PT1567641E

PT1567641E - Proaerolisina contendo sequência de activação de proteases e métodos de uso para o tratamento do cancro da próstata

Info

Publication number: PT1567641E
Application number: PT02768702T
Authority: PT
Inventors: Samuel R Denmeade; John T Isaacs; James Thomas Buckley
Original assignee: Uvic Industry Partnerships Inc; Univ Johns Hopkins
Priority date: 2001-08-24
Filing date: 2002-08-23
Publication date: 2012-08-21
Also published as: EP2518142A1; JP4319908B2; EP1567641A2; HK1178563A1; JP2005520490A; EP2518142B1; WO2003018611A2; ES2542888T3; CA2457903C; CN100488981C; AU2002331720B2; ZA200402319B; US20100234300A1; ES2388170T3; CN1636017A; DK1567641T3; US7745395B2; EP1567641A4; CA2457903A1; EP1567641B1

Description

DESCRIÇÃO

PROAEROLISINA CONTENDO SEQUÊNCIA DE ACTIVAÇÃO DE PROTEASES E MÉTODOS DE USO PARA O TRATAMENTO DO CANCRO DA PRÓSTATA OBJECTO

Este pedido está relacionado com novas variantes da proteína proaerolisina (PA) e métodos para a sua utilização no tratamento do cancro da próstata metastático e localizado.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Um em cada três cancros diagnosticados em homens americanos é de origem prostática, o que faz com que o cancro da próstata seja o tumor mais frequentemente diagnosticado em homens nos Estados Unidos (Berges et al. Clin. Câncer Res. 1:473-480, 1995). A incidência do cancro da próstata nos EUA não tem diminuído com as alterações no estilo de vida; na realidade, a taxa de incidência do cancro da próstata clínico tem registado um aumento regular desde a década de 1930 (Pinski et al. Câncer Res. 61:6372-6,2001). A incidência do cancro da próstata aumenta com a idade mais rapidamente do que qualquer outro tipo de cancro; menos de 1% dos cancros da próstata são diagnosticados em homens com menos de 50 anos de idade (Furuya et al. Câncer Res. 54:6167-75, 1994). Assim, como a esperança de vida da população masculina aumenta ao longo do tempo, a incidência do cancro da próstata clínico aumentará igualmente (Furuya et al. Câncer Res. 54:6167-75, 1994).

Actualmente, não existe qualquer tratamento que prolongue significativamente a sobrevivência dos homens com cancro da próstata metastático (Khan and Denmeade, Prostate 45:80-83, 2000). A castração médica com estrogénio oral (ablação androgénica) constituiu a primeira terapia sistémica efectiva para o cancro, e continua a ser a terapia genericamente mais 1 útil contra o cancro da próstata. Embora a terapia da ablação androgénica tenha um beneficio paliativo substancial, o seu impacto sobre a sobrevivência global é reduzido (Berges et al. Clin. Câncer Res. 1:473-480, 1995). Esta terapia acaba por fracassar porque o cancro da próstata metastático num doente individual possui uma composição heterogénea de células cancerígenas dependentes do androgénio e independentes do androgénio (Christensen et al. Bioorg. Medicinal Chem. 7:1273-80, 1999) . Na sequência da ablação androgénica, as células dependentes do androgénio nestes tumores deixam de proliferar e activam uma via de suicidio celular denominada morte celular programada (PCD de "programmed cell death") ou apoptose. Devido à eliminação deste subgrupo de células dependentes do androgénio, a maioria dos homens com cancros da próstata metastáticos apresenta uma resposta benéfica à terapia de carência de androgénio. Contudo, todos os doentes acabam por recair numa condição que deixa de responder a qualquer terapia adicional antiandrogénio, por mais completa que esta seja, devido à presença de células prostáticas cancerígenas independentes do androgénio dentro dos sitios metastáticos. Infelizmente, nesta fase a doença é uniformemente fatal porque não há hoje uma terapia que seja eficaz na eliminação das células prostáticas cancerígenas independentes do androgénio (Khan and Denmeade, Prostate 45:80-83, 2000). Têm sido propostas várias abordagens alternativas ao tratamento do cancro da próstata. Uma consistiu em desenvolver métodos para o rastreio agressivo da doença localmente enquanto esta ainda se encontra na próstata sendo, assim, potencialmente tratável por uma terapia local definitiva. Os cancros localizados apresentam muitas vezes uma diferenciação moderada e menor volume. Ao longo das últimas décadas, registaram-se melhoramentos na gestão cirúrgica e radioterapêutica de cancros da próstata localizados. Estes melhoramentos culminaram nos últimos anos na redução da taxa 2 de mortalidade do cancro da próstata, pela primeira vez em cinquenta anos.

Todavia, embora este progresso tenha aumentado a taxa de cura, continua a haver um elevado número de homens que não são curados por terapias locais e que acabam por morrer da doença metastática. Esta realidade clinica conduziu ao desenvolvimento de tratamentos não hormonais para o cancro da próstata metastático. Os agentes quimioterapêuticos anti-proliferativos normais não têm tido sucesso no tratamento do cancro da próstata. Este tipo de agente pode ser ineficaz contra os cancros prostáticos independentes do androgénio porque estes cancros apresentam uma taxa de proliferação extremamente baixa em comparação com outros tipos de tumores e muitos tecidos normais como cutâneos, do tracto gastrointestinal e da medula óssea. A titulo de exemplo, a fracção de crescimento em 117 sitios metastáticos de cancro da próstata obtidos de 11 doentes que falharam a ablação de androgénio em autópsia "a quente" foi de 7,1 ± 0,8%. (Pinski el al. Câncer Res. 61:6372-6, 2001). Esta baixa taxa proliferativa pode explicar a relativa falta de resposta das células prostáticas cancerígenas em humanos à quimioterapia antiproliferativa normal, enquanto as linhagens de células prostáticas cancerígenas independentes do androgénio e altamente proliferativas continuam extraordinariamente sensíveis à indução da PCD in vitro. Várias estratégias foram propostas para o tratamento de cancros da próstata de proliferação lenta. Uma abordagem consiste em identificar vias de sinalização específicas para as quais as células prostáticas cancerígenas, no decurso da transformação maligna, adquirem uma dependência única para sobrevivência. Uma vez identificadas, é possível desenvolver pequenas moléculas ou inibidores biológicos destas vias como terapia. Um exemplo desta abordagem consiste no uso de pequenas moléculas ou inibidores de anticorpos monoclonais das 3 vias do Her2/neu ou do receptor EGF. Um outro método é inibir uma proteina intracelular omnipresente cuja função é obrigatória para a sobrevivência de todos os tipos de células. Esta abordagem permitiria ultrapassar o problema da heterogeneidade e "resistência" já que todas as células cancerígenas no interior de um tumor podiam ser mortas recorrendo a esta abordagem. Contudo, a citotoxicidade não seria especifica por tipo de célula e a administração de uma tal toxina genérica estaria associada a uma toxicidade sistémica significativa. Por conseguinte, é necessário dispor de um método para direccionar as citotoxinas directamente para os sitios do cancro prostático.

Uma outra estratégia para o tratamento de cancros da próstata de proliferação lenta consiste em administrar citotoxinas que matam células não através da indução de apoptose subsequente à inibição de vias metabólicas ou de sinalização criticas mas sim através de citólise não especifica por via da ruptura da membrana plasmática. Foram descritas inúmeras toxinas citoliticas (Lesieur et al. Mol. Membr. Biol. 14:45064, 1997). Estas toxinas citoliticas são frequentemente de origem bacteriana e são, em geral, proteinas de folha beta que oligomerizam na membrana plasmática para produzirem poros bem caracterizados que, uma vez formados, conduzem à morte rápida da célula citolitica (Rossjohn et al. J. Struct. Biol. 121:92-100,1998). Estas toxinas apresentam também uma capacidade não especifica de matar células, pelo que não podem ser administradas como terapia sem uma toxicidade significativa. Assim sendo, existe uma necessidade de dispor de agentes para o tratamento do cancro da próstata, que sejam predominantemente citotóxicos para as células prostáticas cancerígenas 4

RESUMO A invenção encontra-se definida nas reivindicações. São divulgadas no presente documento variantes da molécula de proaerolisina (PA) e métodos para a sua utilização no tratamento de cancros da próstata metastáticos e localizados, tais como cancros da próstata de proliferação lenta.

Num exemplo, uma variante da molécula de PA inclui um local de clivagem da protease especifica da próstata, tal como um local de clivagem especifico do antigénio especifico da próstata (PSA de "prostate-specific antigen"), do antigénio especifico da membrana da próstata (PSMA de "prostate specific membrane antigen"), ou da calicreina glandular humana 2 (HK2), que substitui funcionalmente o local de clivagem original da furina PA. Deste modo, a administração das variantes divulgadas da molécula de PA a um sujeito com cancro da próstata resulta na activação das variantes divulgadas da molécula de PA na presença da protease especifica da próstata, e a lise de células tais como células prostáticas cancerígenas. Em alguns exemplos, as variantes da molécula de PA incluem igualmente um dominio de ligação específico do tecido prostático, para reforçar a abordagem selectiva às células cancerígenas.

Num outro exemplo, uma variante da molécula de PA inclui um local de clivagem de furina, e um domínio de ligação específico do tecido prostático que substitui funcionalmente o domínio de ligação original PA, para apoiar na abordagem selectiva às células prostáticas cancerígenas. São divulgados métodos para o tratamento de cancros da próstata metastáticos e localizados usando as variantes divulgadas da molécula de PA. São adicionalmente divulgados métodos para estimular o sistema imunitário de um sujeito no 5 sentido de melhorar o tratamento do cancro da próstata metastático e localizado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Fig. 1 é uma representação esquemática de dominios da proaerolisina (não desenhados à escala) e mostra o resultado da activação pela furina.

A Fig. 2 é um gráfico de barras que mostra os resultados de um ensaio de hemólise em que a PSA-PA 1 é pré-incubada com plasma humano ou plasma humano reforçado com PSA enzimaticamente activo (10.000 ng/ml). A Fig. 3 é um gráfico que compara a toxicidade in vitro de diversas variantes de proaerolisina que incluem um local de clivagem de PSA no lugar do local original da furina, com proaerolisina de tipo selvagem. A Fig. 4 é um gráfico de barras que compara a especificidade da PSA-PA1 em tumores produtores de PSA (LNCaP), e não produtores de PSA (SN12C), in vivo.

As Figs. 5A—5M são desenhos esquemáticos (não à escala) que mostram como é que uma sequência de proaerolisina pode ser alterada para dar origem a inúmeras variantes da molécula de PA diferentes. O símbolo representa uma ou mais mutações pontuais, e/ou uma ou mais deleções que diminuem a função do domínio de ligação PA (ou seja, a capacidade para se concentrar numa membrana celular)

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

As sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos que constam da listagem de sequências anexa são apresentadas usando as abreviaturas normais para as bases de nucleótidos, e um código de três letras para os aminoácidos. É apresentada apenas uma cadeia da sequência de cada ácido nucleico, mas a 6 cadeia complementar é entendida como abrangida por qualquer referência à cadeia visualizada. SEQ N2 ID: 1 e 2 representam um cDNA e uma sequência de proteina de proaerolisina de tipo selvagem, respectivamente. SEQ N2 ID: 3 e 4 representam a sequência de PSA-PA1 cDNA e proteina, respectivamente, na qual o local de furina da proaerolisina foi substituído por um local de clivagem de PSA. SEQ N2 ID: 5 e 15-21 são locais de clivagem de PSA detectada nas proteínas humanas semenogelina I e II. SEQ N2 ID: 6 e 7 representam a sequência de PSA-IK cDNA e proteína, respectivamente, na qual o local de furina da proaerolisina foi substituído por um local de clivagem de PSA.

SEQ N2 ID: 8, 11, e 14-21 são locais de clivagem de PSA alternativos. SEQ N2 ID: 9 e 10 representam a sequência de PSA-PA2 cDNA e proteína, respectivamente, na qual o local de furina da proaerolisina foi substituído por um local de clivagem de PSA. SEQ N2 ID: 12 e 13 representam a sequência de PSA-PA3 cDNA e proteína, respectivamente, na qual o local de furina da proaerolisina foi substituído por um local de clivagem de PSA. SEQ N2 ID: 22 é uma sequência original de proteínas da hormona libertadora de hormona luteinizante (LHRH). SEQ N2 ID: 23 é uma sequência de proteínas da LHRH modificada. SEQ N2 ID: 24 é uma sequência de proteínas de uma variante de péptido de PA, na qual o local de furina da PA foi substituído por um local de clivagem de PSA, e na qual o domínio de ligação original da PA é suprimido e substituído por uma SEQ N° ID: 23. 7 SEQ Ns ID: 25 é uma sequência de proteínas de uma variante de péptido de PA, na qual o local da furina de PA é conservado, e o domínio de ligação original de PA foi suprimido e substituído por uma SEQ N° ID: 23. DESCRIÇÃO DETALHADA DE VÁRIAS CONFIGURAÇÕES Termos e Abreviaturas

As explicações que se seguem de termos e métodos são apresentadas para melhor descrição da presente divulgação e para orientar os técnicos da especialidade na prática da presente divulgação. Tal como usadas no presente texto e nas reivindicações anexas, as formas do singular "um/uma" ou "o/a" incluem as referências ao plural, salvo indicação claramente em contrário resultante do contexto. A título de exemplo, a referência a "uma variante de molécula de PA" inclui uma pluralidade de tais moléculas e a referência a "anticorpo" inclui referência a um ou mais anticorpos e equivalentes do mesmo e conhecidos dos técnicos da especialidade, e assim sucessivamente. Salvo explicação em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados no presente possuem o mesmo significado que lhes é normalmente atribuído pelos técnicos da especialidade a quem a presente divulgação se destina.

Aerolisina: toxina formadora de canais produzida como uma protoxina inactiva denominada proaerolisina (PA) (a PA de tipo selvagem é apresentada na SEQ N° ID: 1 e 2) . A proteína PA contém inúmeras funcionalidades discretas que incluem um domínio de ligação, aminoácidos 1-83 de uma SEQ N° ID: 2), um domínio de toxina de aminoácidos 84-426 de uma SEQ N° ID: 2), e um domínio de péptido inibidor de terminal C- aminoácidos 427-470 da uma SEQ N° ID: 2) que contém um local de activação de protease (aminoácidos 427-432 de uma SEQ N° ID: 2).

