHC CW3 cDNA950bp 断片がアンチセンス配向でネオマイシン遺伝子中に存在するコンフォメーションは制限エンドヌクレアーゼ消化および配向分析によって決定される。このクローンはpSKd1HII／SVneo／αMHCと呼称する。 pSKd1HII／SVneo／αMHCの構築は３路の連結反応で行う。そこでは、実施例１に記載のように、Cla I2.2KbSVneoαMHC断片およびN2R3^-からの1.0Kb MoMLV3′L TR ClaI-HindII断片をClaＩおよびpUC31／N2R5g^MプラスミドのClaＩとHindIII部位の間に挿入する。Ｂ．KT-３Ｃ／SVneo／VARNA／αの構築高水準MHC CW３アンチセンスRNA発現はAd2 VARNA1プロモータの下流のこの配列の挿入によって行う。Ad2 VARNA1プロモータMHCアンチセンスcDNAはRNAポリメラーゼIII（pol III）発現カセットとして組立てられ、次いでKT−３Ｃバックボーン中に挿入される。このpol III発現カセットでは、Ad2 VARNA1プロモータにアンチセンスαMHCcDNAが続き、それに順次pol IIIコンセンサス停止シグナルが続く。二本鎖の−30／＋70Ad2 VARNA1プロモータは化学的に合成し（Railey等、Mol. Cell.Biol.、第８巻。第1147頁、1988年）、夫々５′および３′にXhoＩおよびB gl II部位を含む、 VARNA1プロモータ順方向鎖：（配列番号：）５′−３′：CGAGTCTAGACCGTGCAAAAGGAGAGCCTGTAAGCGGGCACTCTTCCGTGGTCTGGTGGA TAAATTCGGAAGGGTATCATGGCGGACGACCGGGGTTCGAACCCCGGAVARNA1プロモータ逆方向鎖：（配列番号：）５′−３′：GATCTCCGGGGTTCGAACCCCGGTCGTCCGCCATGATACCCTTGCGAATTTATCCACCAG ACCACGGAAGAGTGCCCGCTTACAGGCTCTCCTTTTGCACGGTCTAGAC XhoＩおよびBgl II付着端を持つ二本鎖のVARNA1プロモータを形成するために、同量の一本鎖を10mMMgCl2中で混ぜ合せ、95℃５分間加熱し、次いで室温に徐々に冷却して、鎖をアニールさせる。プラスミドpSKdlHII／SVneo／αmhcからのMHCクラスＩ対立遺伝子CW３断片、ヌクレオチド配列653-854、を次のプライマー対を使用して増幅する。順方向プライマーはヌクレオチド配列653-689に対応する：５′−３′：TATATCCTAGGTCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTG 逆方向プライマーはヌクレオチド配列854-827に対応する：５′−３′：TATATAGATCTACATGGCACGTGTATCTCTGCTCTTCTC MHCクラスＩ対立遺伝子CW３相補的配列の外に、両プライマーはPCRアプリコン生産物の効率的な酵素消化のためにその５′末端に５つのヌクレオチド「緩衝配列」を含有する。緩衝配列に順方向プライマー中ではAvr II認識配列が続き、逆方向プライマー中ではBgl II認識配列が続く。このことは、pol III発現カセット中のAd2 VARNA1プロモータに関して、アンチセンス配向での挿入を可能にする。上記のプライマーを持つMHCの作成は、3.5分の代わりに0.5分の伸張時間を含むように修正された実施例１Bini記載のPCRプロトコールで行う。 Gene Clean(Bio101，San Diego，CA)でMHC CW3 cDNA223bpアプリコン生産物を精製し、次いでAvr IIおよびBgIIIで消化し、２％NuSeive-１％アガロース／TBE ゲル電気泳動法によって単離する。211bpバンドをゲルから取り出し、DNAをGene Cleanで精製する。二本鎖pol IIIコンセンサス停止配列を化学的は合成し（Geiduschek等、Annu ．Rev．Biochem．、第57巻、第873巻、1988年）、夫々５′および３′未満にAvr IIおよびClaＩ部位を含む。 pol III停止配列順方向プライマー：（配列番号：）５′−３′：CTAGGGCGCTTTTTGCGCAT pol III停止配列逆方向プライマー：（配列番号：）５′−３′：CGATGCGCAAAAAGCGCC Avr IIおよびCla Ｉ付着端を持つ二本鎖のpol III停止配列を形成するために、同量の一本鎖を10mMMgCl₂中で混ぜ合せ、95℃５分間加熱し、次いで室温に徐々に冷却して、鎖をアニールさせる。アンチセンスαMHCクラスＩ対立遺伝子CW3のためのpol III発現カセットを４路の連結反応で組立て、その中ではXhoＩ−Bgl II Ad2 VARNA１プロモータ断片、Bgl II−Avr IIαMHC CW3断片、およびAvr II−ClaＩ転写停止断片をXho ＩおよびCla Ｉ部位の間のpSKII⁺中にクローンする。この構成体はpSK／VARNA／αMH Cと呼称する。 KT3B／SVneo／VARNA／αMHCの構築は２工程の連結反応で行う。第一工程は、実施例１に記載のように、Xho Ｉ−ClaＩ VARNA／αMHC断片およびN2R3^-からの 1.0KbのMoMLV3′LTR Cla Ｉ−Hind III断片をpUC31／N2R5g^MプラスミドのXhoＩとHind III部位の間に挿入する３路の連結反応である。この構成体はKT3B／VARNA／αMHCと呼称する。第二連結反応工程では、1.3KbのClaＩ−BstBＩ SVneo断片をKT3B／VARNA／ αMHCのClaＩ部位中に挿入する。この構成体はKT3B／SVneo／VARNA／αMHCと呼称する。