RIBOZYME ZUR SELEKTIVEN HEMMUNG DER EXPRESSION VON GENEN VON MHC-ALLELEN UND DIESE ENTHALTENDE ARZNEIMITTEL
Organtransplantationen stellen ultimative operative Ein¬ griffe aus meist vitaler Indikation dar. Da eine prospektive Spender-Empfänger-Auswahl nach immungenetischen Kriterien, wie z.B. bei Nierentransplantationen, bei fast allen anderen Organen aus einer Vielzahl von Gründen nicht möglich ist, müssen z. Zt. bis auf wenige zufällige Ausnahmen HLA- inkompauible Organe transplantiert werden. Akute wie chroni¬ sche immunologische Abstoßungsreaktionen sind somit im Re¬ gelfall zu erwarten.
Neben einer qualitativen HLA-Differenz zwischen Spender und Empfänger spielt zusätzlich auch ein quantitativer Aspekt für das Entstehen von immunologischen Folgereaktionen eine beträchtliche Rolle. (Mit HLA (Humanes Lymphocyten Antigen) ist hier das MHC (Major Histocompatibility Complex) -System des Menschen gemeint . )
(1) Die Immunogenität einiger transplantierter Organe (wie z.B. Lunge) ist als Folge ihres größeren physiologischer Be¬ satzes an HLA-Klasse-II-Antigenen a priori höher als die an¬ derer Organe (Alwayn et al . , Transpl . Int. 7 (1994) , 43-46) .
(2) Die Expression von HLA-Antigenen in transplantierten Or¬ ganen wird durch Zytokine (wie z.B. Gamma-Interferon) , die bei Abstoßungsreaktionen und Infektionen freigesetzt werden, noch zusätzlich gesteigert.
Die ungünstige immungenetische Ausgangssituation mündet in vielen Fällen in einen circulus vitiosus: Da infolge der schlechten immunologischen Voraussetzungen von Beginn an sehr hohe Dosen an Immunsuppressiva eingesetzt werden müs¬ sen, kommt es zu schweren Infektionen im transplantierten
Organ, was wiederum eine Erhöhung der HLA-Expression, insbe¬ sondere der Klasse-II, nach sich zieht (Steinhoff et al. , j. Heart Transpl . 8 (1989) , 360-370, Grattan et al. , JAMA (1989) , 3561-3566, Milne et al. , Transplantation 57 (1994) , 1762-1766) .
Beispielsweise beträgt die Ein-Jahr-Überlebensrate nach Lun¬ gen- oder kombinierten Herz-/Lungentransplantationen nach internationalen Statistiken 50%-60% (Kriell & Kaye, J. Heart Transpl. 9 (1990) , 323-330) . Dabei beruhen 40% der Todes¬ fälle im ersten Jahr auf technischem Versagen wie z.B. man¬ gelnder Organkonservierung oder Blutungen, mehr als die Hälfte jedoch auf Infektionen (30%) und akuten Abstoßungs- krisen (25%) . Anschließend entwickeln bis zu 50% der überle¬ benden Patienten schwerste Folgereaktionen ("obstruktive Bronchiolitis") , die eine sehr schlechte Prognose aufweisen. Insgesamt werden bei diesem Organ 90% aller Todesfälle, die trotz technisch gelungener Operationen auftreten, nicht be¬ herrschbaren Infektionen und Abstoßungen zugeschrieben. Eine weitere drohende Komplikation des Einsatzes hoher Dosen Im- munsuppressiva ist die Entstehung von Non-Hodgkin-Lymphomen, die bei langzeitüberlebenden Lungentransplantierten die höchsten Quoten aufweist . Manche Organtransplantationen sind somit quoad vi tam für den Patienten mit sehr ernst zu neh¬ menden Risiken verbunden.
Des weiteren muß sich bei vielen Transplantationen (außer bei Niere oder Cornea) eine Spender-Empfänger-Auswahl nach immungenetischen Kriterien auf das ABO-Blutgruppensystem be¬ schränken, da im Regelfall eine sehr hohe Dringlichkeit zur Transplantation besteht und die meisten Patienten längere Wartezeiten auf ein HLA-kompatibles Organ nicht überleben würden. Weitere logistische Probleme ergeben sich aus der Organknappheit sowie der geringen Größe der jeweiligen Em¬ pfängerpools, so daß wegen des hohen HLA-Polymorphismus nur sehr selten gute Matchgrade zu erreichen sind. Da zudem die Organkonservierung noch immer nur für wenige Stunden möglich
ist, können Cross-matches zum Antikörpernachweis bei HLA- präsensibilisierten Empfängern z . Zt . lediglich retrospektiv durchgeführt werden.
Die einzige z.Zt. verfügbare Möglichkeit der Unterdrückung immunologischer Abstoßungsreaktionen besteht im Einsatz meh¬ rerer immunsuppressiv wirkender Medikamente. Die derzeitige Generation dieser Wirkstoffe besitzt jedoch noch immer er¬ hebliche Nebenwirkungen auf die physiologische Infektabwehr des Patienten, was zu einem Dilemma in der notwendigen Be¬ handlung führt: Da sich beginnende schwere Infektionen (wie z.B. mit Zytotomegalie-Virus) häufig nicht eindeutig genug von Rejektionskrisen abgrenzen lassen, kann die Entscheidung für eine der beiden Möglichkeiten von elementarer Bedeutung für den weiteren Verlauf sein.
Eine konzeptuale Alternative zur unspezifischen medikamentö¬ sen Immunsuppression bestünde in einer Modulation derjenigen immunologischen Reaktionspartner, die an den Abstoßungsreak¬ tionen beteiligt sind. Zum einen wäre dabei die Induktion einer selektiven Toleranz des Immunsystems des Empfängers gegenüber den fremdwirkenden Spender-Antigenen zu nennen, zum anderen das Ausschalten der Immunogenität des Transplan¬ tats. Jedoch ließen sich bisher in keinem dieser beiden Be¬ reiche Ergebnisse erzielen, die einen therapeutischen Ein¬ satz gerechtfertigt hätten.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit das technische Pro¬ blem zugrunde, Mittel bereitzustellen, die die oben geschil¬ derten Probleme, die bei der Organtransplantation auftreten, nämlich die Notwendigkeit der Gabe von Immunsuppressiva zur Vermeidung von immunologischen Abstoßungsreaktionen und die damit verbundenen Komplikationen, überwinden.
Die Lösung dieses technischen Problems erfolgt durch die Be¬ reitstellung der in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausfüh- runαsformen. Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß
sich die Expression der Gene, die für die immunologische Ab¬ stoßungsreaktion verantwortlich sind, selektiv mit Hilfe von Ribozymen erniedrigen oder eliminieren läßt . Damit werden auf der Ebene der Transkription individualcharakteristische Zelloberflächenmoleküle, die für derartige Reaktionen ver¬ antwortlich sind, inaktiviert, beispielsweise zum Zweck der Transplantierbarkeit MHC-kompatibler Organe.