O domínio de ligação reconhece e liga-se a âncoras membranares de glicofosfaridilinositol (GPI), como as que se encontram em Thy-1 nos linfócitos T, o produto genético PIGA 8 encontrado na membrana de eritrócitos e no antigénio de células estaminais da próstata (PSCA de "Prostate Stem Cell Antigen"). A maior parte das células dos mamíferos exprimem proteínas ancoradas de GPI nas respectivas superfícies. 0 local de activação ou proteólise na proaerolisina é uma sequência de seis aminoácidos que é reconhecida como um substrato proteolítico pelas proteases da família da furina. A PA é activada por hidrólise de um segmento inibidor de terminal C- pela furina (FIG. 1) . A aerolisina activada liga- se a proteínas ancoradas de GPI na membrana celular e forma um heptâmero que se introduz na membrana para produzir canais bem definidos de ~ 17 Á. A formação de canais conduz à rápida morte das células por via de necrose. A aerolisina de tipo selvagem é tóxica para as células dos mamíferos, incluindo eritrócitos, a, por exemplo, 1 nanomolar ou menos.

Animal: organismos vertebrados multicelulares vivos, uma categoria que inclui, por exemplo, mamíferos e aves.

Anticorpo: moléculas de imunoglobulina e fracções imunologicamente activas de moléculas de imunoglobulina, ou seja, moléculas que contêm um local de ligação a um antigénio que se liga especificamente (imunoreage com) um antigénio.

Um anticorpo que ocorre naturalmente (por exemplo, IgG) inclui quatro cadeias de polipéptidos, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves, (L) interligadas por ligações dissulfureto. Contudo, a função de ligação de um anticorpo ao antigénio pode ser desempenhada por fragmentos de um anticorpo de ocorrência natural. Assim, estes fragmentos de ligação ao antigénio são igualmente designados pelo termo anticorpo. Exemplos de fragmentos ligantes abrangidos pelo termo anticorpo incluem (i) um fragmento Fab constituído pelos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento Fd constituído pelos domínios VH e CHI; (iii) um fragmento Fv constituído pelos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (iv) um fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-6, 1989) 9 constituído por um domínio VH; (v) uma região isolada determinante da complementaridade (CDR de "complimentarity determining region"); e (vi) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfureto na região charneira. Adicionalmente, embora os dois domínios do fragmento Fv estejam codificados por genes separados, é possível criar um ligante sintético que lhes permite apresentarem-se como uma cadeia proteica única (conhecida como cadeia singular Fv (scFv) ; Bird et al. Science 242:423-6, 1988; e Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 85:5879-83, 1988) por métodos recombinantes. Tais anticorpos de cadeia singular estão também incluídos. Numa configuração, um anticorpo inclui anticorpos camelizados (ver, por exemplo, Tanha et al. J. Biol. Chem. 276:24774-80, 2001) .

Num exemplo, os fragmentos de anticorpos são capazes de reticular) os respectivos antigénios alvo, por exemplo fragmentos bivalentes tais como fragmentos F(ab')2. Em alternativa, um fragmento de anticorpo que não reticule o respectivo antigénio alvo (por exemplo, um fragmento Fab) pode ser usado em conjunto com um anticorpo secundário que sirva para reticular o fragmento de anticorpo, reticulando deste modo o antigénio alvo. Os anticorpos podem ser fragmentados usando técnicas convencionais e a utilidade dos fragmentos rastreada de maneira igual à descrita para anticorpos inteiros. Um anticorpo está ainda destinado a incluir moléculas bi-específicas e quiméricas que ligam especificamente o antigénio alvo. "Ligar especificamente" refere-se à capacidade dos anticorpos individualmente imunoreagirem especificamente com um antigénio. A ligação é uma reacção de ligação não aleatória entre uma molécula do anticorpo e um determinante antigénico da molécula da superfície da célula T. A especificidade ligante desejada é tipicamente determinada a partir do ponto 10 de referência da capacidade do anticorpo para ligar diferencialmente a molécula da superfície da célula T e um antigénio não associado, estabelecendo deste modo a distinção entre dois antigénios diferentes, particularmente quando os dois antigénios apresentam epítopos únicos. Um anticorpo que especificamente liga a um epítopo particular é referido como um "anticorpo especifico".

Cancro: neoplasma maligno que passou por uma anaplasia caracteristica com perda de diferenciação, aumento na velocidade de crescimento, invasão do tecido circundante, e capaz de metastizar. cDNA (DNA complementar) : porção de DNA à qual faltam segmentos internos não codificantes (intrões) e sequências reguladoras que determinam a transcrição. É possível sintetizar cDNA em laboratório por transcrição reversa a partir de RNA mensageiro extraído das células. Síntese química: meio artificial pelo qual é possível fazer uma proteína ou um peptídeo. Uma proteína ou um peptídeo sintético são os que são produzidos por um tal meio artificial.

Quimioterapia: no tratamento oncológico, quimioterapia refere-se à administração de um composto, ou combinação de compostos, para matar células de reprodução rápida, ou retardar a sua reprodução. Os agentes quimioterapêuticos incluem aqueles que são conhecidos dos especialistas, nomeadamente, entre outros: 5-fluorouracil (5-FU), azatioprina, ciclofosfamida, antimetabolitos (tais como

Fludarabine) , Doxorubicin, antineoplásticos (tais como Etoposide, metotrexato, e Vincristine), carboplatina, cisplatina e os taxanos, tais como taxol e taxotere. Tais agentes podem ser co-administrados a um sujeito com as variantes divulgadas da molécula de PA. Em alternativa ou adicionalmente, os agentes quimioterapêuticos podem ser 11 administrados antes de e/ou após a administração a um sujeito das variantes divulgadas da molécula de PA. Num exemplo, os agentes quimioterapêuticos são co-administrados com terapia hormonal e de radiações, em conjunto com as variantes divulgadas da molécula de PA, para tratamento de um carcinoma localizado da próstata.

Substituição conservadora: substituições de um ou mais aminoácidos (por exemplo, residuos de 2, 5 ou 10) por residuos de aminoácidos dotados de propriedade bioquímicas similares. Habitualmente, as substituições conservadoras têm um impacto reduzido ou nulo na actividade de um polipéptido resultante. A título de exemplo, idealmente, um péptido de PA modificado incluindo uma ou mais substituições conservadoras retém a actividade da proaerolisina. É possível produzir um polipéptido para conter uma ou mais substituições conservadoras por manipulação da sequência de nucleótidos que codifica esse polipéptido usando, por exemplo, procedimentos normais como mutagénese direccionada para o local ou PCR.

Variantes substitutivas são aquelas em que pelo menos um resíduo na sequência de aminoácidos foi removido sendo introduzido no seu lugar um resíduo diferente. Exemplos de aminoácidos que podem ser substituídos por um aminoácido original numa proteína e que são consideradas substituições conservadoras incluem: Ser por Ala; Lys por Arg; Gin ou His por Asn; Glu por Asp; Ser por Cys; Asn por Gin; Asp por Glu; Pro por Gly; Asn ou Gin por His; Leu ou Vai por Ile; Ile ou Vai por Leu; Arg ou Gin por Lys; Leu ou llie por Met; Met, Leu ou Tyr por Phe; Thr por Ser; Ser por Thr; Tyr por Tip; Tip ou Phe por Tyr; e Ile ou Leu por Vai.

Substituições permissivas são substituições de aminoácidos não conservadoras, mas também alteram significativamente a actividade da proaerolisina. Um exemplo é a substituição de Cys por Ala na posição 300 da SEQ N° ID: 2 ou 4 . 12 É possível encontrar mais informações sobre substituições conservadoras em, entre outros, Ben-Bassat et al., (J. Bacteriol. 169:751-7, 1987), 0'Regan et al. (Gene 77:237-51, 1989), Sahin-Toth et al. (Proteln Sei. 3:240-7, 1994), Hochuli et al. (Bio/Technology 6:1321-5, 1988), WO 00/67796 (Curd et al.) e em manuais correntes de genética e biologia molecular.

Num exemplo, tais variantes podem ser facilmente seleccionadas para testes adicionais efectuando um ensaio (como os descritos nos Exemplos 2-5) para determinar se a variante retém a actividade da variante de PA.

Contém: termo que significa "incluindo." Por exemplo, "compreendendo A ou B" significa incluindo A ou B, ou tanto A como B, salvo indicação clara em contrário.

Deleção: remoção de uma sequência de um ácido nucleico, por exemplo DNA, ficando as regiões de ambos os lados ligadas em conjunto. DNA: Ácido Desoxiribonucleico. O DNA é um polímero de cadeia longa que contém o material genético da maior parte dos organismos vivos (alguns vírus possuem genes que contêm ácido ribonucleico (RNA). As unidades repetitivas nos polímeros de DNA são quatro nucleótidos diferentes, cada um dos quais contém uma das quatro bases, adenina, guanina, citosina e timina ligada a um açúcar desoxirribose ao qual está ligado um grupo fosfato. Tripletos de nucleótidos, denominados codões, nas moléculas de DNA caracterizam um dado aminoácido num polipéptido. O termo codão é também usado para as sequências correspondentes (e complementares) de três nucleótidos no mRNA nos quais a sequência de DNA é transcrita

Reforçar: melhorar a qualidade, a quantidade ou a resistência de algo. Numa configuração, uma terapia reforça a capacidade de um sujeito para reduzir tumores, tais como o carcinoma da próstata, no sujeito se este for mais eficaz no combate aos tumores. Noutra configuração, uma terapia reforça 13 a capacidade de um agente para reduzir tumores, tais como o carcinoma da próstata, num sujeito se o agente for mais eficaz na redução de tumores. Tais reforços podem ser medidos usando os métodos divulgados no presente documento, por exemplo calculando a redução do volume do tumor (ver Exemplo 5).

Deleção funcional: mutação, deleção parcial ou completa, inserção, ou outra variação provocada a uma sequência genética que torna essa fracção da sequência genética não funcional.

Por exemplo, a deleção funcional de um dominio de ligação da PA provoca a diminuição da capacidade de PA para se ligar à, e concentrar-se na, membrana celular. A deleção funcional pode ser revertida inserindo um outro dominio de ligação funcional na proaerolisina, tal como um dominio de ligação especifico da próstata, por exemplo um péptido LHRH.

Exemplos de métodos que podem ser usados para a deleção funcional de um dominio de ligação da proaerolisina, incluem, entre outros: deleção dos aminoácidos 1-83 da SEQ N° ID: 2 ou fragmentos da mesma, tais como dos aminoácidos 45-66 da SEQ N° ID: 2, ou inserção de uma ou mais das seguintes mutações numa variante da sequência de proaerolisina W45A, I47E, M57A,Y61 A, K66Q (os números de aminoácidos referem-se à SEQ N° ID: 2) (ver, por exemplo, Mackenzie et al. J. Biol. Chem. 274: 22604-22609, 1999).

Num outro exemplo, a deleção funcional de um local de clivagem original de furina PA resulta numa diminuição da capacidade da PA ser clivada e activada pela furina, quando comparada com uma molécula de PA de tipo selvagem.

Imobilizado: ligado a uma superfície, como uma superfície sólida. Uma superfície sólida pode ser polimérica, como polistireno ou polipropileno. Numa configuração, a superfície sólida tem a forma de uma conta. Numa outra configuração, a superfície inclui uma toxina de PA modificada, e em alguns 14 exemplos inclui ainda um ou mais elementos de ligação específicos da próstata, tais como péptido LHRH, anticorpo PSMA, e anticorpo de cadeia singular PSMA. Numa perspectiva ideal, a toxina de PA modificada é libertada da conta assim que esta atinge a célula prostática alvo. Métodos para imobilizar péptidos numa superfície sólida podem ser obtidos em WO 94/29436, e na Patente EUA N°. 5.858.358.

Exemplos de como as moléculas podem estar ligadas à conta incluem, entre outros: toxina de PA-local de clivagem de PSA-conta-elemento de ligação da próstata; ou elemento de ligação da próstata-conta-local da PSA-toxina da PA-local de clivagem da PSA-inibidor.

Isolado: Um componente biológico "isolado" (tal como uma molécula de ácido nucleico ou uma proteína) foi substancialmente separado ou purificado de outros componentes biológicos na célula do organismo no qual o componente ocorre naturalmente (ou seja, outro DNA e RNA cromossómico e extra cromossómico) . Os ácidos nucleicos e as proteínas que foram objecto do "isolamento" incluem ácidos nucleicos e proteínas purificados por métodos de purificação normais. 0 termo engloba igualmente ácidos nucleicos e proteínas preparados por expressão recombinante numa célula hospedeira bem como ácidos nucleicos e proteínas sintetizados quimicamente.

Uma célula isolada é uma célula que foi substancialmente separada ou purificada de outros componentes biológicos do organismo no qual a célula ocorre naturalmente.

Malignas: células que possuem as propriedades de anaplasia, invasão e metástase.

Mamíferos: este termo inclui mamíferos humanos e não humanos. De igual modo, o termo "sujeito" inclui sujeitos humanos e animais. Exemplos de mamíferos incluem, entre outros: humanos, porcos, vacas, cabras, gatos, cães, coelhos e ratos. 15

Neoplasma: crescimento anormal de células. Célula normal: célula não tumoral, não maligna, não infectada.

Oligonucleótido: sequência linear de polinucleótidos cujo comprimento pode chegar a cerca de 200 bases de nucleótidos, por exemplo um polinucleótido (tal como DNA ou RNA) cujo comprimento pode atingir pelo menos 6 nucleótidos, e chegando, por exemplo, a 15, 50, 100 ou 200 nucleótidos.

Operacionalmente ligada: uma primeira sequência de ácidos nucleicos está operacionalmente ligada a uma segunda sequência de ácidos nucleicos quando a primeira sequência de ácidos nucleicos se encontra numa relação funcional com a segunda sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência codificante se o promotor afectar a transcrição ou expressão da sequência codificante. De uma forma geral, as sequências de DNA operacionalmente ligada são contíguas e, se necessário para ligar as duas regiões codificantes da proteína, no mesmo quadro de leitura. ORF ("open reading frame" ou quadro de leitura aberto): série de tripletos de nucleótidos (codões) que codificam aminoácidos sem qualquer codão de terminação. Estas sequências podem habitualmente traduzir-se para um péptido.

