JPH09503656A

JPH09503656A - 移植片拒絶の抑制方法

Info

Publication number: JPH09503656A
Application number: JP7508294A
Authority: JP
Inventors: エフ．ワーナー，ジョン; アンダーソン，キャロル−ゲイ; ジェイ．ジョリー，ダグラス; ダブリュ．，ジュニアドゥベンスキー，トーマス; イー．イバネツ，カルロス; ジェイ．アーウィン，マイケル
Original assignee: チロンビアジーンインコーポレイティド
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1994-09-02
Publication date: 1997-04-15
Also published as: WO1995006717A3; WO1995006717A2; CA2158933A1; EP0716691A1; AU7681394A

Abstract

(57)【要約】組換えベクター構成物により形質転換された動物の組織細胞であって、ここで前記組換えベクター構成物が、ＭＨＣ抗原提示を阻害することができる(a)タンパク質もしくはそれの活性断片の発現を指令し；(b)アンチセンス情報を転写し；または(C)リボザイムを転写する、前記組織細胞が提供される。関連する観点では、該細胞が２以上のそのようなタンパク質、アンチセンスもしくはリボザイムまたはそれらの組合せにより形質転換される。前記組織細胞は移植片拒絶を抑制する方法において特に有用である。そのような形質転換された組織細胞を含んで成る医薬組成物も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】移植片拒絶の抑制方法技術分野本発明は一般的に組織移植の分野に関し、より詳しくは、Ｔ細胞の認識および活性化により媒介される移植片拒絶の抑制方法に関する。発明の背景免疫応答を効率的に且つ安全に抑制する方法は1950年代の初めから臨床移植術にとって重要な問題となっている。動物に同種移植片組織を導入すると、体液性応答と細胞性応答の両方から成る免疫系による攻撃が開始される。それらの応答では、組織細胞は移植された組織に対して向けられた抗体によるクリアランスに差し向けられるかまたはキラー細胞により破壊される。同種移植片拒絶は、提供者の組織適合性分子により開始される一連の複雑なＴ細胞依存性現象から成る。Ｔ細胞活性化時の１つの主な現象は、細胞表面タンパク質であるインターロイキン−２レセプター（IL-2R）の新規発現に関係づけられる。これはIL-2への結合により同種活性化されたＴ細胞の増殖および生存力の持続に不可欠である（Cant rell他，Science 224:1312，1984）。IL-2Rが存在しないと免疫応答は抑制される。拒絶応答を抑制する初期の試みは全身照射を使用した。しかしながら、そのような試みは特異性の欠如と腫瘍生成の増加のために不成功であった。この結果、移植拒絶の予防および治療のための特異的薬剤または抗体のいずれか使用に至った。この点で、多数の薬剤（Carpenter他、New Engl．J．Med．32:1224，1991）が好結果に免疫抑制性であることが示されているが、様々な副作用のないものはなかった。それらの毒性作用としては、一般に、神経学的、皮膚、胃腸、内分泌、血管、および血液学的合併症が挙げられる。臓器移植に対して特別の寛容性を誘導する１つの確立されたそのような薬剤はシクロスポリンである。この薬剤は、特にmRNA転写レベルにおけるIL-2生産の抑制によりＴ細胞媒介型同種免疫と自己免疫応答を阻害することによって治療効果を発揮する（Kronke他、PNAS 81: 5214，1984）。正確なメカニズムはまだ解明されていないが、繰り返し薬剤投与による骨髄移植（Hess他、J．Immunol ．128: 355，1983）および腎臓移植受容者（Azogui他、J．Immunol．131: 1205，1983）におけるIL-2合成の減少が生体内で証明されている。しかしながら、シクロスポリンは全身循環を通して非特異的に投与されるため、多数の毒性副作用、例えば血液毒性や腎毒性を有することが知られている（Kahan他、New Engl．J．Med ．321:1725，1989）。その上、シクロスポリンの投与により患者は一般感染しやすくなる。免疫系のリンパ系細胞に向けられた抗体もまた、1960年代に始まった抗拒絶療法に用いられている（Filo他、Transplantation 30:445，1980）。しかしながら、そのような抗リンパ球グロブリンは一般的に有用だが、可変的な効力のものであって、且つ多種多様な非リンパ系組織、例えば血小板やマクロファージに対して向けられた抗体を含有するという欠点も有していた。使用された最初の臨床抗体はOKT3としても知られる抗CD3であった。OKT3は成熟Ｔリンパ球に対してのみ向けられ、その正確な標的はＴ細胞の抗原−レセプター複合体を構成するCD3 クラスターである。OKT3モノクローナル抗体のF(ab)₂断片は、完全抗体の免疫抑制性質を保持しているが、Ｔ細胞活性化とリンホカイン放出を惹起させる力は低下している（Woodle他、Transplantation 52:354，1991）。高エピトープ特異性と高免疫抑制力を有するOKT3分子の生物工学変異体が製造されている。しかし、この抗体はあらゆる接近可能なＴ細胞を活性化するという欠点を有し、時には投与後１日または２日間は深刻な発熱性および循環系問題を引き起こすことがある（Carpen ter，Am．J.Kidney Dis．14:suppl 2:1，1989）。CD3以外の表面レセプターに向けられたモノクローナル抗体はいろいろな結果をもたらした（Heffron他、Trans plant Sci ．1:64，1991）。抗CD4モノクローナル抗体は幾つかの動物モデルにおいて長期持続性免疫学的無応答を誘導する傾向とそれらの低毒性の点からより魅力的と思われたが、CD4⁺Ｔ細胞の涸渇はAIDS症候群を引き起こす可能性がある（ Sablinski他、Transplantation 52:579，1991）。従って、それらの方法は適当な長期効果を提供せず、繰り返し投与しなければならない。従って、上述した方法の副作用または欠点を持たない、免疫応答を抑制する改善された方法が当業界において要望される。本発明はそれらの要望を満たし、更に他の関連する利点を提供する。発明の要約簡単に言えば、本発明は、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含むＴ細胞の免疫応答を抑制するためにＭＨＣ抗原提示を抑制し、それによって移植片拒絶を防止する方法を提供する。一観点では、移植片拒絶を抑制する方法であって、ＭＨＣ抗原提示を阻害することのできるタンパク質またはタンパク質の活性部分の発現を指令する組換えベクター構成物を用いて、提供動物から単離された組織細胞を形質転換せしめ、そして前記組織細胞に対する免疫応答が抑制されるように形質転換された組織細胞を受容動物中に移植することを含んで成る方法が提供される。本発明の一態様では、組換えベクター構成物はβ₂ −ミクログロブリンを結合することができるタンパク質、例えばＨ301の発現を指令する。別の態様では、組換えベクター構成物は、細胞内でＭＨＣクラスＩ重鎖分子を結合することができるタンパク質、例えばE3/19Kの発現を指令する。本発明の別の観点によれば、移植片拒絶を抑制する方法であって、アンチセンス情報を転写する組換えベクター構成物を用いて提供動物から単離された組織細胞を形質転換せしめ、ここで前記アンチセンス情報はＭＨＣ抗原提示を阻害することができ、そして前記組織細胞に対する免疫応答が抑制されるように前記形質転換された組織細胞を受容動物中に移植することを含んで成る方法が提供される。本発明の一態様では、前記組換えベクター構成物は、ＭＨＣクラスＩ重鎖転写物の保存領域、β₂−ミクログロブリン転写物またはPSF1輸送タンパク質転写物に結合するアンチセンス情報を転写する。本発明の更に別の態様によれば、移植片拒絶を抑制する方法であって、ＭＨＣ抗原提示を阻害することができるリボザイムを転写する組換えベクター構成物を用いて、提供動物から単離された組織細胞を形質転換せしめ、そして前記組織細胞に対する免疫応答が抑制されるように前記形質転換された組織細胞を受容動物中に移植することを含んで成る方法が提供される。本発明の一態様では、前記組換えベクター構成物は、ＭＨＣクラスＩ重鎖転写物の保存領域、β₂−ミクログロブリン転写物またはPSF1輸送タンパク質転写物を開裂させるリボザイムを転写する。本発明の別の態様によれば、ＭＨＣ抗原提示を阻害することができるタンパク質またはタンパク質の活性部分の発現およびＭＨＣ抗原提示を阻害することができるアンチセンスまたはリボザイムの発現を指令する多価組換えベクター構成物を用いて、提供動物から単離された組織細胞を形質転換せしめ、そして前記組織細胞に対する免疫応答が抑制されるように前記形質転換された組織細胞を受容動物中に移植することを含んで成る方法が提供される。関連する観点では、ＭＨＣ抗原提示を阻害することができるアンチセンス情報またはリボザイムの発現を指令する多価組み換えベクター構成物を用いて、提供動物から単離された組織細胞を形質転換せしめる。続いて、前記組織細胞に対する免疫応答が抑制されるように前記形質転換された組織細胞を受容動物中に移植する。本発明の別の関連する観点によれば、ＭＨＣ抗原提示を阻害することができる２以上のタンパク質もしくはタンパク質の活性部分、ＭＨＣ抗原提示を阻害することができる２以上のアンチセンス情報、またはＭＨＣ抗原提示を阻害することができる２以上のリボザイム、の発現を指令する多価組み換えベクター構成物を用いて、提供動物から単離された組織細胞を形質転換せしめる。続いて、前記組織細胞に対する免疫応答が抑制されるように前記形質転換された組織細胞を受容動物中に移植する。本発明の様々な態様によれば、多価組換えベクター構成物は、いずれかの組み合わせで次のものの少なくとも２つを発現または転写する：E3/19KおよびH301から成る群より選択されるタンパク質もしくはタンパク質の活性部分；ＭＨＣクラスＩ重鎖の保存領域、β₂−ミクログロブリンもしくはPSF1輸送タンパク質の転写物に結合するアンチセンス情報；またはＭＨＣクラスＩ重鎖の保存領域、β₂ −ミクログロブリンもしくはPSF1輸送タンパク質の転写物を開裂させるリボザイム。別の態様では、多価組換えウイルスベクター構成物は、２つのそのようなタンパク質もしくは該タンパク質の活性部分、２つのアンチセンス情報または２つのリボザイムを発現または転写する。好ましい態様では、組換えベクター構成物は組換えウイルスベクター構成物である。特に好ましい態様では、組換えベクター構成物は組換えレトロウイルスベクター構成物である。他の態様では、組換えウイルスベクター構成物は、トガウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、パルボウイルス科、ヘルペスウイルス科、パラミクソウイルス科およびコロナウイルス科ウイルスから成る群より選択された組換えウイルスにより担持される。本発明の範囲内では、適当な提供体組織細胞としては、骨髄細胞、膵臓島細胞、繊維芽細胞、角膜細胞および皮膚細胞が挙げられる。そのような組織細胞は、直接注射またはカテーテル注入を含む多数の方法を使って受容体動物中に移植することができる。本発明の更に別の関連する観点によれば、上述したような組換えベクター構成物または多価組換えベクター構成物により形質転換された組織細胞を含んで成る医薬組成物が提供される。本発明の様々な態様によれば、形質転換された組織細胞を、同じ型のＭＨＣを有するが組織細胞を取り出したものとは異なる動物種中に移植する方法が提供される。本発明の上記および他の観点は、下記の詳細な説明への参照により明らかになるであろう。発明の詳細な説明本発明を記述する前に、後で使用する幾つかの用語の定義を記載することがその理解に役立つであろう。「移植」とは、組織細胞の少なくとも一部分が移植後に生存可能であるような受容体動物中への組織細胞の挿入または移植のことを言う。移植組織は同様な機能または異なる機能の組織内に置くことができる。例えば、ある動物から組織細胞を取り出し、そして組換えベクター構成物により形質転換せしめた後、別の動物中に「移植する」ことができる。同一種の遺伝学的に類似しない動物間での組織移植は「同種移植」と呼ばれる。組織細胞を「形質転換せしめる」とは、形質転換現象前の組織細胞に比べて形質転換された組織細胞が追加のポリヌクレオチドを発現するような、当業者により認識される様々な手段のいずれかによる組織細胞の形質導入または移入のことを言う。「組換えベクター構成物」または「ベクター構成物」とは、着目の配列または遺伝子を発現することができる集成体のことを言う。タンパク質発現の面においては、ベクター構成物はプロモーター要素を含まなければならず、またポリアデニル化を指令するシグナルを含んでもよい。加えて、ベクター構成物は、好ましくは、転写される時、着目の配列または遺伝子に作用可能に連結されそして翻訳開始配列として働く配列を含む。好ましくは、ベクター構成物は、選択可能マーカー、例えばネオマイシン、チミジンキナーゼ、ヒグロマイシン、フレオマイシン、ヒスチジノールまたはジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）、並びに１または複数の制限部位および翻訳終結配列を含んで成る。更に、ベクター構成物をレトロウイルス粒子の作製に使うのであれば、既に存在するものが使われないことを前提として、ベクター構成物は使用するレトロウイルスに適切なレトロウイルスパッケージングシグナルとＬＴＲを含まなければならない。ベクター構成物は他のウイルスベクターと組み合わせて使用することもでき、または後述するように細胞もしくは組織中に物理的に挿入することもできる。上述したように、ベクター構成物はタンパク質もしくはタンパク質の活性部分、アンチセンスまたはリボザイムをコードする配列を含む。そのような配列は、移植された組織に対する細胞障害性Ｔリンパ球の免疫応答を抑制するためにＭＨＣ抗原提示を阻害するようにデザインされる。一般に、本明細書中に記載の組換えベクター構成物は、強力なプロモーターと該プロモーターの下流への着目のＤＮＡ配列の挿入のための制限部位とを有するプラスミドを選択することにより調製される。上述したように、ベクター構成物は、選択用の抗生物質耐性をコードする遺伝子並びに終結およびポリアデニル化シグナルを有することができる。追加の要素として、機能的なスプライス供与部位と受容部位を有するイントロンやエンハンサーを挙げることができる。