DE69720481T2 - Verfahren zur verwendung von oligonukleotiden mit modifizierten cpg dinukleosiden - Google Patents

Verfahren zur verwendung von oligonukleotiden mit modifizierten cpg dinukleosiden Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung bezieht sich auf modifizierte Oligonukleotide, die nützlich für Genexpressionsstudien und für den therapeutischen Antisense-Ansatz sind.
  • Zusammenfassung des verwandten Fachgebiets
  • Das Potential zur Verwendung von Oligonukleotiden als Inhibitoren der spezifischen Genexpression in einem therapeutischen Antisense-Ansatz wurde zum ersten Mal in drei Artikeln, die 1977 und 1978 veröffentlicht wurden, nahe gelegt. Paterson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 4370–4377 (1977) offenbaren, dass die zellfreie Translation von mRNA durch Bindung eines komplementären Oligonukleotids an die mRNA inhibiert werden kann. Zamecnik und Stephenson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 280–284 und 285–288 (1978), offenbaren, dass ein synthetisches 13-mer-Oligonukleotid, das komplementär zu einem Teil des Rous-Sarkomavirus (RSV)-Genoms ist, die RSV-Replikation in infizierten Zellkulturen inhibieren. kann und die RSV-vermittelte Transformation von primären Küken-Fibroblasten in maligne Sarkomazellen inhibieren kann.
  • Seit diesen frühen Studien wurde die Fähigkeit von Antisense-Oligonukleotiden, die Virus-Vermehrung zu inhibieren, fest etabliert. Die US-PS 4,806,463 lehrt, dass die Vermehrung des humanen Immundefizienzvirus inhibiert werden kann durch Oligonukleotide, die komplementär zu einer der verschiedenen Regionen des HIV-Genoms sind. Die US-PS 5,194,428 beschreibt die Inhibierung der Influenzavirus-Replikation durch Phosphorothioat-Oligonukleotide, die komplementär zu dem Influenzavirus Polymerase 1-Gen sind. Agrawal, Trends in Biotechnology 10: 152–158 (1992), bespricht die Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden als antivirale Mittel.
  • Antisense-Oligonukleotide wurden auch als anti-parasitische Mittel entwickelt. Die PCT-Veröffentlichung WO 93/13740 offenbart die Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden zur Inhibierung der Vermehrung von medikamentenresistenten Malaria-Parasiten. Tao et al., Antisense Research and Development 5: 123–129 (1995), lehren die Inhibierung der Vermeh- rang von Schistosoma-Parasiten durch Antisense-Oligonukleotide.
  • Kürzlich erwiesen sich Antisense-Oligonukleotide vielversprechend als Kandidaten zur therapeutischen Anwendung für Krankheiten, die aus der Expression zellulärer Gene resultieren. Die PCT-Veröffentlichung WO 95/09236 offenbart die Aushebung von beta-Amyloid-induzierten neuralen Zelllinien-morpologischen Abnormalitäten durch Oligonukleotide, die beta-Amyloid-Expression inhibieren. Die PCT-Veröffentlichung WO 94/26887 offenbart den Rückgang von abnormalem Spleißen eines Globin-Gentranskripts durch Oligonukleotide, die komplementär zu bestimmten Teilen dieses Transkripts sind. Die PCT-Anmeldung PCT/US94/13685 offenbart die Inhibierung von Tumorigenität durch Oligonukleotide, die komplementär zu dem Gen sind, das DNA-Methyltransferase kodiert.
  • Die Entwicklung verschiedener Antisense-Oligonukleotide als therapeutische und diagnostische Mittel wurde kürzlich von Agrawal und Iyer, Cunent Opinion in Biotechnology 6: 12–19 (1995) besprochen.
  • Da das Interesse an dem therapeutischen Antisense-Ansatz gewachsen ist, wurden verschiedene Anstrengungen unternommen, um die pharmakologischen Eigenschaften von Oligonukleotiden durch Modifikation des Zuckerphosphat-Rückgrats zu verbessern. Die US-PS 5,149,797 beschreibt chimäre Oligonukleotide, die eine Phosphorothioat-Kernregion zwischen Methylphosphonat oder Phosphoramidat-flankierenden Regionen besitzen. Die PCT-Veröffentlichung WO 94/02498 offenbart Hybrid-Oligonukleotide, die 2'-O-substituierte Ribonukleotide haben, die eine DNA-Kernregion flankieren.
  • Zur Zeit wird viel über die pharmakodynamischen Eigenschaften von Oligonukleotiden entdeckt. Agrawal et al., Clinical Pharmcokinetics 28: 7–16 (1995) und Zhang et al., Clincal Pharmacology and Therapeutics 58: 44–53 (1995), offenbaren die Pharmakokinetik von anti-HIV-Oligonukleotiden in humanen Patienten. Einige dieser neuen Entdeckungen haben zu neuen Herausforderungen geführt, die zur Optimierung von Oligonukleotiden als therapeutische Mittel überwunden werden müssen. Zum Beispiel offenbaren Kniep et al., Nature 374: 546–549 (1995), dass Oligonukleotide, die das CG-Dinukleotid flankiert von bestimmten andere Sequenzen enthalten, eine mitogene Wirkung haben. Wir haben entdeckt, dass viele Nebenwirkungen, die durch Phosphorothioat-Oligonukleotide erzeugt werden, eine Konsequenz der Phosphorothioat-verknüpften CpG-Dinukleotide sind. Es besteht daher ein Bedarf an modifizierten Oligonukleotiden, die Genexpressions-inhibierende Eigenschaften beibehalten, während sie weniger Nebenwirkungen als konventionelle Phosphorothioat-Oligonukleotide erzeugen.
  • KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft modifizierte Oligonukleotide, die nützlich für Studien der Genexpression und für den therapeutischen Antisense-Ansatz sind. Die Erfindung stellt modifizierte Oligonukleotide zur Verfügung, die die Genexpression inhibieren und weniger Nebenwirkungen als konventionelle Phosphorothioat-Oligonukleotide erzeugen. Insbesondere stellt die Erfindung Verfahren zur Verwendung von CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotiden zur Verfügung, zur Modulation von Genexpression mit reduzierter Splenomegalie und reduzierter Depletion von Blutplättchen im Verhältnis zu konventionellen CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotiden.
  • In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung CpG-enthaltende Phosphorothioat-Oligonukleotide und Zusammensetzungen zur Verfügung, die von Bedeutung sind für die Inhibierung spezifischer Genexpression mit reduzierten Nebenwirkungen. Diese Inhibierung der Genexpression kann als eine Alternative zur Mutantenanalyse zur Bestimmung der biologischen Funktion von spezifischen Genen in Zell- oder Tiermodellen verwendet werden. Diese Inhibierung der Genexpression kann auch zur therapeutischen Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die durch Expression von Genen eines Virus oder eines Pathogens verursacht werden oder durch die unangebrachte Expression von zellulären Genen. Insbesondere stellt die Erfindung eine Zusammensetzung zur Inhibierung spezifischer Genexpression mit reduzierten Nebenwirkungen zur Verfügung, wobei die Zusammensetzung ein modifiziertes CpG-enthaltendes Phosphorothioat-Oligonukleotid umfasst, das komplementär zu einem Teil einer genomischen Region oder zu einem Gen für das Inhibierung der Expression gewünscht wird oder zu einer RNA, die von einem solchen Gen transkribiert wurde, ist; wobei alle CpG-Dinukleoside, die in dem Oligonukleotid vorkommen, modifiziert sind, und wobei ein CpG-Dinukleosid modifiziert ist, so dass es verglichen mit dem Oligonukleotid eine reduzierte Fähigkeit besitzt, Splenomegalie und Blutplättchen-Depletion auszulösen, wenn es einem Säuger verabreicht wird, im Verhältnis zu einem ansonsten identischen Oligonukleotid, das ein unmodifiziertes Phosphorothioat-CpG-Dinukleosid besitzt.
  • In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung von einem modifizierten CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotid zur Verfügung, das komplementär zu einem Teil einer genomischen Region oder zu einem Gen für das Inhibierung einer Expression gewünscht wird oder zu einer RNA, die von einem solchen Gen transkribiert wurde, ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Modulation der Genexpression in einem Säuger mit reduzierten Nebenwirkungen, wobei das Oligonukleotid komplementär zu einem Gen ist, das exprimiert wird und wobei die reduzierten Nebenwirkungen reduzierte Splenomegalie und Blutplätchen-Depletion einschließen, im Verhältnis zu einem ansonsten identischen unmodifizierten CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotid und wobei alle CpG-Dinukleoside, die in dem Oligonukleotid vorkommen, modifiziert sind. In der Verwendung gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird die Zusammensetzung gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung einem Säuger verabreicht, wobei das Oligonukleotid komplementär zu einem Gen ist, das in dem Säuger exprimiert wird.