Polinucleótido: sequência linear de ácidos nucleicos de qualquer comprimento. Deste modo, um polinucleótido inclui moléculas com pelo menos 15, 50, 100, 200, 400, 500, 1000, 1100, ou 1200 (oligonucleótidos) e também nucleótidos tão compridos como cDNA longo ou cromossoma.

Proaerolisina: protoxina inactiva da aerolisina. O cDNA e a proteína de uma proaerolisina original ou de tipo selvagem são apresentados nas SEQ N° ID: 1 e 2, respectivamente. 16

Num exemplo, uma variante ou molécula modificada de proaerolisina inclui um local de clivagem de protease específico da próstata tal como um local de clivagem específico da PSA, gue permite a activação da variante de PA na presença de uma protease específica da próstata tal como PSA, PMSA, ou HK2 (ver, por exemplo, FIGS. 5C-I) . Num exemplo, um local de clivagem de protease específica da próstata é inserido no local de clivagem de furina da PA, de tal modo que a PA é activada na presença de uma protease específica da próstata, mas não da furina (ver, por exemplo, FIGS. 5D-I). Em alternativa, o local de clivagem da furina pode ser funcionalmente suprimido recorrendo à mutagénese de seis sequências de aminoácidos, e inserção de uma sequência de clivagem de protease específica da próstata (ver, por exemplo, FIG. 5C) . Num outro exemplo, uma variante de molécula de PA inclui ainda deleção ou substituição de um ou mais, por exemplo pelo menos dois, aminoácidos de PA originais. Ainda num outro exemplo, uma variante da molécula de PA inclui também uma outra molécula (tal como um anticorpo ou um péptido) ligada ou acrescentada à (ou dentro da) variante da molécula de PA. Num outro exemplo, uma variante da molécula de PA inclui um domínio de ligação específico do tecido prostático.

Num outro exemplo, uma variante da molécula de PA inclui também um domínio de ligação funcionalmente suprimido (sobre aminoácidos 1-83 da SEQ N° ID: 2). As deleções funcionais podem fazer-se usando um qualquer método conhecido dos especialistas, tais como deleções, inserções, mutações, ou substituições. Entre os vários exemplos contam-se deleção de todo o domínio de ligação (ou porções do mesmo, (ver, por exemplo, FIGS. 5G-I), ou introdução de mutações pontuais (tais como as descritas acima (ver, por exemplo, FIGS. 5D-F), de que resulta um domínio de ligação com decréscimo de funções. Por exemplo, uma molécula de PA que tenha um domínio de ligação funcionalmente suprimido (e nenhuma sequência de ligação que o 17 substitua), terá uma menor capacidade de se acumular na membrana de uma célula, e por conseguinte de lisar células a uma velocidade inferior à de uma sequência de PA de tipo selvagem (ver, por exemplo, FIG. 5D) . Igualmente divulgadas são variantes da molécula de PA nas quais o dominio de ligação original sofreu uma deleção funcional e foi substituído por um dominio de ligação especifico de tecido prostático como se descreve abaixo (ver, por exemplo, FIGS. 5E-I).

Num outro exemplo, uma variante ou modificação da molécula de PA inclui um local de clivagem de furina, e um domínio de ligação funcionalmente suprimido que é substituído por um domínio de ligação específico do tecido prostático (ver, por exemplo FIGS. 5J-M) . Tais variantes de moléculas de PA são direccionadas para células prostáticas através do domínio de ligação específico do tecido prostático, e activadas na presença da furina.

Exemplos específicos não exclusivos de variantes de proteínas de PSA são apresentados nas SEQ N° ID: 4, 7, 10, 13, 24, e 25. A actividade da PA modificada é a actividade de um agente na qual a lise das células é afectada. As células incluem, entre outras, células secretoras de protease específica da próstata, tais como células secretoras de PSA, tais como células prostáticas cancerígenas, tais como células prostáticas cancerígenas de proliferação lenta. Os agentes incluem, entre outros, proteínas de PA modificadas, ácidos nucleicos, agentes de ligação específicos, incluindo variações, mutações, polimorfismos, fusões, e fragmentos das mesmas, divulgados no presente documento. Num exemplo, refere-se que a actividade da PA modificada é reforçada quando proteínas ou ácidos nucleicos de PA modificada, em contacto com uma célula secretora de PSA (tal como célula prostática cancerígena), promovem a lise e morte da célula, por exemplo de pelo menos 10%, ou por exemplo de pelo menos 25%, 50%, 100%, 200% ou mesmo 500%, quando em comparação com a lise de uma célula não produtora de PSA. 18

Noutros exemplos, refere-se que a actividade da PA modificada é reforçada quando proteínas e ácidos nucleicos de PA modificada, em contacto com um tumor, diminuem o volume das células do tumor, tal como um tumor prostático, por exemplo de pelo menos 10%, ou por exemplo de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ou mesmo 100% (completado com a eliminação do tumor).

Ensaios que podem ser usados para definir se um agente possui actividade de PA modificada são descritos no documento, por exemplo nos Exemplos 2-5 e 9. A titulo de exemplo, é possível avaliar a capacidade de um péptido de PA modificado para a lise específica de células produtoras de PSA (Exemplos 2 e 5), para ser estável no plasma humano (Exemplo 3) , para ser um

substrato eficiente para a actividade enzimática da PSA (Exemplo 9) . A actividade de proteínas funcionais pode ser detectada pela lise preferencial de células produtoras de PSA versus células não produtoras de PSA, decréscimo do volume do tumor prostático, menor toxicidade em comparação com PA de tipo selvagem, e maior estabilidade no sangue em comparação com PA de tipo selvagem. É possível recorrer a ensaios similares para determinar se qualquer agente de PA modificado divulgado no presente pode diminuir o volume de tumores (como um tumor prostático) e especificamente lisar células produtoras de PSA. Por exemplo, é expectável que os péptidos de PA modificada apresentados nas SEQ N° ID: 4, 24, e 25, reduzam o volume do tumor prostático. Qualquer um destes ensaios pode ser modificado usando uma expressão in vivo de um gene de PA modificada, e variações, fusões e fragmentos do mesmo, em vez da administração de proteínas modificadas

Promotor: conjunto de sequências de controlo de ácidos nucleicos que dirigem a transcrição de um ácido nucleico. Um promotor inclui sequências de ácidos nucleicos necessárias e próximas do sítio de início da transcrição, tal como no caso 19 de um promotor do tipo polimerase II, um elemento TATA. Um promotor inclui também opcionalmente um elemento distai estimulador ou repressor que se podem localizar a uma distância de vários milhares de pares de bases do local de inicio da transcrição.

Promotor especifico da próstata: promotor responsável pela testosterona e outros androgénios, que pode, pois, promover a expressão genética nas células prostáticas. Entre os exemplos contam-se, nomeadamente, o promotor da probasina; o promotor do antigénio especifico da próstata (PSA); o promotor do antigénio especifico da membrana da próstata (PSMA); e o promotor da calicreina glandular humana 2 (HK2).

Local de clivagem de protease especifica da próstata: sequência de aminoácidos que é reconhecida e especifica e eficientemente hidrolisada (clivada) por uma protease especifica da próstata. Os exemplos incluem, entre outros, um local de clivagem especifico de PSA, um local de clivagem especifico do PSMA e um local de clivagem especifico da HK2.

Um local de clivagem especifico de PSA é uma sequência de aminoácidos que é reconhecida e especifica e eficientemente hidrolisada (clivada) pelo antigénio especifico da próstata (PSA) . Tal sequência de péptidos pode ser introduzida noutras moléculas, tais como PA, para produzir pró-fármacos que são activados por PSA. Mediante activação da PA modificada por PSA, a PA é activada e pode exercer a sua citotoxicidade. Exemplos de locais de clivagem especificos de PSA, incluem, entre outros, os apresentados nas SEQ N° ID: 5, 8, 11, e 14- 21, os divulgados nas Patentes EUA N°. 5.866.679 para DeFeo-

Jones et al., 5.948.750 de Garsky et al., 5.998.362 de Feng et al., 6.265.540 de Isaacs et al., 6.368.598 de D'Amico et al.,

e 6.391.305 de Feng et al. J&A É possivel encontrar exemplos especificos de locais de clivagem especificos de PSMA em WO/0243773 de Isaacs e 20

Denmeade (aqui incorporados a titulo de referência). Exemplos específicos de locais de clivagem específicos de HK2 são divulgados em WO/0109165 de Denmeade et al.

Domínio de ligação específico do tecido prostático: uma molécula, tal como um ligando de péptido, uma toxina ou um anticorpo, que apresenta uma maior especificidade para células prostáticas do que para outros tipos de células. Num exemplo, um domínio de ligação específico do tecido prostático possui um mais baixo KD em tecido ou células da próstata do que noutros tipos de células, (ou seja, liga-se selectivamente a tecidos prostáticos quando em comparação com outros tecidos normais do sujeito), por exemplo um KD 10 vezes mais baixo, ou por exemplo um KD pelo menos 20, 50, 75, 100 ou mesmo 200 vezes mais baixo. Tais sequências podem ser usadas para direccionar um agente, como uma variante da molécula de PA, para a próstata. Os exemplos incluem, entre outros: anticorpos que reconhecem proteínas que são relativamente específicas da próstata tais como PSA, PSMA, hK2, prostasina, e hepsina; ligandos que possuem receptores selectivos da próstata tais como hormonas libertadoras da hormona luteinizante (LHRH), de origem natural e sintética; e endotelina (que se liga ao receptor de endotelina correlacionado) .

Purificado: o termo "purificado" não requer uma pureza absoluta; é, isso sim, um conceito relativo. Assim, a título de exemplo, uma proteína ou uma preparação de ácido nucleico substancialmente purificadas (tais como as toxinas de PA modificada divulgadas no presente) são aquelas em que a proteína ou o ácido nucleico em causa apresentam maior pureza do que a proteína no seu ambiente natural no interior de uma célula ou de uma câmara de reacção de produção (conforme o caso). Por exemplo, uma preparação de uma proteína de PA modificada é purificada se a proteína representar pelo menos 50%, ou por exemplo pelo menos 70%, do conteúdo de proteína total da preparação. Os métodos para a purificação de 21 proteínas e ácidos nucleicos são bem conhecidos na especialidade. Exemplos de métodos que se podem usar para purificar uma proteína, tal como uma PA modificada, incluem, entre outros, os métodos divulgados em Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989, Cap. 17).

Recombinante: um ácido nucleico recombinante é aquele que possui uma sequência que não ocorre naturalmente ou uma sequência resultante da combinação artificial de dois segmentos de sequência normalmente separados. Esta combinação artificial é muitas vezes obtida por síntese química ou, mais habitualmente, pela manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucleicos, por exemplo, técnicas de engenharia genética. Uma proteína recombinante é aquela que resulta de expressar um ácido nucleico recombinante que codifica a proteína.

Amostra: amostras biológicas que contêm DNA, cDNA, RNA, ou proteína genómica obtidas das células de um sujeito, tais como as que se encontram em sangue periférico, urina, saliva, sémen, biópsia de tecidos, espécimes cirúrgicos, aspirados de agulhas finas, amostras de amniocentese e material de autópsia. Num exemplo, uma amostra inclui células cancerígenas prostáticas obtidas de um sujeito.

Identidade/similaridade de sequências: a identidade/similaridade entre duas ou mais sequências de ácidos nucleicos, ou duas ou mais sequências de aminoácidos, exprime-se em termos da identidade ou similaridade entre as sequências. A identidade de sequências pode ser medida em termos de identidade percentual; quanto mais elevada a percentagem, mais idênticas são as sequências. A similaridade de sequências pode ser medida em termos de similaridade percentual (que leva em conta substituições conservadoras de aminoácidos); quanto mais elevada a percentagem, mais similares são as sequências. 22

Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na especialidade. Vários programas e algoritmos de alinhamento encontram-se descritos em: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol.

Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988;

Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989;Corpetera/.,/vwc. Acids

Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the

Biosciences 8, 155-65, 1992; e Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24:307-31,1994. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990, apresentam análises detalhadas de métodos de alinhamento de sequências e cálculos de homologia. A NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990) pode ser obtida a partir de diversas fontes, incluindo o National Center for Biological Information (NCBI, National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894) e na Internet, para utilização em associação com os programas de análise de sequências blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx. É possível obter informações adicionais no sítio web do NCBI.

Para comparação de sequências de aminoácidos com mais de 30 aminoácidos, utiliza-se a função de sequências Blast 2 usando o conjunto da matriz predefinida BLOSUM62 para parâmetros predefinidos, (custo da existência do espaçamento de 11, e um custo de espaçamento por resíduo de 1) . Ao alinhar péptidos curtos (com menos de 30 aminoácidos) , o alinhamento deve ser feito usando a função de sequências Blast 2, usando o conjunto da matriz PAM30 para parâmetros predefinidos (espaçamento aberto 9, penalização de extensão do espaçamento de 1). As proteínas com similaridade ainda maior para a sequência de referência apresentam identidades percentuais crescentes quando avaliadas por este método, tais como pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou mesmo 99% de identidade de sequência. Quando se compara menos do que toda a sequência 23 para efeitos de identidade da sequência, os homólogos possuem habitualmente pelo menos 75% de identidade de sequência em curtas janelas de 10-20 aminoácidos, e podem apresentar identidades de sequência de pelo menos 85%, 90%, 95% ou 98% dependendo da sua identidade para a sequência de referência. Os métodos para determinar a identidade de sequências em janelas tão curtas estão descritos no sitio web do NCBI.

Os homólogos de proteínas são tipicamente caracterizados por possuírem pelo menos 70%, ou pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou até mesmo 98% de identidade de sequência, contada em todo o comprimento do alinhamento com a sequência de aminoácidos usando a NCBI Basic Blast 2.0, blastp espaçado com bases de dados como a base de dados nr ou swissprot. As pesquisas feitas com o programa blastn são filtradas com DUST (Hancock and Armstrong, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:67-70). Outros programas recorrem ao SEG.

Um especialista verificará que estes intervalos de identidade de sequências são apresentados unicamente a título orientativo; é possível que se possam obter homólogos altamente significativos fora dos intervalos apresentados. Apresentadas aqui são os homólogos de péptidos descritos acima, bem como moléculas de ácidos nucleicos que codificam tais homólogos.