実施例４ MHCクラスＩ重鎖の保存性領域を切断するリボザイムのKT−3BへにクローニングＡ．pSK／VARNA／MHCHRBZの構築形質導入細胞中でのMHCクラスＩの発現を効率的に阻止するために、MHCクラスＩ対立遺伝子についての標的特異性をもつヘアーピン・リボザイムをKT3B／SVne oベクター中に挿入する。リボザイムをAd2 VARNAプロモータから高水準で発現させる。MHCヘアーピン・リボザイム（HRBZ）を実施例３に記載のpol IIIpSK/VARN A／αMHC発現カセット中に挿入する。 HRBZおよびMHCクラスＩ対立遺伝子CW3は以下の同族配列を有する。（配列番号：）５′−３′：GATGAGTCTCTCATCG HRBZは標的配列中に含有されるAGTCヘアピン基質motif中のＡ残基の後を切断するようにデザインされている。切断後、HRBZは再循環させて、MHCクラスＩRNA 分子にハイブリダイズし、切断することができる。 (Hampel等、Nucleic Acids Research、第18巻、第299頁、1990年)にすでに規定され、４個の塩基「テトラループ」３および拡大ヘリックス４を含有し、上記のMHCクラスＩ同族配列についての特異性をもつ二本鎖HRBZは化学的に合成され、夫々５′および３′末端にBgl IIおよびAvr II部位を含む。 MHC HRBZセンス鎖：（配列番号：）５′−３′：GATCTCGATGAGAAGAACATCACCAGAGAAACACACGGACTTCGGTCCGTGGTATATTAC CTGGTAC MHC HRBZアンチセンス鎖：（配列番号：）５′−３′：CTAGGTACCAGGTAATATACCACGGACCGAAGTCCGTGTGTTTCTCTGGTGATGTTCTTC TCATCGA Bgl IIおよびAvr II付着端を持つ二本鎖のMHCクラスＩ特異的HRBZを形成するために、同量の一本鎖を10mMMgCl2中で混ぜ合せ、95℃５分間加熱し、次いで室温に徐々に冷却して、鎖をアニールさせる。 MHC HRBZについてのpol III発現カセットを、Bgl IIおよびAvr II付着端をもつ科学的の合成した二本鎖のMHCクラスＩ特異的HRBZをBgl IIとAvr II消化かつC IAP処理したpSK／VARNA／αMHC中に連結することによって組立てる。そこではα MHC配列は配列ベクターからゲル精製除去されている。このプラスミドはpSK／VA RNA／MHCHCHRBZと呼称し、Ad2 VARNA1プロモータを含有し、それにMHCHCHRBZが続き、順次pol IIIコンセンサス停止配列が続く。pol III発現成分はXhoＩおよびClaＩ認識部位によってフランクされる。Ｂ．KT3B／SVneo／VARNA／MHCHCHRBZの構築 KT3B／SVneo／VARNA／MHCHCHRBZの構築は２工程の連結反応によって行う。第一工程はXhoＩ−ClaＩ VARNA／MHCHCHRBZ断片およびN2R3^-からの1.0KbのMoMLV3 ′LTR ClaＩ−Hind III断片を、実施例１に記載のpUC31／H2R5g^MプラスミドのXh oＩとHind III部位の間に挿入する３路の連結反応である。この構成体はKT3B／V A RNA／MHCHCHRBZと呼称する。第二工程では、1.3KbのClaＩ−BstBＩSVneo断片をK T3B／VARNA／MHCHCHRBZのClaＩ部位中に連結する。この構成体はKT3B／SVneo／V ARNA／MHCHCHRBZと呼称する。実施例５ PSF1アンチセンスcDNAのクローニングＡ．KT−3C／SVneo／αPSF1 KT−3Cバックボーンベクター中、ネオマイシン耐性遺伝子の非翻訳領域中に挿入する特定の配列の増幅のためのPCR反応において、PSF1のcDNAクローン(Spies 等、Nature、第351巻、第323頁、1991年、Spies等、Nature、第348巻、第744頁、1990年)をテンプレートとして使用する。次のプライマー対を使用して、PSF1c DNAはヌクレオチド配列91−１，124の間で増幅される。順方向プライマーはヌクレオチド配列９-111に対応する：（配列番号：）５′−３′：TATATGTCGACGAGCCATGCGGCTCCCTGAC 逆方向プライマーはヌクレオチド配列１，124-1，105に対応する：（配列番号：）５′−３′：TATATGTCGACCGAACGGTCTGCAGCCCTCC PSF1相補的配列の外に、両プライマーはPCRアプリコン生産物の効率的な酵素消化のために、その５′未満に５つのヌクレオチド「緩衝配列」を含有する。両プライマー中では、緩衝配列にHinc II認識配列が続く。上記のプライマーをもつPSF1アンプリコンの作成は実施例２Biに記載のPCRプロトコールで行う。このプロトコールはVent ポリメラーゼ（New England Biolabs，Beverly，MA）を使用することによって修正され、さらに3.5分の代わりに１分の伸張時間を含むように修正される。Ventポリメラーゼはブラント末端をもつアンプリコンを生成する。Ｂ．KT3B／SVneo／VARNA／αPSF1の構築高水準のPSF1アンチセンス配列はこの配列をAd2 VARNAlプロモーターの下流に挿入することによって行う。先ず、Ad2 VARNAlプロモターPSF1アンチセンスcDNA をpol III発現カセットとして組立て、次いでKT−3Bバックボーン中に挿入する。このpol III発現カセット中では、Ad2 VARNAlプロモータにアンチセンスPSF1 cDNAが続き、順番にpol IIIコンセンサス停止シグナルが続く。次のプライマー対を使用するPCE反応において、PSF1 cDNAのヌクレオチド配列91-309が増幅される。