  • In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung von einem modifizierten CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotid zur Verfügung, das komplementär zu einem Teil einer genomischen Region oder zu einem Gen für das Inhibierung der Expression gewünscht wird oder zu einer RNA, die von einem solchen Gen transkribiert wurde, ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur therapeutischen Behandlung einer Krankheit, die durch abnormale Genexpression verursacht wird, mit reduzierten Nebenwirkungen, wobei das Oligonukleotid komplementär zu einem Gen ist, das abnormal exprimiert wird, wobei diese abnormale Expression die Krankheit verursacht und wobei die reduzierten Nebenwirkungen reduzierte Splenomegalie und Blutplättchen-Depletion einschließen, im Verhältnis zu einem ansonsten identischen unmodifizierten CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotid und wobei alle CpG-Dinukleoside, die in dem Oligonukleotid vorkommen, modifiziert sind. In diesem Zusammenhang bedeutet abnormale Genexpression die Expression eines Gens, das für die Vermehrung eines Virus oder eines prokaryotischen oder eukaryotischen Pathogens benötigt wird, in einem Wirtsorganismus oder unangebrachte Expression eines zellulären Gens des Wirts. Unangebrachte zelluläre Genexpression des Wirts schließt die Expression eines mutierten Allels eines zellulären Gens oder Unterexpression oder Überexpression eines normalen Allels eines zellulären Gens ein, so dass die Krankheit aus dieser unangebrachten zellulären Genexpression des Wirts resultiert.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die Ergebnisse von Blutplättchenzählungen von CD1-Mäusen, denen intraperitoneal Saline, konventionelles Phosphorothioat-Oligonukleotid (91), Methylphosphonatmodifiziertes CpG-Oligonukleotid (255), invertiertes CpG-Oligonukleotid (256) und 5-MethylC-CpG-Oligonukleotid (257) verabreicht wurde.
  • 2 zeigt die Ergebnisse von Milzgewichtsuntersuchungen von CD1-Mäusen, denen intraperitoneal Saline, konventionelles Phosphorothioat-Oligonukleotid (91), Methylphosphonatmodifiziertes CpG-Oligonukleotid (255), invertiertes CpG-Oligonukleotid (256) und 5-MethylC-CpG-Oligonukleotid (257) verabreicht wurde.
  • 3 zeigt die Ergebnisse der Analyse der Plättchenzählungen (Feld A), die ALT-Spiegel (Feld B) und die AST-Spiegel (Feld C) von Fisher-Ratten, denen intraperitoneal Saline, konventionelles Phosphorothioat-Oligonukleotid (1), invertiertes CpG-Oligonukleotid (2), inver- tiertes CpG-Oligonukleotid (3), 5-MethylC-CpG-Oligonukleotid (4), Methylphosphonatmodifiziertes CpG-Oligonukleotid (5), 2'-O-substituiertes CpG-Oligonukleotid (6) verabreicht wurde.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die Erfindung betrifft modifizierte Oligonukleotide, die nützlich für Studien der Genexpression und für den therapeutischen Antisense-Ansatz sind. Alle US-Patente, Patentveröffentlichungen und wissenschaftliche Literatur, die in dieser Beschreibung zitiert werden, zeigen den Wissensspiegel auf diesem Gebiet und werden hiermit durch Referenz eingeschlossen.
  • Die Erfindung stellt modifizierte Oligonukleotide zur Verfügung, die Genexpression inhibieren und die weniger Nebenwirkungen als konventionelle Phosphorothioat-Oligonukleotide erzeugen. Insbesondere stellt die Erfindung modifizierte CpG-enthaltende Oligonukleotide zur Verfügung, die in reduzierter Splenomegalie und Blutplättchen-Depletion resultieren, wenn sie an einen Säuger verabreicht werden, im Verhältnis zu konventionellen CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotiden. Die Erfindung stellt weiterhin Verwendungen von solchen Oligonukleotiden zur Verfügung, zur Modulation der Genexpression in vivo, einschließlich der therapeutischen Behandlung von Krankheiten, die durch unangebrachte Genexpression ausgelöst werden.,
  • In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung modifizierte CpG-enthaltende Phosphorothioat-Oligonukleotide und Zusammensetzungen zur Verfügung, die von Bedeutung für die Inhibierung spezifischer Genexpression mit reduzierten Nebenwirkungen sind. Diese Inhibierung der Genexpression kann als eine Alternative zur Mutantenanalyse verwendet werden, zur Bestimmung der biologischen Funktion von spezifischen Genen in Zell- oder Tiermodellen. Diese Inhibierung der Genexpression kann auch zur therapeutischen Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die durch Expression der Gene eines Virus oder eines Pathogens oder durch unangebrachte Expression von zellulären Genen verursacht werden. Insbesondere stellt die Erfindung eine Zusammensetzung zur Inhibierung spezifischer Genexpression mit reduzierten Nebenwirkungen zur Verfügung, wobei die Zusammensetzung ein modifiziertes CpG-enthaltendes Phosphorothioat-Oligonukleotid umfasst, das komplementär zu einem Teil einer genomischen Region oder zu einem Gen, für das Inhibierung der Expression gewünscht wird oder zu einer RNA, die von einem solchen Gen transkribiert wurde, ist, wobei die reduzierten Nebenwirkungen reduzierte Splenomegalie und Blutplättchen-Depletion einschließen, im Vergleich zu einem ansonsten identischen unmodifizierten CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotid und wobei alle CpG-Dinukleoside, die in den Oligonukleotiden vor kommen, modifiziert sind. Das CpG-Dinukleosid ist 5'-CpG-3', d. h. in der 5'- zu 3'-Orientie- rung ist ein C-Nukleosid kovalent an ein G-Nukleosid durch eine Internukleosid-Verbindung gebunden. Für die erfindungsgemäßen Zwecke gilt ein CpG-Dinukleosid als "unmodifiziert", wenn die Internukleosid-Verbindung eine razemische Phosphorothioat-Verbindung ist und die 5'-Position des C-Nukleosids mit einem Wasserstoffatom besetzt ist. Für die erfindungsgemäßen Zwecke ist ein CpG-Dinukleosid "modifiziert", wenn es von dem unmodifizierten CpG-Dinukleosid abweicht, so dass es auf das Oligonukleotid eine reduzierte Fähigkeit Splenomegalie oder Blutplättchen-Depletion zu verursachen überträgt, wenn es einem Säuger verabreicht wird, im Verhältnis zu einem ansonsten identischen Oligonukleotid, das ein unmodifiziertes Phosphorothioat-CpG-Dinukleosid besitzt. Eine Zusammensetzung von Bedeutung für die Inhibierung spezifischer Genexpression mit reduzierten Nebenwirkungen gemäß diesem Aspekt der Erfindung umfasst ein modifiziertes CpG-enthaltendes Phosphorothioat-Oligonukleotid, das komplementär zu einem Teil einer genomischen Region oder zu einem Gen, für das Inhibierung der Expression gewünscht wird oder zu einer RNA, die von einem solchen Gen transkribiert wurde, ist. Für die erfindungsgemäßen Zwecke schließt der Begriff Oligonukleotid Polymere von zwei oder mehr Desoxyribonukleotiden, Ribonukleotiden oder 2'-Osubstituierten Ribonukleotid-Monomeren oder jede Kombination davon ein. Der Begriff Oligonukleotid umfasst auch solche Polymere, die chemisch modifizierte Basen oder Zucker haben und/oder zusätzliche Substituenten besitzen, einschließlich; ohne Einschränkung, lipophile Gruppen, interkalierende Mittel, Diamine und Adamantan. Für die erfindungsgemäßen Zwecke bezeichnet der Begriff "Phosphorothioat-Oligonukleotid" ein Oligonukleotid, das wenigstens eine Phosphorothioat-Internukleosid-Verbindung enthält, vorzugsweise von etwa 20% bis etwa 100% Phosphorothioat-Internukleosid-Verbindungen und am meisten bevorzugt von etwa 50% bis etwa 