As sequências de ácidos nucleicos que não apresentam um elevado grau de identidade podem não obstante codificar sequências de aminoácidos idênticas ou similares (conservadas), devido à degeneração do código genético. Podem fazer-se alterações numa sequência de ácidos nucleicos usando esta degeneração para produzir múltiplas moléculas de ácidos nucleicos que codificam substancialmente a mesma proteína.

Tais péptidos homólogos podem, por exemplo, possuir pelo menos 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% de identidade de sequência determinada por este método. Quando se compara menos do que toda a sequência para efeitos de identidade de sequência, os 24 homólogos podem, por exemplo, possuir pelo menos 75%, 85% 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência em curtas janelas de 10-20 aminoácidos. Os métodos para determinar a identidade de sequências em janelas tão curtas podem ser obtidos no sitio web do NCBI. Um especialista verificará que estes intervalos de identidade de sequências são apresentados unicamente a titulo orientativo; é possível que se possam obter homólogos significativos ou outras variantes fora dos intervalos apresentados.

Sujeito: organismos vertebrados multicelulares vivos, uma categoria que inclui sujeitos tanto humanos como animais, que requerem um aumento no efeito biológico pretendido. Os exemplos incluem, entre outros: humanos, macacos, cães, gatos, ratos, coelhos, gatos, cavalos, porcos e vacas.

Quantidade com eficácia terapêutica: uma quantidade suficiente para obter um efeito biológico desejado, por exemplo uma quantidade que é eficaz para diminuir o tamanho (ou seja, o volume), os efeitos secundários e/ou as metástases do cancro da próstata. Num exemplo, é uma quantidade suficiente para diminuir os sintomas ou efeitos de um carcinoma da próstata, como o tamanho do tumor. Em exemplos específicos, é uma quantidade eficaz para diminuir o tamanho de um tumor da próstata e/ou metástases da próstata em pelo menos 30%, 40%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mesmo 100% (eliminação completa do tumor).

Em exemplos específicos, é uma quantidade de uma molécula de PA modificada eficaz para diminuir um tumor da próstata e/ou uma quantidade de células prostáticas cancerígenas lisadas por uma PA modificada, como num sujeito a quem é administrada, por exemplo um sujeito com um ou mais carcinomas da próstata. Noutros exemplos, é uma quantidade de uma molécula de PA modificada e/ou uma quantidade de células prostáticas cancerígenas lisadas por tal molécula de PA modificada, eficaz para diminuir as metástases de um carcinoma da próstata. 25

Numa configuração, a quantidade com eficácia terapêutica inclui também uma quantidade de PA modificada e/ou uma quantidade de células prostáticas cancerígenas lisadas por uma PA modificada suficiente para obter um efeito desejado num sujeito em tratamento. Por exemplo, esta pode ser uma quantidade necessária para melhorar os sinais e/ou sintomas de uma doença como um cancro, por exemplo cancro da próstata.

Uma quantidade eficaz de PA modificada e/ou células prostáticas cancerígenas lisadas por tal molécula de PA modificada pode ser administrada numa dose única, ou em várias doses, por exemplo diariamente, no decurso de um tratamento. Todavia, a quantidade eficaz depende do sujeito em tratamento, da gravidade e do tipo da condição em tratamento, e do método de administração. Por exemplo, uma quantidade com eficácia terapêutica de PA modificada pode variar entre cerca de 1-10 mg por 70 kg de peso corporal, por exemplo cerca de 2,8 mg, em caso de administração iv e cerca de 10-100 mg por 70 kg de peso corporal, por exemplo cerca de 28 mg, em caso de administração intraprostática ou intratumoral. Adicionalmente, uma quantidade com eficácia terapêutica de células prostáticas cancerígenas lisadas por PA (variante ou de tipo selvagem) pode oscilar entre cerca 106 e 108 células.

Dose com eficácia terapêutica: num exemplo, uma dose de PA modificada suficiente para diminuir o volume das células de um tumor, como um carcinoma da próstata, num sujeito a quem é administrada, de que resulte a regressão da uma condição patológica, ou que seja capaz de aliviar os sinais ou sintomas causados pela condição. Num exemplo específico, trata-se de uma dose de PA modificada suficiente para diminuir as metástases de um cancro da próstata.

Ainda num outro exemplo, uma dose de lisado celular resultante do contacto de células com uma PA modificada suficiente para diminuir o volume das células de um tumor, como um carcinoma da próstata, num sujeito a quem é 26 administrado, de que resulte a regressão da uma condição patológica, ou que seja capaz de aliviar os sinais ou sintomas causados pela condição. Num exemplo especifico, é uma dose de lisado celular resultante do contacto de células com uma PA modificada ou de tipo selvagem suficiente para diminuir as metástases de um cancro da próstata.

Tumor: neoplasma. Inclui tumores sólidos e hematológicos (ou líquidos).

Exemplos de tumores hematológicos incluem, entre outros: leucemias, incluindo leucemias agudas (tais como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielogénica aguda e mieloblástica, promielócito, mielomonocítico, monocítico e eritroleucemia), leucemias crónicas (tais como leucemia mielocítica (granulocítica) crónica, leucemia mielogénica crónica, e leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, doença de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin (incluindo graus baixo, intermédio, e alto), mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença das cadeias pesadas, síndrome mielodisplásico, linfoma de células do manto e mielodisplasia.

Exemplos de tumores sólidos, tais como sarcomas e carcinomas, incluem, entre outros: fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, osteossarcoma, e outros sarcomas, sarcoma sinovial, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma do cólon, cancro linfóide, cancro do pâncreas, cancro da mama, cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro da próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma das glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma das células renais, hepatoma, de Wilms carcinoma das vias biliares, coriocarcinoma, tumor , cancro cervical, tumor testicular, carcinoma da 27 bexiga, e tumores do SNC (tais como a glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma).

Transformada: uma célula transformada é uma célula na qual foi introduzida uma molécula de ácido nucleico por técnicas de biologia molecular. Tal como utilizado no presente documento, o termo transformação abrange todas as técnicas pelas quais uma molécula de um ácido nucleico pode ser introduzida em tal célula, incluindo transfecção com vectores virais, transformação com vectores plasmidicos, e introdução de DNA nu por electroporação, lipofecção, e técnica de aceleração de partículas. Célula transgénica: células transformadas que contêm DNA estranho, não original.

Mamífero transgénico: mamíferos transformados que contêm DNA estranho, não original. Numa configuração, o DNA não original é uma PA modificada que inclui um local de clivagem de PSA, tal como o da SEQ N° ID: 3, ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína apresentada nas SEQ N° ID: 24 ou 25.

Variantes ou fragmentos ou fusões de proteínas: a produção de proteína de PA modificada pode ser concretizada de várias formas (por exemplo, ver Exemplos 12 e 16) . As sequências de DNA que codificam uma proteína da PA modificada ou proteína de fusão, ou um fragmento ou variante de uma proteína (por exemplo, um fragmento ou variante com 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência para uma PA modificada) pode ser fabricada para permitir que a proteína seja expressa em células ou organismos eucarióticos, bactérias, insectos, e/ou plantas. Para obter expressão, a sequência de DNA pode ser alterada e operacionalmente ligada a outras sequências reguladoras. O produto final, que contém as sequências 28 reguladoras e a proteína PA modificada terapêutica, é citado como um vector. Este vector pode ser introduzido em células eucarióticas, bactérias, insectos e/ou plantas. Uma vez introduzida a célula, o vector possibilita que a proteína seja produzida.

Uma proteína de fusão que inclui uma PA modificada (ou variações, polimorfismos, mutações, ou fragmentos da mesma) ligada a outras sequências de aminoácidos que não inibem a actividade pretendida da proteína, a capacidade para a lise de células secretoras de PSA. Num exemplo, as outras sequências de aminoácidos não são mais do que resíduos de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, ou 50 aminoácidos de comprimento.

Um especialista verificará que o DNA pode ser alterado de inúmeras formas sem afectar a actividade biológica da proteína codificada. Por exemplo, é possível usar PCR para produzir variações na sequência de DNA que codifica uma variante de toxina de PA. Tais variações podem ser optimizadas para preferência de codões numa célula hospedeira usada para exprimir a proteína, ou outras alterações de sequência que facilitam a expressão.

Vector: uma molécula de ácido nucleico tal como introduzida numa célula hospedeira, dando assim origem a uma célula hospedeira transformada. Um vector pode incluir sequências de ácidos nucleicos que lhe permitem replicar-se na célula hospedeira, como uma origem de replicação. Um vector pode também incluir um ou mais genes marcadores seleccionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na especialidade. É possível obter definições adicionais de termos habitualmente usados na genética molecular em Benjamin Lewin, Genes V publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and 29

Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Variantes da molécula de proaerolisina

As toxinas bacterianas, como a aerolisina produzida pela Aeromonas hydrophilia e uma hemolisina produzida pela Staph aureus, são proteínas de folha beta que oligomerizam na membrana plasmática para produzir poros que conduzem a uma rápida morte celular citolitica (FIG. 1) . A formação de poros rompe fisicamente a membrana das células, e provoca a morte das células em todas as fases do ciclo celular, incluindo células não proliferantes (ou seja, retidas em GO). Contudo, a aerolisina de tipo selvagem mata as células indiscriminadamente. O presente documento divulga uma forma de protoxina inactiva de aerolisina (uma variante de PA) que pode ser direccionada para, e activada por, proteínas específicas do cancro da próstata. Uma vantagem das variantes divulgadas da molécula de PA para o tratamento do cancro da próstata metastático e localizado é que combina uma terapia que não depende da proliferação com a administração de fármacos específicos da próstata, de que resultam efeitos secundários mínimos para os doentes. Um especialista compreenderá que outras protoxinas, tais como a toxina alfa Clostridium septicum, a toxina delta Bacillus thuringiensis e a perforina humana podem ser substituídas por proaerolisina. O presente documento divulga variantes da molécula de PA, incluindo sequência de DNA e proteínas, que incluem uma sequência de clivagem de protease específica da próstata.

Exemplos de sequências de clivagem de protease específica da próstata incluem, entre outras: sequências de clivagem de PSA, PSMA, e HK2. A sequência de clivagem de protease específica da próstata substitui funcionalmente o local de clivagem da furina original de PA (ver, por exemplo, FIGS. 5B-I). Desta substituição resulta uma variante de proaerolisina que apenas se torna citoliticamente activa na presença de proteases 30 activas enzimaticamente, tais como PSA, PSMA, ou hK2. PSA é uma serina protease com a capacidade de reconhecer e hidrolisar sequências especificas de péptidos. É segregada por células prostáticas normais e malignas numa forma enzimaticamente activa e fica desactivada depois de entrar na circulação. Uma vez que nem o sangue nem os tecidos normais para além da próstata contêm PSA enzimaticamente activo, a actividade proteolitica do PSA foi usada para activar protoxinas em locais de cancro da próstata. Pode ser usado qualquer local de clivagem de PSA, PSMA, ou hK2. Exemplos de locais de clivagem de PSA, incluem, entre outros, os apresentados nas SEQ N° ID: 5, 8, 11, e 14-21. Num exemplo especifico, o local de clivagem de PSA inclui a SEQ N° ID: 5.

Em alguns exemplos, o local de clivagem da furina de PA (aminoácidos 427-432 da SEQ N° ID: 2) é suprimido e é inserido um local de clivagem de protease especifico da próstata, tal como um local de clivagem de PSA (ver, por exemplo, FIG. 5B) . Noutros exemplos, o local de clivagem da furina de PA sofre uma mutação e um local de clivagem de protease especifico da próstata, tal como um local de clivagem de PSA, é introduzido no ou acrescentado ao terminal N- ou C- do local da furina (ver, por exemplo, FIG. 5C) .

Igualmente divulgadas são variantes da molécula de PA nas quais o domínio de ligação da PA é funcionalmente suprimido (ver, por exemplo, FIGS. 5D-M) . Tais variantes da molécula de PA podem conter um local de clivagem de furina original (ver, por exemplo, FIGS. 5J-M), no qual o direccionamento para células prostáticas é conseguido substituindo funcionalmente o domínio de ligação da PA por um domínio de ligação específico do tecido prostático. Em alternativa, as variantes da molécula de PA contêm um local de clivagem de protease específica da próstata (ver, por exemplo, FIGS. 5D-I), no qual a activação das protoxinas ocorre primordialmente em células que segregam uma protease específica da próstata. 0 domínio de ligação da 31 PA inclui os aminoácidos 1-83 da SEQ N° ID: 2. 0 dominio de ligação pode ser funcionalmente suprimido usando qualquer método conhecido na especialidade, por exemplo por deleção de todos ou de alguns dos aminoácidos do dominio de ligação, tal como deleção dos aminoácidos 1-83 da SEQ N° ID: 2 ou 4 (ver, por exemplo, FIG. 5G) , ou a deleção de um ou mais aminoácidos apresentados como aminoácidos 45-66 da SEQ N° ID: 2 ou 4 (ver, por exemplo, FIG. 5D em que * representa uma ou mais deleções) . Noutros exemplos, o dominio de ligação é funcionalmente suprimido por introdução de uma ou mais mutações especificas de sitio na variante da sequência de PA, tal como W45A, I47E, M57A.Y61 A, e K66Q da SEQ N° ID: 2 ou 4 (ver, por exemplo, FIG. 5D, em que * representa uma ou mais mutações) . São divulgadas variantes da molécula de PA que incluem um dominio de ligação especifico do tecido prostático que substitui funcionalmente o dominio de ligação de PA original (ver, por exemplo FIGS. 5E,5F, 5H e 5I-M). 0 uso de um ou mais domínios de ligação específicos do tecido prostático pode aumentar o direccionamento das variantes divulgadas da molécula de PA para as células prostáticas e respectivas metástases. São conhecidos vários domínios de ligação específicos de tecido prostático. Entre os exemplos inclui-se uma sequência da hormona libertadora da hormona luteinizante (LHRH) , como as que se apresentam nas SEQ N° ID: 22 e 23, e anticorpos que reconhecem PSA e/ou PSMA.