Somit betrifft die Erfindung ein Ribozym, das dadurch ge¬ kennzeichnet ist, daß es einen katalytischen Bereich (a) und einen Hybridisierungsbereich (b) umfaßt, wobei der Hybridi¬ sierungsbereich im wesentlichen (1) zu allen mRNAs korriOle- mentär ist, die von den Vertebraten-Genen einer spezifischen Familie von eng verwandten MHC-Allelen transkribiert werden, oder (2) zur mRNA, die von einem Vertebraten-Gen eines ein¬ zelnen MHC-Allels transkribiert wird, und diese mRNA(s) se¬ lektiv spalten kann, wobei die mRNA(s) einen Zielnucleinsäu- rebereich mit den folgenden Eigenschaften enthalten: Er ist im Fall (1) innerhalb aller Gene einer spezifischen Familie eng verwandter MHC-Allele im wesentlichen konser¬ viert, unterscheidet sich jedoch im Fall (1) und (2) von Ge¬ nen aller anderen MHC-Allele in einem solchen Ausmaß, daß die Spaltung der von den Genen der anderen MHC-Allele transkribierten mRNAs durch das Ribozym eliminiert ist, wodurch die selektive Erniedrigung oder Hemmung der Expres¬ sion aller Gene einer gewünschten Familie eng verwandter MHC-Allele oder des Gens eines einzelnen MHC-Allels durch selektive Spaltung der von diesen Genen oder diesem Gen transkribierten mRNA(s) ermöglicht wird.
Der hier verwendete Begriff "Ribozym" bezeichnet eine RNA, die mit einer ZielLRNA spezifisch interagieren, und diese an einer definierten Stelle irreversibel spalten kann. Vorzugs¬ weise besitzt das Ribozym eine zentrale Sequenz, die zur Ziel-RNA nicht komplementär ist und für dessen katalytische Aktivität verantwortlich ist (katalytischer Bereich (a) ) und zwei flankierende Sequenzen, die zu zwei benachbarten Se-
quenzen der Ziel-RNA im wesentlichen komplementär sind
(Hybridisierungsbereich (b) ) , so die Bindung des Ribozyms über Basenpaarung und dadurch die selektive Spaltung der Ziel-RNA erlauben.
Bei dem erfindungsgemäßen Ribozym kann es sich beispiels¬ weise um ein "Hammerhead"-, "Hairpin"- oder "Axehead"-Ribo¬ zym handeln.
Die Struktur von "Hammerhead"-Ribozymen ist dem Fachmann be¬ kannt (siehe auch Figur 2) und auch beispielsweise in Sy- mons, Ann. Rev. Biochem. 61 (1992), 641-671, und Rossi, Methods 5 (1993) , 1-5, beschrieben. Wie nachstehend erwähnt, kann der Fachmann die katalytische Struktur so modifizieren, daß sie für die geplante Anwendung optimale Ergebnisse hin¬ sichtlich Effektivität und Substratspezifität liefert.
"Hairpin"-Ribozyme wurden ursprünglich als Teil des Minus- Stranges der TRSV-Satelliten RNA identifiziert. Es konnte inzwischen gezeigt werden, daß diese Ribozyme Ziel-RNAs wirksam in trans spalten können, wobei der Wirkungsmechanis¬ mus ähnlich dem der "Hammerhead"-Ribozyme ist. Die für Sub¬ stratbindung und katalytische Wirkung verantwortlichen Be¬ reiche wurden bestimmt, sowie außerdem invariable Struktur¬ bzw. Sequenzmotive charakterisiert. Das Spaltmotiv der Ziel- RNA ist N'GNPy (N ist G, C, U oder A, Py ist C oder U) (siehe beispielsweise Rossi, a.a.O., und Hampel et al. , Nucleic Acids Res. 18 (1990), 299-304) . Anhand der im Stand der Technik dargestellten Erfordernisse bezüglich der für eine wirksame Spaltung der Ziel-RNA erforderlichen Struktur und Sequenz des "Hairpin"-Ribozyms und bezüglich des Spalt¬ motivs auf der Ziel-RNA kann der Fachmann unter Verwendung von Standardverfahren ein Ribozym konstruieren, das die ge¬ wünschten Eigenschaften besitzt.
"Axehead"-Ribozyme wurden ursprünglich als Teil der genomi¬ schen und antigenomischen RNA des Hepatitis Delta Virus be¬ stimmt. Auch hier konnte die für eine Spaltung in trans er-
forderliche Minimalsequenz bzw. -Struktur ermittelt werden und, wie vorstehend für die "Hammerhead"- und "Hairpin"-Ri¬ bozyme beschrieben, kann der Fachmann anhand der im Stand der Technik beschriebenen Daten "Axehead"-Ribozyme konstru¬ ieren, die die für die Zwecke der Erfindung erforderlichen Eigenschaften aufweisen (siehe beispielsweise Been, Trends Biochem. Sei. 19 (1994), 251-256, und Wu et al. , Nucleic Acids Res. 21 (1993) , 4193-4199) .
Für festgelegte Zielsequenzen mit dem zugehörigen, hochspe¬ zifischen Ribozym wurde beobachtet, daß sich durch eine An¬ passung des katalytischen Bereichs eine stark erhöhte kata¬ lytische Aktivität erreichen läßt (Koizumi, et al. , Nucleic Acids. Res. 17 (1989), 7059-7071), Koizumi and Ohtsuka, in: Murray J.A.H. (Hrsg) . Antisense RNA and DNA. Wiley-Liss, New York, (1992) , 373-381) . Falls die kinetischen Daten eine zu geringe Ribozym-Effizienz zeigen, kann der Fachmann auch eine Optimierung der Ribozym-Struktur durch die inzwischen recht gut etablierten " in vi tro Evolutionsverfahren" vorneh¬ men (Joyce, in: Murray, J.A.H. (Hrsg.) Antisense RNA and DNA. Wiley-Liss, New York (1992) 353-372, und Yvon and Alt- man, Science 263 (1994) , 1269-1273) .
Unter dem hier verwendeten Begriff "Familie eng verwandter MHC-Allele" sind Gruppen von MHC-Allelen zu verstehen, deren DNA-Sequenzen trotz Punktmutationen oder Genkonversionen noch immer eine hochgradige Homologie aufweisen (Beispiel: HLA-Al/3/11) (Kato et al. , J. Immunol. 143 (1989), 3371ff.) .
In der vorliegenden Erfindung ist der Begriff "Familie eng verwandter MHC-Allele" weiterhin so definiert, daß diese Al¬ lele in ihrem Zielnucleinsäurebereich so ausreichend homolog sind, daß das Ribozym sich an alle von den Genen dieser Al¬ lele transkribierten mRNAs innerhalb dieses Bereichs anla¬ gern und diese spalten kann.
Der hier verwendete Begriff "im wesentlichen komplementär" bedeutet, daß die Komplementarität zwischen Ribozym und Zielnucleinsäurebereich so hoch ist, daß sie die spezifische Anlagerung des Ribozyms über Hybridisierung und selektive Spaltung des Zielnucle-insäurebereichs unter den Bedingungen, bei denen das Ribozym angewendet wird, gestattet. Die Ribo¬ zyme sind vorzugsweise zum Zielnucleinsäurebereich vollstän¬ dig komplementär.
