WO1998031813A1 - Inhibitor für die präsentation von antigenen durch mhc-klasse i moleküle - Google Patents

Inhibitor für die präsentation von antigenen durch mhc-klasse i moleküle Download PDF

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WO1998031813A1
WO1998031813A1 PCT/EP1998/000233 EP9800233W WO9831813A1 WO 1998031813 A1 WO1998031813 A1 WO 1998031813A1 EP 9800233 W EP9800233 W EP 9800233W WO 9831813 A1 WO9831813 A1 WO 9831813A1
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polypeptide
cells
mhc class
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PCT/EP1998/000233
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Ulrich Helmut Koszinowski
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Roche Diagnostics Gmbh
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the invention relates to a gene from the mouse cytomegalovirus (MCMV), a polypeptide encoded thereby, an antibody directed against the polypeptide and the pharmaceutical application of the nucleic acid, the polypeptide and the antibody.
  • MCMV mouse cytomegalovirus
  • T cell-mediated immune response plays a central role in the defense against intracellular pathogens.
  • T cells that express otß receptors specialize in the recognition of peptides presented by MHC-encoded molecules. Proteins that are synthesized during viral gene expression are degraded in the cytosol by the proteasome. Then peptides are assembled using transporter molecules (TAP) with the heavy MHC class I chain and 32 microglobulin to form a trimeric complex.
  • TAP transporter molecules
  • This complex is then transported from the endoplasmic reticulum (ER) through the ER-Golgi-Intermediate Compartment (ERGIC) / cis-Golgi network, the middle Golgi and the Trans-Golgi (TGN) network to the plasma membrane, where the MHC complex presented the peptide for cytotoxic CD8 T cells.
  • ER endoplasmic reticulum
  • ERGIC ER-Golgi-Intermediate Compartment
  • TGN Trans-Golgi
  • DNA viruses such as smallpox viruses, herpes viruses and adenoviruses, contain genes which inhibit the development of an inflammatory reaction by influencing the complement cascade and by interaction with cytokines and interferons (Smith, Trends in Microbiol. 2 (1994), 81-88). These genes appear to be derived from the host's cellular genes and their potential function can be predicted by sequence homology. However, viruses can also influence the antigen presentation via the MHC class I mechanism by acting on proteins which are involved in the antigen presentation. No cellular homologs have yet been found for these viral genes. There is therefore a particular interest in them because they can point to previously unknown functions in cell biology.
  • Herpes viruses are able to maintain a lifelong infection despite the presence of an active immune system in the host.
  • MCMV mouse cytomegalovirus
  • the protein ICP47 acts as an inhibitor of peptide transport proteins (TAP).
  • TAP peptide transport proteins
  • the protein E3 / 19K shows a direct association with MHC class I molecules from humans, mice and rats, whereby the intracellular transport and the expression on the cell surface are strongly inhibited.
  • the international patent application WO 95/06717 discloses methods for suppressing the MHC class I antigen presentation with the aid of recombinant vectors which express the immunomodulatory gene E3 / 19K of the adenovirus or the H301 gene of the human CMV.
  • the object of the present invention was to identify new genes which influence the antigen presentation by MHC I molecules and thus act as immunomodulators.
  • the invention describes the identification, cloning and characterization of a mouse cytomegalovirus gene, designated ml52, which encodes a new polypeptide.
  • ml52 mouse cytomegalovirus gene
  • This gene was identified by microinjection of MCMV DNA fragments into cells and investigation of the surface expression of MHC I molecules.
  • the gene product of the ml52 gene significantly inhibits the surface expression of MHC I molecules. The effect has so far been demonstrated in the mouse MHC class I haplotypes H-2 d , H-2 ⁇ H-2 D and H-2 q .
  • the ml52 gene, the polypeptide encoded by it and antibodies directed against the polypeptide are suitable as diagnostic, therapeutic or preventive agents for diseases which are directly or indirectly associated with disorders of the MHC class I antigen presentation on the cell surface.
  • the gene and the polypeptide are suitable as immunomodulators for gene therapy.
  • the Rawlinson et al. discloses the DNA sequence of the murine cytomegalovirus, which is also stored in the EMBL database under the accession number U 68299. This includes the gene sequence of the ml52 gene. However, no evidence of a biological function of a putative protein encoded by this sequence is given.
  • the publication Tplile et al. J. Virol.
  • the present invention relates to a nucleic acid which codes for a polypeptide which influences the MHC class I antigen presentation, comprising:
  • the in SEQ ID No. The nucleotide sequence shown in Figure 1 contains an open reading frame of 1134 bp, which corresponds to a polypeptide with a length of 378 amino acids.
  • the amino acid sequence of this polypeptide is shown in SEQ ID No. 2 shown.
  • the polypeptide is a type I transmembrane glycoprotein with a calculated molecular mass of 42 kDa.
  • a hydrophobic region at the N-terminus corresponds to a potential signal peptide sequence with 19 amino acid residues.
  • a second hydrophobic region of 16 amino acids (position 1150-1197) is presumably used as the transmembrane segment.
  • the cytoplasmic tail has a length of 26 amino acids.
  • the luminal part containing the section essential for the function has a length of 317 amino acid residues (positions 199 to 1149) and 3 potential N-glycosylation sites.
  • the invention also comprises a nucleotide sequence which hybridizes with one of the aforementioned sequences.
  • hybridization according to the present invention is used as in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104).
  • a positive hybridization signal is observed in particular for one hour in 0.2 ⁇ SSC and 0.1% SDS at 50 ° C., preferably at 55 ° C., particularly preferably at 62 ° C. and most preferably at 68 ° C.
  • One under such washing conditions with the SEQ ID No. 1 or a nucleotide sequence hybridizing therewith in the context of the degeneration of the genetic code is a nucleotide sequence according to the invention.
  • the nucleic acid according to the invention is preferably not associated with other protein-coding nucleic acid sections from MCMV. Furthermore, the nucleic acid according to the invention is preferably operatively linked to an expression control sequence which is active in eukaryotic cells, in particular in mammalian cells.
  • the nucleotide sequence according to the invention is preferably a DNA. However, it can also be an RNA or a nucleic acid analogue. gon such as a peptide nucleic acid.
  • the nucleic acid according to the invention particularly preferably comprises a sequence which corresponds to the sequence shown in SEQ ID No. 1 nucleotide sequence shown and preferably the luminal portion thereof has a homology of more than 80%, preferably as 90% and particularly preferably more than 95%.
  • a modified nucleic acid according to the invention or a nucleic acid analog according to the invention contains at least one 12 base, preferably at least 15 base long section of the nucleic acid sequence as previously indicated.
  • Such substances are suitable as hybridization probes, antisense molecules or catalytically active ribozymes.
  • Another object of the present invention is a polypeptide encoded by a nucleic acid as indicated above.
  • This polypeptide preferably has
  • Nucleic acids according to the invention are obtainable from cytomegaloviruses, in particular from mouse cytomegaloviruses. You can use known techniques using short sections of the procedure described in SEQ ID No. 1 nucleotide sequence shown as hybridization probes and / or primers can be isolated by known methods. Furthermore, nucleic acids according to the invention can be produced by mutagenesis from naturally occurring nucleic acids or by chemical synthesis. In chemical synthesis, the usual nucleo- modified nucleotide building blocks can also be used. Nucleic acids which consist partially or completely of modified nucleotide building blocks or nucleic acids analogs such as peptidic nucleic acids whose base sequence corresponds to a nucleic acid according to the invention can be used, for example, as therapeutic agents.
  • the present invention furthermore relates to a recombinant vector which contains at least one copy of a nucleic acid according to the invention.
  • This vector can be any prokaryotic or eukaryotic vector on which the nucleic acid according to the invention is under the control of an expression signal (promoter, operator, enhancer etc.).
  • prokaryotic vectors are chromosomal vectors such as bacteriophages and extrachomosomal vectors such as plasmids, circular plasmid vectors being particularly preferred.
  • Suitable prokaryotic vectors are e.g. B. Sambrook et al. , supra, chap. 1-4.
  • the vector according to the invention is particularly preferably a eukaryotic vector, in particular a vector for mammalian cells.
  • a vector for mammalian cells are vectors suitable for gene therapy, such as retroviruses, modified adenoviruses or adeno-associated viruses.
  • retroviruses such as retroviruses, modified adenoviruses or adeno-associated viruses.
  • Such vectors are familiar to the person skilled in the field of molecular biology and gene therapy. In this connection, in particular, Sambrook et al. , supra, chap. 16 referenced.
  • the invention also relates to muteins, variants and fragments thereof. These are to be understood as sequences which differ from the one shown in SEQ ID no. By substitution, deletion and / or insertion of individual amino acids or short amino acid segments. 2 differentiate amino acid sequence shown.
  • variant includes both naturally occurring variations in individual virus strains and by recurrent binant DNA technology (especially in vitro mutagenesis with the help of chemically synthesized oligonucleotides) produces proteins that are able to influence the antigen presentation of MHC class I molecules on the surface of cells.
  • This term also includes chemically modified polypeptides which are attached to the termini and / or reactive amino acid side groups by acylation, e.g. B. acety- lation, or amidation are modified.
  • Another object of the present invention is a cell which is transformed or transfected with a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention.
  • the cell can be both a eukaryotic and a prokaryotic cell. Methods for transforming cells with nucleic acids are general prior art and therefore do not need to be explained in more detail. Examples of particularly preferred cells are eukaryotic cells, in particular animal cells and particularly preferably mammalian cells.
  • the present invention also relates to the use of the polypeptide according to the invention or fragments of this polypeptide as an immunogen for the production of antibodies.
  • Antibodies can be produced in a customary manner by immunizing experimental animals with the complete polypeptide or fragments thereof and then obtaining the resulting polyclonal antisera. According to the Köhler and Milstein method or their further developments, monoclonal antibodies can be obtained from the antibody-producing cells of the test animals in a known manner by cell fusion. Human monoclonal antibodies can also be produced by known methods. The recombinant ml52 protein or peptide fragments thereof are preferred as the immunogen.
  • Another object of the present invention is therefore an antibody against the ml52 protein or a variant thereof. of, preferably an antibody that does not cross-react with other CMV-encoded proteins.
  • the antibody is particularly preferably directed against the entire polypeptide or against a peptide sequence which corresponds to amino acids 156 to 170 of the s in SEQ ID No. 2 corresponds to the amino acid sequence shown.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition which contains, as active components, nucleic acids, modified nucleic acids or nucleic acid analogs, vectors, cells, polypeptides or antibodies as stated above.
  • the pharmaceutical composition according to the invention can furthermore contain pharmaceutically customary excipients, auxiliaries and / or additives and optionally further active components.
  • the pharmaceutical composition can be used in particular for diagnostic purposes or for the production of a therapeutic agent.
  • Use as a therapeutic agent for modulating the immune system is particularly preferred. This modulation of the immune system can be achieved by influencing, in particular by inhibiting, the antigen presentation of MHC class I molecules on the surface of cells.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is particularly suitable for applications in gene therapy, eg. B. to reduce the immunogenicity of transfected cells.
  • a nucleic acid according to the invention is incorporated in an operative linkage with an expression signal active in the intended host cell in a transfection vector suitable for gene therapy purposes. Expression of the ml52 gene product in the cell transfected with the vector enables the transfected cell to be recognized by the
  • the nucleic acid according to the invention can be introduced both in the body and extracorporeally in cells. If appropriate, the nucleic acid according to the invention can be used together with other known immunomodulatory agents which can be selected, for example, from viral MHC I inhibitors and nucleic acids coding therefor. Specific examples are the viral genes US2, US3, US11, ICP47 and E3 / 19K mentioned at the beginning and their gene products.
  • the inhibitor according to the invention is distinguished from known inhibitors by the fact that it intervenes at a very late stage in the mechanism for the presentation of antigens by the MHC class I complex on the surface of cells. This late blocking can be combined in a particularly advantageous manner with the early blocking by the inhibitors of the prior art.
  • SEQ ID No. 1 a nucleotide sequence which contains genetic information coding for the ml52 gene and
  • SEQ ID No. 2 the amino acid sequence of the ml52 gene product.