Um ou mais domínios de ligação específicos do tecido prostático podem estar ligados a um ou mais aminoácidos das variantes divulgadas da molécula de PA, mas idealmente não interferem significativamente com a capacidade da variante da PA ser activada por uma protease específica da próstata tal como PSA, e a capacidade de formar poros em membranas celulares. A título de exemplo, domínios de ligação específicos do tecido prostático podem ser ligados ou 32 inseridos num terminal N- e/ou C- de uma variante de PA (ver, por exemplo, FIGS. 5E e 5H) . Em alguns exemplos, o domínio de ligação original de PA é suprimido (ou seja, os aminoácidos 1-83 da SEQ N° ID: 2 ou 4), de tal modo gue a fixação ou ligação de um domínio de ligação específico do tecido prostático ao terminal N- resulta numa fixação ao aminoácido 84 da SEQ N° ID: 2 ou 4 (ver, por exemplo, FIGS. 5H e 5L). Noutros exemplos, são introduzidas pequenas deleções ou mutações pontuais no domínio de ligação original de PA, de tal modo que a fixação ou ligação de um domínio de ligação específico do tecido prostático ao terminal N- resulta numa fixação ao aminoácido 1 da SEQ N° ID: 2 ou 4 (ou qualquer outro aminoácido que seja N terminal na sequência da deleção funcional do domínio de ligação de PA original) (ver, por exemplo, FIGS. 5E e 51). Em alguns exemplos, o aminoácido N-terminal de PA é alterado para um Cys ou outro aminoácido antes de se fixar ao domínio de ligação específico do tecido prostático, para apoiar a ligação do domínio de ligação específico do tecido prostático à variante da proteína de PA.

Em alternativa ou adicionalmente, um ou mais domínios de ligação específicos do tecido prostático podem fixar-se ou ligar-se a outros aminoácido de uma variante da molécula de PA, tal como os aminoácidos 215 ou 300 da SEQ N° ID: 2 ou 4 (ver, por exemplo, FIGS. 5F, 51,5K e 5M); Em alguns exemplos, um aminoácido Cys substitui o aminoácido original nessa posição. A título de exemplo, podem ser feitas as seguintes alterações às SEQ N° ID: 2 ou 4: Tyr215Cys ou AIa300Cys. Num exemplo, em que o domínio de ligação específico do tecido prostático é um anticorpo, a reticulação pode ser usada para fixar anticorpos a uma variante de PA, por exemplo fazendo reagir grupos amino no anticorpo com cisterna localizada na variante de PA (tal como aminoácidos Cysl9, Cys75, Cysl59, e/ou Cysl64 da SEQ N° ID: 2) . 33

Igualmente divulgadas são variantes especificas da molécula de PA, tais como as que se apresentam nas SEQ N° ID: 3, 4, 6, 7, 9, 10,12, 13, 24 e 25.

Em alguns exemplos, as variantes divulgadas da molécula de PA estão ligadas a ou imobilizadas numa superficie do género de uma gota. A gota pode também incluir um ligando especifico da próstata para reforçar o direccionamento para uma célula prostática, tal como uma célula prostática cancerígena localizada ou metastizada.

Tratamento do cancro da próstata com proaerolisina modificada

As variantes da molécula de PA divulgadas e analisadas acima são especificamente activadas para potentes citotoxinas no interior de sitios prostáticos cancerígenos por via da actividade proteolitica de proteases especificas da próstata como PSA, PSMA, e hK2. 0 direccionamento em alguns exemplos é conseguido pela inclusão de um ou mais dominios de ligação específicos do tecido prostático, tais como péptido de LHRH que se pode ligar ao seu receptor de LHRH correlacionado expresso por células prostáticas cancerígenas, ou anticorpos PSMA ou LHRH, os quais se podem ligar a PSMA ou LHRH expresso na superfície das células prostáticas cancerígenas. Um especialista reconhecerá que o uso de uma variante da molécula de PA, que inclui um local de clivagem e um péptido de LHRH ou anticorpo, pode ser usado para tratar outros cancros que exprimem receptores LHRH, tais como melanomas e cancros da mama, do ovário e dos pulmões, usando as variantes da molécula de PA e os métodos divulgados no presente documento.

Adicionalmente, um especialista reconhecerá que o uso de uma variante da molécula de PA que inclui um local de clivagem de furina ou PSMA, e/ou um anticorpo de PSMA, pode ser usada para tratar outros cancros nos quais o PSMA está expresso (por exemplo, na vasculatura do tumor) , tais como cancros da mama, do cólon, dos rins, da bexiga e do cérebro, usando as 34 variantes da molécula de PA e os métodos divulgados no presente.

As variantes divulgadas da molécula de PA, tais como ácidos nucleicos e/ou proteínas, podem ser administradas local ou sistemicamente usando qualquer método conhecido na especialidade, a sujeitos com cancro da próstata localizado e metastático. Adicionalmente, as variantes divulgadas da molécula de PA podem ser administradas a um sujeito para terapia imunoestimulante. Devido à especificidade da ligação e da activação das variantes divulgadas da molécula de PA, a administração local e sistémica deve ter efeitos minimos sobre os tecidos normais de um doente e, idealmente, produzir efeitos secundários reduzidos ou nulos.

Num exemplo, as variantes divulgadas da molécula de PA são injectadas na glândula prostática (intraprostaticamente) e/ou no tumor prostático (intratumoralmente) num sujeito com cancro da próstata, tal como um tumor localizado. Tal injecção localizada e subsequente lise das células prostáticas cancerígenas no interior da glândula prostática pode produzir um efeito imunoestimulante conducente a uma diminuição ou eliminação da doença micrometastática nos sujeitos tratados. Deste modo, a doença sistémica é tratada ou reduzida através de uma terapia minimamente tóxica, de aplicação local.

Adicionalmente, ou em alternativa, as variantes divulgadas da molécula de PA podem ser administradas sistemicamente, por exemplo por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, ou oral, a um sujeito com cancro da próstata, como um tumor prostático metastático. A terapia sistémica pode também ter um efeito imunoestimulante anti-tumoral. As variantes divulgadas da molécula de PA que incluem um local de clivagem de PSA não são hidrolisadas por serina proteases ou PSA enzimaticamente inactivo no sangue. Em vez disso, as variantes não hidrolisadas divulgadas da molécula de PA são administradas por via do sangue ao fluido extracelular no interior de 35 depósitos cancerígenos hidrolisadas para a toxina terapêutica activa pela PSA enzimaticamente activa segregada por estas células prostáticas cancerígenas. Uma vez hidrolisada, a toxina libertada entra nas células próximas produtoras e não produtoras de PSA na vizinhança imediata devido à sua elevada capacidade de penetrar na membrana e induz a morte citolítica destas células. metastáticos onde podem ser É igualmente divulgado um método adicional para o tratamento sistémico do cancro da próstata num sujeito. Neste método, as células prostáticas cancerígenas são retiradas do sujeito com cancro da próstata, tal como um tumor prostático metastático. Em alternativa, ou adicionalmente, podem ser usadas linhagens de células prostáticas cancerígenas. Exemplos de linhagens de células prostáticas cancerígenas que se podem usar incluem, entre outras: células produtoras de PSA como LNCaP (tais como ATTC N°. CRL-174 0 e CRL-10995) e CWR22R (ATCC N°. CRL-2505 e Nagabhushan et al, Câncer Res. 56(13):3042-6, 1996), ou células não produtoras de PSA tais como PC-3 (ATCC N°. CRL-1435) e DU 145 (ATCC N°. HTB-81) . As células ou linhagens celulares removidas são incubadas ou contactadas pelas variantes divulgadas da molécula de PA. Esta incubação resulta na lise das células pela variante da molécula de PA, e a produção de um lisado celular que é administrado ao sujeito. Num exemplo, o método inclui ainda a administração de factores imunoestimulantes, lisados de células prostáticas cancerígenas fabricados para produzirem factores imunoestimulantes, e/ou células prostáticas cancerígenas irradiadas (incluindo células prostáticas cancerígenas fabricadas para produzirem factores imunoestimulantes). Exemplos de factores imunoestimulantes incluem, entre outros: factor estimulante do crescimento de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) ; membros da família de proteínas das interleucinas tais como, entre outras, interleucina-2 e interleucina-6, factor estimulante da colonização de granulócitos (G-CSF); e membros da família dos 36 interferões, como o interferão alfa, beta ou gama. A administração de tais substâncias a um sujeito pode fazer-se em simultâneo com o lisado celular (co-administração), antes da administração do lisado celular, e/ou subsequente à administração do lisado celular.

Num exemplo, tal administração reforça a capacidade de um sujeito para reduzir o volume de um tumor prostático e/ou tumor metastático. A titulo de exemplo, os métodos divulgados podem reduzir o volume das células do tumor prostático e/ou o volume das células do tumor metastático, de pelo menos 10%, ou de pelo menos 20% ou mais. Adicionalmente, os métodos divulgados podem resultar numa redução dos sintomas associados a um tumor prostático e/ou a um tumor prostático metastático.

As variantes divulgadas da molécula de PA podem ser administradas como uma terapia de modalidade única ou em combinação com outras terapias, tais como terapia de radiação e/ou terapias ablativas de androgénio (tais como agonistas/antagonistas de receptor LHRH, antiandrogénios, estrogénios, inibidores da sintese de esteróides adrenais cetoconazol e aminoglutetimida). Adicionalmente, a administração das variantes divulgadas da molécula de PA pode fazer-se isoladamente ou em combinação com um portador aceitável do ponto de vista farmacêutico, e/ou em combinação com outros compostos terapêuticos, como aqueles que reduzem a produção de anticorpos às variantes administradas de proteinas de PA (por exemplo Rituximab e esteróides) e outro agentes anti-tumorais. A divulgação de certos exemplos específicos não pretende excluir outras configurações. Adicionalmente, quaisquer tratamentos descritos no presente documento não excluem necessariamente outros tratamentos, mas podem ser combinados com outros agentes bioactivos ou modalidades de tratamento. 37 EXEMPLO 1

Produção de toxinas de proaerolisina activadas por PSA

Este exemplo descreve métodos usados para produzir as variantes de toxinas de proaerolisina apresentadas na Tabela 1, as quais são activadas por PSA. Um especialista compreenderá que se podem usar métodos similares para produzir outras variantes de proteínas da proaerolisina, as quais são activadas por PSA ou qualquer outra protease especifica da próstata. Tais proteínas podem ser produzidas substituindo a sequência da furina de proaerolisina por um local de clivagem de protease especifica da próstata, como uma sequência de clivagem especifica da PSA (ver Exemplo 9).

Tabela 1: Variantes da proaerolisina especificas de PSA

Mutante (SEQ N° ID) Mudança(s) efectuada(s) (SEQ N° ID) Comparação para Proaerolisina de tipo selvagem ADSKVRRARSVDGAGQGLRLEIPLD (aa 424-448 da SEQ N° ID: 2) PSA-PA KVRRAR (aa 427-432 da ADSHSSKLQSVDGAGQGLRLEIPLD 1 SEQ N° ID: 2) alterada (aa 424-448 da SEQ N° ID: (3 e 4) para HSSKLQ (5) 4) PSA-1K KVRRARSV (aa 427-434 da ADSHSSKLQSADGAGQGRLEIPLD (6 e 7) SEQ N° ID: 2) alterada (aa 424-448 da SEQ N° para HSSKLQSA (8) ID: 7) PSA-PA2 KVRRAR (aa 427-432 da ADSQF YSSNS VDG A (9 e SEQ N° ID: 2) alterada GQGLRLEIPLD 10) para QFYSSN (11) (aa 424-448 da SEQ N° ID: 10) PSA-PA3 KVRRAR (aa 427-432 da ADSGISSFQSSVDGAGQGLRLEIPLD (12 e SEQ N° ID: 2) alterada (aa 424-448 da SEQ N° ID: 38 13) para GISSFQS (14) 13)

As variantes ou modificações de proaerolisina (PA) apresentadas na Tabela 1 incluem uma sequência de proaerolisina (PA de tipo selvagem apresentada nas SEQ N° ID: 1 e 2) nas quais o local de reconhecimento da protease da furina dos seis aminoácidos (aminoácidos 427-432 da SEQ N° ID: 2) foi substituído por um substrato de PSA. Por exemplo, a variante da toxina de proaerolisina (PA) denominada PSA-PA 1 (SEQ N° ID: 3 e 4), inclui uma sequência de PA na qual o local de clivagem da furina foi substituído por um substrato de PSA HSSKLQ (SEQ N° ID: 5). 0 PCR recombinante foi usado para substituir o local da furina de aerolisina (aminoácidos 427-432 da SEQ N° ID: 2) por um local de clivagem específico de PSA (SEQ N° ID: 5, 8, 11 ou

14) usando métodos anteriormente descritos (Vallette et al., Nucl. Acids Res. 17:723-33, 1988). Resumidamente, o PCR recombinante foi executado num volume final de 50 μΐ que continha 0,2 mM desoxinucleótido trifosfato (dNTP), 0,5 μΜ de iniciadores dianteiro e reverso, 0,1 μg de DNA modelo (template) e 2,5 unidades de polimerase pfu clonada em pfu tampão da reacção [20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM KC1, 10 mM (NH4) 2S04, 2 mM MgS04,0,l% Triton X-100, e 0,1 mg/ml BSA] . O rastreio de células transformadas para inserção da proaerolisina foi executado por PCR usando polimerase Taq. Foi preparado um cocktail em tampão de reacção de PCR [50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2) e 10 mM Tris-HCl (pH 9,0)] contendo 0,2 mM dNTP, 0,5 μΜ de iniciadores dianteiro e reverso e 5 unidades de polimerase Taq. Amostras de 10 μΐ deste cocktail foram aliquotadas em tubos de 0,2 ml e foram adicionadas células transformadas usando estiletes esterilizados. 39

Os produtos de PCR finais foram digeridos usando enzimas de restrição adequados, e depois ligados no vector de clonagem pTZ18u (BioRad) para amplificação. Resumidamente, as digestões de restrição decorreram a 37°C durante 90 minutos em tampão Pharmacia One-Phor-All [10 mM Tris-acetato (pH 7,5), 10 mM Mg-acetato, e 50 mM K-acetato] contendo cerca de uma unidade de enzima de restrição por cada yg de DNA. A inserção resultante, e o DNA vector pTZl 8u, foram misturados conjuntamente num rácio aproximado de 5:1 e aquecidos a 45°C durante 15 minutos. Subsequentemente, as amostras foram diluídas em solução tampão One-Phor All e acrescentado ATP para uma concentração final de I mM para ligações de extremidade coesiva ou 0,5 mM para ligações de extremidade plana. De seguida, foram acrescentadas II unidades de T4 DNA ligase a cada amostra e amostras foram agitadas suavemente. As ligações foram feitas a 13°C durante 4 horas (ligações de extremidade coesiva) ou 16 horas (ligações de extremidade plana).