順方向プライマーはヌクレオチド配列91-111に対応する：（配列番号：）５′−３′：TATATCCTAGGGAGCCATGCGGCTCCCTGAC 逆方向プライマーはヌクレオチド配列309-288に対応する：（配列番号：）５′−３′：TATATAGATCTCAGACAGAGCGGGAGCAGCAG PSF1相補的配列の外に、両プライマーはPCRアプリコン生産物の効率的な酵素消化のために、その５′未満に５つのヌクレオチド「緩衝配列」を含有する。順方向プライマーでは緩衝配列にAvr II認識配列が続き、逆方向プライマーではBg l II認識配列が続き、RNAポリメラーゼIII発現カセット中のAd2 VARNAlプロモータに関して、アンチセンス配向での挿入を可能にする。上記のプライマーをもつ PSF1アプリコンの作成は、3.5分に代わりに0.5分の伸張時間を含むように修正した実施例２Biに記載のPCRプロトコールで行う。 MHC CW3 cDNA240bpアプリコン生産物はGene Clean(Bio101，San Diego，CA) で精製し、Avr IIおよびBgl IIで消化し、２％NuSeive-１％アガロース／TBEゲル電気泳動法によって単離する。次いで 211bpバンドをゲルから取り出し、Gene Cleanで精製する。 KT3B／SVneo／VARNA／αPSF1の構築は２工程に連結反応で行う。第一工程はXh oＩ−Cla Ｉ VARNA／MHCHCHRBZ／αPSF1断片およびN2R3^-からの1.0KbのMoMLV3′ LTR ClaＩ−Hind III断片を、実施例１に記載のpUC31／N2R5g^MプラスミドのXho Ｉと-Hind III部位の間に挿入する３路の連結反応である。この構成体はKT3B／V ARNA／αPSF1と呼称する。第二連結工程では、1.3KbのClaＩ−BstBＩSVneo断片をKT3B／VARNA／αPSF1のClaＩ部位中に連結する。この構成体はKT3B／SVneo／V ARNA／αPSF1と呼称する。実施例６ PSF1の保存性領域を切断するリボザイムのKT−3BへのクローニングＡ．pSK／VARNA／αPSFIHRBZの構築形質導入細胞中でのPSF1の発現効率的に阻止するために、PSF1 RNAについての標的特異性をもつヘアピン・リボザイムをKT3B／SVneoベクター中に挿入する。リボザイムをAd2 VARNAプロモータから高水準で発現させる。PSF1ヘアピン・リボザイム（HRBZ）を実施例３に記載のpol IIIpSK／VARNA／αMHC発現カセット中に挿入する。 HRBZおよびPSF1 RNAは以下の同族配列を有する。（配列番号：）５′−３′：GCTCTGTCTGGCCAC HRBZは標的配列中に含有されるTGTCヘアーピン基質motif中のＴ残基の後を切断するようにデザインされている。切断後、HRBZは再循環させて、PSF1 RNA分子にハイブリッド化し、切断することができる。 (Hampel等、Nucleic Acids Research、第18巻、第299頁、1990年)にすでに規定され、４個の塩基「テトラループ」３および拡大ヘリックス４を含有し、上記のPSF1同族配列についての特異性をもつ二本鎖HRBZ は科学的に合成され、夫々５′および３′末端にBg1 IIおよびAvr II部位を含む。（配列番号：）５′−３′：GATCTGTGGCCAGACAGAGCACCAGAGAAACACACGGACTTCGGTCCGTGGTATATTACC TGGTAC （配列番号：）５′−３′：CTAGGTACCAGGTAATATACCACGGACCGAAGTCCGTGTGTTTCTCTGGTGCTCTGTCTG GCCACA Bgl IIおよびAvr II付着端を持つ二本鎖のPSF1特異的HRBZを形成するために、同量の一本鎖を10mMMgCl₂中で混ぜ合せ、95℃５分間加熱し、次いで室温に徐々に冷却して、鎖をアニールさせる。 PSF1 HRBZについてのpol III発現カセットを、Bgl IIおよびAvr II付着端をもつ科学的の合成した二本鎖のPSF1特異的HRBZをBgl IIとAvr II消化かつCIAP処理したpSK／VARNA／αMHC中にベクター中で連結することによって組立てる。このプラスミドはpSK／VARNA／MHCHCHRBZと呼称し、Ad2 VARNAlプロモータを含有し、それにMHCHCHRBZが続き、順次pol IIIコンセンサス停止配列が続く。pol III 発現成分はXhoＩおよびClaＩ認識部位によってフランクされる。Ｂ．KT3B／SVneo／VARNA／PSF1HCHRBZの構築 KT3B／SVneo／VARNA／MHCHCHRBZの構築は２工程の連結反応によって行う。第一工程はXhoＩ−ClaＩVARNA／PSF1IHRBZ断片およびN2R3−からの1.0KbのMoMLV3 ′LTR ClaＩ−Hind III断片を、実施例１に記載のpUC31／H2R5g^MプラスミドのXh oＩとHind III部位の間に挿入する３路の連結反応である。この構成体はKT3B／V ARNA／PSFIHRBZと呼称する。第二工程では、1.3KbのClaＩ−BstB Ｉ SVneo断片をKT3B／VARNA／PSF1HRBZのClaＩ部位中に連結する。この構成体はKT3 B／SVneo／VARNA／PSF1HRBZと呼称する。実施例７多価組換えレトロウイルスベクターKT3b−Ｅ３／19Ｋ／αMHCの構築実施例２と３に記載のスリークラスIMHC対立遺伝子Ａ２，CW3およびＢ27の間に保存性領域に特異的なＥ３／19Ｋ配列およびアンチセンス配列の両方を含有する種々のレトロウイルスベクターKT3b−Ｅ３／19Ｋもまた構築することができる。このプラスミドはKT3b−Ｅ３／19Ｋ／αMHCとして知られ、キメラ分子として発現されるＥ３／19Ｋ配列の３′末端でMHCクラスＩアンチセンス配列を取込むようにデザインされている。