  • Figure 1 is a schematic representation of the ml52 gene of the mouse cytomegalovirus.
  • the first line shows the Hind III restriction map of the 230 kb MCMV genome.
  • the second line shows the position of the Hind III fragment E and the direction of transcription of the ml52 gene (bold arrow) and a number of related genes (small arrows).
  • the position of the EcoRI fragment O is indicated by open triangles.
  • the third line shows a schematic representation of the ml52 orf with the signal peptide SP, branch symbols for glycosylation sites, the transmembrane region TM and the cytoplasmic tail CT.
  • Below is the amino acid sequence of the ml52 orf shows.
  • the signal peptide, the glycosylation sites and the transmembrane region are printed in bold.
  • the peptide sequence used to make a rabbit antiserum is underlined.
  • B12 fibroblasts were mock-infected or with MCMV, the MCMV deletion mutant ⁇ MS94.5, which lacks the region coding for ml52 (Thael et al., J. Virol. 69
  • gp40 and gp37 are two different glycosylated forms of the ml52 gene product.
  • Mock-infected or MCMV-infected B12 cells were incubated with tunicamycin, an inhibitor of N-glycosylation.
  • the cells were labeled with 35 S for one hour and gp40 / gp37 was immunoprecipitated with the rabbit 7 anti-gp40 antiserum.
  • the proteins were separated by 10% SDS-PAGE.
  • gp40 has a short half-life and acquires Endo H resistance.
  • B52 cells infected with ml52 vaccinia were pulse-labeled with [ 35 S] methionine for 4 h after infection for 30 min.
  • gp40 / gp37 was immunoprecipitated with the rabbit 7 anti-gp40 antiserum and subjected to an Endo H cleavage.
  • the proteins were analyzed by 10% SDS-PAGE.
  • Figure 4 shows that ml52 prevents MHC class I surface expression and antigen presentation.
  • ml52 gene expression reduces the plasma membrane expression of newly synthesized MHC class I molecules, but not of CD44 (Pgp-1).
  • Mouse L cells (H-2 k) of a steroid-inducible promoter were transfected with the ML52 gene under control, were either mock-treated or with dexamethasone for
  • MCMV ml52 blocks the antigen presentation by MHC class I molecules.
  • BALB / c fibroblasts were infected with pp89-Vac alone, with pp89-Vac and either wild-type Vac or ml52-Vac.
  • the controls were mock infected.
  • the presentation of the pp89 peptides was tested by H-2L d restricted cytotoxic lymphocytes, which are specific for the nonapeptide of pp89 at the specified effector / target cell ratios (E / T) in a 4 h 51 Cr release test.
  • Figure 5 shows that ml52 prevents the maturation of newly synthesized mouse MHC class I molecules.
  • B12 cells were infected with MCMV, wild-type vaccinia or ml52-Vac. The controls were mock infected. At 4 hours after infection, the cells were pulse-labeled with [ 35 S] methionine for 1 h and newly synthesized molecules were chased for 2 h. Cell lysates were prepared and K d complexes were precipitated with a mixture of the monoclonal antibodies SF 1.1.1 and MA 215. The precipitates were divided and aliquots were either digested with Endo H or sham before they were separated by 13% SDS-PAGE.
  • FIG. 6 shows the retention of MHC class I molecules in the ERGIC / cis-Golgi compartment of MCMV-infected cells.
  • Infected (aj) and sham infected (k-1) B12 cells were fixed with paraformaldehyde and permeabilized with detergent before double labeling with rabbit anti-gp40 (a) and Mouse anti-PDI antibody (b) was carried out.
  • the cells were incubated with FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG and rhodium-conjugated anti-mouse IgG.
  • the subcellular distribution of K d molecules (c, e, g and j) was compared with the distribution of BiP, p58 (f), Manll (i) and gp40 (h). Mock-infected cells were stained for K d (l) and Manll (k).
  • Figure 7 shows that the cytoplasmic tail of ml52 / gp40 is not required for the retention of MHC class I molecules.
  • LL d cells were infected with wild-type vaccinia, ml52-Vac and ml52 ⁇ ct-Vac. 4 hours after infection, the cells were pulse-marked for 1 hour and subjected to a chase treatment for 6 hours.
  • the ml52 and ml52 ⁇ ct proteins were precipitated with the peptide antiserum against gp40 (a).
  • MHC class I molecules were precipitated with antibodies against H-2L d (b). The precipitates were divided and a fraction was incubated with Endo H before analysis by reducing 10% SDS-PAGE.
  • MCMV strain Smith (ATCC VR-194) was grown according to standard methods in tissue culture.
  • the open reading frame of the ml52 gene was cloned into the polylinker of the pBK-CMV expression vector (Stratagene, La Jolla, USA) under the control of the HMCV immediate early enhancer promoter.
  • the primers were as follows: forward primer 5'- CGC GGG GGA TCC GGT CTC CCG ATC GCT AGC-3 '; Reverse primer 5'-CGC GGG AAG CTT GGT CGC ACG AAC ATC ACC-3 '.
  • the PCR product was cloned using the 5'-BamHI and 3 'HindIII restriction sites, thereby obtaining a 1,200 bp recombinant ml52 gene.
  • the gene sequence was further cloned via the 5'-BamHI and the 3'-SmaI restriction sites into the BamHI and EcoRV sites of the plasmid p7.5K131 (Schlicht H.-J. and Schaller HJ Virol 63 (1989) 5399-5404) .
  • This construct was then used to produce a recombinant vaccinia virus after homologous recombination with the Copenhagen vaccinia strain.
  • the expression of the ml52 gene in the vaccinia virus is carried out under the control of the Vaccinia 7.5K promoter.
  • Recombinant vaccinia viruses ml52-Vac which express the ml52 gene, were selected by infection with HU TK-143 cells (American Type Culture Collection CRL-8303 (£ 143B tk-)).
  • the reverse primer: 5 '-CGC GGG AAG CTT TTA TCA CTT CAC CAG ATA CAT-3' was used to generate the ml52 gene with a deletion of the sequence coding for the cytoplasmic tail.
  • the subsequent cloning to generate the recombinant vaccinia virus ml52 ⁇ cyt-Vac was as described above.
  • the protein encoded by the mutated gene ends at position 353 after the lysine residue.
  • the ml52 gene was cloned into the plasmid pBK-CMV and further into the 5'-SacI and 3'-HindIII sites of the vector pGRE5-1 (Mader et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (1993) , 5603-5607).
  • This construct was cotransfected into L cells with a bacterial plasmid which carries the neo r resistance gene.
  • NIH 3T3 cells (American Type Culture Collection CRL-1658) were infected with MCMV at an infection multiplicity of 10.
  • Cellular RNA was isolated at various times after infection.
  • Total RNA (5 ⁇ g) was electrophoresed according to standard protocols over 0.9% formaldehyde agarose gels. The RNA was blotted onto a nylon membrane (Quiabrane; Quiagen, Wegen, Germany).
  • a defined RNA transcript which is identical to the complete coding strand of the ml52 gene, was generated using an in vitro transcription system (Promega) on a template which was obtained by cloning the ml52 gene into the transcription vector pGEM-3Z (Promega, Madison, USA) was received.
  • Complete cDNA from the mouse ⁇ -Aktingen (Stratagene), labeled with [ ⁇ - 32 P] dCTP by using a random primer labeling system (Stratagene) was used as the standard RNA.
  • subclone B12 of an immortalized cell line from BALB / c fibroblasts was cultivated in Dulbecco's modified Eagl's medium with 10% (vol / vol) fetal calf serum .
  • Another subclone C12 was used to produce target cells.
  • NIH 3T3 cells were used to analyze the transcription kinetics of MCMV genes.
  • IT KOP B27 cells a subclone of the Th cell line IT 22 isolated from Swiss 3T3 cells (Arnold et al., Cell 38 (1984) 79-87) and transfected with the human class I allele B27, was developed by Dr. B.
  • LC-5-K d is a subcell line of the human cell line LC-5 (Meliert et al., AIDS 4 (1990) 527-535), which is transfected with the mouse class I allele Kd and was developed by Dr. Erfle (Society for Radiation Research, Kunststoff, Germany).
  • the L-ml52 transfectants were propagated in the presence of 0.5 mg / ml G-418 and induced with 25 nM dexamethasone 24 h before harvest.
  • the cells were sown on cellocates (Eppendorf, Hamburg, Germany) and used the method of Tplile et al. (1995), injected supra with plasmid DNA and stained with antibodies specific for the K d allele.
  • the injected cells were incubated for 24 h at 37 ° C. and 5% CO 2 and stained by indirect immunofluorescence.
  • Infected target cells were treated with trypsin and labeled with Na 2 51 Cr0 4 for 90 min.
  • a four-hour standard cytolytic assay was then carried out with 10 3 target cells per well and variable numbers of effector cells (Del Val et Al., J. Virol. 62 (1988), 3965-3972). The data given represent the mean percentage of the specific lysis of 3 replicate cultures.
  • the cells were labeled with [ 35 S] methionine (1,200 Ci / mmol, Amersham, Braunschweig, Germany) in a concentration of 300 ⁇ Ci / ml at 37 ° C. for 60 min and in the presence of 10 mM unlabeled methionine as in Del Val et al. , J. Exp. Med. 176 (1992) 729-738).
  • Tunicamycin (5 ⁇ g / l), an inhibitor of N-linked glycosylation, was added 45 min before and during the 35 S-labeling.
  • Cell lysates were pre-cleaned by adding anti-actin and rabbit anti-mouse IgG. Immune complexes were immobilized with Protein A-Sepharose.
  • lysates were incubated twice with Protein A-Sepharose. Digestion with endoglycosidase H (Endo H; Boehringer, Mannheim, Germany) was carried out according to the method of Del Val et al. , (1992), supra.
  • Nylon filters (Immobilon P; Boehringer) were used for protein blots. The membrane was blocked overnight with a blocking reagent at + 4 ° C. and the binding of the primary antibody was visualized by peroxidase-conjugated sheep anti-rabbit IgG and chemiluminescence (Boehringer).
  • Trypsinized L-ml52 transfectants expressing the ml52 gene were sham-treated or induced with 25 nM dexamethasone for 24 h.
  • the cells were washed with PBS (2% fetal calf serum, 0.3% NaN 3 ) and labeled with the monoclonal anti-K k antibody H100.27.55.
  • Bound antibodies were anti-mouse antibodies by adding FITC-conjugated goat
  • gp40 was detected by a polyclonal rabbit antiserum which had been generated against a synthetic peptide from the luminal part of the viral protein.
  • the following monoclonal and polyclonal antibodies were used for the intracellular localization of gp40 and MHC class I molecules: monoclonal antibody SF1-1.1 (anti-Kd, Pharmingen), polyclonal rabbit anti-GRP-78 serum (anti-BiP, Affinity Bioreagents, Golden , Co.) monoclonal antibody 1D3 (anti-PDI, Tooze et al., J. Cell. Biol. 109 (1989), 35-50), antibody against p58 (Saraste et al., J. Cell. Sci. 100 ( 1991), 415-430) and antibodies against mannosidase II (Moremen et al., J. Biol. Chem. 266 (1991), 16876-16885).
  • Double immunofluorescence was carried out by incubating the cells with primary antibodies in the same medium for 45 min. After thorough washing with PBS, the cells were incubated again in 0.2% gelatin and stained with 2% second antibodies, FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG (Dianova) and rhodamine-conjugated goat anti-mouse IgG (Dianova) for 45 min . After washing with PBS, the slides were applied to glass frames with Histogel (Camon). The cells were analyzed with a confocal laser scanning microscope (Leitz DM IRB, scanner: Leica TCS 4D). 2 results
  • the internal EcoRI fragment O within the HindII fragment E (FIG. 1) was cleaved with a number of restriction enzymes and the DNA fragments were injected into cells. After MCMV EcoRI O DNA was cleaved with Xbal, no effect on the MHC class I distribution was found, while cells into which Smal digested DNA was injected showed an intracellular accumulation of MHC complexes. Only one of the open reading names within the EcoRI O fragment is split by Xbal, but not by Smal. This open reading frame was selectively cloned into an expression vector. The expression vector was micro-injected into cells, whereby an intracellular accumulation of H-2K d was found in the micro-injected cells. The gene had the SEQ ID No.