Procedeu-se ao sequenciamento do DNA para assegurar que se faziam as substituições correctas. A inserção foi subsequentemente isolada do vector de clivagem e subclonado no plasmídeo com largo espectro de hospedeiros pMMB66HE (Furste et al., Gene 48:119-131, 1986) para expressão em E. coli. Células DH5a de E. coli foram tornadas competentes usando o método de lavagem de CaCl2 anteriormente descrito (Cohen et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69:2110-4, 1972). Células na fase log (OD6oo= 0,4 - 0,7) foram recolhias por centrifugação e lavadas em 1/4 de volume de 100 mM MgCl2 frio. As células foram de novo granuladas, e resuspensas em 2 volumes de 100 mM CaCl2 frio. As células foram de seguida incubadas em gelo durante 45 minutos aproximadamente. As células foram então centrifugadas e resuspensas em 1/10 de volume de 100 mM CaCl2. A incubação prosseguiu durante mais 45 minutos antes da adição de glicerol para uma concentração final de 15%. As células competentes foram armazenadas a -70°C até utilização. 40 A transformação de plasmídeos recombinantes em células de E. coli competentes decorreu segundo a método de Inoue et al. (Gene 96: 23-8, 1990). As células competentes (alíquotas de 200 μΐ) foram incubadas com 0,5 - 10 ng de DNA durante 1 hora em gelo. As células foram então submetidas a um choque térmico a 42°C durante 4 minutos. As células foram rapidamente transferidas de volta para o gelo durante 5 minutos. Subsequentemente, adicionaram-se 500 μΐ de meio LB a cada amostra e as células foram incubadas durante 1 hora a 37°C com agitação moderada. Alíquotas (150 μΐ) foram colocadas em agar LB em placas contendo 50 pg/ml de ampicilina. Estas placas foram incubadas ON a 37°C.

Os clones de pMMB66HE recombinante foram transferidos para a estirpe CB3 de Aeromonas salmonicida (ver Buckley, Biochem. Cell. Biol. 68:221-4, 1990) por conjugação usando a técnica de acoplamento de filtros de Harayama et al. (Mol. Gen. Genet. 180:47-56, 1980). O uso desta estirpe de A. salmonicida deficitária de protease resultou na produção de variantes de proaerolisina não contaminadas por aerolisina activada e resultou na produção de grandes quantidades de proteína. A proteína final de proaerolisina foi purificada por cromatografia em hidroxiapatita e cromatografia de permuta iónica como anteriormente descrito (Buckley, Biochem. Cell. Biol. 68:221-4, 1990). Deste método resultaram preparações de proteínas da proaerolisina idênticas de lote para lote. EXEMPLO 2

Lise especifica in vitro por PSA-PAl de células produtoras de

PSA

Este exemplo descreve métodos usados para determinar a especificidade das variantes de proaerolisina descritas no Exemplo 1. Tais métodos podem ser usados para testar a 41 especificidade de qualquer variante de proaerolisina que inclua um local de clivagem especifico de PSA. A toxina PSA-PA 1 foi testada contra células LNCaP produtoras de PSA (American Type Culture Collection, Manassas, VA) e células TSU não produtoras de PSA (Dr. T. Itzumi, Teikyo University, Japão). As células foram incubadas na presença de IO”12 M a IO”6 M de toxina durante 24 horas. Subsequentemente, as células foram contadas e classificadas em relação à percentagem de células viáveis com base na capacidade de exclusão de azul Tripan. Foi determinada a concentração necessária para matar 50% de células (IC5o) para a toxina contra as duas linhagens LNCaP e TSU. A LD5o para PSA-PA1 contra células produtoras de PSA foi de 10” 10 M. Em contrapartida, contra células TSU não produtoras de PSA a LD5o foi de ~5 x 10”8 M. Este resultado demonstra que a toxina PSA-PA 1 é especificamente activada por PSA como evidenciado pela diferença de toxicidade de 500 vezes entre linhagens de células humanas cancerígenas produtoras de PSA versus não produtoras de PSA. EXEMPLO 3

PSA-PAl não é activada em sangue contendo PSA

As variantes divulgadas de péptidos da proaerolisina específicos da próstata e activados por protease, tais como os descritos no Exemplo 1, podem ser injectados intraprostaticamente (ou intratumoralmente) como terapia local para o cancro da próstata. A toxina pode também ser injectada por via intravenosa (ou intramuscular) como terapia sistémica para cancro da próstata metastático. As variantes da molécula de PA que incluem um local de PSA não devem ser activadas no sangue, porque o PSA está enzimaticamente inactivado no sangue devido à presença de um grande excesso molar de inibidores de 42 serina protease tais como αι-antiquimotripsina e oí2- macroglobulina.

Para testar a activação não específica de PSA-PA1 por outras serinas protease e PSA no soro humano, foi executado o seguinte ensaio de hemólise sensível. Adicionaram-se glóbulos vermelhos (RBC, de "red blood cell", 2% v/v) a plasma ou solução tampão contendo toxina PSA-PA 1 ± PSA. A extensão da hemólise foi testada medindo a libertação de hemoglobina para o sobrenadante. A adição de 0,1% de Triton resulta em 100% de hemólise em alguns segundos e foi usada como controlo positivo. A quantidade de hidrólise exprimiu-se como um rácio entre a absorvância da amostra a 540 nm e a absorvância da amostra tratada com Triton. A pré-incubação da toxina PSA-PA 1 (10“8 M) com PSA unicamente em solução tampão aquosa durante 1 hora antes de adicionar os RBC resultou numa hemólise de ~ 45% (FIG. 2) .

Para determinar se a PSA-PA 1 se activa no plasma humano, a toxina PSA-PA 1 (10 —8 M) foi incubada em plasma humano a 50% durante 1 hora. Numa experiência associada, começou por se adicionar excesso de PSA (10.000 ng/ml) ao plasma humano, que se deixou incubar várias horas. O plasma contendo PSA-PAI ± PSA foi então incubado com RBC humano (2% v/v) . A adição de PSA-PA 1 ao plasma humano, ou plasma humano marcado com elevada concentração de PSA, não resultou em qualquer hemólise apreciável (ou seja, <1% do controlo de Triton) (FIG. 2) . Estes resultados demonstram que é possível administrar PSA-PA1 sistemicamente sem qualquer activação significativa no sangue, mesmo que o sangue contenha PSA mensurável. 43 EXEMPLO 4

Toxicidade in vitro e in vivo de variantes da proaerolisina

Este exemplo descreve métodos usados para determinar a toxicidade in vitro e in vivo das variantes de proaerolisina modificadas divulgadas. Tais métodos podem ser usados para medir a toxicidade de qualquer proteina de variante de proaerolisina clivável por protease especifica da próstata.

Para determinar a toxicidade in vitro, executou-se o seguinte ensaio de viabilidade celular. Células de linfoma células-T de rato E14 (ATCC TIB-39) foram cultivadas em 10+5 células por poço em MTS/PMS Cell Titer 96 (Promega). Foram adicionadas variantes de proaerolisina a 1 x ΙΟ-13 Μ- 1 x 10~7 M como se mostra na FIG. 3, e incubadas com as células durante 4 horas a 37°C. A viabilidade celular foi subsequentemente determinada por leitura da placa num leitor de placa, seguindo as indicações do fabricante do kit de MTS/PMS. Como se vê na FIG. 3, as variantes da proaerolisina são menos tóxicas do que a proaerolisina de tipo selvagem, com um LC50 de 4 x 1CT9 (PSA-PA 1), 1 x 10‘9 (PSA-1K), e 1 x 10“7 (PSA-PA2), em contraste com um LC5o de 1,5 x 10‘10 para o tipo selvagem.

Para determinar a toxicidade in vivo, as variantes de proaerolisina foram administrados a ratos por via intravenosa. A proaerolisina de tipo selvagem (SEQ N° ID: 2) revelou-se altamente tóxica para os ratos; uma dose de 1 pg provocou a morte decorrida uma hora e a LDioo a 24 horas (ou seja, a dose que mata 100% dos animais decorridas 24 horas) na sequência de uma única injecção IV foi de 0,1 pg. Em contraste, a LDioo de PSA-PA1 (SEQ N° ID: 4) nas 24 horas pós injecção foi 25 vezes superior (ou seja, dose total de 2,5 pg). 44 EXEMPLO 5

PSA-PAl reduz volume de células tumorais secretoras de PSA

Com base nos dados de toxicidade descritos no Exemplo 4, a uma série de ratos portadores de LNCaP (xeno enxertos de cancro da próstata de LNCaP humanos que produzem PSA) e a uma série de ratos portadores de SN12C (ratos de controlo com um xeno enxerto de carcinoma renal humano que não produz PSA) foi administrada uma única injecção intratumoral de 100 μΐ de 0,25 - 25 yg PSA-PAl (0,1-10 vezes a dose LDioo) · 48 horas após a injecção, os tumores foram recolhidos, fixados e corados com H&E, e para Ki-67 (índice proliferativo) e Tunel (índice apoptótico). A percentagem de tumor dentro da amostra foi determinada calculando o rácio entre as áreas de tumor viável e de tumor total na sequência da análise de imagens de finas secções do tumor.

Como se mostra na FIG. 4, a administração de 2,5 -25 yg de PSA-PA 1, reduz o volume das células tumorais de 85-99%, enquanto uma redução <20% foi observada a 0,25 yg de PSA-PA 1. Em contrapartida, quando os ratos portadores de xeno enxertos de carcinoma renal humano SN12C não produtores de PSA (células apresentadas pelo Dr. Isaiah Fidler Anderson Câncer Center, Houston TX) , foram injectados por via intratumoral com PSA-PA 1, não se observou qualquer redução significativa (ou seja, <25%) na percentagem de tumor viável no mesmo intervalo de doses (FIG. 4) .

Em tumores de controlo (ratos SN12C), o índice proliferativo foi de ~ 40% decorridas 48 horas sobre a administração intratumoral de PSA-PA 1. Em contrapartida, nos tumores que responderam ao tratamento com PSA-PA 1, a percentagem de células positivas de Ki-67 foi <1% em 48 horas.

Adicionalmente, nos tumores de controlo o índice apoptótico foi <1% decorridas 48 horas sobre a administração intratumoral de PSA-PA 1, enquanto nos tumores tratados com PSA-PAl todas 45 as células eram positivas às 48 horas (ou seja, índice apoptótico >99%).

Estes resultados demonstram que a toxina PSA-PA 1 mata eficiente e rapidamente as células produtoras de PSA e esta citotoxicidade in vivo é específica e depende da presença de PSA existente no fluido extracelular dos tumores. EXEMPLO 6

Direccionar a protoxina através de domínios de ligação específicos da próstata

Este exemplo descreve métodos para produzir e utilizar variantes de toxinas da proaerolisina específicas da próstata activadas por protease nas quais o domínio de ligação da PA de tipo selvagem (ou original) (aproximadamente os aminoácidos 1-83 da SEQ N° ID: 2) é funcionalmente substituído por um domínio de ligação específico do tecido prostático, tal como o péptido LHRH. 0 domínio de ligação original da PA pode ser funcionalmente suprimido por qualquer método conhecido na especialidade, por exemplo pro deleção dos aminoácidos 1-83 da SEQ N° ID: 2 (ou fragmentos dos mesmos, tais como 45-66) , ou por inserção de mutações que diminuem a capacidade da PA se concentrar em membranas celulares. 0 domínio de ligação da proteína N-terminal âncora de GPI da PA (aproximadamente os aminoácidos 1-83 da SEQ N° ID: 2) pode ser funcionalmente suprimido (por exemplo, por deleção dos aminoácidos 1-83 ou por inserção de mutações que tornam o domínio não funcional) sem afectar significativamente a formação de poros. Contudo, é necessário um domínio de ligação para concentrar a toxina na membrana celular. As proteínas mutantes às quais falta o domínio de ligação são citolíticas, mas apenas quando as células estão expostas a concentrações de toxinas significativamente superiores. A maior parte da toxicidade in vivo da PA de tipo selvagem e da variante 46 activada por PSA descrita acima no Exemplo 4 deve-se à ligação não especifica de proteínas de âncora de GPA expressa pela maior parre das células de mamiferos. Para produzir uma protoxina mais especifica e menos tóxica sistemicamente, o dominio de ligação não especifica da proteína de âncora de GPI da proaerolisina pode ser funcionalmente suprimido e substituído por um domínio de ligação específico do tecido prostático.

Anticorpos

Um exemplo de meio ligante que pode ser usado para identificar uma proteína da proaerolisina modificada com alta especificidade para o tecido prostático é uma proteína de fusão que inclui um anticorpo de cadeia singular para a proteína da membrana específica da próstata, e anticorpos que reconhecem domínio de PSMA ou LHRH fundido nos domínios da toxina. De um ponto de vista ideal, a fixação do anticorpo a uma molécula de PA modificada não interfere significativamente com a capacidade da molécula para se ligar a, e concentrar numa, membrana celular, resultando na morte da célula. Os anticorpos podem fixar-se aos terminais N- ou C- de uma PA modificada usando métodos de fusão de genes bem conhecidos na especialidade (ver, por exemplo, Debinski and Pastan, Clin. Câncer Res. 1:1015-22, 1995). O anticorpo pode, por exemplo, substituir o lobo pequeno original de proaerolisina (aminoácidos 1-83 da SEQ N° ID: 2), ou o anticorpo pode ser adicionado à molécula da PA com mutações no domínio de ligação original. Uma tal proaerolisina modificada pode também incluir uma sequência de activação de PSA para aumentar a especificidade. Num exemplo, o anticorpo é um anticorpo de cadeia singular para PSMA fundido nos domínios da toxina de PA.