レトロウイルス、KT3b−Ｅ３／19Ｋ／αMHCは、MHC アンチセンス配列を含有するClaＩ消化PCR増幅生産物をKT3b−Ｅ３／19ＫのCla Ｉ部位中に連結することによって構築することができる。さらに詳しくは、MHC クラスＩ対立遺伝子CW3のcDNAクローン(Zemmour等、Tissue Antigens、第32巻、第249頁、1992年)は次のプライマー対を使用してヌクレオチド653と854の間のPC Rによって増幅される。（配列番号：）５′−３′：ATTATCGATTCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTG （配列番号：）５′−３′：ATTAATCGATACATGGCAAGTGTATCTCTGCTCTTCTC プラマー対は、増幅Cla Ｉ消化生産物を部分的前消化KT−３Ｂ−Ｅ３／19Ｋベクター中にアンチセンス配向で挿入するために、ClaＩ制限酵素部位によってフランクされる。ClaＩ断片を逆配向に入れることによって、ベクターは転写のとき負アンチセンス鎖を発現する。実施例８組換えレトロウイルスベクターKT3B−Ｅ３／19Ｋまたは他のベクターによる包装細胞株DAの形質導入Ａ．プラスミドDNA形質導入 293 2-3細胞(293細胞ATTC No.CRL 1573から誘導された細胞株、WO、第92／052 66号公報)の５×10₅細胞を６cm組織培養皿上に約50％集落で接種する。翌日、感染４時間前に培地を４ml新鮮な培地で取換える。標準カルシウムリン酸塩−DNA 共沈殿法は、10.0μｇのKT−3B−Ｅ３／19Ｋプラスミドと10.0μｇのMLP G プラスミドを２Ｍ CaCl₂溶液で混合し、pH6.9の１×ヘペス緩衝食塩溶液を添加し、室温で15分間インキュウベートすることによって行う。カルシウムリン酸塩-DNA 共沈殿を293 2-3細胞に移し、次いで５％CO₂中で37℃で一夜インキュウベートする。翌日、細胞をpH7.0の１×PBSで３回リンスする。新鮮な培地を細胞に添加し、次いで10％CO₂中で37℃で一夜インキュウベートする。翌日、培地を細胞から収集し、0.45μフィルタを通す。この上澄液を使用して、包装と腫瘍細胞株を形質導入する。同様の方法で他のベクターについて過渡性ベクター上澄液を作成する。Ｂ．包装細胞株の形質導入 DA細胞（Ｄ−17細胞から誘導された両栄養性細胞株ATCC No.183，WO、第92／0 5266号公報）を５×10₅細胞／10cm皿に接種する。約0.5mlの新しく収集した293 2-3上澄液（または−70℃に保管してあった上澄液）にDA細胞を添加する。翌日、フレオマイシンをこれら細胞に添加し、１週間かけて薬剤耐性プールを作成する。この細胞プールを希釈クローンして、96ウエルプレートのウエル当たり１個の細胞を得た。24クローンを24ウエルプレートに展開し、次いで６ウエルプレートに展開し、このとき細胞上澄液を分析のために収集する。ベクター生産のためのDAクローンを選択し、DA−Ｅ３／19Ｋと呼ぶ。ベクター上澄液をポリブレンまたはプロタミン硫酸塩を含有する正常培地で培養したDA−Ｅ３／19Ｋクローンの10cm交会プレートから収集する。その他、ベクター上澄液をバイオリアクターまたはローラーボトルから採取し、加工し、使用前にさらに精製することができる。薬剤耐性マーカーのないまたはすでに包装細胞株中にあるマーカーをもつこれらのベクターについて、293 2-3作成上澄液で細胞を形質導入して１から２日後にDA形質導入細胞を希釈クローニングすることによって、安定的に形質導入されるクローンの選択を行なわねばならない。次いで、PT-PCRとして知られている操作法、すなわちメッセージRNAの逆転写次いでポリメラーゼ連鎖反応によるcDNA メッセージの増幅を使用することによって、希釈クローンをＥ３／19Ｋ発現の存在についてスクリーニングする。商業キットがInvitrogen社(San Diego，CA)から入手できる。程よい数の安定的に形質転換されたクローンを見出だすためには、RT-PCRは少なくとも10日間増殖されたクローンについて行うべきであり、約50 から100クローンがスクリーニングされる必要である。PT-PCRを行うためには、特異的なプライマーは各メッセージが増殖される必要がある。Ｅ３／19Ｋメセージクリーニングについて401bp生産物を増殖するようにデザインさたプライマーは次の通りである。Ｅ３／19Ｋについてのスクリーニングプライマー：（配列番号：）５′−３′：ATGAGGTACATGATTTTAGGCTTG （配列番号：）５′−３′：TCAAGGCATTTTCTTTTCATCAATAAAAC実施例９複製コンピテントレトロウイルスの検出拡大Ｓ⁺Ｌ⁺アッセイによって複製コンピテント感染性ウイルスが関心のある細胞株上澄液中に存在するかどうかが決定される。アッセイは感染性レトロウイルスがインディケーター細胞株MiCl₁(ATCC CCL64.1)上にフォーカスを作るという実験的観察に基ずく。MiCl₁細胞株はMvlLu ミンク細胞株（ATCC CCL64）からマウス肉腫ウイルス(MSV)での形質導入によって誘導される。MSVゲノムの存在を示す肉腫（Ｓ⁺）を形成し、複製コンピテントウイルスの不在を示す白血病（Ｌ^-）を起こさないのは、マウス肉腫プロウイルスを含有する非生産者、非形質転換的、復帰突然変異体クローンである。複製コンピテントレトロウイルスによるMiCl₁ 細胞の感染によって、MSVゲノムは「活性化」されて増殖班を与える「形質転換」を起こす。複製コンピテントレトロウイルスの存在について試験する細胞株から上澄液取出し、0.45μフィルタに通して細胞も除去する。MvlLu細胞をDMEM２ml、10％FBS と８μｇポリブレン中に６ウエルプレートのウエル当たり（試験試料当たり１ウエル）１×10⁵細胞で接種する。