ES2881346T3

ES2881346T3 - Anticuerpos que se unen a C6 humano y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2881346T3
Application number: ES15832821T
Authority: ES
Inventors: Frank Baas; Dijk Marc Van
Original assignee: Regenesance BV
Current assignee: Regenesance BV
Priority date: 2014-12-19
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2021-11-29
Anticipated expiration: 2035-12-18
Also published as: AU2015365583A1; EP3945096A1; US11590222B2; CN107278206A; DK3233912T3; KR20230137502A; JP6738348B2; CN113563468A; PT3233912T; US20210060157A1; JP2020178711A; PL3233912T3; EP3233912B1; EP3233912A1; US20240016926A1; WO2016097865A1; AU2021240139A1; US10675348B2; CA2971542A1; JP2018502598A

Abstract

Un anticuerpo aislado que se une al C6 humano y que es capaz de inhibir la actividad de C6 en un ensayo hemolítico con una IC50 de 0.5 μg/ml o menos, anticuerpo que es un anticuerpo de rata o humanizado y que comprende secuencias CDR1, 2 y 3 de cadena pesada mostradas en SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, y comprende secuencias CDR1, 2 y 3 de cadena ligera mostradas en SEQ ID NO: 11, 12 y 13, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos que se unen a C6 humano y usos de los mismos

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No. de serie 62/094,649, presentada el 19 de diciembre de 2014.

Antecedentes de la invención

El sistema de complemento es parte del sistema inmunológico innato que funciona para ayudar, o "complementar", anticuerpos y células fagocíticas en la eliminación de patógenos de un organismo. Tras la activación del sistema, se produce un conjunto catalítico de reacciones e interacciones que dan como resultado la selección de la célula, el organismo o la partícula activadora para su destrucción. El sistema de complemento comprende un conjunto de más de 30 proteínas plasmáticas y de membrana que actúan juntas en un sistema en cascada regulado para atacar formas extracelulares de patógenos (por ejemplo, bacterias). El sistema de complemento incluye dos cascadas de activación enzimática distintas, la ruta clásica y la ruta alternativa, que convergen en una ruta no enzimática terminal común conocida como ruta de ataque a la membrana.

La primera cascada activada enzimáticamente, conocida como ruta clásica, comprende varios componentes, C1, C4, C2, C3 y C5 (enumerados por orden en la ruta). La iniciación de la ruta clásica del sistema de complemento ocurre después de la unión y activación del primer componente del complemento (C1) por activadores tanto inmunes como no inmunes. C1 comprende un complejo de componentes C1q, Clr y C1s dependiente de calcio, y se activa mediante la unión del componente C1q. C1q contiene seis subunidades idénticas y cada subunidad comprende tres cadenas (las cadenas A, B y C). Cada cadena tiene una región de la cabeza globular que está conectada a una cola similar al colágeno. La unión y activación de C1q por complejos antígeno-anticuerpo se produce a través de la región del grupo de cabeza C1q. Numerosos activadores de C1q que no son anticuerpos, que incluyen proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, se unen y activan C1q a través de un sitio distinto en la región del tallo similar al colágeno. El complejo Clqrs luego cataliza la activación de los componentes del complemento C4 y C2, formando el complejo C4b2a que funciona como una convertasa C3.

La segunda cascada activada enzimáticamente, conocida como ruta alternativa, es una ruta rápida e independiente de anticuerpos para la activación y amplificación del sistema de complemento. La ruta alternativa comprende varios componentes, C3, Factor B y Factor D (enumerados por orden en la ruta). La activación de la ruta alternativa se produce cuando C3b, una forma de C3 escindida proteolíticamente, se une a un agente de superficie activador, como una bacteria. Luego, el factor B se une a C3b y se escinde por el factor D para producir la enzima activa, Ba. La enzima Ba luego escinde más C3 para generar más C3b, produciendo una deposición extensa de complejos C3b-Ba en la superficie de activación.

Por tanto, tanto la ruta clásica como la alternativa del complemento producen convertasas C3 que dividen el factor C3 en C3a y C3b. En este punto, ambas convertasas C3 se ensamblan en convertasas C5 (C4b2a3b y C3b3bBb). Estos complejos posteriormente escinden el componente del complemento C5 en dos componentes: el polipéptido C5a (9 kDa) y el polipéptido C5b (170 kDa). El polipéptido C5a se une a un receptor acoplado a proteína G transmembrana 7, que originalmente estaba asociado con leucocitos y ahora se sabe que se expresa en una variedad de tejidos que incluyen hepatocitos y neuronas. La molécula C5a es el componente quimiotáctico principal del sistema de complemento humano y puede desencadenar una variedad de respuestas biológicas que incluyen la quimiotaxis de leucocitos, la contracción del músculo liso, la activación de las rutas de transducción de señales intracelulares, la adhesión de neutrófilos al endotelio, la liberación de mediadores de citoquinas y lípidos y la formación de oxidantes.

El fragmento C5b más grande se une secuencialmente a los componentes posteriores de la cascada de complemento, C6, C7, C8 y C9 para formar el complejo de ataque de membrana C5b-9 ("MAC"). El MAC C5b-9 lipófilo puede someter a lisis directamente los eritrocitos, y en mayores cantidades es lítico para los leucocitos y daña tejidos como las células musculares, epiteliales y endoteliales. En cantidades sublíticas, el C5b-9 MAC puede estimular la regulación positiva de las moléculas de adhesión, el aumento de calcio intracelular y la liberación de citoquinas. Además, a concentraciones sublíticas, el C5b-9 MAC puede estimular células como las células endoteliales y las plaquetas sin causar lisis celular. Los efectos no líticos de C5a y C5b-9 MAC son comparables e intercambiables.

Aunque el sistema de complemento tiene un papel importante en el mantenimiento de la salud, tiene el potencial de causar o contribuir a la enfermedad. Por ejemplo, los estudios han demostrado que la inhibición de la cascada de complemento o el agotamiento de los componentes del complemento reduce el daño en las enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso central o en la lesión cerebral experimental (véase, por ejemplo, Feasby, T.E. et al. (1987) Brain Res. 419: 97-103; Vriesendorp, F.J. et al. (1995) J. Neuroimmunol. 58: 157-165; Jung, S. et al. (1995) Neurosci. Lett. 200: 167-170; Dailey, A.T. et al. (1998) J. Neurosci. 18: 6713-6722; Woodruff, T.M. et al. (2006) FASEB J. 20: 1407-1417; Leinhase, I. et al. (2006) Bm S Neurosci. 14: 7: 55). En particular, las ratas deficientes en C6 y, por lo tanto, incapaces de formar el complejo de ataque a la membrana (MAC), no presentan desmielinización ni daño axonal y una puntuación clínica significativamente reducida en el modelo de encefalomielitis autoinmune experimental mediada por anticuerpos (EAE) para la esclerosis múltiple en comparación con ratas con suficiente C6 emparejadas (Mead, R.J. et al. (2002) J. Immunol. 168: 458-465). Sin embargo, los niveles de infiltración de células mononucleares fueron equivalentes a los observados en ratas con suficiente cantidad de C6. Mead et al. (2002) concluyeron que la desmielinización y el daño axonal ocurren en presencia de anticuerpo y requieren la activación de toda la cascada de complemento, incluida la deposición de MAC, que puede inhibirse por el agotamiento de C6.

Por consiguiente, se necesitan reactivos para inhibir C6 y son deseables para una variedad de propósitos terapéuticos.

La tesis de Lisa Victoria Jane Eynstone Clayton, titulada "Generation and characterization of anti-C6 monoclonal antibodies in C6 deficient mice: The search for an anti-C6 therapy", University of Wales 2005, (20060109), URL: http://orca.cf.ac.uk/54080/4/Clayton.pdf, (20160603), divulga anticuerpos 23D1 y 27B1 que son específicos para C6 humano.

Resumen de la invención

La invención proporciona anticuerpos anti-C6 que tienen propiedades funcionales deseables para fines terapéuticos, incluida la capacidad de inhibir eficazmente la actividad funcional de C6 de manera que se inhiba la formación del complejo de ataque de membrana (MAC), tanto in vitro como in vivo, así como una Kd muy baja (por ejemplo, 1 x10 ' 8 M, 1x 10-9 M, 5 x 10-10 M o menos) y una vida media muy larga (por ejemplo, 40 horas o más). Se generó un panel de 38 anticuerpos C6 anti-humano inmunizando ratas con proteína C6 humano purificada. De estos 38, 2 demostraron que inhiben la formación del complejo de ataque de membrana (MAC). Se generó un anticuerpo de rata anti-C6 humano en particular que tenía estas propiedades funcionales deseadas (denominado aquí 7E5), y se preparó un panel de anticuerpos humanizados que retienen las CDR de 7E5, incluidos los mAbs humanizados 8G09, 7E12, 7G09, 8F07, 7F06, 7F11, 7E11 y 7F02. Las regiones variables de cadena pesada y ligera de estos ocho mAb humanizados, así como la región variable de cadena pesada de mAb 7C02 humanizado y la región variable de cadena ligera de mAb 7G08 humanizado se expresaron en las 81 combinaciones posibles de "mezclar y emparejar", y se demostró que los 81 emparejamientos inhiben eficazmente la actividad funcional de C6. Además, el epítopo de 7E5 se ha mapeado dentro de C6 humano.

Por consiguiente, en un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo aislado según las reivindicaciones que se une al C6 humano.

Un anticuerpo de la invención es un anticuerpo de rata o humanizado.

Un anticuerpo de la invención comprende secuencias de CDR1, 2 y 3 de cadena pesada mostradas en SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, y comprende secuencias de CDR1, 2 y 3 de cadena ligera mostradas en SEQ ID NO: 11, 12 y 13, respectivamente. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado que comprende las CDR mencionadas anteriormente.

Ejemplos representativos de anticuerpos que comprenden las CDR mencionadas anteriormente incluyen los siguientes:

(a) un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 30 y la región variable de cadena ligera de s Eq ID NO: 31;

(b) un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de s Eq ID NO: 33;

(c) un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 34 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 35;

(d) un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 36 y la región variable de cadena ligera de s Eq ID NO: 37;

(e) un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 38 y la región variable de cadena ligera de s Eq ID NO: 39;

(f) un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 40 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 41;

(g) un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 42 y la región variable de cadena ligera de s Eq ID NO: 43; y

(h) un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 44 y la región variable de cadena ligera de s Eq ID NO: 45.

En una realización, el anticuerpo aislado es uno en donde:

(a) la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 y 46; y

(b) la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 y 47.

Vectores de expresión que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo de la invención, así como células hospedadoras transformadas por dichos vectores de expresión, y métodos para expresar de manera recombinante el anticuerpo usando las células hospedadoras transformadas, también están abarcados por la invención. En una realización, un anticuerpo de la invención se expresa como un fragmento Fab. En otra realización, un anticuerpo de la invención se expresa como un anticuerpo de longitud completa, tal como un anticuerpo de isotipo IgG4, tal como con una región constante IgG4 (S228P).

También se incluyen las composiciones que comprenden un anticuerpo de la invención, tal como una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención se refiere a métodos de uso de un anticuerpo de la invención. En una realización, la invención proporciona un anticuerpo de la invención para su uso según las reivindicaciones. En una realización, la invención proporciona un anticuerpo de la invención para su uso en un método para estimular la regeneración de nervios en un sujeto, o promover la recuperación de nervios dañados o degenerados en un sujeto, o reducir o retrasar la degeneración de nervios en un sujeto, en donde el sujeto sufre una lesión física de los nervios, como una lesión traumática (por ejemplo, de un accidente), una lesión quirúrgica o una lesión no traumática (por ejemplo, una compresión nerviosa). En una realización, la lesión es del sistema nervioso periférico (SNP). En otra realización, la lesión es del sistema nervioso central (SNC).

En otra realización, el sujeto padece un trastorno inflamatorio inmunomediado o un trastorno neurodegenerativo progresivo. En una forma de realización, se adquiere el trastorno. En otra forma de realización, el trastorno es hereditario. En una realización, el trastorno es una neuropatía desmielinizante crónica, como la esclerosis múltiple (EM). En otra realización, el trastorno es un trastorno neurodegenerativo, como miastenia gravis o esclerosis lateral amiotrófica (ELA).

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A es un gráfico de barras que muestra los resultados de un ensayo hemolítico usando sobrenadantes de hibridoma 38 de dos ratas diferentes inmunizadas con C6 humano, demostrando que el sobrenadante 11 (que produce el mAb 7E5) tiene el efecto inhibidor más fuerte.

La Figura 1B es un gráfico de barras que muestra los resultados de un ELISA de complemento activado por manano usando sobrenadantes del hibridoma 38 de dos ratas diferentes inmunizadas con C6 humano, demostrando que el sobrenadante 11 (que produce el mAb 7E5) tiene el efecto inhibidor más fuerte.

La Figura 2 es un gráfico que muestra la cinética de biacore para la unión de 7E5 de rata recombinante a C6 humano.

Las Figuras 3A-D son gráficos que muestran los resultados del experimento de bloqueo cruzado de epítopos entre mAb 27B1 y mAb 7E5, lo que indica que 7E5 ocupa un epítopo diferente al 27B1.

La Figura 4A es una alineación de la secuencia de aminoácidos parcial de C6 humano (SEQ ID NO: 50) y la secuencia de aminoácidos parcial de C6 de rata (SEQ ID NO: 51) que muestra la ubicación del péptido 418.

La Figura 4B es un diagrama esquemático de la proteína C6 humano que muestra la ubicación del péptido 418.

La Figura 5 es un gráfico de barras que muestra que 7E5 bloquea C6 in vivo en ratas deficientes en C6 suplementadas con C6 humano, medido por ensayo hemolítico. Las ratas recibieron la cantidad indicada de C6 humano y anticuerpo 7E5. La actividad del complemento se traza en el eje Y, por lo que el D.E. 1.0 indica lisis máxima de eritrocitos sensibilizados y O.D. 0 indica ausencia de lisis.

La Figura 6A es una alineación de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada del mAb anti-C5 7E5 de rata (SEQ ID NO: 5) y la línea germinal VH3_1 humana (SEQ ID NO: 48), con las diferencias indicadas. Debajo de la alineación se indican los intercambios de aminoácidos destinados a la humanización.

La Figura 6B es una alineación de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena ligera del mAb anti-C5 7E5 de rata (SEQ ID NO: 10) y la línea germinal Vk2_5 humana (SEQ ID NO: 49), con las diferencias indicadas. Debajo de la alineación se indican los intercambios de aminoácidos destinados a la humanización.

La Figura 7A es un gráfico de barras que muestra los resultados de un ensayo hemolítico que demuestra la actividad inhibidora de las 81 combinaciones posibles de las 9 cadenas VH variantes 7E5 humanizadas y 9 cadenas VL variantes 7E5 humanizadas (mostradas en las Figuras 7Ay 7B, respectivamente).

La Figura 7B es un gráfico de barras que muestra los resultados de un ensayo MAC ELISA que demuestra la actividad inhibidora de las 81 combinaciones posibles de las 9 cadenas VH de la variante 7E5 humanizada y 9 cadenas VL de la variante 7E5 humanizada (mostradas en las Figuras 7A y 7B, respectivamente).

La Figura 8A es un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada 7E5 (SEQ ID NO: 5) con las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de las variantes 7E5 humanizadas 7C02 (SEQ ID NO: 46), 7E11 (SEQ ID NO: 42), 7E12 (SEQ ID NO: 32), 7F02 (SEQ ID NO: 44), 7F06 (SEQ ID NO: 38), 7F11 (SEQ ID NO: 40), 7G09 (SEQ ID NO: 34), 8F07 (SEQ ID NO: 36) y 8G09 (SEQ ID NO: 30). Se indican las regiones conservadas de CDR1, 2 y 3.La

Figura 8B es una alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera 7E5 (SEQ ID NO: 10) con las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de las variantes 7E5 humanizadas 7E11 (SEQ ID NO: 43), 7E12 (SEQ ID NO: 33), 7F02 (SEQ ID NO: 45), 7F06 (SEQ ID NO: 39), 7F11 (SEQ ID NO: 41), 7G08 (SEQ ID NO: 47), 7G09 (SEQ ID NO: 35), 8F07 (SEQ ID NO: 37) y 8G09 (SEQ ID NO: 31). Se indican las regiones CDR1, 2 y 3 conservadas.

La Figura 9 muestra la afinidad (Biacore) de 8 F'Ab humanizados por C6 humano en comparación con la afinidad del F'Ab de rata 7E5 de tipo salvaje.

La Figura 10 muestra los resultados de un experimento de aplastamiento de nervios in vivo.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos anti-C6 que exhiben propiedades funcionales beneficiosas. Estas características funcionales incluyen una IC50 en un ensayo hemolítico de 0.5 |jg/ml o menos. Los anticuerpos incluyen regiones variables de cadena ligera y pesada particulares y/o secuencias de CDR. Por ejemplo, se proporcionan nueve regiones variables de cadena pesada humanizada y nueve de cadena ligera humanizada que muestran una actividad inhibidora de C6 eficaz en las 81 combinaciones posibles de "mezclar y combinar" de las cadenas.

Para que la presente invención pueda entenderse más fácilmente, primero se definen ciertos términos. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.

El término "C6" (también denominado "complemento C6" o "componente de complemento C6") se refiere a un componente de la cascada de complemento que se une con los componentes C5b, C7, C8 y C9 para formar el C5b-C9 complejo de ataque a la membrana (MAC). C6, o cualquier variante e isoforma del mismo, puede aislarse de células o tejidos que los expresan de forma natural o producirse de forma recombinante usando técnicas bien conocidas en la técnica. Genbank® (No. de acceso NP_00110860.3) informa la secuencia de aminoácidos del C6 humano de la siguiente manera (Se Q ID NO: 52):

1 marrsvlyfi llnalinkgq acfcdhyawt qwtscsktcn sgtqsrhrqi vvdkyyqenf

61 ceqicskqet recnwqrcpi ncllgdfgpw sdcdpciekq skvrsvlrps qfggqpctap

121 lvafqpcips klckieeadc knkfrcdsgr ciarklecng endcgdnsde rdcgrtkavc

181 trkynpipsv qlmgngfhf1 ageprgevld nsftggickt vkssrtsnpy rvpanlenvg

241 fevqtaeddl ktdfykdlts lghnenqqgs fssqggssfs vpifysskrs eninhnsafk

301 qaiqashkkd ssfirihkvm kvlnfttkak dlhlsdvflk alnhlpleyn salysrifdd

361 fgthyftsgs lggvydllyq fsseelknsg lteeeakhcv rietkkrvlf akktkvehrc

421 ttnklsekhe gsfiqgaeks islirggrse ygaalawekg ssgleektfs ewlesvkenp

481 avidfelapi vdlvrnipca vtkrnnlrka lqeyaakfdp cqcapcpnng rptlsgtecl

541 cvcqsgtyge ncekqspdyk snavdgqwgc wsswstcdat ykrsrtrecn npapqrggkr

601 cegekrqeed ctfsimenng qpcinddeem kevdlpeiea dsgcpqpvpp engfirnekq

6 61 lylvgedvei scltgfetvg yqyfrclpdg twrqgdvecq rtecikpvvq evltitpfqr

721 lyrigesiel tcpkgfvvag psrytcqgns wtppisnslt cekdtltklk ghcqlgqkqs

781 gsecicmspe edcshhsedl cvfdtdsndy ftspackfla ekclnnqqlh flhigscqdg

841 rqlewglert rlssnstkke scgydtcydw ekcsastskc vcllppqcfk ggnqlycvkm

901 gsstsektln icevgtirca nrkmeilhpg kcla

[0024] El término "anticuerpo" como se menciona en el presente documento incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, "porción de unión a antígeno") o cadena sencilla del mismo. Un "anticuerpo" se refiere, en una realización preferida, a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una porción de unión a antígeno de la misma. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada aquí como Vh) y una región constante de cadena pesada. La región constante de la cadena pesada se compone de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada aquí como Vl) y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada Vh y Vl está compuesto por tres CDR y cuatro FR, ordenados desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del huésped, incluidas diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico.

El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), como se usa en este documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, C6 humano). Dichos "fragmentos" tienen, por ejemplo, entre aproximadamente 8 y aproximadamente 1500 aminoácidos de longitud, adecuadamente entre aproximadamente 8 y aproximadamente 745 aminoácidos de longitud, adecuadamente aproximadamente 8 a aproximadamente 300, por ejemplo, aproximadamente 8 a aproximadamente 200 aminoácidos, o aproximadamente de 10 a aproximadamente 50 o 100 aminoácidos de longitud. Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consta de los dominios Vl, Vh, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consta de los dominios Vh y CH1; (iv) un fragmento Fv que consta de los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consta de un dominio Vh; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada o (vii) una combinación de dos o más CDR aisladas que pueden unirse opcionalmente mediante un enlazador sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, están codificados por genes separados, pueden unirse, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite fabricarse como una única cadena de proteína en la que Vl y las regiones Vh se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883). También se pretende que dichos anticuerpos monocatenarios estén incluidos dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se seleccionan para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. Las porciones de unión a antígeno se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.

Un "anticuerpo biespecífico" o "bifuncional" es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesadas/ligeras diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante una variedad de métodos que incluyen la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo que muestra una única especificidad de unión y afinidad por un epítopo particular. Por consiguiente, el término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a un anticuerpo que muestra una única especificidad de unión y que tiene regiones constantes variables y opcionales derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada.

El término "anticuerpo recombinante", como se usa en este documento, incluye todos los anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de ellos, (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de un humano recombinante, combinatorio o humanizado biblioteca de anticuerpos, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN.

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos que tienen regiones marco de secuencias de la línea germinal humana y CDR de una especie no humana (por ejemplo, ratón, rata, conejo) e incluye, por ejemplo, anticuerpos en los que las regiones marco humanas y/o las CDR han sufrido mutagénesis dirigida a un sitio específico para optimizar la unión. En el Ejemplo 8 se presenta una descripción de ejemplo de la preparación de anticuerpos anti-C6 humanizados.

El término "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes (si están presentes) de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la divulgación pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo) (véase Lonberg, N. et al. (1994)) Nature 368(6474): 856-859); Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764: 536-546). Sin embargo, el término "anticuerpo humano" no incluye anticuerpos en los que se hayan injertado secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, como un ratón, en secuencias marco humanas (es decir, anticuerpos humanizados).

Un "anticuerpo aislado", como se usa en este documento, pretende referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a C6 humano está sustancialmente libre de anticuerpos que específicamente se unen a antígenos distintos del C6 humano). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo de puede tener reactividad cruzada con otras proteínas C6 de diferentes especies. Sin embargo, el anticuerpo siempre se une preferiblemente al C6 humano. Además, un anticuerpo aislado normalmente está sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos. En una realización de la invención, se combina una combinación de anticuerpos "aislados" que tienen diferentes especificidades de C6 en una composición bien definida.

El término "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio en un antígeno al que se une específicamente una inmunoglobulina o un anticuerpo. Los epítopos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos se retienen típicamente tras la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario se pierden típicamente en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo incluye típicamente al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar qué epítopos están unidos por un anticuerpo dado (es decir, mapeo de epítopos) son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ensayos de inmunotransferencia e inmunoprecipitación, en los que los péptidos superpuestos o contiguos de C6 se prueban para determinar la reactividad con el anti anticuerpo C6. Los métodos para determinar la conformación espacial de epítopos incluyen técnicas en el arte y las descritas en este documento, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional (véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, GE Morris, Ed. (1996)).

El término "epítopo discontinuo" se refiere a un epítopo formado por aminoácidos no contiguos. Por ejemplo, el epítopo puede incluir residuos de múltiples regiones de C6 humano que, cuando se pliegan conformacionalmente, se juntan (en proximidad) de manera que el anticuerpo se une a uno o más residuos dentro de cada región.

El término "mapeo de epítopos" se refiere al proceso de identificación de los determinantes moleculares para el reconocimiento de anticuerpos y antígenos.

El término "se une al mismo epítopo" con referencia a dos o más anticuerpos significa que los anticuerpos compiten por unirse a un antígeno y se unen al mismo, solapando o abarcando segmentos continuos o discontinuos de aminoácidos. Los expertos en la técnica comprenderán que la expresión "se une al mismo epítopo" no significa necesariamente que los anticuerpos se unan exactamente a los mismos aminoácidos. Los aminoácidos precisos a los que se unen los anticuerpos pueden diferir. Por ejemplo, un primer anticuerpo puede unirse a un segmento de aminoácidos que está completamente abarcado por el segmento de aminoácidos unido por un segundo anticuerpo. En otro ejemplo, un primer anticuerpo se une a uno o más segmentos de aminoácidos que se superponen significativamente al uno o más segmentos unidos por el segundo anticuerpo. Para los propósitos de este documento, se considera que tales anticuerpos "se unen al mismo epítopo".