100% Phosphorothioat-Internukleosid-Verbindungen. Vorzugsweise besitzen solche Oligonukleotide von etwa 12 bis etwa 50 Nukleotide, am meisten bevorzugt von etwa 17 bis etwa 35 Nukleotide. Für die erfindungsgemäßen Zwecke bedeutet der Begriff "2'-O-substituiert" eine Substitution der 2'-Position des Pentoserestes mit einer niederen -O-Alkylgruppe, die 1–6 gesättigte oder ungesättigte Kohlenstoffatome enthält oder mit einer O-Aryl- oder Allylgruppe, die 2–6 Kohlenstoffatome enthält, wobei diese Alkyl-, Ary1- oder Allylgruppe unsubstituiert oder substituiert sein kann, z. B. mit Halo-, Hydroxy-, Trifluormethyl-, Cyano-, Nitro-, Acyl-, Acyloxy-, Alkoxy-, Carboxyl-, Carbalkoxyl- oder Aminogruppen; oder mit einer Hydroxy-, einer Amino- oder einer Halogruppe, aber nicht mit einer 2'-H-Gruppe. Der Begriff "komplementär" bedeutet die Fähigkeit zu besitzen, an eine genomische Region, ein Gen oder an RNA-Transkripte davon unter physiologischen Bedingungen zu hybridisieren. Diese Hybridisierung ist normalerweise das Ergebnis von basenspezifischer Wasserstoffbindung zwischen komplementären Strängen, vorzugsweise um Watson-Crickoder Hoogsteen-Basenpaare zu bilden, obwohl andere Arten der Wasserstoffbindung genauso wie Basenstapelung auch zur Hybridisierung führen kann. Praktischerweise kann solch eine Hybridisierung aus der Beobachtung spezifischer Genexpressions-Inhibierung geschlussfolgert werden. Die Gensequenz oder RNA-Transkriptsequenz, zu der die modifizierte Oligonukleotidsequenz komplementär ist, wird von der biologischen Wirkung abhängen, die modifiziert werden soll. In einigen Fällen kann die genomische Region, das Gen oder das RNA-Transkript davon von einem Virus sein. Bevorzugte Viren schließen ohne Einschränkung ein, humanes Immundefizienzvirus (Typ 1 oder 2), Influenzavirus, Herpes Simplex Virus (Typ 1 oder 2), Epstein-Barr Virus, Cytomegalovirus, respiratorischer Syncytalvirus, Influenzavirus, Hepatitis B Virus, Hepatitis C Virus und Papillomavirus. In anderen Fällen kann die genomische Region, das Gen oder das RNA-Transkript davon von endogenen Säuger (einschließlich humaner) chromosomaler DNA sein. Bevorzugte Beispiele solcher genomischer Regionen, Gene oder RNA-Transkripte davon schließen ohne Einschränkung ein, Sequenzen die vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) kodieren, beta-Amyloid, DNA-Methyltransferase, Proteinkinase A, ApoE4-Protein, p-Glykoprotein, c-MYC-Protein, BCL-2-Protein und CAPL. In noch anderen Fällen kann die genomische Region, das Gen oder das RNA-Transkript davon von einem eukaryotischen oder prokaryotischen Pathogen stammen, ohne Einschränkung einschließend, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Schistosoma spp. und Mycobacterium tuberculosis.
  • Zusätzlich zu den erfindungsgemäßen modifizierten Oligonukleotiden kann die Zusammensetzung von Bedeutung für die Inhibierung der Genexpression mit reduzierten Nebenwirkungen optional einen der gut bekannten pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel enthalten. Die Zusammensetzung von Bedeutung kann weiterhin eine oder mehrere zusätzliche erfindungsgemäße Oligonukleotide enthalten. Alternativ kann diese Zusammensetzung ein oder mehrere traditionelle Antisense-Oligonukleotide enthalten, so wie ein Oligonukleotid-Phosphorothioat, ein Hybrid-Oligonukleotid oder ein chimäres Oligonukleotid oder es kann jedes andere pharmakologisch aktive Mittel enthalten., In einer bevorzugten Ausführungsform gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist das modifizierte CpG-Dinukleosid ausgewählt aus Alkylphosphonat-CpG, invertiertem CpG, 5-Methylcytosin-CpG, 2'-O-substituiertem CpG, stereospezifischem Phosphorothioat-CpG, Phosphotriester-CpG, Phosphoramidat-CpG und 2'-5'-CpG.
  • Ein Alkylphosphonat-CpG ist ein CpG-Dinukleosid, in dem das C-Nukleosid und das G-Nukleosid durch eine Alkylphosphonat-Internukleosid-Verbindung kovalent miteinander verbunden sind. Alkylphosphonat-CpG-enthaltende Oligonukleotide werden normalerweise unter Verwendung jedes konventionellen Festphasensynthese-Protokolls hergestellt, um die CpG-enthaltenden Oligonukleotide herzustellen, mit der Ausnahme, dass das Alkylphosphonat CpG-Dinukleosid hergestellt wird unter Verwendung jedes Standardverfahrens zur Einführung von Alkylphosphonat-Internukleosid-Verbindungen in Oligonukleotide. Ein besonders bevorzugtes Verfahren für diesen Schritt ist beschrieben in Iyer et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 6: 1393–1398 (1996). Vorzugsweise ist der Alkylrest der Alkylphosphonat-Verbindung ein niederer Alkylrest von 1–6 Kohlenstoffatomen, die optional ungesättigt und/oder gesättigt sein können. Am meisten bevorzugt ist das Alkylphosphonat-CpG ein Methylphosphonat-CpG.
  • Ein invertiertes CpG ist ein 5'-GpC-3'-Dinukleosid. Invertierte CpG-enthaltende Oligonukleotide werden in geeigneter Weise unter Verwendung jedes konventionellen Festphasensynthese-Protokolls zur Herstellung des Oligonukleotids hergestellt, mit der Ausnahme, dass ein G-Monomer-Synthon anstelle des C-Monomer-Synthons verwendet wird und umgekehrt.
  • Ein 5-Methyl-CpG ist ein CpG-Dinukleosid, in dem das C-Nukleosid an der 5 Position der Cytosin Base methyliert ist. 5-MethylC CpG-enthaltende Oligonukleotide werden in geeigneter Weise hergestellt, unter Verwendung jedes konventionellen Festphasensynthese Protokolls hergestellt, um das Oligonukleotid herzustellen, mit der Ausnahme, dass ein 5-MethylC Monomer-Synthon anstelle des C-Monomer-Synthons verwendet wird.
  • Ein 2'-O-substituiertes CpG ist ein CpG-Dinukleosid, in dem die 2'-Position des Pentoserestes substituiert ist, das eine niedere -O-Alkylgruppe, die 1–6 gesättigte oder ungesättigte Kohlenstoffatome enthält oder eine -O-Aryl- oder Allylgruppe, die 2–6 Kohlenstoffatome besitzt, wobei diese Alkyl-, Aryl- oder Allylgruppe unsubstituiert oder substituiert sein kann, z. B. mit Halo-, Hydroxy-, Trifluormethyl-, Cyano-, Nitro-, Acyl-, Acyloxy-, Alkoxy-, Carboxyl-, Carbalkoxyl- oder Aminogruppen; oder mit einer Hydroxy-, einer Amino- oder einer Halogruppe, jedoch nicht mit einer 2'-H-Gruppe. Am meisten bevorzugt ist das 2'-O-substituierte CpG, ein 2'-O-Methylcytosin-enthaltendes CpG oder ein 2'-O-Methylguanosin-enthaltendes CpG oder beides. 2'-O-substituierte CpG-enthaltende Oligonukleotide werden in geeigneter Weise hergestellt durch Verwendung jedes konventionellen Festphasen-Syntheseprotokolls zur Herstellung des Oligonukleotids, mit der Ausnahme, dass ein 2'-O-substituiertes Monomer-Synthon verwendet wird anstelle des Monomer-Synthons.
  • Ein Phosphotriester-CpG ist ein CpG-Dinukleosid, in dem das C-Nukleosid und das G-Nukleosid kovalent durch eine Phosphotriester-Internukleosid-Verbindung miteinander verbunden sind. Phosphotriester-CpG-enthaltende Oligonukleotide werden in geeigneter Weise hergestellt durch Verwendung jedes konventionellen Festphasen-Syntheseprotokolls zur Herstellung des CpG-enthaltenden Oligonukleotids, mit der Ausnahme, dass das Phosphotriester-CpG-Dinukleosid hergestellt wird unter Verwendung jedes Standardverfahren zur Einführung von Phosphotriester-internukleosid-Verbindungen in Oligonukleotide. Ein besonders bevorzugtes Verfahren für diesen Schritt ist beschrieben in Iyer et al., Tetrahedron Letters 37: 1539–1542 (1996). Vorzugsweise ist die Phosphotriester-Verbindung eine Methylphosphotriester-Verbindung.