多価組換えベクター構成物の作製は、２つのタンパク質を発現させようとする時に２つのプロモーターを必要とするかもしれない。何故なら、１つのプロモーターは第二の遺伝子の適切な遺伝子発現レベルを保証しないことがあるからである。特に、ベクター構成物がアンチセンス情報またはリボザイムを発現する場合には、第二のプロモーターは必要ないかもしれない。或る態様では、第二の遺伝子の遺伝子発現レベルを増大させるために、着目の第二の遺伝子と接続して内部リボソーム結合部位（IRBS）または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HS VTK）プロモーターが置かれる。IRBSに関して簡単に言えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質の上流非翻訳領域が２シストロン情報の内部の約束事を支持することが証明されている（Jacejak他、Nature 353:90，1991）。この配列は小さな約300塩基対の配列であり、この配列からシストロンが始まる多シストロン情報から複数の遺伝子を発現させるためにベクター中に容易に組み込むことができる。組換えベクター構成物がウイルスにより担持される時、そのような構成物は、プロモーター、スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルを含有するウイルスの配列を、当業界で公知の方法を使って、着目の所望の遺伝子を含有するプラスミド中に挿入することにより調製される。着目の遺伝子を含有する組換えウイルスベクターは、標的組織細胞中への形質導入後に高コピー数に複製することができる。組換えベクター構成物の調製後、ＭＨＣ抗原提示をダウンレギュレートするベクター形質転換細胞の能力を評価することが好ましいかもしれない。一般に、そのような評価はウエスタンブロット、FACS分析または当業者が認める他の方法により実施することができる。好ましい態様では、組換えベクター構成物はレトロウイルスにより担持される。レトロウイルスは一般的に非溶菌性である一本の正鎖ゲノムを有するＲＮＡウイルスである。感染するとレトロウイルスはそのＲＮＡをＤＮＡに逆翻訳し、宿主細胞ゲノム中に挿入されるプロウイルスを形成する。本発明に使われるレトロウイルス構成物の調製は、「組換えレトロウイルス」という発明の名称の出願（ 1990年9月21日に出願のU.S.S.N.07/586,603）の中に詳細に記載されている（この出願は参考として本明細書中に組み込まれる）。レトロウイルスゲノムは、概念上２部分に分けることができる。「トランス作用性」部分は、コア外皮タンパク質の合成のための群特異抗原（gag）遺伝子；逆転写酵素およびインテグラーゼ酵素の合成のためのpol遺伝子；並びにエンベロープ糖タンパク質の合成のためのエンベロープ（env）遺伝子を包含する、ウイルス構造タンパク質をコードする領域から成る。「シス作用性」部分は、最終的にウイルス粒子中にパッケージングされるゲノムの領域から成る。それらの領域は、パッケージングシグナル、プロモーターとポリアデニル化部位を有するＬＴＲ（long terminal repeats ）、および２つのＤＮＡ複製開始部位を含む。クローン化されたプロウイルスの内部または「トランス作用性」部分を着目の遺伝子により置き換えて「ベクター構成物」を作製する。ベクター構成物をウイルスパッケージングタンパク質が存在する細胞中に導入すると（U.S.S.N.07/800,921参照）、転写されたＲＮＡがウイルス粒子としてパッケージングされ、次いで芽体となって細胞から分離するだろう。それらの粒子は組織細胞に形質導入するのに使われ、ベクター構成物を細胞ゲノムに組み込ませるだろう。ベクター構成物は遺伝子産物を発現するけれども、それを担持するウイルスはウイルスゲノムのトランス作用性部分が無いために複製欠陥である。任意の複製応答能のある感染性レトロウイルスの存在を検出するために様々なアッセイを使うことができる。１つの好ましいアッセイは実施例９に記載の拡張Ｓ⁺Ｌ^-アッセイである。好ましいレトロウイルスベクターとしてはマウス白血病両向性もしくは異種向性ベクター、またはVsVgプソイド型ベクターが挙げられる（WO 92/14829；およびＰＴＯにより指定されるであろうU.S.S.N．08/ を参照のこと；これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。組換えベクター構成物は、様々なウイルス担体と共に開発および使用してもよい。例えば、ポリオウイルス（Evans他、Nature 339:385，1989およびSabin他、J．of Biol．Standardization 1:115，1973）（ATCC VR-58）；ライノウイルス（Arnold他、J．Cell Biochem． L401，1990）（ATCC VR-1110）；ポックスウイルス、例えばカナリア痘ウイルスまたはワクシニアウイルス（Fischer-Hoch 他、PNAS 86:317，1989；Flexner他、Ann．N.Y．Acad．Sci．569:86，1989；Fl exner他、Vaccine 8:17，1990；U.S．4,603,112およびU.S．4,769,330；WO 89 /01973）（ATCC VR-111；ATCC VR-2010）；SV40（Mulligan他、Nature 277: 10 8，1979）（ATCC VR-305），（Madzak他、J．Gen．Vir. 73:1533，1992）；インフルエンザウイルス（Luytjes他、Cell 59:1107，1989；McMicheal他、The New England Journ al of Medicine 309:13，1983およびYap他、Nature 273: 238，1978）（ATCC VR-797）；アデノウイルス（Berkner他、Biotechniques 6:616，1988およびR osenfeld他、Science 252: 431，1991）（ATCC VR-1）；パルボウイルス、例えばアデノ関連ウイルス（Samulski他、J．Vir．63:3822，1989およびMendelson 他、Virology 166: 154，1988）（ATCC VR-645）；単純ヘルペスウイルス（Kit 他、Adv，Exp．Med．Biol. 215:219，1989）（ATCC VR-977；ATCC VR-260）；ＨＩＶ（EPO 386,882,Buchschacher他、J．Vir．66: 2731，1992）；はしかウイルス（EPO 440,219）（ATCC VR-24）；シンドビスウイルス（Xiong他、Science 234:1188，1989）（ATCC VR-68）；およびコロナウイルス（Hamre他、Proc．S oc．Exp．Biol．Med. 121: 190，1966）（ATCC VR-740）が挙げられる。ＭＨＣ抗原提示を阻害することができるタンパク質、アンチセンス情報またはリボザイムを発現するように上記のウイルス担体を変更することが必要かもしれない。ベクター構成物が調製されたら、それを用いて様々な経路により単離された組織細胞を形質転換せしめることができる。より詳しくは、ＭＨＣ抗原提示を阻害することができるタンパク質もしくはタンパク質の活性部分、アンチセンス情報またはリボザイムをコードする遺伝子を含有する裸のＤＮＡまたは組換えウイルスベクター構成物を、物理的方法を使ってまたは上述したようなウイルスもしくはレトロウイルスの使用を通して、提供者から単離された組織細胞中に導入することができる。物理的および化学的取込み方法の生体外手法としては、リン酸カルシウム沈澱、無傷の標的細胞中へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション、および細胞膜を一時的に分極させて巨大分子の進入を可能にするために導電性溶液中に懸濁された細胞を強い電場にかけることによるエレクトロポレーションが挙げられる。他の手法としては、リガンドに結合させたＤＮＡの使用、不活性アデノウイルスに結合させたＤＮＡの使用（Cotton他、PNAS 89: 60 94，1990）、粒子に結合させたＤＮＡによる衝撃、組換えベクター構成物を封入するリポソーム、組換えウイルスベクター構成物を含有するＥ．コリから外側の細胞壁を取り除きそしてポリエチレングリコールを使って動物細胞に融合させるスフェロプラスト融合、およびウイルス形質導入（Cline他、Pharmac．Ther. 2 9 :69，1985；およびFriedmann他、Science 244:1275，1989）が挙げられる。あるいは、上述したように、ベクター構成物はウイルス、例えばワクシニア、シンドビスまたはコロナウイルスにより担持されてもよい。更に、レトロウイルスベクターを介してベクター構成物を投与する方法が「組換えレトロウイルス」という発明の名称の出願（U.S.S.N.07/586,603）の中に詳細に記載されている（この出願は参考として本明細書中に組み込まれる）。生体外環境において、形質転換された細胞を動物に移植し、そして実施例15に記載の通りに遺伝子発現についてモニタリングする。プロトコールは選択した組織細胞に依存して異なる。簡単に言えば、その発現がＭＨＣクラスＩ抗原提示を阻害する配列を有する組換えベクター構成物により組織細胞を形質転換させる。好ましくは10⁵〜10⁹個の組織細胞を形質転換させる。細胞を培養し、そして形質転換された細胞を抗生物質耐性により選択することができる。細胞をウエスタンブロットとFACS分析、または他の手段により、遺伝子発現についてアッセイする。例えば、下記に詳細に記載するように、形質転換された骨髄細胞を２〜３×10⁷ 個の細胞の静脈内投与により動物中に移植する（WO 93/00051参照）。形質転換させることができる細胞としては、繊維芽細胞、骨髄細胞、内皮細胞、角質細胞、肝細胞および甲状腺濾胞細胞が挙げられるが、それらに限定されない。形質転換された細胞は、筋肉内、皮内、皮下、静脈内、または体腔中への直接カテーテル注入により、患者に直接投与することができる。形質導入された骨髄細胞の生体内遺伝子発現は、ヘマトクリットの関数としての造血およびリンパ球産生をモニタリングすることにより検出される。単離された脾臓島細胞も、上述したように形質転換せしめることができることは当業者に明らかであろう。次いで、そのような形質転換された細胞を、胃−大網動脈を通した注射により受容体に移植することができる。血中グルコース濃度をモニタリングすることにより、インスリンの生体内遺伝子発現が観察される。上述したように、本発明は、宿主の免疫応答を抑制するためにＭＨＣ抗原提示を阻害するのに適当な方法および組成物を提供する。簡単に言えば、CD8、細胞間接着分子−１（ICAM-1）、ICAM-2、ICAM-3、白血球機能抗原−１（LFA-1）（A ltmann他、Nature 338:521，1989）、B7/BB1分子（Freeman他、J．Immunol．14 3: 2714，1989）、LFA-3（Singer，Science 255:1671，1992；Rao，Crit.Rev． Immunol ．10:495，1991）または他の細胞接着分子のような補助分子と共に自己ＭＨＣ分子の面でのプロセシングされたペプチドの表示によりＣＴＬが特異的に活性化される。ＭＨＣクラスＩ分子に関連した抗原性ペプチド提示はＣＴＬ活性化をもたらす。ＭＨＣ抗原提示を阻害すると思われる生成物を発現することができる特異配列の導入および適当な組込みは、CD8⁺ CTLのようなＴ細胞の活性化を阻止し、従って移植片拒絶を抑制する。実施例13中により詳細に記載される通り、この応答を検出するのに標準ＣＴＬアッセイが使われる。抗原提示経路の構成成分は、45 Kd ＭＨＣクラスＩ重鎖、β₂−ミクログロブリン、プロテアーゼのようなプロセシング酵素、補助分子、チャペロン、およびPSF1のような輸送タンパク質を包含する。本発明の一態様では、ＭＨＣクラスＩ抗原提示を阻害することができるタンパク質またはタンパク質の活性部分の発現を指令するベクター構成物が提供される。本発明では、タンパク質の「活性部分」は、生物学的活性のために保持されなければならないタンパク質の断片である。そのような断片または活性領域は、タンパク質配列からヌクレオチド配列を系統的に除去し、得られた組換えベクター構成物を用いて標的細胞を形質転換せしめ、そしてFACS分析または他の免疫学的アッセイ、例えばＣＴＬアッセイを使って、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ抗原提示を測定することにより、容易に同定することができる。それらの断片は、タンパク質全体をコードする配列のサイズがウイルス担体の収容力を越える時に特に有用である。あるいは、ＭＨＣ抗原提示阻害タンパク質の活性領域を酵素消化し、そして活性部分を生化学的方法により精製することができる。例えば、該タンパク質の活性部分をブロックするモノクローナル抗体を使って、開裂されたタンパク質の活性部分を単離・精製することができる（Harlow他、Antibodies：A La boratory Manual ，Cold Spring Harbor，1988）。一態様では、組換えベクター構成物は、新しく合成されたＭＨＣクラスＩ分子に細胞内で結合するタンパク質またはタンパク質部分の発現を指令する。この結合は、小胞体からのＭＨＣクラスＩ分子の移動を防ぎ、末端のグリコシル化の阻害をもたらす。これは細胞表面へのそれらの分子の輸送を阻止し、且つＣＴＬによる細胞認識と溶解を防ぐ。例えば、形質転換された細胞の表面へのＭＨＣクラスＩ分子の輸送を抑制するのにＥ３遺伝子の生産物の１つを使うことができる。より詳しくは、Ｅ３は、アデノウイルス２ゲノムのＥ３領域から転写される19 k Dの細胞膜貫通糖タンパク質であるE3/19Kをコードする。本発明の範囲内では、発現されるとE3/19Kタンパク質を生産するE3/19K配列を含有する組換えベクター構成物により組織細胞を形質転換せしめる。E3/19Kタンパク質はＭＨＣクラスＩ表面分子の表面発現を阻害し、そして該ベクター構成物により形質転換された細胞は免疫応答を逃れる。この点に関して代表的な組換えベクター構成物の作製は実施例２に与えられる。結果として、移植片拒絶の危険性が削減された供与細胞を移植することができ、且つ移植患者に最小限の免疫抑制摂生のみを要求するだろう。これは、合併症がより少ない容認できる提供体−受容体キメラ状態の存在を可能にする。本発明の別の観点では、組換えベクター構成物は、β₂−ミクログロブリンを結合することができるタンパク質またはタンパク質の活性部分の発現を指令する。抗原提示にむけた細胞表面へのＭＨＣクラスＩ分子の輸送は、β₂−ミクログロブリンとの会合を必要とする。