Como se usa en el presente documento, los términos "unión específica", "unión selectiva", "unión selectiva" y "unión específica" se refieren a la unión de un anticuerpo a un epítopo en un antígeno predeterminado. Por lo general, el anticuerpo se une con una constante de disociación de equilibrio (Kd) de aproximadamente menos de 10'7 M, como aproximadamente menos de 10'8 M, 10'9 M o 10'1° M o incluso menor cuando se determina por resonancia de plasmón de superficie (SPR) en un instrumento BIACORE 200° que usa C6 humano recombinante como analito y el anticuerpo como ligando y se une al antígeno predeterminado con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad por unirse a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) distintos del antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado. Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se usan de manera intercambiable en el presente documento con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno".

El término "Kd", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de equilibrio de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Normalmente, los anticuerpos de la invención se unen a C6 con una constante de equilibrio de disociación (Kd) de aproximadamente 10'8 M o menos, o 10'9 M o menos, o 10'10 M o menos o incluso más baja cuando se determina mediante tecnología de resonancia de plasmón de (SPR) en un instrumento BIACORE 2000 que utiliza C6 humano recombinante como analito y el anticuerpo como ligando.

El término "kd", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de velocidad de disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno.

El término "ka", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de velocidad de activación para la asociación de un anticuerpo con el antígeno.

El término "IC50", como se usa en este documento, se refiere a la concentración de un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo, que se necesita, ya sea en un ensayo in vitro o in vivo, para inhibir una respuesta biológica dada a la mitad. Es decir, es la concentración inhibidora (IC) media mínima (50%) del anticuerpo o de la porción de unión al antígeno del mismo.

Como se usa en este documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpos (por ejemplo, IgM o IgG1) que está codificada por genes de región constante de cadena pesada. En una realización, un anticuerpo monoclonal humano de la invención es del isotipo IgG1. En otra realización, un anticuerpo monoclonal humano de la invención es del isotipo IgG2. En otra realización, un anticuerpo monoclonal humano de la invención es del isotipo IgG4. En otra realización, un anticuerpo monoclonal humano de la invención es del isotipo IgG4 (S228P) (es decir, un isotipo IgG4 que tiene una sustitución de prolina del residuo de serina de tipo salvaje en la posición 228 del aminoácido).

El término "se une a C6 inmovilizado" se refiere a la capacidad de un anticuerpo humano de la invención para unirse a C6, por ejemplo, expresado en la superficie de una célula o que está unido a un soporte sólido.

El término "de reacción cruzada", como se usa en este documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo de la invención para unirse a C6 de una especie diferente. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente invención que se une al C6 humano también puede unirse a otra especie de C6, como el mono cynomolgus. Como se usa en este documento, la reactividad cruzada se mide detectando una reactividad específica con antígeno purificado en ensayos de unión (por ejemplo, SPR, ELISA) o unión a, o interactuando funcionalmente de otro modo con, células que expresan fisiológicamente C6. Los métodos para determinar la reactividad cruzada incluyen ensayos de unión estándar como se describe en este documento, por ejemplo, mediante análisis de resonancia de plasmón superficial (SPR) Biacore™ usando un instrumento Biacore™ 2000 SPR (Biacore AB, Uppsala, Suecia) o técnicas de citometría de flujo.

Como se usa en este documento, "patrón de glicosilación" se define como el patrón de unidades de carbohidratos que están unidas covalentemente a una proteína, más específicamente a una proteína inmunoglobulina. Un patrón de glicosilación de un anticuerpo heterólogo se puede caracterizar por ser sustancialmente similar a los patrones de glicosilación que ocurren naturalmente en anticuerpos producidos por la especie del animal transgénico no humano, cuando un experto en la técnica reconocería el patrón de glicosilación del anticuerpo heterólogo como siendo más similar a dicho patrón de glicosilación en la especie del animal transgénico no humano que a la especie de la que se derivaron los genes CH del transgén.

El término "de origen natural", como se usa en el presente documento, aplicado a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (incluidos los virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionalmente por el hombre en el laboratorio es de origen natural.

El término "reordenado" como se usa en este documento se refiere a una configuración de un locus de inmunoglobulina de cadena pesada o cadena ligera en donde un segmento V se coloca inmediatamente adyacente a un segmento D-J o J en una conformación que codifica esencialmente un dominio Vh o Vl completo, respectivamente. Se puede identificar un locus del gen de inmunoglobulina reordenado por comparación con el ADN de la línea germinal; un locus reordenado tendrá al menos un elemento de homología heptámero/nonámero recombinado.

El término "no reordenado" o "configuración de la línea germinal" como se usa en el presente documento en referencia a un segmento V se refiere a la configuración en la que el segmento V no se recombina para ser inmediatamente adyacente a un segmento D o J.

El término "molécula de ácido nucleico", como se usa en este documento, pretende incluir moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario.

El término "molécula de ácido nucleico aislada", como se usa en este documento en referencia a ácidos nucleicos que codifican anticuerpos o porciones de anticuerpos (por ejemplo, Vh, Vl, CDR3) que se unen a C6, pretende hacer referencia a una molécula de ácido nucleico en la que las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo o la porción de anticuerpo están libres de otras secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos o porciones de anticuerpo que se unen a antígenos distintos de C6, cuyas otras secuencias pueden flanquear naturalmente el ácido nucleico en el ADN genómico humano. Por ejemplo, las SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 y 28 corresponden a las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables de la cadena pesada (Vh) de los anticuerpos monoclonales anti-C6 8G09, 7E12, 7G09, 8F07, 7F06, 7F11, 7E11 y 7F02, respectivamente. Las SEQ ID NO: 15, 17, 19, 21,23, 25, 27 y 29 corresponden a las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables de la cadena ligera (Vh) de los anticuerpos monoclonales anti-C6 8G09, 7E12, 7G09, 8F07, 7F06, 7F11 , 7E11 y 7F02, respectivamente.

La presente divulgación también abarca "modificaciones de secuencia conservadora" de las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 4-47, es decir, modificaciones de secuencia de nucleótidos y aminoácidos que no anulan la unión del anticuerpo codificado por la secuencia de nucleótidos o que contiene la secuencia de aminoácidos, al antígeno. Tales modificaciones de secuencia conservadoras incluyen sustituciones conservadoras de nucleótidos y aminoácidos, así como adiciones y eliminaciones de nucleótidos y aminoácidos. Por ejemplo, se pueden introducir modificaciones en las SEQ ID NO: 4-47 mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen aquellas en las que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales apolares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, un residuo de aminoácido no esencial predicho en un anticuerpo anti-C6 humano se reemplaza preferiblemente con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Los métodos para identificar sustituciones conservadoras de nucleótidos y aminoácidos que no eliminan la unión de antígenos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12 (10): 879-884 (1999); and Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)).

Alternativamente, en otro aspecto de la divulgación, las mutaciones se pueden introducir aleatoriamente a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante del anticuerpo anti-C6, tal como por mutagénesis de saturación, y los anticuerpos anti-C6 modificados resultantes se pueden cribar con relación a la actividad de unión.

Para los ácidos nucleicos, el término "homología sustancial" indica que dos ácidos nucleicos, o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean y comparan de manera óptima, son idénticos, con inserciones o eliminaciones de nucleótidos apropiadas, en al menos aproximadamente el 80% de los nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente del 90% al 95%, y más preferiblemente al menos aproximadamente del 98% al 99.5% de los nucleótidos. Alternativamente, existe una homología sustancial cuando los segmentos se hibridan en condiciones de hibridación selectiva con el complemento de la hebra.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = # de posiciones idénticas/# total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que debe introducirse para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes más adelante.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de brecha de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1,2, 3, 4, 5 o 6. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos también se puede determinar usando el algoritmo de E. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989)) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

Las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas de la presente invención pueden usarse además como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda en bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Estas búsquedas se pueden realizar utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína de la invención. Para obtener alineaciones con espacios con fines de comparación, Gapped BLAST se puede utilizar como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Los ácidos nucleicos o proteínas de la invención pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico o proteína se "aísla" o "se vuelve sustancialmente puro" cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas estándar, incluido el tratamiento alcalino/SDS, bandas de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otros bien conocidos en la técnica. Véase, F. Ausubel, et al., Ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987).

Las composiciones de ácido nucleico de la presente invención, aunque a menudo se encuentran en una secuencia nativa (excepto para los sitios de restricción modificados y similares), de ADNc, genómico o mezclas de los mismos pueden estar mutados, de acuerdo con técnicas estándar para proporcionar secuencias de genes. Para las secuencias codificantes, estas mutaciones pueden afectar a la secuencia de aminoácidos según se desee. En particular, se contemplan secuencias de ADN sustancialmente homólogas o derivadas de V, D, J, constantes, conmutadores y otras secuencias de este tipo descritas en el presente documento (donde "derivada" indica que una secuencia es idéntica o modificada a partir de otra secuencia).

Un ácido nucleico está "operativamente enlazado" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor o potenciador está operativamente ligado a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia. Con respecto a las secuencias reguladoras de la transcripción, enlazadas operativamente significa que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas y, cuando es necesario para unir dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en marco de lectura. Para las secuencias de cambio, enlazado operativamente indica que las secuencias son capaces de efectuar una recombinación de cambio.

El término "vector", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN bicatenario en donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomales) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la célula huésped y, por lo tanto, se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están ligados operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante se encuentran a menudo en forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos en la replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que cumplen funciones equivalentes.

El término "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped"), como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que dichos términos están destinados a referirse no solo a la célula objeto particular sino a la progenie de dicha célula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula madre, pero todavía está incluida dentro del alcance del término "célula huésped" como se usa en este documento.

Como se usa en este documento, el término "enlazado" se refiere a la asociación de dos o más moléculas. El enlace puede ser covalente o no covalente. El enlace también puede ser genético (es decir, fusionado de forma recombinante). Dichos enlaces se pueden lograr usando una amplia variedad de técnicas reconocidas en el arte, tales como la conjugación química y la producción de proteínas recombinantes.

Como se usa en este documento, los términos "inhibe" o "bloquea" (por ejemplo, que se refiere a la inhibición/bloqueo de la formación de MAC por un anticuerpo anti-C6) se usan indistintamente y abarcan tanto inhibición/bloqueo parcial como completo. La inhibición/bloqueo de C6 preferiblemente reduce o altera el nivel normal o el tipo de actividad que ocurre cuando C6 no está bloqueado o inhibido. La inhibición y el bloqueo también pretenden incluir cualquier disminución medible en la unión o actividad de C6 cuando está en contacto con un anticuerpo anti-C6 en comparación con C6 que no está en contacto con un anticuerpo anti-C6, por ejemplo, inhibe la unión o actividad de C6 por al menos alrededor del 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. En una realización, el anticuerpo anti-C6 inhibe la unión o la actividad de C6 en al menos aproximadamente un 70%. En otra realización, el anticuerpo anti-C6 inhibe la unión o la actividad de C6 en al menos un 80%

Los términos "tratar", "que trata" y "tratamiento", como se usan en el presente documento, se refieren a medidas terapéuticas o preventivas descritas en el presente documento. Los métodos de "tratamiento" emplean la administración a un sujeto, que necesita tal tratamiento, de un anticuerpo de la presente invención, por ejemplo, un sujeto que necesita tal tratamiento.

El término "dosis efectiva" o "dosificación efectiva" se define como una cantidad suficiente para lograr o al menos lograr parcialmente el efecto deseado. El término "dosis terapéuticamente efectiva" se define como una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya padece la enfermedad. Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad del trastorno que se esté tratando y del estado general del propio sistema inmunológico del paciente.

El término "paciente" incluye seres humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.

Como se usa en este documento, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. Por ejemplo, los métodos y composiciones de la presente invención pueden usarse para tratar a un sujeto con un trastorno inmunológico. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.

Diversos aspectos de la invención se describen con más detalle en las siguientes subsecciones.

I. Producción de anticuerpos para C6

La presente invención abarca anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos humanizados, que se unen a C6, por ejemplo, C6 humano. Anticuerpos monoclonales de ejemplo que se unen a C6 incluyen 7E5, 8G09, 7E12, 7G09, 8F07, 7F06, 7F11, 7E11 y 7F02, cuyas regiones variables de cadena pesada se muestran en las SEQ ID NO: 5, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 y 44, respectivamente, y cuyas regiones variables de cadena ligera se muestran en las SEQ ID NO: 10, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 y 45, respectivamente. Las CDR1, 2 y 3 de cadena pesada de estos anticuerpos se muestran en las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, mientras que las CDR1,2 y 3 de cadena ligera de estos anticuerpos se muestran en las SEQ ID NO: 11, 12 y 13, respectivamente.

Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden producir usando una variedad de técnicas conocidas, tales como la técnica estándar de hibridación de células somáticas descrita por Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975). Aunque se prefieren los procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, también se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B, técnica de presentación de fagos usando bibliotecas de genes de anticuerpos humanos y técnicas de humanización como las descritas en el Ejemplo 6.

Por consiguiente, en un aspecto, se describe un método de hibridoma para producir un anticuerpo que se une a C6 humano. En este método, se puede inmunizar una rata, un ratón u otro animal huésped apropiado con un antígeno adecuado para provocar linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al antígeno usado para la inmunización. Como se describe en el Ejemplo 1, un animal huésped particularmente adecuado para producir anticuerpos anti-C6 humanos es una rata que es deficiente en C6 (C6 -/- rata), de modo que la inmunización con C6 humano se considerará completamente "extraña". Los sobrenadantes de animales hospedadores inmunizados pueden probarse en un ensayo adecuado para detectar actividad anti-C6, tal como un ensayo hemolítico o ELISA MAC como se describe en detalle en el Ejemplo 1, para identificar animales hospedadores que expresan anticuerpos con actividad inhibidora de C6.

Los linfocitos de animales huésped seleccionados se pueden fusionar con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 1986)). Un asociado de fusión de ejemplo son las células Y3-Ag1.2.3, aunque también son adecuadas otras células de mieloma conocidas en la técnica, tales como las células SP2/0-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580). El medio de cultivo en donde crecen las células de hibridoma se analiza para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno, tal como con el ensayo hemolítico y/o ELISA MAC. Una vez identificadas las células de hibridoma que producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse limitando los procedimientos de dilución y cultivarse mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. Academic Prees, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores ascíticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden separarse del medio de cultivo, líquido ascítico o suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. Un ejemplo representativo, no limitante, de preparación de hibridomas que secretan anticuerpos anti-C6 se describe en detalle en el Ejemplo 1.

Se puede humanizar un anticuerpo monoclonal no humano, tal como un anticuerpo de rata o ratón, usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, como se describe en detalle en el Ejemplo 6, se puede humanizar un mAb C6 antihumano de rata usando un enfoque descrito en Hwang, W.Y et al. (2205) Methods 36: 35-42. Este enfoque se basa en el principio de que, si un anticuerpo humano y no humano tienen CDR estructuradas de manera similar, los marcos humanos también apoyarán las CDR no humanas, con una buena retención de afinidad. Por tanto, en este método, las secuencias marco humanas se eligen del conjunto de genes de la línea germinal humana basándose en la similitud estructural de las CDR humanas con las del anticuerpo a humanizar (mismas estructuras canónicas de Chothia). Se genera una biblioteca de presentación de fagos de secuencias variantes de Fab, que contienen residuos de FR que se desvían. Después de las selecciones impulsadas por afinidad, se seleccionan los clones individuales para determinar la unión y la velocidad de desviación y se determina la identidad y homología humanas de la secuencia. También pueden usarse otros enfoques y metodologías para el injerto de CDR y la humanización que están bien establecidos en la técnica para generar anticuerpos anti-C6 humanizados de la invención.

Generación de transfectomas productores de anticuerpos monoclonales contra C6

Los anticuerpos de la invención también se pueden producir en un transfectoma de célula huésped usando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección de genes como es bien conocido en la técnica (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202). En el Ejemplo 5 se describen adicionalmente realizaciones de ejemplo para la expresión recombinante de anticuerpos anti-C6 (en donde se usan vectores de expresión pMQR en células hospedadoras HEK-293), en el Ejemplo 6 (Expresión de Fab usando vectores de expresión pCB4 en células hospedadoras de E. coli) y en el Ejemplo 7 (expresión de células CHO).

Además, en una realización, el gen o genes de interés, por ejemplo, genes de anticuerpos, pueden ligarse en un vector de expresión tal como un plásmido de expresión eucariótico tal como el usado por el sistema de expresión del gen GS descrito en el documento WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338 841 u otros sistemas de expresión bien conocidos en la técnica. El plásmido purificado con los genes de anticuerpos clonados puede introducirse en células huésped eucariotas tales como células CHO o células NSO o, alternativamente, otras células eucariotas como células derivadas de plantas, hongos o células de levadura. El método utilizado para introducir estos genes podría ser métodos descritos en la técnica tales como electroporación, lipofectina, lipofectamina u otros. Después de introducir estos genes de anticuerpos en las células huésped, las células que expresan el anticuerpo pueden identificarse y seleccionarse. Estas células representan los transfectomas que luego pueden amplificarse por su nivel de expresión y aumentarse para producir anticuerpos. Los anticuerpos recombinantes pueden aislarse y purificarse a partir de estos sobrenadantes de cultivo y/o células.

Alternativamente, estos genes de anticuerpos clonados pueden expresarse en otros sistemas de expresión tales como E. coli o en organismos completos o pueden expresarse sintéticamente.

Anticuerpos de competencia cruzada y que se unen al mismo epítopo

Como se describe en detalle en el Ejemplo 3, el epítopo al que se une el anticuerpo 7E5 se ha mapeado mediante mutagénesis de barrido de alanina en residuos dentro de la región de C6 humano correspondiente a los aminoácidos 835-854 de SEQ ID NO: 52 (C6 humano). También se demostró que los péptidos particulares que se muestran en las SEQ ID NO: 1, 2 y 3 contienen residuos que forman parte del epítopo al que se une 7E5. En consecuencia, en una realización, la invención proporciona un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones que se une a un epítopo de C6 humano que incluye todos o una parte de los residuos 835-854 de SEQ ID NO: 52. En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo según las reivindicaciones que se une a un epítopo de C6 humano que incluye todos o una parte de los residuos 835-854 de SEQ ID NO: 52, en donde el epítopo es discontinuo. En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones que se une a un epítopo de C6 humano que incluye toda o una porción de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1, 2 y 3. En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones que se une a un epítopo de C6 humano que incluye toda o una porción de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 2 y 3, en donde el epítopo es discontinuo. En otra realización más, la invención proporciona un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones que compite de forma cruzada para unirse a C6 humano con un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 5 y una región variable de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 10 (las secuencias VH y VL de 7E5). En otras realizaciones más, los anticuerpos de la invención compiten de forma cruzada para unirse a C6 con otros anticuerpos anti-C6 descritos en el presente documento, tales como 8G09, 7E12, 7G09, 8F07, 7F06, 7F11, 7E11 o 7F02.

Estos anticuerpos competidores pueden identificarse basándose en su capacidad para inhibir competitivamente la unión a C6 de uno o más de los mAb 7E5, 8G09, 7E12, 7G09, 8F07, 7F06, 7F11, 7E11, 7F02 en ensayos de unión de C6 estándar. Un ensayo de ejemplo para examinar la competencia cruzada para la unión a C6 es un ELISA Epítope Sandwich, descrito en detalle en el Ejemplo 3. Además, los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo o compiten por la unión pueden identificarse usando otras técnicas de rutina. Tales técnicas incluyen, por ejemplo, un inmunoensayo, que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana, es decir, un ensayo de unión competitiva. La unión competitiva se determina en un ensayo en donde la inmunoglobulina bajo prueba inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común, como C6. Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto (RIA) en fase sólida, inmunoensayo enzimático directo o indirecto (EIA) en fase sólida, ensayo de competición en sándwich (véase Stahli et al., Methods in Enzymology 9: 242 (1983)); EIA de biotina-avidina directa en fase sólida (véase Kirkland et al., J. Immunol. 137: 3614 (1986)); ensayo de marcación directa en fase sólida, ensayo sándwich de marcación directa en fase sólida (véase Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA de marcación directo en fase sólida usando marcación 1-125 (véase Morel et al., Mol. Immunol.

25(1): 7 (1988)); EIA de biotina-avidina directa en fase sólida (Cheung et al., Virology 176: 546 (1990)); y etiquetado directo RIA. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Normalmente, tal ensayo implica el uso de antígeno purificado unido a una superficie sólida o células que portan cualquiera de estos, una inmunoglobulina de prueba no marcada y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o células en presencia de la inmunoglobulina de prueba. Por lo general, la inmunoglobulina de prueba está presente en exceso. Por lo general, cuando un anticuerpo competidor está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% o más.

En consecuencia, también, se divulgan anticuerpos que se unen a un epítopo en C6 que comprende todo o una parte de un epítopo reconocido por los anticuerpos particulares descritos en este documento (por ejemplo, la misma región o una solapada o una región entre o que abarca la región).

En un aspecto, el anticuerpo que compite por unirse a C6 y/o se une al mismo epítopo en C6 humano es un anticuerpo humanizado. Dichos anticuerpos monoclonales humanizados se pueden preparar y aislar, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 6.

Otras técnicas para determinar el epítopo al que se une un anticuerpo incluyen, por ejemplo, métodos de mapeo de epítopos, tales como análisis de rayos X de cristales de complejos de antígeno: anticuerpos que proporcionan resolución atómica del epítopo. Otros métodos controlan la unión del anticuerpo a fragmentos de antígeno o variaciones mutadas del antígeno donde la pérdida de unión debido a una modificación de un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de antígeno a menudo se considera una indicación de un componente de epítopo. Además, también se pueden usar métodos combinatorios computacionales para mapeo de epítopos. Estos métodos se basan en la capacidad del anticuerpo de interés para aislar por afinidad péptidos cortos específicos de bibliotecas de péptidos de presentación de fagos combinatorios. Los péptidos se consideran entonces como pistas para la definición del epítopo correspondiente al anticuerpo usado para cribar la biblioteca de péptidos. Para el mapeo de epítopos, también se han desarrollado algoritmos computacionales que se ha demostrado que mapean epítopos conformacionales discontinuos.

Una vez que se ha aislado un único mAb anti-C6 arquetípico que tiene las propiedades deseadas descritas en el presente documento, es sencillo generar otros mAb con propiedades similares, por ejemplo, que tengan el mismo epítopo, utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden inmunizar ratones o ratas con C6 como se describe en el presente documento, se pueden producir hibridomas y se pueden cribar los mAb resultantes para determinar la capacidad de competir con el mAb arquetípico por la unión a C6. También se pueden inmunizar ratas o ratones con un fragmento más pequeño de C6 que contiene el epítopo al que se une el mAb arquetípico. El epítopo se puede localizar, por ejemplo, cribado para la unión a una serie de péptidos superpuestos que abarcan C6. Alternativamente, se puede usar el método de Jespers et al., Biotechnology 12: 899, 1994 para guiar la selección de mAb que tienen el mismo epítopo y, por lo tanto, propiedades similares al mAb arquetípico. Usando la presentación de fagos, primero la cadena pesada del anticuerpo arquetípico se empareja con un repertorio de cadenas ligeras (preferiblemente humanas) para seleccionar un mAb de unión a C6, y luego la nueva cadena ligera se empareja con un repertorio de cadenas pesadas (preferiblemente humanas) para seleccionar un mAb de unión a C6 (preferiblemente humano) que tenga el mismo epítopo que el mAb arquetípico. Alternativamente, pueden obtenerse variantes del mAb arquetípico mediante mutagénesis de ADNc que codifica las cadenas pesada y ligera del anticuerpo.

Mapeo de epítopos, por ejemplo, como se describe en Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 1388-1394, se puede realizar para determinar si el anticuerpo se une a un epítopo de interés. La "mutagénesis de exploración de alanina", como se describe por Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085, o alguna otra forma de mutagénesis puntual de residuos de aminoácidos en C6 humano también puede usarse para determinar el epítopo funcional de un anti-C6. anticuerpo de la presente invención. Los estudios de mutagénesis, sin embargo, también pueden revelar residuos de aminoácidos que son cruciales para la estructura tridimensional general de C6 pero que no están directamente involucrados en los contactos anticuerpo-antígeno y, por lo tanto, pueden ser necesarios otros métodos para confirmar un epítopo funcional determinado usando este método.