  • ml52 1 nucleotide sequence shown and was designated ml52.
  • the open reading frame of ml52 (1137 bp) codes for a protein with 378 amino acids, the sequence of which is shown in SEQ ID No. 1 and 2 is shown. It didn't significant nucleotide sequence homology to any known gene sequence found.
  • amino acid sequence encoded by the ml52 gene corresponds to a type I transmembrane glycoprotein with a molecular weight of 42 kDa (FIG. 1, center).
  • a hydrophobic region at the N-terminus represents a potential signal peptide sequence of 19 amino acid residues.
  • a second hydrophobic region of 17 amino acids presumably serves as a transmembrane segment.
  • the luminal portion of approximately 317 amino acid residues has three potential N-glycosylation sites.
  • a recombinant vaccinia virus ml52-Vac was produced which contains the ml52 gene from MCMV. Proteins from ml52-Vac infected cells were compared with proteins from MCMV-infected cells by a Western blot (FIG. 3a). In both cases the expression of proteins with an apparent molecular mass of 40 or 37 kDa was found.
  • tunicamycin which inhibits the de novo synthesis of N-linked oligosaccharides
  • MCMV-infected cells resulted in the fact that only a single protein band with approximately 34 kDa appeared (FIG. 3b). This indicates that gp40 and gp37 represent different glycosylated forms of the ml52 gene product.
  • the antigen presentation was significantly reduced. Forty times the number of effector cells were required to achieve a similar level of specific lysis. Thus, the expression of the isolated pg40 protein from MCMV is sufficient to block the antigen presentation.
  • the K d molecules remained in the somewhat faster migrating form, which can be cleaved by Endo H and is typical of ER / cis-Golgi-localized glycoproteins. Endo H sensitive MHC class I molecules remained stable for more than 6 h. This result showed that the isolated ml52 gene prevented the transport of the MHC complex.
  • the intracellular localization of gp40 and MHC class I complexes was examined by confocal microscopy on MCMV-infected cells.
  • An affinity-purified rabbit antiserum (see 2.1) was used to detect gp40.
  • a monoclonal antibody against K d was used to detect MHC class I complexes.
  • B12 cells were either certified (Fig. 6k and 1) or infected with MCMV (Fig. 6a-j) for 5 h.
  • the double staining of gp40 and protein disulfide isomerase (Tooze et al (1989), supra) as ER marker in infected cells showed a punctiform distribution of the viral protein.
  • the adenovirus E3 / 19K protein binds to class I alleles from humans and from the mouse (Signas et al., Nature 299 (1982), 175). It blocks the surface expression of all HLA molecules and three of seven murine MHC alleles tested.
  • H-2 d human cells transfected with the mouse class I allele H-2K d
  • the mouse MHC molecules were sensitive to gp40, whereas endogenous human class I alleles were not subject to a transport block.
  • HLA-B27 in a mouse cell line was not found to have an effect of gp40 on the human allele when the cotransfection of the human class I alley was stable, while the endogenous mouse class I alleles were sensitive.
  • gp40 is able to induce MHC retention in both mouse cells and human cells. However, it does not affect the human HLA-B27 allele.
  • cytoplasmic tail of gp40 is not essential for retention
  • a Deletion mutant made without the 25 C-terminal amino acid residues.
  • the deletion mutant was produced by a recombinant vaccinia virus and showed the expected faster mobility in gels (Fig. 7a).
  • the deleted protein like the complete gp40, was able to retain MHC class I molecules (FIG. 7b).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Gen aus dem Maus Cytomegalovirus (MCMV), ein davon codiertes Polypeptid, einen gegen das Polypeptid gerichteten Antikörper sowie die pharmazeutische Anwendung der Nucleinsäure, des Polypeptids und des Antikörpers.

Description

Inhibitor für die Präsentation von Antigenen durch MHC-Klasse I Moleküle
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Gen aus dem Maus Cytomegalovirus (MCMV) , ein davon codiertes Polypeptid, einen gegen das Polypeptid gerichteten Antikörper sowie die pharmazeutische Anwen- düng der Nucleinsäure, des Polypeptids und des Antikörpers.
Die T-Zell vermittelte Immunantwort spielt eine zentrale Rolle bei der Abwehr intrazellulärer Pathogene. T-Zellen, die otß- Rezeptoren exprimieren, sind auf die Erkennung von Peptiden spezialisiert, die durch MHC-codierte Moleküle präsentiert werden. Proteine, die während der viralen Genexpression synthetisiert worden sind, werden im Cytosol durch das Proteasom abgebaut . Dann werden Peptide mit Hilfe von Transportermolekülen (TAP) mit der schweren MHC-Klasse I Kette und 32-Mikroglo- bulin assembliert, um einen trimeren Komplex zu bilden. Dieser Komplex wird dann aus dem endoplasmatisehen Reticulum (ER) durch das ER-Golgi-Intermediat Compartment (ERGIC) /cis-Golgi Netzwerk, das mittlere Golgi- und das Trans-Golgi (TGN) Netzwerk) zur Plasmamembran transportiert, wo der MHC Komplex das Peptid für cytotoxische CD8 T-Zellen präsentiert.
Während der Coevolution und mit ihren Wirten haben Viren Mech- nismen der Anpassung an das Immunsystem entwickelt. Einige Viren können trotz einer starken Immunreaktion persistieren. DNA-Viren, wie Pockenviren, Herpesviren und Adenoviren, enthalten Gene, welche das Entstehen einer Entzündungsreaktion durch Beeinflussung der Komplementkaskade und durch Wechselwirkung mit Cytokinen und Interferonen hemmen (Smith, Trends in Microbiol. 2 (1994) , 81-88) . Diese Gene scheinen von zellu- lären Genen des jeweiligen Wirts abzustammen, und durch Sequenzhomologie kann ihre potentielle Funktion vorhergesagt werden. Viren können jedoch auch die Antigenpräsentation über den MHC- Klasse I Mechanismus beeinflussen, indem sie auf Proteine, die bei der Antigenpräsentation beteiligt sind, einwirken. Für diese viralen Gene sind bisher noch keine zellulären Homologe gefunden worden. Somit besteht an ihnen ein besonderes Interesse, weil sie auf bislang noch unbekannte Funktionen in der Zellbiologie hinweisen können.
Herpesviren sind in der Lage, trotz des Vorhandenseins eines aktiven Immunsystems im Wirt eine lebenslange Infektion aufrechtzuerhalten. Der Befund, daß die Präsentation eines viralen Antigens von Maus Cytomegalovirus (MCMV) , einem -Herpes- virus, während der Phasen der Replikationskaskade stark reguliert ist (Reddehase et al . , J. Virol . 60 (1986), 1125-1129; Del Val et al . , Cell 58 (1989), 505-315) führte zu der Erkenntnis, daß die frühen MCMV-Gene die Expression von MHC- Klasse I Molekülen regulieren (Del Val et. al . , J. Exp. Med. 176 (1992), 729-738; Campbell & Slater, J. Virol. 68 (1994) 1805-1811) . Auch beim humanem Cytomegalovirus (Beersma et al . J. Im unol . 151 (1993), 4455-4464; Yamashita et al . , Virology 193 (1993), 727-736; Warren et al., J. Virol. 68 (1994), 2822- 2829) und beim Herpes Simplex Virus Typ I (York et al . , Cell 77 (1994) , 525-535) konnte eine Hemmung der Antigenrepräsenta- tion durch MHC-Klasse I Moleküle gezeigt werden.
Aus dem humanen Cytomegalovirus sind mehrere Genprodukte bekannt, welche als Inhibitoren von MHC-Klasse I Molekülen wirken. Beispiele sind die Genprodukte US3 , US11 und US2 (siehe z. B. Jones et al . , Proc . Natl . Acad. Sei. USA 93 (1996) 11327-11333; Jones et. al . , J. Virol. 69 (1995), 4830-4841; Wiertz et al . Cell 84 (1996), 769-779). Aus dem Herpes-Simplex Virus Typ I ist das Protein ICP147 (McGeoch et al . , J. Mol. Biol . 181 (1985), 1-13) bekannt, welches ebenfalls die Antigenpräsentation durch MHC-Klasse I Moleküle inhibiert (York et al., Cell. 77 (1994), 525-535; Früh et al . Nature 375 (1995), 415-418) . Das Protein ICP47 wirkt als Inhibitor von Peptid- transportproteinen (TAP) . Aus Adenoviren ist schließlich das Protein E3/19K bekannt, welches die schweren Ketten von MHC- Klasse I Transplantationsantigenen aus Mensch und Maus bindet (vgl. z. B. Signas et al . , Nature 299 (1982), 175-178; Burgert et al., Proc. Natl . Acad. Sei. USA 84 (1987), 1356-1360; Ta- naka & Tevrethia, Virology 165 (1988) , 357-366; Jefferies & Burgert, J. Exp . Med. 172 (1990), 1653-1664; Hermiston et al . , J. Virol. 67 (1993), 5289-5298). Das Protein E3/19K zeigt eine direkte Assoziation mit MHC-Klasse I Molekülen von Mensch, Maus und Ratte, wodurch der intrazelluläre Transport und die Expression an der Zelloberfläche stark inhibiert werden. Die internationale Patentanmeldung WO 95/06717 offenbart Verfahren zur Unterdrückung der MHC-Klasse I Antigen-Präsentation mit Hilfe von rekombinanten Vektoren, die das immunmodulatorische Gen E3/19K des Adenovirus bzw. das H301 Gen des humanen CMV exprimieren.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, neue Gene zu identifizieren, welche die Antigenpräsentation durch MHC I Moleküle beeinflussen und somit als Immunmodulatoren wirken.
Die Erfindung beschreibt die Identifizierung, Klonierung und Charakterisierung eines Gens aus Maus Cytomegalovirus, das als ml52 bezeichnet wird und für ein neues Polypeptid codiert. Identifiziert wurde dieses Gen durch Mikroinjektion von MCMV DNA Fragmenten in Zellen und Untersuchung der Oberflächenexpression von MHC I -Molekülen. Das Genprodukt des ml52 Gens bewirkt eine signifikante Inhibierung der Oberflächenexpression von MHC I Molekülen. Die Wirkung konnte bisher bei dem Maus MHC Klasse I Haplotypen H-2d, H-2\ H-2D und H-2q nachgewiesen werden. Das ml52 Gen, das davon codierte Polypeptid sowie gegen das Polypeptid gerichtete Antikörper sind als diagnostische, therapeutische oder präventive Mittel für Er- krangungen geeignet, die mit Störungen der MHC-Klasse I Anti- genprasentation an der Zelloberfläche direkt oder indirekt assoziert sind. Insbesondere sind das Gen und das Polypeptid als Immunmodulatoren für die Gentherapie geeignet. Die Pulikation von Rawlinson et al . (J. Virol. 70 (1996), 8833-8849) offenbart die DNA-Sequenz des murinen Cytomegalovirus, die auch in der EMBL Datenbank unter der Zugriffsnummer (accession number) U 68299 hinterlegt ist. Dies schließt die Gensequenz des ml52 Gens ein. Es sind jedoch keinerlei Hinweise auf eine biologische Funktion eines mutmaßlichen, von dieser Sequenz codierten Proteins angegeben. Die Veröffentlichung Thäle et al . (J. Virol. 69 (1995), 6098-6105) beschreibt die grobe Lokalisation des MCMV ml52 Gens innerhalb einer 15,8 kb langen DNA-Sequenz, deren Deletion aus dem viralen Genom zur teilweisen Wiederherstellung der MHC-Klasse I Antigenpräsentation führte. Das Dokument von Ziegler et al . (Immunity 6 (1997) 57-66) wurde am 29.01.1997 nach dem Anmeldetag der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht und offenbart den Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nucleinsäu- re, welche für ein die MHC-Klasse I Antigenpräsentation beein- flussendes Polypeptid codiert, umfassend:
(a) die in SEQ ID No . 1 dargestellte Nucleotidsequenz mindestens im Bereich zwischen den Nucleotiden 199 und 1149,
(b) eine der Sequenz aus (a) oder/ und (b) im Rahmen der Degeneration des genetischen oder entsprechende Nucleotidsequenz oder
(c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter strin- genten Bedingungen hybridisierende Nucleotidsequenz,
Die in SEQ ID No. 1 dargestellte Nucleotidsequenz enthält einen offenen Leserahmen von 1134 bp, der einem Polypeptid mit einer Länge von 378 Aminosäuren entspricht. Die Aminosäuresequenz dieses Polypeptids ist in SEQ ID No. 2 dargestellt. Das Polypeptid ist ein Typ I Transmembranglykoprotein mit einer berechneten Molekularmasse von 42 kDa. Eine hydrophobe Region am N-Terminus entspricht einer potentiellen Signalpeptidse- quenz mit 19 Aminosäureresten. Eine zweite hydrophobe Region von 16 Aminosäuren (Position 1150-1197) dient vermutlich als Transmembransegment. Der cytoplasmatische Schwanz hat eine Länge von 26 Aminosäuren. Der den für die Funktion wesentlichen Abschnitt enthaltende luminale Teil hat eine Länge von 317 Aminosäureresten (Position 199 bis 1149) und 3 potentielle N- Glykosilierungsstellen.