Em alternativa, os anticorpos ou fragmentos de FAB podem fixar-se a uma PA modificada por reticulação covalente (ver, por exemplo, Woo et al., Arch. Pharm. Res. 22(5):459-63, 1999 47 e Debinski and Pastan, Clin. Câncer Res. 1(9): 1015-22, 1995). A reticulação pode ser não específica, usando por exemplo um agente reticulante homobifuncional reactivo da lisina, ou pode ser específico, usando por exemplo um agente reticulante que reage com grupos amino no anticorpo e com cisteína localizada na variante de proaerolisina (tais como aminoácidos Cysl9, Cys7 5, Cysl59, e/ou Cysl64 da SEQ N° ID: 2) .

Ligandos

Outros meios ligantes que podem ser usados são pequenos ligandos péptidos que se ligam ao seu receptor correlacionado expresso na membrana das células prostáticas cancerígenas. Entre vários exemplos podemos referir a hormona libertadora da hormona luteinizante (LHRH) de origem natural e sintética, péptidos agonistas (ver, por exemplo, Genbank Accession N°. CAA25526 e SEQ N° ID: 22 e 23), que se ligam com elevada afinidade a receptores de LHRH, e péptidos que se podem ligar selectivamente a PMSA. Os receptores de LHRH são expressos por uma elevada percentagem de cancros prostáticos humanos, mas não por células hematopoiéticas. Esta expressão diferencial é responsável pela especificidade ligante. É conhecido que alguns resíduos de LHRH, tais como o Gly na 6a posição (Gly6), podem ser substituídos sem comprometer a afinidade ligante do receptor (Janaky et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:972-6, 1992; Nechushtan et al. J. Biol. Chem., 272:11597-603, 1997). Por conseguinte, pode ser produzida uma toxina de variante da PA (na qual o domínio de ligação original é funcionalmente suprimido) a qual estabelece uma ligação covalente com a LHRH D-Lys6 purificada (na amina épsilon desta lisina). LHRH D-Lys6 (SEQ N° ID: 23) pode fixar-se a várias porções de uma proteína de proaerolisina modificada com um domínio de ligação suprimido funcionalmente. Idealmente, contudo, tal colocação não interfere significativamente com a capacidade da 48 toxina se inserir na membrana para formar um poro. Por exemplo, a amina épsilon do análogo de D-Lys6 pode ligar-se ao terminal amino da proaerolisina modificada por via de um ligante de ácido dicarboxilico. A clivagem pela furina ou uma protease especifica da próstata (dependendo de qual o local de clivagem que está presente no péptido da proaerolisina) resulta na libertação da fracção inibidora do terminal C-enquanto a toxina permanece ligada ao receptor LHRH.

Em alternativa ou adicionalmente, a amina épsilon do análogo D-Lys6 de LHRH pode ligar-se directamente ao carboxilo do terminal C- da proaerolisina modificada à qual falta um dominio de ligação de tipo selvagem funcional, pela adição de um Cys ao terminal C- da PA modificada, reticulando depois este Cys à amina épsilon do análogo D-Lys6 de LHRH. Esta ligação produz uma proteina de PA derivada na qual o péptido de LHRH se fixa ao dominio inibidor do terminal C- de PA. A clivagem pela furina ou por uma protease especifica da próstata, tal como PSA, liberta a toxina e deixa o fragmento inibidor ligado ao receptor de LHRH. Por conseguinte, a formação de poros não deve ser inibida pela firme ligação ao receptor. Além disto, é possível produzir proteínas de fusão recombinante nas quais péptidos de LHRH modificada se fundem nos terminais N- e C- da toxina de PA modificada à qual falta um domínio de ligação original funcional.

Noutros exemplos, um resíduo de cisteína é introduzido na 6a posição do péptido de LHRH e o péptido fixa-se às toxinas da PA modificada por via de uma ponte dissulfureto, por exemplo nos aminoácidos 215 e/ou 300 da SEQ N° ID: 2, na qual os aminoácidos 215 e/ou 300 sofreram uma mutação para uma cisteína. Num outro exemplo, é produzida uma proteína recombinante na qual o péptido de LHRH se funde nos terminais amino da toxina de PA modificada.

As proteínas da proaerolisina modificada resultantes as quais incluem um domínio de ligação específico do tecido prostático 49 funcionalmente substituído para o domínio de ligação da PA original, são testadas in vitro e in vivo em termos de especificidade de ligação e activação de toxinas, usando os métodos descritos nos Exemplos 1-5.

Para demonstrar que domínios de ligação específicos do tecido prostático, tais como LHRH ou PSMA, podem ser funcionalmente substituídos pelo domínio de ligação da PA original, façam-se as seguintes experiências. Os métodos abaixo enumerados descrevem o uso de uma molécula na qual o domínio de ligação da PA original foi suprimido, e a LHRH ligada à proaerolisina resultante. Todavia, é possível usar métodos similares para testar qualquer variante da molécula de PA, tais como moléculas nas quais se usam outros domínios de ligação específicos do tecido prostático, e onde o domínio de ligação da PA sofre uma mutação (por exemplo, pela inserção de uma ou mais das seguintes mutações: W45A, I47E, M57A, Y61A, K66Q, e W324A) em vez de uma deleção. São produzidas proteínas de LHRH-proaerolisina contendo a sequência de activação original de furina da PA. Compara-se a especificidade de ligação destas toxinas às células positivas (LNCaP) e negativas (TSU) do receptor de LHRH usando métodos descritos no Exemplo 2. Ambas as linhagens celulares activam a PA de tipo selvagem, contendo um local de activação da furina. Por conseguinte, enquanto cada linhagem pode activar as proteínas de LHRH-proaerolisina, o péptido ideal é aquele que é tóxico a baixas concentrações para as células positivas do receptor de LHRH. Usando estes métodos, são identificadas regiões da proaerolisina às quais o péptido de LHRH se pode fixar sem interferir com a formação de canais pela toxina.

Para demonstrar que as proteínas de LHRH-proaerolisina se ligam ao receptor de LHRH e são activadas por PSA, produzem-se toxinas que contêm um local de activação por PSA em vez do

local de furina usando os métodos descritos no Exemplo 1. A activação destas toxinas por células LNCaP produtoras de PSA, 50 LHRH positivo, é comparada com a activação por células TSU não produtoras de PSA LHRH receptor negative, usando os métodos descritos no Exemplo 2.

As toxinas de proaerolisina activada por LHRH-PSA são testadas in vivo para demonstrar que a introdução do meio ligante de LHRH resulta na diminuição da toxicidade não especifica e no aumento da capacidade de direccionamento. Como se descreve acima, determina-se a LDioodestas toxinas na sequência de uma única injecçao intravenosa e compara-se com a correspondente toxina não contendo LHRH, activada por PSA, usando os métodos descritos no Exemplo 4. Subsequentemente, a toxina é administrada em doses variáveis, tais como 0,1 yg a 1 mg, por via intravenosa a animais portadores de LNCaP para demonstrar que se observa um efeito anti-tumoral melhorado em doses da toxina mais elevadas e menos tóxicas. 51 EXEMPLO 7

Determinação da antigenicidade da proaerolisina

Este exemplo apresenta métodos para determinar se os péptidos da proaerolisina modificada aqui divulgados são antigénicos. Adicionalmente, divulgam-se métodos para reduzir a antigenicidade potencial.

Como se descreve nos Exemplos acima, a injecção intratumoral de PSA-PA1 (SEQ N° ID: 4) demonstra a utilidade da toxina como terapia para o cancro da próstata localizado por via de injecção intraprostática. Contudo, uma tal terapia pode também ser administrada por outras vias, como por exemplo intravenosa (iv), intramuscular, oral, etc., como terapia sistémica para o cancro da próstata metastático. Contudo, a administração sistémica das variantes de péptidos da PA aqui divulgadas pode resultar no desenvolvimento de uma resposta de anticorpos de neutralização susceptivel de limitar dosagens repetidas. A cinética e a magnitude da resposta dos anticorpos a qualquer uma das variantes de PA aqui divulgadas podem ser determinadas

como segue. Por exemplo, a resposta antigénica a PSA-PA 1 (SEQ N° ID: 4) pode ser determinada em ratos imunocompetentes, para desenvolver um regime de dosagem que possa ser utilizado num humano imunocompetente. A ratos imunocompetentes (C57-BL6) são administradas doses iv de PSA-PA1 (SEQ N° ID: 5) quer diariamente x 5 que semanalmente x 3 num intervalo de dosagem entre 0,1 yg e 5 yg. Os ratos foram sacrificados em intervalos variáveis (por exemplo, na sequência de uma dose única, na sequência de doses múltiplas) sendo obtido soro. Pode recorrer-se a um ensaio baseado no ELISA para detectar a presença de anticorpos anti-proaerolisina. Neste ensaio, uma quantidade definida de proaerolisina é fixada à superfície de polistireno em placas de 96 poços. Subsequente ao bloqueio com seroalbumina bovina (BSA, de "bovine serum albumin"), acrescenta-se aos poços soro de ratos exposto à proaerolisina em diluições variáveis. Após um período de tempo definido para 52 a incubação, os poços são lavados, e adiciona-se um anticorpo secundário de cabra-anti-rato conjugado com fosfatase alcalina, seguido de um substrato. Determina-se a guantidade de anticorpo presente medindo a absorvância num espectrofotómetro, o que permite determinar a evolução temporal e a magnitude da resposta do anticorpo fazendo variar os programas e as doses de PSA-PA 1 iv.

Para diminuir a antigenicidade da proaerolisina, o domínio de ligação original pode ser funcionalmente suprimido e substituído, por exemplo, por LHRH, como se descreve no Exemplo 6. A antigenicidade de tais péptidos pode ser determinada na sequência da exposição a programas variáveis de proteínas de LHRH-proaerolisina às quais faltam porções do domínio de ligação original usando os métodos acima descritos. Um outro método que se pode utilizar para permitir o tratamento continuado com toxinas específicas da próstata e activadas por protease consiste em usar toxinas líticas alternativas com antigenicidade não sobreposta (ver Exemplo 10). Um exemplo consiste em usar uma toxina bacteriana modificada, estruturalmente relacionada, como a alfa toxina Clostridium septicum que também pode ser activada por uma protease específica da próstata, como PSA, mas que não é reconhecida ou neutralizada por anticorpos que reconhecem a PA (ver Exemplo 10). Um outro exemplo consiste em usar uma toxina formadora de poros produzida por tecidos humanos, tal como perforina humana produzida por células T humanas citolíticas. As perforinas modificadas nas quais a sequência de activação de tipo selvagem é substituída por péptidos que são substratos para proteases específicas da próstata, tais como PSA, podem ser administradas e não produzir uma resposta de anticorpos pelo facto de as proteínas serem de origem humana.

Adicionalmente, apresentam-se métodos para determinar se o anticorpo produzido pode neutralizar as propriedades citolíticas da aerolisina. Uma PA modificada divulgada (tal 53 como SEQ N° ID: 4, 24 e 25) é incubada com PSA para activar a toxina. A toxina activada é incubada soro contendo anticorpos em doses variáveis. Adicionam-se RBC lavados para determinar o grau de hemólise versus controlo (toxina não exposta a soro) como se descreve no Exemplo 2.

Adicionalmente, animais portadores de tumor produtor de PSA podem ser inoculados duas vezes com toxinas de proaerolisina activada por PSA, e depois inoculado de novo com uma dose letal de toxina (ver Exemplo 4) para determinar se o anticorpo neutraliza a toxicidade in vivo. Subsequentemente, avalia-se a resposta antitumoral que se segue à injecção intratumoral de animais vacinados, para determinar se os anticorpos neutralizam a toxina quando injectados intratumoralmente. EXEMPLO 8

Indução de uma resposta imunoestimulante sistémica

Este exemplo apresenta métodos que podem ser usados para demonstrar que a lise celular mediada pela proaerolisina produz um efeito imunoestimulante sistémico. Um tal efeito imunoestimulante sistémico resultante de uma administração intraprostática das toxinas aqui divulgadas pode constituir uma terapia local para o cancro prostático no interior da próstata, induzindo simultaneamente um efeito antitumoral sistémico contra uma doença micrometastática oculta. Em alternativa ou adicionalmente, os sujeitos podem ser vacinados com células prostáticas cancerígenas lisadas pelas proaerolisina modificada na presença ou na ausência de citoquinas, como GMCSF, para tratar uma doença metastática inicial ou recorrente.

Administração de células prostáticas tumorais lisadas com proaerolisina modificada 54

Para demonstrar que células tratadas com proaerolisina modificada estimulam uma resposta imunitária sistémica num sujeito, é possível usar os seguintes métodos. Resumidamente, a sujeitos (tais como ratos ou um sujeito humano imunocompetente com cancro da próstata) são administradas células prostáticas tumorais (tais como células prostáticas tumorais de rato TC2, células prostáticas cancerígenas obtidas do sujeito com cancro da próstata, e/ou linhagens de células prostáticas humanas cancerígenas para administração a doentes) as quais foram lisadas com uma ou mais moléculas modificadas de proaerolisina aqui divulgadas. Para determinar se ocorre ou não uma resposta imunitária sistémica, ratos administrados com células prostáticas cancerígenas lisadas podem ser inoculados de novo com as mesmas células sendo medido o crescimento destas células tumorais inoculadas. Por exemplo, os ratos C57-BL6 foram injectados subcutaneamente com células TC2 lisadas de proaerolisina. Para o conseguir, 107 células TC2 são lisadas por incubação com proaerolisina durante 1 hora a 37°C em solução salina tamponada de fosfato (PBS) esterilizada. Aos animais são administradas duas injecções por semana deste lisado celular para estimular uma resposta imunitária às células TC2. Os animais são subsequentemente inoculados de novo com uma injecção subcutânea de células cancerígenas TC2 uma semana após a segunda inoculação de lisado. TC2 é uma linhagem celular de cancro da próstata de rato derivada de tecido canceroso isolado de um rato TRAMP (Foster et al, Câncer Res. 57:3325-30, 1997). Os sujeitos de controlo recebem um número similar de células que foram lisadas por congelamento e descongelamento, ou tratadas com radiação para indução de apoptose. Um outro grupo de controlo recebe apenas o péptido de proaerolisina modificado. O crescimento do tumor é comparado entre os grupos usando os métodos descritos no Exemplo 5.