El epítopo unido por un anticuerpo específico también puede determinarse evaluando la unión del anticuerpo a péptidos que comprenden fragmentos de C6 humano. Una serie de péptidos superpuestos que abarcan la secuencia de C6 pueden sintetizarse y seleccionarse para la unión, por ejemplo, en un ELISA directo, un ELISA competitivo (donde se evalúa la capacidad del péptido para prevenir la unión de un anticuerpo a C6 unido a un pozo de una placa de microtitulación), o en un chip. Dichos métodos de rastreo de péptidos pueden no ser capaces de detectar algunos epítopos funcionales discontinuos, es decir, epítopos funcionales que involucran residuos de aminoácidos que no son contiguos a lo largo de la secuencia primaria de la cadena polipeptídica C6.

El epítopo unido por los anticuerpos de la presente invención también se puede determinar mediante métodos estructurales, como la determinación de la estructura cristalina de rayos X (por ejemplo, WO2005/044853), modelado molecular y espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN), incluida la determinación de RMN de los tipos de cambio de HD de los hidrógenos de amida lábiles en C6 cuando están libres y cuando están unidos en un complejo con un anticuerpo de interés (Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31, 11335-11347; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32, 6884-6891).

Con respecto a la cristalografía de rayos X, la cristalización se puede lograr usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, Giege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50: 339-350; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189: 1-23), incluyendo microlotes (por ejemplo, Chayen (1997) Structure 5: 1269-1274), difusión de vapor en gotas colgantes (por ejemplo, McPherson (1976) J. Biol. Chem. 251: 6300-6303), siembra y diálisis. Es deseable utilizar una preparación de proteína que tenga una concentración de al menos aproximadamente 1 mg/ml y preferiblemente de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. La cristalización se puede lograr mejor en una solución precipitante que contenga polietilenglicol 1000-20.000 (PEG; peso molecular medio que varía de aproximadamente 1000 a aproximadamente 20.000 Da), preferiblemente de aproximadamente 5000 a aproximadamente 7000 Da, más preferiblemente de aproximadamente 6000 Da, con concentraciones que varían de aproximadamente 10% a aproximadamente 30% (p/v). También puede ser deseable incluir un agente estabilizador de proteínas, por ejemplo, glicerol a una concentración que oscila entre aproximadamente el 0.5% y aproximadamente el 20%. También puede ser deseable una sal adecuada, tal como cloruro de sodio, cloruro de litio o citrato de sodio en la solución precipitante, preferiblemente en una concentración que varía de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1000 mM. El precipitante se regula preferiblemente a un pH de aproximadamente 3.0 a aproximadamente 5.0, preferiblemente aproximadamente 4.0. Los reguladores específicos útiles en la solución precipitante pueden variar y son bien conocidos en la técnica (Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994) Springer-Verlag, Nueva York). Ejemplos de reguladores útiles incluyen, pero no se limitan a, HEPES, Tris, MES y acetato. Los cristales se pueden cultivar en una amplia gama de temperaturas, que incluyen 2°C, 4°C, 8°C y 26°C.

Los cristales de anticuerpo:antígeno se pueden estudiar usando técnicas de difracción de rayos X bien conocidas y se pueden refinar usando software de ordenador como X-PLOR (Universidad de Yale, 1992, distribuido por Molecular Simulations, Inc.; véase, por ejemplo, Blundell & Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114&115, H.W. Wyckoff et al., Eds., Academic Press; Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2004/0014194), y BUSTER (Bricogne (1993) Acta Cryst. D49: 37-60; Bricogne (1997) Meth. Enzymol. 276A: 361-423, Carter & Sweet, eds.; Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56: 1313-1323).

Uso de secuencias parciales de anticuerpos para expresar anticuerpos intactos

Un anticuerpo anti-C6 de la invención comprende una CDR3 de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 8; y una CDR3 de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 13. El anticuerpo comprende además una CDR2 de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 7; y una CDR2 de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 12. El anticuerpo aún comprende además una CDR1 de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 6; y una CDR1 de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 11. Los anticuerpos de ejemplo de la invención que utilizan las CDR mencionadas anteriormente incluyen los siguientes:

Los anticuerpos interactúan con los antígenos diana predominantemente a través de residuos de aminoácidos que están ubicados en las seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las cadenas ligeras y pesadas. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre los anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos específicos de origen natural mediante la construcción de vectores de expresión que incluyen secuencias de CDR del anticuerpo específico de origen natural injertado en secuencias marco de un anticuerpo diferente. con diferentes propiedades (véase, por ejemplo, Riechmann, L. et al., 1998, Nature 332: 323-327; Jones, P. et al., 1986, Nature 321: 522-525; y Queen, C. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. See. USA 86: 10029-10033). Dichas secuencias marco se pueden obtener de bases de datos públicas de ADN que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de la línea germinal. Estas secuencias de la línea germinal diferirán de las secuencias de genes de anticuerpos maduros porque no incluirán genes variables completamente ensamblados, que se forman mediante la unión de V(D)J durante la maduración de las células B. Las secuencias de genes de la línea germinal también diferirán de las secuencias de un anticuerpo de repertorio secundario de alta afinidad en un individuo uniformemente a través de la región variable. Por ejemplo, las mutaciones somáticas son relativamente poco frecuentes en la parte amino-terminal de la región marco. Por ejemplo, las mutaciones somáticas son relativamente poco frecuentes en la parte amino terminal de la región marco 1 y en la parte carboxi terminal de la región marco 4. Además, muchas mutaciones somáticas no alteran significativamente las propiedades de unión del anticuerpo. Por esta razón, no es necesario obtener la secuencia de ADN completa de un anticuerpo particular para recrear un anticuerpo recombinante intacto que tenga propiedades de unión similares a las del anticuerpo original (véase WO 1999/045962). La secuencia de cadena ligera y pesada parcial que abarca las regiones CDR suele ser suficiente para este propósito. La secuencia parcial se usa para determinar qué variable de línea germinal y qué segmentos de genes de unión contribuyeron a los genes de variables de anticuerpos recombinados. La secuencia de la línea germinal se usa luego para completar las porciones que faltan de las regiones variables. Las secuencias líder de las cadenas pesada y ligera se escinden durante la maduración de la proteína y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Para agregar secuencias faltantes, las secuencias de ADNc clonadas se pueden combinar con oligonucleótidos sintéticos mediante ligación o amplificación por PCR. Alternativamente, la región variable completa puede sintetizarse como un conjunto de oligonucleótidos cortos, solapados, y combinarse mediante amplificación por PCR para crear un clon de región variable completamente sintético. Este proceso tiene ciertas ventajas tales como eliminación o inclusión o sitios de restricción particulares, u optimización de codones particulares.

Las secuencias de nucleótidos de los transcritos de cadena pesada y ligera de un hibridoma se utilizan para diseñar un conjunto superpuesto de oligonucleótidos sintéticos para crear secuencias V sintéticas con capacidades de codificación de aminoácidos idénticas a las de las secuencias naturales. Las secuencias sintéticas de cadena pesada y kappa pueden diferir de las secuencias naturales de tres formas: las cadenas de bases de nucleótidos repetidas se interrumpen para facilitar la síntesis de oligonucleótidos y la amplificación por PCR; los sitios óptimos de iniciación de la traducción se incorporan de acuerdo con las reglas de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870); y los sitios HindIII se diseñan corriente arriba de los sitios de inicio de la traducción.

Para las regiones variables de cadena pesada y ligera, las secuencias de cadena codificantes optimizadas y no codificantes correspondientes se descomponen en 30-50 nucleótidos aproximadamente en el punto medio del oligonucleótido no codificante correspondiente. Por tanto, para cada cadena, los oligonucleótidos pueden ensamblarse en conjuntos bicatenarios superpuestos que abarcan segmentos de 150 a 400 nucleótidos. Los conjuntos se utilizan luego como plantillas para producir productos de amplificación por PCR de 150 a 400 nucleótidos. Normalmente, un conjunto de oligonucleótidos de región variable única se dividirá en dos conjuntos, que se amplifican por separado para generar dos productos de PCR superpuestos. Estos productos superpuestos se combinan luego mediante amplificación por PCR para formar la región variable completa. También puede ser deseable incluir un fragmento superpuesto de la región constante de la cadena ligera o pesada (incluido el sitio Bbs1 de la cadena ligera kappa, o el sitio Agel si es la cadena pesada gamma) en la amplificación por PCR para generar fragmentos que pueden ser fácilmente clonado en los constructos del vector de expresión.

Las regiones variables de cadena pesada y ligera reconstruidas se combinan luego con el promotor clonado, la secuencia guía, el inicio de la traducción, la secuencia guía, la región constante, las secuencias 3' sin traducir, poliadenilación y terminación de la transcripción para formar constructos de vector de expresión. Los constructos de expresión de cadena pesada y ligera pueden combinarse en un solo vector, cotransfectarse, transfectarse en serie o transfectarse por separado en células huésped que luego se fusionan para formar una célula huésped que exprese ambas cadenas.

Los plásmidos para su uso en la construcción de vectores de expresión se construyeron de modo que las secuencias de ADNc de cadena ligera kappa V y pesada V amplificadas por PCR pudieran usarse para reconstruir minigenes completos de cadena ligera y pesada. Estos plásmidos pueden usarse para expresar anticuerpos IgG-iK o IgG4K completamente humanos. Los anticuerpos completamente humanos y quiméricos de la presente invención también incluyen anticuerpos IgG2, IgG3, IgE, IgA, IgM e IgD. Pueden construirse plásmidos similares para la expresión de otros isotipos de cadena pesada o para la expresión de anticuerpos que comprenden cadenas ligeras lambda.

Por tanto, en otro aspecto de la divulgación, las características estructurales de los anticuerpos anti-C6 de la invención se utilizan para crear anticuerpos anti-C6 estructuralmente relacionados que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tales como, para ejemplo,

(a) se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-C6 de la invención, tal como 7E5, 8G09, 7E12, 7G09, 8F07, 7F06, 7F11, 7E11 o 7F02;

(b) tiene una IC50 en un ensayo hemolítico de 0.5 pg/ml o menos;

(c) tiene un Kd, determinado por resonancia de plasmón superficial, de 1 x 10'8 M o menos (o alternativamente, 5x10 ' 8 M o menos, 1 x 10'9 M o menos, 5 x 10'9 M o menos o 5 x 10'10 M o menos);

(d) tiene una vida media de unión de anticuerpo-C6, determinada por resonancia de plasmón superficial, de 40 horas o más; o

(e) reacciona de forma cruzada con el mono cynomolgus C6.

En un aspecto de la divulgación, una o más regiones CDR de anticuerpos de la invención se pueden combinar de forma recombinante con regiones marco conocidas y CDR para crear anticuerpos anti-C6 adicionales, modificados por ingeniería recombinante, de la invención. Las regiones marco variables de cadena pesada y ligera pueden derivarse de la misma secuencia de anticuerpos o de secuencias de anticuerpos diferentes. Las secuencias de anticuerpos pueden ser secuencias de anticuerpos de origen natural o pueden ser secuencias consenso de varios anticuerpos. Véase Kettleborough et al., Protein Engineering 4: 773 (1991); Kolbinger et al., Protein Engineering 6: 971 (1993) y Carter et al., WO 92/22653.

Por consiguiente, en otro aspecto, la divulgación describe un método para preparar un anticuerpo anti-C6 que incluye: preparar un anticuerpo que incluye (1) regiones marco de cadena pesada y CDR de cadena pesada, donde al menos una de las CDR de cadena pesada incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las CDR mostradas en las SEQ ID NO: 6, 7 y 8; y (2) regiones marco de cadena ligera y CDR de cadena ligera, donde al menos una de las CDR de cadena ligera incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las CDR mostradas en las SEQ ID NO: 11, 12 y 13; donde el anticuerpo conserva la capacidad de unirse a C6. La capacidad del anticuerpo para unirse a C6 se puede determinar usando ensayos estándar de unión y/o funcionales, tales como los que se exponen en los Ejemplos. Preferiblemente, el anticuerpo exhibe al menos una, o al menos dos o al menos tres o al menos cuatro o las cinco propiedades funcionales enumeradas anteriormente como (a) a (e). Ejemplos de dichos anticuerpos, como se describen en el presente documento, incluyen los anticuerpos 7E5, 8G09, 7 E12 , 7G09, 8F07, 7F06, 7F11, 7E11 y 7F02 (como se describe en el Ejemplo 6).

Es bien conocido en la técnica que los dominios CDR3 de cadena ligera y pesada del anticuerpo juegan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo por un antígeno (véase Hall et al., J. Imunol., 149: 1605-1612 (1992); Polymenis et al., J. Immunol., 152: 5318-5329 (1994); Jahn et al., Immunobiol., 193: 400-419(1995); Klimkaetal., Brit. J. Cancer, 83: 252-260 (2000); Beiboer et al., J. Mol. Biol, 296: 833-849 (2000); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 8910-8915 (1998); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc., 116: 2161-2162 (1994); Ditzel et al., J. Immunol., 157: 739-749 (1996)). Por consiguiente, los anticuerpos recombinantes de la invención preparados como se ha expuesto anteriormente comprenden preferiblemente la CDR3 de cadena pesada y/o ligera del anticuerpo 7E5, como se indica en las SEQ ID NO: 8 y 13, respectivamente. Ejemplos de dichos anticuerpos, como se describen en el presente documento, incluyen los anticuerpos 7E5, 8G09, 7E12, 7G09, 8F07, 7F06, 7F11, 7E11 y 7F02 (como se describe en el Ejemplo 6).

Además, en otra realización, la invención proporciona además anticuerpos anti-C6 que comprenden: (1) regiones marco de cadena pesada, una región CDR1 de cadena pesada, una región CDR2 de cadena pesada y una región CDR3 de cadena pesada, donde la cadena pesada La región CDR3 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8 y (2) regiones marco de cadena ligera, una región CDR1 de cadena ligera, una región CDR2 de cadena ligera y una región CDR3 de cadena ligera, donde la región CDR3 de cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO: 13, en donde el anticuerpo se une a C6. El anticuerpo incluye además la CDR2 de cadena pesada y la CDR2 de cadena ligera del anticuerpo 7E5, como se establece en las SEQ ID NO: 7 y 12, respectivamente. El anticuerpo comprende además la CDR1 de cadena pesada y la CDR1 de cadena ligera del anticuerpo 7E5, como se establece en las SEQ ID NO: 6 y 11, respectivamente. Ejemplos de dichos anticuerpos, como se describen en el presente documento, incluyen los anticuerpos 7E5, 8G09, 7e 12, 7G09, 8F07, 7F06, 7F11, 7E11 y 7F02 (como se describe en el Ejemplo 6).

En otra realización más, el anticuerpo aislado es uno en donde

El Ejemplo 7 describe en detalle experimentos de "mezclar y combinar" en los que cada una de estas regiones variables de cadena pesada y ligera se emparejaron entre sí, en las 81 combinaciones posibles, y se demostró la actividad funcional de las 81 combinaciones en la inhibición de la actividad C6.

Se pueden realizar modificaciones dentro de una o más de las regiones marco, FR1, FR2, FR3 y FR4, de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo, siempre que estas modificaciones no eliminen la afinidad de unión del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos no de la línea germinal en las regiones marco de la región variable de la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo de la invención, se sustituyen con un residuo de aminoácido de la línea germinal, es decir, el residuo de aminoácido correspondiente en la secuencia de la línea germinal humana para la región variable de la cadena ligera o pesada, con la que el anticuerpo tiene una identidad de secuencia significativa. Por ejemplo, una cadena de anticuerpo se puede alinear con una cadena de anticuerpo de la línea germinal, con la que comparte una identidad de secuencia significativa, y los residuos de aminoácidos que no coinciden entre la secuencia del marco del anticuerpo y el marco de la cadena de la línea germinal pueden sustituirse por los residuos correspondientes de la secuencia de la línea germinal. Cuando un aminoácido difiere entre una región marco variable de anticuerpo y una región marco variable de secuencia de línea germinal humana equivalente, el aminoácido marco de anticuerpo normalmente debe sustituirse por el aminoácido de secuencia de línea germinal humana equivalente si se espera razonablemente que el aminoácido se encuentre dentro de las siguientes categorías:

(1) un residuo de aminoácido que se une directamente al antígeno de forma no covalente,

(2) un residuo de aminoácido adyacente a una región CDR,

(3) un residuo de aminoácido que de otra manera interactúa con una región CDR (por ejemplo, está dentro de aproximadamente 3-6 A de una región CDR según lo determinado por modelado informático), o

(4) un residuo de aminoácido que participa en la interfaz VL-VH.

Los residuos que "se unen directamente al antígeno no covalentemente" incluyen aminoácidos en posiciones en las regiones marco que tienen una buena probabilidad de interactuar directamente con los aminoácidos en el antígeno de acuerdo con fuerzas químicas establecidas, por ejemplo, mediante enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones hidrófobas y similares. Por consiguiente, en una realización, un residuo de aminoácido en la región marco de un anticuerpo de la invención se sustituye con el residuo de aminoácido de la línea germinal correspondiente que se une directamente al antígeno de forma no covalente.

Los residuos que son "adyacentes a una región CDR" incluyen residuos de aminoácidos en posiciones inmediatamente adyacentes a una o más de las CDR en la secuencia primaria del anticuerpo, por ejemplo, en posiciones inmediatamente adyacentes a una CDR según lo definido por Kabat, o una CDR como la define Chothia (véase, por ejemplo, Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901 (1987)). Por consiguiente, en una realización, un residuo de aminoácido dentro de la región marco de un anticuerpo de la invención se sustituye con un residuo de aminoácido de la línea germinal correspondiente que está adyacente a una región CDR.

Los residuos que "interaccionan de otra manera con una región CDR" incluyen aquellos que se determinan mediante análisis estructural secundario para estar en una orientación espacial suficiente para afectar a una región CDR. Dichos aminoácidos generalmente tendrán un átomo de cadena lateral dentro de aproximadamente 3 unidades angstrom (A) de algún átomo en las CDR y deben contener un átomo que podría interactuar con los átomos de CDR de acuerdo con fuerzas químicas establecidas, como las enumeradas anteriormente. Por consiguiente, en una realización, un residuo de aminoácido dentro de la región marco de un anticuerpo de la invención se sustituye con el residuo de aminoácido de la línea germinal correspondiente que, de otro modo, interactúa con una región CDR.

Se sabe que los aminoácidos en varias posiciones en el marco son importantes para determinar la confirmación de CDR (por ejemplo, capaces de interactuar con las CDR) en muchos anticuerpos (Chothia and Lesk, supra, Chothia et al., Supra and Tramontano et al. al., J. Mol. Biol. 215: 175 (1990)). Estos autores identificaron residuos de estructura conservados importantes para la conformación de CDR mediante el análisis de las estructuras de varios anticuerpos conocidos. Los anticuerpos analizados pertenecían a un número limitado de clases estructurales o "canónicas" basadas en la conformación de las CDR. Los residuos del marco conservados dentro de los miembros de una clase canónica se denominan residuos "canónicos". Los residuos canónicos incluyen los residuos 2, 25, 29, 30, 33, 48, 64, 71, 90, 94 y 95 de la cadena ligera y los residuos 24, 26, 29, 34, 54, 55, 71 y 94 de la cadena pesada. Pueden identificarse residuos adicionales (por ejemplo, residuos determinantes de la estructura de CDR) de acuerdo con la metodología de Martin and Thorton (1996) J. Mol. Biol. 263: 800. En particular, se sabe que los aminoácidos en las posiciones 2, 48, 64 y 71 de la cadena ligera y 26-30, 71 y 94 de la cadena pesada (numeración según Kabat) son capaces de interactuar con las CDR en muchos anticuerpos. También es probable que los aminoácidos en las posiciones 35 en la cadena ligera y 93 y 103 en la cadena pesada interactúen con las CDR. Pueden identificarse residuos adicionales que pueden afectarla conformación de las CDR según la metodología de Foote and W inter(1992) J. Mol. Biol. 224: 487. Dichos residuos se denominan residuos "vernier" y son aquellos residuos en la región marco que subyace estrechamente (es decir, que forman una "plataforma" debajo) de las CDR.

Los residuos que "participan en la interfaz VL-VH" o "residuos de empaquetamiento" incluyen aquellos residuos en la interfaz entre VL y VH como se define, por ejemplo, por Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 4592-66 (1985) o Chothia et al, supra.

Ocasionalmente, existe cierta ambigüedad acerca de si un aminoácido particular cae dentro de una o más de las categorías mencionadas anteriormente. En tales casos, se producen anticuerpos variantes alternativos, uno de los cuales tiene esa sustitución particular, el otro de los cuales no. Los anticuerpos variantes alternativos así producidos se pueden probar en cualquiera de los ensayos descritos en el presente documento para determinar la actividad deseada y seleccionar el anticuerpo preferido.

Los candidatos adicionales para la sustitución dentro de la región marco son los aminoácidos que son inusuales o "raros" para un anticuerpo en esa posición. Estos aminoácidos pueden sustituirse por aminoácidos de la posición equivalente de la secuencia de la línea germinal humana o de las posiciones equivalentes de anticuerpos más típicos. Por ejemplo, la sustitución puede ser deseable cuando el aminoácido en una región marco del anticuerpo es raro para esa posición y el aminoácido correspondiente en la secuencia de la línea germinal es común para esa posición en las secuencias de inmunoglobulina; o cuando el aminoácido en el anticuerpo es raro para esa posición y el aminoácido correspondiente en la secuencia de la línea germinal también es raro, en relación con otras secuencias. Se contempla que reemplazando un aminoácido inusual con un aminoácido de la secuencia de la línea germinal que resulta ser típico de los anticuerpos, el anticuerpo puede hacerse menos inmunogénico.

El término "raro", como se usa en este documento, indica un aminoácido que se encuentra en esa posición en menos de aproximadamente el 20%, preferiblemente menos de aproximadamente el 10%, más preferiblemente menos de aproximadamente el 5%, incluso más preferiblemente menos de aproximadamente 3%, incluso más preferiblemente menos de aproximadamente 2% e incluso más preferiblemente menos de aproximadamente 1% de secuencias en una muestra representativa de secuencias, y el término "común", como se usa en este documento, indica un aminoácido que se encuentra en más de aproximadamente 25% pero normalmente más del 50% de las secuencias en una muestra representativa. Por ejemplo, todas las secuencias de la región variable de la cadena ligera y pesada se agrupan respectivamente en "subgrupos" de secuencias que son especialmente homólogas entre sí y tienen los mismos aminoácidos en determinadas posiciones críticas (Kabat et al., Supra). Al decidir si un aminoácido en una secuencia de anticuerpo es "raro" o "común" entre secuencias, a menudo será preferible considerar solo aquellas secuencias en el mismo subgrupo que la secuencia de anticuerpo.

En general, las regiones marco de los anticuerpos suelen ser sustancialmente idénticas y, más habitualmente, idénticas a las regiones marco de las secuencias de la línea germinal humana de las que se derivan. Por supuesto, muchos de los aminoácidos en la región marco hacen poca o ninguna contribución directa a la especificidad o afinidad de un anticuerpo. Por tanto, pueden tolerarse muchas sustituciones conservadoras individuales de residuos marco sin un cambio apreciable de la especificidad o afinidad de la inmunoglobulina resultante. Por tanto, en una realización, la región marco variable del anticuerpo comparte al menos el 85% de identidad de secuencia con una secuencia de la región marco variable de la línea germinal humana o consenso de tales secuencias. En otra realización, la región marco variable del anticuerpo comparte al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de región marco variable de línea germinal humana o consenso de tales secuencias.

También se pueden realizar modificaciones de la estructura para reducir la inmunogenicidad del anticuerpo o para reducir o eliminar los epítopos de células T que residen en el mismo, como describen, por ejemplo, Carr et al en el documento US2003/0153043.

Los anticuerpos modificados genéticamente de la invención incluyen aquellos en los que se han realizado modificaciones en los residuos de estructura dentro de Vh y/o Vl, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente, tales modificaciones del marco se realizan para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque consiste en "retromutar" uno o más residuos del marco a la secuencia de la línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que ha sufrido una mutación somática puede contener residuos de marco que difieren de la secuencia de la línea germinal de la que se deriva el anticuerpo. Dichos residuos se pueden identificar comparando las secuencias marco del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de las que se deriva el anticuerpo.