よって、β₂−ミクログロブリンを結合しそしてそれとＭＨＣクラスＩ分子との会合を阻害するタンパク質は、ＭＨＣクラスＩ抗原提示を間接的に阻害する。適当なタンパク質としてはH301遺伝子産物が挙げられる。簡単には、ヒトシトメガロウイルス（ＣＭＶ）から得られるH301遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ分子の重鎖上のβ₂−ミクログロブリン結合部位との配列相同性を有する糖タンパク質をコードする（Browne他、Nature 347: 770，1990）。H301はβ₂−ミクログロブリンを結合し、それによってＭＨＣクラスＩ分子の成熟を防止し、そして形質転換された細胞を細胞障害性Ｔ細胞による認識不可能にし、かくしてＭＨＣクラスＩ制限免疫監視を回避する。ＭＨＣクラスＩ抗原提示を阻害またはダウンレギュレートする作用がある上述しなかった他のタンパク質を、本発明の範囲内で同定しそして使用してもよい。そのようなタンパク質、特に哺乳類の病原体から誘導されたもの（ひいては、それの活性部分）を同定するために、ＭＨＣクラスＩ抗原提示を阻害することができると思われるタンパク質またはそれの活性部分を発現する組換えベクター構成物を用いて、テスター細胞系、例えばＢＣを形質転換せしめる。候補タンパク質をコードする配列を有するまたは有さないテスター細胞系を、ＣＴＬアッセイにおいて刺激物質および／または標的と比較する。形質転換されたテスター細胞に該当する細胞溶解の減少は、候補タンパク質がＭＨＣ提示を阻害できることを示す。ＭＨＣクラスＩ表面発現のダウンレギュレーションを測定する別の方法はFACS 分析による方法である。より詳しくは、候補タンパク質をコードする組換えベクター構成物により細胞系を形質転換せしめる。薬剤選択および増殖後、ＭＨＣクラスＩ発現について細胞をFACSにより分析し、未形質転換細胞のものと比較する。ＭＨＣクラスＩの細胞表面発現の減少は、候補タンパク質がＭＨＣ提示を阻害することができることを示す（例えば、実施例12を参照のこと）。本発明の別の観点では、ＭＨＣクラスＩ抗原提示を阻害することができるアンチセンス情報を転写する組換えベクター構成物を用いて組織細胞を形質転換せしめることにより移植片拒絶を抑制する方法が提供される。簡単に言えば、タンパク質コード配列または「センス」配列に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドは「アンチセンス」と呼ばれる。アンチセンスＲＮＡ配列は、相補的なｍＲＮＡ配列にハイブリダイズして翻訳を停止させることにより遺伝子発現の調節物質として働く（Mizuno他、PNAS 81:1966，1984；Heywood他、Nuclei c Acids Res. 14: 6771，1986）。標的転写物の全配列またはそれのいずれかの部分を含んで成るアンチセンス分子を合成し（Ferretti他、PNAS 83:599，1986）、ベクター構成物中に置き、そして細胞中に効率的に導入して遺伝子発現を抑制することができる（Izant他、Cell 3 6 : 1007，1984）。加えて、逆配向でクローニングされたＤＮＡからのアンチセンスＲＮＡ（asＲＮＡ）の合成は経時安定性を提供し、なお且つ構成的asＲＮＡ発現は正常な細胞機能を妨害しない。本発明の一態様では、組換えレトロウイルスベクター構成物はＭＨＣクラスＩ転写物の保存領域に結合し、それによって細胞表面発現とＭＨＣクラスＩ抗原提示を阻害することができる、アンチセンス情報を転写する。そのような保存領域は、ＤＮＡ配列データバンク（例えばGenbank）中の利用可能な別のクラスのＭＨＣ遺伝子（例えば、ＨＬＡＡ，ＢおよびＣ）を表す配列のコンピューター補助比較分析を通して同定することができる。次いで、ヌクレオチド配列の相同性についてのコンピューター補助整列を通して、保存配列を同定する。保存領域は、ＭＨＣクラスＩ遺伝型間で100塩基対あたり50％未満のミスマッチ（食い違い）、好ましくは20％未満のミスマッチを有する配列である。本発明の別の態様では、組換えベクター構成物はβ₂−ミクログロブリン転写物への結合を招くアンチセンス情報を転写する。この結合はβ₂−ミクログロブリンタンパク質の翻訳を阻害し、それによって細胞表面発現に必要なＭＨＣクラスＩ分子複合体の正しい集成を阻害する。好ましい態様では、β₂−ミクログロブリンのヌクレオチド配列を逆の配向においてベクター構成物中にクローニングする。正しいアンチセンス配向は制限酵素分析により決定することができる。本発明の更に別の態様では、組換えベクター構成物は、ペプチド輸送タンパク質であるPSF1転写物の結合を招くアンチセンス情報を転写する。このタンパク質はＭＨＣクラスＩ分子の効率的集成に必要であるため、そのようなアンチセンスは、ＭＨＣクラスＩ分子複合体との結合前にプロセシングされた抗原性ペプチド断片が小胞体（ＥＲ）へ輸送されるのを阻止する。好ましい態様では、アンチセンスPSF1のヌクレオチド配列を調製し、逆の配向においてベクター構成物中に挿入し、そして制限酵素分析により配列決定する。上述したように、抗原提示に関与する他のタンパク質の配列を同定し、ＭＨＣ抗原提示を阻害するアンチセンスＲＮＡ情報を転写することができる組換えベクター構成物をデザインするのに使ってもよい。より詳しくは、該タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を調べ、そして同定された配列を使って適当なアンチセンス情報を合成する。標的情報の開始配列の上流または接近した部分に相補的な配列を使うことが好ましい。これはアンチセンス配列がmRNAに結合して該タンパク質の有意部分の翻訳を防ぐことを可能にする。そのような分子の例はICAM-1，ICAM-2，ICAM-3，LFA-1，LFA-2，LFA-3およびB7/BB1である。ＭＨＣクラスＩ発現または抗原提示のダウンレギュレーションは、それぞれ実施例14と 15に記載されたようなFACS分析またはＣＴＬアッセイにより、あるいはＭＨＣクラスＩ提示を阻害することができるタンパク質について上述したような別の手段により、分析することができる。本発明の別の観点では、ＭＨＣ抗原提示に関与する成分の酵素的開裂を招くリボザイムを転写する組換えベクターを用いて、選択された動物細胞を形質転換せしめることにより、免疫応答を抑制する方法が提供される。簡単に言えば、リボザイムは、別のＲＮＡ分子を消化するのに使われる酵素的開裂活性を有するＲＮＡ分子である。それらは、所望の標的分子中の潜在的開裂部位に関する該酵素の正確な配置を可能にする領域により隣接された高度保存配列特異的開裂領域を有する短いＲＮＡ分子である。それらは、特定遺伝子の発現および活性化を阻害する際に非常に融通のきく手段を提供する（Haseloff他、Nature 334: 585，1988）。遺伝子の転写配列が既知であれば、注文のリボザイムを容易にデザインすることができる。詳しくは、まず特定の標的ＲＮＡ配列を選択し、そしてリボザイムコード配列の始めと終わりに相補的配列を取り付けることにより、リボザイムをデザインすることができる。このリボザイム産生遺伝子単位を次いで組換えベクター構成物中に挿入し、組織細胞を形質転換させるのに使うことができる。発現と同時に、相補的結合と開裂により標的遺伝子が中和され、永久的な不活性化を保証する。加えて、それらの酵素活性のため、リボザイムは複数の標的を破壊することができる。本発明の一態様では、抗原提示を抑制するために、特定のリボザイムを含有する組換えベクター構成物を用いてＭＨＣクラスＩ分子の保存領域の転写物を開裂させる。本発明の別の態様では、組換えベクター構成物はβ₂−ミクログロブリン転写物の酵素的開裂を招くリボザイムを転写する。詳しくは、β₂−ミクログロブリン情報の配列に相補的な隣接領域を有するリボザイムが該転写物を開裂し、それによってタンパク質翻訳とＭＨＣクラスＩ分子複合体の適切な集成を妨げる。これは細胞表面へのＭＨＣクラスＩ複合体の輸送を阻害し、それによって抗原提示を抑制する。本発明の更に別の観点では、組換えベクター構成物はPSF1転写物の酵素的開裂を招くリボザイムを転写し、それによってＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を抑制し且つ抗原提示を抑制する。詳しくは、PSF1情報の配列に相補的な隣接領域を有するようにデザインされたリボザイムは、該転写物を開裂させそしてＥＲへのペプチドの輸送を阻害し、それによってＭＨＣクラスＩ複合体の集成と抗原提示を抑制する。ＭＨＣ抗原提示に関与する他のタンパク質の配列（下記参照）を同定し、そしてＭＨＣ抗原提示を抑制するリボザイムを転写することができる組換えベクター構成物をデザインするのに用いることができることは、当業者に明白であろう。ＭＨＣクラスＩ発現または抗原提示のダウンレギュレーションは、それぞれFACS またはＣＴＬ分析により、あるいはＭＨＣクラスＩ提示を阻害することができるタンパク質について上述したような別の手段により、アッセイすることができる。本発明の別の観点では、多価組換えベクター構成物が提供される。簡単に言えば、多価組換えベクター構成物を用いて細胞を形質転換せしめることにより、自己免疫応答を抑制する効率を増加させることができる。発現時に、遺伝子産物が２つの異なる経路を経て単一成分を攻撃するかまたは同一もしくは異なる経路を経て２つの異なる成分を攻撃することにより、ＭＨＣ抗原提示の妨害の程度を増加させる。多価組換えベクター構成物の作製は２つのプロモーターを要求し得る。何故なら、１つのプロモーターでは第二の遺伝子の適当な遺伝子発現レベルを保証しない場合があるからである。着目の第二の遺伝子と接続して置かれた第二のプロモーター、例えば内部リボゾーム結合部位（IRBS）プロモーターまたは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）プロモーターは、第二の遺伝子の遺伝子発現レベルを増大させる。好ましい態様では、ベクター構成物は、任意の組合せにおいて次の成分の少なくとも２つを発現または転写する：(a)タンパク質 E3/19KもしくはH301または該タンパク質の活性部分；(b)ＭＨＣクラスＩ重鎖の保存領域、β₂−ミクログロブリンまたはPSF1輸送タンパク質の転写物に結合するアンチセンス情報；および(c)上記(b)に挙げたタンパク質の転写物を開裂させるリボザイム。加えて、２つの上述のタンパク質もしくはタンパク質の活性部分、２つのアンチセンス情報、または２つのリボザイムを発現する多価組換えベクター構成物が提供される。関連する態様では、多価組換えベクター構成物を作るのに多数の特定の組合せを使うことができる。例えば、多価組換えベクター構成物は、ＭＨＣクラスＩ重鎖の保存領域、β₂−ミクログロブリンまたはPSF1輸送タンパク質のアンチセンス情報またはリボザイム情報と組み合わせた、E3/19KまたはH301を発現する遺伝子から成ってもよい。本発明の別の態様では、担体または希釈剤と共に、上述の組換えベクター構成物のうちの１つまたはベクター構成物を担持している組換えウイルス、例えばレトロウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス、SV40、HIV、はしかウイルス、コロナウイルスまたはシンドビスウイルス、を含んで成る医薬組成物が提供される。該組成物は液体溶液として、または組織細胞を形質転換させる前に生体外で溶液中に懸濁される固形形態（例えば凍結乾燥された形）としてのいずれかで調製することができる。加えて、本明細書中に記載のアプローチは、前に植えつけられた組織の拒絶を食い止めるためまたは改善するために生体内で使用することができる。この点において、注射用にまたは担体に適する別の手段のために医薬上許容される担体または希釈剤を使って組成物を調製してもよい。一般に、ベクター構成物を担持している組換えウイルスは、製剤前に0.25％〜25％、好ましくは約５％〜20％の範囲の濃度に精製される。次いで、組成物の調製後、組換えベクターは用量あたり約10ng〜約１μgの材料を占めるだろう。これは共に精製される混入物として存在する材料の量の約10倍を有する。好ましくは、該組成物は後述のように製剤される水性溶液0.1〜1.0ml中に調製されるだろう。医薬上許容される担体または希釈剤は、使用する用量および濃度において受容体に無毒であるものである。注射液用の担体または希釈剤の代表的例としては、水；好ましくは生理的pHに緩衝されており、且つマンニトール、ラクトース、トレハロース、デキストロース、グリセロールおよびエタノールのうちの１または複数、並びにポリペプチドまたはタンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する等張溶液（例えばリン酸塩緩衝化塩溶液またはトリス緩衝化塩溶液）が挙げられる。１つの適当な組成物は、10mg／mlのマンニトール、１mg／ml のＨＳＡ、20mM Tris pH=7.2および150mM NaCl中にベクター構成物を担持している組換えウイルスを含んで成る。この場合、ベクター構成物を担持している組換えウイルスは約10ng〜１μgの材料を占めるので、それは全高分子量材料の１％未満であり、全材料（水を含む）の１／100,000未満であろう。この組成物は、一般に−70℃で少なくとも６か月間安定である。実質的等価量の多価組換えベクター構成物を調製できることは明らかであろう。これに関しては、ベクター構成物は用量あたり100ng〜100μgの材料を占め、これは共に精製される混入物として存在する材料の量の約10倍を有するだろう。ベクター構成物を担持している組換えウイルスについては、通常使われる個体量は10⁶〜10¹⁰c.f.u.（例えば、HT1 080細胞上で力価測定したネオマイシン耐性のコロニー形成単位）である。それらの組成物は、３または４回投与の間（少なくとも初期）は１〜４週間おきに投与される。６〜12か月後に１回または２回投与として、そしてその後は年１回ずつ、ブースター注射を与えてもよい。次の実施例は例示のつもりで与えられ、限定のつもりではない。（移植−移植片拒絶）実施例実施例１マウスレトロウイルスプロベクターＤＮＡの調製Ａ．レトロウイルス骨格KT-3Bの調製 pUC31プラスミド中のＮ２ベクター（Armentano他、J．Vir．61:1647，1987；E glita他、Science 230:1395，1985）からの、gag配列を含むモロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）5′LTR EcoRＩ−EcoRＩ断片を、プラスミドSK⁺（Stratag ene，San Diego，CA）中に連結させる。得られた構成物をN2R5と命名する。