Der hier verwendete Begriff "im wesentlichen konserviert, unterscheidet sich jedoch von Genen aller anderen MHC-Al¬ lele" bedeutet einerseits, daß sich die Gene einer bestimm¬ ten Familie eng verwandter MHC-Allele in dem mRNA-Bereich, an den sich das Ribozym anlagert, in nicht mehr als 1 Nucleotid außerhalb des zentralen Bereichs (= N2NUNN2 bezo¬ gen auf die in Fig. 1 abgebildeten N5NUNN5-Sequenzen) unter¬ scheiden, vorzugsweise vollständig homolog sind, bzw. ande¬ rerseits, daß der Unterschied zu den entsprechenden mRNA-Be- reichen der Gene aller anderen MHC-Allele so groß ist, daß eine selektive Spaltung erreicht wird. Dieser Unterschied sollte so groß sein, daß sich die Sequenz des Zielnuclein- säurebereichs und des entsprechenden Nucleinsäurebereichs der Gene aller anderen MHC-Allele in mindestens 1 Nucleotid, vorzugsweise mindestens 3 Nucleotiden innerhalb des zentra¬ len Bereichs, unterscheiden, abhängig von der Position des Nucleotids und davon, ob es sich um ein G, C, A oder U han¬ delt.
Der hier verwendete Begriff "selektive Erniedrigung oder Hemmung" bedeutet, daß die Expression der Gene der gewünsch¬ ten Familie eng verwandter MHC-Allele in einem solchen Aus¬ maß unterdrückt wird, daß die gewünschte medizinische Wir¬ kung erreicht wird.
Die selektive Inhibition der Genexpression in Zellen mittels des erfindungsgemäßen Ribozyms bedeutet somit nicht, daß das Zielgen irreversibel geschädigt oder eliminiert werden
müßte. Vielmehr führt der Einsatz der Ribozyme vorteilhaf¬ terweise nur zur selektiven Inhibition der Translation die¬ ses Gens. Die Eigenschaft von Ribozymen zur spezifischen Bindung von Ziel-RNA und deren Inaktivierung durch Spaltung ließ sich bereits mehrfach anhand der spezifischen Inhibi¬ tion von HIV-RNA demonstrieren (Lisziewicz et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (1993) , 8000-8004; Yu et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (1993) , 6340-6344; Morgan and Ander¬ son, Annu. Rev. Biochem. 62 (1993) , 191-217; Yamada et al. , Gene Therapy 1 (1994) , 38-45) .
In der vorliegenden Erfindung wird der konzeptuale Ansatz geltend gemacht, vorzugsweise gezielt die Expression be¬ stimmter MHC-Genprodukte durch Ribozyme herabzuregulieren, um die Transplantation genetisch MHC-differenter Organe, Ge¬ webe oder Zellen zu ermöglichen, sowie MHC-assoziierte Au- toimmunerkrankungen zu behandeln.
Für die Herabregulation von MHC-Genprodukten, beispielsweise HLA in menschlichen transplantierten Geweben, erweist es sich als großer Vorteil, daß die Sequenzen der polymorphen mRNA-Bereiche bereits bekannt sind (Bodmer et al. , Hum. Im¬ muno1. 41 (1994) , 1-20) und mit Hilfe vorhandener PCR-Pri- merpaare über PCR aus genomischer DNA kloniert werden konn¬ ten. Innerhalb der polymorphen Sequenzbereiche sind mehrere Segmente erkennbar, die sich durch hochvariable Sequenzen auszeichnen. Gemäß den Ergebnissen mit bereits gut unter¬ suchten Beispielen für "Hammerhead"-Ribozyme konnte ein all¬ gemein gültiges Strukturmodell für aktive Ribozyme dieses Typs definiert werden (Abb. 2) . Dabei ist in der Ziel-RNA die Triplettsequenz "5'NUN3'" Voraussetzung für eine effi¬ ziente Spaltung (Ruffner et al. , Biochemistry 29, (1990) , 10695-19702) . Dabei müssen Basenpaare zwischen dem Dinucleo- tid "5 'NU" in der Ziel-RNA und dem komplementären Antisense- Ribozym ausgebildet werden, während das Nucleotid "N3 ' " un- gepaart vorliegen muß.
In einem speziellen Beispiel konnte erfolgreich demonstriert werden, daß diese Bedingungen zur hochspezifischen Erkennung von Ziel-RNA genutzt werden können, die sich nur durch eine einzige Punktmutation unterscheiden (Koizumi et al. , Nucleic Acid Res. 17, (1989) , 7059-7071) .
Diese einzige, in Publikationen detailliert untersuchte Punktmutation betrifft nicht MHC-Allele, sondern ein Onko- gen, außerdem wurde nur die zentrale Nucleotidposition in der Target-RNA (inaktivierendes G in Position 17; vgl. Fig. 4) untersucht, die nicht in die Hybridisierung mit dem Ribo¬ zym einbezogen ist. Die vorliegende Erfindung erlaubt dage¬ gen die Ableitung von Regeln, die auch eine Differenzierung durch Punktmutationen in hybridisierenden Bereichen ermögli¬ chen.
Für die Anwendung des Ribozyms der vorliegenden Erfindung erwies sich der außerordentliche Polymorphismus der HLA-Gene als sehr vorteilhaft, da es dadurch bevorzugt möglich ist, im Spenderorgan spezifisch nur die Expression derjenigen HLA-Moleküle zu reduzieren, die aus Sicht des Empfängers in¬ kompatibel sind. Negative Auswirkungen auf physiologisch re¬ levante zellbiologische Abläufe beim Empfänger sind demzu¬ folge nach dem gegenwärtigen Stand der Erkenntnisse kaum zu erwarten. In Figur 3 ist beispielsweise ein Ribozym gezeigt, das spezifisch eine von DRB1 0101 codierte mRNA binden und spalten kann, während bei der von DRB1 1501 codierten RNA aufgrund von 4 sich von DRB1 0101 unterscheidenden Nucleoti- den eine Spaltung unterbleibt.
Der Zielnucleinsäurebereich kann somit aus Genombereichen, die den polymorphen Regionen innerhalb der MHC-Allele ent¬ sprechen, ausgewählt werden. Diese Regionen können durch ge¬ eignete Verfahren identifiziert werden, beispielsweise durch Vergleich der Nucleinsäuresequenzen der veröffentlichten MHC-Allele. Die Selektivität der Spaltung kann dadurch er¬ reicht werden, daß die Nicht-Ziel-RNAs entweder mit dem Ri-
bozym nicht ausreichend hybridisieren, es also zu keiner An¬ lagerung und damit zu keiner Spaltung kommt, und/oder das für eine Spaltung erforderliche, konservierte Motiv auf der Nicht-Ziel-RNA nicht vorhanden ist, beispielsweise im Fall der "Hammerhead"-Ribozyme das an geeigneter Stelle relativ zum Hybridisierungsbereich (a) gelegene Motiv bei der Ziel- RNA "NUN" ist, an entsprechender Position der Nicht-Ziel-RNA beispielsweise "NCN" (siehe Figur 2) . Dabei kann es zwar zur Anlagerung des Ribozyms, nicht jedoch zur Spaltung der RNA kommen. Es erweist sich beispielsweise bei der Differenzie¬ rung zwischen Sequenzen, die das Ziel bzw. kein Ziel sein sollen, auch als besonders vorteilhaft, wenn die essentiel¬ len Basenpaare in Pos. 1 und Pos. 2 des NUN-Triplets in die Unterscheidung einbezogen werden (Koizumi et al. , Nucleic Acids Res. 17 (1989) , 7059-7071, Ruffner et al. , Bio- chemistry 29 (1990) , 10695-10702) .