Otro tipo de modificación del marco implica la mutación de uno o más residuos dentro de la región marco, o incluso dentro de una o más regiones CDR, para eliminar los epítopos de células T para reducir así la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este enfoque también se denomina "desinmunización" y se describe con más detalle en la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 20030153043.

Además de simplemente unirse a C6, un anticuerpo puede seleccionarse por su retención de otras propiedades funcionales de los anticuerpos de la invención, tales como, por ejemplo:

(b) tiene una IC50 en un ensayo hemolítico de 0.5 pg/ml o menos;

(c) tiene una Kd, determinada por resonancia de plasmón superficial, de 5 x 10-10 M o menos;

(e) reacciona de forma cruzada con el mono cynomolgus C6.

Modificaciones adicionales de anticuerpos

Los anticuerpos de la presente divulgación pueden contener uno o más sitios de glicosilación en la región variable de cadena ligera o pesada. Dichos sitios de glicosilación pueden dar como resultado un aumento de la inmunogenicidad del anticuerpo o una alteración del pK del anticuerpo debido a la unión alterada del antígeno (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41: 673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172: 5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168: 1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12: 43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316: 452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37: 697-706). Se sabe que la glicosilación se produce en motivos que contienen una secuencia N-X-S/T. En algunos casos, se prefiere tener un anticuerpo anti-C6 que no contenga glicosilación de región variable. Esto se puede lograr seleccionando anticuerpos que no contienen el motivo de glicosilación en la región variable o mutando residuos dentro de la región de glicosilación.

Por ejemplo, en una realización, se modifica la glicosilación de un anticuerpo, por ejemplo, se altera la región variable para eliminar uno o más sitios de glicosilación residentes en la región variable. Más particularmente, es deseable en la secuencia de los presentes anticuerpos eliminar los sitios propensos a la glicosilación. Esto se logra alterando la aparición de una o más secuencias N-X-(S/T) que ocurren en la región variable original (donde X es cualquier residuo de aminoácido), particularmente sustituyendo el residuo N y/o el residuo S o T. En una realización, T95 está mutado a K95. En otra realización, N47 está mutado a R47.

Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos aglicosilados (es decir, que carecen de glicosilación). La glicosilación se puede alterar para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Tales modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación del marco de la región variable para eliminar de ese modo la glicosilación en ese sitio. Tal aglicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Véanse, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5.714.350 y 6.350.861.

Adicional o alternativamente, el anticuerpo puede tener un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tiene estructuras de GlcNac bisectantes aumentadas. Se ha demostrado que tales patrones de glicosilación alterados aumentan la capacidad ADCC de los anticuerpos. Tales modificaciones de carbohidratos pueden lograrse, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula huésped con maquinaria de glicosilación alterada. Se han descrito en la técnica células con maquinaria de glicosilación alterada y se pueden usar como células huésped en las que expresar anticuerpos recombinantes de la invención para producir de ese modo un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 carecen del gen de la fucosiltransferasa, FUT8 (a (1,6)-fucosiltransferasa), de modo que los anticuerpos expresados en las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 carecen de fucosa en sus carbohidratos. Las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 FUT8 -/- se crearon mediante la alteración dirigida del gen FUT8 en células CHO/DG44 utilizando dos vectores de reemplazo (Véase la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 20040110704 and Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87: 614-22). Como otro ejemplo, el documento EP 1.176.195 describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosil transferasa, de manera que los anticuerpos expresados en dicha línea celular exhiben hipofucosilación al reducir o eliminar la enzima relacionada con el enlace a-1,6. El documento EP 1.176.195 también describe líneas celulares que tienen una baja actividad enzimática para añadir fucosa a la N-acetilglucosamina que se une a la región Fc del anticuerpo o que no tiene la actividad enzimática, por ejemplo, la línea celular de mieloma de rata YB2/0 (ATCC CRL 1662). La publicación PCT WO 03/035835 describe una línea celular CHO variante, células Lec13, con capacidad reducida para unir fucosa a carbohidratos ligados a Asn (297), lo que también da como resultado la hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula huésped (véase también Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733 26740). También se pueden producir anticuerpos con un perfil de glicosilación modificado en huevos de gallina, como se describe en la publicación PCTWO 06/089231. Alternativamente, se pueden producir anticuerpos con un perfil de glicosilación modificado en células vegetales, como Lemna. Los métodos para la producción de anticuerpos en un sistema vegetal se describen en la Solicitud de Patente estadounidense US2008/0066200 La publicación PCT WO 99/54342 describe líneas celulares diseñadas para expresar glicosiltransferasas modificadoras de glicoproteínas (por ejemplo, B(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares manipuladas exhiben estructuras GlcNac bisectantes aumentadas que dan como resultado una actividad ADCC aumentada de los anticuerpos (véase también Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-180). Alternativamente, los residuos de fucosa del anticuerpo se pueden escindir usando una enzima fucosidasa; por ejemplo, la fucosidasa a-L-fucosidasa elimina los residuos de fucosilo de los anticuerpos (Tarentino et al. (1975) Biochem. 14: 5516-23).

Los anticuerpos de la invención se pueden alterar en la región variable para eliminar uno o más sitios de glicosilación y/o para mejorar la estabilidad física del anticuerpo. Por ejemplo, en una realización, la estabilidad física del anticuerpo se mejora sustituyendo la serina en la posición 228 de la región variable con un residuo de prolina (es decir, el anticuerpo tiene una región variable que comprende una mutación S228P). La alteración de S228P estabiliza significativamente la estructura del anticuerpo contra la formación de enlaces disulfuro intracadena. En una realización, un anticuerpo de longitud completa de la invención es un isotipo IgG4 con una alteración de S228P (IgG4 S228P).

En otra realización, la región variable se altera para eliminar uno o más sitios de glicosilación residentes en la región variable. Más particularmente, es deseable en la secuencia de los presentes anticuerpos eliminar los sitios propensos a la glicosilación. Como se describió anteriormente, esto se puede lograr alterando la aparición de una o más secuencias N-X-(S/T) que ocurren en la región variable original (donde X es cualquier residuo de aminoácido), particularmente sustituyendo el residuo N y/o el residuo S o T. En una realización, T95 está mutado a K95. En otra realización, N47 está mutado a R47.

Además o como alternativa a las modificaciones realizadas dentro de las regiones marco, los anticuerpos de la invención pueden diseñarse para incluir modificaciones dentro de la región Fc, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, como la vida media en suero, la fijación del complemento, unión al receptor Fc y/o citotoxicidad celular dependiente de antígeno. El anticuerpo también puede modificarse químicamente (por ejemplo, pueden unirse una o más unidades estructurales químicas al anticuerpo) o modificarse para alterar su glicosilación, de nuevo para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con más detalle más adelante. La numeración de residuos en la región Fc es la del índice UE de Kabat.

En ciertas realizaciones, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas, pero no todas las funciones efectoras, lo que lo convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la vida media del anticuerpo in vivo es importante pero ciertas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarios o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/agotamiento de las actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, pueden realizarse ensayos de unión al receptor de Fc (FcR) para asegurar que el anticuerpo carece de unión a FcgR (por lo tanto, probablemente carece de actividad ADCC), pero conserva la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar ADCC, las células NK, expresan solo FcgRIII, mientras que los monocitos expresan FcgRI, FcgRII y FcgRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch, J. V. and Kinet, J. P., Annu Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. Se describen ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés en la Patente de los Estados Unidos No. 5.500.362 (véase, por ejemplo, Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; and Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502); Patente de los Estados Unidos No. 5.821.337 (véase Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). Alternativamente, se pueden emplear métodos de ensayos no radiactivos (véase, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radiactiva ACTI.TM. para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, California; y ensayo de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96.RTM. (Promega, Madison, Wis.). Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Alternativa o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el descrito en Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. También se pueden llevar a cabo ensayos de unión de C1q para confirmar que el anticuerpo es incapaz para unirse a Clq y, por tanto, carece de actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro, H. etal., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. etal., Blood 101 (2003) 1045-1052; and Cragg, M.S and M. J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743). Las determinaciones de unión de FcRn y aclaramiento/vida media in vivo también se pueden realizar usando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S. B. et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769).

En una realización particular, el anticuerpo comprende una región variable que está mutada para mejorar la estabilidad física del anticuerpo. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo de isotipo IgG4 que comprende una mutación de serina a prolina en una posición correspondiente a la posición 228 (S228P; índice EU) en la región bisagra de la región constante de la cadena pesada. Se ha informado que esta mutación elimina la heterogeneidad de los puentes disulfuro entre cadenas pesadas en la región de bisagra (Angal et al. Supra; la posición 241 se basa en el sistema de numeración de Kabat). Por ejemplo, en diversas realizaciones, un anticuerpo anti-C6 de la invención puede comprender la región variable de cadena pesada de cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento unidos a una región constante de IgG4 humana en la que la serina en una posición correspondiente a la posición 241 como se describe en Angal et al., Supra, se ha mutado a Prolina. Por tanto, para las regiones variables de cadena pesada unidas a una región constante de IgG4 humana, esta mutación corresponde a una mutación S228P según el índice EU.

En otra realización, la región de bisagra de CH1 se modifica de manera que el número de residuos de cisteína en la región de bisagra se altera, por ejemplo, aumenta o disminuye. Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de los Estados Unidos No. 5.677.425. El número de residuos de cisteína en la región de bisagra de CH1 se modifica para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

En otra realización, la región de bisagra Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la vida media biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento de bisagra Fc de manera que el anticuerpo tiene la unión de proteína A de estafilococilo (SpA) alterada con respecto a la unión de SpA del dominio de bisagra Fc nativo. Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de los Estados Unidos No. 6.165.745.

En otra realización, el anticuerpo se modifica para aumentar su vida media biológica. Son posibles varios enfoques. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 6.277.375. Alternativamente, para aumentar la vida media biológica, el anticuerpo se puede alterar dentro de la región CH1 o CL para que contenga un epítopo de unión al receptor de rescate tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos No. 5.869.046 y 6.121.022. En otro enfoque más, el anticuerpo se modifica para aumentar su vida media biológica mediante la introducción de dos mutaciones, una en una serina en la posición 434 y una segunda mutación seleccionada de un grupo que consiste en: una isoleucina en la posición 311, una valina en la posición 311, una isoleucina en la posición 436 y una valina en la posición 436. Este enfoque se describe en la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2012/6128663.

En otras realizaciones más, la región Fc se altera reemplazando al menos un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente para alterar la función o funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 pueden reemplazarse con un residuo de aminoácido diferente de modo que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector, pero retiene la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo original. El ligando efector al que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc o el componente C1 del complemento. Este enfoque se describe con más detalle en las Patentes Estadounidenses Nos. 5.624.821 y 5.648.260.

En otra realización, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácidos 329, 331 y 322 pueden reemplazarse con un residuo de aminoácido diferente de modo que el anticuerpo tenga la unión de C1q alterada y/o reduzca o elimine la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de los Estados Unidos No. 6.194.551.

En otra realización, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las posiciones de aminoácidos 231 y 239 se alteran para alterar de ese modo la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este enfoque se describe con más detalle en la Publicación PCT WO 94/29351.

En otra realización más, la región Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy modificando uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Este enfoque se describe con más detalle en la publicación PCTWO 00/42072. Además, se han cartografiado los sitios de unión en IgG1 humana para FcyR1, FcyRIl, FcyRIII y FcRn y se han descrito variantes con unión mejorada (véase Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 6591 6604). Se demostró que mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 mejoran la unión a FcyRIII. Además, se demostró que las siguientes combinaciones de mutantes mejoran la unión de FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A.

En otra realización más, la región Fc se modifica para reducir la capacidad del anticuerpo para mediar en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y/o para reducir la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy introduciendo una sustitución de aminoácido en posición Pro329 y al menos una sustitución de aminoácido adicional, preferiblemente seleccionada entre S228P, E233p , L234A, L235A, L235E, N297A, N297D y P331S. Este enfoque se describe en la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2012/0251531.

Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (Patente de los Estados Unidos No. 6.737.056). Dichos mutantes Fc incluyen mutantes Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluido el mutante Fc denominado "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (Patente de los Estados Unidos No. 7.332.581).

Se describen ciertas variantes de anticuerpos con unión mejorada o disminuida a FcR. (Véanse, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6.737.056; WO 2004/056312, y Shields, R. L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).

En determinadas realizaciones, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración UE de residuos).

En algunas realizaciones, se realizan alteraciones en la región Fc que dan como resultado una unión de Clq alterada (es decir, mejorada o disminuida) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 6.194.551, WO 99/51642 e Idusogie, E. E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.

Anticuerpos con vidas medias aumentadas y unión mejorada al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, y Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), se describen en el documento US 2005/0014934. Esos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Tales variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, sustitución del residuo 434 de la región Fc (Patente de los Estados Unidos No. 7.371.826). Véase también Duncan, A. R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; Patente de los Estados Unidos No. 5.648.260; Patente de los Estados Unidos No.

5.624.821; y WO 94/29351 con respecto a otros ejemplos de variantes de la región Fc.

Además, el anticuerpo se puede pegilar, por ejemplo, para aumentar la semivida biológica (por ejemplo, en suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, normalmente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), como un éster reactivo o derivado de aldehido de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos PEG se unen al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferiblemente, la pegilación se lleva a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Como se usa en este documento, el término "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivar otras proteínas, tales como mono (C1-C10) alcoxi o ariloxipolietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En determinadas realizaciones, el anticuerpo por pegilar es un anticuerpo aglicosilado. Los métodos para pegilar proteínas se conocen en la técnica y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 0 154316 y EP 0401 384.

Caracterización de anticuerpos monoclonales contra C6

Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden caracterizar por la unión a C6 y/o la inhibición funcional de C6 usando una variedad de técnicas conocidas. Normalmente, la unión del anticuerpo a su antígeno diana se caracteriza inicialmente por ELISA. En resumen, las placas de microtitulación se pueden recubrir con C6 purificado en PBS y luego se pueden bloquear con proteínas irrelevantes como la albúmina de suero bovino (BSA) diluida en PBS. Se añaden diluciones de plasma de ratones inmunizados con C6 a cada pozo y se incuban durante 1-2 horas a 37°C. Las placas se lavan con PBS/Tween 20 y luego se incuban con un reactivo policlonal específico de Fc de IgG antihumano de cabra conjugado con fosfatasa alcalina durante 1 hora a 37°C. Después del lavado, las placas se revelan con sustrato ABTS y se analizan a una DO de 405. Preferiblemente, los ratones que desarrollan los títulos más altos de anticuerpos que exhiben la actividad inhibidora funcional y/o de unión más alta se usan para las fusiones.

Puede usarse un ensayo ELISA como se describió anteriormente para seleccionar anticuerpos y, por lo tanto, hibridomas que producen anticuerpos que muestran reactividad positiva con el inmunógeno C6. Los hibridomas que se unen, preferiblemente con alta afinidad, a C6 pueden luego subclonarse y caracterizarse adicionalmente. Más adelante, se puede elegir un clon de cada hibridoma, que retiene la reactividad de las células parentales (mediante ELISA), para hacer un banco de células y para la purificación de anticuerpos.

Además o alternativamente, se puede usar un ensayo funcional que determina la capacidad de un anticuerpo para inhibir o bloquear la actividad de C6 para cribar y seleccionar un anticuerpo de interés. Los ensayos funcionales in vitro adecuados incluyen ensayos hemolíticos y ensayos ELISA de MAC, como se describe en detalle en el Ejemplo 1. Un ensayo adecuado para determinar la actividad funcional in vivo se describe en detalle en el Ejemplo 4.

Para purificar anticuerpos anti-C6, se pueden cultivar hibridomas seleccionados en botellas rotativas, matraces giratorios de dos litros u otros sistemas de cultivo. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) para purificar la proteína. Después del intercambio de regulador a PBS, la concentración se puede determinar mediante DO280 usando un coeficiente de extinción de 1.43 o preferiblemente mediante análisis nefelométrico. La IgG puede comprobarse mediante electroforesis en gel y mediante un método específico de antígeno.

Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-C6 seleccionados se unen a epítopos únicos, cada anticuerpo puede biotinilarse usando reactivos disponibles comercialmente (Pierce, Rockford, IL). La unión de MAb biotinilado se puede detectar con una sonda marcada con estreptavidina. Para determinar el isotipo de anticuerpos purificados, se pueden realizar ELISA de isotipo usando técnicas reconocidas en la técnica. Por ejemplo, los pozos de las placas de microvaloración se pueden recubrir con 10 pg/ml de anti-Ig durante la noche a 4°C. Después del bloqueo con BSA al 5%, las placas se hacen reaccionar con 10 pg/ml de anticuerpos monoclonales o controles de isotipo purificados, a temperatura ambiente durante dos horas. Más adelante, los pozos se pueden hacer reaccionar con IgG1 u otras sondas conjugadas específicas de isotipo. Las placas se desarrollan y analizan como se describe anteriormente.

Los métodos para analizar la afinidad de unión, la reactividad cruzada y la cinética de unión de varios anticuerpos anti-C6 incluyen ensayos estándar conocidos en la técnica, por ejemplo, análisis de resonancia de plasmón de superficie (SPR) Biacore™ usando un instrumento Biacore™ 2000 SPR (Biacore AB, Uppsala, Suecia), como se describe en el Ejemplo 2 de la presente.

Preferiblemente, un anticuerpo de la invención se une a C6 con una Kd de 5 x 10'8 M o menos, se une a C6 con una Kd de 2 x 10'8 M o menos, se une a C6 con una Kd de 5 x 10'9 M o menos, se une a C6 con una Kd de 4 x 10'9 M o menos, se une a C6 con una Kd de 3 x 10'9 M o menos, se une a C6 con una Kd de 2 x 10 ’9 M o menos, se une a C6 con una Kd de 1 x 10'9 M o menos, se une a C6 con una Kd de 5 x 10'1° M o menos, o se une a C6 con una Kd de 2.5 x 10'10 M o menos.

Preferiblemente, un anticuerpo de la invención tiene un T1/2 (determinado por resonancia de plasmón superficial) de al menos 24 horas, o al menos 30 horas, o al menos 36 horas, o al menos 40 horas o al menos 45 horas.

Propiedades físicas del anticuerpo

Los anticuerpos de esta divulgación se pueden caracterizar por sus diversas propiedades físicas, para detectar y/o diferenciar diferentes clases de los mismos.

En una realización preferida, los anticuerpos de la presente divulgación no contienen sitios de isomería de asparagina. La desamidación de la asparagina puede ocurrir en las secuencias N-G o D-G y dar como resultado la creación de un residuo de ácido isoaspártico que introduce una torsión en la cadena polipeptídica y disminuye su estabilidad (efecto del ácido isoaspártico).

Cada anticuerpo tendrá un punto isoeléctrico único (pI), que generalmente cae en el rango de pH entre 6 y 9.5. El pI de un anticuerpo IgG1 normalmente se encuentra dentro del rango de pH de 7-9.5 y el pI de un anticuerpo IgG4 normalmente se encuentra dentro del rango de pH de 6-8. Se especula que los anticuerpos con un pI fuera del rango normal pueden tener cierto despliegue e inestabilidad en condiciones in vivo. Por tanto, se prefiere tener un anticuerpo anti-C6 que contenga un valor de pI que se encuentre en el intervalo normal. Esto se puede lograr seleccionando anticuerpos con un pI en el rango normal o mutando residuos de superficie cargados.

En una realización preferida, se seleccionan anticuerpos que no se degradan rápidamente. La degradación de un anticuerpo se puede medir usando electroforesis capilar (CE) y MALDI-MS (Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67: 3626-32).

En otra realización preferida, se seleccionan anticuerpos que tienen efectos de agregación mínimos, que pueden conducir al desencadenamiento de una respuesta inmune no deseada y/o propiedades farmacocinéticas alteradas o desfavorables. Generalmente, los anticuerpos son aceptables con agregación del 25% o menos, preferiblemente del 20% o menos, incluso más preferiblemente del 15% o menos, incluso más preferiblemente del 10% o menos e incluso más preferiblemente del 5% o menos. La agregación se puede medir mediante varias técnicas, incluida columna de exclusión por tamaño (SEC), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y dispersión de luz.

Cada anticuerpo tendrá una temperatura de fusión característica, con una temperatura de fusión más alta que indica una mayor estabilidad general in vivo (Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3: 361-71). Generalmente, se prefiere que la Tm1 (la temperatura de despliegue inicial) sea mayor de 60°C, preferiblemente mayor de 65°C, incluso más preferiblemente mayor de 70°C. El punto de fusión de un anticuerpo se puede medir usando calorimetría de barrido diferencial (Chen et al (2003) Pharm Res 20: 1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68: 47-52) o dicroísmo circular (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40: 343-9).

En una realización, un anticuerpo de la invención tiene una temperatura de fusión alta. En una realización, el anticuerpo tiene un punto de fusión de al menos 65°C, más preferiblemente, al menos 66°C, incluso más preferiblemente al menos 67°C, e incluso más preferiblemente al menos 68°C. Preferiblemente, un anticuerpo de la invención tiene un punto de fusión en un rango de 67°C a 72°C, más preferiblemente de 68°C a 72°C, o de 69°C a 72°C, o de 70°C a 72°C o de 69°C a 71.43°C.

II. Inmunotoxinas, inmunoconjugados y derivados de anticuerpos

En otra realización, los anticuerpos de la presente invención están unidos a una unidad estructural terapéutica, como una citotoxina, un fármaco o un radioisótopo. Cuando se conjugan con una citotoxina, estos conjugados de anticuerpos se denominan "inmunotoxinas". Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células (por ejemplo, las mata). Los ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, entre otros, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil descarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisdiclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (antes daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina, (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). Un anticuerpo de la presente invención se puede conjugar con un radioisótopo, por ejemplo, yodo radiactivo, para generar radiofármacos citotóxicos.

Los conjugados de anticuerpos de la divulgación pueden usarse para modificar una respuesta biológica dada, y la unidad estructural de fármaco no debe interpretarse como limitada a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la unidad estructural de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o un fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina diftérica; una proteína como el factor de necrosis tumoral o el interferón-y; o modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), estimulantes de colonias de macrófagos de granulocitos factor ("GM-CSF"), factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF") u otros factores de crecimiento.

Las técnicas para conjugarta la unidad estructural terapéutica con anticuerpos son bien conocidas, véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).

Pueden prepararse conjugados del anticuerpo y una citotoxina usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato, iminotiolano, derivados bifuncionales de imidoésteres tales como dimetil adipimidato HCL, ésteres activos tales como suberato de disuccinimidilo, aldehidos como glutaraldehído, compuestos bis-azido como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilendiamina), diisocianatos como tolueno 2,6-diisocianato y compuestos de flúor bis-activos (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). El ácido 1-isotiocianobencil-3-metildietilen triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con C14 es un agente quelante adecuado para la conjugación del radionúclido con el anticuerpo.

El componente de toxina de la inmunotoxina puede ser, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, una toxina tal como una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de los mismos, o una toxina de molécula pequeña, o un isótopo radioactivo como 212Bi, 131I, 131In, 111In, 90Y y 186Re.

Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de dichos inmunoconjugados incluyen los maitansinoides que incluyen DM-1 y DM-4, auristatinas, adriamicina, doxorrubicina, epirrubicina, 5-fluorouracilo, arabinósido de citosina ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfán, citoxina, taxoides, por ejemplo, paclitaxel y docetaxel, taxotere, metotrexato, cisplatino, melfalán, vinblastina, bleomicina, etopósido, ifosamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatino, tenipósido, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, esperamicinas, 5-FU, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina, actinomicina D, VP-16, clorambucilo, melfalán y otras mostazas nitrogenadas relacionadas. También se incluyen agentes hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores como el tamoxifeno y la onapristona. Las toxinas y sus fragmentos que pueden usarse incluyen la cadena A de la difteria, los fragmentos activos no enlazantes de la toxina diftérica, la toxina del cólera, la toxina botulínica, la cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la cadena A de modecina, la alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, sapaonaria, inhibidor de officinalis, gelonina, saporina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotcenos. Las toxinas de molécula pequeña incluyen, por ejemplo, caliqueamicinas, maitansinoides, palitoxina y CC1065.