N2R5 構成物を部位特異的試験管内突然変異誘発により突然変異させ、ATGコドンをATT に変更してgag発現を抑制する。この変異断片は長さが200塩基対（bp）であり、 PstＩ制限部位により隣接されている。PstＩ−PstＩ変異断片をSK⁺プラスミドから精製し、そしてプラスミドpUC31中のN2 MoMLV 5′LTR のPstＩ部位中に挿入して未変異型200bp断片を置き換える。プラスミドpUC31はpUC19（Stratagene，San Diego，CA）に由来し、該プラスミド中のポリリンカーのEcoRＩ部位とSacＩ部位の間に追加の制限部位XhoＩ，BglII，BssHIIおよびNcoＩが挿入される。この構成物をpUC31/N2R5g^Mと命名する。Ｎ２からの1.0キロ塩基(Kb)のMoMLV 3′LTR EcoRＩ−EcoRＩ断片をプラスミド SK⁺中にクローニングし、N2R3^-と命名された構成物を得た。この構成物から1.0K b ClaＩ−HindIII断片を精製する。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を指令する SV40初期プロモーターを含んで成る、pAFVXMレトロウイルスベクター（Kriegler 他、Cell 38:483，1984；St．Louis他、PNAS 85:3150，1988）からのClaＩ−C laＩ優性選択マーカー遺伝子断片を、プラスミドSK⁺中にクローニングする。このSK⁺プラスミドから1.3Kb ClaＩ−BstBＩ遺伝子断片を精製する。この断片と、 3′LTR ClaＩ−HindIII断片およびpUC31/N2R5g^M中の5′LTRを使ってKT-3B骨格を作製する。別の選択可能マーカーであるフレオマイシン耐性（Mulsant他、Som．Cell and Mol．Gen ．14:243，1988；Cayla，Cedex，FRから入手可能）を使って、既にネオマイシン耐性である細胞に遺伝子を形質転換させるのに使われるレトロウイルス骨格KT-3Cを作製してもよい。プラスミドpUT507（Mulsant他、Som．Cell and Mol．Gen .14:243，1988；Cayla，Cedex，FRから入手可能）をNdeＩで消化し、クレノウポリメラーゼＩにより末端を平滑にする。次いで該試料を更にHpaＩで消化し、断片の混合物にClaＩリンカーを連結させ、そして更にClaＩで消化する。過剰のClaＩリンカーをClaＩでの消化により除去し、RSV LTRとフレオマイシン耐性遺伝子を含む1.2Kb ClaＩ断片を、アガロースゲル電気泳動とGene Clean（B io101，San Diego，CA）を使った精製により単離する。この断片を1.3Kb ClaＩ −BstBＩネオマイシン耐性断片の代わりに使用して骨格KT-3Cを与える。発現ベクターは３部分連結により次のようにして作製する。着目の遺伝子を含有するXhoＩ−ClaＩ断片と1.0Kb MoMLV 3′LTR ClaＩ−HindIII断片を、pUC31/N 2R5g^MプラスミドのXhoＩ−HindIII部位に挿入する。次いでこのプラスミドのCla Ｉ部位に1.3Kb ClaＩ−BstBＩ neo遺伝子または1.2Kb ClaＩフレオマイシン断片をセンス配向において挿入する。実施例２Ａ．KT-3B中へのE3/19K遺伝子のクローニングｉ．アデノウイルスの単離と精製アデノウイルスの単離と精製はGreen他、Methods in Enzymology 58:425，19 79により記載されている。詳しくは、100〜500プラーク形成単位(pfu)／mlのアデノウイルス２型（Ad2）ウイルス粒子（ATCC VR-846）を５ｌのHela細胞（3-6 ×10⁵細胞／ml）に感染させる。37℃で30〜40時間インキュベーション後、細胞を氷上に置き、４℃にて230ｇで20分間の遠心により収集し、Tris-HCl緩衝液(pH 8.1)中に再懸濁する。ペレットを超音波処理により機械的に破壊し、トリクロロトリフルオロエタン中でホモジナイズした後、1,000gで10分間遠心する。上部水性層を取り、10mlのCsCl（1.43g／cm³）の上に重層させ、そしてSW27ローター中で20,000rpmにて１時間遠心する。乳白色のウイルスバンドを取り出し、CsClで1 .34g／cm³に調整し、Ti 50ローター中で30,000rpmにて16〜20時間更に遠心する。勾配の中央に見えるウイルスバンドを取り、アデノウイルスＤＮＡの精製まで４℃で保存する。 ii．アデノウイルスＤＮＡの単離と精製アデノウイルスバンドをプロテアーゼと共に37℃で１時間インキュベートしてタンパク質を消化する。４℃にて7,800gで10分間遠心した後、５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で室温で30分間粒子を可溶化し、次いで同容量のフェノールで抽出する。上部水性層を取り、フェノールで再抽出し、エーテルで３回抽出し、そしてTris緩衝液中で24時間透析する。ウイルスAd2 DNAをエタノール沈澱させ、エタノール洗浄し、そしてTris-EDTA緩衝液，pH8.1中に再懸濁する。1. 0ｌの細胞中で生産されたウイルスから約0.5mgのウイルスAd2 DNAが単離される。 iii．E3/19K遺伝子の単離ウイルスAd2 DNAをEcoRＩ(New England Biolabs，Beverly，MA)で消化し、１％アガロースゲル上での電気泳動により分離する。E3/19K遺伝子（Herisse他、N ucleic Acids Research 8: 2173，1980；Cladaras他、Virology 140:28，1985 ）を含有する、Ad2配位領域75.9〜83.4中に置かれた2.7Kb Ad2 EcoRＩ生成断片を、電気泳動により溶出させ、フェノール抽出し、エタノール沈澱させ、そして Tris-EDTA緩衝液（pH8.1）中に溶かす。 iv．KT-3B中へのE3/19K遺伝子のクローニング E3/19K遺伝子をPUC1813のEcoRＩ部位の中にクローニングする。PUC1813は、本質的にはKay他、Nucleic Acids Research 15:2778，1987とGray他、PNAS 80:5 842，1983により記載された通りに調製する。EcoRＩ消化によりE3/19Kを回収し、そして単離された断片を、ホスファターゼ処理したpSP73プラスミド(Promega ，Madison，WI)のEcoRＩ部位にクローニングする。この構成物をSP-E3/19Kと命名する。適当な制限酵素消化とＤＮＡ配列決定により、SP-E3/19K cDNAの配向を確認する。センス配向では、前記cDNAの５′末端がpSP73ポリリンカーのXhoＩ部位に隣接し、そして３′末端がClaＩ部位に隣接する。センス配向またはアンチセンス配向のいずれかにおいてE3/19K cDNAを含有するXhoＩ−ClaＩ断片をSP-E3 /19K構成物から回収し、そしてKT-3Bレトロウイルス骨格のXhoＩ−ClaＩ部位の中にクローニングする。この構成物をKT-3B/E3/19Kと命名する。Ｂ．KT-3B中へのＰＣＲ増幅されたE3/19K遺伝子のクローニングｉ．E3/19K遺伝子のＰＣＲ増幅 E3/19Kタンパク質をそれ自身小胞体（ＥＲ）中に埋め込ませるような、アミノ末端シグナル配列に次いで管内領域とカルボキシ末端の細胞質性末尾を含んで成るAd2 DNA E3/19K遺伝子を、ウイルスヌクレオチド28 ,812と29,288の間に置く。下記に示すようなプライマー対を使ったＰＣＲ増幅により、ウイルスゲノムＤＮＡからのAd2 E3/19K遺伝子の単離を行う：正プライマーはAd2ヌクレオチド配列28,812〜28,835に該当する：（配列番号）５′→３′：TATATCTCCAGATGAGGTACATGATTTTAGGCTTG 逆プライマーはAd2ヌクレオチド配列29,241〜29,213に該当する：（配列番号）５′→３′：TATATATCGATTCAAGGCATTTTCTTTTCATCAATAAAAC Ad2相補的配列に加えて、両プライマーは、ＰＣＴアンプリコン生成物の効率的酵素消化のためにそれらの５′末端に５ヌクレオチドの「緩衝配列」を含有する。正プライマー中のこの配列の後にはXhoＩ認識部位があり、逆プライマー中ではClaＩ認識部位がある。よって、５′→３′方向において、E3/19K遺伝子はX hoＩ認識部位とClaＩ認識部位により隣接されている。Ad2 DNAからのE3/19K遺伝子の増幅は、次のＰＣＲサイクルプロトコールを使って達成される： ii．ＰＣＲ増幅されたE3/19K遺伝子のKT-3B中への連結 SK-E3/19K構成物から長さ約780bpのE3/19K遺伝子を取り出し、実施例２Ｂｉに記載したような１％アガロース／ＴＢＥゲル電気泳動により単離する。次いでXhoＩ−ClaＩ E3/19K断片をKT-3Bレトロウイルス骨格中に連結させる。この構成物をKT-3B/E3/19Kと命名する。KT-3B/E3/19K構成物によりDH5α菌株を形質転換せしめることにより該構成物を増幅させる。詳しくは、１〜100ngの連結反応混合物ＤＮＡを用いて細菌を形質転換せしめる。形質転換された細菌細胞をアンピシリン含有ＬＢプレート上に塗抹する。該プレートを 37℃で一晩インキュベートし、細菌コロニーを選択し、それらからＤＮＡを調製する。該ＤＮＡをXhoＩとClaＩで消化する。E3/19K遺伝子を含むプラスミドに予想されるエンドヌクレアーゼ制限開裂断片サイズは、780bpと1300bpである。Ｃ．KT-3B中への合成E3/19K遺伝子のクローニングｉ．E3/19K遺伝子ＤＮＡの合成合成ＤＮＡの化学合成は以前に記載されている（Caruthers他、Methods in En zymology 211: 3，1992）。E3/19K遺伝子をコードする配列は、５′および３ ′境界としてＰＣＲプライマーを使いそして該末端上に同じXhoＩとClaＩを維持して、ホスホトリエステル法によりApplied Biosystems Inc．のＤＮＡ合成装置 392型（Foster City，CA）上で合成する。長さ約14〜40ヌクレオチドの短鎖オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、一緒に連結して一本鎖ＤＮＡ分子を形成させる（Ferretti他、PNAS 83:599，1986）。 ii．E3/19K遺伝子ＤＮＡの配列決定該ＤＮＡの増幅のためにバクテリオファージベクターM13mp18とM13mp19（GIBC P，Gaithersburg，MD）中に断片をクローニングする。鋳型として一本鎖M13mp18 およびM13mp19組換えファージＤＮＡを使ってそしてプライマーとして特定の合成オリゴヌクレオチドを使って、ジデオキシ法により各断片のヌクレオチド配列を決定する。これは該遺伝子の同一性および前記構造的完全性を確証する。 iii．KT-3B中への合成E3/19K遺伝子の連結実施例２Ｂiiに記載した通りにE3/19K遺伝子をKT-3BまたはKT-3Cベクター中に連結せしめる。実施例３ KT-3C中へのＭＨＣの保存領域のアンチセンス配列のクローニングＡ．KT3CneoαMHCの作製ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子CW3（Zemmour他、Tissue Antigens 39:249，1992 ）のcDNAクローンを、異なるヒトＭＨＣハプロタイプ間で保存されている特定配列の増幅のためのＰＣＲ反応における鋳型として使用し、KT-3B骨格ベクターのネオマイシン耐性遺伝子の非翻訳領域中に挿入する。次のプライマー対を使って、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子CW3 cDNAのヌクレオチド配列147〜1,075を増幅させる：正プライマーはMHC CW3 cDNAヌクレオチド配列147〜166に該当する：（配列番号）。５′→３′：TATATGTCGACGGGCTACGTGGACGACACGC 逆プライマーはMHC CW3 cDNAヌクレオチド配列1,075〜1,056に該当する：（配列番号）５′→３′：TATATGTCGACCATCAGAGCCCTGGGCACTG ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子CW3相補的配列に加えて、両プライマーは、ＰＣＴアンプリコン生成物の効率的酵素消化のためにそれらの５′末端に５ヌクレオチドの「緩衝配列」を含有する。両プライマー中、この緩衝配列の後にはHincIII認識配列がある。それらのプライマーを使ったＭＨＣアンプリコンの生成は、実施例２Ｂｉに記載されたＰＣＲプロトコールを使って達成される。Ventポリメラーゼ（New England Biolabs，Beverly， MA）を使うことによりこのプロトコールを変更し、更に3.5分の代わりに１分の伸長時間を含むように変更する。Ventポリメラーゼは平滑末端を有するアンプリコンを生成する。あるいは、正および逆プライマーがMHC CW3相補的配列のみを含んでもよい。 MHC CW3 cDNAの950bpアンプリコン消化生成物をGene Clean（Bio101，San Die go，CA）を使って精製し、そしてHincIIで消化する。938bp断片を１％アガロース／ＴＢＥゲル電気泳動により単離し、Gene Cleanを使って精製する。 MHC CW3 cDNA 938bp断片を、アンチセンス配向においてネオマイシン耐性遺伝子の３′非翻訳領域に挿入する。詳しくは、pBluescript II SK⁺（pSK⁺）プラスミド(Stratagene，San Diego，CA）のヌクレオチド配列番号676のところのHincI I認識配列を、HincIIとKpnＩでの消化により除去する。KpnＩ３′末端をT4 DNA ポリメラーゼにより平滑末端にし、そして平滑末端を連結する。このプラスミドをpSKdlHIIと命名する。実施例１Ａに記載した通りに、pAFVXMレトロウイルスベクターからの1.3kb ClaＩ−ClaＩ優性選択マーカー遺伝子断片をpSKdlHIIのCla Ｉ部位にアンチセンス配向において挿入する。このプラスミドをpSKdlHII/SVneo と命名する。MHC CW3 cDNA 938bp断片を、ネオマイシン耐性遺伝子の３′非翻訳領域中に置かれたpSKdlHII/SVneoのHincII部位の中にアンチセンス配向において挿入する。MHC CW3 cDNA 938bp断片がアンチセンス配向でネオマイシン耐性遺伝子中に存在することを、制限エンドヌクレアーゼ消化と配列分析により確認する。このクローンを pSKdlHII/SVneo/αMHCと命名する。 