Alle Allele des Subtyps HLA-DR1 enthalten beispielsweise die ideale Zielsequenz AUC bzw. GUC als Triplett 31 (DRB1*0101, DRB1*0102, DRB1*0103, DRB1*0104 bzw. DRB1*1001 in Fig. 1) . Dagegen ist UUC in allen anderen mRNAs vorhanden; dies be¬ deutet eine doppelt reduzierte Aktivität: Das ungünstige U in Pos. 1 und eine U:U Fehlpaarung an Stelle des essentiel¬ len Basenpaares .
Die Allele des Subtyps HLA-DR3 , -DR11 und -DR8 (Sequenzen DRB1*03011 bis DRB1*0304 und 'DRB1*11011 bis DRB1*0810, Fig. 1) enthalten die Idealsequenz GUA (Codons 9/10) . Die anderen sind mit GCA oder GCU nicht spaltbar.
Bei den Allelen des Subtyps HLA-DR4 (DRB1*0401 bis DRB1*0415) ist GUU das Codon 11. Die anderen enthalten hier CUU oder die sehr ungünstigen CCU, GCU, UCU oder GAU. Abschließend soll noch ein andersartiges Beispiel erwähnt werden, dem aus logistischen wie auch aus Spezifitäts-Be- trachtungen große Bedeutung zukommt: Die Subtypen HLA-DR1, - DR2 und -DR4 enthalten beispielsweise GUC bzw. GUA als Codon 36/37. In der Basenpaarung mit einem einzigen Antisense-Ri- bozvm erweisen sich diese drei Subtypen innerhalb der vier
genannten als identisch, während GAA in Subtyp HLA-DR3 des¬ sen Spaltung verhindert. Somit können in geeigneten Fällen mit nur einem einzelnen "Hammerhead"-Ribozym eine ganze Reihe von HLA-Subtypen gleichzeitig erfaßt werden. Je nach dem Grad der Inkompatibilität einer individuellen Spender- Empfänger-Kombination muß daher lediglich ein Ribozym einge¬ setzt werden, um ein oder mehrere Spender-Allele in ihrer Expression zu reduzieren.
Bei Anwendung dieses konkreten Beispiels auf die nord¬ deutsche Bevölkerung würde sich anhand der hiesigen HLA-DR- Genfrequenzen folgendes Bild ergeben: Die insgesamt 6 mögli¬ chen heterozygoten bzw. homozygoten Kombinationen HLA- DR1/DR2, -DR1/DR4, -DR2/DR4 sowie -DRI, -DR2, -DR4 sind ver¬ gleichsweise häufig und bei insgesamt 63 % der Bevölkerung nachzuweisen. Demgegenüber stehen 35 % der Population, die keines dieser Antigene geerbt haben. Hieraus kann der Fach¬ mann ableiten, daß bereits für 5 % aller HLA-DR-inkompa¬ tiblen Spender-Empfänger-Kombinationen das oben erwähnte Ri¬ bozym allein ausreicht. Durch eine ähnliche Vorgehensweise können vom Fachmann leicht andere Sequenzbereiche ausgewählt werden, die es erlauben, passende Ribozyme mit hoher Wirkung und Spezifität zu entwerfen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ribozyms sind die Gene der MHC-Allele Säugergene, vorzugs¬ weise menschliche Gene.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin¬ dungsgemäßen Ribozyms befindet sich der Zielnucleinsäurebe¬ reich im HLA-Klasse I- oder HLA-Klasse II-Komplex, vorzugs¬ weise in den polymorphen Sequenzen der HLA-A, -B, -C und -G Loci der Klasse I oder HLA-DR, -DQ und -DP Loci der Klasse II.
In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform des erfin¬ dungsgemäßen Ribozyms umfaßt der Zielnucleinsäurebereich
eine der Sequenzen in Figur 1. Vorzugsweise ist der Ziel¬ nucleinsäurebereich eine der Sequenzen in Figur 1.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin¬ dungsgemäßen Ribozyms handelt es sich um ein "Hammerhead"-, "Hairpin"- oder "Axehead"-Ribozym.
Das erfindungsgemäße "Hammerhead"-Ribozym ist vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, daß der Hybridisierungbereich (b) aus zwei Domänen besteht, die den katalytischen Bereich (a) flankieren und zu dem Zielnucleinsäurebereich ausreichend komplementär sind, um an alle mRNAs selektiv binden zu kön¬ nen, die von einer gewünschten Familie eng verwandter MHC- Allele transkribiert werden, oder an die RNA, die von einem gewünschten einzelnen MHC-Allel transkribiert wird, um diese RNAs selektiv spalten zu können.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfin¬ dungsgemäßen "Hammerhead"-Ribozyms kann dieses durch die folgende allgemeine Formel dargestellt werden: b a b
5' [N3_2o] [CUGANGARN0_30YGAAA] [N3_2OJ3' ,
wobei N G, C, A oder U sein kann, R ein Purin und Y ein Py- rimidin ist, und wobei der zentrale Bereich NQ_3O der Se¬ quenz (a) durch einen Linker, der keine Nucleinsäure dar¬ stellt, z.B. eine Kohlenwasserstoffkette sein kann (Thomson et al., Nucleic Acid Research 21 (1993) , 5600-5603) ersetzt sein kann.
Die konservierten Nucleotide innerhalb des katalytischen Be¬ reichs sind für eine katalytische Wirkung essentiell, können aber auch vom Fachmann gegebenenfalls mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens (Joyce, a.a.O., Yan and Altman, a.a.O.) so verändert werden, daß das Ribozym in seiner Effi¬ zienz und Selektivität günstig beeinflußt wird. Die Länge des Hybridisierungsbereichs (b) (N3_2o) hängt von vielen
Faktoren ab und wird so gewählt, daß eine ausreichende Hy¬ bridisierung mit der zu spaltenden RNA unter den gewählten Bedingungen (wie z.B. Temperatur, Ionenmilieu) eintritt, um eine effiziente Spaltung zu ermöglichen, daß aber - falls der Unterschied zwischen Ziel-RNA und Nicht-Ziel-RNA nicht das Spaltmotiv selbst umfaßt -, eine ausreichende Hybridi¬ sierung mit der Nicht-Ziel-RNA nicht mehr stattfindet. Die Wahl der Länge des Hybridisierungsbereichs hängt somit bei¬ spielsweise vom GC-Gehalt der RNAs und der Anzahl der zwi¬ schen Ziel-RNA und Nicht-Ziel-RNA verschiedenen Nucleotide ab. Vorzugsweise sind die Längen des 5' -Hybridisierungsbe¬ reichs und des 3 ' -Hybridisierungsbereichs gleich, können aber auch asymmetrisch sein, z.B. eine Kombination von drei und 20 Nucleotiden aufweisen. Die Gesamtlänge des Hybridisierungsbereichs (b) beträgt 12 bis 30 Nucleotide.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz, die das erfindungs¬ gemäße Ribozym codiert. Vorzugsweise ist diese DNA-Sequenz in einem rekombinanten Vektor enthalten wie z.B. pcDNA3 (Fa. Invitrogen) .