Neben der in SEQ ID No . 1 gezeigten Nucleotidsequenz und einer dieser Sequenz im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nucleotidsequenz umfasst die Erfindung auch noch eine Nucleotidsequenz, die mit einer der zuvor genannten Sequenzen hybridisiert. Der Begriff "Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird wie bei Sambrook et al . (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104) verwendet. Vorzugsweise spricht man von einer stringenten Hybridisierung, wenn nach Waschen für eine Stunde mit 1 x SSC und 0,1% SDS bei 50°C, vorzugsweise bei 55°C, besonders bevorzugt bei 62°C und am meisten bevorzugt bei 68°C, insbesondere für eine Stunde in 0,2x SSC und 0,1% SDS bei 50°C, vorzugsweise bei 55°C, besonders bevorzugt bei 62 °C und am meisten bevorzugt bei 68 °C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Eine unter derartigen Waschbedingungen mit der für SEQ ID No. 1 gezeigten Nucleotidsequenz oder einer damit im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nucleotidsequenz hybridisierende Nucleotidsequenz ist eine erfindungsgemäße Nucleotidsequenz.
Die erfindungsgemäße Nucleinsäure ist vorzugsweise nicht asso- ziiert mit anderen Protein-codierenden Nucleinsäureabschnitten aus MCMV. Weiterhin ist die erfindungsgemäße Nucleinsäure vorzugsweise in operativer Verknüpfung mit einer Expressions- kontrollsequenz, die in eukaryontisehen Zellen, insbesondere in Säugerzellen wirksam ist.
Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Nucleotidsequenz eine DNA. Sie kann jedoch auch eine RNA oder ein Nucleinsäureanalo- gon wie etwa eine peptidische Nucleinsäure umfassen. Besonders bevorzugt umfasst die erfindungsgemäße Nucleinsäure eine Sequenz, die zu der in SEQ ID No . 1 dargestellten Nucleotidsequenz und vorzugsweise dem luminalen Abschnitt davon eine Homologie von mehr als 80%, vorzugsweise als 90 % und besonders bevorzugt mehr als 95 % aufweist.
Eine erfindungsgemäße modifizierte Nucleinsäure oder ein er- findungsgemäßes Nucleinsäureanalogon enthält mindestens einen 12 Basen, vorzugsweise mindestens 15 Basen langen Abschnitt der Nucleinsäuresequenz wie zuvor angegeben. Solche Substanzen sind als Hybridisierungssonden, Antisense-Moleküle bzw. kata- lytisch aktive Ribozyme geeignet.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein von einer Nucleinsäure wie oben angegeben codiertes Polypeptid. Dieses Polypeptid weist vorzugsweise
a) die in SEQ ID No. 2 dargestellte Aminosäuresequenz minde- stens im Bereich zwischen den Aminosäuren 20 und 337,
b) eine mehr als 70 %, vorzugsweise mehr als 80 % und besonders bevorzugt mehr als 90 % zur Sequenz aus (a) homologe Aminosäuresequenz oder/und
c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) immunologisch kreuzreaktive Aminosäuresequenz auf.
Erfindungsgemäße Nucleinsäuren sind aus Cytomegaloviren, ins- besondere aus Maus-Cytomegaloviren erhältlich. Sie können nach bekannten Techniken unter Verwendung kurzer Abschnitte der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nucleotidsequenz als Hybridisierungssonden oder/und Primer nach bekannten Methoden isoliert werden. Weiterhin können erfindungsgemäße Nucleinsäuren durch Mutagenese aus natürlich vorkommenden Nucleinsäuren oder durch chemische Synthese hergestellt werden. Bei der chemischen Synthese können gegebenenfalls anstelle der üblichen Nucleo- tidbausteine auch modifizierte Nucleotidbausteine eingesetzt werden. Nucleinsäuren, die teilweise oder vollständig aus modifizierten Nucleotidbausteinen bestehen oder Nucleinsäuren- analoga wie etwa peptidische Nucleinsäuren, deren Basensequenz einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure entspricht, können beispielsweise als therapeutische Mittel eingesetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinanter Vektor, der mindestens eine Kopie einer erfin- dungsgemäßen Nucleinsäure enthält . Dieser Vektor kann ein beliebiger prokaryontischer oder eukaryontischer Vektor sein, auf dem sich die erfindungsgemäße Nucleinsäure unter Kontrolle eines Expressionssignals (Promotor, Operator, Enhancer etc.) befindet. Beispiele für prokaryontische Vektoren sind chromo- somale Vektoren wie etwa Bakteriophagen und extrachomosomale Vektoren wie etwa Plasmide, wobei zirkuläre Plasmidvektoren besonders bevorzugt sind. Geeignete prokaryontisehen Vektoren sind z. B. bei Sambrook et al . , supra, Kap. 1-4 beschrieben.
Besonders bevorzugt ist der erfindungsgemäßer Vektor ein eukaryontischer Vektor, insbesondere ein Vektor für Säugerzellen. Besonders bevorzugte Vektoren sind für die Gentherapie geeignete Vektoren wie etwa Retroviren, modifizierte Adenoviren oder Adeno-assoziierte Viren. Derartige Vektoren sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie und Gentherapie geläufig. Insbesondere wird in diesem Zusammenhang auf Sambrook et al . , supra, Kap. 16 verwiesen.
Neben dem in SEQ ID No. 2 dargestellten Polypeptid betrifft die Erfindung auch Muteine, Varianten und Fragmente davon. Darunter sind Sequenzen zu verstehen, die sich durch Substitution, Deletion oder/und Insertion einzelner Aminosäuren oder kurzer Aminosäureabschnitte von der in SEQ ID No. 2 dargestellten Aminosäurensequenz unterscheiden.
Unter den Begriff "Variante" fallen sowohl natürlich vorkommende Variationen in einzelnen Virenstämmen sowie durch rekom- binante DNA Technologie (insbesondere in vitro Mutagenese mit Hilfe von chemisch synthetisierten Oligonucleotiden) erzeugte Proteine, die in der Lage sind, die Antigenpräsentation von MHC-Klasse I Molekülen an der Oberfläche von Zellen zu beein- flussen. Ebenfalls fallen unter diesen Begriff auch chemisch modifizierte Polypeptide, die an den Termini oder/und reaktiven Aminosäurenseitengruppen durch Acylierung, z. B. Acetylie- rung, oder Amidierung modifiziert sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert, bzw. transfiziert ist. Die Zelle kann sowohl eine eukaryontische als auch eine pro- karyontische Zelle sein. Verfahren zur Transformation von Zel- len mit Nucleinsäuren sind allgemeiner Stand der Technik und brauchen daher nicht näher erläutert zu werden. Beispiele für besonders bevorzugte Zellen sind eukaryontische Zellen, insbesondere tierische Zellen und besonders bevorzugt Säugerzellen.
Ebenfalls ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids oder Fragmenten dieses Polypeptids als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern. Die Herstellung von Antikörpern kann dabei auf übliche Weise durch Immunisierung von Versuchstieren mit dem vollständigen Polypeptid oder Fragmenten davon und anschließende Gewinnung der resultierenden polyklonalen Antiseren erfolgen. Nach der Methode von Köhler und Milstein oder deren Weiterentwicklungen können aus den Antikörper-produzierenden Zellen der Versuchstiere auf bekannte Weise durch Zellfusion monoklo- nale Antikörper erhalten werden. Ebenso können nach bekannten Methoden humane monoklonale Antikörper hergestellt werden. Als Immunogen bevorzugt sind das rekombinante ml52 Protein oder Peptidfragmente hiervon.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Antikörper gegen das ml52 Protein oder eine Variante da- von, vorzugsweise ein Antikörper, der keine Kreuzreaktion mit anderen CMV-codierten Proteinen zeigt. Besonders bevorzugt ist der Antikörper gegen das gesamte Polypeptid oder gegen eine Peptidsequenz gerichtet, die den Aminosäuren 156 bis 170 der s in SEQ ID No. 2 dargestellten Aminosäuresequenz entspricht.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Komponenten Nucleinsäuren, modifizierte Nucleinsäuren oder Nucleinsäurenanaloga, Vekto- 0 ren, Zellen, Polypeptide oder Antikörper wie zuvor angegeben, enthält .
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann weiterhin pharmazeutisch übliche Träger-, Hilfs- oder/und 5 Zusatzstoffe sowie gegebenenfalls weitere aktive Komponenten enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann insbesondere für diagnostische Zwecke oder zur Herstellung eines therapeutischen Mittels eingesetzt werden. Besonders bevorzugt ist die Verwendung als therapeutisches Mittel zur Modulation 0 des Immunsystems. Diese Modulation des Immunsystems kann durch Beeinflussung, insbesondere durch Inhibierung, der Antigenpräsentation von MHC-Klasse I Molekülen an der Oberfläche von Zellen erreicht werden.
5 Aufgrund der immunmodulatorisehen Eigenschaften des ml52 Genprodukts eignet sich die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung insbesondere für Anwendungen in der Gentherapie, z. B. zur Verringerung der Immunogenität von transfizierten Zellen. Hierzu wird eine erfindungsgemäße Nucleinsäure in 0 operativer Verknüpfung mit einem in der vorgesehenen Wirtszelle aktiven Expressionssignal in einen für gentherapeutische Zwecke geeigneten Transfektionsvektor eingebaut. Durch Expression des ml52 Genprodukts in der mit dem Vektor transfizierten Zelle wird eine Erkennung der transfizierten Zelle durch das
35 Immunsystem verhindert oder doch zumindest verringert . Die erfindungsgemäße Nucleinsäure kann sowohl im Körper als auch extrakorporeal in Zellen eingebracht werden. Gegebenenfalls kann die erfindungsgemäße Nucleinsäure zusammen mit anderen bereits bekannten immunmodulatorisch wirkenden Mitteln eingesetzt werden, die beispielsweise ausgewählt sein können aus viralen MHC I Inhibitoren und dafür codierenden Nucleinsäuren. Spezifische Beispiele sind die eingangs genannten viralen Gene US2 , US3, US11, ICP47 und E3/19K sowie deren Genprodukte .
Dabei zeichnet sich der erfindungsgemäße Inhibitor gegenüber bekannten Inhibitoren dadurch aus, daß er in einem recht späten Stadium in den Mechanismus zur Präsentation von Antigenen durch den MHC-Klasse I Komplex an der Oberfläche von Zellen eingreift. Diese späte Blockierung kann auf besonders vorteilhafte Weise mit den frühen Blockierungen durch die Inhibitoren des Standes der Technik kombiniert werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Sequenzprotokolle näher erläutert:
Es zeigen:
SEQ ID No. 1. eine Nucleotidsequenz, die für das ml52 Gen codierende genetische Information enthält und
SEQ ID No. 2 die Aminosäuresequenz des ml52 Gen Produkts.