Los agentes terapéuticos adicionales que se pueden conjugar con el anticuerpo para formar una inmunotoxina incluyen antimetabolitos, agentes alquilantes, ligantes de ADN de surcos menores, intercaladores de ADN, reticuladores de ADN, inhibidores de histona desacetilasa, inhibidores de exportación nuclear, inhibidores de proteasoma, topoisomerasa I o II, inhibidores de proteínas de choque térmico, inhibidores de tirosina quinasa, antibióticos y agentes antimitóticos. En el conjugado, el anticuerpo y el agente terapéutico se conjugan preferiblemente mediante un enlazador escindible tal como un enlazador peptidilo, disulfuro o hidrazona. Más preferiblemente, el enlazador es un enlazador de peptidilo como Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO: 15), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser o Glu. Los conjugados se pueden preparar como se describe en las Patentes de los Estados Unidos No. 7.087.600; 6,989,452; y 7.129.261; Publicaciones PCT WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312; y WO 08/103693; Publicaciones de Patente de los Estados Unidos Nos. 20060024317; 20060004081; y 20060247295.

Los anticuerpos de la invención también se pueden usar con fines de diagnóstico, incluyendo pruebas de muestras e imágenes in vivo, y para este propósito el anticuerpo (o fragmento de unión del mismo) se puede conjugar con un agente detectable apropiado, para formar un inmunoconjugado. Para fines de diagnóstico, los agentes apropiados son marcadores detectables que incluyen radioisótopos, para la formación de imágenes de todo el cuerpo, y radioisótopos, enzimas, marcadores fluorescentes y otros marcadores de anticuerpos adecuados para análisis de muestras.

Para la detección de C6, los marcadores detectables pueden ser cualquiera de los diversos tipos utilizados actualmente en el campo del diagnóstico in vitro, incluidos los marcadores de partículas que incluyen soles metálicos como el oro coloidal, isótopos como I125 o Tc99 presentados, por ejemplo, con un agente quelante peptídico del tipo N2S2, N3S o N4, cromóforos que incluyen marcadores fluorescentes, marcadores luminiscentes, marcadores fosforescentes y similares, así como marcadores de enzimas que convierten un sustrato dado en un marcador detectable, y marcadores de polinucleótidos que se revelan después de la amplificación como por reacción en cadena de la polimerasa. Los marcadores enzimáticos adecuados incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y similares. Por ejemplo, el marcador puede ser la enzima fosfatasa alcalina, detectada midiendo la presencia o formación de quimioluminiscencia después de la conversión de sustratos de 1,2 dioxetano como adamantilmetoxifosforiloxifenildioxetano (AMPPD), disódico 3-(4-(metoxispiro{1,2-dioxetano-3,2'-(5'-cloro)triciclo{3.3.1.1 3,7}decan}-4-il)fenil fosfato (CSPD), así como CDP y CDP-star® u otros sustratos luminiscentes bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, los quelatos de lantánidos adecuados como Terbio (III) y Europio (III). El medio de detección está determinado por la etiqueta elegida. Se puede lograr la apariencia de la etiqueta o sus productos de reacción a simple vista, en el caso de que la etiqueta sea particulada y se acumule a niveles apropiados, o usando instrumentos como un espectrofotómetro, un luminómetro, un fluorímetro y similares, todo de acuerdo con la práctica estándar.

En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento puede modificarse adicionalmente para que contenga unidades estructurales no proteicas adicionales que se conocen en la técnica y están fácilmente disponibles. Las unidades estructurales adecuadas para la derivación del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros solubles en agua. Ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinil pirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico y mezclas de los mismos. El propionaldehído polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede tener cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar, y si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivación se puede determinar basándose en consideraciones que incluyen, pero no se limitan a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo a mejorar, si el derivado del anticuerpo se usará en una terapia bajo condiciones definidas, etc.

En otra realización, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y una unidad estructural no proteica que se pueden calentar selectivamente mediante exposición a radiación. En una realización, la unidad estructural no proteica es un nanotubo de carbono (Kam, N. W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan las células ordinarias, pero que calientan la unidad estructural no proteica a una temperatura a la que mueren las células próximas a la unidad estructural no proteica del anticuerpo.

Los métodos de conjugación que dan como resultado enlaces que son sustancialmente (o casi) no inmunogénicos son especialmente adecuados. Por lo tanto, el enlace péptido (es decir, amida), sulfuro, (impedido estéricamente), disulfuro, hidrazona o éter son especialmente adecuados. Estos enlaces son casi no inmunogénicos y muestran una estabilidad razonable dentro del suero (véase, por ejemplo, Senter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244; WO 2009/059278; WO 95/17886).

Dependiendo de la naturaleza bioquímica de la unidad estructural y del anticuerpo, se encuentran disponibles diferentes estrategias de conjugación. En caso de que la unidad estructural sea de origen natural o recombinante de entre 50 y 500 aminoácidos, existen procedimientos estándar en los libros de texto que describen la química para la síntesis de conjugados de proteínas, que pueden ser seguidos fácilmente por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Hackenberger, C.P.R. and Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074). En una realización, se usa la reacción de una unidad estructural maleinimido con un residuo de cisteína dentro del anticuerpo o la unidad estructural. Esta es una química de acoplamiento especialmente adecuada en el caso, por ejemplo, se utiliza un fragmento Fab o Fab' de un anticuerpo. Alternativamente, en una realización, se realiza el acoplamiento al extremo C-terminal del anticuerpo o unidad estructural. La modificación C-terminal de una proteína, por ejemplo, de un fragmento Fab puede, por ejemplo, realizarse como se describe (Sunbul, M. and Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371).

En general, la reacción específica de sitio y el acoplamiento covalente se basan en la transformación de un aminoácido natural en un aminoácido con una reactividad ortogonal a la reactividad de los otros grupos funcionales presentes. Por ejemplo, una cisteína específica dentro de un contexto de secuencia poco común puede convertirse enzimáticamente en un aldehído (véase Frese, M. A. and Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427). También es posible obtener una modificación de aminoácidos deseada utilizando la reactividad enzimática específica de ciertas enzimas con un aminoácido natural en un contexto de secuencia dado (véase, por ejemplo, Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15 (2008) 128-136; y la formación catalizada por proteasa de enlaces C-N es utilizada por Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403).

La reacción específica del sitio y el acoplamiento covalente también se pueden lograr mediante la reacción selectiva de los aminoácidos terminales con los reactivos modificadores apropiados.

La reactividad de una cisteína N-terminal con benzonitrilos (véase Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662) puede usarse para lograr un sitio específico acoplamiento covalente.

La ligadura química nativa también puede depender de residuos de cisteína C-terminal (Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96).

El documento EP 1074 563 describe un método de conjugación que se basa en la reacción más rápida de una cisteína dentro de un tramo de aminoácidos cargados negativamente con una cisteína ubicada en un tramo de aminoácidos cargados positivamente.

La unidad estructural también puede ser un péptido sintético o un péptido mimético. En caso de que un polipéptido se sintetice químicamente, se pueden incorporar aminoácidos con reactividad química ortogonal durante dicha síntesis (véase, por ejemplo, de Graaf, A. J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295). Dado que está enjuego una gran variedad de grupos funcionales ortogonales y pueden introducirse en un péptido sintético, la conjugación de dicho péptido a un enlazador es química estándar.

Para obtener un polipéptido monomarcado, el conjugado con estequiometría 1:1 puede separarse mediante cromatografía de otros subproductos de conjugación. Este procedimiento puede facilitarse utilizando un miembro de par de unión marcado con colorante y un enlazador cargado. Al usar este tipo de miembro de par de unión marcado y con una carga muy negativa, los polipéptidos monoconjugados se separan fácilmente de los polipéptidos no marcados y los polipéptidos que portan más de un enlazador, ya que la diferencia de carga y peso molecular puede usarse para la separación. El colorante fluorescente puede ser útil para purificar el complejo a partir de componentes no unidos, como un aglutinante monovalente marcado.

En una realización, la unidad estructural efectora se selecciona del grupo que consiste en una unidad estructural de unión, una unidad estructural de marcación y una unidad estructural biológicamente activa.

III. Composiciones

En otra realización, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo, una composición, que contiene uno o una combinación de anticuerpos monoclonales de la presente invención, formulada junto con un vehículo (por ejemplo, un vehículo farmacéuticamente aceptable). También se proporcionan composiciones que contienen moléculas biespecíficas que comprenden un anticuerpo de la presente invención. En una realización, las composiciones incluyen una combinación de múltiples (por ejemplo, dos o más) anticuerpos aislados de la invención. Preferiblemente, cada uno de los anticuerpos de la composición se une a un epítopo de C6 preseleccionado distinto.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden administrar en terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir una composición de la presente invención con al menos uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como agentes antiinflamatorios, FAME (fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad), agentes inmunosupresores y quimioterapéuticos. Las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden administrar junto con radioterapia. La coadministración con otros anticuerpos también está incluida en la invención.

Como se usa en el presente documento, los términos "vehículo" y "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares que sean fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la ruta de administración, el compuesto activo, es decir, el anticuerpo, la molécula biespecífica y multiespecífica, puede recubrirse con un material para proteger el compuesto de la acción de los ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Ejemplos de adyuvantes que pueden usarse con los anticuerpos y constructos de la presente invención incluyen: adyuvante incompleto y adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Michigan); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.); AS-2 (SmithKline Beecham, Filadelfia, Pensilvania); sales de aluminio tales como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o zinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos derivados catiónicamente o aniónicamente; polifosfacenos; microesferas biodegradables; citoquinas, tales como GM-CSF, interleucina-2, -7, -12 y otros factores similares; 3D-MPL; oligonucleótido CpG; y monofosforil lípido A, por ejemplo monofosforil lípido A 3-des-O-acilado.

Los adyuvantes de MPL están disponibles en Corixa Corporation (Seattle, Washington; véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos No. 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 y 4.912.094). Los oligonucleótidos que contienen CpG (en los que el dinucleótido CpG no está metilado) son bien conocidos y se describen, por ejemplo, en los documentos W o 96/02555, WO 99/33488 y la Patente de los Estados Unidos Nos. 6,008,200 y 5,856,462. Las secuencias de ADN inmunoestimuladoras también se describen, por ejemplo, por Sato et al., Science 273: 352, 1996.

Otros adyuvantes alternativos incluyen, por ejemplo, saponinas, tales como Quil A, o derivados de las mismas, que incluyen QS21 y QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, Mass.); Escina; Digitonina; o saponinas de Gypsophila o Chenopodium quinoa; Montanide ISA 720 (Seppic, Francia); SAF (Chiron, California, Estados Unidos); Is Co Ms (CSL), MF-59 (Quirón); la serie SBAS de adyuvantes (por ejemplo, SBAS-2 o SBAS-4, disponibles de SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica); Detox (Enhanzyn™) (Corixa, Hamilton, Mont.); RC-529 (Corixa, Hamilton, Mont.) y otros 4-fosfatos de aminoalquil glucosaminida (AGP); adyuvantes de polioxietilen étertales como los descritos en el documento WO 99/52549A1; imidazoquinolinas sintéticas tales como imiquimod [S-26308, R-837], (Harrison, et al., Vaccine 19: 1820-1826, 2001; y resiquimod [S-28463, R-848] (Vasilakos, et al., Cellular inmunology 204: 64-74, 2000; bases de Schiff de carbonilos y aminas que se expresan constitutivamente en las superficies de las células presentadoras de antígenos y de las células T, como el tucaresol (Rhodes, J. et al., Nature 377: 71-75, 1995); citoquinas, quimioquinas y moléculas coestimuladoras como proteínas o péptidos, incluidas, por ejemplo, citoquinas proinflamatorias tales como interferón, GM-CSF, IL-1 alfa, IL-1 beta, TGF-alfa y TGF-beta, inductores Th1 tales como interferón gamma, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-21, inductores de Th2 tales como IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 y otros genes de quimioquinas y coestimuladores como MCP-1, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, RANTES, TCA-3, CD80, CD86 y CD40L; agentes inmunoestimuladores dirigidos a ligandos como CTLA-4 y L-selectina, estimulantes de la apoptosis proteínas y péptidos como Fas; adyuvantes sintéticos a base de lípidos, tales como vaxfectina, (Reyes et al., Vaccine 19: 3778-3786, 2001) escualeno, alfa-tocoferol, polisorbato 80, Do PC y colesterol; endotoxina, [Lp S], (Beutler, B., Current Opinion in Microbiology 3: 23-30, 2000); ligandos que activan los receptores Toll para producir citoquinas inductoras de Th1, tales como lipoproteínas micobacterianas sintéticas, proteína micobacteriana p19, peptidoglicano, ácido teicoico y lípido A; y CT (toxina del cólera, subunidades A y B) y LT (enterotoxina termolábil de E. coli, subunidades A y B), familia de proteínas de choque térmico (HSP) y LLO (listeriolisina O; WO 01/72329). Estos y otros agonistas del receptor tipo Toll (TLR) se describen, por ejemplo, en Kanzler et al, Nature Medicine, mayo de 2007, Vol 13, No 5.

Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto original y no imparte ningún efecto toxicológico no deseado (véase, por ejemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci 66: 1-19). Ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácidos y sales de adición de bases. Las sales de adición de ácido incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fósforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales de adición de bases incluyen las derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

Una composición de la presente invención se puede administrar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como apreciará el experto en la técnica, la ruta y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protegerán al compuesto contra una liberación rápida, como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

Para administrar un compuesto de la invención mediante ciertas rutas de administración, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o coadministrar el compuesto con, un material para prevenir su inactivación. Por ejemplo, el compuesto se puede administrar a un sujeto en un vehículo apropiado, por ejemplo, liposomas o un diluyente. Los diluyentes aceptables incluyen soluciones reguladoras salinas y acuosas. Los liposomas incluyen emulsiones CGF de agua-en aceite-en agua, así como liposomas convencionales (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).

Los vehículos incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas de la invención. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones.

Las composiciones terapéuticas normalmente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Puede conseguirse una absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de microfiltración de esterilización. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y el secado por congelación (liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente esterilizada filtrada del mismo.

Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden administrarse una o dos veces por semana mediante inyección subcutánea o intramuscular o una o dos veces al mes mediante inyección subcutánea o intramuscular.

Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación, como se usa en este documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos por tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación de las formas unitarias de dosificación de la invención está dictada y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se desea lograr, y (b) las limitaciones inherentes a la técnica de la preparación de compuestos activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.

Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.

Para las composiciones terapéuticas, las formulaciones de la presente invención incluyen aquellas adecuadas para administración intravenosa, intraperitoneal, oral, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica de la farmacia. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una única forma de dosificación variará dependiendo del sujeto que se esté tratando y el modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una única forma de dosificación será generalmente la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. Generalmente, del cien por ciento, esta cantidad variará de aproximadamente el 0.001 por ciento a aproximadamente el noventa por ciento de ingrediente activo, preferiblemente de aproximadamente el 0.005 por ciento a aproximadamente el 70 por ciento, lo más preferiblemente de aproximadamente el 0.01 por ciento a aproximadamente el 30 por ciento.

Las formulaciones de la presente invención que son adecuadas para la administración vaginal también incluyen pesarios, reguladores, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en aerosol que contienen los vehículos que se sabe que son apropiados en la técnica. Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de las composiciones de esta invención incluyen polvos, aerosoles, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo se puede mezclar en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y con cualquier conservante, regulador o propulsor que pueda ser necesario.

Las expresiones "administración parenteral" y "administrado por ruta parenteral" como se usan en este documento significan modos de administración distintos a la administración enteral y tópica, generalmente por inyección, e incluyen, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, inyección e infusión intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.

Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, como el aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, como el oleato de etilo. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse tanto mediante procedimientos de esterilización, supra, como mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede producirse mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Cuando los compuestos de la presente invención se administran como productos farmacéuticos, a humanos y animales, se pueden administrar solos o como una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, 0.001 a 90% (más preferiblemente, 0.005 a 70%, tal como 0.01 a 30%) de ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Independientemente de la ruta de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden usarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de tratamiento, sin resultar ser tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o el éster, sal o amida de los mismos, la ruta de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros medicamentos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historial médico previo del paciente que está siendo tratado, y como factores bien conocidos en las artes médicas. Un médico o veterinario que tenga una experiencia normal en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad efectiva de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría iniciar dosis de los compuestos de la invención empleados en la composición farmacéutica a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta lograr el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una composición de la invención será la cantidad del compuesto que sea la dosis más baja eficaz para producir un efecto terapéutico. Una dosis tan eficaz dependerá generalmente de los factores descritos anteriormente. Se prefiere que la administración sea intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, preferiblemente administrada proximal al sitio de la diana. Si se desea, la dosis diaria eficaz de una composición terapéutica puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas por separado a intervalos apropiados a lo largo del día, opcionalmente, en formas de dosificación unitaria. Si bien es posible que un compuesto de la presente invención se administre solo, es preferible administrar el compuesto como una formulación (composición) farmacéutica.

Las composiciones terapéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización preferida, una composición terapéutica de la invención se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, como los dispositivos descritos en las Patentes estadounidenses números 5.399.163, 5.383.851, 5.312.335, 5.064.413, 4.941.880, 4.790.824 o 4.596.556. Ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención incluyen: Patente de los Estados Unidos No. 4.487.603, que describe una bomba de microinfusión implantable para dispensar medicación a una velocidad controlada; Patente de los Estados Unidos No.

4,486.194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; Patente de los Estados Unidos No. 4.447.233, que describe una bomba de infusión de medicación para administrar medicación a una velocidad de infusión precisa; Patente de los Estados Unidos No. 4.447.224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua de fármacos; Patente de los Estados Unidos No.

4.439.196, que describe un sistema de suministro de fármaco osmótico que tiene compartimentos multicámara; y la Patente de los Estados Unidos No. 4.475.196, que describe un sistema de administración de fármacos osmóticos. Los expertos en la técnica conocen muchos otros implantes, sistemas de administración y módulos de este tipo.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención se pueden formular para asegurar una distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para asegurar que los compuestos terapéuticos de la invención crucen la BBB (si se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para métodos de fabricación de liposomas, véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos 4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender una o más unidades estructurales que se transportan selectivamente a células u órganos específicos, mejorando así la administración de fármacos dirigida (véase, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Las unidades estructurales de direccionamiento de ejemplo incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 5.416.016 de Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); receptor de proteína A tensioactivo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134), diferentes especies de las cuales pueden comprender las formulaciones de la invención, así como componentes de las moléculas inventadas; p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090); ver también K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273. En una realización de la invención, los compuestos terapéuticos de la invención se formulan en liposomas; en una realización más preferida, los liposomas incluyen una unidad estructural de direccionamiento. La composición debe ser fluida en la medida en que exista una fácil aplicación con jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos.

La composición debe ser estéril y fluida en la medida en que pueda administrarse mediante jeringa. Además de agua, el vehículo puede ser una solución salina regulada isotónica, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como manitol o sorbitol y cloruro de sodio en la composición. La absorción a largo plazo de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina.

Cuando el compuesto activo está adecuadamente protegido, como se describió anteriormente, el compuesto se puede administrar por ruta oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable.

IV. Usos y métodos de la invención

Los anticuerpos anti-C6 de la invención son capaces de inhibir funcionalmente C6, tanto in vitro como in vivo, de modo que se inhibe la formación del complejo de ataque de membrana, que requiere C6. Por consiguiente, en otro aspecto, la invención divulga un método para inhibir la formación o actividad del complejo de ataque de membrana (MAC) en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto el anticuerpo de la invención en una cantidad efectiva para inhibir la formación o la actividad de MAC en el sujeto. En otra realización, la invención divulga un método para tratar, prevenir o reducir los síntomas de un trastorno mediado por la actividad no deseada del sistema de complemento en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención. Ejemplos de tales trastornos se describen más adelante.

Como se describe en detalle en la Patente de los Estados Unidos 8.703.136, se ha establecido que la regeneración axonal se puede potenciar mediante la inhibición del sistema de complemento. Por tanto, el uso de anticuerpos anti-C6 para la inhibición del sistema de complemento, y en particular la inhibición de la formación de MAC, se puede usar en el tratamiento de afecciones que requieren regeneración axonal, por ejemplo, en mamíferos afectados por una lesión o enfermedad del sistema nervioso central o periférico. Las afecciones que requieren regeneración axonal que pueden tratarse de acuerdo con la invención incluyen lesiones físicas, así como trastornos neurodegenerativos del sistema nervioso central o periférico.

En una realización, un anticuerpo de la invención facilita la regeneración axonal. Como se usa en este documento, los términos "facilitar la regeneración axonal" o "facilitar la regeneración nerviosa" se distinguen de reducir o prevenir la degeneración axonal o nerviosa. Se entiende en este documento que la facilitación (o promoción) de la regeneración axonal o nerviosa significa que la regeneración de un axón o nervio mejora en sujetos que son tratados en comparación con sujetos no tratados. La regeneración mejorada de un axón es preferiblemente la regeneración que se produce en un momento anterior (después de una lesión axonal o nerviosa o después del inicio del tratamiento) en un sujeto tratado en comparación con sujetos no tratados. La regeneración mejorada de un axón o nervio también puede comprender la regeneración que se produce a una velocidad más alta y/o en mayor medida en sujetos tratados en comparación con sujetos no tratados. Por tanto, un anticuerpo según la invención produce preferiblemente una ganancia de función sensorial o motora.

Por consiguiente, en una realización, la invención proporciona un anticuerpo de la invención para su uso en un método para estimular la regeneración de nervios en un sujeto, o promover la recuperación de nervios dañados o degenerados en un sujeto, o reducir o retrasar la degeneración de nervios en un sujeto, en donde el sujeto sufre una lesión física del nervio, como una lesión del Sistema Nervioso Periférico (SNP) o del Sistema Nervioso Central (SNC), como un traumatismo nervioso debido a una lesión física (discutido más abajo). La lesión física puede ser, por ejemplo, de una lesión traumática (por ejemplo, un accidente), una lesión quirúrgica o una lesión no traumática (como una compresión nerviosa. Alternativamente, el sujeto padece una enfermedad, como un trastorno inflamatorio inmunomediado y/o un trastorno neurodegenerativo progresivo, que puede ser adquirido y/o hereditario, como una neuropatía desmielinizante crónica, como esclerosis múltiple (EM), u otro trastorno neurodegenerativo como la miastenia gravis o la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) (que se comentan más adelante).

La mejora en la regeneración axonal se determina preferiblemente mediante pruebas funcionales que se realizan con relativa facilidad en sujetos humanos, por ejemplo, la recuperación de la función sensorial o motora se determina preferiblemente en una prueba estandarizada disponible en la técnica (véase, por ejemplo, Wong, K.H. et al. (2006) Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand Surg. 40: 219-224; Jerosch-Herold (2005) Hand Surg. 30: 252-264. Las pruebas adecuadas son preferiblemente cuantitativas, estandarizadas y, más preferiblemente, se han evaluado y cuantificado sus propiedades psicométricas. Tales pruebas incluyen, por ejemplo, la prueba sensorial mejorada de Weinstein (WEST) o la prueba de monofilamento de Semmes-Weinstein (SWMT) y la prueba de identificación de forma y textura (STI) para la gnosis táctil. La regeneración axonal mejorada puede determinarse experimentalmente en animales de prueba mediante pruebas funcionales para la recuperación de la función sensorial o motora como lo describen Hare, G.M.T. et al. (1992) Plastic and Reconstr. Surg. 89: 251-258 y De Koning, P. et al. (1986) J. Neurol. Sci. 74: 237-246. Un anticuerpo preferiblemente produce una ganancia de función sensorial o motora, como puede determinarse, por ejemplo, en una prueba indicada anteriormente.

El Ejemplo 8 describe en detalle un modelo animal que puede usarse para probar el efecto de los anticuerpos anti-C6 de la invención sobre la función sensorial. Este modelo de aplastamiento de nervios (aplastamiento del nervus ischiadicus) se utiliza para probar el efecto de los anticuerpos monoclonales anti-C6 humano sobre la recuperación de la función sensorial en ratas con inactivación de C6 (PVC) suplementadas con C6 humano. El aplastamiento de nervios es un modelo de lesión de nervios periféricos. Véase WO 2010/005310 (PCT/NL2009/050418); and de Jonge et al. (2004) Hum Mol Genet. 13(3): 295-302.

La regeneración axonal mejorada también puede determinarse experimentalmente en animales de ensayo mediante examen histológico, por ejemplo, la remielinización mejorada puede determinarse comparando las medidas de las vainas de mielina alrededor del axón en animales tratados con animales no tratados, por lo que una vaina de mielina más gruesa es indicativa de una remielinización mejorada. La regeneración axonal más eficaz puede determinarse como la producción de brotes de axones únicos de gran diámetro en animales tratados en comparación con grupos de axones más pequeños en animales no tratados.