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die DNA- Sequenz in dem rekombinanten Vektor unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors, um eine effiziente Transkription zu ermöglichen. Derartige Promotoren sind dem Fachmann be¬ kannt und umfassen beispielsweise den Glucocorticoid-indu¬ zierbaren Promotor im MMTV-LTR, späte und frühe Promotoren von SV40, den CMV-Promotor, MLV-LTR Promotor, RSV-Promotor, polIII-Promotor (Adenovirus VA1) , Herpes simplex (HSV) "immediate-early" 4/5 Promotor, etc.
Promotor-Ribozym codierende DNA kann direkt oder mit Hilfe eines Virus in die Zelle eingebracht werden. Beim direkten Verfahren wird die DNA beispielsweise über ein poly-L-Lysin an ein Fab-Fragment gebunden und von den das entsprechende Antigen tragenden Zellen absorbiert (Ferkol et al. , J. Clin. Invest. 95 (1995), 493-502). Bei Verwendung eines Virus wird
die in ihn verpackte DNA mittels des Virus in die Zelle eingeschleust. Wird die Promotor-Ribozym Einheit 5'- und 3'- seitig von viralen "inverted terminal repeats" flankiert, kann diese Einheit in das Genom integrieren (Goodman et al. , Blood 84 (1994) , 1492--1500) . Ist dies nicht der Fall, so liegt die DNA episomal vor (Flotte et al. , Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 11 (1994) , 517-521) . Beispielsweise handelt es sich bei dem Virus um Adenoviren (Brody und Crystal, Ann. N.Y. Acad. Sei. 716 (1994) , 90-101) , "adeno-associated-vi- rus" (AAV) in Kombination mit kationischen Liposomen (Philip et al., Mol. Cell. Biol. 14 (1994) , 2411-2418) , Adenovirus in Kombination mit Retroviren (Adams et al. , J. Virol. 69 (1995) , 1887-1894) , Sendai-Viren (von der Leyen et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 92 (1995) , 1137-1141) , Retro¬ viren (Rettinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91 (1994) , 1460-1464) oder Vaccinia-Viren (Lee et al. , Cancer Res. 54 (1994) , 3325-3328) . Gegebenenfalls kann der rekom¬ binante Vektor zusätzlich ein nachweisbares Markergen tra¬ gen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt außerdem ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Ribozyms, wobei es sich um enzymatische oder chemische Verfahren handeln kann. Bei¬ spielsweise kann die DNA-Sequenz, die das Ribozym codiert, in einen in einem prokaryotischen Wirt replizierbaren Vek¬ tor, unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors, bei¬ spielsweise eines SP6-, T3- oder T7-Promotors, inseriert werden, was nach Gewinnung des amplifizierten Plasmids aus dem Wirt die in vitro Transkription der das Ribozym codie¬ renden DNA-Sequenz und die Gewinnung von Ribozym-RNA er¬ laubt. Alternativ kann das Ribozym durch ein chemisches Ver¬ fahren, beispielsweise ein auf der Phosphoramidit-Chemie ba¬ sierendes Verfahren (Sproat et al. , Nucleosides & Nucleoti- des 14 (1995) , 255-273) , in großen Mengen synthetisiert wer¬ den.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Ribozym, das so modifiziert ist, daß eine Resistenz gegenüber Nucleasen erhalten wird. Da¬ durch erhöht sich die Verweilzeit und damit die Wirksamkeit des Ribozyms am Zielort, beispielsweise in bestimmten Zellen eines Patienten. Außerdem können dadurch die zu applizie- rende Menge des Ribozyms und ggf. damit in Zusammenhang ste¬ hende Nebenwirkungen erniedrigt werden.
Beispiele für solche Modifikationen sind die Substitution der 2 ' -OH-Gruppen der Ribose, durch 2'-H-, 2 ' -0-methyl- , 2'- 0-allyl-, 2 ■ -Fluor- oder 2 ' -Amino-Gruppen (Paolella, et al., EMBO J. 11 (1992) , 1913-1919, und Pieken et al. , Science 253 (1991) , 314-317) oder die Modifizierung von Phosphodiester- bindungen, wobei beispielsweise ein oder zwei Sauerstoff¬ atome gegen Schwefel ausgetauscht werden (Phosphorthioat bzw. Phosphordithioat,- Eckstein, Ann. Rev. Biochem. 54 (1985) , 367-402, und Beaton et al. , in: Eckstein, F. (Hrsg.) Oligonucleotides and analogues - A practical approach - Ox¬ ford, JRL Press (1991) , 109-135) bzw. gegen eine Methyl¬ gruppe (Methylphosphonat; Miller, ebenda, 137-154) . Weitere Modifikationen umfassen die Konjugation der RNA mit poly-L- Lysin, Polyalkylderivaten, Cholesterin oder PEG. Vorzugs¬ weise enthalten die erfindungsgemäßen Ribozyme mindestens eine der vorstehend beschriebenen Phosphatmodifikationen und/oder mindestens eine der vorstehend beschriebenen Ribo- semodifikationen.
Die Transkription der das erfindungsgemäße Ribozym codieren¬ den DNA-Sequenzen führt zur Synthese von Ribozymen, die die gewünschte Ziel-RNA inaktivieren können. Damit eignen sich sowohl die das Ribozym codierenden DNA-Sequenzen als auch die erfindungsgemäßen Ribozyme selbst als Arzneimittel.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit außerdem Arzneimit¬ tel, die die das erfindungsgemäße Ribozym codierende DNA oder einen, die das erfindungsgemäße Ribozym codierende DNA
umfassenden Vektor, ggf. in Kombination mit einem pharmazeu¬ tisch verträglichen Träger, enthalten.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Arzneimittel, die das erfindungsgemäße Ribozym enthalten.