  • Ein Phosphoramidat-CpG ist ein CpG-Dinukleosid, in dem das C-Nukleosid und das G-Nukleosid kovalent durch eine Phosphoramidat-Internukleosid-Verbindung miteinander verbunden sind. Phosphoramidat-CpG-enthaltende Oligonukleotide werden in geeigneter Weise hergestellt durch Verwendung jedes konventionellen Festphasen-Syntheseprotokolls zur Herstellung des CpG-enthaltenden Oligonukleotids, mit der Ausnahme, dass das Phosphoramidat-CpG-Dinukleosid hergestellt wird unter Verwendung jedes Standardverfahren zur Einführung von Phosphoramidat-Internukleosid-Verbindungen in Oligonukleotide. Ein besonders bevorzugtes Verfahren für diesen Schritt ist beschrieben in Iyer et al., Tetrahedron Letters 37: 1539–1542 (1996). Am stärksten bevorzugt ist die Phosphoramidat-Internukleosid-Verbindung eine primäre Phosphoramidat-Internukleosid-Verbindung.
  • Ein stereospezifisches Phosphorothioat-CpG ist ein CpG-Dinukleosid, in dem das C-Nukleosid und das G-Nukleosid durch eine stereospezifische Phosphorothioat-Internukleosid-Verbindung kovalent miteinander verbunden sind. Stereospezifische Phosphorothioat-CpG-enthaltende Oligonukleotide werden in geeigneter Weise hergestellt unter Verwendung jedes konventionellen Festphasen-Syntheseprotokolls zur Herstellung des CpG-enthaltenden Oligonukleotids, mit der Ausnahme, dass das Phosphoramidat-CpG-Dinukleosid hergestellt wird unter Verwendung eines Verfahrens zur Einführung von stereospezifischen Phosphorothioat-Internukleosid-Verbindungen m Oligonukleotide, bevorzugt, wie beschrieben in Iyer et al., Tetrahedron Asymmetry 6: 1051–1054 (1995).
  • Ein 2'-5'-CpG ist ein CpG-Dinukleosid, in dem das C-Nukleosid und das G-Nukleosid kovalent durch eine 2'-5'-Internukleosid-Verbindung miteinander verbunden sind. Die Internukleosid-Verbindung kann von jedem Typ sein und ist vorzugsweise eine Phosphorothioat- oder Phosphodiester-Verbindung. 2'-5'-CpG-enthaltende Oligonukleotide werden in geeigneter Weise hergestellt durch Verwendung jedes konventionellen Festphasen-Syntheseprotokolls zur Herstellung des CpG-enthaltenden Oligonukleotids, mit der Ausnahme, dass das 2'-5'-CpG-Dinukleosid hergestellt wird unter Verwendung eines Verfahrens zur Einführung von stereospezifischen Phosphorothioat-Intemukleosid-Verbindungen in Oligonukleotide, z. B. wie beschrieben in Dougherty et al., J. Am. Chem. Soc. 114: 6254 (1992) oder Hashimoto und Switzer.
  • Andere Modifikationen des CpG-Dinukleosids schließen Substitutionen der Phosphorothioat-Internukleosid-Verbindung mit jeder anderen Internukleosid-Verbindung ein, einschließlich, ohne Einschränkung, Phosphorothioat, Alkylphosphonothioat, Siloxan, Carbonat, Carboxymethylester, Acetamidat, Carbamat, Thioether, Amid (PNA), verbrücktes Phosphoramidat, verbrücktes Methylenphosphonat, verbrücktes Phosphorothioat und Sulfon-Internukleotid-Verbindungen.
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Zusammensetzungen gemäß diesem Aspekt der Erfindung werden die Oligonukleotide als "chimäre" oder "hybride" Oligonukleotide konfiguriert, z. B. wie jeweils beschrieben in der US-PS 5,149,797 und der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/02498. Kurz, chimäre Oligonukleotide enthalten Oligonukleotid-Regionen mit ionischen Internukleosid-Verbindungen wie auch Oligonukleotid-Regionen mit nicht-ionischen Internukleosid-Verbindungen. Hybrid-Oligonukleotide besitzen Oligonukleotid-Regionen, die DNA enthalten, genauso wie Oligonukleotid-Regionen, die RNA oder 2'-O- substituierte RNA enthalten. Der Fachmann wird erkennen, dass die Elemente von diesen bevorzugten Ausführungsformen kombiniert werden können und dass der Erfinder solche Kombinationen in Erwägung zieht. Zum Beispiel können 2'-O-substituierte Ribonukleotid-Regionen gut von einer bis zu allen nicht-ionischen Internukleosid-Verbindungen enthalten. Alternativ können nicht-ionische Regionen von einer bis zu allen 2'-O-substituierte Ribonukleotide besitzen. Vielmehr können die erfindungsgemäßen Oligonukleotide 2'-O-substituierte oder nicht-ionische Regionen in dem Kernbereich des Oligonukleotids enthalten, flankiert durch Phosphorothioat-enthaltende DNA-Regionen oder umgekehrt und können weiterhin Kombinationen von einem oder mehreren 2'-O-substituierten Ribonukleotid-Regionen und einer oder mehreren nicht-ionischen Regionen enthalten, von denen eine oder beide durch Phosphorothioat-Regionen flankiert werden (vgl. Nucleosides & Nucleotides 14: 1031–1035 (1995) für relevante Synthesetechniken).
  • In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung eine Verwendung eines modifizierten CpG-enthaltenden Phosphorothiaot-Oligonukleotids zur Verfügung, das komplementär zu einem Teil einer genomischen Region oder zu einem Gen, für das Inhibierung der Expression gewünscht wird oder zu einer RNA, die von einem solchen Gen transkribiert wurde, ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Modulation der Genexpression mit reduzierten Nebenwirkungen, wobei dieses Oligonukleotid komplementär zu einem Gen ist, das exprimiert wird, und wobei die reduzierten Nebenwirkungen reduzierte Splenomegalie und Blutplättchen-Depletion einschließen, im Verhältnis zu einem ansonsten identischen unmodifizierten CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotid, und wobei alle CpG-Dinukleoside, die in dem Oligonukleotid vorkommen, modifiziert sind. In der Verwendung gemäß diesem erfindungsgemäßen Aspekt wird eine Zusammensetzung gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung an einen Säuger verabreicht, wobei das Oligonukleotid komplementär zu einem Gen ist, das in dem Säuger exprimiert wird. Vorzugsweise kann diese Verabreichung parenteral, oral, intranasal oder intrarektal sein. Vorzugsweise wird eine Gesamtdosis der Oligonukleotide in einem Bereich von etwa 0,1 mg Oligonukleotid pro kg Körpergewicht pro Tag bis etwa 200 mg Oligonukleotid pro kg Körpergewicht pro Tag liegen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die biologische Wirkung der Splenomegalie und Blutplättchen-Depletion reduziert, nachdem die Zusammensetzung verabreicht wurde, verglichen mit der gleichen Wirkung, die erhalten wird, nach Verabreichung einer ansonsten identischen Zusammensetzung, die die gleiche Menge eines ansonsten identischen Oligonukleotids enthält, mit der Ausnahme, dass dieses Oligonukleotid ein unmodifiziertes CpG-Dinukleosid anstelle des modifizierten CpG-Dinukleosids enthält. Diese bevorzugte biologische Wirkung kann verfolgt werden durch Messen der Blutplättchenspiegel vor und nach Oligonukleotid-Verabreichung. Vorzugsweise werden weniger als etwa 20%, mehr bevorzugt weniger als etwa 10% der Blutplättchen depletiert. Die biologische Wirkung kann auch durch Messung des Serumalanin-Aminotransferase- (ALT) und Serumaspartat-Aminotransferase- (AST) Spiegels nach Oligonukleotid-Verabreichung verfolgt werden. Vorzugsweise werden Serum-ALT- und AST-Spiegel weniger als 2,5-fach, mehr bevorzugt weniger als 2,0-fach steigen.