１日目に、MvlLu細胞を別々の６ウエルプレート上にポジチブとネガチブコントロールのために同じ方法でプレートする。MvlLu 細胞を37℃で10％CO₂で一夜インキュウベートする。２日目に、1.0mlの試験上澄液をMvlLu細胞に添加する。ネガチブコントロールプレートを1.0ml培地でインキュベートする。ポジチブコントロールは、MAウイルス（Miller等、Molec．and C ell．Biol.、第５巻、第431頁、1985年）の３希釈(1.0mの培地中200増殖班形成単位(ffu)、20ffuと２ffu)からからなり、それはポジチブコントロール・ウエル中の細胞に添加される。細胞を一夜インキュベートする。３日目に、培地をアスピレートし、細胞に3.0mlの新鮮なDMEM と10％FBSを添加する。細胞を交会まで成育させ、６日目と10日目に１：10に分割し、複製コンピテントレトロウイルスを増殖させる。13日目に、MVlLu細胞上の培地をアスピレートし、2.0mlのDMEMと10％FBSを細胞に添加する。さらに、Mi Cl₁ をDMEM２mL10％FBSと８μｇポリブレン中に６ウエルプレートのウエル当たり１×10⁵細胞で接種する。14日目に、MvlLu細胞からの上澄液をMiCl₁細胞の相当するウエルに移し、37℃で10％CO₂で一夜インキュウベートする。15日目に、培地をアスピレートし、3.0mlの新鮮DMEMと10％FBSを細胞に添加する。20日目に、細胞を細胞の単層上のフォーカス形成（単層に過増殖し付着したままである、群生した抵抗性の細胞として現れる）について検査する。増殖班がMiCl₁細胞上に出現する場合、試験部品は複製コンピーテントレトロウイルスによって汚染されると決定する。実施例10 細胞株のＥ３／19Ｋレトロウイルスベクターによる形質導入４μｇ／mlポリブレン：HT1080(ATCC No．CCL121)，Hela (ATCCNo．CCL2)，BC 10ME(Patek等、Cell．Immuno．、第72巻、第113頁、1982年、ATCC No．TIB85)， BCenv，HIV-1 IIIBenvを発現するBC10ME（Warner等、AIDS Res．and Human Zetr oviruses、第７巻、第 645頁、1991年、Gunther Oennert，University of South ern Californiaからの得たＬ33）、およびL33envを持つ５×10⁵細胞／１−cm皿に次の粘着性ヒトおよびマウス細胞株を接種する。翌日、DA Ｅ３／19Ｋからの 1.0mlの濾過上澄液を各細胞培養プレートに添加する。翌日、フレオマイシンをすべての細胞培養の培地に添加する。すでにネオマイシン耐性である細胞株については、KT−３Ｃバックボーン中のＥ３／19Ｋ（フレオマイシン耐性）を使用する。293 2-3についてまたはDA誘導株からの過渡的上澄液を使用することができる。選択が完全であり、遺伝子発現を試験するのに十分な細胞数が作成されるまで、培養物を保持する。形質導入細胞株は夫々、HT1080−Ｅ３／19Ｋ、He la−Ｅ３／19Ｋ、および、L33env−Ｅ３／19Ｋと呼ぶ。 EBV形質転換細胞株（BLCL）、および他の懸濁細胞株を照射プロデュサー細胞株、DA−Ｅ３／19Ｋとの共培養によって形質導入する。特に、照射（10,000rads ）プロデュサー細胞株を４μｇmlポリブレンを含有する増殖培地中で５×10⁵細胞／６cm皿でプレートする。細胞を２−24時間付着させた後、10⁶懸濁細胞を添加する。２−３日後、懸濁細胞を取出し、遠心分離でペッレト化し、１mg／mlフレオマイシンを含有する増殖培地中に懸濁し、丸ボトル96ウエルプレートの10ウエル中に接種する。培養物を24ウエルプレート、次いでＴ−25フラスコに拡張する。実施例11 多価組換えレトロウイルスベクター構成体KT3B−Ｅ３／19Ｋ中でのＥ３／19Ｋの発現Ａ．Ｅ３／19Ｋについてのウエスタン・ブロット分析Ｅ３／19Ｋ発現の分析のために放射性免疫沈殿検定法（RIPA）溶解物を選択培養物から作成する。RIPA溶解物を融合性プレートから調製する。特に、初めに培地を細胞からスピレートする。細胞を含有する培養プレートのサイズに依って、 100から500μの氷冷RIPA溶解物緩衝液(pH7.4の10mMTris，１％Nonidet P40(Calb iochem，San Diego，CA)，0.1％SDS，150mM NaCl)を細胞に添加する。プレートからマイクロピペットを使用して細胞を取出し、混合物をマイクロチューブに移す。チューブを５分間遠心分離して細胞破片を沈殿させ、上澄液を他のチューブに移す。上澄液を10％SDS-PAGEゲル上で電気泳動し、タンパク質バンドをCAPS緩衝液（Aldrich，Milwauk ee，WI）（10mM CAPS，pH11.0，10％メタノール）中で10から60ボルトで２から1 8時間でImmobilon膜に移す。膜をCAPS緩衝液から５％Blotto(５％無脂肪乾燥ミルク、pH7.4の50mM Tris，150mM NaCl，0.02％アジ化ナトリウム、および0.05％ Tween20)に移し、Ｅ３／19Ｋに対するマウス・モノクローナル抗体でプローブする(Severinsson等、J，Cell Biol．、第101巻、第540頁、1985年)。膜に結合する抗体を1251−プロテインＡを使用して検出する。実施例12 非形質導入細胞と比較してクラスＩ発現が減少した水準を示すＥ３／19Ｋ−ベクター形質導入細胞のFACS検査Ｅ３／19Ｋ−ベクターで形質導入した細胞株をFACS分析によってMHCクラスＩ分子発現について検査する。非形質導入細胞もMHCクラスＩ分子発現について分析し、Ｅ３／19Ｋ形質導入細胞と比較して形質導入のMHCクラスＩ分子に対する効果を決定する。 