ClaＩ 2.2Kb SVneoαMHC断片とN2R3^-からの1.0Kb MoMLV ３′LTR ClaＩ−Hind III断片を、実施例１に記載のpUC31/N2R5g^MプラスミドのClaＩ部位とHindIII部位の間に挿入するという３元連結により、KT3B/SVneo/αMHCの作製を行う。Ｂ．KT3C/SVneo/VARNA/αMHCの作製高レベルMHC CW3 アンチセンスＲＮＡの発現は、この配列をAd2 VARNA1プロモーターの下流に挿入することにより達成される。Ad2 VARNA1プロモーター−ＭＨＣアンチセンスcDNAをＲＮＡポリメラーゼIII（polIII）発現カセットとして組立て、次いでKT-3BまたはKT-3C骨格中に挿入する。このpolIII発現カセット中では、Ad2 VARNA1プロモーターの後にアンチセンスαMHC cDNAがあり、その後にpo lIII共通終結シグナルがある。二重鎖−30／＋70 Ad2 VARNA1プロモーターは化学合成され（Railey他、Mol． Cell Biol ．8:1147，1988）、これは５′および３′末端のところにそれぞれXho Ｉ部位とBglII部位を含む。 VARNA1プロモーター、正鎖：（配列番号）５′→３′：TCGAGTCTAGACCGTGCAAAAGGAGAGCCTGTAAGCGGGCACTCTTCC GTGGTCTGGTGGATAAATTCGCAAGGGTATCATGGCGGACGACCGGGG TTCGAACCCCGGA VARNA1プロモーター、逆鎖：（配列番号）５′→３′：GATCTCCGGGGTTCGAACCCCGGTCGTCCGCCATGATACCCTTGCGAA TTTATCCACCAGACCACGGAAGAGTGCCCGCTTACAGGCTCTCCTTTT GCACGGTCTAGAC XhoＩとBglII粘着末端を有する二本鎖VARNA1プロモーターを作製するために、等量の一本鎖を10mM MgCl₂中で一緒に混合し、95℃で５分間加熱し、次いで室温にゆっくり冷やして両鎖をアニールさせる。プラスミドpSKdlHII/SVneo/αMHCからのヌクレオチド配列633〜854のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子CW3断片を、次のプライマー対を使って増幅させる：正プライマーはヌクレオチド配列653〜680に該当する：５′→３′：TATATCCTAGGTCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTG 逆プライマーはヌクレオチド配列854〜827に該当する：５′→３′：TATATAGATCTACATGGCACGTGTATCTCTGCTCTTCTC ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子CW3相補的配列に加えて、両プライマーは、ＰＣＴアンプリコン生成物の効率的酵素消化のためにそれらの５′末端に５ヌクレオチドの「緩衝配列」を含有する。正プライマー中ではこの緩衝配列の後にはAvrII 認識配列があり、逆プライマー中ではBglII認識配列があり、polIIII発現カセット中のAd2 VARNA1プロモーターに関してアンチセンス配向での挿入を可能にする。上述のプライマーを使ったＭＨＣアンプリコンの生成は、3.5分の代わりに0.5 分の伸長時間を含むように変更された実施例２Ｂｉに記載のＰＣＲプロトコールを使って達成される。 MHC CW3 cDNA 223bpアンプリコン生成物をGene Clean(Bio101，San Diego，CA )を使って精製し、次いでAvrIIとBglIIで消化し、そして２％NuSeive−１％アガロース／ＴＢＥゲル電気泳動により単離する。次いでゲルから211bpバンドを切り出し、Gene Cleanを使って該ＤＮＡを精製する。二本鎖polIII共通終結配列は化学的に合成され（Geiduscheck他、Annu．Rev． Biochem ．57:873，1988）、これは５′末端と３′末端にそれぞれAvrII部位とClaＩ部位を含む。 polIII終結配列、正プライマー：（配列番号）５′→３′：CTAGGGCGCTTTTTGCGCAT polIII終結配列、逆プライマー：（配列番号）５′→３′：CGATGCGCAAAAAGCGCC AvrIIとClaＩ粘着末端を有する二本鎖polIII転写終結配列を形成させるために、等量の一本鎖を10mM MgCl₂中で一緒に混合し、95℃で５分間加熱し、次いで室温にゆっくり冷やして両鎖をアニールさせる。 XhoＩ−BglII Ad2 VARNA1プロモーター断片、BglII−AvrIIαMHC CW3断片およびAvrII−ClaＩ転写終結断片を、pSKII⁺のXhoＩ部位とClaＩ部位の間にクローニングするという四元連結により、アンチセンスαＭＨＣクラスＩ対立遺伝子CW3 のためのpolIII発現カセットを組み立てる。この構成物をpSK/VARNA/αMHCと命名する。 KT3B/SVneo/VARNA/αMHCの作製は２段階連結により達成される。第一段階は、 XhoＩ−ClaＩ VARNA/αMHC断片とN2R3^-からの1.0Kb MoMLV 3′LTR ClaＩ−HindI II断片を、実施例１に記載のpUC31/N2R5g^MプラスミドのXhoＩ部位とHindIII部位の間に挿入するという三元連結である。この構成物をKT3B/VARNA/αMHCと命名する。第二連結段階において、1.3Kb ClaＩ−BstBI SVneo断片をKT3B/VARNA/αMHC のClaＩ部位に挿入する。この構成物をKT3B/SVneo/VARNA/αMHCと命名する。実施例４ＭＨＣクラスＩ重鎖の保存領域を開裂させるであろうリボザイムのKT-3B中へのクローニングＡ．pSK/VARNA/MHCHRBZの作製形質導入された細胞中でのＭＨＣクラスＩの発現を効率的に阻害するために、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に対する標的特異性を有するヘアピンリボザイムをKT 3B/SVneoベクター中に挿入する。リボザイムはAd2 VARNA1プロモーターから高レベルで発現される。ＭＨＣヘアピンリボザイム（HRBZ）を実施例３に記載のpolI II pSK/VARNA/αMHC発現カセット中に挿入する。 HRBZおよびＭＨＣクラスＩ対立遺伝子CW3は下記に記載の相同配列を有する：（配列番号）５′→３′：GATGAGTCTCTCAT HRBZは、標的配列中に含まれるAGTCヘアピン基質モチーフ中のＡ残基の後で開裂するようにデザインする。開裂後、HRBZを再循環させ、別のＭＨＣクラスＩＲＮＡ分子にハイブリダイズさせ、そして開裂させることができる。４塩基の「テトラループ」３と広範囲ヘリックス４を含有し、上記に示したＭＨＣクラスＩ相同配列に対する特異性を有する、以前に定義されたような二本鎖 HRBZ（Hampel他、Nucleic Acids Research 18:299，1990）は化学的に合成され、これは５′末端と３′末端にそれぞれAvrII部位とClaＩ部位を含む。 MHC HRBZ、センス鎖：（配列番号）５′→３′：GATCTCGATGAGAAGAACATCACCAGAGAAACACACGGACT TCGGTCCGTGGTATATTACCTGGTAC MHC HRBZ、アンチセンス鎖：（配列番号）５′→３′：CTAGGTACCAGGTAATATACCACGGACCGAAGTCCGTGTGTT TCTCTGGTGATGTTCTTCTCATCGA BglIIとAvrII粘着末端を有する二本鎖ＭＨＣクラスＩ特異的HRBZを形成させるために、等量の一本鎖を10mM MgCl₂中で一緒に混合し、95℃で５分間加熱し、次いで室温にゆっくり冷やして両鎖をアニールさせる。 BglIIとAvrII粘着末端を有する化学合成された二本鎖ＭＨＣクラスＩ特異的HR BZを、BglIIとAvrIIで消化されそしてCIAP処理された、polIII発現ベクターから αMHC配列が除去されているpSK/VARNA/αMHC中に連結せしめることにより、MHC HRBZのためのpolIII発現カセットを組み立てる。このプラスミドをpSK/VARNA/MH CHRBZと命名する。このプラスミドは、Ad2 VARNA1プロモーターの後にMHC HRBZ があり、その後にpolIII共通終結配列を含む。polIII発現成分はXhoＩおよびCla Ｉ認識部位により隣接されている。Ｂ．KT3B/SVneo/VARNA/MHCHRBZの作製 KT3B/SVneo/VARNA/MHCHRBZの作製は２段階連結により達成される。第一段階は、XhoＩ−ClaＩ VARNA/MHCHRBZ断片とN2R3^-からの1.0Kb MoMLV 3′LTR ClaＩ−H indIII断片を、実施例１に記載のpUC31/N2R5g^MプラスミドのXhoＩ部位とHindIII 部位の間に挿入するという三元連結である。この構成物をKT3B/VARNA/MHCHRBZと命名する。第二段階において、1.3Kb ClaＩ−BstBＩ SVneo断片をKT3B/VARNA/MH CHRBZのClaＩ部位の中に連結させる。この構成物をKT3B/SVneo/VARNA/MHCHRBZと命名する。実施例５ PSF1アンチセンスcDNAのクローニングＡ．KT3C/SVneo/αPSF1の作製 PSF1のcDNAクローン（Spies他、Nature 351:323，1991；Spies他、Nature 3 48: 744，1990）を、KT-3B骨格ベクター中のネオマイシン耐性遺伝子の３′非翻訳領域中に挿入する予定の特定配列の増幅のためのＰＣＲ反応において鋳型として使用する。PSF1 cDNAは、次のプライマー対を使ってヌクレオチド配列91〜1,1 24の間が増幅される：正プライマーはヌクレオチド配列91〜111に該当する：（配列番号）５′→３′：TATATGTCGACGAGCCATGCGGCTCCCTGAC 逆プライマーはヌクレオチド配列1,124〜1,105に該当する：（配列番号）５′→３′：TATATGTCGACCGAACGGTCTGCAGCCCTCC PSF1相補的配列に加えて、両プライマーは、ＰＣＴアンプリコン生成物の効率的酵素消化のためにそれらの５′末端に５ヌクレオチドの「緩衝配列」を含有する。両プライマー中、緩衝配列の後にはHincII認識配列がある。上述のプライマーを使ったPSF1アンプリコンの生成は、実施例２Ｂｉに記載のＰＣＲプロトコールを使って達成される。Ventポリメラーゼ（New England Biolabs，Beverly，MA ）を使うことによりこのプロトコールを変更し、更に3.5分の代わりに１分の伸長時間を含むように変更する。Ventポリメラーゼは平滑末端を有するアンプリコンを生成する。Ｂ．KT3B/SVneo/VARNA/αPSF1の作製 PSF1アンチセンス配列をAd2 VARNA1プロモーターの下流に挿入することにより、高レベルのPSF1アンチセンス発現が達成される。まず、Ad2 VARNA1プロモーター−PSF1アンチセンスcDNAをpolIII発現カセットとして組み立て、次いで該カセットをKT-3B骨格中に挿入する。このpolIII発現カセット中では、Ad2 VARNA1プロモーターの後にアンチセンスPSF1 cDNAがあり、さらにその後にpolIII共通終結シグナルがくる。次のプライマー対を使ったＰＣＲ反応において、PSF1 cDNAのヌクレオチド配列91〜309を増幅させる。正プライマーはヌクレオチド配列91〜111に該当する：（配列番号）５′→３′：TATATCCTAGGGAGCCATGCGGCTCCCTGAC 逆プライマーはヌクレオチド配列309〜288に該当する：（配列番号）５′→３′：TATATAGATCTCAGACAGAGCGGGAGCAGCAG PSF1相補的配列に加えて、両プライマーは、ＰＣＴアンプリコン生成物の効率的酵素消化のためにそれらの５′末端に５ヌクレオチドの「緩衝配列」を含有する。正プライマー中には緩衝配列の後にAvrII認識配列があり、そして逆プライマー中には緩衝配列の後にBglII認識配列があり、ＲＮＡポリメラーゼIII発現カセット中のAd2 VARNA1プロモーターに関してアンチセンス配向における挿入を可能にする。上述のプライマーを使ったPSF1アンプリコンの生成は、3.5分の代わりに１分の伸長時間を含むように変更された実施例２Ｂｉに記載のＰＣＲプロトコールを使って達成される。 MHC CW3 cDNAの240bpアンプリコン生成物をGene Clean(Bio101，San Diego，C A)を使って精製し、次いでAvrIIとBglIIで消化し、そして２％NuSeive−１％アガロース／ＴＢＥゲル電気泳動により単離する。次いで211bpバンドをゲルから切り出し、Gene Cleanを使って精製する。 KT3B/SVneo/VARNA/αPSF1の作製は２段階連結により達成される。第一段階は、XHoＩ−ClaＩ VARNA/αPSF1断片とN2R3^-からの1.0Kb MoMLV 3′LTR ClaＩ−Hi ndIII断片を、実施例１に記載のpUC31/N2R5g^MプラスミドのXhoＩ部位とHindIII 部位の間に挿入するという三元連結である。この構成物をKT3B/VARNA/αPSF1と命名する。第二段階において、1.3Kb ClaＩ−BstBＩ SVneo断片をKT3B/VARNA/α PSF1のClaＩ部位の中に連結させる。この構成物をKT3B/SVneo/VARNA/αPSF1と命名する。実施例６ PSF1の保存領域を開裂させるであろうリボザイムのKT-3B中へのクローニングＡ．pSK/VARNA/PSF1HRBZの作製形質導入された細胞中でのPSF1の発現を効率的に阻害するために、PSF1 RNAに対して標的特異性を有するヘアピンリボザイムをKT3B/SVneoベクター中に挿入する。該リボザイムはAd2 VARNA1プロモーターから高レベルで発現される。PSF1ヘアピンリボザイム（HRBZ）を実施例３に記載のpolIII pSK/VARNA/αMHC発現カセット中に挿入する。次いでPSF1 HRBZ−polIII発現カセットをKT3B/SVneo骨格ベクター中に挿入する。 HRBZとPSF1 RNAは下記に記載の相同配列を有する：（配列番号）５′→３′：GCTCTGTCTGGCCAC 標的配列中に含まれるTGTCヘアピン基質モチーフ中のＴ残基の後で開裂するようにHRBZをデザインする。開裂後、HRBZを再循環させ、別のPSF1 RNA分子にハイブリダイズさせ、そして開裂させることができる。４塩基の「テトラループ」３と拡張ヘリックス４を含有し、上記に示したPSF1 相同配列に対する特異性を有する、以前に定義されたような二本鎖HRBZ（Hampel 他、Nucleic Acids Research 18:299，1990）を化学的に合成し、これは５′末端と３′末端にそれぞれBglII部位とAvrII部位を含む。 