  • In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines modifizierten CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotids zur Verfügung, das komplementär zu einem Teil einer genomischen Region oder zu einem Gen, für das die Inhibierung der Expression gewünscht wird, oder zu einer RNA, die von einem solchen Gen transkribiert wurde, ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur therapeutischen Behandlung einer Krankheit, die durch abnormale Genexpression verursacht wird, mit reduzierten Nebenwirkungen, wobei das Oligonukleotid komplementär zu einem Gen ist, das abnormal exprimiert wird und diese abnormale Expression verursacht die Krankheit und wobei die reduzierten Nebenwirkungen reduzierte Splenomegalie und Blutplättchen-Depletion einschließen, im Vergleich zu einem ansonsten identischen unmodifizierten CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotid, und wobei alle CpG-Dinukleoside, die in dem Oligonukleotid vorkommen, modifiziert sind. In der Verwendung wird eine Zusammensetzung gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung an ein Individuum, das die Krankheit hat, verabreicht, wobei das Oligonukleotid komplementär zu einem Gen ist, das abnormal exprimiert wird, wobei diese abnormale Expression die Krankheit verursacht. Somit ist dies ein bevorzugtes Beispiel für eine Verwendung zur Modulation der Genexpression in einem Säuger, wie vorstehend für den zweiten Aspekt der Erfindung diskutiert. In diesem Zusammenhang bedeutet abnormale Genexpression die Expression eines Gens, das für die Vermehrung eines Virus oder eines prokaryotischen oder eukaryotischen Pathogens benötigt wird in einem Wirtsorganismus oder unangebrachte Expression eines zellulären Gens des Wirts. Unangebrachte zelluläre Genexpression des Wirts schließt die Expression eines mutierten Allels eines zellulären Gens ein oder Unterexpression oder Überexpression eines normalen Allels eines zellulären Gens, so dass die Krankheit aus dieser unangebrachten zellulären Genexpression des Wirts resultiert. Vorzugsweise sollte diese Verabreichung parenteral, oral, sublingual, transdermal, topisch, intranasal oder intrarektal erfolgen. Die Verabreichung der therapeutischen Zusammensetzung kann durchgeführt werden unter Verwendung bekannter Verfahren zur Dosierung und für Zeiträume, die wirksam sind, die Symptome zu reduzieren oder die Krankheitsmerkmale zu ersetzen. Wenn systemisch verabreicht wird, wird die therapeutische Zusammensetzung vorzugsweise mit einer ausreichenden Dosis verabreicht, um einen Blutspiegel des Oligonukleotids von etwa 0,01 Mikromolar bis etwa 10 Mikromolar zu erreichen. Für lokale Verabreichung können viel geringere Konzentrationen als diese wirksam sein und viel höhere Konzentrationen können toleriert werden. Vorzugsweise wird eine Gesamtdosis des Oligonukleotids von etwa 0,1 mg Oligonukleotid pro Patient pro Tag bis zu etwa 200 mg Oligonukleotid pro kg Körpergewicht pro Tag reichen. Es kann erwünscht sein, simultan oder nacheinander eine therapeutisch wirksame Menge einer oder mehrerer der therapeutischen Zusammensetzungen der Erfindung als einen Einzelbehandlungsabschnitt an ein Individuum zu verabreichen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die biologischen Wirkungen der Splenomegalie und Blutplättchen-Depletion nach Verabreichung der entsprechenden Zusammensetzung reduziert, im Vergleich zu den gleichen Wirkungen, die erhalten werden, wenn eine ansonsten identische Zusammensetzung, die die gleiche Menge eines ansonsten identischen Oligonukleotids enthält, mit der Ausnahme, dass dieses Oligonukleotid ein unmodifiziertes CpG-Dinukleosid anstelle des modifizierten CpG-Dinukleosids enthält, verabreicht wird. Diese biologische Wirkung kann durch Messen des Blutspiegels der Blutplättchen vor und nach Oligonukleotid-Verabreichung verfolgt werden. Vorzugsweise werden weniger als etwa 20% der Blutplättchen depletiert sein, stärker bevorzugt weniger als etwa 10%. Die bevorzugte biologische Wirkung kann auch durch Messen der Serumalanin-Aminotransferase- (ALT) und Serumaspartat-Aminotransferase- (AST) Spiegel nach Oligonukleotid-Verabreichung verfolgt werden. Vorzugsweise werden Serum-ALT- und AST-Spiegel um weniger als das 2,5-fache, mehr bevorzugt um weniger als das 2,0-fache steigen.
  • Die nachstehenden Beispiele sollen die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung weiter darstellen und sind nicht dazu gedacht, den Rahmen der Erfindung eizuschränken.
  • Beispiel 1
  • Synthese, Deprotektion und Reinigung von Oligonukleotiden
  • Oligonukleotid-Phosphorothioate werden unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesizers (Modell 8700, Biosearch, Bedford, MA) unter Verwendung eines Beta-Cyanoethyl-Phosphoramidit-Ansatzes in einem 10-Mikromol-Maßstab synthetisiert. Um die Phosphorothioat-Verbindungen herzustellen, wurden die intermediäre Phosphit-Verbindung, die nach jeder Kopplung erhalten wurde, unter Verwendung von 3H,1,2-Benzodithiol-3H-on-1,1-dioxid oxidiert (vgl. Beaucage, in: Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties, Agrawal (Hrsg.), Humana Press, Totowa, NJ, Seiten 33–62 (1993)). Ähnliche Synthesen wurden durchgeführt, um Phosphodiester-Verbindungen herzustellen, mit der Ausnahme, dass eine Standard-Oxidation durchgeführt wurde unter Verwendung von Standard-Iod-Reagenz. Die Synthese von Methylphosphonat-CpG-enthaltendem Oligonukleotid wurde auf die gleiche Weise durchgeführt, mit der Ausnahme, dass Methylphosphonat-Verbindungen unter Verwendung von Nukleosid-Methylphosphonamidit hergestellt wurden (Glen Research, Sterling, VA), gefolgt von Oxidation mit 0,1 M Iod in Tetrahydrofuran/2,6-Lutidin/Wasser (75 : 25 : 0,25) (vgl. Agrawal & Goodchild, Tet. Lett. 28: 3539–3542 (1987). Deprotektion und Reinigung von Oligonukleotiden wurde gemäß Standardverfahren durchgeführt (vgl. Padmapriya et al., Antisense Res. & Dev. 4: 185–199 (1994)), mit Ausnahme von Oligonukleotiden, die Methylphosphonat-enthaltende Regionen enthielten. Für diese Oligonukleotide wurde das CpG-gebundene Oligonukleotid mit konzentriertem Ammoniumhydroxid 1 Stunde bei Raumtemperatur behandelt und der Überstand wurde entfernt und abgedampft, um einen blassgelben Rest zu erhalten, der dann mit einem Gemisch von Ethylendiamin/Ethanol (1 : 1 v/v) 6 Stunden bei Raumtemperatur behandelt wurde und dann wieder unter reduziertem Druck getrocknet wurde.
  • Beispiel 2
  • Reduzierte in vivo-Salenomegalie unter Verwendung modifizierter CpG-enthaltender Oligonukleotide
  • CD-1-Mäusen und Fischer-Ratten (Charles River Laboratories, Raleigh, NC) wurde tägliche für 7 Tage intravenös eine Dosis von 3-30 mg/kg Körpergewicht eines CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotids, Methylphosphonat-CpG-enthaltenden Phosphorothioat- Oligonukleotids, invertierten CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotids, 5-MethyIC-CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonuklegtids, 2'-O-substituierten CpG oder Saline als Kontrolle injiziert. An Tag 8 wurden die Tiere eingeschläfert und die Milz wurde entfernt und gewogen. Tiere, die mit Methylphosphonat-CpG-enthaltendem Phosphorothioat-Oligonukleotid, invertiertem CpG-enthaltendem Phosphorothioat-Oligonakleotid, 5-MethylC- CpG-enthaltendem Phosphorothioat-Oligonukleotid oder 2'-O-substituiertem CpG behandelt wurden, zeigten eine signifikant geringere Steigerung des Milzgewichts als die, die mit CpG-enthaltenden Oligonukleotid-Phosphorothioaten behandelt wurden. Ähnliche Ergebnisse werden für Phosphotriester-CpG-enthaltende Phosphorothioat-Oligonukleotide, Phosphoramidat-CpG-enthaltende Phosphorothioat-Oligonukleotide und 2'-5'-CpG-enthaltende Phosphorothioat-Oligonukleotide erwartet.