Abhängig davon, ob das Ribozym selbst oder die das Ribozym codierende DNA-Sequenz, ggf. in einem rekombinanten Vektor, appliziert wird, kann die Verabreichung auf unterschiedli¬ chen Wegen erfolgen. Im ersten Fall erfolgt die Verabrei¬ chung beispielsweise nach Kopplung der 3 ' -Enden der Ribozyme an Poly- (L-Lysin) über Standardverfahren, wie sie beispiels¬ weise von Leonetti et al . , in: Cohn and Moldave (Hrsg.) , Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology 44 (1993) , 143-146 (New York, Academic Press) beschrieben sind, durch Mikroinjektion nach dem Fachmann bekannten Verfahren (siehe z.B. Leonetti et al. , PNAS USA 88 (1991) , 2702-2706) , nach Einkapselung in Liposomen, beispielsweise durch das von Farhood (Farhood et al. , Ann. N.Y. Acad. Sei. 716 (1994) 23- 34) beschriebene Verfahren, nach Verpackung in Phagen (Picket und Peabody, Nucleic Acids Res. 21 (1993) , 4621- 4626) , oder durch Peptid-vermittelte Einschleusung in die Zellen, wie sie beispielsweise von Derossi et al . , J. Biol. Chem. 269 (1994) , 10444-10450, beschrieben wurde. Desweite¬ ren kann durch Koppeln der Promotor-Ribozym-DNAs an spezifi¬ sche Antikörper oder andere geeignete Liganden eine gezielte Einschleusung des Ribozyms oder der Promotor-Ribozym codie¬ renden DNAs in gewünschte Organe, Gewebe oder Zellen er¬ reicht werden (Leonetti et al. , PNAS USA 87 (1990) , 2448- 2451) . Die Verabreichung erfolgt beispielsweise systemisch oder lokal, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, via Katheter oder durch Inhalation von Aerosolen.
Im zweiten Fall erfolgt die Verabreichung beispielsweise über eine Transfektion, beispielsweise über dem Fachmann be¬ kannte Standardverfahren wie Calciumpräzipitation, Elektro-
poration, das DEAE-Dextran-Verfahren, über kationische Lipo¬ somen, beispielsweise Lipofectin, Polyamine, das Trans- ferrin-Polylysin-Verfahren oder Verknüpfung der DNA oder des rekombinanten Vektors an einen spezifischen Antikörper oder einen anderen Liganden. Die Verabreichung kann, wie vorste¬ hend beschrieben, erfolgen.
Die Formulierung des wirksamen Bestandteils kann ggf. in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Trägern, bei¬ spielsweise einem Verdünnungsmittel, Excipienten, Netzmit¬ tel, grenzflächenaktive Mittel, Bindemittel etc. abhängig von der Art der Verabreichung, erfolgen.
Der wirksame Bestandteil wird in einer geeigneten Dosis ver¬ abreicht, die vom Patienten selbst, der Art und Schwere der Erkrankung etc. abhängt. Die erforderliche Dosismenge kann vom Fachmann routinemäßig bestimmt werden, wobei auch be¬ rücksichtigt wird, ob die Verabreichung als Einzeldosis er¬ folgt oder, über einen bestimmten Zeitraum verteilt, durch mehrfache Dosen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsge¬ mäße Arzneimittel zur transienten oder permanenten Suppres- sion der Expression aller Gene aus einer gewünschten Familie eng verwandter MHC-Allele oder des Gens eines einzelnen MHC- Allels in Geweben, Zellen oder Organen in vivo oder ex vivo verwendet . Transiente Expression wird im wesentlichen durch die nicht in das Genom integrierte, Ribozym-codierende DNA erreicht, welche bei Zellteilung inäqual an die Nachkommen¬ schaft verteilt und somit "ausverdünnt" wird (Flotte et al. , Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 11 (1994) , 517-521) . Als der Zeitraum, bis keine nennenswerten Transkriptmengen mehr nachgewiesen werden können, werden zwei Wochen bis drei Mo¬ nate angenommen, wobei die Schwankungen Gewebe- und Vektor¬ typisch sind. Das gleiche gilt für chemisch synthetisierte Ribozyme. Permanente Expression wird im wesentlichen durch die in das Genom integrierte, Ribozym-codierende DNA er-
reicht, von welcher dauerhaft Transkripte gebildet werden (Goodman et al., Blood 84 (1994) , 1492-1500) . Unter in vivo wird die Verabreichung im Körper verstanden. Unter ex vivo wird die Behandlung von explantierten Organen verstanden, also einer Ribozymbehandlung, während des Zeitraums inner¬ halb dessen sich das Organ außerhalb eines Körpers befindet.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Arzeimittel zur Unterdrückung einer "graft-versus-host"-Reaktion (GvHR) oder einer "host-versus- graft" -Reaktion" (HvGR) verwendet. Hierbei handelt es sich um außerordentlich schwerwiegende Immunreaktionen, bei denen (a) die transplantierten immunkompetenten Zellen des Spen¬ ders den Empfänger mit z.T. fatalen Folgen angreifen (GvHR) und/oder (b) der verbliebene funktionsfähige Teil des Immun¬ apparats des Empfängers transplantierte Organe/Gewebe/Zellen attackiert (HvGR) . Ferner werden diese erfindungsgemäßen Arzneimittel vorzugsweise zur Eliminierung der durch die Blutgruppen-Polymorphismen, vorzugsweise der Allele der ABO-, Rhesus- oder Kell-Blutgruppensysteme, induzierten Inkompatibilität verwendet.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform wer¬ den die erfindungsgemäßen Arzneimittel zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen verwendet, die eine Assoziation mit HLA-Genen aufweisen. Nach dem derzeitigen Erkenntnisstand sind bestimmte HLA-Antigene unmittelbar in die Pathogenese einzelner Autoimmunerkrankungen mit einbezogen. Als derzeit am besten dokumentierte Beispiele für HLA-assoziierte Autoimmunerkrankungen sind der juvenile Diabetes mellitus, die rheumatoide Arthritis oder die Zöliakie zu nennen (Thorsby, Immunologist 3, (1995) , 51-58) .
Beschreibung der Figuren:
Figur 1: Sequenzen der polymorphen Kette der HLA-MHC-Klasse» I (HLA-A. -B. -C) und HLA-MHC-Klasse II (HLA-DPB, - DOB. -DRB)
Die Listen enthalten alle nach dem Stand vom Ok¬ tober 1994 bekannten HLA-Klasse 1 (HLA-A, HLA-B, HLA-C) und Klasse 2 (HLA-DPB, HLA-DQB, HLA-DRB) Al¬ lele des jeweils polymorphen Anteils des Gesamtmo¬ leküls. Diesen Listen schließen sich jeweils die für die Ribozyme relevanten mRNA-Zielsequenzen an. Sie wurden der Reihe ihres Auftretens nach durchnu¬ meriert und mit dem Buchstaben des entsprechenden Allels versehen. Über diesen befindet sich in klei¬ nen fetten Buchstaben die jeweilige Consensus-Se- quenz mit Numerierung: Codon-Nummern im Falle von KLasse 2 Sequenzen (Triplett Nr.) , Exon- und Basen- Nummern im Fall von Klasse 1 Sequenzen. Mit Aus¬ nahme der Ribozym-Zielsequenz entspricht das Zähl- verfahren der von Bodmer et al. festgelegten Nomen¬ klatur (Bodmer et al. , Eur. J. Immunogen. 21 (1994) , 485-517) . Von den Sequenzen sind jeweils fünf Basen vor und fünf Basen nach dem "NUN" Motiv (N= A oder U oder G oder C) gemäß dem Schema "N5 NUN N5" dargestellt, enthalten also die für eine eindeutige Ribozym-Spezifität notwendige Zielse¬ quenz . Ein Bindestrich bedeutet Übereinstimmung mit der in der ersten Sequenz-Zeile angegebenen Consen- sus-Sequenz. Sterne innerhalb der Sequenz markieren nicht bekannte Positionen.