PSF1 HRBZ、センス鎖：（配列番号）５′→３′：GATCTGTGGCCAGACAGAGCACCAGAGAAACACACGGACTTCGG TCCGTGGTATATTACCTGGTAC PSF1 HRBZ、アンチセンス鎖：（配列番号）５′→３′：CTAGGTACCAGGTAATATACCACGGACCGAAGTCCGTGTGTT TCTCTGGTGCTCTGTCTGGCCACA BglIIとAvrII粘着末端を有する二本鎖PSF1特異的HRBZを形成させるために、等量の一本鎖を10mM MgCl₂中で一緒に混合し、95℃で５分間加熱し、次いで室温にゆっくり冷やして両鎖をアニールさせる。 BglIIとAvrII粘着末端を有する化学合成された二本鎖PSF1特異的HRBZを、BglI IとAvrIIで消化されそしてCIAP処理された、polIII発現ベクターからαMHC配列がゲル精製除去されているpSK/VARNA/αMHC中に連結せしめることにより、PSF1 HRBZのためのpolIII発現カセットを組み立てる。このプラスミドをpSK/VARNA/PS F1HRBZと命名する。このプラスミドは、Ad2 VARNA1プロモーターの後にPSF1 HRB Zを含み、その後にpolIII共通終結配列を含む。polIII発現成分はXhoＩおよびCl aＩ認識部位により隣接されている。Ｂ．KT3B/SVneo/VARNA/PSF1HRBZの作製 KT3B/SVneo/VARNA/PSF1HRBZの作製は２段階連結により達成される。第一段階は、XhoＩ−ClaＩ VARNA/PSF1HRBZ断片とN2R3^-からの1.0Kb MoMLV 3′LTR ClaＩ−HindIII断片を、実施例１に記載のpUC31/N2R5g^MプラスミドのXho Ｉ部位とHindIII部位の間に挿入するという三元連結である。この構成物をKT3B/ VARNA/PSF1HRBZと命名する。第二段階において、1.3Kb ClaＩ−BstBＩ SVneo断片をKT3B/VARNA/PSF1HRBZのClaＩ部位の中に連結させる。この構成物をKT3B/SVn eo/VARNA/PSF1HRBZと命名する。実施例７多価組換えレトロウイルスベクターKT3B-E3/19Kの作製３つのクラスＩＭＨＣ対立遺伝子A2，CW3およびB27の間で保存されている保存領域に特異的なアンチセンス配列とE3/19K配列の両方を含有するレトロウイルスベクターKT3B-E3/19Kの変形も作製することができる。KT3B-E3/19K/αMHCとして知られるこのベクターは、E3/19K配列の３′末端のところにＭＨＣクラスＩアンチセンス配列を組み込むようにデザインされ、これはキメラ分子として発現されるだろう。レトロウイルスベクターKT3B-E3/19K/αMHCは、ＭＨＣアンチセンス配列を含有するClaＩで消化されたＰＣＲ増幅生成物をKT3B-E3/19KベクターのCl aＩ部位の中に連結せしめることにより、作製することができる。より詳しくは、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子CW3のcDNAクローン（Zemmour他、Tissue Antigens 39:249，1992）を、次のプライマー対を使ってＰＣＲによりヌクレオチド653〜 854を増幅させる： αMHCの正プライマー：（配列番号）５′→３′：ATTATCGATTCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTG αMHCの逆プライマー：（配列番号）５′→３′：ATTAATCGATACATGGCACGTGTATCTCTGCTCTTCTC このプライマー対は、部分的に予備消化されたKT3B-E3/19Kベクター中にアンチセンス配向において増幅ClaＩ消化生成物を挿入するために、ClaＩ制限酵素部位により隣接される。ClaＩ断片を逆の配向に置くことにより、該ベクターは転写されると負のアンチセンス鎖を発現するだろう。実施例８組換えレトロウイルスベクターKT3B-E3/19Kを用いたパッケージング細胞系ＤＡの形質導入Ａ．プラスミドＤＮＡトランスフェクション 293 2-3細胞（293細胞から誘導される細胞系、ATCC No．CRL 1573，WO 92/052 66）の5×10⁵個の細胞を、約50％集密性において６cm組織培養皿上に接種する。翌日、トランスフェクションの４時間前に培地を４mlの新鮮培地に置き換える。 10.0μgのKT3B-E3/19Kプラスミドと10.0μgのMLP Gプラスミドを2M CaCl₂溶液と混合し、１×Hepes緩衝化塩溶液，pH 6.9を加え、そして室温で15分間インキュベートすることにより、標準的なリン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈澱を行う。リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈物を293 2-3細胞に移し、次いでそれを37℃、5% CO₂ で一晩インキュベートする。翌朝、細胞を１×PBS，pH7.0中で３回洗浄する。細胞に新鮮な培地を加えた後、37℃、10% CO₂で一晩インキュベートする。翌日、細胞から培地を回収し、0.45μmフィルターを通して濾過する。この上清を使ってパッケージング細胞系と腫瘍細胞系を形質導入する。他のベクターについての一時的ベクター上清も同様な様式で作製される。Ｂ．パッケージング細胞系形質導入ＤＡ細胞（D-17細胞から誘導される両向性細胞系，ATCC No.183，WO 92/05266 ）を5×10⁵細胞／10cm皿において接種する。回収したばかりの293 2-3上清（または−70℃で保存しておいた上清）の約0.5mlをＤＡ細胞に加える。翌日、それらの細胞にG418を加え、一週間に渡り薬剤耐性プールを生成させる。96ウエルプレートのウエルあたり0.8〜1.0細胞を加えることにより、この細胞のプールを希釈クローニングする。24個のクローンを24ウエルプレートに広げ、次いで６ウエルプレートに広げ、その時点で力価測定のために細胞上清を収集する。ベクター生産用にＤＡクローンを選択し、DA-E3/19Kと命名する。ポリブレンまたは硫酸プロタミンを含有する普通培地中で培養したDA-E3/19Kクローンの10cm集密プレートから、ベクター上清を収集する。あるいは、バイオリアクターまたはローラーボトルからベクター上清を回収し、後処理し、そして使用前に更に精製することができる。パッケージング細胞系中に薬剤耐性マーカーを含まないかまたは既に薬剤耐性マーカーを含むそれらのベクターについて、293 2-3産生上清によりＤＡ細胞を形質導入した１日〜２日後、ＤＡ形質導入細胞を希釈クローニングすることにより、安定に形質導入されたクローンの選択を実施しなければならない。次いで、伝令ＲＮＡの逆転写に続いてポリメラーゼ連鎖反応によるcDNA情報の増幅を使うことによって（RT-PCRとして知られる方法）、E3/19K発現の存在について希釈クローンをスクリーニングする。RT-PCR用の市販のキットはInvitrogen Corp．(Sa n Diego，CA)から入手可能である。少なくとも10日間増殖させたクローンにおいてRT-PCRを実施すべきであり、そして適度な数の安定に形質転換されたクローンを発見するために約50〜100個のクローンをスクリーニングすることが必要であろう。RT-PCRを実施するために、増幅させようとする各情報に対して特異的プライマーが要求されるだろう。E3/19K情報の401bp生成物を増幅させるためにデザインされたプライマーは次の通りである： E3/19Kのためのスクリーニングプライマー：（配列番号）５′→３′：ATGAGGTACATGATTTTAGGCTTG （配列番号）５′→３′：TCAAGGCATTTTCTTTTCATCAATAAAAC 実施例９複製応答能のあるレトロウイルスの検出拡張Ｓ⁺Ｌ^-アッセイは、複製応答能のある感染性ウイルスが着目の細胞系の上清中に存在するかどうかを決定する。該アッセイは、感染性レトロウイルスが指示細胞系MiCl₁(ATCC CCL 64.1)上でフォーカスを形成するという経験的観察結果に基づく。MiCl₁細胞系は、マウス肉腫ウイルス（ＭＳＶ）での形質導入によりM vlLuミンク細胞系（ATCC CCL 64）から誘導される。それは、マウス肉腫プロウイルスを含有する非生産体で、非形質転換型の、復帰変異体クローンであり、ＭＳＶゲノムの存在を示す肉腫を形成する（Ｓ⁺）が、白血病を引き起こさず（Ｌ^- ）、複製応答能のあるウイルスの不在を示す。複製応答能のあるレトロウイルスによるMiCl₁細胞の感染は、ＭＳＶゲノムを「活性化」して「形質転換」を開始させ、フォーカス形成を引き起こす。複製応答能のあるレトロウイルスの存在について調べようとする細胞系から上清を回収し、0.45μフィルターを通して細胞を取り除く。１日目に、MvlLu細胞を、２ml DMEM，10% FBSおよび８μg/mlポリブレン中、６ウエルプレートのウエルあたり１×10⁵細胞（試験しようとする試料につき１ウエル）において接種する。正および負の対照のために同じ方法でMvlLu細胞を別の６ウエルプレート中に入れる。37℃、10％CO₂で一晩細胞をインキュベートする。２日目に、試験上清1.0mlをMvlLu細胞に加える。負の対照プレートは1.0mlの培地と共にインキュベートする。正の対照は、ＭＡウイルス（Miller他、Molec．and Cell Biol．5: 431，1985）の３つの希釈液〔培地1.0ml中の200フォーカス形成単位(ffu)、20ffuおよび２ffu〕から成り、これを正の対照ウエルの中の細胞に加える。細胞を一晩インキュベートする。３日目に、培地を吸引し、そして3.0mlの新鮮なDMEMと10% FBSを細胞に加える。細胞を集密まで増殖させ、６日目と10日目に1：10分割し、複製応答能のあるレトロウイルスを増幅させる。13日目に、MvlLu細胞上の培地を吸引し、2.0mlのDMEM と10% FBSを細胞に加える。更に、MiCl₁細胞を2.0mlのDMEM，10% FBSおよび８μ g/mlポリブレン中、ウエルあたり１×10⁵細胞において接種する。14日目に、Mvl Lu細胞からの上清を対応するウエルのMiCl₁細胞に移し、37℃，10% CO₂で一晩インキュベートする。15日目に、培地を吸引し、3.0mlの新鮮なDMEMと10% FBSを細胞に加える。21日目に、単層細胞上でのフォーカス形成（該単層を過剰増殖し且つ付着したままである密集した屈折性細胞として現れる）について細胞を調べる。MiCl₁細胞上にフォーカスが現れたら、試験品が複製応答能のあるレトロウイルスで汚染されていると決定される。実施例10 E3/19Kレトロウイルスベクターによる細胞系の形質導入次の付着性ヒトおよびマウス細胞系を、5×10⁵細胞／10cm皿（４μg／mlのポリブレンを有する）において接種する：HT 1080 (ATCC No．CCL 121)、Hela（ATCC No．CCL 2）およびBC10ME（Patek他、Cell．I mmuno ．72:113，1982，ATCC Co．TIB 85)。翌日、DA E3/19Kプールからの濾過上清1.0mlを細胞培養プレートの各々に加える。翌日、800μg/mlのG418を全ての細胞培養物の培地に加える。選択が完了しそして遺伝子発現について試験するのに十分な細胞数が得られるまで、培養物を維持する。形質導入された細胞系をそれぞれHT 1080-E3/19K、Hela-E3/19KおよびBC10ME-E3/19Kと命名する。 EBVで形質転換された細胞系（BLCL）および別の懸濁細胞系を、照射された生産細胞系DA-E3/19Kとの同時培養により形質導入する。詳しくは照射された（10, 000ラド）生産細胞系を、５×10⁵細胞／６cm皿において４μg/mlのポリブレンを含む増殖培地中に接種する。細胞を２〜24時間接着させた後、10⁶個の懸濁細胞を加える。２〜３日後、懸濁細胞を除去し、遠心によりペレットにし、１mg／ml のG418を含む増殖培地中に再懸濁し、そして丸底96ウエルプレートの10ウエルに接種する。培養物を24ウエルプレートに拡張し、次いでＴ−25フラスコに拡張する。実施例11 組換えレトロウイルスベクター構成物KT3B-E3/19K中のE3/19Kの発現Ａ．E3/19Kについてのウエスタンブロット分析 E3/19K発現の分析のために、選択された培養物から放射免疫沈澱アッセイ（RI PA）溶解産物を調製する。RIPA溶解産物は細胞集密プレートから調製する。詳しくは、まず細胞から培地を吸引により除去する。細胞を含有する培養プレートの大きさに応じて、100〜500μｌの氷冷RIPA溶解緩衝液〔10mM Tris，pH7.4；1% N onidet p40 (Calbiochem，San Diego，CA)；0.1% SDS；150mM NaCl〕を細胞に加える。マイクロピペットを使って細胞をプレートから取り、細胞混合物を超遠心管に移す。遠心管を５分間遠心して細胞破片を沈澱させ、次いで上清を別の試験管に移す。上清を10% SDS-PAGEゲル上で電気泳動し、CAPS緩衝液（Aldrich，Milwaukee，WI ）（10mM CAPS，pH11.0；10％メタノール）中10〜60ボルトで2〜18時間、タンパク質バンドをImmobilon膜に移行させる。前記膜をCAPS緩衝液から５％ Blotto（５％脱脂粉乳；50mM Tris，pH7.4；150mM NaCl；0.02％アジ化ナトリウム；および0.05％Tween20）に移し、そしてE3/19Kに対するマウスモノクローナル抗体（S everinsson他、J．Cell Biol．101: 540-547，1985）を使って探査する。¹²⁵Ｉ −プロテインＡを使うことにより、膜への抗体結合を検出する。実施例12 非形質導入細胞と比較して増加したクラスＩ発現レベルを証明するためのE3/19K−ベクター形質導入細胞のFACS分析 E3/19K−ベクターにより形質導入された細胞系を、FACS分析によりＭＨＣクラスＩ分子発現について調べる。非形質導入細胞もＭＨＣクラスＩ分子発現について分析し、E3/19K形質導入細胞と比較してＭＨＣクラスＩ分子発現に対する形質導入の効果を調べる。マウス細胞系BC10ME，BC10ME-E3/19K，P815（ATCC No．TIB 64）およびP815-E 3/19Kを、細胞表面上へのH-2D^d分子の発現について試験する。ほぼ集密的（subc onfluent）密度に増殖させた細胞を、Versene処理により培養皿から取り出し、そして200gでの遠心により冷（４℃）ＰＢＳ＋１％ＢＳＡおよび0.02％アジ化ナトリウム（洗浄緩衝液）で２回洗浄する。