  • Beispiel 3
  • Reduzierte in vivo-Blutalättchen-Depeltion unter Verwendung modifizierter CpG-enthaltender Oligonukleotide
  • CD-1-Mäusen und Fischer-Ratten wurde täglich für 7 Tage eine Dosis von 3-30 mg/kg Körpergewicht eines CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotids, Methylphosphonat-CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotids, invertierten CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotids, 5-MethylC-CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotids, 2'-Osubstituierten CpG oder Saline als Kontrolle injiziert. An Tag 8 wurde den Tieren Blut entnommen und Biutplättchenwerte wurden gemessen. Tiere, die mit Methylphosphonat-CpG-enthaltendem Phosphorothioat-Oligonukleotid, invertiertem CpG-enthaltendem Phosphorothioat-Oligonukleotid oder mit 5-MethylC-CpG-enthaltendem Phosphorothioat-Oligonukleotid behandelt wurden, zeigten signifikant weniger Depletion der Blutplättchen als diejenigen, die mit CpG-enthaltenden Oligonukleotid-Phosphorothioaten behandelt wurden. Ähnliche Ergebnisse werden für Phosphotriester-CpG-enthaltende Phosphorothioat-Oligonukleotide, Phosphoramidat-CpG-enthaltende Phosphorothioat-Oligonukleotide und 2'-5'-CpG-enthaltende Phosphorothioat-Oligonukleotide erwartet.
  • Beispiel 4
  • Reduzierter in vivo-Anstieg in Serum-ALT- und AST-Spiegeln unter Verwendung von modifizierten CpG-enthaltenden Oligonukleotiden
  • CD-1-Mäusen und Fischer-Ratten wurde täglich für 7 Tage eine Dosis von 3–30 mg/kg Körpergewicht eines CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotids, Methylphosphonat-CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotids, invertierten CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotids, 5-MethylC-CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotids, 2'-Osubstituierten CpG oder Saline als Kontrolle intravenös verabreicht. An Tag 8 wurde den Tieren Blut entnommen und Serum-ALT und AST-Spiegel wurden unter Verwendung eines Roche Cobas Fara-Chemie-Analysegeräts (Roche Diagnostics Systems, Branchburg, NJ) gemessen. Tiere, die mit Methylphosphonat-CpG-enthaltendem Phosphorothioat-Oligonukleotid, invertiertem CpG-enthaltendem Phosphorothioat-Oligonukleotid, 5-MethylC-CpG-enthaltendem Phosphorothioat-Oligonukleotid oder mit 2'-O-substituiertem CpG-enthaltendem Phosphorothioat-Oligonukleotid behandelt wurden, zeigten eine signifikante Reduktion in dem Anstieg von Serum-ALT und AST-Spiegeln verglichen mit denjenigen, die mit CpG-enthaltenden Oligonukleotid-Phosphorothioaten behandelt wurden. Ähnliche Ergebnisse werden für Phosphotriester-CpG-enthaltende Phosphorothioat-Oligonukleotide, Phosphoramidat-CpG-enthaltende Phosphorothioat-Oligonukleotide und 2'-5'-CpG-enthaltende Phosphorothioat-Oligonukleotide erwartet.

Claims (4)

  1. Eine Zusammensetzung zur Hemmung spezifischer Genexpression mit verminderten Nebenwirkungen, wobei die Zusammensetzung ein modifiziertes CpG-enthaltendes Phosphorothioat-Oligonukleotid umfasst, das komplementär zu einem Teil einer genomischen Region oder Gen ist, wofür Hemmung der Expression gewünscht wird, oder zu einer RNA, die von einem solchen Gen transkribiert wird, wobei die verminderten Nebenwirkungen verminderte(n) Splenomegalie und Abbau der Blutplättchen verglichen mit einem sonst identischen, nicht modifizierten CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotid einschliessen, und wobei alle CpG-Dinukleoside, die im Oligonukleotid vorhanden sind, modifiziert sind.
  2. Die Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, wobei das modifizierte CpG ausgewählt ist aus Alkylphosphonat-CpG, invertiertes CpG, 2'-O-substituiertes CpG, 5-Methylcytosin-CpG, stereospezifisches Phosphorothioat-CpG, Phosphotriester-CpG, Phosphoramidat-CpG und 2'-5'-CpG.
  3. Die Verwendung eines modifizierten CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotids, das komplementär zu einem Teil einer genomischen Region oder Gen ist, wofür Hemmung der Expression gewünscht wird, oder zu einer RNA, die von einem solchen Gen transkribiert wird, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Veränderung der Genexpression mit verminderten Nebenwirkungen, wobei das Oligonukleotid komplementär ist zu einem Gen, das exprimiert wird, und wobei die verminderten Nebenwirkungen verminderte(n) Splenomegalie und Abbau der Blutplättchen verglichen mit einem sonst identischen, nicht modifizierten CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotid einschliessen, und wobei alle CpG-Dinukleoside, die im Oligonukleotid vorhanden sind, modifiziert sind.
  4. Die Verwendung eines modifizierten CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotids, das komplementär zu einem Teil einer genomischen Region oder Gen ist, wofür Hemmung der Expression gewünscht wird, oder zu einer RNA, die von einem solchen Gen transkribiert wird, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur therapeutischen Behandlung mit verminderten Nebenwirkungen einer Krankheit, die durch fehlerhafte Genexpression verursacht wird, wobei das Oligonukleotid komplementär ist zu einem Gen, das fehlerhaft exprimiert wird und diese fehlerhafte Expression die Krankheit verursacht, und wobei die verminderten Nebenwirkungen verminderte(n) Splenomegalie und Abbau der Blutplättchen verglichen mit einem sonst identischen, nicht modifizierten CpG-enthaltenden Phosphorothioat-Oligonukleotid einschliessen, und wobei alle CpG-Dinukleoside, die im Oligonukleotid vorhanden sind, modifiziert sind.
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Families Citing this family (129)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2711670B1 (fr) 1993-10-22 1996-01-12 Pasteur Institut Vecteur nucléotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation à l'encontre d'une hépatite.
US6727230B1 (en) * 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US7034007B1 (en) 1995-06-07 2006-04-25 East Carolina University Low adenosine anti-sense oligonucleotide, compositions, kit & method for treatment of airway disorders associated with bronchoconstriction, lung inflammation, allergy(ies) & surfactant depletion
US6825174B2 (en) 1995-06-07 2004-11-30 East Carolina University Composition, formulations & method for prevention & treatment of diseases and conditions associated with bronchoconstriction, allergy(ies) & inflammation
US6592877B1 (en) * 1995-09-01 2003-07-15 Corixa Corporation Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis
US6290969B1 (en) * 1995-09-01 2001-09-18 Corixa Corporation Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis
US6458366B1 (en) 1995-09-01 2002-10-01 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis
US20020147143A1 (en) 1998-03-18 2002-10-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US6238921B1 (en) * 1998-03-26 2001-05-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of human mdm2 expression
JP2002514397A (ja) * 1998-05-14 2002-05-21 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー ＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いる造血調節の方法
CN1317009A (zh) * 1998-08-03 2001-10-10 东卡罗来纳大学 低腺苷反义寡核苷酸制剂、组合物、试剂盒及处理
ES2394458T3 (es) * 1998-09-09 2013-01-31 Genzyme Corporation Metilación de vectores plasmídicos
US20030235557A1 (en) 1998-09-30 2003-12-25 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US6172216B1 (en) * 1998-10-07 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of BCL-X expression
US6214986B1 (en) * 1998-10-07 2001-04-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of bcl-x expression
US5959097A (en) * 1998-11-20 1999-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of MEK2 expression
US5962673A (en) * 1998-11-20 1999-10-05 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of inhibitor-kappa B kinase-alpha expression
US5977341A (en) * 1998-11-20 1999-11-02 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of inhibitor-kappa B kinase-beta expression
US5981732A (en) * 1998-12-04 1999-11-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of G-alpha-13 expression
US6140124A (en) * 1999-04-06 2000-10-31 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of P38 mitogen activated protein kinase expression
US20040171566A1 (en) * 1999-04-06 2004-09-02 Monia Brett P. Antisense modulation of p38 mitogen activated protein kinase expression
CN1330513A (zh) * 1999-04-06 2002-01-09 东卡罗来纳大学 低腺苷反义寡核苷酸、组合物、试剂盒及与支气管紧缩、肺炎、过敏及表面活性剂缺失相关的通气途径疾病的治疗方法
US8143386B2 (en) * 1999-04-07 2012-03-27 Corixa Corporation Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses
US6013788A (en) * 1999-04-09 2000-01-11 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Smad3 expression
US6046321A (en) * 1999-04-09 2000-04-04 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of G-alpha-i1 expression
DE19935756A1 (de) * 1999-07-27 2001-02-08 Mologen Forschungs Entwicklung Kovalent geschlossenes Nukleinsäuremolekül zur Immunstimulation
EP1496121A3 (de) * 1999-08-13 2005-02-09 Hybridon, Inc. Modulierung der durch CpG-oligonukleotide verursachte Immunstimulierung durch positionsbedingte Veränderung von Nukleosiden
JP5268214B2 (ja) * 1999-08-13 2013-08-21 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヌクレオシドの位置的修飾によるオリゴヌクレオチドＣｐＧ−媒体免疫刺激の変調
JP2003510370A (ja) * 1999-10-07 2003-03-18 コリクサ コーポレイション Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの融合タンパク質
CA2291367A1 (en) * 1999-12-06 2001-06-06 Isabelle Henry Genetic constructions having a reduced or an increased number of epigenetic control regions and methods of use thereof
AU2001227889A1 (en) 2000-01-14 2001-07-24 The United States of America, represented by The Secretary, Department of Health & Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
ATE487733T1 (de) 2000-02-23 2010-11-15 Glaxosmithkline Biolog Sa Neue verbindungen
AU2001241738A1 (en) * 2000-02-25 2001-09-03 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis and immunotherapy of tuberculosis
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US20040006036A1 (en) * 2000-04-12 2004-01-08 Gmr, A Delaware Corporation Silencing transcription by methylation
PT1284740E (pt) 2000-05-19 2008-07-09 Corixa Corp Tratamento profiláctico e terapêutico de doenças infecciosas, autoimunes e alérgicas com compostos à base de monossacáridos
ES2374620T3 (es) 2000-06-20 2012-02-20 Corixa Corporation Antígeno mtb32a de mycobacterium tuberculosis con el sitio activo inactivado y proteínas de fusión de los mismos.