La dosis apropiada de un anticuerpo es la cantidad efectiva para promover la regeneración axonal, como puede verse mediante la mejora de la función sensorial o motora como se describe anteriormente. Por "cantidad efectiva", "cantidad terapéutica" o "dosis efectiva" se entiende la cantidad suficiente para provocar los efectos farmacológicos o terapéuticos deseados, lo que da como resultado un tratamiento eficaz de la lesión o trastorno.

Con el fin de minimizar la lesión nerviosa y/o facilitar la regeneración axonal lo antes posible, en los métodos de la invención, el anticuerpo se administra preferiblemente poco después de la aparición de la lesión nerviosa, es decir, dentro de las 24, 12, 6, 3, 2 o 1 hora, más preferiblemente dentro de los 45, 30, 20 o 10 minutos después de la aparición de la lesión nerviosa. En una realización de la invención, el anticuerpo puede administrarse (por ejemplo, como medida de precaución) antes de la cirugía con riesgo de lesión nerviosa (véase más abajo), para minimizar la lesión nerviosa y/o facilitar la regeneración axonal inmediatamente después de la lesión quirúrgica del nervio.

Se pueden tratar diversas afecciones que requieren regeneración axonal con los anticuerpos de la invención. Las condiciones incluyen lesión del SNP, así como lesión del SNC. Las condiciones incluyen traumatismo nervioso como resultado de lesiones físicas y como resultado de una enfermedad. Dichas enfermedades incluyen trastornos o lesiones inflamatorios mediados por el sistema inmunitario y/o trastornos neurodegenerativos progresivos que pueden ser adquiridos y/o hereditarios.

Las lesiones físicas del SNP y del SNC pueden ser lesiones traumáticas, incluidas lesiones quirúrgicas o lesiones no traumáticas. Las lesiones traumáticas del SNP y del SNC que pueden tratarse con los métodos y/o los medicamentos de la invención incluyen lesiones de la médula espinal, así como heridas traumáticas de los nervios periféricos, incluidas las lesiones por colisiones, accidentes de vehículos de motor, heridas de arma de fuego, fracturas, dislocaciones, laceraciones o alguna otra forma de trauma penetrante. Los nervios periféricos lesionados por traumatismos que pueden tratarse incluyen los nervios digital, mediano, cubital, radial, facial, espinal accesorio y del plexo braquial.

Las lesiones quirúrgicas de SNP se entienden en el presente documento como lesiones de los nervios periféricos que surgen cuando se vuelve clínicamente necesario extirpar o disecar un nervio durante un procedimiento quirúrgico. Esto ocurre en miles de procedimientos quirúrgicos cada año. Un ejemplo de nervios periféricos lesionados quirúrgicamente que pueden tratarse con los métodos y/o medicamentos de la invención incluyen, por ejemplo, los nervios cavernosos que apoyan la función eréctil y el control de la vejiga; estos nervios a menudo se dañan durante la extirpación quirúrgica de un tumor de próstata y el tejido que lo rodea. Otro ejemplo de un nervio periférico lesionado quirúrgicamente que puede tratarse de acuerdo con la invención es el nervio frénico después de un injerto de derivación de la arteria coronaria (CABG).

Las lesiones físicas no traumáticas del SNP que pueden tratarse con los anticuerpos de la invención incluyen compresión y/o adhesión de nervios periféricos, también conocidos como síndromes de atrapamiento. El síndrome de atrapamiento más común es el síndrome del túnel carpiano.

Además, los trastornos o lesiones inflamatorios mediados por el sistema inmunitario pueden tratarse con los anticuerpos de la invención. Estos incluyen enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico que se cree que tienen una base autoinmune y dan como resultado la desmielinización del nervio como resultado del daño causado a los oligodendrocitos o directamente a la mielina. Tales enfermedades desmielinizantes incluyen, por ejemplo, síndrome de Guillain-Barré (GBS; también conocido como polineuropatía desmielinizante inflamatoria, polirradiculoneuritis idiopática aguda, polineuritis idiopática aguda, poliomielitis francesa y parálisis ascendente de Landry). Preferiblemente, los anticuerpos de la invención se aplican para promover la regeneración axonal posterior a la fase aguda en GBS. De manera similar, la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), considerada la contraparte crónica del GBS, puede tratarse con los anticuerpos de la invención. La esclerosis múltiple (EM) es otra enfermedad desmielinizante que puede tratarse con los anticuerpos de la invención.

Otros trastornos neurodegenerativos del SNC y/o SNP con un componente genético que pueden tratarse con los anticuerpos de la invención incluyen la esclerosis lateral amiotrófica (ELA, a veces llamada enfermedad de Lou Gehrig), la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (Neuropatía hereditaria motora y sensorial, HMSN) y Enfermedad de Huntington (HD).

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes adicionales.Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoclonales anti-C6 humano de rata

Se generaron anticuerpos monoclonales de rata anti-C6 humano inmunizando cinco ratas de la cepa PVG C6 -/- con proteína C6 humana. Se eligieron ratas deficientes en C6 porque, según los conocimientos actuales en el campo, es extremadamente difícil generar anticuerpos C6 funcionales en roedores normales. Se plantea la hipótesis de que la inmunización contra C6 no es eficaz en animales de tipo salvaje debido al alto grado de homología de la proteína C6 entre humanos y roedores. La respuesta de anticuerpos en animales deficientes en C6 es más robusta porque estos animales no tienen proteína C6 funcional en circulación y, por lo tanto, es probable que consideren a C6 como completamente "extraño". El C6 humano se purificó a partir de suero humano completo mediante cromatografía de afinidad usando el anticuerpo 23D1 monoclonal de ratón 23D1 (descrito en detalle en L. Clayton (2005) Ph.D. Thesis, Cardiff University) acoplado a Sepharose (GE Healthcare Cat No. 17- 0717-01).

Antígeno e inmunización: una semana antes de la inmunización, se realizó un sangrado previo a la inmunización en las ratas recogiendo 100 |jl de sangre de la vena de la cola. El día 1 de la inmunización, se inyectaron ratas en cuatro lugares por ruta subcutánea (s.c.) con 100 jg de antígeno C6 en adyuvante completo de Freund (CFA), en un volumen de 250 j l por inyección. Las inyecciones de refuerzo se realizaron los días 14 y 21, nuevamente a las cuatro s.c. localizaciones con 50 jg de antígeno C6 en adyuvante incompleto de Freund (IFA) en un volumen de 250 j l por inyección. Los sangrados de prueba se realizaron el día 36 recolectando 100 j l de sangre de la vena de la cola para pruebas in vitro. Los sangrados de prueba se analizaron en un ELISA C6, un Western blot C6 y en un ensayo hemolítico (descrito más adelante), que mostró que las cinco ratas tenían una respuesta inmune positiva contra el C6 humano: las cinco ratas tenían anticuerpos que bloqueaban la hemólisis en el ensayo hemolítico y las cinco ratas tenían anticuerpos que reconocían C6 purificado en Western blot (condiciones desnaturalizantes). Se realizó un refuerzo previo a la fusión el día 62 mediante la inyección de 100 |jg de antígeno en 250 |jl de PBS por ruta intraperitoneal. Finalmente, se realizó un refuerzo previo a la fusión el día 64 mediante la inyección de 100 jg de antígeno en 250 j l de PBS por ruta intravenosa (vena de la cola). Los bazos de dos ratas se recogieron el día 66 (quedando las otras tres ratas como reserva) y los esplenocitos aislados se utilizaron para la preparación de hibridomas.

Preparación de hibridomas: Se prepararon hibridomas mediante la fusión de los esplenocitos de las ratas inmunizadas con C6 humana con células asociadas de fusión Y3-Ag1.2.3 usando fusión estándar mediada por polietilenglicol (PEG) esencialmente como se describe en Luk, J. M. et al. (1990) J. Immunol. Methods 129: 243-250. Se recogieron los sobrenadantes y se utilizaron para la selección inicial de anticuerpos anti-C6 humanos mediante ELISA utilizando placas de 96 pozos recubiertas con antígeno C6 humano. Los clones positivos se seleccionaron y subclonaron. Se seleccionaron treinta y ocho clones positivos para un análisis adicional.

Ensayo hemolítico: Estos 38 sobrenadantes y sobrenadantes de control se ensayaron adicionalmente en un ensayo hemolítico a una dilución 1:50 usando suero humano como fuente de complemento. En este ensayo, los eritrocitos recubiertos con antígenos activadores del complemento se incuban en presencia de suero. El suero contiene los componentes del sistema de complemento, que se activan a través de la ruta clásica cuando se encuentran los eritrocitos recubiertos. El complejo de ataque de membrana (MAC) se forma como parte del sistema de complemento terminal y el MAC inicia la lisis de los eritrocitos. La lisis de eritrocitos se puede cuantificar midiendo la DO a 405 o 415 nm en el sobrenadante y es una medida directa de la actividad del MAC. Los inhibidores del complemento se pueden probar en este sistema porque, si son eficaces, evitarán la lisis de eritrocitos de forma cuantitativa.

Para realizar el ensayo, se obtuvo comercialmente un sistema hemolítico listo para usar (Virion/Serion GmbH, Wurzburg, Gemany) junto con regulador CFT (Virion/Serion GmbH, Wurzburg, Alemania). El regulador CFT se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El sistema hemolítico se colocó en un banco de rodillos en una cámara fría para mezclar a fondo los eritrocitos. Para preparar un cóctel de suero CFT, se añadieron 100 j l de suero humano a 5 ml de regulador CFT. Se agregaron diluciones de inhibidores de prueba, en un volumen de 50 jl, a placas de 96 pozos de fondo redondo, se agregaron 50 j l de cóctel de suero CFT a cada pozo y se mezclaron cuidadosamente mientras se pipetea y las placas se incubaron a 37°C durante 30 minutos. Los controles positivos fueron EDTA. El control negativo fue suero sin o deficiente en C6. Después de la incubación, las placas se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 minutos (centrífuga de mesa Hettich) y se transfirieron 80 j l de sobrenadante a una placa de fondo plano para medir a 405 o 415 nm. La DO se midió dentro de los 10 minutos posteriores a la transferencia.

Se añadieron los sobrenadantes de prueba en dilución en el ensayo hemolítico para determinar si previenen la lisis de eritrocitos. Los resultados de ejemplo se muestran en la Figura 1A, que demuestra que algunos de los sobrenadantes exhibieron una actividad inhibidora más fuerte que otros. En particular, los sobrenadantes #6-12 exhibieron una inhibición más fuerte que los otros sobrenadantes, mostrando los sobrenadantes #11 y #12 la inhibición más fuerte. Los sobrenadantes (dilución 1:50) también se probaron en el ensayo hemolítico usando suero de rata como fuente de complemento y no se observó ningún efecto inhibidor, demostrando que la actividad inhibidora de los anticuerpos era específica para el C6 humano.

Ensayo de MAC ELISA: Se usó un segundo ensayo para determinar si los sobrenadantes eran capaces de bloquear la formación de MAC. En este ensayo, los pozos de ELISA en la placa se recubren con Manano o IgG como desencadenante de la Lectina o la ruta clásica del complemento, respectivamente, en presencia de suero. El suero contiene los componentes del sistema de complemento, que se activan a través de cualquiera de las rutas cuando se exponen a la placa recubierta. El complejo de ataque de membrana (MAC) se forma como parte del sistema de complemento terminal y el MAC se depositará en la placa ELISA. La deposición de MAC en la placa puede detectarse mediante anticuerpos conjugados con HRP y visualizarse mediante una reacción enzimática en presencia de un cromógeno y un sustrato. Esta reacción produce un color que se puede cuantificar midiendo la DO a 450 o 655 nm. La DO es una medida directa de la cantidad de formación de MAC. Los inhibidores del complemento se pueden probar en este sistema porque, si son eficaces, evitarán o inhibirán el depósito de MAC en la placa.

En el segundo ensayo usado para probar los sobrenadantes de hibridoma, se realizó un ensayo ELISA de complemento activado por manano. En resumen, se recubrieron placas de ELISA con manano y sobrenadante de hibridoma diluido y se añadió suero humano. Los componentes del complemento que forman un complejo en la placa recubierta de manano se pueden detectar usando anticuerpos. En este ensayo en particular, se detectó C9 como un indicador de la formación de MAC. Si se detecta menos C9 en presencia del sobrenadante frente a la ausencia del sobrenadante, esto indica inhibición de MAC. Los controles positivos utilizados fueron EDTA (ya que la reacción depende del calcio).

Para realizar el ensayo, se prepararon regulador de recubrimiento (Na2CO315 mM, NaHCO335 mM, NaN315 mM, pH 9.6), regulador de bloqueo (1 mg/ml BSA/HAS, Tris/HCl 10 mM, pH 7.4, NaCl 145 mM, N aN 15 nM, pH 7.4) regulador de lavado (1 x t Bs , Tween 20 al 0.05%, CaCl25 mM) y regulador de dilución (barbital 4 mM, NaCl 145 mM, CaCl22 mM, MgCh 1 mM, BSA al 0.3%, Tween 20 al 0.02%). Los pozos de una placa de 96 pozos de fondo plano de alta unión se recubrieron con 100 j l de regulador de recubrimiento que contenía 10 jg/m l de manano (Sigma, Cat.

No. M7504) y se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas se bloquearon con 200 |jl de regulador de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Se diluyó suero humano en regulador de dilución (1:100) con sobrenadante (1:50) en placas de fondo redondo y se añadieron 50 j l por pozo a las placas de alta unión de fondo plano. Las placas se incubaron durante 1 hora a 37°C, seguido de lavado 3 veces con regulador de lavado. El anti-C5b-9neo (clon aE11; DAKO, Cat. No. M0777) se diluyó 1:100 en regulador de dilución, se agregaron 50 j l por pozo y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de lavado 3 veces con regulador de lavado. Se diluyó HRP anti-ratón (DAKO, Cat. No. P0447) 1:2000 en regulador de dilución, se añadieron 50 j l por pozo y las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de lavado tres veces con regulador de lavado. Para desarrollar, se añadieron 50 j l de cromógeno TMB (TMB: Sigma T2885; solución madre preparada de 10 mg/ml de TMB en DMSO) y 10 j l de H2O2 al 3% a 5 ml de regulador NaAc (8.2 g de acetato de sodio, 21 g de ácido cítrico monohidrato en 1 litro de H2O) y se distribuyó a las placas de 96 pozos. La reacción se detuvo con 25 j l de H2SO41 M y se midió la DO con un espectrofotómetro a 450 nm/655 nm.

Los resultados de ejemplo de este ensayo se muestran en la Figura 1B, que demuestra que dos sobrenadantes, #11 y #17 tenían una capacidad inhibitoria significativamente mejor que los otros 36 sobrenadantes, y el sobrenadante #11 tiene, con mucho, la capacidad inhibidora más superior de todos de los clones analizados.

Dado que el sobrenadante #11 exhibió la inhibición más fuerte tanto en el ensayo hemolítico como en el ensayo MAC ELISA, este hibridoma se seleccionó para una caracterización adicional. El anticuerpo monoclonal producido por este hibridoma se denomina en el presente documento 7E5.

Ejemplo 2: Caracterización del anticuerpo monoclonal 7E5

En este ejemplo, se realizaron experimentos adicionales para examinar adicionalmente las características funcionales y de unión del anticuerpo monoclonal C6 antihumano de rata 7E5.

Reactividad cruzada: Se realizaron transferencias Western usando suero humano y suero de monos cynomolgus (Cyno). Se utilizó suero humano y Cyno para PAGE (gel al 10%) y transferencia Western estándar. El anticuerpo se incubó en las transferencias durante 1 hora en una dilución 1:500. La detección se realizó utilizando peroxidasa de rábano picante anti-rata (HRP) (DAKO, 1:1000) y Lumilight (Roche) en un sistema de imágenes de caja oscura LAS3000 (Fuji). Los resultados indicaron que el 7E5 es capaz de reconocer C6 tanto en humanos como en monos cynomolgus.

Cinética de unión: Para investigar la cinética de la unión de 7E5 a C6 , se utilizó la medición de resonancia de plasmón superficial en un BIACORE 2000 (GE Healthcare) equipado con un chip sensor CM5 de grado de investigación. El ligando (C6 , 113 kDa) se inmovilizó usando química de acoplamiento de amina. La superficie de la celda de flujo dos se activó durante 7 minutos con una mezcla 1:1 de NHS 0.1 M (N-hidroxisuccinimida) y EDC 0.4 M (3-(N,N-dimetilamino) propil-N-etilcarbodiimida) a un caudal de 5 jl/min. El ligando a una concentración de 10 jg/m l en acetato de sodio 10 mM, pH 5.0, se inmovilizó a una densidad de 955 RU. La superficie se bloqueó con una inyección de etanolamina 1 M de 7 minutos, pH 8.0.

La celda de flujo 1 se inmovilizó con un anticuerpo de un experimento anterior (avWWF; 987 RU) y sirvió como superficie de referencia.

Para recopilar datos de unión cinética, los analitos (anticuerpos anti C6 , 150 kDa) en HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, P20 al 0.005%, pH 7.4, se inyectaron sobre las dos celdas de flujo a una velocidad de flujo de 30 jl/m in y a una temperatura de 25°C. Las concentraciones inyectadas difieren según el anticuerpo. Los datos se recopilaron a una frecuencia de 1 Hz. Se permitió que el complejo se asociara y disociara durante 90 y 300 segundos, respectivamente. Las superficies se regeneraron con una inyección de 10 segundos de HCl 0.1 M. Se hicieron fluir inyecciones duplicadas (en orden aleatorio) de cada muestra y un blanco de regulador sobre las dos superficies.

Los datos se ajustaron a un modelo de interacción 1:1 simple usando la opción de análisis de datos global disponible dentro del software BiaEvaluation 4.1. Los resultados cinéticos de Biacore se muestran en la Figura 2. Los resultados de un experimento representativo también se resumen en las Tablas 1-4 a continuación.

Tabla 1: Cinética de la unión de 7E5 determinada por resonancia de plasmón superficial

Tabla 2: Vida media de complejo para la unión 7E5

Tabla 3: Tiempo hasta el 5% de disociación para la unión de 7E5

Tabla 4: Tiempo hasta el 95% de disociación para la unión de 7E5

La Kd de 7E5 se calcula como 2.5 x 10-10 M. Esta alta afinidad está causada principalmente por la alta vida media del complejo anticuerpo-antígeno (45 horas). Por tanto, la unión de 7E5 es muy estable, con la vida media del complejo 7E5-C6 estimada en más de 40 horas.

Para determinar si el complejo antígeno-anticuerpo podría liberarse en los endosomas y lisosomas después de la unión y absorción celular por el receptor Fc gamma, se probó la sensibilidad del complejo 7E5-C6 a pH bajo. Dado que en los lisosomas el pH es de aproximadamente 4.8, se probó la estabilidad del complejo hasta pH = 4. En este experimento BIACORE, el complejo 7E5-C6 del chip se lavó con reguladores con pH decreciente. Se usó solución salina regulada con Hepes ((HBS) para pH 7.4, 7.0 y 6.5. Se utilizó acetato de sodio 10 mM para pH 6.0, 5.5, 5.0, 4.5 y 4.0. Se observó que la estabilidad del complejo no es sensible a pH bajo.

Efecto de la preincubación en el ensayo hemolítico: Dado que los experimentos de BIACORE revelaron que la liberación lenta de 7E5 a partir de C6 es un determinante principal de la Kd de 7E5, se investigó si la preincubación de 7E5 con la fuente del complemento (suero humano) antes de añadir los eritrocitos aumentó la eficacia inhibidora en el ensayo hemolítico. Se preincubó 7E5 con suero humano durante 30, 90 o 180 minutos a temperatura ambiente (20°C) antes de que se añadieran los eritrocitos y se iniciara la reacción a 37°C. Los resultados mostraron que el aumento del tiempo de preincubación hasta 3 horas no dio como resultado un aumento adicional de la inhibición de la hemólisis. Esto significa que la cinética de la unión de C6 por 7E5 en esta reacción es tal que el C6 se compleja y neutraliza de manera efectiva por completo en minutos.

Ejemplo 3: Mapeo de epítopos del anticuerpo monoclonal 7E5

Se usaron matrices de péptidos para determinar el epítopo de 7E5 en C6 humano. Se sintetizaron péptidos de 16 meros superpuestos consecutivos (péptidos de 16 aminoácidos de longitud, 14 aminoácidos superpuestos) de la secuencia de la proteína C6 y se colocaron en un patrón de rejilla en una membrana. Más adelante, la membrana se incubó con el anticuerpo 7E5 para detectar qué péptido reconocía el anticuerpo. La secuencia de péptido primaria reconocida por 7E5 fue GSCQDGRQLEWGLERT (péptido 418) (SEQ ID NO: 1).

Posteriormente, se realizó un escaneo de alanina (en donde se usa alanina para reemplazar los aminoácidos uno por uno) en péptidos seleccionados para ayudar a identificar el epítopo. En este estudio, además de las modificaciones del péptido 418, un péptido con 4 aminoácidos desplazados con respecto a 418, el péptido 420 (DGRQLEWGLERTRLSS) (Se Q ID NO: 2), y varias de sus modificaciones de alanina, mostraron unión de 7E5. Por tanto, se concluyó que se espera que los aminoácidos que forman una porción del epítopo principal de 7E5 estén dentro de esta secuencia peptídica que combina los péptidos 418 y 420: GSCQDGRQl Ew Gl ERTRLSS (SEQ ID NO: 3).

La Figura 4A muestra la secuencia del péptido 418 y el área circundante en humanos (SEQ ID NO: 50) y C6 de rata (SEQ ID NO: 51). Como se ilustra esquemáticamente en la Figura 4B, el péptido 418 está ubicado parcialmente en el extremo del primer dominio FIM de C6.

Para determinar si otros anticuerpos se unen al mismo epítopo que el anticuerpo 7E5, se llevó a cabo un experimento de bloqueo cruzado Biacore en donde el antígeno C6 se acopló al chip, seguido por el flujo del analito(s), que era un anticuerpo anti-C6 único solo (como control) o un primer anticuerpo anti-C6 (Anticuerpo 1) seguido de un segundo anticuerpo anti-C6 (Anticuerpo 2) para determinar el bloqueo cruzado. Los resultados del experimento de bloqueo cruzado para determinar si el mAb 27B 1 de ratón se une al mismo epítopo que el mAb 7E5 de rata se muestran en la Figura 3A-D, en la que la Figura 3A muestra los resultados con 27B1 como Anticuerpo 1 y 7E5 como Anticuerpo 2, la Figura 3B muestra los resultados con 7E5 como Anticuerpo 1 y 27B1 como Anticuerpo 2, la Figura 3C muestra los resultados para 27B1 solo y la Figura 3D muestra los resultados para 7E5 solo.

Ejemplo 4: Eficacia in vivo del anticuerpo monoclonal 7E5

Para probar si 7E5 es capaz de bloquear C6 en un animal vivo, se utilizaron ratas PGR deficientes en C6 suplementadas con C6 humano. Este enfoque se utilizó porque 7E5 es específico para el C6 humano y no puede bloquear el C6 de rata. En las ratas deficientes en C6, se puede inyectar C6 humano para restaurar la funcionalidad del sistema de complemento completo y la actividad de MAC, y el efecto de 7E5 se puede medir sin los efectos de confusión causados por el C6 de rata.

En primer lugar, este enfoque se probó determinando la actividad hemolítica en dos ratas inyectadas con C6 humano. Tomando varias muestras de sangre a tiempo después de la inyección de C6, se estimó que la vida media del C6 humano en las ratas era de aproximadamente 48 horas. Se inyectaron IV a dos ratas deficientes en C64 mg/kg de C6 humano. Se extrajeron muestras de sangre 10 minutos, 24 horas y 48 horas después de la inyección de C6. Después de la coagulación de todas las muestras de sangre, se aisló el suero centrifugando el coagulado (13.000 rpm en una centrífuga de sobremesa Eppendorf durante 10 minutos a temperatura ambiente). El suero se usó en el ensayo hemolítico descrito en el Ejemplo 1 para determinar la actividad de MAC. El suero de una rata PVG de tipo salvaje y una rata deficiente en C6 no tratada se utilizaron como referencias para la actividad hemolítica máxima y mínima. Utilizando el ensayo hemolítico, se estimó que la vida media del C6 humano en las ratas era de aproximadamente 48 horas.