２百万個の細胞を超遠心管中に入れ、 200gにて超遠心管中にペレット化した後、上清を除去する。細胞ペレットをH-2D^d特異的Mab 34-2-12s（精製抗体の1：100希釈液50μｌ、ATC C No．HB 87）と共に再懸濁し、時折かきまぜながら４℃で30分間インキュベートする。抗体で標識された細胞を１mlの洗浄緩衝液（４℃）で２回洗浄した後、上清を除去する。細胞をビオチン化ヤギ抗マウスκ軽鎖Mab（精製抗体の1：100 希釈液50μｌ）（Amersham，Arlington Height，IL）と共に再懸濁し、４℃で30 分間インキュベートする。細胞を洗浄し、50μｌのアビジン接合FITC（Pierce， Rockford，IL）と共に再懸濁し、そして４℃で30分間インキュベートする。細胞をもう１回洗浄し、１mlの洗浄緩衝液中に再懸濁し、FACStar Analyzer(Becton Dickinson，Los Angeles，CA)上での分析まで氷上に維持する。形質導入細胞の平均蛍光強度を非形質導入細胞のそれと比較し、E3/19Kタンパク質が表面ＭＨＣクラスＩ分子発現に対して与える効果を決定する。実施例13 マウス同種ＣＴＬ分析 10,000ラドで照射したH-2^d腫瘍細胞（P815またはBC/10ME）を、６〜８週齢の雌C57BL/6（H-2^d）マウス（Harlan Sprague-Dawley，Indianapolis，IN）から単離した脾細胞と共に培養して同種ＣＴＬを誘導する。詳しくは、3×10⁶個の脾細胞／mlをT-25フラスコ中で1.5×10⁴個の照射された腫瘍細胞／mlと共に37℃で４〜５日間試験管内培養する。培地はRPMI 1640；熱不活性化5% FBS；１mMピルビン酸塩；50μg/mlのゲンタマイシンおよび10^-5 M ２−メルカプトエタノールから成る。５日後にエフェクター細胞を収得し、標準的４〜６時間アッセイにより 96ウエルミクロタイタープレート中で様々なエフェクター：標的細胞比を使って試験する。該アッセイは37℃１時間100μCiのNa₂ ⁵¹CrO₄(Amersham，Arlington Heights，IL)で標識された標的細胞を、ウエルあたり200μｌの最終全容量で4〜 10×10³細胞／ウエルにおいて使用する。37℃で４〜６時間インキュベーション後、培地100μｌを取り、WALLACガンマ分光器(Gaithersburg，MD)中で分析する。標的＋培地から自然放出（ＳＲ）をＣＰＭ（counts per minute）として測定し、そして標的＋1M HClから最大放出（ＭＲ）をＣＰＭとして測定する。標的細胞溶解率を次のようにして算出する：｛〔（エフェクター細胞＋標的ＣＰＭ）− （ＳＲ）〕／〔（ＭＲ）−（ＳＲ）〕｝×100。標的の自然放出値は典型的にはＭＲの10％〜20％である。着目の遺伝子（リボザイム、E3/19K、アンチセンス等）により形質導入されている腫瘍細胞は、同種ＣＴＬ誘導および検出の減少を証明するためのこのアッセイにおいて、刺激物質および／または標的細胞として使われる。実施例14 非形質導入細胞と比較して増加したＭＨＣクラスＩ発現レベルを証明するための E3/19K−ベクター形質導入ヒト細胞のFACS分析 E3/19K−ベクターにより形質導入された細胞系を、FACS分析によりクラスＩ分子発現について調べる。非形質導入細胞もクラスＩ分子発現について分析し、形質導入がクラスＩ分子発現に対して与える効果を調べる。２つのヒト細胞系JY-E3/19KとJY（ATCC No. ）を使って細胞表面上へのHLA -A2分子の発現について試験する。10⁶細胞／mlに増殖させた懸濁細胞をピペットにより培養フラスコから取り出し、そして200gでの遠心により冷（４℃）ＰＢＳ＋１％ＢＳＡおよび0.02％アジ化ナトリウム（洗浄緩衝液）で２回洗浄する。２百万 (2×10⁶)個の細胞を超遠心管中に入れ、200gにてペレット化した後、上清を除去する。細胞ペレットをHLA-A2特異的Mab BB7.5（精製抗体の1：100希釈液50μｌA TCC No．HB 82）と共に再懸濁し、時折かきまぜながら該抗体と共に４℃で30分間インキュベートする。抗体で標識された細胞を１mlの洗浄緩衝液（４℃）で２回洗浄する。上清を除去する前に、細胞をビオチン化ラット抗マウスκ軽鎖Mab （精製抗体の1：100希釈液50μｌ）と共に再懸濁し、４℃で30分間インキュベートする。細胞を洗浄し、50μｌのアビジン接合FITC（Pierce，Rockford，IL）と共に再懸濁し、そして４℃で30分間インキュベートする。細胞をもう１回洗浄し、１mlの洗浄緩衝液中に再懸濁し、FACStar Analyzer上での分析まで氷上に維持する。形質導入細胞の平均蛍光強度を非形質導入細胞のそれと比較し、E3/19Kタンパク質が表面ＭＨＣクラスＩ分子発現に対して与える効果を決定する。実施例15 同種ヒトＣＴＬ系によるE3/19K形質導入型および非形質導入型ＥＢＶ形質転換ヒトＪＹ細胞に対する免疫応答の測定ヒトＣＴＬ系は、刺激物質として同種ＥＢＶ形質転換細胞系を使って提供者の血液試料から増殖させることができる。それらのＣＴＬ系をＡ２分子を有するＪＹ細胞と共に増殖させると、ＪＹ標的細胞を溶解させることができる。E3/19K 遺伝子により形質転換されているＪＹ標的細胞または非形質転換型ＪＹ標的細胞とそれらのＣＴＬ系を使ってクロム放出アッセイを実施することができる。E3/1 9K形質転換型ＪＹ標的細胞は、非形質転換型ＪＹ標的細胞に比較して減少された該細胞の認識および溶解を証明するために使われる。それらの結果は、ＭＨＣクラスＩ表面発現を減少させる物質による細胞の形質転換が試験管内ヒト細胞モデル系においてもＭＨＣクラスＩ制限された細胞媒介免疫応答を減少させることを示す。同種ＣＴＬ反応は、照射された（10,000ラド）10⁶個のＪＹ細胞を非HLA-A2型の人からの10⁷個のPBMCと共に10mlの培地中で37℃，5% CO₂で７〜10日間培養することにより誘導する。培地は、ＣＴＬ増殖用に予備選択された５％熱不活性化ウシ胎児血清、１mMピルビン酸ナトリウムおよび非必須アミノ酸が補足されたRP MI 1640から成る。７〜10日間インキュベーション後、エフェクター細胞を収得し、標準的４〜６時間クロム放出アッセイにより、正の対照としての⁵¹Cr標識ＪＹおよび⁵¹Cr標識ＪＹ−E3/19Kを使って試験する。ＪＹ細胞とＪＹ−E3/19K細胞を300μCiのNa₂ ⁵¹CrO₄で37℃で１時間標識し、次いで洗浄し、カウントし、ウエルあたり200μｌの最終全容量で４×10³細胞／ウエルにおいて該アッセイに使用する。インキュベーション後、培地100μｌを取り、WALLACガンマ分光器(Gaithe rsburg，MD)中で分析する。標的＋培地から自然放出（ＳＲ）をＣＰＭとして測定し、標的＋1M HClから最大放出（ＭＲ）をＣＰＭとして測定する。標的細胞溶解率を次のようにして算出する：｛〔（エフェクター細胞＋標的ＣＰＭ）−（ＳＲ）〕／〔（ＭＲ）−（ＳＲ）〕｝×100。標的の自然放出値は典型的にはＭＲの10％〜30％である。着目の遺伝子（リボザイム、E3/19K、アンチセンス等）により形質導入されている腫瘍細胞は、正の対照である非形質導入型の細胞系に比べて同種ＣＴＬ誘導および検出の減少を証明するためのこのアッセイにおいて、刺激物質および／または標的細胞として使われる。実施例16 同種骨髄移植片ｉ．C3H（H-2^k）およびBALB/C（H-2^d）からの４ｌの骨髄の除去第23ゲージ注射針と注射器を使って骨髄栓を除去する。骨髄を収集し、そして骨髄をハンクス液（Mauch他、PNAS 77: 2927，1980）中に再懸濁する。 ii．E19レトロウイルスベクターによる骨髄細胞の形質導入 E3/19Kベクターを含有する1.0mlのDMEM＋10% FBS中での遠心と再懸濁により骨髄細胞を調製する。骨髄細胞とE3/19Kレトロウイルスベクターを33℃で４時間インキュベートし、次いで25％ドナーウシ血清と0.1mMコハク酸ナトリウムヒドロコルチゾンが補足されたフィッシャー培地９mlを加える。24時間後、骨髄細胞を HBBS中で洗浄し、そして注射用に2×10⁶細胞／mlにおいてHBBS中に再懸濁する。 iii．マウスへの骨髄細胞の注入注射直前にC57BL/6（B6，H-2^b）マウスに700ラドのγ線を照射する。２グループのB6マウスに0.5mlのC₃H骨髄細胞を静注する。５日後、マウスに再び700ラドを照射し、そしてベクター形質導入型C₃H骨髄細胞か未処理のC₃H骨髄細胞のいずれかの0.5mlを静注する。致死線量を照射した純真なB6マウスに、正の対照として0.5ml（1×10⁶個）のC₃H骨髄細胞を、そして負の対照として0.5ml（1×10⁶個）のBalb/c骨髄細胞を静注する。 iv．移植片拒絶の評価注射後５日目に２つの方法のいずれかにより骨髄移植片拒絶を評価する：ａ．マウスを犠牲にした後、脾臓を取り出し、10％ホルマリン中に入れる。脾臓コロニーをカウントし、記録する。ｂ．マウスにFUdR（Sigma，St．Louis，MO）を注射し、30分後に¹²⁵I-IUdR(Am ersham，Arlington Height，IL)を注射する。18時間インキュベーション後、脾臓を取り出し、骨髄細胞を複製している脾臓において¹²⁵ I-IUdR取込みを測定する。ｃ．同系の増殖対照において測定された放射能取込み値を任意に100Ｕに設定し、そして実験グループの全ての値をこの対照に関して標準化する。〜10Ｕを有する動物は目に見える脾臓コロニーを示さず、一方50〜100Ｕを有する動物は200 以上の脾臓コロニーを有する。10Ｕ未満を示す動物は強い拒絶を表したと考えられ、10〜30Ｕを有するものは弱い拒絶を表したと考えられ、そして30Ｕより多いものは全く有意な拒絶を示さない。実施例17 Ａ．骨髄細胞の単離と形質導入既知の技術により行われる注射器排気により患者の骨髄から多能性造血幹細胞 CD34⁺を収集する。あるいは、誕生前に患者を診断する場合には乳児の索血液からCD34⁺を得てもよい。一般的に、局所麻酔または全身麻酔の下で大腿骨幹を穿刺することによるかまたは後腸骨稜から20の骨髄吸引液を得る。次いで骨髄吸引液をプールし、100単位／mlの硫酸ヘパリンと100μg/mlのデオキシリボヌクレアーゼＩを含有するHepes緩衝化ハンクス液中に懸濁し、それをフィコール勾配分離にかける。バフィコート骨髄細胞を、CEPRATE^TM LC（CD34）分離システム（Cellpro，Bothell，WA）に従って収集・洗浄する。バフィコート細胞を順次抗CD34モノクローナル抗体で染色し、洗浄し、次いでCEPR ATE^TMシステムにより供給されたビオチン化二次抗体で染色する。細胞混合物をC EPRATE^TMアビジンカラム上に負荷する。ビオチン標識された細胞はカラム上に吸着し、未標識細胞はカラムを通過する。次いでCEPRATE^TMシステムの説明書に従ってカラムを洗浄し、手動でゲル床を絞ることによるカラムの撹拌によりCD34⁺ 細胞を溶出させる。CD34⁺細胞が精製されたら、精製された幹細胞をカウントし、20％のプールした熱不活性化してないヒトＡＢ血清（hAB血清）を含有するイコブ改良ダルベッコ培地IMDM（Irvine Scientific，Santa Ana，CA）に１×10⁵ 細胞／mlの濃度で接種する。 CD34⁺細胞の精製後、精製幹細胞を形質導入する数種類の方法を実施することができる。第一のアプローチは、ベクター産生細胞から誘導したベクター含有上清培養物による精製幹細胞集団の形質導入を含む。第二のアプローチは、ベクター産生細胞の照射済単層と非付着性精製CD34⁺細胞集団との同時培養を含む。第三の好ましいアプローチは、同様な同時培養アプローチを含むが、精製CD34⁺細胞を種々のサイトカインで予備刺激し、そして48時間培養した後、照射済ベクター産生細胞と同時培養する。形質導入前の予備刺激は効率的遺伝子伝達を増大させる（Nolta他、Exp．Hematol．20:1065，1992）。形質導入レベルの増加は、効率的なレトロウイルス形質導入に必要な幹細胞の増殖の増加にある。それらの培養物の増殖を刺激することは、患者への再注入に用いられる増加された細胞集団も提供する。 CD34⁺細胞の予備刺激は、該細胞をサイトカインと増殖因子（IL-1，IL-3，IL- 6およびマスト細胞増殖因子(MGF)を包含する）の組合せと共にインキュベートすることにより実施する。予備刺激は、1-2×10⁵ 個のCD34⁺細胞／ml培地を骨髄刺激培地の入ったT25組織培養フラスコ中で48時間培養することにより実施する。骨髄刺激培地は30％熱不活性化されていないhAB 血清、2mM Ｌ−グルタミン、0.1mM ２−メルカプトエタノール、１μＭヒドロコルチゾンおよび１％脱イオンしたウシ血清アルブミンを含有するIMDMから成る。骨髄培養に使用する全ての試薬は、正常骨髄からの最大数の顆粒球／赤血球／マクロファージ／巨核球コロニー形成単位を維持するそれらの能力についてスクリーニングすべきである。予備刺激用の精製組換えヒトサイトカインと増殖因子（ Immunex Corp.，Seattle，WA）は、次の濃度で使用されるだろう：Ｅ．コリ由来 IL-1α（100Ｕ／ml）、酵母由来IL-3（５ng／ml）、IL-6（50U／ml）およびMGF （50ng／ml）〔Anderson他、Cell Growth Differ．2:373，1991〕。 CD34⁺細胞の予備刺激後、次いで刺激培地の継続存在下で照射済のＤＡ由来生産細胞系（E3/19Kベクターを発現している）と同時培養することにより、該細胞を形質導入する。ＤＡベクター産生細胞系をまずトリプシン処理し、10,000ラドを使って照射し、1〜2×10⁵細胞／ml骨髄刺激培地で再塗布する。翌日、1〜2×1 0⁵個の予備刺激されたCD34⁺細胞／mlをＤＡベクター産生細胞系単層上に添加し、４μg/mlの最終濃度になるようにポリブレン（Sigma，St.Louis，MO）を添加する。上記細胞の同時培養は48時間行われるだろう。同時培養後、培地を強くフラッシュすることにより接着性ＤＡベクター産生細胞単層からCD34⁺細胞を収集し、そして２時間置くことにより取り出されたベクター産生細胞を接着させる。次いで細胞を収集し、更に72時間増殖させる。細胞を収集し、1×10⁷細胞のアリコート／バイアルにおいて凍結保護剤を使って液体窒素中で凍結させる。形質転換されたCD34⁺細胞を外来物質の存在について試験したら、凍結させた形質転換されたCD34⁺細胞を解凍し、１×10⁵細胞／ mlの濃度で塗布し、骨髄刺激培地中で更に48時間培養する。次いで形質転換細胞を収集し、２回洗浄し、そして生理的食塩水中に再懸濁する。