EP1961819A3 (de) 2000-06-28 2008-11-12 Corixa Corporation Zusammensetzungen und Verfahren zur Heilung und Diagnose von Lungenkrebs
JP2004509970A (ja) * 2000-09-26 2004-04-02 ハイブリドン・インコーポレイテッド 位置的化学変化による免疫刺激オリゴヌクレオチドアナログの免疫刺激活性の調節
EP1985702A3 (de) * 2000-12-08 2010-08-18 Coley Pharmaceutical GmbH CPG-ähnliche Nukleinsäuren und Verwendungsverfahren dafür
GB0105360D0 (en) * 2001-03-03 2001-04-18 Glaxo Group Ltd Chimaeric immunogens
US7105495B2 (en) * 2001-04-30 2006-09-12 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
CA2446788A1 (en) 2001-05-09 2002-11-14 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
US7785610B2 (en) * 2001-06-21 2010-08-31 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—III
PT1404873E (pt) 2001-06-21 2013-07-30 Dynavax Tech Corp Compostos de imunomodulação quiméricos e métodos de utilização dos mesmos
PT1567641E (pt) 2001-08-24 2012-08-21 Uvic Industry Partnerships Inc Proaerolisina contendo sequência de activação de proteases e métodos de uso para o tratamento do cancro da próstata
NZ531814A (en) * 2001-09-20 2005-10-28 Glaxo Group Ltd Vaccines
AU2002353783A1 (en) 2001-09-24 2003-04-07 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of SUPPRESSORS OF CpG OLIGONUCLEOTIDES AND METHODS OF USE
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
WO2003035836A2 (en) * 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
US7700572B2 (en) * 2001-11-02 2010-04-20 Giuliani International, Ltd. SMAD7 inhibitors for the treatment of CNS diseases
WO2003053220A2 (en) 2001-12-17 2003-07-03 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of inflammatory bowel disease
CA2474709A1 (en) * 2002-02-04 2003-08-14 Biomira, Inc. Immunostimulatory, covalently lipidated oligonucleotides
WO2003070187A2 (en) 2002-02-15 2003-08-28 Corixa Corporation Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis
EP1575504A4 (de) 2002-08-01 2009-11-04 Us Gov Health & Human Serv Verfahren zur behandlung von entzündlichen arthropathien mit suppressoren der cpg-oligonucleotide
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
US8043622B2 (en) 2002-10-08 2011-10-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of treating inflammatory lung disease with suppressors of CpG oligonucleotides
ES2639812T3 (es) 2003-01-06 2017-10-30 Corixa Corporation Ciertos compuestos de fosfato de aminoalquil glucosaminida y sus usos
US7960522B2 (en) 2003-01-06 2011-06-14 Corixa Corporation Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use
US7354907B2 (en) 2003-02-07 2008-04-08 Idera Pharmaceuticals, Inc. Short immunomodulatory oligonucleotides
WO2004087203A2 (en) * 2003-04-02 2004-10-14 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations for topical application
ITRM20030149A1 (it) 2003-04-02 2004-10-03 Giuliani Spa Oligonucleotidi (odn) antisenso per smad7 e loro usi in campo medico
CN101454451A (zh) * 2003-10-30 2009-06-10 科勒制药有限公司 具有增强免疫刺激能力的c类寡核苷酸类似物
CN1989439B (zh) 2004-05-06 2010-12-29 美国政府健康及人类服务部 治疗葡萄膜炎的方法以及组合物
AU2005285513B2 (en) 2004-05-25 2011-02-24 Oregon Health And Science University SIV and HIV vaccination using RhCMV- and HCMV-based vaccine vectors
GB0427131D0 (en) * 2004-12-10 2005-01-12 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel combination
WO2006065751A2 (en) 2004-12-13 2006-06-22 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Cpg oligonucleotide prodrugs, compositions thereof and associated therapeutic methods
EP2392347A3 (de) 2005-03-31 2012-01-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Impfstoffe gegen Chlamydieninfektion
KR101352806B1 (ko) 2005-04-29 2014-02-17 인펙셔스 디지즈 리서치 인스티튜트 (아이디알아이) 결핵균 감염을 예방 또는 치료하기 위한 신규한 방법
NZ564954A (en) 2005-06-14 2011-02-25 Protox Therapeutics Inc Method of treating or preventing benign prostatic hyperplasia using modified pore-forming proteins
MX2009003398A (es) 2006-09-27 2009-08-12 Coley Pharm Gmbh Analogos de oligonucleotidos cpg que contienen analogos t hidrofobos con actividad inmunoestimuladora mejorada.
MX351247B (es) * 2007-04-04 2017-10-05 Infectious Disease Res Institute Star Composiciones inmunogenicas que comprenden polipeptidos de mycobacterium tuberculosis y fusiones de los mismos.
AR066405A1 (es) 2007-04-20 2009-08-19 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna
DK2170384T3 (en) 2007-07-02 2016-07-25 Etubics Corp METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF AN adenovirus vector for use in higher vaccination
KR101624751B1 (ko) 2007-11-07 2016-05-27 셀덱스 쎄라퓨틱스, 인크. 인간 수지상 및 상피 세포 205(ｄｅｃ-205)에 결합하는 항체
BRPI0821532A2 (pt) 2007-12-24 2015-06-16 Id Biomedical Corp Quebec Antígenos de rsv recombinantes
EP2278979A4 (de) 2008-05-21 2012-09-26 Us Gov Health & Human Serv Verfahren zur behandlung von pneumokoniose mit oligodesoxynukleotiden
MX2011005915A (es) 2008-12-03 2011-08-17 Proyecto Biomedicina Cima Sl Uso de modulinas solubles en fenol para el desarrollo de vacunas.