Fiσur 2 : Beispiel der Struktur eines "Hammerhead"-Ribozvms
Die Hybridisierung von einem Segment der Ziel-RNA (Zielsequenz schraffiert) mit einem Antisense-Ribo- zym erfolgt durch Basenpaarung in den Helices I und III. Die Spaltung der Ziel-RNA erfolgt hier am 3'-
Ende des Trinucleotids "NUN" [Pfeil] . Die inva¬ riablen Sequenzpositionen sind angegeben, für va¬ riable Nucleotide wurden die Buchstaben N (alle vier Nucleotide) , R (Purin) oder Y (Pyrimidin) ein¬ gesetzt. Die -Längen der Helices I und III können variiert werden, ebenso Helix II zur Optimierung von Struktur und kinetischer Aktivität des Ribo¬ zyms .
Figur 3 : Selektivität der Spaltung durch ein "Hammerhead"- Ribozym
In Figur 3A hybridisiert das grau unterlegte Ribo¬ zym an eine von DRB1 10101 codierte mRNA und spal¬ tete diese spezifisch an der mit dem Pfeil gekenn¬ zeichneten Stelle. In Figur 3B ist dies wegen der Fehlpaarungen nicht der Fall .
Figur 4 : Sequenz des Oligoribonucleotidsubstrats (obere Se¬ quenz, Triplett 34 bis 41 in der DRl-mRNA) und Struktur des "Hammerhead"-Ribozyms RB124 (untere Sequenz) .
Die in der Substratsequenz angegebenen Ziffern ent¬ sprechen dem üblichen Nummerierungssystem für "Hammerhead"-Ribozyme.
Figur 5 : Beispiele für Spaltungsreaktionen an Mutanten des Oligoribonucleotidsubstrats mit dem Ribozym RB124 Es sind jeweils vier Bahnen für die jeweilige Sub¬ stratsequenz und die Zielsequenz (Positionen 16.2 bis 1.1) entsprechend den Angaben über dem Gel ge¬ zeigt, wobei GUC C die ideale Zielsequenz dar¬ stellt. 100 fmol Substrat und ansteigende Mengen des Ribozyms wurden eingesetzt. Die Verhältnisse [S] : [R] sind jeweils über den Bahnen angegeben (von 0 Ribozym als Kontrolle bis zu einem dreifachen mo¬ laren Überschuß) . Die Analyse wurde auf einem dena¬ turierenden 20 % Polyacrylamid-Gel durchgeführt und
die Spaltungsraten wurden densitometrisch bestimmt (siehe Tabelle I) .
Figur 6 : Beispiele für Spaltungsreaktionen an vier mRNA-Seg- menten mit dem Ribozym RB124 :
Die jeweiligen Substrate sind über dem Gel angege¬ ben, wobei für jedes Substrat 4 Bahnen gezeigt sind. Es wurden 100 fMol Substrat und ansteigende Mengen Ribozym verwendet . Die Verhältnisse [S] : [R] sind jeweils über den Bahnen angegeben (von 0 Ribo¬ zym als Kontrolle bis zu einem neunfachen molaren Überschuß) . Die Analyse wurde auf einem denaturie¬ renden 8 % Polyacrylamid-Gel durchgeführt und die Spaltungsraten wurden densitometrisch bestimmt (siehe Tabelle II) .
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 (Allgemeine Methodik)
1.1 01igoribonucleotidsubsträte
Ein 25mer-0ligoribonucleotid wurde durch enzymatische RNA-Synthese erhalten, d.h. durch . Transkription mit T7- RNA-Polymerase. Im Handel erhältliche (TIB MOL.BIOL. , Berlin) , teilweise doppelsträngige Matrizen wurden ver¬ wendet (Milligan et al . , Nucleic Acids Res. 15 (1987) , 8783-8798) . Ein 42mer-Matrizenstrang enthielt die das gewünschte 25mer-Transkript codierende DNA-Sequenz, zu¬ sätzlich befand sich die 17mer-Promotorsequenz für die T7-RNA-Polymerase am 3 ' -Ende (Krupp, Gene 72 (1988) , 75-89) . Um einen funktionellen doppelsträngigen Promo¬ tor zu erhalten, wurde vor der enzymatischen RNA-Syn¬ these mit T7-RNA-Polymerase, d. h. vor der Trans¬ kription, das komplementäre I7mer-Oligonucleotid zuge¬ fügt. Die Transkripte wurden intern markiert, indem etwa 1 μCi [α-32P] -UTP zum Transkriptionsreaktionsge- misch zugegeben wurde. Dadurch konnten die molaren Aus-
beuten durch Cerenkov-Messung der gelgereinigten Trans¬ kripte bestimmt werden. Zusätzlich war im Trans- kriptionsreaktionsmedium das Dinucleotid ApG enthalten, um eine 5 ' -Endmarkierung zu erleichtern. Die Markie¬ rungsreaktion wurde mit 5 pMol gelgereinigter RNA, 10 μCi [γ-32P] -ATP und 5 Einheiten T4-Polynucleotid-Ki- nase durchgeführt (Kleineidam et al. , Nucleic Acids Res. 21 (1993) , 1097-1101) . Die 5 ' -markierten Oligori- bonucleotide wurden erneut gelgereinigt und in den Spaltassays mit den Ribozymen verwendet.
1.2 mRNA-Fragmente als Substrate
Es wurden vier DR-Subtypen (DR-1, DR-2, DR-3 und DR-4) ausgewählt. Die entsprechenden Plasmide für die Trans¬ kription wurden durch PCR-Clonierung erhalten. Die mRNA-Segmente befanden sich unter der Kontrolle eines Promotors für SP6-RNA-Polymerase und wurden durch voll¬ ständige Sequenzierung charakterisiert. Die Plasmide wurden durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym EcoRV linearisiert, wobei die Transkriptionsreaktionen mit SP6-RNA-Polymerase Transkripte mit einer Länge von 377 Nucleotiden ergaben. Die Transkripte wurden intern mar¬ kiert, indem etwa 10 μCi [α-32P] -UTP im Transkrip- tionsreaktionsgemisch enthalten waren. Dadurch konnten die molaren Ausbeuten durch Cerenkov-Messung der gel- gereinigten Transkripte bestimmt werden. Diese Trans¬ kripte wurden direkt als Substrate in den Spaltassays mit den Ribozymen verwendet.
1.3 "Hammerhead"-Ribozyme
Zwei Zielbereiche wurden in den mRNA-Segmenten ausge¬ wählt und entsprechend die komplementären "Hammerhead" - Ribozyme entworfen. Das Ribozym RB4 war gegen die Nucleotidpositionen 23 - 44 gerichtet und das Ribozym RB124 gegen die Nucleotidpositionen 100 - 121.