Die beigefügten Figuren 1 bis 7 sind wie folgt:
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des ml52 Gens des Maus-Cytomegalovirus . In der ersten Zeile ist die Hind III Restriktionskarte des 230 kb MCMV Genoms gezeigt. Die zweite Zeile zeigt die Position des Hind III Fragments E und die Transkriptionsrichtung des ml52 Gens (fetter Pfeil) und einer Anzahl verwandter Gene (kleine Pfeile) . Die Position des EcoRI Fragments O ist durch offene Dreiecke gekennzeichnet. Die dritte Zeile zeigt eine schematische Darstellung des ml52 orf mit dem Signalpeptid SP, Zweigsymbolen für Glykosilierungs- stellen, der Transmembranregion TM und dem cytoplasmatischen Schwanz CT. Unten ist die Aminosäuresequenz des ml52 orf ge- zeigt. Fettgedruckt sind das Signalpeptid, die Glykosilie- rungsstellen und die Transmembranregion. Die zur Herstellung eines Kaninchenantiserums verwendete Peptidsequenz ist unterstrichen.
Ganz unten ist ein Hydrophilizitatsblot der vorhergesagten Sequenz gezeigt.
Fig. 2 zeigt die Expression des ml52 Gens während des Replika- tionszyklus von MCMV.
a) ml52 RNA Transkriptionskinetik. RNA wurde aus MCMV infizierten und scheininfizierten Fibroblasten zu den angegebenen Zeiten isoliert. Die Northern Blot Analyse wurde unter Verwendung von 5 μg RNA pro Spur durchgeführt. Als Sonden wurden eine 3P-markierte Riboprobe, die für MCMV ml52 codiert (oben) , und als Kontrolle eine cDNA Sonde für das Maus-Aktingen (unten) verwendet.
b) Expression von ml52 codierten Polypeptiden während des Replikationszyklus von MCMV. Scheininfizierte und MCMV- infizierte Zellen wurden mit [35S] Met ionin für 60 min zu den angegebenen Zeiten nach Infektion radiomarkiert . Zell-Lysate wurden mit Kaninchenantiserum gegen das ml52 Peptid (oben) und als Kontrolle mit Kaninchenantiserum gegen das zelluläre 14-3-3 Protein (unten) immunpräzipi- tiert und durch reduzierende SDS/10% PAGE analysiert.
Fig. 3
a) Expression des ml52 Genprodukt gp40 durch einen rekom- binanten Vaccinia Virus.
B12 Fibroblasten wurden scheininfiziert oder mit MCMV, der MCMV Deletionsmutante Δ MS94.5, der die für ml52 codierende Region fehlt (Thäle et al . , J. Virol. 69
(1995) , 6098-6105) , oder mit dem rekombinanten ml52 Vac- cinia Virus infiziert. 12 Stunden nach Infektion wurden die Zellen lysiert und die Proteine durch reduzierende 10 % SDS-PAGE aufgetrennt und geblottet. Die Bindung von Peptidantiserum wurde unter Verwendung von Peroxidase- konjugiertem Zweitantikörper sichtbar gemacht.
b) gp40 und gp37 sind zwei verschiedene glykosilierte Formen des ml52 Genprodukts.
Scheininfizierte oder MCMV-infizierte B12 Zellen wurden mit Tunicamycin, einem Inhibitor der N-Glykosilierung, inkubiert . Die Zellen wurden eine Stunde mit 35S markiert und gp40/gp37 wurde mit dem Kaninchen-7Anti-gp40-Antiserum immunpräzipitiert . Die Proteine wurden durch 10% SDS-PAGE aufgetrennt.
c) gp40 hat eine kurze Halbwertzeit und erwirbt Endo H resi- stance.
ml52-Vaccinia infizierte B12 Zellen wurden 4 h nach Infektion für 30 min mit [35S] Methionin pulsmarkiert. Direkt nach dem Puls oder nach 3 h Chase wurde gp40/gp37 mit dem Kaninchen-7Anti-gp40-Antiserum immunpräzipitiert und einer Endo H Spaltung unterzogen. Die Proteine wurden durch 10% SDS-PAGE analysiert.
Fig. 4 zeigt, daß ml52 die MHC-Klasse I Oberflächenexpression und die Antigenpräsentation verhindert.
a) Die ml52 Genexpression verringert die Plasmamembranexpression von neusynthetisierten MHC Klasse I Molekülen, aber nicht von CD44 (Pgp-1) .
Maus L Zellen (H-2k) , die mit dem ml52 Gen unter Kontrolle eines steroid-induzierbaren Promotors transfiziert waren, wurden entweder scheinbehandelt oder mit Dexamethason für
24 h induziert. Die Plasmamembranexpression des H-2 AI- lels Kk und von CD44 wurde durch FACS Analyse untersucht. Die gepunktete Linie zeigt die FITC Kontrolle in Abwesenheit des primären Antikörpers. Um den Einfluß von Dexame- thason auf MHC Klasse I Moleküle zu bestimmen, wurden auch nichttransfizierte L Zellen auf die Plasmamembranexpression von Kk analysiert.
b) MCMV ml52 blockiert die Antigenpräsentation durch MHC- Klasse I Moleküle. BALB/c Fibroblasten wurden infiziert mit pp89-Vac alleine, mit pp89-Vac und entweder Wildtyp- Vac oder ml52-Vac. Die Kontrollen waren scheininfiziert. Die Präsentation der pp89 Peptide wurde durch H-2Ld restringierte cytotoxische Lymphozyten getestet, die spezifisch für das Nonapeptid von pp89 bei den angegebenen Effektor/Ziel-Zellverhältnissen (E/T) in einem 4 h 51Cr Freisetzungstest sind.
Fig. 5 zeigt, daß ml52 die Reifung von neusynthetisierten Maus-MHC-Klasse I Molekülen verhindert.
B12 Zellen wurden mit MCMV, Wildtyp-Vaccinia oder ml52-Vac infiziert. Die Kontrollen wurden scheininfiziert. Bei 4 Stunden nach Infektion .urden die Zellen für 1 h mit [35S] Methionin pulsmarkiert und neusynthetisierte Moleküle wurden für 2 h einem Chase unterzogen. Zellysate wurden hergestellt und Kd Komplexe wurden mit einer Mischung der monoklonalen Antikörper SF 1.1.1 und MA 215 präzipitier . Die Präzipitate wurden aufgeteilt und Aliquots entweder mit Endo H gespalten oder einer Scheinbehandlung unterzogen, bevor sie durch eine 13% SDS-PAGE aufgetrennt wurden.
Figur 6 zeigt die Retention von MHC Klasse I Molekülen im ERGIC/cis-Golgi Kompartment MCMV-infizierter Zellen.
Infizierte (a-j ) und scheininfizierte (k-1) B12 Zellen wurden mit Paraformaldehyd fixiert und mit Detergenz permeabilisiert , bevor eine Doppelmarkierung mit Kaninchen-Anti-gp40 (a) und Maus-Anti-PDI Antikörper (b) durchgeführt wurde. Die Zellen wurden mit FITC-konjugiertem Ziege-Anti-Kaninchen IgG und Rho- damin-konjugiertem Anti-Maus-IgG inkubiert. Die subzelluläre Verteilung von Kd Molekülen (c, e, g und j) wurde mit der Ver- teilung von BiP, p58 (f) , Manll (i) und gp40 (h) verglichen. Scheininfizierte Zellen wurden auf Kd(l) und Manll (k) angefärbt .
Figur 7 zeigt, daß der cytoplasmatische Schwanz von ml52/gp40 nicht für die Retention von MHC Klasse I Molekülen benötigt wird.
L-Ld Zellen wurden mit Wildtyp-Vaccinia, ml52-Vac und ml52Δct- Vac infiziert. 4 h nach Infektion wurden die Zellen für 1 h pulsmarkiert und einer Chasebehandlung für 6 h unterzogen. Die ml52- und ml52Δct-Proteine wurden mit dem Peptidantiserum gegen gp40 präzipitiert (a) . MHC Klasse I Moleküle wurden mit Antikörpern gegen H-2Ld präzipitiert (b) . Die Präzipitate wurden aufgeteilt und eine Fraktion wurde mit Endo H vor Ana- lyse durch reduzierende 10 % SDS-PAGE inkubiert.
Beispiele
1. Methoden
1.1 Klonierungsarbeiten, Viruspropagierung und Herstellung rekombinanter Vacciniaviren
MCMV Stamm Smith (ATCC VR-194) wurde nach nach Standardmetho- den in der Gewebekultur gezüchtet .
Der offene Leserahmen des ml52 Gens wurde nach PCR Amplifika- tion von MCMV Smith DNA mit Oligonucleotidprimern in den Polylinker des pBK-CMV Expressionsvektors (Stratagene, La Jolla, USA) unter Kontrolle des HMCV Immediate-Early Enhancer-Promotor cloniert . Die Primer waren wie folgt: Vorwärtsprimer 5'- CGC GGG GGA TCC GGT CTC CCG ATC GCT AGC-3'; Rückwärtsprimer 5'-CGC GGG AAG CTT GGT CGC ACG AAC ATC ACC-3' . Das PCR Produkt wurde unter Verwendung der 5'-BamHI- und 3 ' -Hindlll-Restrik- tionsstellen cloniert, wodurch ein 1.200 bp langes rekombinan- tes ml52 Gen erhalten wurde. Die Gensequenz wurde weiterhin über die 5'-BamHI- und die 3'-SmaI Restriktionsstellen in die BamHI- und EcoRV Stellen des Plasmids p7.5K131 (Schlicht H.-J. und Schaller H. J. Virol 63 (1989) 5399-5404) cloniert. Dieses Konstrukt wurde dann zur Herstellung eines rekombinanten Vac- ciniavirus nach homologer Rekombination mit dem Vacciniastamm Kopenhagen verwendet. Die Expression des ml52 Gens im Vacci- niavirus erfolgt unter Kontrolle des Vaccinia 7.5K Promoters. Rekombinante Vacciniaviren ml52-Vac, die das ml52 Gen expri- mieren, wurden durch Infektion von HU TK-143 Zellen (American Type Culture Collection CRL-8303 ( £ 143B tk-)) selektioniert . Zur Erzeugung des ml52 Gens mit einer Deletion der für den cytoplasmatischen Schwanz codierenden Sequenz wurde der Rück- wärtsprimer: 5' -CGC GGG AAG CTT TTA TCA CTT CAC CAG ATA CAT-3' verwendet. Die anschließende Klonierung zur Erzeugung des rekombinanten Vacciniavirus ml52Δ cyt-Vac war wie oben be- schrieben. Das von dem mutierten Gen kodierte Protein endet nach dem Lysinrest an Position 353.
Die Herstellung rekombinanter Vacciniavieren, welche den kompletten für pp89 kodierenden MCMV iel orf exprimieren, wurde bereits beschrieben (Volkmer et al . , J. Exp. Med. 166 (1987) 668-677) . Auf analoge Weise wurde der rekombinante Vacciniavirus Kd-Vac hergestellt, der den offenen Leserahmen des Maus MHC Klasse I Allels Kd exprimiert .
Parallel wurde das ml52 Gen in das Plasmid pBK-CMV kloniert und weiter in die 5'-SacI und 3'-HindIII Stellen des Vektors pGRE5-l (Mader et al . , Proc . Natl . Acad. Sei. USA 90 (1993), 5603-5607) cloniert. Dieses Konstrukt wurde mit einem bakteriellen Plasmid, welches das neor Resistenzgen trägt, in L Zellen cotransfiziert . 1.2 RNA Analyse
NIH 3T3 Zellen (American Type Culture Collection CRL-1658) wurden mit MCMV bei einer Infektionsmultiplizität von 10 infi- ziert. Zelluläre RNA wurde zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion isoliert. Gesamt-RNA (5μg) wurde nach Standardprotokollen über 0,9% Formaldehyd-Agarosegele elektrophoretisch aufgetrennt. Die RNA wurde auf eine Nylonmembran (Quiabrane; Quiagen, Hüten, Deutschland) geblottet. Ein definiertes RNA Transkript, welches identisch zum vollständigen codierenden Strang des ml52 Gens ist, wurde unter Verwendung eines in vitro Transkiptionssystems (Promega) an einem Template erzeugt, welches durch Klonierung des ml52 Gens in den Transkriptionsvektor pGEM-3Z (Promega, Madison, USA) erhalten wur- de. Als Standard RNA wurde vollständige cDNA aus dem Maus ß- Aktingen (Stratagene) , markiert mit [α-32P] dCTP durch Verwendung eines Randomprimer-Markierungssystems (Stratagene) verwendet .