msウス細胞株、Ｌ33−Ｅ３／19Ｋ，L33env−Ｅ３／19Ｋ，L33env，BC10ME，BC env，BCenv-Ｅ３／19Ｋを細胞表面上のＨ−２Ｄ^d分子の発現について試験する。準集密密度にまで増殖した細胞を(ベルセンVersene)による処理によって培養物から取出し、冷(４℃)PBSプラス１％BSAと0.02％アジ化ナトリウム（洗浄緩衝液）で200ｇの遠心分離によって２回洗浄する。２百万個の細胞をマイクロフュージ・チューブ中に入れ、200ｇの遠心分離によってペレット化し、上澄液を除去する。細胞ペレットをＨ−２Ｄ^d−特異性Mab34-2−12s(精製抗体の１：100希釈液の50μ，ATCC No．HB87)で再懸濁し、時どき混合して４℃で30分間インキュウベートする。抗体標識細胞を１mlの洗浄緩衝液（４℃）で洗浄し、遠心分離し、上澄液を除去する。細胞をビオチン化ヤギ・アンチマウス・カッパ軽鎖Mab(Amer sham，Arlington Heigts，IL)(50μ、精製抗体の１：100 希釈液)で再懸濁し、４℃で30分間インキュウベートする。細胞を洗浄し、50μ のアビジン結合FITC（Pierce，Rockford，IL）で再懸濁し、４℃で30分間インキュウベートする。細胞をもう１回洗浄し、１mlの洗浄緩衝液中に再懸濁し、FACS tar Analyzer(Becton，Dickinson，Los Angels，CA)での分析の前に氷上に保持する。形質導入細胞の平均蛍光強度を非形質導入細胞のそれと比較して、Ｅ３／ 19Ｋタンパク質が表面MHCクラスＩ分子発現に対して有する効果を決定する。実施例13 マウスCTL検査 Balb／ｃマウスに10⁷照射(10,000ラド)BCenv細胞を注射する。７日後脾臓を採取し、単細胞懸濁液に分散し、３×10⁶脾臓細胞／mlを生体外で６×10⁴細胞／ml 照射BCenvまたはBCenv-Ｅ３／19Ｋ細胞と共にＴ−25フラスコ中で37℃で７日間培養する。培養液はRPM11640；熱失活した５％胎児ウシ血清(FBS)；１mMピルビン酸塩；50μｇ／mlゲンタマイシンおよび10^-5Ｍ２−メルカプトエタノールからなる。７日後にエフェクター細胞を採取し、標準４−６時間検査で96ウエル・マイクロタイター・プレート中で種々のエフェクター：標的細胞比を使用して試験する。この検査には、Na₂ ⁵¹CrO4−標識、100μCi、37℃で時間(Amersham，Arlin gton Heighs，Illinois)の標的細胞（BC，BCenv，Warner等、Aids Res．and Hum an Retroviruses、第７巻、第645頁、1991年またはBCenvＥ３／19Ｋ）を200μのウエル当たり最終全量で1.0×10⁴細胞／ウエルで使用する。インキュウベートの後、100μの培養液を取出し、WALLACガンマ分光計（Gaithersgurg、MD）中で分析する。自発放出（SR）を標的プラス培地からCPMとして決定し、そして最高放出（MR）を標的プラスＩＭ HClから毎秒カウント数(CPM)として決定する。標的細胞溶菌パーセントを「（エフェクター細胞＋標的CPM）−（SR）」／〔（MR） −（SR）］×100として算出する。標的の自発放出価は典型的にはMRの10％−30 ％である。関心のある遺伝子（リボザイム、Ｅ３／19Ｋ、アンチセンスなど）で形質導入された腫瘍細胞をこの検査の刺敵物質および／または標的細胞として使用して、ポジチブコントロールである非形質導入株と比較してHIV-特異的CTLの誘発および検出の減少を実証する。実施例14 Ｅ３−ベクター形質導入によってクラスＩ分子表面発現が減少する場合BALB／ＣマウスによるL33env細胞の腫瘍拒絶が阻害される遺伝子治療処理の形質導入細胞についてのモデルとしてL33env細胞が使用されている。遺伝子治療処理細胞は、それらをCTLによるクリアランスについての可能な標的とする外来タンパク質を産生する。生Ｌ33腫瘍細胞を注射されたBalb／ｃマウスは露呈後３週間以内にカリッパー測定によって確認可能な固形腫瘍を発生することが示されている。しかし、生Ｌ33形質導入腫瘍細胞(HIV−１IIIBエンベロープタンパク質の発現について形質導入されかつ選択されたＬ33細胞)を注射されたBalb／ｃマウスはＨ−２Ｄ^dの文脈でHIVenvを認識し、15週間後までに明白な腫瘍を持たない腫瘍細胞を拒絶する（Warner等、Aids Res．and Human Re troviruses、第７巻、第６45頁、1991年）。L33env細胞をＥ３／19Ｋベクターで形質導入するとMHCクラスＩ分子の細胞表面発現が減少して、これらの細胞が免疫監視を回避し、それによって腫瘍を確立する。L33env腫瘍の発生は、MHCクラスＩ分子の細胞表面発現が細胞をＥ19遺伝子で共形質導入することによって減少したことを示す。このことは免疫系クリアランス機構を妨げる。腫瘍細胞株L33env、およびＥ３／19Ｋ−L33envを10％FBSを含有するDMEM中で増殖させる。腫瘍細胞を冷(４℃)PBSで静かにリンスし、ベルセンで処理してプレートから取出す。プレートから細胞をスピレートした後、単細胞懸濁液を無菌プラスチックチューブに添加する。細胞懸濁液を無菌PBS(４℃)２回洗浄し、計数し、PBS中に10⁷細胞／mlまで再懸濁する。Balb／ｃマウス（４− ６週令）に10⁶生腫瘍細胞(0.1ml)を皮下注射し、腫瘍形成および腫瘍クリアランスについて評価する。種々のマウスに種々の腫瘍細胞株を注射する。Ｌ33細胞を注射されたマウスは腫瘍形成についてポジチブ動物であり、一方L33envを注射されたマウスはネガチブコントロールであり、env特異的CTL応答のために腫瘍細胞を拒絶するはずである。