注入１回あたり患者に注入し戻すのに使われる形質導入細胞の数は、注入１回あたり患者１人あたり最少で10⁷×10⁸細胞であるように計画される。注入の部位は患者の骨髄中に直接であるかまたは末梢血流中へのi.v.であることができる。Ｂ．膵臓島細胞の単離ヒト膵臓島細胞の単離方法は以前に記載されている（Warnock他、Diabetologi a 35:85，1992；Warnock他、Transplantation 45:957，1988）。ペンシルベニア州フィラデルフィアにあるNational Disease Research Interchangeの成人ヒト死体臓器提供者から膵臓を得る。大網と脾靭帯を分割することによる開腹術により膵臓を取り出す。門脈から膵臓の頸部を開放し、腹膜後腔から腺の残部を取り外す。脾臓の重量を量り、４℃のハンクス液（HBSS）中に浸漬する。頭部の膵管に16ゲージのカニューレを挿入し、次いでHBSS含有コラーゲナーゼXI型（Si gma Chemicals，St．Louis，MO）を注入する。冷却用トレーに移した後、膵管を腺の中央で暴露し、膵管のこの部分に２本の追加の16ゲージカニューレを挿入する。各膵管に４℃のコラーゲナーゼ溶液を灌流させ、次いで徐々に38℃に温める。顕微鏡検査した時に島が外分泌組織から自由に解離した時、膵臓の消化が完了したと判断する。消化した組織を、４℃の２％(v/v)新生ウシ血清（Gibco，Burl ington，Ontario，Canada）を含むHBSS中に移し、次いで穏やかに掻き裂く。該組織を洗浄し、累進的に小さくなるサイズの注射針を通過させ、培地3.4mlあたり組織0.6gを使って４℃の組織培養培地199（Gibco，Burlington，Ontario，Can ada）に懸濁させる。組織懸濁液のアリコートを培地およびフィコール（密度1.125，Sigma，St．Louis，MO）と混合し、そして不連続フィコール勾配中で22℃にて550gで25分間遠心分離する。界面部を収集し、洗浄し、培地に再懸濁する。次いで細胞を明細書中に記載の数種類の方法のうちの１つで形質転換せしめる。膵細胞は培養物中では効率的に複製しないので、非複製性細胞に感染することができるＤＮＡまたはベクター系、例えばシンドビスウイルスまたはアデノ関連ウイルスを用いて形質転換せしめることが有用であろう。導入される遺伝子はレトロウイルスベクター系について記載したものである。実施例18 移植可能な膵臓島細胞の置換膵臓島細胞の置換は、以前に記載された大網皮弁法〔Altman他、Hormone and Metabolic Res．Suppl ．25:136，1990〕を使うことによって達成することができる。上述したような島の形質導入後、細胞をペレット化し、10mlのHBSSのヘパリン加溶液中に再懸濁する。大網に結紮した一層大きな曲線の血管輪をその中央部分で切断し、胃から遊離させ、それの大網皮弁により周囲から分離した。細胞溶液の逆行性注入を胃大網動脈の右端に塞栓化した。これは、臍傍領域の皮下に固定された大網皮弁中に島調製物を平等に分配した。島カプセル化または生物人工膵臓の開発を利用してもよい。アルギニンポリ− Ｌ−リジン膜を使ったマイクロカプセル化は、幾つかの研究グループにより実証されている（Fritschy他、Diabetes 40:37，1991；Krestow他、Transplantatio n 51:750，1991；Mazaheri他、Transplantation 51:651，1991）。この技術は異種と同種の両方の島に適用することができ、正常血糖を長期持続させることができる。上記から、今まで本発明の特定実施態様を例示の目的で記載してきたが、本発明の範囲を逸脱することなく様々な変更を行えることはわかるだろう。従って、本発明は特許請求の範囲によるもの以外限定されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ジョリー，ダグラスジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92024, ルーカディア，ヒルクレストドライブ 277 (72)発明者ドゥベンスキー，トーマスダブリュ．, ジュニアアメリカ合衆国，カリフォルニア 92014, デルマー，ビアフェリノ 12729 (72)発明者イバネツ，カルロスイー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92129, サンディエゴ，ミルポンドウェイ 13592 (72)発明者アーウィン，マイケルジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92109, サンディエゴ，＃７，ダイアモンドストリート 1944

Claims

【特許請求の範囲】１．移植片拒絶を抑制する方法において使われる、ＭＨＣ抗原提示を阻害することができるタンパク質またはタンパク質の活性部分の発現を指令する組換えベクター構成物により形質転換された動物の組織細胞。２．前記タンパク質がβ₂−ミクログロブリンを結合することができる、請求項１に記載の細胞。３．前記タンパク質が細胞内でＭＨＣクラスＩ重鎖分子を結合することができる、請求項１に記載の細胞。４．前記タンパク質がE3/19KまたはH301である、請求項１に記載の細胞。５．移植片拒絶を抑制する方法において使われる、アンチセンス情報を転写する組換えベクター構成物により形質転換された組織細胞であって、ここで前記アンチセンス情報はＭＨＣ抗原提示を阻害することができる、前記形質転換された組織細胞。６．前記組換えベクター構成物が、ＭＨＣクラスＩ重鎖転写物の保存領域に結合するアンチセンス情報を転写する、請求項５に記載の細胞。７．前記組換えベクター構成物が、β₂−ミクログロブリン転写物を結合するアンチセンス情報を転写する、請求項５に記載の細胞。８．前記組換えベクター構成物が、PSF1輸送タンパク質転写物を結合するアンチセンス情報を転写する、請求項５に記載の細胞。９．移植片拒絶を抑制する方法において使われる、リボザイムを転写する組換えベクター構成物により形質転換された組織細胞であって、ここで前記リボザイムはＭＨＣ抗原提示を阻害することができる、前記形質転換された組織細胞。 10．前記組換えベクター構成物が、ＭＨＣクラスＩ重鎖転写物の保存領域を開裂させるリボザイムを転写する、請求項９に記載の細胞。 11．前記組換えベクター構成物が、β₂−ミクログロブリン転写物を開裂させるリボザイムを転写する、請求項９に記載の細胞。 12．前記組換えベクター構成物が、PSF1輸送タンパク質転写物を開裂させるリボザイムを転写する、請求項９に記載の細胞。 13．前記組換えベクター構成物が、トガウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、パルボウイルス科、ヘルペスウイルス科およびパラミクソウイルス科ウイルスから成る群より選択された組換えウイルスにより担持される、請求項１，５または９のいずれか一項に記載の細胞。 14．前記組換えベクター構成物が、ポリオウイルス、ライノウイルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびはしかウイルスから成る群より選択された組換えウイルスにより担持される、請求項１，５または９のいずれか一項に記載の細胞。 15．前記組換えベクター構成物がコロナウイルスにより担持される、請求項１，５または９のいずれか一項に記載の細胞。 16．前記組換えベクター構成物がシンドビスウイルスにより担持される、請求項１，５または９のいずれか一項に記載の細胞。 17．前記組換えベクター構成物が組換えウイルスベクター構成物である、請求項１，５または９のいずれか一項に記載の細胞。 18．前記組換えベクター構成物が組換えレトロウイルスベクター構成物である、請求項１，５または９のいずれか一項に記載の細胞。 19．前記組織細胞が組換えベクター構成物により生体外で形質転換される、請求項１，５または９のいずれか一項に記載の細胞。 20．移植片拒絶を抑制する方法において使われる、多価組換えベクター構成物により形質転換された組織細胞であって、ここで前記多価組換えベクター構成物はＭＨＣ抗原提示を阻害することができるタンパク質もしくはタンパク質の活性部分の発現、およびＭＨＣ抗原提示を阻害することができるアンチセンスまたはリボザイムの発現を指令する、前記形質転換された組織細胞。 21．移植片拒絶を抑制する方法において使われる、多価組換えベクター構成物により形質転換された組織細胞であって、ここで前記多価組換えベクター構成物はＭＨＣ抗原提示を阻害することができるアンチセンス情報とリボザイムの発現を指令する、前記形質転換された組織細胞。 22．移植片拒絶を抑制する方法において使われる、多価組換えベクター構成物により形質転換された組織細胞であって、ここで前記多価組換えベクター構成物はＭＨＣ抗原提示を阻害することができる２以上のタンパク質もしくは前記タンパク質の活性部分の発現、またはＭＨＣ抗原提示を阻害することができる２以上のアンチセンス情報、またはＭＨＣ抗原提示を阻害することができる２以上のリボザイムの発現を指令する、前記形質転換された組織細胞。 23．前記多価組換えベクター構成物が、E3/19KもしくはH301タンパク質または E3/19KもしくはH301タンパク質の活性部分、およびE3/19KとH301から成る群より選択された第二のタンパク質または前記第二のタンパク質の活性成分の発現を指令する、請求項22に記載の細胞。 24．前記多価組換えベクター構成物が、ＭＨＣクラスＩ重鎖の保存領域、β₂ −ミクログロブリンおよびPSF1輸送タンパク質から成る群より選択されたタンパク質の転写物に結合するアンチセンス情報を転写する、請求項20または21に記載の細胞。 25．前記多価組換えベクター構成物が２つのアンチセンス情報を転写し、ここで第一の転写されたアンチセンス情報はＭＨＣクラスＩ重鎖転写物の保存領域に結合し、そして第二の転写されたアンチセンス情報はＭＨＣクラスＩ重鎖の保存領域、β₂−ミクログロブリンおよびPSF1輸送タンパク質から成る群より選択されたタンパク質の転写物に結合する、請求項22に記載の細胞。 26．前記多価組換えベクター構成物が２つのアンチセンス情報を転写し、ここで第一の転写されたアンチセンス情報はβ₂−ミクログロブリン分子に結合し、そして第二の転写されたアンチセンス情報はＭＨＣクラスＩ重鎖の保存領域、β₂ −ミクログロブリンおよびPSF1輸送タンパク質から成る群より選択されたタンパク質の転写物に結合する、請求項22に記載の細胞。 27．前記多価組換えベクター構成物が２つのアンチセンス情報を転写し、ここで第一の転写されたアンチセンス情報はPSF1分子に結合し、そして第二の転写されたアンチセンス情報はＭＨＣクラスＩ重鎖の保存領域、β₂−ミクログロブリンおよびPSF1輸送タンパク質から成る群より選択されたタンパク質の転写物に結合する、請求項22に記載の細胞。 28．前記多価組換えベクター構成物が、ＭＨＣクラスＩ重鎖の保存領域、β₂ −ミクログロブリンおよびPSF1輸送タンパク質から成る群より選択されたタンパク質の転写物を開裂させるリボザイムを転写する、請求項20または21に記載の細胞。 29．前記多価組換えベクター構成物が２つのリボザイムを転写し、ここで第一の転写されたリボザイムはＭＨＣクラスＩ重鎖の保存領域を開裂させ、そして第二の転写されたリボザイムはＭＨＣクラスＩ重鎖の保存領域、β₂−ミクログロブリンおよびPSF1輸送タンパク質から成る群より選択されたタンパク質の転写物を開裂させる、請求項22に記載の細胞。 30．前記多価組換えベクター構成物が２つのリボザイムを転写し、ここで第一の転写されたリボザイムはβ₂−ミクログロブリン分子を開裂させ、そして第二の転写されたリボザイムはＭＨＣクラスＩ重鎖の保存領域、β₂−ミクログロブリンおよびPSF1輸送タンパク質から成る群より選択されたタンパク質の転写物を開裂させる、請求項22に記載の細胞。 31．前記多価組換えベクター構成物が２つのリボザイムを転写し、ここで第一の転写されたリボザイムはPSF1分子を開裂させ、そして第二の転写されたリボザイムはＭＨＣクラスＩ重鎖の保存領域、β₂−ミクログロブリンおよびPSF1輸送タンパク質から成る群より選択されたタンパク質の転写物を開裂させる、請求項 22に記載の細胞。 32．前記多価組換えベクター構成物が、トガウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、パルボウイルス科、ヘルペスウイルス科およびパラミクソウイルス科ウイルスから成る群より選択された組換えウイルスにより担持される、請求項20，21または22のいずれか一項に記載の細胞。 33．前記組織細胞が、骨髄細胞、膵臓島細胞、繊維芽細胞、角膜細胞および皮膚細胞から成る群より選択される、請求項１，５，９，20，21または22のいずれか一項に記載の細胞。 34．E3/19KまたはH301の発現を指令する組換えベクター構成物。 35．組換えベクター構成物であって、ＭＨＣクラスＩ重鎖の保存領域、β₂− ミクログロブリンおよびPSF1輸送タンパク質から成る群より選択されたタンパク質の転写物に結合するアンチセンス情報を転写する前記組換えベクター構成物。 36．組換えベクター構成物であって、ＭＨＣクラスＩ重鎖の保存領域、β₂− ミクログロブリンおよびPSF1輸送タンパク質から成る群より選択されたタンパク質の転写物を開裂させるリボザイムを転写する前記組換えベクター構成物。 37．ポリオウイルス、ライノウイルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびはしかウイルスから成る群より選択された組換えウイルスにより担持された組換えベクター構成物。 38．トガウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、パルボウイルス科、ヘルペスウイルス科およびパラミクソウイルス科から成る群より選択された組換えウイルスにより担持された組換えベクター構成物。 39．前記ベクター構成物が組換えウイルスベクター構成物である、請求項34〜 38のいずれか一項に記載の組換えベクター構成物。 40．前記ベクター構成物が組換えレトロウイルスベクター構成物である、請求項34〜38のいずれか一項に記載の組換えベクター構成物。 41．請求項34〜38のいずれか一項に記載の組換えベクター構成物により形質転換された組織細胞。 42．請求項39に記載の組換えウイルスベクター構成物により形質転換された組織細胞。 43．請求項40に記載の組換えレトロウイルスベクター構成物により形質転換された組織細胞。 44．請求項41〜43のいずれか一項に記載の形質転換された組織細胞と生理学的に許容される担体または希釈剤とを含んで成る医薬組成物。