1.3 Zellen und Transfektanten
Zur Mikroinjektion wurde der Subklon B12 einer immortalisier- ten Zellinie von BALB/c Fibroblasten (Del Val et al . , Cell. 66 (1991) 1145-1153) in Dulbecco's modifiziertem Eagl s Medium mit 10% (vol/vol) fötalem Kälberserum kultiviert. Zur Herstellung von Zielzellen wurde ein anderer Subklon C12 verwendet. Zur Analyse der Transkriptionskinetik von MCMV Genen wurden NIH 3T3 Zellen verwendet. IT KOP B27 Zellen, ein Subklon der Th-Zellinie IT 22 isoliert aus Swiss 3T3 Zellen (Arnold et al . , Cell 38 (1984) 79-87) und transfiziert mit dem humanen Klasse I Allel B27, wurde von Herrn Dr. B. Arnold (Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg, Deutschland) zur Verfügung gestellt. LC-5-Kd ist eine Subzellinie der humanen Zellinie LC- 5 (Meliert et al . , AIDS 4 (1990) 527-535), die mit dem Maus Klasse I Allel Kd tranfiziert ist und wurde von Herrn Dr. Erfle (Gesellschaft für Strahlenforschung, München, Deutschland) zur Verfügung gestellt . Die L-ml52 Transfektanten wurden in Gegenwart von 0,5 mg/ml G-418 propagiert umd mit 25 nM Dexamethason 24 h vor der Ernte induziert.
1.4 Mikroinjektion und Immunfluoreszenz
Die Zellen wurden auf Cellocates (Eppendorf , Hamburg, Deutschland) ausgesät und nach der Methode von Thäle et al . (1995), supra mit Plasmid-DNA injiziert und mit für das Kd Allel spezifischen Antikörpern angefärbt. Die injizerten Zellen wurden für 24 h bei 37°C und 5% C02 inkubiert und durch indirekte Immunfluoreszenz angefärbt.
1.5 Cytolytische Tests
Infizierte Zielzellen wurden mit Trypsin behandelt und 90 min mit Na2 51Cr04 markiert . Danach wurde ein vierstündiger cytoly- tischer Standardassay mit 103 Zielzellen pro Vertiefung und variablen Zahlen von Effektorzellen durchgeführt (Del Val et AI., J. Virol. 62 (1988), 3965-3972) durchgeführt. Die angege- benen Daten stellen den mittleren Prozentwert der spezifischen Lyse von 3 Replicatkulturen dar.
1.6 Metabolische Markierung, Endo H Behandlung, Immunpräzipi- tation und Westernblots
Die Zellen wurden mit [35S] Methionin (1.200 Ci/mmol, Amersham, Braunschweig, Deutschland) in einer Konzentration von 300 μCi/ml bei 37°C für 60 min markiert und in Gegenwart von 10 mM unmarkiertem Methionin wie bei Del Val et al . , J. Exp . Med. 176 (1992) 729-738) beschrieben inkubiert. Tunicamycin (5 μg/ l) , ein Inhibitor der N-verknüpften Glykosilierung, wurde 45 min vor und während der 35S-Markierung zugegeben. Zellysate wurden durch Zugabe von Anti-Aktin- und Kaninchen-Anti-Maus IgG vorgereinigt. Immunkomplexe wurden mit Protein A-Sepharose immobilisiert. Quantitative Präzipitationen von MHC Molekülen wurden mit Ascitesfluid, die eine Mischung der monoklonalen Antikörper MA-215 (Hengel et al . , J. Virol. 68 (1994), 289-297) und SF1.1.1 (ATCC HB159) spezifisch für Kd, mit dem monoklonalen Antikörper 28-14-8S (ATCC HB27) spezifisch für Ld und mit dem monoklonalen Antikörper W6/32 (ATCC HB158) spezifisch für humane Klasse I schwere Ketten inkubiert. Als Kontrolle für ein zelluläres Protein wurde die Thetaform des Proteins 14-3-3 durch einen Kaninchenantikörper (Santa Cruz Biotechnology, Sta. Cruz, Kalifornien) präzipitiert. Um eine quantitative Immobilisierung von Immunkomplexen sicherzustellen, wurden die Lysate zweimal mit Protein A-Sepharose inkubiert. Die Verdauung mit Endoglycosidase H (Endo H; Boehringer, Mannheim, Deutschland) wurde nach der Methode von Del Val et al . , (1992), supra, durchgeführt.
Für Proteinblots wurden Nylonfilter (Immobilon P; Boehringer) verwendet. Die Membran wurde über Nacht bei +4°C mit einem Blockierungsreagenz blockiert und die Bindung des Primäranti- körpers wurde durch Peroxidase-konjugiertes Schaf Anti-Kaninchen IgG und Chemilumineszenz (Boehringer) sichtbar gemacht.
1.7 Durchflußcytometrie
Trypsinisierte L-ml52 -Transfektanten, die das ml52 Gen expri- mieren, wurden scheinbehandelt oder mit 25 nM Dexamethason für 24 h induziert. Die Zellen wurden mit PBS (2% fötales Kälberserum, 0,3% NaN3) gewaschen und mit dem monoklonalen Anti-Kk Antikörper H100.27.55 markiert. Gebundene Antikörper wurden durch Zugabe von FITC-konjugierten Ziege Anti-Maus-Antikörpern
(Dianova) sichtbar gemacht. Mit dem zweiten Antikörper alleine inkubierte Zellen dienten als negative Kontrollen. Insgesamt 5 x 103 Zellen wurde für jedes Fluoreszenzprofil durch fluores- zenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) auf einem FACScan Gerät (Becton Dickinson & Co . , San Jose, Calif.) analysiert. 1.8 Konfokale Mikroskopie
gp40 wurde durch ein polyklonales Kaninchenantiserum nachgewiesen, welches gegen ein syntetisches Peptid aus dem lumina- len Teil des viralen Proteins erzeugt worden war. Für die intrazelluläre Lokalisierung von gp40 und MHC Klasse I Moleküle wurden die folgenden monoklonalen und polyklonalen Antikörper verwendet: Monoklonaler Antikörper SF1-1.1 (anti-Kd, Pharmingen) , polyklonales Kaninchen anti-GRP-78 Serum (anti- BiP, Affinity Bioreagents, Golden, Co.) monoklonaler Antikörper 1D3 (anti-PDI, Tooze et al . , J. Cell. Biol . 109 (1989), 35-50), Antikörper gegen p58 (Saraste et al . , J. Cell. Sei. 100 (1991) , 415-430) und Antikörper gegen Mannosidase II (Mo- remen et al . , J. Biol. Chem. 266 (1991), 16876-16885).
Subkonfluente Schichten von B12 Zellen wurden auf Glasobjektträgern kultiviert und mit MCMV für 5 h infiziert (Multiplizi- tät der Infektion = 1) . Als Kontrollen wurden nichtinfizierte Zellen verwendet. Die Zellen wurden mit PBS gespült und mit 3% (W/Vol . ) Paraformaldehyd in PBS für 20 min infiziert. Nach Blockierung der freien Aldehydgruppen mit 50 mM NH4Cl , 20 mM Glycin in PBS wurden die Zellen mit 0,1% Triton X-100 in PBS permeabilisiert . Zur Blockierung unspezifischer Bindung von Antikörpern wurden die Objektträger für 10 min in 0,2% (W/Vol) Fischhautgelantine (Sigma) in PBS inkubiert.
Durch Inkubation der Zellen mit primären Antikörpern im gleichen Medium für 45 min wurde eine Doppelimmunfluoreszenz durchgeführt. Nach gründlichem Waschen mit PBS wurden die Zellen erneut in 0,2% Gelantine inkubiert und mit 2% Zweitantikörpern, FITC-conjugiertem Ziege Anti-Kaninchen- IgG (Dianova) und Rhodamin-konjugiertem Ziege Anti-Maus-IgG (Dianova) 45 min angefärbt. Nach Waschen mit PBS wurden die Objektträger auf Glasrahmen mit Histogel (Camon) aufgebracht. Die Zellen wurden mit einem konfokalen Laser-Scanningmikroskop (Leitz DM IRB, Scanner: Leica TCS 4D) analysiert. 2. Ergebnisse
2.1 Intrazelluläre Akkumulation von MHC Klasse I Molekülen induziert durch das MCMV ml52 Gen
Während der frühen Phase der MCMV Genexpression blockieren virale Funktionen das Verlassen von frisch synthetisierten MHC Klasse I Komplexen aus dem Golgi . Anstelle eines schnellen Abbaus verbleiben die Moleküle in der infizierten Zelle. Zur Lokalisierung von Genen innerhalb des CMV Genoms, die zu einer intrazellulären Akkumulierung von MHC Klasse I Molekülen führen, wurden MCMV DNA Fragmente in die Zelle mikroinj iziert und die intrazelluläre Verteilung frisch synthetisierter MHC Klasse I Kd Moleküle durch indirekte Immunfluoreszenz untersucht. Diese Methode, kombiniert mit der Herstellung von Virusmutanten, hatte die codierende Region auf eine 5,9 kbp Domäne am rechten Ende des MCMV Genoms eingeschränkt (Thäle et al . , J. Virol. 69 (1995), 6098-6105).
Zur Identifizierung des gesuchten Gens wurde das interne EcoRI Fragment O innerhalb des HindiII Fragments E (Figur 1) mit einer Anzahl von Restriktionsenzymen gespalten und die DNA- Fragmente in Zellen injiziert. Nach Spaltung von MCMV EcoRI O DNA mit Xbal wurde keine Wirkung auf die MHC Klasse I Vertei- lung festgestellt, während Zellen, in die Smal gespaltene DNA injiziert wurde, eine intrazelluläre Akkumulierung von MHC Komplexen zeigten. Nur einer der offenen Leseramen innerhalb des EcoRI O Fragments wird durch Xbal, aber nicht durch Smal gespalten. Dieser offene Leserahmen wurde selektiv in einen Expressionsvektor kloniert . Der Expressionsvektor wurde in Zellen mikroinj iziert , wodurch eine intrazelluläre Akkumulierung von H-2Kd in den mikroinj izierten Zellen gefunden wurde. Das Gen hatte die in SEQ ID No. 1 gezeigte Nucleotidsequenz und wurde ml52 bezeichnet. Der offene Leserahmen von ml52 (1137 bp) codiert für ein Protein mit 378 Aminsoäuren, dessen Sequenz in SEQ ID No . 1 und 2 gezeigt ist. Es wurde keine signifikante Nucleotidsequenzhomologie zu irgendeiner bekannten Gensequenz festgestellt.
Die vom ml52 Gen codierte Aminosäuresequenz entspricht einem Typ I Transmembranglycoprotein mit einer Molmasse von 42 kDa (Figur 1, Mitte) .
Eine hydrophobe Region am N-Terminus stellt eine potentielle Signalpeptidsequenz von 19 Aminosäureresten dar. Eine zweite hydrophobe Region von 17 Aminosäuren dient vermutlich als Transmembransegment. Der cytoplasmatische Schwanz vom 26 Aminosäuren enthält die Sequenz YRLV, die ähnlich dem allgemeinen YXXF-Motiv (Y = beliebige Aminosäure, X = hydrophobe Aminosäure) , welche Proteine zu Endosomen oder Lysosomen dirigiert. Der luminale Abschnitt von ungefähr 317 Aminosäureresten weist drei potentielle N-Glycosylierungsstellen auf.