En un experimento piloto, una rata PVG deficiente en C6 hembra (220 gramos de peso corporal) se inyectó con una dosis alta de 12 mg de 7E5 por ruta intraperitoneal y se complementó con 2 mg de C6 humano (inyección intravenosa). El C6 humano se aisló del suero humano usando purificación por afinidad con columnas recubiertas con anticuerpo C6. Se dosificó C6 1 mg 24 horas antes y 1 m g 5 minutos después de la inyección en bolo 7E5. La rata de control (del mismo peso que la rata tratada con 7E5) recibió solo la inyección de C6. Se extrajo sangre para el ensayo hemolítico 60 minutos después de la inyección de 7E5. Los resultados se muestran en la Figura 5. Los resultados mostraron que la actividad hemolítica fue bloqueada por 7E5 60 minutos después de la dosificación de 7E5, demostrando así que 7E5 puede bloquear la formación de MAC in vivo.

En un experimento posterior, se inyectaron 1 mg de C6 a dos ratas hembra deficientes en C6 (cepa PVG). Se tomaron muestras de sangre antes de la inyección de C6 y después de la inyección de C6 (1 mg IV) para establecer una actividad hemolítica normal y complementada. Tras 10 minutos después de la inyección de C6, se dosificó 7E5 a 8 m g I P o 2 m g IV. 60 minutos después de la dosificación de 7E5, se tomaron muestras de sangre para evaluar el efecto de 7E5 sobre la actividad hemolítica. Ambas estrategias de dosificación bloquearon la actividad de MAC en la sangre. Luego se inyectó por ruta intravenosa otro 1 mg de C6 en las mismas ratas. Latoma de muestras de sangre en los 15 minutos posteriores a la nueva suplementación con C6 mostró solo un aumento modesto en la actividad hemolítica, lo que infiere que la actividad hemolítica permaneció inhibida en ambas ratas por el 7E5 circulante libre.

Estos experimentos descritos anteriormente demuestran que 7E5 es capaz de bloquear C6 en un animal vivo.

Ejemplo 5: Secuenciación y expresión recombinante del anticuerpo monoclonal 7E5

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera del mAb 7E5 se determinaron mediante procedimientos estándar.

La secuencia de nucleótidos de la región VH es la siguiente:

gaggtgcagctggtggagtctgatggaggcttagtgcagcctggagggtccctgaaactctcctgtgtagcctcaggattctctttcagtg

actattacatggcctgggtccgccagggtccaacgaaggggctggagtgggtcgcaaccattaattatgatggtagtagtacttactatc

gagagtccgtgaagggccgattcactatctccagagataatgcgaaacgcaccctatacctgcaaatggacagtctgaggtctgagg

acacggccacttattactgttcaagaccttctacggaggccctgtttgcttactggggccacggcactctggtcactgtctcctca (SEQ

ID NO: 4)

[0246] La secuencia de aminoácidos de la región VH es la siguiente:

EVQLVESDGGLVQPGGSLKLSCVASGFSFSDYYMAWVRQGPTKGLEWVATINYDGSSTYYRE

SVKGRFTISRDNAKRTLYLQMDSLRSEDTATYYCSRPSTEALFAYWGHGTLVTVSS (SEQ ID

NO: 5)

Las secuencias de aminoácidos de VH CDR1, CDR y CDR3 son las siguientes:

CDR1: DYYMA (SEQ ID NO: 6)

CDR2: TINYDGSSTYYRESVKG (SEQ ID NO: 7)

CDR3: PSTEALFAY (SEQ ID NO: 8)

La secuencia de nucleótidos de la región VL es la siguiente:

gatgttgtgctgacccagactccatccacattatcggctaccattggacaatcggtctccatctcttgcaggtcaagtcagagtctcttaaat

gatgttggaaacacctatttatattggtatctacagaggcctggccaatctccacagcttctaatttatttggtctccgacctgggatctgggg

tccccaacaggttcagtggcagtgggtcaggaacagatttcacactcaaaatcagtggagtggaggctgaggatttgggaatttattact

gcatgcaagctagtcatgctccgtacacgtttggagctgggaccaacctggaactgaaa (SEQ ID NO: 9)

La secuencia de aminoácidos de la región VL es la siguiente:

DVVLTQTPSTLSATIGQSVSISCRSSQSLLNDVGNTYLYWYLQRPGQSPQLLIYLVSDLGSGVPN

RFSGSGSGTDFTLKISGVEAEDLGIYYCMQASHAPYTFGAGTNLELK (SEQ ID NO: 10)

[0250] Las secuencias de aminoácidos de VL CDR1, CDR y CDR3 son las siguientes:CDR1: RSSQSLLNDVGNTYLY (SEQ ID NO: 11)

CDR2: LVSDLGS (SEQ ID NO: 12)

CDR3: MQASHAPYT (SEQ ID NO: 13)

Después de la introducción de sitios de restricción apropiados para la clonación y la optimización de la secuencia codificante para la expresión en la línea celular de producción (células Hek-293), se prepararon casetes de expresión. Los dominios variables de cadena ligera y pesada sintetizados de 7E5 se clonaron en el conjunto de vectores de expresión eucariota pMQR (pMQR-hIgG1 y pMQR-hIgK), generando así un anticuerpo recombinante quimérico humano-rata. El análisis de secuencia de los clones resultantes indicó que ambas secuencias se clonaron correctamente. Los vectores de expresión eucariotas pMQR que albergan ambos dominios variables 7E5 se transfectaron en células Hek-293 y se permitió que estas células produjeran el anticuerpo recombinante. Después de la producción, se detectaron anticuerpos hIgG1/hIgK en el sobrenadante gastado mediante ELISA de captura. Se demostró que el sobrenadante de transfección contenía 7E5 recombinante a 0.019 mg/ml.

Ejemplo 6: Humanización del anticuerpo monoclonal 7E5

Como alternativa a los métodos de humanización de anticuerpos basados en ciclos de mutagénesis dirigida al sitio, se humanizó el mAb 7E5 de rata usando un enfoque de humanización basado en la homología de CDR entre anticuerpos humanos y murinos como describen Hwang y colegas (Methods. 2005. 36: 35-42). Este método se basa en el principio de que si un anticuerpo humano y no humano tienen CDR estructuradas de manera similar, los marcos humanos también soportarán las CDR no humanas, con una buena retención de afinidad. En este método, las secuencias marco humanas se eligen del conjunto de genes de la línea germinal humana basándose en la similitud estructural de las CDR humanas con las del anticuerpo por humanizar (mismas estructuras canónicas de Chothia). Se genera una biblioteca de presentación de fagos de secuencias variantes de Fab, que contienen residuos de FR que se desvían. Después de las selecciones impulsadas por afinidad, se seleccionan los clones individuales para determinar la unión y la velocidad de desviación y se determina la identidad y homología humanas de la secuencia.

El proceso para humanizar el anticuerpo de rata 7E5 aplicado en este trabajo consistió en los siguientes pasos:

1- Diseño de biblioteca de humanización: Identificación de las líneas germinales humanas más cercanas e identificación de los residuos VH y VK FR de rata que se desvían de estas líneas germinales humanas.

2- Ensamblaje de las bibliotecas de genes 7E5 (utilizando oligonucleótidos superpuestos para generar sintéticamente los genes que codifican la cadena variable pesada (VH) y ligera (VL) mediante PCR).

3- Clonación de estas bibliotecas de genes en un fagémido (pCB13-CK1/3) que contiene la cadena humana constante pesada (CH1) y ligera (Ck) (construcción de la biblioteca).

4- Selección de los Fabs funcionales mediante presentación de fagos y selección de afinidad.

5- Detección de tasa de desactivación (Biacore) y secuenciación.

6- Selección de los Fabs con mayor identidad y homología humana sin pérdida de unión a hC6.

7- Producción y purificación de ocho cables humanizados para su uso en otras medidas de afinidad y en ensayos funcionales.

Diseño de biblioteca de humanización: Utilizando las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de los dominios variables del anticuerpo 7E5 de rata y herramientas de bases de datos públicas, se confirmó que 7E5 usa IGHV5S45*01, IGHD1-6*01, IGHJ3*01 y IGKV2S27*01, IGKJ2-3*01 como segmentos de la línea germinal. También se concluyó que las combinaciones de pliegues canónicos para CDR H1 y CDR H2 de 7E5 es 1-3 y para CDR L1 y CDR L2 de 7E5 es 4-1.

La comparación de la secuencia de 7E5 VH con líneas germinales humanas con la combinación de pliegues canónicos idénticos 1-3 para CDR1 y CDR2 reveló que el miembro 1 de la familia VH3 de la línea germinal humana era el más cercano. La línea germinal de JH humana más cercana es IGHJ4. La alineación contra estos segmentos de la línea germinal se muestra en la Figura 6A. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada 7E5 también se muestra en SEQ ID NO: 5. La secuencia de aminoácidos VH3_1 de la línea germinal humana también se muestra en SEQ ID NO: 48. Se indican las FR y las CDR, lo que permite la identificación de residuos de FR que se desvían de las líneas germinales humanas.

Usando un análisis similar, se determinó que para la secuencia de 7E5 Vk, la línea germinal humana más cercana es el miembro 5 de la familia VK2 humana. La línea germinal JH humana más cercana son IGKJ2 e IGKJ5. La alineación contra estos segmentos de la línea germinal se muestra en la Figura 6B. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera 7E5 también se muestra en SEQ ID NO: 10. La secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana VK2_5 también se muestra en SEQ ID NO: 49. Se indican las FR y las CDR, lo que permite la identificación de residuos de FR que se desvían de las líneas germinales humanas.

Como se muestra en las Figuras 6A y 6B, había 13 posiciones para las secuencias de 7E5 VH y 16 para 7E5 Vk, respectivamente, para las cuales se incorporaron los residuos humanos para las bibliotecas de humanización, pero también el residuo de rata en caso de que el cambio fuera perjudicial para unión al antígeno. Teniendo en cuenta el número de posiciones para mutar y el número de variantes por posición, el tamaño de la biblioteca para cubrir la diversidad introducida sería 8.2 x 103 y 9.8 x 104 para las bibliotecas VH y Vk humanizadas, respectivamente.

Construcción de la biblioteca 7E5 Fab humanizada: Para la construcción de la biblioteca de presentación de fagos 7E5 Fab humanizada final, inicialmente se construyeron dos subbibliotecas diferentes:

1- Subbiblioteca Fab humanizada de VH, en la que el gen VH 7E5 humanizado se clonó junto con el WT 7E5Vk en el fagémido pCB 13-CK3, que contiene los genes que codifican los dominios constantes humanos CH1 y Ck.

2- Subbiblioteca Fab humanizada VL, en la que el gen Vk 7E5 humanizado se clonó junto con el WT 7E5VH en vectores fagémidos pCB 13-CK1 y pCB 13-CK3, que contienen los genes que codifican los dominios constantes humanos CH1 y Ck.

Debido a la estrategia de clonación y las secuencias de los dos fagémidos diferentes usados, los residuos en las posiciones 104 a 107 del dominio V de la cadena ligera de los clones producidos a partir de pCB 13-CK1 corresponderían a LEIK (secuencia 7E5 humanizada), mientras que V Las cadenas ligeras de dominio de los clones producidos en pCB 13-CK3 mostrarían en las mismas posiciones los aminoácidos LELK (secuencia 7E5 WT Vk).

Las dos subbibliotecas resultantes se cribaron contra C6 humano y se recuperaron los clones de unión para proceder a la construcción final de la biblioteca Fab en la que se humanizaron tanto la cadena pesada como la ligera.

Ensamblaje de genes sintéticos: Para construir las diferentes subbibliotecas de cadenas pesadas y ligeras humanizadas, se generaron los genes 7E5 VH y Vk humanizados mediante ensamblaje de genes (Cherry, J. et al. (2008) J Biochem Biophys Methods, 70: 820-2; Stemmer, W.P. et al. (1995) Gene, 164: 49-53).

Construcción de las subbibliotecas 7E5 VH y Vk humanizadas: Para la construcción de la subbiblioteca 7E5 VH Fab, los genes VH sintéticos de aproximadamente 400 pb generados por ensamblaje génico y un fragmento de ADN que codifica 7E5 Vk WT se clonaron en el fagémido pCB13-CK3 (que contiene los genes que codifican la cadena pesada constante humana y la cadena ligera kappa).

Para la construcción de la subbiblioteca 7E5 Vk Fab, los genes Vk sintéticos de aproximadamente 400 pb generados por ensamblaje de genes y un fragmento de ADN que codifica para 7E5 VH WT se clonaron a través de sitios ApaLI/XhoI y NcoI/NheI respectivamente en una mezcla equimolar de fagémidos pCB 13-CK1 y pCB 13-CK3 (que contiene los genes que codifican la cadena pesada constante humana y la cadena ligera kappa).

Los nuevos vectores resultantes del proceso de clonación se transformaron mediante electroporación en células E. coli TG1. El tamaño de las bibliotecas se calculó a partir de manchas de 5 |jl de células transformadas con TG1 en carbenicilina LBA (100 jg/ml), glucosa al 2% y se determinó el porcentaje de insertos Fab mediante PCR de colonias. El tamaño y el porcentaje de inserción de las subbibliotecas se resumen más adelante en la Tabla 5.

Tabla 5: Tamaño y porcentaje de inserto obtenido para las subbibliotecas 7E5 humanizadas

Las subbibliotecas también se sometieron a control de calidad mediante análisis de secuencia de ADN de 48 clones por biblioteca. Las secuencias de aminoácidos se extrajeron utilizando el software CLC Main Workbench. El análisis de las secuencias VH y Vk válidas y de la frecuencia de W t o residuo mutado por posición reveló que las subbibliotecas se diseñaron y construyeron con éxito con una relación de WT/mutación de aproximadamente 50/50 (33/33/33 para la posición 103 en el gen Vk) y el número medio de mutaciones de FR se obtuvo tal como se diseñó.

Selecciones de cribado de subbibliotecas 7E5 VH y Vk humanizadas: Se prepararon fagos a partir de las dos subbibliotecas y se utilizaron para una primera ronda de selección en C6 humano revestido. El objetivo de esta ronda de selección fue limpiar las subbibliotecas de los Fab no vinculantes y, por lo tanto, no se aplicaron condiciones estrictas.

Para las selecciones de cribado, se recubrieron 5 y 0 jg/m l de C6 humano en una placa Maxisorp de 96 pozos (Nunc) y se bloquearon con leche en polvo baja en grasa (Marvell 4% en PBS). Después de 2 horas de incubación con la subbiblioteca de fagos y lavados posteriores, se realizó la elución de tripsina (10 mg/ml) a temperatura ambiente. La actividad proteasa se neutralizó inmediatamente aplicando inhibidor de proteasa ABSF 16 mM.

Se infectaron todas las salidas de fagos en células TG1 de E. coli cultivadas logarítmicamente y se sembraron 5 j l de las bacterias infectadas en placas de agar (LBAGluc2% Carb100 jg/m l) para el análisis de las salidas y para la determinación del enriquecimiento. El enriquecimiento se calculó como la relación entre el número de fagos eluidos de C6 humano frente a los eluidos de las condiciones sin proteína. Se observaron muy buenos enriquecimientos en comparación con el fondo (PBS) para las subbibliotecas de Vk de 7E5 humanizado y Fab de VH.

Construcción de la biblioteca de presentación de fagos 7E5 Fab humanizada final: La biblioteca de Fab 7E5 humanizada final se construyó combinando las cadenas pesadas humanizadas recuperadas (VHCH) de clones seleccionados de la subbiblioteca 7E5 VH Fab con las cadenas ligeras humanizadas recuperadas (VkCk) seleccionado de la subbiblioteca 7E5 Vk Fab. El tamaño de la biblioteca resultante se calculó a partir de manchas de 5 j l de células transformadas con TG1 en carbenicilina LBA (100 jg/ml), glucosa al 2% y el porcentaje de insertos Fab se determinó mediante PCR de colonias.

Selecciones de la biblioteca 7E5 Fab humanizada: Para seleccionar variantes humanizadas sin pérdida de afinidad, o incluso con afinidades mejoradas, en comparación con el anticuerpo WT 7E5 de rata, se realizaron selecciones de presentación de fagos en solución con la biblioteca 7E5 Fab humanizado utilizando biotinilado antígeno hC6. El C6 humano se biotiniló y se sometió a control de calidad mediante SDS-PAGE, Western Blot y ELISA utilizando el anticuerpo anti-C6 humano 7E5 para detectar el C6 biotinilado capturado en placas recubiertas con neutravidina. Se realizaron tres rondas consecutivas de selecciones impulsadas por afinidad en las que la concentración de antígeno disminuyó de ronda a ronda, así como la entrada de fagos también disminuyó de ronda 1 a ronda 2. En la segunda y tercera ronda de selecciones, el fago se incubó con neutravidina -El C6 humano capturado también se incubó en presencia de un exceso de C6 no biotinilado durante 2 horas o durante la noche (selecciones de tasa de desactivación) en un intento de, después de varios lavados, deshacerse de los clones de unión de alta velocidad. Como control, en paralelo, se realizaron selecciones similares en las que los fagos se incubaron con C6 humano capturado con neutravidina y PBS en lugar de hC6 no biotinilado (sin selecciones de tasa de desactivación).

Todas las salidas de selección de fagos se infectaron en células E. coli TG1 cultivadas logarítmicamente y se sembraron 5 |jl de las bacterias infectadas en placas de agar (LBAGluc2% Carb100 |jg/ml) para el análisis de las salidas y para la determinación del enriquecimiento. El enriquecimiento se calculó como la relación entre el número de fagos eluidos de C6 humano frente a los eluidos de las condiciones sin proteína. Se obtuvieron muy buenos enriquecimientos en comparación con el fondo (PBS).

Cribado de unión de clones seleccionados de la biblioteca 7E5 Fab humanizada: Colonias individuales de E. coli TG1 infectadas con los conjuntos de fagos eluidos obtenidos después de la segunda y tercera ronda de selecciones de tasa de desactivación se cultivaron a 37°C durante 8 horas en dos placas de 96 pozos (placas maestras) que contienen 100 j l de 2TYGlucosa 2% Carbenicilina 100 jg/ml, almacenadas en glicerol al 20% a -80°C y utilizadas para la posterior secuenciación y producción de extracto periplásmico. Se generaron un total de dos placas maestras (MP) con clones de las selecciones de la segunda ronda y de las selecciones de la tercera ronda. A partir de estos MP, se produjeron extractos bacterianos que contenían Fabs monoclonales solubles (extractos periplásmicos). Se indujeron cultivos bacterianos monoclonales a pequeña escala a una DO600 de 0.8 añadiendo isopropil-b-D-tiogalactopiranósido (IPTG) hasta una concentración final de 1 mM. Más adelante, se prepararon los extractos periplásmicos (P.E.s) que contenían Fab mediante congelación-descongelación del sedimento bacteriano en PBS y posterior centrifugación para eliminar los residuos celulares.

Para determinar la capacidad de unión a la diana de los clones seleccionados, se ensayó la unión de P.E.s a una dilución de 1:5 a 10 nM de hC6 biotinilada capturada en una placa Maxisorp recubierta con neutravidina. P.E. preparado a partir de 7E5 WT Fab de rata se utilizó como control positivo. P.E. blanco (preparado a partir de pozo no inoculado en el MP) se utilizó como controles negativos. La unión de P.E.s a la diana se detectó con un anticuerpo de ratón anti-c-myc conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP). Se obtuvo una tasa de aciertos de unión del 40% para ambos MP y las señales de unión (valores de D.O. 450 nm) de los clones positivos fueron comparables a la señal obtenida con el Fab 7E5 de rata parental.

Detección y análisis fuera de tasa de identidad humana y homología de clones seleccionados que se unen a C6 humano: Para los clones de unión positiva, se determinó la tasa de desviación para hC6 usando el método SPR y, en paralelo se secuencio el ADN que codifica el dominio variable de las cadenas pesada y ligera.

Para determinar la tasa de desviación se usó un Biacore 3000 (GE Healthcare). Para ese propósito, se inmovilizaron 50 jg/m l de hC6 en regulador acetato pH 4.5 en un chip sensor CM5 (GE Healthcare BR-1000-12) hasta aproximadamente 2000 RU. Se probaron las condiciones de regeneración y se usaron 2 x 10 j l de NaOH 10 mM y NaCl 1 M para la regeneración entre inyecciones de muestra. Se diluyeron 30 j l de P.E.s, preparados como se describió anteriormente, en 120 j l de regulador HBS-EP y de esto se inyectaron 60 j l con un flujo de 30 jl/min. Se midió la disociación durante 400 segundos y se determinó la tasa de desviación aplicando el modelo de ajuste de disociación de Langmuir 1:1.

En paralelo, para analizar la identidad humana y la homología, se secuenció el ADN que codifica la cadena pesada variable y la cadena ligera de los clones que mostraban unión específica a hC6. Las secuencias de aminoácidos se extrajeron utilizando el software CLC Main Workbench. Las secuencias VK y VH se alinearon por separado frente a la secuencia de referencia (7E5 WT). Todas las secuencias se analizaron para determinar el porcentaje de identidad humana (fracción de residuos del marco que se encuentra en la línea germinal más cercana coincidente) y homología humana (fracción de residuos del marco que se encuentra en la línea germinal coincidente más cercana u otras líneas germinales de la misma subclase) usando el software Abligner.

En general, se observó una buena correlación entre los datos de ELISA y Biacore, y también buenos valores de porcentaje de homología e identidad humana que variaban del 88 al 99%.