Ｅ３／19Ｋ形質導入された、L33env細胞を注射されたマウスの群を監視して、L33env細胞中でのＥ３／19Ｋ発現がこれら腫瘍細胞に対するマウスの免疫応答に対して有する効果が分かる。実施例15 非形質導入細胞と比較してMHC クラスＩ発現が減少した水準を示すＥ３／19Ｋ− ベクター形質導入ヒト細胞のFACS検査Ｅ３／19Ｋ−ベクターで形質導入した細胞株をFACS分析によってクラスＩ分子発現について検査する。非形質導入細胞をクラスＩ分子発現について分析し、Ｅ３／19Ｋ形質導入細胞と比較して、形質導入がクラスＩ分子に対して有する効果を決定する。２種のヒト細胞株、JY-Ｅ３／19ＫおよびJY（ATCC No. ）を細胞表面上のHLA-Ａ２分子の発現について試験する。10⁶細胞／mlまで増殖した懸濁細胞をピペットによって培養フラスコから取出し、冷(４℃)PBSプラス１％BSAと0.02％アジ化ナトリウム（洗浄緩衝液）で200ｇの遠心分離によって２回洗浄する。２百万（２×10⁶）個の細胞をマイクロフュージ・チューブ中に入れ、200ｇでペレット化し、上澄液を除去する。細胞ペレットをHLA-Ａ２−特異性MabBB7.2（精製抗体の１：100希釈液の50μ、ATCC No.HB82）で再懸濁し、抗体と共に時どき混合して４℃で30分間インキュウベートする。抗体標識細胞を１ mlの洗浄緩衝液（４℃）で洗浄する。上澄液を除去する前に、細胞をビオチン化ヤギ・アンチマウス・カッパ軽鎖Mab(Amersham，Arlington Heigts，IL)(50μ、精製抗体の１：100希釈液)で再懸濁し、４℃で30分間インキュウベートする。細胞を洗浄し、50μのアビジン結合FITCで再懸濁し、４℃で30分間インキュウベートする。細胞をもう１回洗浄し、１mlの洗浄緩衝液中に再懸濁し、FACStar Anal yzerでの分析の前に氷上に保持する。形質導入細胞の平均蛍光強度を非形質導入細胞のそれと比較して、Ｅ３／19Ｋタンパク質が表面MHCクラスＩ分子発現に対して有する効果を決定する。実施例16 HLA-Ａ２制限されたEBV-特異的ヒトCTL株によるＥ３／19−形質導入と非形質導入されたEBV-形質転換ヒトJY細胞に対する免疫応答の測定刺激要因として自己EBV形質転換細胞を使用して供血試料から増殖させたヒトC TL株は制限されかつEBVに特異的であるHLA-Ａ２であることが分かっている。自己EBV形質転換細胞と共に増殖したこれらのCTL株はJY標的細胞（HLA-Ａ２⁺とEBV 形質転換された）を溶菌することができる。クロム放出検査を、Ｅ３／19Ｋ遺伝子で形質転換されているまたは非形質転換であるこれらCTL株およびJY標的細胞で行うことができる。非形質転換JT標的細胞と比軟した場合にこの細胞の認識と溶菌が減少することを実証するのに、Ｅ３／19Ｋ遺伝子形質転換JY標的細胞を使用する。これらの結果は、MHCクラスＩ表面発現を減少させる試薬による細胞形質転換は、生体内ヒト細胞モデル系中でのMHCクラスＩ制限細胞仲介免疫応答をも減少させることを示す。 HLA-Ａ２でありEBV応答を有することが確認されている人間からの１×10⁷PBMC と共に約１×10⁶照射（10,000ラド）JY細胞を10mlの培地中で37℃５％CO₂で７− 10日間培養する。培養液はCTL増殖用に前選択された５％熱失活胎児ウシ血清、１mMピルビン酸ナトリウムおよび非必須アミノ酸を補足したRPMI1640からなる。７−10日培養の後、エフェクター細胞を採取し、ポジチブとして⁵¹Cr標識JY細胞および⁵¹Cr標識JY-Ｅ３／19Ｋを使用する標準４−６時間クローム放出検査で試験する。JYおよびJY-Ｅ３／19Ｋ細胞をNa₂ ⁵¹CrO４の300μCiで37℃で１時間標識し、次いで洗浄し計数して、100μのウエル当たり最終全量で４×10³細胞／ウエルでの検査に使用する。インキュウベートの後、100μの培養液を取出し、WALLA Cガンマ分光計中で分析する。自発放出（SR）を標的プラス培地から毎秒カウント数（CPM）CPMとして決定し、そして最高放出（MR）を標的プラス１Ｍ HClから決定する。標的細胞溶菌パーセントを「(エフェクター細胞＋標的CPM)−（SR）」／［（MR）−（SR）］×100として算出する。標的の自発放出価は典型的にはM Rの10％−30％である。関心のある遺伝子（リボザイム、Ｅ３／19Ｋ、アンチセンスなど）で形質導入された腫瘍細胞をこの検査の刺激物質および／または標的細胞として使用して、ポジチブコントロールである非形質導入株と比較してHIV- 特異的CTLの誘発および検出の減少を実証する。患者中に注入当たり注入するのに使用する形質転換細胞数は患者当たり注入当たり10⁷−10⁸細胞の最小数とするように計画する。注入の部位は直接に患者の滑液膜中または静脈注射で末梢血流中とすることができる。上記から、本発明の特定の実施態様は説明の目的のためにここに記載されたものであって、本発明の範囲を逸脱することなく種々の修正を作成することができる。それ故、請求の範囲による以外、本発明は制限されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者イルウィン，マイケルジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92109, サンディエゴ，ダイヤモンドストリート＃７ 1944 (72)発明者ワーナー，ジョンエフ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92130, サンディエゴ，カーメルクリークロード 12962―137 (72)発明者ドゥベンスキー，トーマスダブリュ．, ジュニアアメリカ合衆国，カリフォルニア 92014, デルマー，ビアフェリノ 12729 (72)発明者イバネツ，カルロスイー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92129, サンディエゴ，ミルポンドウェイ 13592