2.2 Transkription und Expressionskinetik des ml52 Gens
Zur Bestimmung der Expressionskinetik von ml52 wurde zelluläre Gesamt-RNA zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion isoliert und eine Northern-Hybridisierung durchgeführt. Die Hybridisierung mit strangspezifischen Sonden zeigt zwei Transkripte von 1,4 und 2,6 kb (Figur 2a) . Beide Transkripte stammen vom gleichen Strang. Aufgrund der vorhergesagten Größe muß das 1,4 kb Transkript der ml52 mRNA entsprechen. Die Transkription begann zwei Stunden nach Infektion, erreichte ein Maximum 4 h nach Infektion und wurde über den gesamten MCMV Replikations- zyklus von 24 h fortgesetzt.
Ein Antiserum gegen das ml52 Polypeptid wurde durch Immunisierung von Kaninchen mit einem synthetischen Peptid (Figur 1, Sequenz unterstrichen) erzeugt. Das Peptidantiserum reagierte mit einem 40 kDa Protein aus Lysaten von MCMV-infizierten Zel- len (Figur 3a, 2. Zeile) in einem Westernblot . Eine Immunprä- zipitation zu verschiedenen Zeitpunkten der Infektion zeigte, daß die gp40 Synthese 3-4 h nach Infektion beginnt und ein Maximum bei 5-6 h nach Infektion hat (Figur 2b) . Ein Verdau mit Endoglycosidase H (Endo H) der präzipitierten Produkte zeigte, daß Kohlehydrate an allen drei vorhergesagten N-Glyko- silierungsstellen vorliegen.
2.3 Expression von gp40 durch einen rekombinanten Vacciniavi- rus
Es wurde ein rekombinanter Vacciniavirus ml52-Vac hergestellt, der das ml52 Gen aus MCMV enthält. Proteine aus ml52-Vac infizierten Zellen wurden mit Proteinen aus MCMV-infizierten Zellen durch einen Westernblot verglichen (Figur 3a) . In beiden Fällen wurde die Expression von Proteinen mit einer scheinbaren Molekularmasse von 40 bzw. 37 kDa gefunden.
Die Zugabe von Tunicamycin, das die de novo Synthese von N- verknüpften Oligosacchariden inhibiert, zu MCMV-infizierten Zellen führte dazu, daß nur eine einzige Proteinbande mit etwa 34 kDa auftrat (Figur 3b) . Dies weist darauf hin, daß gp40 und gp37 unterschiedlich glycosilierte Formen des ml52 Genprodukts darstellen.
Nach 3 h Chase erreichten die gp40 Moleküle eine Resistenz gegen EndoH (Figur 3c) . Die EndoH resistente Form von gp40 wanderte auf eine Position zwischen der 40kDa und der 37 kDa Form.
2.4 Blockierung der Plasmamembranexpression von MHC Klasse I Molekülen durch gp40
Um die Wirkung von pg40 auf neusynthetisierte MHC Klasse I Moleküle zu untersuchen, wurden L-ml52 Transfekanten hergestellt, welche die induzierbare Expression des Proteins erlauben. Die Lokalisierung des MHC Klasse I Komlexes wurde durch FACS Analyse unter Verwendung eines Kk spezifischen Antikörpers verfolgt (Figur 4a) . In Abwesenheit von gp40 war kein signifikanter Effekt auf Plasmamembranexpression von Kk Molekülen festzustellen. Nach Induktion der gp40 Expression durch Dexa- methason wurde jedoch ein klarer Rückgang der Konzentration von Kk Molekülen festgestellt. Die Plasmamembranexpression des Oberflächenmarkers CD44 wurde nach Induktion von gp40 nicht beeinflußt (Fig. 4a) .
2.5 Hemmung der Antigenpräsentation an der Zelloberfläche durch gp40 Expression
Um die Antigenpräsentation in Gegenwart von gp40 als einzigem MCMV Protein zu untersuchen, wurden murine Ld-exprimierende Fibroblasten mit einem rekombinanten Vacciniavirus, der für das Protein pp89 codiert (Volkmer et al . (1987), supra), in Gegenwart oder /Abwesenheit vom ml52-Vac infiziert. Die Anti- genprasentation wurde mit pp89 Peptid-spezifischen cytotoxi- schen Lymphozyten getestet. Die Lyse der Zielzellen wurde durch einen 51Cr-Freisetzungstest ermittelt. Die mit dem rekombinanten pp89-Vac infizierten Zellen wurden lysiert ebenso wie Zellen, die mit pp89-Vac und Wildtyp-Vac coinfiziert worden waren (Fig. 4b) . Nach Coinfektion von Zellen mit pp89-Vac und ml52-Vac wurde jedoch die Antigenpräsentation signifikant verringert. Eine vierzigfach höhere Anzahl von Effektorzellen waren zum Erreichen eines ähnlichen Grads an spezifischer Lyse erforderlich. Somit reicht die Expression des isolierten pg40 Proteins von MCMV aus, um die Antigenpräsentation zu blockieren.
2.6 gp40 hält MHC Klasse I Moleküle in einem Endo H sensitiven Zustand
Korrekt assemblierte MHC Klasse I Komplexe reifen stetig und treten in das mittlere Golgikompartment ein, wo sie eine Gly- canstruktur erwerben, die gegenüber einer Spaltung durch Endo H resistent ist. Murine Fibroblasten wurden ml52-Vac infi- ziert, mit 35S Methionin 4 h nach der Infektion für 60 min markiert, gefolgt von einer zweistündigen Chasedauer, bevor eine Immunpräzipitation von Kd Molekülen durchgeführt wurde. In scheininfizierten Zellen und mit Wildtyp-Vac infizierten Zellen erreichte der Großteil von Kd Molekülen während dieser Chasedauer eine Endo H Resistenz (Fig. 5) . In ml52-Vac- und in MCMV-infizierten Zellen blieben die Kd Moleküle in der etwas schneller wandernden Form, die von Endo H gespalten werden kann und typisch für ER/cis-Golgi -lokalisierte Glycoproteine ist. Endo H sensitive MHC Klasse I Moleküle blieben für mehr als 6 h stabil. Dieses Ergebnis zeigte, daß das isolierte ml52 Gen den Transport vom MHC Komplexen verhindert .
2.7 Akkumulierung zurückgehaltener MHC Klasse I Moleküle im ERGIC/cis Golgi
Zur genaueren Identifizierung des Kompartments, in dem die MHC Klasse I Komplexe zurückgehalten werden, wurde die intrazelluläre Lokalisierung von gp40 und MHC Klasse I Komplexen durch konfokale Mikroskopie an MCMV-infizierten Zellen untersucht. Zum Nachweis von gp40 wurde ein affinitätsgereinigtes Kaninchenantiserum (siehe 2.1) verwendet. Zum Nachweis von MHC Klasse I Komplexen diente ein monoklonaler Antikörper gegen Kd. B12 Zellen wurden entweder scheinifiziert (Fig. 6k und 1) oder für 5 h mit MCMV (Fig. 6a-j) infiziert. Die Doppelanfärbung von gp40 und Proteindisulfidisomerase (Tooze et al (1989) , supra) als ER-Marker in infizierten Zellen zeigte eine punkt- förmige Verteilung des viralen Proteins. Bei Vergleich der zellulären Verteilung von Kd Molekülen mit der Verteilung eines anderen ER-Proteins, dem Immunglobulin-Schwerketten-Bindepro- tein (BiP) wurde fast keine Kolokalisierung festgestellt (Fig. 6c und d) , was darauf hinweist, daß der Großteil von MHC Klas- se I Molekülen aus dem ER austritt. In scheininfizierten Zellen wurde keine intrazelluläre Konzentration von Kd Molekülen gefunden (Fig. 61) . Eine Doppelimmunfluoreszenzanfärbung von Kd und dem medialen Golgi-Marker Mannosidase II (Fig. 6e und j) wies auf eine Lokalisierung in Nachbarschaft des Golgi hin. Der Vergleich zwischen der Verteilung von Kd und p58, einem Marker für das mittlere und frühere Golgikompartment (Saraste & Svenson (1991) , supra) zeigte eine Akkumulierung von Kd Mole- külen in diesem Kompartment (Fig 6e und f) . Ein direkter Vergleich der subzellulären Verteilung von gp40 und Kd (Fig. 6g und h) zeigte eine hohe Übereinstimmung, aber keine vollständige Identität.
Insgesamt war festzustellen, daß ein Großteil von gp40 und Kd Molekülen in Post-ER Kompartmenten akkumuliert und kolokali- siert und daß MHC Moleküle mit p58, einem Marker des ERG IC/cis-Golgi, kolokalisieren.
2.8 Spezifität der gp40 Funktion für H-2 Allele
Das Adenovirus E3/19K Protein bindet an Klasse I Allele aus dem Menschen und aus der Maus (Signas et al . , Nature 299 (1982) , 175) . Es blockiert die Oberflächenexpression aller HLA-Moleküle und drei von sieben getesteten murinen MHC Allelen.
Das gp40. Protein verhindert den Transport aller bisher gete- steter Maus MHC Klasse I Haplotypen (H-2d, H-2k, H-2b, H-2q) . In humanen Zellen, die mit dem Maus Klasse I Allel H-2Kd trans- fiziert waren, waren die Maus MHC Moleküle gegenüber gp40 sensitiv, während endogene humane Klasse I Allele keinem Transportblock unterlagen. Umgekehrt war bei einer stabilen Cotransfektion des humanen Klasse I Alleis HLA-B27 in einer Mauszellinie in einer Wirkung von gp40 auf das humane Allel nicht festzustellen, während die endogenen Maus Klasse I Allele sensitiv waren. Somit ist gp40 in der Lage, eine MHC Retention sowohl in Mauszellen als auch in humanen Zellen hervorzurufen. Es wirkt jedoch nicht auf das humane Allel HLA- B27.
2.9 Der cytoplasmatische Schwanz von gp40 ist nicht essentiell für die Retention
Um die Rolle der 26 Aminosäuren langen cytoplasmatischen Domäne von gp40 als ER-Retentionsmodul zu testen, wurde eine Deletionsmutante ohne die 25 C-terminalen Aminosäurereste hergestellt. Die Deletionsmutante wurde durch einen rekombinanten Vacciniavirus hergestellt und zeigte die erwartete schnellere Mobilität in Gelen (Fig. 7a) . Das deletierte Pro- tein war ebenso wie das vollständige gp40 zur Retention von MHC Klasse I Molekülen in der Lage (Fig. 7b) .