EP2445526B1 (de) 2009-06-24 2016-05-11 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Rekombinante rsv-antigene
US8889146B2 (en) 2009-06-24 2014-11-18 Glaxosmithkline Biologicals, Sa Vaccine
EP3988115A3 (de) 2009-07-15 2022-08-17 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Rsv-f-proteinzusammensetzungen und verfahren zu ihrer herstellung
GB0919117D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Process
WO2011101332A1 (en) 2010-02-16 2011-08-25 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Compositions based on the fibronectin extracellular domain a for the treatment of melanoma
KR101958753B1 (ko) 2010-04-13 2019-03-15 셀덱스 쎄라퓨틱스, 인크. 인간 ｃｄ27에 결합하는 항체 및 이의 용도
US20130345079A1 (en) 2010-10-27 2013-12-26 Infectious Disease Research Institute Mycobacterium tuberculosis antigens and combinations thereof having high seroreactivity
EA201390676A1 (ru) 2010-11-08 2013-11-29 Инфекшес Дизиз Рисерч Инститьют Вакцины, содержащие полипептиды неспецифической нуклеозидгидролазы и стерол 24-c-метилтрансферазы (smt), для лечения и диагностики лейшманиоза
EP2505640A1 (de) 2011-03-29 2012-10-03 Neo Virnatech, S.L. Impfstoffzusammensetzungen für vom Birnavirus übertragenen Krankheiten
GB201106357D0 (en) 2011-04-14 2011-06-01 Pessi Antonello Composition and uses thereof
US20150030586A1 (en) 2011-06-21 2015-01-29 Sarah Ellen Warren Compositions and methods for the therapy and diagnosis of cancer
EP2666785A1 (de) 2012-05-23 2013-11-27 Affiris AG Auf Komplementfaktor C5a basierender Impfstoff
BR112015002483A2 (pt) 2012-08-03 2017-11-07 Infectious Disease Res Inst composições e métodos para o tratamento de uma infecção ativa por mycobacterium tuberculosis
CA2879939A1 (en) 2012-08-06 2014-02-13 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel method
US20140037680A1 (en) 2012-08-06 2014-02-06 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Novel method
WO2014031178A1 (en) 2012-08-24 2014-02-27 Etubics Corporation Replication defective adenovirus vector in vaccination
EP2703483A1 (de) 2012-08-29 2014-03-05 Affiris AG PCSK9 Peptidimpfstoff
TW201502136A (zh) 2013-03-15 2015-01-16 Glaxosmithkline Biolog Sa 疫苗
WO2014160987A2 (en) 2013-03-28 2014-10-02 Infectious Disease Research Institute Vaccines comprising leishmania polypeptides for the treatment and diagnosis of leishmaniasis
WO2015018806A1 (en) 2013-08-05 2015-02-12 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Combination immunogenic compositions
EP2952893A1 (de) 2014-06-04 2015-12-09 Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) Verfahren zur Erkennung von antikörpersezernierenden, HLA-spezifischen B-Zellen
EP3888676A1 (de) 2014-06-13 2021-10-06 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogene kombinationen
AR102547A1 (es) 2014-11-07 2017-03-08 Takeda Vaccines Inc Vacunas contra la enfermedad de manos, pies y boca y métodos de fabricación y su uso
AR102548A1 (es) 2014-11-07 2017-03-08 Takeda Vaccines Inc Vacunas contra la enfermedad de manos, pies y boca y métodos de fabricación y uso
ES2881346T3 (es) 2014-12-19 2021-11-29 Regenesance B V Anticuerpos que se unen a C6 humano y usos de los mismos
KR102193635B1 (ko) 2015-01-09 2020-12-21 이투빅스 코포레이션 복합 면역요법을 위한 방법 및 조성물
AU2015384786B2 (en) 2015-03-03 2020-08-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Display platform from bacterial spore coat proteins
US20180044429A1 (en) 2015-03-09 2018-02-15 Celldex Therapeutics, Inc. Cd27 agonists
EP3286213B1 (de) 2015-04-20 2021-08-04 Etubics Corporation Verfahren und zusammensetzungen für eine kombinationsimmuntherapie
CN107708730A (zh) 2015-05-26 2018-02-16 俄亥俄州创新基金会 针对猪流感病毒的基于纳米粒子的疫苗策略
LU92821B1 (en) 2015-09-09 2017-03-20 Mologen Ag Combination comprising immunostimulatory oligonucleotides
GB2542425A (en) 2015-09-21 2017-03-22 Mologen Ag Means for the treatment of HIV
SG10201913248VA (en) 2016-04-18 2020-02-27 Celldex Therapeutics Inc Agonistic antibodies that bind human cd40 and uses thereof
JP2019521095A (ja) 2016-05-21 2019-07-25 インフェクシャス ディズィーズ リサーチ インスティチュート 二次性結核および非結核性マイコバクテリウム感染症を治療するための組成物および方法
MX2018014602A (es) 2016-05-27 2019-06-10 Etubics Corp Composiciones de vacunas neoepitopos y metodos de uso de las mismas.
MX2019003035A (es) 2016-09-16 2019-09-13 Infectious Disease Res Inst Vacunas que comprenden polipeptidos de mycobacterium leprae para la prevencion, el tratamiento y el diagnostico de la lepra.
EP3554538A2 (de) 2016-12-16 2019-10-23 Institute for Research in Biomedicine Neuartige rekombinante rsv-f-präfusionsproteine und verwendungen davon
WO2018162450A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Fundación Para La Investigación Médica Aplicada New inmunostimulatory compositions comprising an entity of cold inducible rna-binding protein with an antigen for the activation of dendritic cells
CA3058979A1 (en) 2017-04-19 2018-10-25 Institute For Research In Biomedicine Novel malaria vaccines and antibodies binding to plasmodium sporozoites
CA3067224A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 Infectious Disease Research Institute Nanostructured lipid carriers and stable emulsions and uses thereof
US11123415B2 (en) 2017-08-16 2021-09-21 Ohio State Innovation Foundation Nanoparticle compositions for Salmonella vaccines
JP7295124B2 (ja) 2017-11-03 2023-06-20 タケダ ワクチン，インコーポレイテッド ジカワクチン及び免疫原性組成物、ならびにその使用方法
WO2019147925A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Nantcell, Inc. Compositions and methods for combination cancer vaccine and immunologic adjuvant therapy
CN112166118A (zh) 2018-03-22 2021-01-01 德克萨斯大学体系董事会 治疗自身免疫性疾病和癌症的可溶性白介素-7受体(sIL7R)调节疗法
US20210198374A1 (en) 2018-04-17 2021-07-01 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-cd27 and anti-pd-l1 antibodies and bispecific constructs
US20230310323A1 (en) 2020-09-04 2023-10-05 Access To Advanced Health Institute Co-lyophilized rna and nanostructured lipid carrier
BR112023020303A2 (pt) 2021-04-09 2023-11-14 Celldex Therapeutics Inc Anticorpos contra ilt4, anticorpo anti-ilt4/pd-l1 bispecífico e seus usos
WO2023077521A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Celldex Therapeutics, Inc Anti-ilt4 and anti-pd-1 bispecific constructs
WO2023114727A1 (en) 2021-12-13 2023-06-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bacteriophage lambda-vaccine system
WO2024052882A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Access To Advanced Health Institute Immunogenic vaccine composition incorporating a saponin

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5194428A (en) * 1986-05-23 1993-03-16 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of influenza virus replication by oligonucleotide phosphorothioates
US4806463A (en) * 1986-05-23 1989-02-21 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides
US5149797A (en) * 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
DE4200433A1 (de) * 1992-01-10 1993-07-15 Otto Hofstetter Verfahren zur herstellung von stabilen fluessigen parfuemrohstoffmischungen mit hohem feststoffgehalt
US5652355A (en) * 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
KR960702518A (ko) * 1993-05-17 1996-04-27 린다 에스, 스티븐슨 Hiv 감염 및 aids에 대한 리보자임 유전자 치료(ribozyme gene therapy for hiv infection and aids)
CN1136327A (zh) * 1993-09-28 1996-11-20 综合医院公司 用反义寡核苷酸调节神经生长并使β/A4淀粉样肽诱导的形态逆转
DE69535905D1 (de) * 1994-07-15 2009-02-26 Coley Pharm Group Inc Immunomodulatorische Oligonukleotide
EP0807171A1 (de) * 1994-12-22 1997-11-19 HYBRIDON, Inc. Herstellung von stereospezifischen phosphorothioatenoligonukleotiden

Also Published As

Publication number Publication date
JP5265067B2 (ja) 2013-08-14
DE69720481D1 (de) 2003-05-08
WO1998011211A2 (en) 1998-03-19
CA2265917C (en) 2008-07-08
JP2001500511A (ja) 2001-01-16
ES2190541T3 (es) 2003-08-01
PT928335E (pt) 2003-07-31
DK0928335T3 (da) 2003-06-16
ATE236248T1 (de) 2003-04-15
US5856462A (en) 1999-01-05
EP0928335A2 (de) 1999-07-14
AU4339997A (en) 1998-04-02
EP0928335B1 (de) 2003-04-02
CA2265917A1 (en) 1998-03-19
WO1998011211A3 (en) 1998-04-16

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