Claims

【特許請求の範囲】１．動物体内の自己免疫応答を抑制する方法に使用するための、MHC抗原提示を阻止することが出来るタンパク質またはタンパク質の活性部分を発現する組換えベクター構成体で形質転換された動物の組織細胞。２．組換えベクター構成体がβ₂−ミクログロブリンに結合することが出来るタンパク質の発現を指令する請求の範囲第１項に記載の細胞。３．組換えベクター構成体が細胞内でMHCクラスＩ重鎖分子に結合することが出来るタンパク質の発現を指令する請求の範囲第１項に記載の細胞。４．組換えベクター構成体がＥ３／19ＫおよびH301よりなる群から選択されるタンパク質またはタンパク質の活性部分の発現を指令する請求の範囲第１項に記載の細胞。５．動物体内の自己免疫応答を抑制する方法に使用するための、細胞に対する自己免疫応答が抑制されるように、MHC抗原提示を阻止することが出来るアンチセンスメッセージを転写する組換えベクター構成体で形質転換された動物の組織細胞。６．組換えベクター構成体がMHCクラスＩ重鎖転写産物の保存性領域に結合するアンチセンスメッセージを転写する請求の範囲第５項に記載の細胞。７．組換えベクター構成体がβ₂−ミクログロブリン転写産物に結合するアンチセンスメッセージを転写する請求の範囲第５項に記載の細胞。８．組換えベクター構成体がPSF1輸送タンパク質転写産物に結合するアンチセンスメッセージを転写する請求の範囲第５項に記載の細胞。９．動物体内の自己免疫応答を抑制する方法に使用するための、細胞に対する自己免疫応答が抑制されるように、MHC抗原提示を阻止することが出来るリボザイムを転写する組換えベクター構成体で形質転換された動物の組織細胞。 10．組換えベクター構成体がMHCクラスＩ重鎖転写産物の保存性領域を切断するリボザイムを転写する請求の範囲第９項に記載の細胞。 11．組換えベクター構成体がβ₂−ミクログロブリン転写産物を切断するリボザイムを転写する請求の範囲第９項に記載の細胞。 12．組換えベクター構成体がPSF1輸送タンパク質転写産物を切断するリボザイムを転写する請求の範囲第９項に記載の細胞。 13．動物体内の自己免疫応答を抑制する方法に使用するための、細胞に対する自己免疫応答が抑制されるように、MHC抗原提示を阻止することが出来るタンパク質またはタンパク質の活性部分およびMHC抗原提示を阻止することが出来るアンチセンスメッセージもしくはリボザイムの発現を指令する多価組換えベクター構成体で形質転換された動物の組織細胞。 14．動物体内の自己免疫応答を抑制する方法に使用するための、細胞に対する自己免疫応答が抑制されるように、MHC抗原提示を阻止することが出来るアンチセンスメッセージおよびリボザイムの発現を指令する多価組換えベクター構成体で形質転換された動物の組織細胞。 15．動物体内の自己免疫応答を抑制する方法に使用するための、細胞に対する自己免疫応答が抑制されるように、ａ）MHC抗原提示を阻止することが出来る２種以上のタンパク質またはタンパク質の活性成分；ｂ）MHC抗原提示を阻止することが出来る２種以上のアンチセンスメッセージ；またはｃ）MHC抗原提示を阻止することが出来るリボザイムの発現を指令する多価組換えベクター構成体で形質転換された動物の組織細胞。 16．タンパク質がＥ３／19ＫもしくはH301またはそれらの活性タンパク質である請求の範囲第13項または第15項に記載の細胞。 17．アンチセンスメッセージがMHCクラスＩ重鎖の保存性領域、β₂−ミクログロブリンおよびPSF1輸送タンパク質よりなる群から選択されるタンパク質の転写産物に結合する請求の範囲第13項、第14項または第15項のいずれか一項に記載の細胞。 18．リボザイムがMHCクラスＩ重鎖の保存性領域、β₂−ミクログロブリンおよびPSFI輸送タンパク質よりなる群から選択されるタンパク質の転写産物を切断する請求の範囲第13項、第14項または第15項のいずれか一項に記載の細胞。 19．前記組換えベクター構成体が組換えウイルスベクター構成体である請求の範囲第１項、第５項、第９項、第13項、第14または第15項のいずれか一項に記載の細胞。 20．組換えベクター構成体が組換えレトロウイルスベクター構成体である請求の範囲第１項、第５項、第９項、第13項、第14項または第15項のいずれか一項に記載の細胞。 21．組換えベクター構成体がポリオウイルス、ライノウイルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびはしかウイルスよりなる群から選択される組換えウイルスによって担持される請求の範囲第１項、第５項、第９項、第13項、第14項または第15項のいずれか一項に記載の細胞。 22．組換えベクター構成体がトガウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、パルボウイルス科、ヘルペスウイルス科、パラミクソウイルス科、およびコロナウイルス科よりなる群から選択される組換えウイルスによって担持される請求の範囲第１項、第５項、第９項、第13項、第14項または第15項のいずれか一項に記載の細胞。 23．組換えベクター構成体が組換えコロナウイルスによって担持される請求の範囲第１項、第５項、第９項、第13項、第14項または第15項のいずれか一項に記載の細胞。 24．組換えベクター構成体が組換えシンドビスウイルスによって担持される請求の範囲第１項、第５項、第９項、第13項、第14項または第15項のいずれか一項に記載の細胞。 25．組織細胞が滑液膜細胞、膵島細胞、肝細胞および角膜細胞よりなる群から選択される請求の範囲第１項、第５項、第９項、第13項、第14項または第15項のいずれか一項に記載の細胞。