SEQUENZPROTOKOLL ii) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME : Boehringer Mannheim GmbH
(B) STRASSE: Sandhofer Str. 112-132
(C) ORT: Mannheim
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: 68305
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Inhibitor fuer die Präsentation von Antigenen durch MHC Klasse I Moleküle
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG: (A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1 , 0, Version #1.30
(EPA)
(v) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG: ANMELDENUMMER: EP 97100689.5
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1520 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: beides (D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 143..1276
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
AGGTAAACAT GGACACATAG TATAAAAAGA GCAGAGGCGC TCACAGAGAA CTCAGACGCG 60
GGCTACTCCC GAAAGAGTAA CATCACAAGC CGTGTCACCG CTCCACGTTT CACCGTCGGT 120
CTCCCGATCG CTAGCCTGTA CA ATG CTG GGC GCT ATC ACC TAC TTG CTC CTC 172
Met Leu Gly Ala Ile Thr Tyr Leu Leu Leu 1 5 10
TCG GTT CTC ATA AAC CGA GGC GAG ACG GCG GGC AGC AGC TAT ATG GAC 220
Ser Val Leu Ile Asn Arg Gly Glu Thr Ala Gly Ser Ser Tyr Met Asp
15 20 25
GTG CGC ATA TTC GAG GAT GAG CGG GTG GAC ATC TGT CAA GAC CTG ACG 268 Val Arg Ile Phe Glu Asp Glu Arg Val Asp Ile Cys Gin Asp Leu Thr 30 35 40 GCG ACG TTC ATC TCG TAC AGA GAA GGT CCG GAG ATG TTC CGC CAC AGT 316 Ala Thr Phe Ile Ser Tyr Arg Glu Gly Pro Glu Met Phe Arg His Ser 45 50 55 ATC AAT CTA GAG CAG TCG TCT GAT ATC TTT CGG ATC GAA GCC TCC GGA 364 Ile Asn Leu Glu Gin Ser Ser Asp Ile Phe Arg Ile Glu Ala Ser Gly 60 65 70
GAG GTG AAA CAT TTT CCT TGG ATG AAC GTG AGC GAG CTG GCG CAG GAG 412 Glu Val Lys His Phe Pro Trp Met Asn Val Ser Glu Leu Ala Gin Glu 75 80 85 90
AGT GCG TTC TTC GTG GAG CAG GAG AGG TTC GTA TAC GAG TAC ATT ATG 460 Ser Ala Phe Phe Val Glu Gin Glu Arg Phe Val Tyr Glu Tyr Ile Met 95 100 105
AAT GTC TTC AAA GCC GGA CGG CCG GTA GTC TTC GAA TAT AGA TGC AAG 508
Asn Val Phe Lys Ala Gly Arg Pro Val Val Phe Glu Tyr Arg Cys Lys 110 115 120
TTC GTT CCA TTC GAA TGT ACC GTA CTT CAG ATG ATG GAC GGC AAT ACG 556
Phe Val Pro Phe Glu Cys Thr Val Leu Gin Met Met Asp Gly Asn Thr 125 130 135 TTG ACA CGT TAC ACC GTA GAC AAA GGC GTC GAA ACG CTC GGG TCT CCG 604 Leu Thr Arg Tyr Thr Val Asp Lys Gly Val Glu Thr Leu Gly Ser Pro 140 145 150
CCG TAC TCT CCC GAC GTA TCC GAG GAT GAC ATC GCG CGC TAC GGA CAA 652 Pro Tyr Ser Pro Asp Val Ser Glu Asp Asp Ile Ala Arg Tyr Gly Gin 155 160 165 170
GGG TCC GGA ATC TCT ATC TTG AGG GAC AAC GCT GCT CTA CTC CAG AAA 700 Gly Ser Gly Ile Ser Ile Leu Arg Asp Asn Ala Ala Leu Leu Gin Lys 175 180 185
CGC TGG ACG TCC TTC TGT CGG AAG ATC GTC GCC ATG GAC AAC CCC AGA 748 Arg Trp Thr Ser Phe Cys Arg Lys Ile Val Ala Met Asp Asn Pro Arg 190 195 200
CAC AAC GAA TAC TCG CTG TAC AGT AAT CGA GGC AAC GGC TAC GTG TCC 796 His Asn Glu Tyr Ser Leu Tyr Ser Asn Arg Gly Asn Gly Tyr Val Ser 205 210 215 TGT ACG ATG CGC ACT CAG GTT CCG TTG GCG TAC AAC ATC AGT CTC GCG 844 Cys Thr Met Arg Thr Gin Val Pro Leu Ala Tyr Asn Ile Ser Leu Ala 220 225 230
AAC GGA GTG GAC ATC TAC AAG TAC ATG CGC ATG TAT TCT GGT GGA CGA 892 Asn Gly Val Asp Ile Tyr Lys Tyr Met Arg Met Tyr Ser Gly Gly Arg 235 240 245 250
TTG AAG GTG GAA GCG TGG CTC GAT CTC AGA GAC CTG AAC GGT AGT ACC 940 Leu Lys Val Glu Ala Trp Leu Asp Leu Arg Asp Leu Asn Gly Ser Thr 255 260 265
GAC TTC GCG TTC GTG ATT TCT TCC CCG ACG GGA TGG TAC GCT ACG GTC 988 Asp Phe Ala Phe Val Ile Ser Ser Pro Thr Gly Trp Tyr Ala Thr Val 270 275 280
AAG TAT TCT GAG TAC CCT CAA CAG AGT CCC GGC ATG CTG TTG TCG TCG 1036 Lys Tyr Ser Glu Tyr Pro Gin Gin Ser Pro Gly Met Leu Leu Ser Ser 285 290 295 ATC GAT GGG CAG TTC GAG TCG TCC GCG GTC GTC TCG TGG CAC AGG GGA 1084 Ile Asp Gly Gin Phe Glu Ser Ser Ala Val Val Ser Trp His Arg Gly 300 305 310 CAC GGT CTC AAG CAC GCT CCT CCC GTC TCC GCG GAG TAC TCC ATC TTC 1132 His Gly Leu Lys His Ala Pro Pro Val Ser Ala Glu Tyr Ser Ile Phe 315 320 325 330 TTC ATG GAC GTG TGG TCC TTG ATC GCG ATC GGA GTC GTG TTC GTG ATC 1180 Phe Met Asp Val Trp Ser Leu Ile Ala Ile Gly Val Val Phe Val Ile 335 340 345
GTC TTC ATG TAT CTG GTG AAG TTA CGG GTG GTG TGG ATC AAT CGG GTC 1228 Val Phe Met Tyr Leu Val Lys Leu Arg Val Val Trp Ile Asn Arg Val 350 355 360
TGG CCT CGT ATG CGG TAT CGC CTG GTC TAC ATC AAC TGC CGC GTG TGG 1276 Trp Pro Arg Met Arg Tyr Arg Leu Val Tyr Ile Asn Cys Arg Val Trp 365 370 375
TGATGTTCGT GCGACCGGCA CACTGGACAA TGTCAGATCG TCGGGTGCTC TCGCTCGAGC 1336
CGCCCGTCGG GCCACATACA CTAACTGGAC AATGATCAAC CTCGGTGGGG AATCTGGGGC 1396
GGGTTGACCT GGGAATGGGC TCAGGGATAA CACACAACAC TTGTACAATA AAGATAACTT 1456
ATTAGTCAAC TCTTGGGGTC TTGTGTGCCT ATGTGTTTCT CAGGCGCGAC GACGCGGAGC 1516 GCGC 1520
( 2 ) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 2 : ( i ) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE : 378 Aminosäuren
(B ) ART : Aminosäure (D) TOPOLOGIE : l inear ( i i ) ART DES MOLEKÜLS : Protein
(xi ) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO : 2 :
Met Leu Gly Ala Ile Thr Tyr Leu Leu Leu Ser Val Leu Ile Asn Arg 1 5 10 15
Gly Glu Thr Ala Gly Ser Ser Tyr Met Asp Val Arg Ile Phe Glu Asp 20 25 30
Glu Arg Val Asp Ile Cys Gin Asp Leu Thr Ala Thr Phe Ile Ser Tyr 35 40 45
Arg Glu Gly Pro Glu Met Phe Arg His Ser Ile Asn Leu Glu Gin Ser 50 55 60 Ser Asp Ile Phe Arg Ile Glu Ala Ser Gly Glu Val Lys His Phe Pro 65 70 75 80
Trp Met Asn Val Ser Glu Leu Ala Gin Glu Ser Ala Phe Phe Val Glu 85 90 95
Gin Glu Arg Phe Val Tyr Glu Tyr Ile Met Asn Val Phe Lys Ala Gly 100 105 110
Arg Pro Val Val Phe Glu Tyr Arg Cys Lys Phe Val Pro Phe Glu Cys 115 120 125
Thr Val Leu Gin Met Met Asp Gly Asn Thr Leu Thr Arg Tyr Thr Val 130 135 140 Asp Lys Gly Val Glu Thr Leu Gly Ser Pro Pro Tyr Ser Pro Asp Val 145 150 155 160
Ser Glu Asp Asp Ile Ala Arg Tyr Gly Gin Gly Ser Gly Ile Ser Ile 165 170 175
Leu Arg Asp Asn Ala Ala Leu Leu Gin Lys Arg Trp Thr Ser Phe Cys 180 185 190 Arg Lys Ile Val Ala Met Asp Asn Pro Arg His Asn Glu Tyr Ser Leu 195 200 205
Tyr Ser Asn Arg Gly Asn Gly Tyr Val Ser Cys Thr Met Arg Thr Gin 210 215 220
Val Pro Leu Ala Tyr Asn Ile Ser Leu Ala Asn Gly Val Asp Ile Tyr 225 230 235 240
Lys Tyr Met Arg Met Tyr Ser Gly Gly Arg Leu Lys Val Glu Ala Trp 245 250 255
Leu Asp Leu Arg Asp Leu Asn Gly Ser Thr Asp Phe Ala Phe Val Ile 260 265 270 Ser Ser Pro Thr Gly Trp Tyr Ala Thr Val Lys Tyr Ser Glu Tyr Pro 275 280 285
Gin Gin Ser Pro Gly Met Leu Leu Ser Ser Ile Asp Gly Gin Phe Glu 290 295 300
Ser Ser Ala Val Val Ser Trp His Arg Gly His Gly Leu Lys His Ala 305 310 315 320
Pro Pro Val Ser Ala Glu Tyr Ser Ile Phe Phe Met Asp Val Trp Ser 325 330 335
Leu Ile Ala Ile Gly Val Val Phe Val Ile Val Phe Met Tyr Leu Val 340 345 350 Lys Leu Arg Val Val Trp Ile Asn Arg Val Trp Pro Arg Met Arg Tyr 355 360 365
Arg Leu Val Tyr Ile Asn Cys Arg Val Trp 370 375

Claims

Ansprüche
1) . Isolierte Nucleinsäure, welche für ein die MHC Klasse I Antigenpräsentation beeinflussendes Polypeptid codiert, umfassend
(a) die in SEQ ID NO. 1 dargestellte Nucleotidsequenz mindestens im Bereich zwischen den Nucleotiden 199 und 1449,
(b) eine der Sequenz aus (a) oder/und (b) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nucleotidsequenz oder
(c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nucleotidsequenz .
2) Nucleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Homologie von mehr als 80% zu der in SEQ ID No. 1 dargestellten Nucleotidsequenz aufweist.
3) Modifizierte Nucleinsäure oder Nucleinsäureanalogon, die eine Nucleotidsequenz nach Anspruch 1 oder 2 oder einen mindestens 12 Basen langen Abschnitt davon aufweist.
4) Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Kopie einer Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 oder einen Abschnitt davon enthält .
5) Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er ein eukaryontischer Vektor ist. 6 ) Zelle , dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 oder einem Vektor nach Anspruch 4 oder 5 transformiert ist .
7) Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Säugerzelle ist.
8) Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von einer Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 codiert ist.
9) Polypeptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es
(a) eine in SEQ ID No. 2 dargestellte AminosäureSequenz mindestens im Bereich zwischen den Aminosäuren 20 und 337,
(b) eine mehr als 70% zur Sequenz aus (a) homologe Aminosäuresequenz oder/und
(c) eine mit den Sequenzen aus (a) oder/und (b) immuno- logisch kreuzreaktive Aminosäuresequenz aufweist.
10) Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 8 oder 9 oder von Fragmenten dieses Polypeptids als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern.
11) Antikörper gegen ein Polypeptid, nach Anspruch 8 oder 9.
12) Antikörper nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen das gesamte Polypeptid oder eine Peptidsequenz entsprechend den Aminosäuren 156-170 aus SEQ ID No. 2 gerichtet ist. 13) Pharmazeutische Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet, daß sie als aktive Komponente umfasst:
(a) eine Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2,
(b) eine modifizierte Nucleinsäure nach Anspruch 3,
(c) einen rekombinanten Vektor nach Anspruch 4 oder 5,
(d) eine Zelle nach Anspruch 6 oder 7,
(e) ein Polypeptid nach Anspruch 8 oder 9 oder/und
(f) einen Antikörper nach Anspruch 11 oder 12. 0
14) Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 13 als diagnostisches Mittel.
15) Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 13 zur 15 Herstellung eines therapeutischen Mittels.
16) Verwendung nach Anspruch 15 zur Modulation des Immunsystems .
20 17) Verwendung nach Anspruch 15 oder 16 zur Inhibierung der Antigenpräsentation durch MHC Klasse I Moleküle an der Oberfläche von Zellen.
18) Verwendung nach einem der Ansprüche 14-17 in der Genthe- 25 rapie.
19) Verwendung nach Anspruch 18 zur Verringerung der Immuno- genität von transfizierten Zellen.
30 20) Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 19 in Kombination mit mindestens einem weiteren immunmodulatorisch wirkenden Mittel . 21) Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß weitere immunmodulatorisch wirkende Mittel ausgewählt ist aus viralen MHC-Klasse I Inhibitoren und dafür codierenden Nucleinsäuren.
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