1.4 Spaltassays mit Ribozymen
Eine 10 μl-Reaktion enthielt 100 fMol Substrat und 0 - 300 fMol Ribozym für die 10 Oligoribonucleotide und 0 - 900 fMol Ribozym für DR-Transkripte. Oligoribonucleo- tidsubstrate und -das Ribozym wurden in 40 mM Tris-HCl
(pH-Wert 8.0) durch einminütiges Erhitzen auf 80 °C an¬ einander gelagert, anschließend wurde 12 mM Magnesium¬ chlorid zugegeben und die Reaktion 60 Minuten bei 50 °C
(oder 37 °C) zugeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe des gleichen Volumens Gelauftragspuffer (8M Harnstoff, 0,03 % Xylencyanol und Bromphenolblau) , der 20 mM EDTA enthielt, beendet. Die Analyse erfolgte auf denaturie¬ renden 20 % Polyacrylamid-Gelen mit nachfolgender Auto- radiographie. Mit den DR-Transkripten wurde keine Vor¬ Anlagerung durchgeführt. Die Substrat-RNA und Ribozyme wurden getrennt 5 Minuten unter Reaktionsbedingungen vorinkubiert, dann zum Start der Reaktion vermischt. Im Anschluß daran wurde das Verfahren, wie für die Oligo¬ ribonucleotide beschrieben, durchgeführt, die Analyse wurde jedoch auf denaturierenden 8 % Polyacrylamidgelen durchgeführt.
Beispiel 2
Spezifische Spaltung von Oligoribonucleotidsubstraten Die Struktur des idealen Substrats und des "Hammerhead"-Ri¬ bozyms RB124 sind in Fig. 4 gezeigt. Es wurden unterschied¬ liche Oligoribonucleotidsubstrate verglichen, die jeweils nur eine einzelne Basenänderung an den Positionen 16.2, 16.1 bzw. 1.1 enthielten. Sie wurden als Substrate in Spaltassays mit Ribozymen verwendet, wobei die Ergebnisse in Tabelle I zusammengefaßt sind. Fig. 5 zeigt ein Beispiel der Ergeb¬ nisse. Wie bereits von Ruffner et al. , Nucleic Acids Res. 18 (1990) , 6025 - 6029, gezeigt, führen entsprechende kompensa- torische Austausche in den Ribozymsequenzen zum Beibehalt einer 100 %igen Komplementär!tat zwischen Substrat und Ribo¬ zym. Der Austausch von G16.2 durch A oder U führt zu einer
nur geringfügig erniedrigten Spalteffizienz (57 % bzw. 25 %) , während diese bei C16.2 etwa 8 % betrug. Abweichend davon wurde eine starke Spaltung mit A und U beobachtet, selbst wenn keine Paarung mehr möglich war, während diese mit C nur noch sehr gering war. Jede Änderung an dem zentra¬ len U16.1 (gepaart oder ungepaart) führte zu sehr stark ver¬ ringerten Spaltraten. Für Sequenzänderungen in der Position 1.1 waren keine früheren Daten verfügbar. Wurde die Basen¬ paarung an dieser Position unterbrochen, so war die Spal¬ tungseffizienz sehr stark verringert, während eine nicht standardgemäße G:U-"wobble"-Paarung mit Ul.1 im Substrat gut toleriert wurde. Die beobachtete Temperaturabhängigkeit der relativen Spaltraten ist mit den Beobachtungen von Ruffner et al. , Biochemistry 29 (1990), 10695-10702, vergleichbar.
Tabelle I
Vergleich der unterschiedlichen Oligoribonucleotidsubstrate
Zielsequenz Kommentar Relative Spalteffizienz bei (16.2 - 1.1) 50 °C 37 °C
GUCC Ideale Paarung 100 (a) 100 (b) AUCC Fehlpaarung: A16.2:C 23 40 UUCC Fehlpaarung: Ul6.2 :C 26 27 CUCC Fehlpaarung: Cl6.2 :C 1.6(c) 1.8(c> GGCC Fehlpaarung: G16.1:A nil nil GACC Fehlpaarung: A16.1:A 0.3<c) 0.4(c) GCCC Fehlpaarung: C16.1:A nil nil GUCG Fehlpaarung: Gl.1:G 0.6(c) 2(c) GUCA Fehlpaarung: AI.1:G 0.3(c) ι_(c) GUCU Wobble: U1.1:G 50 85
(a) Bei 50 °C wurden etwa 35% der 100 fMol Substrat von 33 fMol RB124 gespalten.
(b) Etwa 30 % Spaltung bei 37 °C.
(c) Diese Werte wurden nicht direkt bestimmt, sondern von Reaktionen mit einem Überschuß von RB124 (300 fMol) kalkuliert, wobei von einem linearen Anstieg bei an¬ steigender Ribozymkonzentration ausgegangen wurde.
Beispiel 3
Spezifische Spaltung von mRNA-Segmenten
Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt. Ein Strukturbeispiel ist in Fig. 3, entsprechende Ergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt. Die beobachteten Spezifitaten sind nachstehend beschrieben.
Ribozym RB4 sollte nur eines der vier getesteten RNA-Sub- strate speichern, wobei es zu DR4 (GUU-Zielsequenz) ideal komplementär war. Die anderen drei mRNAs sollten nicht ge¬ spalten werden.
DRI (CUU-Zielsequenz) mit einer C:C-Fehlpaarung und weiteren an den Flanken bei Gl.3 , U1.4, Ul.5, AI.9 und G16.7, U 16.8.
DR2 (CCU-Zielsequenz) mit einer C:C-Fehlpaarung und der zen¬ tralen C:A-Fehlpaarung und weiteren an den Flanken bei G.1.3, AI.4, G1.5, Gl.6 und G16.7, U16.8.
DR3 (UCU-Zielsequenz) mit einer U:C-Fehlpaarung und der zen¬ tralen C:A-Fehlpaarung und weiteren an den Flanken bei Cl.2, G1.3, U1.4, C1.5 und C16.3, U16.5.
Das Ribozym RB124 sollte drei der vier getesteten Substrat- RNAs spalten: Es war zu DRI (GUC-Zielsequenz) ideal komple¬ mentär und auch zu DR4 (GUA-Zielsequenz) , wobei DR2 eine einzelne G:U-Wobblepaarung an der peripheren Flanke (G an Position 16.8) enthielt.
RB124 sollte DR3 nicht spalten, das ebenfalls die Wobblepaa- rung bei G16.8 enthielt, die Zielsequenz GAA mit der zentra¬ len A:A-Fehlpaarung die Spaltung jedoch verhindern sollte.
Die Ergebnisse zeigen, daß die beiden Ribozyme RB4 und RB124 die gewünschten Ziel-RNAs effizient und spezifisch spalten konnten, die anderen RNAs jedoch nicht spalteten.
Tabelle II
Spalteffizienzen mit mRNA-Segmenten mit einer Länge von 377 Nucleotiden als Substrat.
Substrat Zielsequenz Spalteffizienz in % bei (Ribozym) 50 °C 37 °C
DRI (RB4) CUU U nil nil
DR2 (RB4) CCU U nil nil
DR3 (RB4) UCU U nil nil
DR4 (RB4) GUU U 20 5
DRI (RB124) GUC C 53 8
DR2 (RB124) GUC C (Wobble G16.8) 10 2
DR3 (RB124) GAA C nil nil
-DR4 (RB124) GUA C 22 5