Se seleccionó un panel de guía de ocho clones que tenían buenos datos de unión, de velocidad y de identidad humana y homología, denominados 8G09, 7E12, 7G09, 8F07, 7F06, 7F11, 7E11 y 7F02. A continuación se muestran las secuencias completas de nucleótidos y aminoácidos de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera del panel principal de ocho clones humanizados:

ecuencas e nuce os e y :

8G09 VH GAGGTGTAGCTGGTGGAGTCTGATGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCC TCAGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC GCAACCATTAATTATGATGGTAGTAGTACTTACTATCGAGAGTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGAG ATAATGCGAAACGCACCCTATACCTGCAAATGGACAGTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGC AAGACCTTCTACGGAGGCCCTGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGCACTCTGGTCACTGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 14)

8G09 Vk

GATATTGTGCTGACCCAGACTCCATTGACATTATCGGTTACCCCTGGACAATCGGTCTCCATCTCTTGCAGGTC AAGTCAGAGTCTCTTAAATGATGTTGGAAACACCTATTTATATTGGTATCTACAGAAGCCTGGCCAATCTCCAC AGCTTCTAATTTATTTGGTCTCCGACCTGGGATCTGGGGTCCCCAACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAAC AGATTTCACACTCAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGAGTTTATTACTGCATGCAAGCTAGTCAT GCTCCGTACACGTTTGGAGCGGGGACCAGACTCGAGATCAAA (SEQ. ID NO: 15)

Secuencias de nucleótidos de 7E12 VH y VL:

7E12VH GAGGTGTAGCTGGTGGAGTCTGATGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCC TCAGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGGTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC GCAACCATTAATTATGATGGTAGTAGTACTTACTATCGAGAGTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGAG ATAATGCGAAAAACACCCTATACCTGCAAATGAACAGTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCACTTATTACTGTGC AAGACCTTCTACGGAGGCCCTGTTTGCTTACTGGGGCCACGGCACTCTGGTCACTGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 16)

7E12 Vk GATGTTGTGCTGACCCAGACTCCATCGACATTATCGGTTACCCCTGGACAACCGGCCTCCATCTCTTGCAGGTC AAGTCAGAGTCTCTTAAATGATGTTGGAAACACCTATTTATATTGGTATCTACAGAAGCCTGGCCAATCTCCAC AGCTTCTAATTTATTTGGTCTCCGACCTGGGATCTGGGGTCCCCAACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAAC AGATTTCACACTCAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGAATTTATTACTGCATGCAAGCTAGTCAT GCTCCGTACACGTTTGGACAGGGGACCAACCTCGAGATCAAA (SEQ ID NO: 17)

Secuencias de nucleótidos de 7G09 VH y VL:

7G09VH GAGGTGTAGCTGGTGGAGTCTGATGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCC TCAGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGGTCCAACGAAGGGGCTGGAGTGGGTC GCAACCATTAATTATGATGGTAGTAGTACTTACTATCGAGAGTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGAG ATAATGCGAAAAACACCCTATACCTGCAAATGGACAGTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGC AAGACCTTCTACGGAGGCCCTGTTTGCTTACTGGGGCCACGGCACTCTGGTCACTGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 18)

7G09 Vk GATGTTGTGCTGACCCAGACTCCATCGTCATTATCGGTTACCCCTGGACAATCGGCCTCCATCTCTTGCAGGTC AAGTCAGAGTCTCTTAAATGATGTTGGAAACACCTATTTATATTGGTATCTACAGAAGCCTGGCCAATCTCCAC AGCTTCTAATTTATTTGGTCTCCGACCTGGGATCTGGGGTCCCCGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAAC AGATTTCACACTCAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAATTTATTACTGCATGCAAGCTAGTCAT GCTCCGTACACGTTTGGACAGGGGACCAAACTCGAGCTGAAA (SEQ ID NO: 19)

Secuencias de nucleótidos de 8F07 VH y VL:

8F07 VH GAGGTGTAGCTGGTGGAGTCTGGTGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCC TCAGGATTCTCTTTCAGTGACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGGTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC GCAACCATTAATTATGATGGTAGTAGTACTTACTATCGAGAGTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGAG ATAATGCGAAAAACACCCTATACCTGCAAATGAACAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCACTTATTACTGTGC AAGACCTTCTACGGAGGCCCTGTTTGCTTACTGGGGCCACGGCACTCTGGTCACTGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 20)

8F07 VK GATGTTGTGCTGACCCAGACTCCATTGACATTATCGGTTACCCCTGGACAATCGGTCTCCATCTCTTGCAGGTC AAGTCAGAGTCTCTTAAATGATGTTGGAAACACCTATTTATATTGGTATCTACAGAAGCCTGGCCAATCTCCAC AGCTTCTAATTTATTTGGTCTCCGACCTGGGATCTGGGGTCCCCGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAAC AGATTTCACACTCAAAATCAGTGGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGAGTTTATTACTGCATGCAAGCTAGTCAT GCTCCGTACACGTTTGGAGCGGGGACCAAACTCGAGATCAAA (SEQ ID NO: 21)

Secuencias de nucleótidos de 7F06 VH y VL:

7F06 VH

GAGGTGTAGCTGGTGGAGTCTGGTGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCC TCAGGATTCACTTTCAGGGACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGGTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC GCAACCATTAATTATGATGGTAGTAGTACTTACTATCGAGAGTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGAG ATAATGCGAAAAACAGCCTATACCTGCAAATGGACAGTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTG CAAGACCTTCTACGGAGGCCCTGTTTGCTTACTGGGGCCACGGCACTCTGGTCACTGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 22)

7F06 Vk

GATGTTGTGCTGACCCAGACTCCATTGACATTATCGGTTACCCCTGGACAACCGGTCTCCATCTCTTGCAGGTC AAGTCAGAGTCTCTTAAATGATGTTGGAAACACCTATTTATATTGGTATCTACAGAAGCCTGGCCAATCTCCAC AGCTTCTAATTTATTTGGTCTCCGACCTGGGATCTGGGGTCCCCAACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAAC AGATTTCACACTCAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGAGTTTATTACTGCATGCAAGCTAGTCAT GCTCCGTACACGTTTGGAGCGGGGACCAGACTCGAGCTGAAA (SEQ ID NO: 23)

Secuencias de nucleótidos de 7F11 VH y VL:

7F11 VH

GAGGTGTAGCTGGTGGAGTCTGATGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCC TCAGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGGTCCAACGAAGGGGCTGGAGTGGGTC GCAACCATTAATTATGATGGTAGTAGTACTTACTATCGAGAGTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGAG ATAATGCGAAAAACACCCTATACCTGCAAATGAACAGTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTTC AAGACCTTCTACGGAGGCCCTGTTTGCTTACTGGGGCCACGGCACTCTGGTCACTGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 24)

7F11 Vk

GATGTTGTGCTGACCCAGACTCCATCGACATTATCGGTTACCCCTGGACAACCGGTCTCCATCTCTTGCAGGTC AAGTCAGAGTCTCTTAAATGATGTTGGAAACACCTATTTATATTGGTATCTACAGAAGCCTGGCCAATCTCCAC AGCTTCTAATTTATTTGGTCTCCGACCTGGGATCTGGGGTCCCCAACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAAC AGATTTCACACTCAAAATCAGTGGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGAGTTTATTACTGCATGCAAGCTAGTCAT GCTCCGTACACGTTTGGAGCGGGGACCAGACTCGAGATCAAA (SEQ ID NO: 25)

Secuencias de nucleótidos de 7E11 VH y VL:

7E11 VH GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGTGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCC TCAGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC GCAACCATTAATTATGATGGTAGTAGTACTTACTATCGAGAGTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGAG ATAATGCGAAAAACACCCTATACCTGCAAATGGACAGTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGC AAGACCTTCTACGGAGGCCCTGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGCACTCTGGTCACTGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 26)

7E11 Vk

GATATTGTGCTGACCCAGACTCCATTGTCATTATCGGCTACCCCTGGACAATCGGTCTCCATCTCTTGCAGGTC A AGT C AG AGTCT CTT A AAT G ATGTTG G A AAC ACCT ATTT AT ATT GGTATCTACAGAGGCCTGG CC AAT CTCC AC AGCTTCTAATTTATTTGGTCTCCGACCTGGGATCTGGGGTCCCCGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAAC AG ATTT C AC ACT C A AA AT C AGT AGAGTGGAGGCTGAGGATGTG G G AGTTT ATT ACT G C AT G C A AG CTAGT C AT GCTCCGTACACGTTTGGAGCGGGGACCAACCTCGAGATCAAA (SEQ ID NO: 27)

Secuencias de nucleótidos de 7F02 VH y VL:

7F02 VH GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGTGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCC TCAGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGGTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC GCAACCATTAATTATGATGGTAGTAGTACTTACTATCGAGAGTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGAG ATAATGCGAAAAACAGCCTATACCTGCAAATGAACAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGC AAGACCTTCTACGGAGGCCCTGTTTGCTTACTGGGGCCACGGCACTCTGGTCACTGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 28)

7F02 Vk

GATGTTGTGATGACCCAGACTCCATCGACATTATCGGCTACCCCTGGACAATCGGCCTCCATCTCTTGCAGGTC AAGTCAGAGTCTCTTAAATGATGTTGGAAACACCTATTTATATTGGTATCTACAGAAGCCTGGCCAATCTCCAC AGCTTCTAATTTATTTGGTCTCCGACCTGGGATCTGGGGTCCCCAACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAAC AGATTTCACACTCAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGAATTTATTACTGCATGCAAGCTAGTCAT GCTCCGTACACGTTTGGAGCGGGGACCAGACTCGAGCTGAAA (SEQ ID NO: 29)

Secuencias de aminoácidos de 8G09 VH y VL:

8G09 VH EVQLVESDGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVATINYDGSSTYYRESVKGRFTISRDNA KRTLYLQMDSLRAEDTAVYYCARPSTEALFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 30)

8G09 V k DIVLTQTPLTLSVTPGQSVSISCRSSQSLLNDVGNTYLYWYLQKPGQSPQLUYLVSDLGSGVPNRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDVGVYYCMQASHAPYTFGAGTRLEIK (SEQ ID NO: 31)

Secuencias de aminoácidos de 7E12 VH y VL:

E12 VH EVQLVESDGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMAWVRQGPGKGLEWVATINYDGSSTYYRESVKGRFTISRDNA KNTLYLQMNSLRAEDTATYYCARPSTEALFAYWGFIGTLVTVSS (SEQ ID NO: 32)

E12 Vk

DWLTQTPSTLSVTPGQPASISCRSSQSLLNDVGNTYLYWYLQKPGQSPQLUYLVSDLGSGVPNRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDVGIYYCMQASHAPYTFGQGTNLEIK (SEQ ID NO: 33)

Secuencias de aminoácidos de 7G09 VH y VL:

G09 VH EVQLVESDGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQGPTKGLEWVATINYDGSSTYYRESVKGRFTISRDNA KNTLYLQMDSLRAEDTAVYYCARPSTEALFAYWGHGTLVTVSS (SEQ ID NO: 34)

G09 V k DIVLTQTPLTLSVTPGQSVSISCRSSQSLLNDVGNTYLYWYLQKPGQSPQLUYLVSDLGSGVPNRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDVGVYYCMQASHAPYTFGAGTRLEIK (SEQ ID NO: 35)

Secuencias de aminoácidos de 8F07 VH y VL:

F07 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSDYYMAWVRQGPGKGLEWVATINYDGSSTYYRESVKGRFTISRDNA KNTLYLQMNSLRSEDTATYYCARPSTEALFAYWGHGTLVTVSS (SEQ ID NO: 36)

F07 Vk

DVVLTQTPLTLSVTPGQSVSISCRSSQSLLNDVGNTYLYWYLQKPGQSPQLUYLVSDLGSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISGVEAEDVGVYYCMQASHAPYTFGAGTKLEIK (SEQ ID NO: 37)

Secuencias de aminoácidos de 7F06 VH y VL:

F06 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFRDYYMAWVRQGPGKGLEWVATINYDGSSTYYRESVKGRFTISRDNA KNSLYLQMDSLRAEDTAVYYCARPSTEALFAYWGHGTLVTVSS (SEQ ID NO: 38)

F06 Vk

DWLTQTPLTLSVTPGQPVSISCRSSQSLLNDVGNTYLYWYLQKPGQSPQLUYLVSDLGSGVPNRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDVGVYYCMQASHAPYTFGAGTRLELK (SEQ ID NO: 39)

Secuencias de aminoácidos de 7F11 VH y VL:

F11 VH EVQLVESDGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMAWVRQGPTKGLEWVATINYDGSSTYYRESVKGRFTISRDNA KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSRPSTEALFAYWGHGTLVTVSS (SEQ ID NO: 40)

7F11 Vk

DVVLTQTPSTLSVTPGQPVSISCRSSQSLLNDVGNTYLYWYLQKPGQSPQLUYLVSDLGSGVPNRFSGSGSGTDFTL

KISGVEAEDVGVYYCMQASHAPYTFGAGTRLEIK (SEQ ID NO: 41)

Secuencias de nucleótidos de 7E11 VH y VL:

7E11 VH

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVATINYDGSSTYYRESVKGRFTISRDNA

KNTLYLQMDSLRAEDTAVYYCARPSTEALFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 42)

7E11 Vk

DIVLTQTPLSLSATPGQSVSISCRSSQSLLNDVGNTYLYWYLQRPGQSPQLUYLVSDLGSGVPDRFSGSGSGTDFTL

KISRVEAEDVGVYYCMQASHAPYTFGAGTNLEIK (SEQ ID NO: 43)

Secuencias de aminoácidos de 7F02 VH y VL:

7F02 VH

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMAWVRQGPGKGLEWVATINYDGSSTYYRESVKGRFTISRDNA

KNSLYLQMNSLRSEDTAVYYCARPSTEALFAYWGHGTLVTVSS (SEQ ID NO: 44)

7F02 Vk

DWMTQTPSTLSATPGQSASISCRSSQSLLNDVGNTYLYWYLQKPGQSPQLUYLVSDLGSGVPNRFSGSGSGTDFT

LKISRVEAEDVGIYYCMQASHAPYTFGAGTRLELK (SEQ ID NO: 45)

[0279] En la Figura 8Ase muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada 7E5 de rata con las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada de las variantes 7E5 humanizadas 8G09, 7E12, 7G09, 8F07, 7F06, 7F11, 7E11 y, con CDR1, 2 y 3 indicados. En la Figura 8B se muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera 7E5 de rata con las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena ligera de las variantes 7E5 humanizadas 8G09, 7E12, 7G09, 8F07, 7F06, 7F11,7E11 y 7F02, con CDR1,2 y 3 indicados. Las secuencias de CDR1,2 y 3 de cadena pesada para las ocho variantes humanizadas del anticuerpo 7E5 de rata son las mismas que las del mAb 7E5 de rata (cuyas secuencias de aminoácidos se muestran en las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente). Asimismo, las secuencias de CDR1,2 y 3 de cadena ligera para las ocho variantes humanizadas del anticuerpo 7E5 de rata son las mismas que las del mAb 7E5 de rata (cuyas secuencias de aminoácidos se muestran en las SEQ ID NO: 11, 12 y 13, respectivamente).

Expresión, purificación y control de calidad de Fab: Para caracterizar algunas de las variantes humanizadas de 7E5 en ensayos adicionales (es decir, análisis de lisis mediada por complemento de eritrocitos presensibilizados, determinación de afinidad, temperaturas de fusión y ensayos de comportamiento de agregación), se utilizaron Fabs solubles producidos y purificados a partir del panel principal de ocho clones descrito anteriormente. Los genes Fab de los 8 clones humanizados más el control 7E5 WT se clonaron en el vector de expresión pCB4 (muy similar a pCB13 pero sin la secuencia codificante del gen 3) mediante digestión Sfil/Notl y se transformaron en la cepa TG1 E. coli mediante choque térmico. Las secuencias se confirmaron utilizando el software CLC Main Workbench.

La producción de P.E.s que contienen Fabs solubles de las variantes humanizadas 7E5 clonadas con pCB4 así como de 7E5 WT se realizó en 800 ml de 2xYT suplementado con 0.1% de glucosa y carbenicilina a 100 ^g/ml. Después de la inducción a una DO600 de 0.5-0.8 con IPTG hasta una concentración final de 1 mM, el cultivo se incubó a 24°C durante al menos 20 horas. Los Fab solubles se purificaron con resina de afinidad por metales TALON.

Cuando se procesaron 500 ng de los productos de purificación resultantes en una SDS-PAGE, se observaron varias bandas adicionales además de las bandas específicas de Fab (50 KDa y aproximadamente 25 KDa en condiciones no reducidas y reducidas, respectivamente). Para purificar aún más estas muestras, se utilizó una resina de Life Technologies que contiene un VHH que se une específicamente al dominio CH1 humano (CaptureSelectTM Affinity resin IgG-CH1, cat # 194320005) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de la proteína purificada resultante se estimó midiendo la DO280nm usando un espectrofotómetro de microvolumen y asumiendo un coeficiente de extinción molar en e = 1.53. El análisis SDS-PAGE de las muestras purificadas mostró un alto nivel de pureza. La funcionalidad del Fab purificado se confirmó en ELISA donde se examinó la unión de diluciones en serie de estos Fab a 10 nM de hC6 biotinilada capturada en una placa Maxisorp recubierta con neutravidina. Los ocho Fab purificados exhibieron una unión eficaz a hC6.

Análisis por Biacore: Para determinar si la humanización de 7E5 alteraba la especificidad de unión o la actividad de los anticuerpos humanizados resultantes, se realizó un análisis de afinidad de Biacore en los ocho Fabs humanizados seleccionados (7E12, 7E11, 7F2, 7F6, 7F11, 7G9, 8F7 y 8F9) en comparación con el mab 7E5 de rata de tipo salvaje (parental) y con el mAb 27B1 de ratón. Los resultados se muestran en la Figura 9. Los resultados indican que la humanización de 7E5 no alteró la especificidad o actividad del anticuerpo.

Ejemplo 7: Caracterización "Mix & Match" de anticuerpos anti-C6 humanizados

En este experimento, un panel de cadenas VH humanizadas y cadenas VL humanizadas de los anticuerpos anti-C6 humanizados seleccionados se expresaron como anticuerpos de longitud completa en células de mamífero en diversas combinaciones y se evaluó su actividad funcional.

Las cadenas VH humanizadas utilizadas fueron las ocho cadenas VH descritas en el Ejemplo 6 (8G09, 7E12, 7G09, 8F07, 7F06, 7F11, 7E11 y 7F02), así como una novena cadena, 7C02, cuya secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 46. En la Figura 8A se muestra una alineación de estas nueve cadenas.

Las cadenas VL humanizadas utilizadas fueron las ocho cadenas VH descritas en el Ejemplo 6 (8G09, 7E12, 7G09, 8F07, 7F06, 7F11, 7E11 y 7F02), así como una novena cadena, 7G08, cuya secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 47. En la Figura 8B se muestra una alineación de estas nueve cadenas.

Las secuencias de nucleótidos de cadena pesada y ligera se clonaron en vectores de expresión para crear secuencias codificantes de cadenas de longitud completa que tienen una región constante de IgG4 estabilizada (S228P). Las 9 cadenas pesadas y las 9 cadenas ligeras se coexpresaron como pares en todas las combinaciones posibles en las células huésped CHO. Por tanto, se evaluaron las 81 posibles combinaciones de "Mix & Match" de las 9 cadenas pesadas y las 9 cadenas ligeras. Los 81 pares se probaron cada uno en el ensayo hemolítico y en el ELISA MAC. Para cada ensayo, se usaron 4 |jg de mAb 7E5 humanizado del sobrenadante de CHO. Los resultados del ensayo hemolítico se muestran en la Figura 7A. Los resultados del MAC ELISA se muestran en la Figura 7B. Los resultados demuestran que las 81 posibles combinaciones de "Mix & Match" de las 9 cadenas VH y 9VL exhibieron una fuerte actividad inhibidora en ambos ensayos.

Ejemplo 8: Modelo animal para probar el efecto de los anticuerpos C6 sobre la regeneración nerviosa

El modelo de aplastamiento nervioso (aplastamiento del nervus ischiadicus) se usa para probar el efecto de anticuerpos monoclonales anti-C6 humanos, tales como 7E5 de rata o 7E5 humanizado, sobre la recuperación de la función sensorial en ratas con inactivación de C6 (PVC) suplementado con C6 humano. El aplastamiento de nervios es un modelo de lesión de nervios periféricos. Véase WO 2010/005310 (PCT/NL2009/050418); y de Jonge et al. (2004) Hum Mol Genet. 13(3): 295-302.

Para el tratamiento, se suplementaron ratas C6 -/-(PVG, 6-8 semanas) con C6 humano o control (PBS). Se administró C6 por ruta intravenosa en ratas C6'/_ a una dosis de 4 mg/kg en PBS un día antes de la lesión por aplastamiento (día -1) y una vez al día los días 0-6. Las ratas suplementadas con C6 y el grupo de control se trataron con mAb C6 anti humano comenzando 10 minutos antes del aplastamiento (día 0) (inyección intraperitoneal de 4 mg/rata). Las ratas PVG se trataron de nuevo con mAb C6 anti-humano (4 mg/IP de rata) 5 minutos antes del aplastamiento nervioso. Las dosis posteriores de mAb C6 anti-humano se administraron los días 1-6 (4 mg/IP de rata). Los animales de control recibieron el mismo aplastamiento de nervios, pero no se trataron con anticuerpos. Se sacrificó un subconjunto de animales a las 72 horas después del aplastamiento para estudiar la histología del nervio. Se eligieron 72 horas porque la degeneración walleriana es entonces máxima en animales WT y este punto de tiempo es muy informativo para evaluar la eficacia del tratamiento.

El aplastamiento nervioso se realizó como sigue. Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron asépticamente bajo anestesia profunda con isoflurano (2.5% en volumen de isoflurano, 1 l/min O2 y 1 l/min N20). Se afeitó el muslo izquierdo y se expuso el nervio ciático mediante una incisión en la parte superior del muslo. El nervio se aplastó durante tres períodos de 10 segundos al nivel de la muesca ciática utilizando unas pinzas curvas suaves (No. 7), lo que dio como resultado una apariencia completamente translúcida del área aplastada del nervio. La pierna derecha se utilizó como control interno. Más adelante, se cerraron el músculo y la piel con suturas.

Más adelante, en la Tabla 6, se muestra la configuración experimental para el tratamiento con el mAb C6 antihumano recombinante 7E5 (12 mg/kg):

Tabla 6: Configuración experimental para el experimento de aplastamiento de nervios

Número Temgesic Reconstitución Presangrado Tratamiento Lesión por Postsangrado de rata (4 mg/kg) (12 mg/Kg) aplastamiento

1 sí C6 sí 7 E 5 sí sí

9 sí ninguna sí PBS sí sí 10 sí ninguna sí PBS sí sí

A los 3 días después de la lesión, todos los animales se perfundieron intracardialmente con paraformaldehído al 4% en regulador piperazina-N-N'-bis(ácido 2-etanosulfónico) (PIPES), pH 7.6. Se extrajeron los nervios ciáticos izquierdo y derecho de cada animal y se recogió un segmento de 5 mm de longitud distalmente del sitio de aplastamiento. Cada segmento se procesó convencionalmente en cera de parafina para inmunohistoquímica.

Se montaron secciones de parafina de siete micrómetros de espesor sobre portaobjetos de vidrio Superfrost Plus (Knittel Glass, Alemania). Las secciones se desparafinaron y rehidrataron. Los epítopos se expusieron mediante recuperación de antígeno inducida por calor en regulador de citrato de sodio 10 mM (pH 6.0). La unión inespecífica de anticuerpos se bloqueó usando suero de cabra normal al 10% (DAKO, Glostrup, Dinamarca) en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se diluyeron en diluyente de anticuerpos normales (Immunologic, Duiven, Países Bajos) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La detección se realizó incubando las secciones en IgG conjugado con isotiocianato de fluoresceína anti-conejo de cabra (FITC) o IgG conjugado con Cy3 anti-ratón de oveja de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) diluido 1:200 en albúmina de suero bovino al 1%. Cuando se indicó, los portaobjetos se contratiñeron con 4,6-diaminodina-2-fenilindol (DAPI) (Sigma-Aldrich) y se montaron con medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Las imágenes se capturaron con una cámara digital (DP12; Olympus, Zoeterwoude, Países Bajos) conectada a un microscopio fluorescente (Vanox, AHBT3; Olympus, Países Bajos).

Los resultados se muestran en la Figura 10. Las células se tiñeron con anti-C9, para detectar MAC, anti-panneurofilamento (SMI312) para detectar axones, proteína básica anti-mielina (MBP) para detectar mielina y membrana anti-lisosomal (CD68) para detectar células fagocíticas (macrófagos). El panel A muestra los resultados para el nervio ciático ileso, mostrando ausencia de MAC, fuerte tinción axonal, tinción de mielina anular y sin macrófagos activados. El panel B muestra los resultados después de la lesión, en los que una rata con actividad normal del complemento mostró depósito de MAC, pérdida de axones y mielina y afluencia de macrófagos. El panel C muestra los resultados después del tratamiento de la rata reconstituida en C6 con anti-C6, demostrando que el anticuerpo bloquea completamente la formación de MAC, inhibe la destrucción de axones y mielina e inhibe la entrada de macrófagos. El panel D muestra los resultados para las ratas C6-/- que no se reconstituyeron, mostrando una ausencia de depósito de MAC y una rápida degeneración nerviosa.

Por tanto, los resultados del experimento de aplastamiento nervioso demuestran que el tratamiento in vivo con el anticuerpo anti-C6 7E5 bloqueó con éxito la formación de MAC e inhibió la destrucción de axones y mielina y redujo el influjo de macrófagos, demostrando así la eficacia del anticuerpo in vivo en un modelo animal de lesión del nervio periférico.

Equivalentes

Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar utilizando únicamente experimentación de rutina, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención descritas en este documento.

Resumen del listado de secuencias

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado que se une al C6 humano y que es capaz de inhibir la actividad de C6 en un ensayo hemolítico con una IC50 de 0.5 |jg/ml o menos, anticuerpo que es un anticuerpo de rata o humanizado y que comprende secuencias CDR1, 2 y 3 de cadena pesada mostradas en SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, y comprende secuencias CDR1, 2 y 3 de cadena ligera mostradas en SEQ ID NO: 11, 12 y 13, respectivamente.

2. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

3. El anticuerpo aislado de la reivindicación 2, el cual se selecciona del grupo que consiste en:

4. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en donde:

(b) la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 y 47.

5. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, el cual comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 33.

6. Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo que se une al C6 humano como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Una célula que comprende un vector de expresión de la reivindicación 6.

8. Una composición que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un portador.

9. Un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en un método de tratamiento del síndrome de atrapamiento, síndrome del túnel carpiano, síndrome de Guillain-Barré (GBS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), esclerosis múltiple (EM), esclerosis amiotrófica lateral (ELA), enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (neuropatía motora y sensorial hereditaria; HMSN) o enfermedad de Huntington (HD).

10. Un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en un método de tratamiento de un mamífero afectado por una lesión o enfermedad del sistema nervioso central o periférico.

11. Un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que padece una lesión física de los nervios o que padece un trastorno inflamatorio inmunomediado o un trastorno neurodegenerativo progresivo, estimulando la regeneración de los nervios en el sujeto, o promoviendo la recuperación de nervios dañados o degenerados en el sujeto, o reducir o retrasar la degeneración de nervios en el sujeto.