Para sujeitos humanos, as células prostáticas cancerígenas podem ser obtidas do doente no momento da prostatectomia ou 55 biopsia, ou é possível usar linhagens de células prostáticas cancerígenas. Exemplos de linhagens de células prostáticas cancerígenas de humanos incluem células LNCaP produtoras de PSA (como ATTC N°s. CRL-1740 e CRL-10995) ou CWR22R (ATCC N° . CRL-2505 e Nagabhushan et al, Câncer Res. 56(13):3042-6,1996), ou PC-3 não produtoras de PSA (ATCC N° . CRL-1435) e DU 145 (ATCC N°. HTB-81). Aproximadamente 107-108 células de ambas as origens (doente ou linhagens celulares) são incubadas com 1 pg de PA (de tipo selvagem ou variante) durante 1 hora a 37°C em PBS esterilizado. O lisado resultante é cuidadosamente misturado com pipetação vigorosa, e a suspensão é administrada a um sujeito por injecção subcutânea de ~0,5 ml. Os doentes podem ser tratados semanalmente com 3 doses. Os doentes são rigorosamente monitorizados com exames físicos semanais. A resposta imunitária à PA subcutânea pode ser monitorizada avaliando a presença de anticorpos para PSA, PSMA, e hK2, e avaliando a resposta às células B e T recorrendo a metodologia anteriormente descrita (Simons et ai. Câncer Res. 59:5160-8, 1999).

Em alternativa ou adicionalmente, as células prostáticas cancerígenas de um doente ou as linhagens de células prostáticas cancerígenas fabricadas para exprimir proteínas imunoestimulantes (tais como GM-CSF) são incubadas com PA (de tipo selvagem ou variante) e usadas para produzir o lisado (ver, por exemplo, Simons et al. Câncer Res. 59:5160-8, 1999). As células prostáticas cancerígenas lisadas com PA podem ser co-administradas com células prostáticas cancerígenas irradiadas produzindo moléculas imunoestimulantes. A irradiação induz a apoptose nas células. É expectável que a combinação das células mortas por citólises e das células mortas por indução de apoptose produza efeitos imunoestimulantes superiores (Sauter et ai. J. Exp. Med. 191:423-33, 2000). Num exemplo, a um sujeito são co-administradas células prostáticas cancerígenas lisadas com PA misturadas com proteína imunoestimulante. Num outro exemplo, 56

PA são células prostáticas cancerígenas Usadas com administradas subcutaneamente, e é sistemicamente administrada um proteína imunoestimulante, tal como GM-CSF, interleucinas, interferões, G-CSF (Dranoff et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:3539-43, 1993)

Administração intraprostática de proaerolisina modificada

Um outro método que pode ser usado para estimular uma resposta imunitária sistémica num sujeito com cancro da próstata consiste em administrar as toxinas da proaerolisina modificada aqui divulgadas directamente na próstata do sujeito. Por exemplo, as toxinas da proaerolisina modificada podem ser administradas directamente na próstata (ou no próprio tumor) de um sujeito humano com um tumor prostático, ou em ratos ProHA transgénicos seguida de uma transferência adoptiva de células T preparadas com hemaglutinina (HA) . É expectável que a citólise que se segue à injecção intraprostática das toxinas da proaerolisina modificada provoque uma resposta imunitária à HA na próstata dos ratos ProHA, ou aos antigénios do tumor prostático em humanos. Os ratos transgénicos ProHA expressam a proteína HÁ influenza sob o controlo do promotor de probasina restringido à próstata. Os ratos ProHA expressam HA apenas na próstata. Neste sistema, as células T específicas de CD4 e CD8 provenientes de ratos dadores separados são preparadas por exposição a HA e depois transferidos adoptivamente para o animal transgénico HA.

Aos sujeitos é administrada uma dose intraprostática subletal de proaerolisina modificada (por exemplo, definida usando os

métodos descritos no Exemplo 4) . Pelo facto de os ratos ProHA não produzirem PSA ou um homólogo equivalente do ponto de vista enzimático, usa-se a aerolisina de tipo selvagem. Aos humanos, contudo, administra-se uma ou mais das toxinas da proaerolisina modificada divulgada. 24 horas após a injecção intraprostática, alguns ratos são sacrificados sendo-lhes retirada a próstata e analisado o grau de necrose. Um segundo 57 grupo de ratos injectados recebe células T CD4 e CD8 específicas de HA, que foram colhidas de dadores transgénicos TCR inoculados com 109 pfu de hemaglutinina recombinante expressando o vírus vaccinia como anteriormente descrito (Staveley-0'Carroll et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:1178-83, 1998). Estas células T são Thy 1.1+ e são transferidas para os ratos ProHA que são Thy 1.2+. Quatro dias após a transferência adoptiva para os ratos ProHA tratados com proaerolisina, os ratos receptores são sacrificados, e os nódulos de drenagem do baço, das axilas (irrelevantes) e da próstata são dissecados, dissociados e lavados.

Para avaliar a activação de células T específicas, podem executar-se os seguintes ensaios: Um milhão de células isoladas foram marcadas usando um anticorpo anti Thy 1.1 marcado com Ficoeritrina e anticorpo antiCD4 ou CD8 marcado com Cy-chrome (Pharmingen, San Diego, CA) . As células isoladas são analisadas usando FacsScan (Becton Dickinson). 0 índice de expansão de células T específicas de HA é calculado dividindo a percentagem de células clonotípicas (Thy 1.1+) nos animais ProHA tratados pela percentagem de células clonotípicas numa localização de tecido idêntico em controlos de ProHA não tratados. Adicionalmente, a relação entre a percentagem de células clonotípicas nos nódulos de drenagem da próstata versus nódulos linfáticos irrelevantes permite obter um índice de proliferação específico da próstata subsequente ao tratamento de PA. Num outro ensaio, mede-se a proliferação específica de antigénios tal como descrito anteriormente (Adler et al. J. Exp. Med. 187: 1555-64, 1998). Resumidamente, linfócitos ou esplenócitos HA agregados são incubados com péptido de HA de classe II (proliferação específica de células CD4) ou péptido de HA de classe I (proliferação específica de células CD8) . As células são cultivadas durante três dias e depois pulsadas durante a noite com timidina tritiada seguida de colheita e determinação de contagens. Aumento de contagens 58 incorporadas em relação ao controlo significa activação de células T especificas.

As próstatas dos ratos ProHA tratados com PA que receberam HA specific Thyl .1 T cells são analisadas do seguinte modo. Secções fixas da próstata de ratos tratados são marcadas com anticorpo Thy 1.1 biotinilado (Pharmingen) e contramarcados com estreptavidina peroxidase usando procedimentos imuno-histoquímicos padrão. Para determinar a extensão da estimulação, compara-se o grau de marcação positiva com controlos tratados com soro fisiológico.

Para avaliar se a proaerolisina intraprostática pode influenciar o desenvolvimento, crescimento ou modelo de propagação subsequente do tumor, podem usar-se os seguintes métodos. A proaerolisina (ou os péptidos da proaerolisina modificada aqui divulgados) pode ser injectada na próstata de ratos TRAMP em diferentes momentos do ciclo de vida dos animais (pré-pubescente, pós-pubescente antes da doença metastática, com doença metastática). Os animais anestesiados são injectados intraprostaticamente em condições de esterilização. Em vários momentos subsequentes à inoculação intraprostática, os animais são sacrificados e é-lhes efectuada uma necropsia para avaliar a extensão do tumor. As próstatas são removidas e realiza-se uma análise imuno-histoquimica para avaliar a presença de lesões precursoras e cancro da próstata explicito. De igual modo, animais TRAMP pré-pubescente podem receber duas vezes por via subcutânea células TC2 lisadas de proaerolisina ou tumores primários lisados de proaerolisina removidos de ratos TRAMP portadores de cancro em última fase. Estes animais são acompanhados e sacrificados em momentos definidos para avaliar a evolução temporal e a magnitude do desenvolvimento do tumor em comparação com os controlos.

Uma abordagem similar pode ser usada para administrar PA modificada a doentes com cancro da próstata localizado. Tal 59 terapia intraprostática de PA modificada pode ser usada como tratamento inicial para cancro da próstata localizado, só ou em combinação com radiação (feixe externo ou braquiterapia) e/ou terapia de ablação de androgénio. A terapia intraprostática de PA modificada pode também ser administrada a doentes que tenham falhado a terapia de radiação e sejam suspeitos de apenas terem uma recorrência local de cancro da próstata no interior da próstata. A terapia intraprostática de PA modificada pode também ser dada a doentes com cancro da próstata metastático e localizado para tratar directamente o cancro localizado e para tratar o cancro metastático por via da estimulação de uma resposta imunitária anti-tumoral sistémica.

Para produzir a terapia intraprostática de PA modificada, injecta-se a PA modificada na próstata de doentes em conformidade com um modelo predefinido similar ao usado para administrar a braquiterapia intraprostática. As técnicas e o equipamento necessários para a administração intraprostática são de igual modo similares aos que se usam na braquiterapia e foram objecto de descrição anterior (Deweese et al, Câncer Res. 61:7464-72, 2001). Para determinar a dose adequada a

administrar intraprostaticamente, leva-se a efeito um ensaio clinico para determinar a posologia. Os doentes recebem múltiplas injecções (20-80) em locais predefinidos de modo a abranger toda a próstata. A dose total administrada de PA modificada varia entre cerca de 0,1 - 1,0 mg, e não mais de 10 mg no total. A dose por injecção é determinada dividindo a dose total pelo número total de injecções. Os doentes são tratados como doentes internos e monitorizados no hospital durante 48 horas após a injecção. Subsequentemente, os doentes são examinados semanalmente para detectar sinais de toxicidade. Pode usar-se MR1 da próstata para monitorizar o efeito directo do tratamento no tamanho da próstata. A resposta imunitária à PA intraprostática é monitorizada como 60 anteriormente descrito (Simons et al. Câncer Res. 59:5160- 8,1999) . EXEMPLO 9

Locais de clivagem adicionais de PSA São conhecidos locais de clivagem adicionais de PSA, com base no mapa de clivagem de PSA de proteínas seminais humanas semenogelina I e II, e num ensaio baseado numa membrana de celulose (ver Tabela 2 e Denmeade et al., Câncer Res., 57:4924-30, 1997). Os locais de clivagem da PSA apresentados na Tabela 2 podem substituir o local de activação da protease furina de tipo selvagem da proaerolisina (aminoácidos 427-432 da SEQ N° ID: 2), usando os métodos descritos no Exemplo 1. Resumidamente, o PCR recombinante pode ser usado para substituir o local da furina de PA com um local de clivagem específico de PSA, como os que são apresentados nas Tabelas 1 e 2. A sequência de variantes de PA é subclonada na pMMB66HE para expressão em E. coli. Os clones recombinantes são transferidos para uma estirpe deficitária em protease de A. salmonicida, e a variante resultante de proteína de proaerolisina purificada por cromatografia em hidroxiapatita e cromatografia de permuta iónica.

Tabela 2. Cinética da hidrólise de PSA.

Substrato de PSA (SEQ N& ID) Km (uM) Kcat (S'1) Kcat/Km ( S_1M-1) KGISSQY (15) 160 0,043 270 SRKSQQY (16) 90 0,023 260 ATKSKQH (17) 1310 0,0091 6, 9 KGLSSQC (18) 300 0,0017 5, 6 61 LGGSSQL (19) 900 0,0037 4,1 EHSSKLQ (20) 1165 0,012 10, 6 HSSKLQ (5) 470 0,011 23, 6 SKLQ (21) 813 0,020 24, 6

Os péptidos foram marcados com corante fluorescente (aminometil cumarina). Os ensaios foram executados em 50 mM Tris, 0,1 M NaCl, pH 7,8.

As sequências apresentadas na Tabela 2 incluem substratos que foram eficientemente, mas não especificamente, hidrolisados por PSA (KGISSQY; SEQ N° ID: 15) e SRKSQQY; SEQ N° ID: 16), e aqueles que não foram eficientemente, mas foram especif icamente, hidrolisados por PSA (ATKSKQH; SEQ N° ID: 17 e LGGSSQL; SEQ N° ID: 19) . As características destas toxinas modificadas podem ser comparadas com PSA-PA 1 contendo a sequência HSSKLQ (SEQ N° ID: 5) . A titulo de controlo, foi produzida uma toxina modificada na qual o local de activação foi completamente suprimido (EX-PA).

Estas toxinas purificadas foram rastreadas para hidrólise de PSA usando o ensaio de hemólise descrito no Exemplo 3. A proaerolisina de tipo selvagem não está activada ou citolitica para eritrócitos. A activação da proaerolisina por proteases, contudo, dá origem a uma hemólise rápida. Resumidamente, para ensaiar a activação de PSA, foram incubadas concentrações variáveis de variantes purificadas de toxinas de PA com PSA durante 1 hora, lavadas, sendo-lhes adicionado soro isento de glóbulos vermelhos (RBC) (2% v/v). Decorrida mais 1 hora, as misturas da incubação são centrifugadas sendo determinada a absorvância do sobrenadante a 540 nm. Determina-se a concentração mínima de toxina modificada requerida para a lise de 50% de RBC para classificar as toxinas com base na eficiência da hidrólise de PSA.

Para determinar quer a activação por PSA quer a especificidade da activação, efectuam-se ensaios de citotoxicidade expondo 62 toxinas de proaerolisina PSA purificadas a linhagens de células produtoras de PSA (LNCaP) e não produtoras de PSA (TSU) in vitro, usando os métodos descritos no Exemplo 2. A concentração necessária para matar 50% das células (IC5o) pode ser determinada para cada toxina de variante de PA contra as linhagens de LNCaP e de TSU. As diferenças na citoxicidade são usadas para classificar as toxinas activadas por PSA com base na especificidade.

As toxinas de variantes de PA podem também ser rastreadas in vivo em termos de actividade antitumoral por injecção intratumoral em xeno enxertos de LNCaP produtoras de PSA em ratos nus usando os métodos descritos no Exemplo 5. Como se descreve acima no Exemplo 5, a injecção intratumoral da toxina PSA-PA 1 diminui o tumor dentro de 48 horas. Em contrapartida, a proaerolisina, que é mais eficientemente activada pelas duas linhagens de células produtoras e não produtoras de PSA in vitro, teve um efeito minimo contra xeno enxertos de LNCaP. Isto indica que a cinética da activação da toxina pode ser importante no efeito antitumoral global. A PSA-PA 1 é activada mais especificamente por PSA, mas a cinética da activação é mais lenta do que a da toxina de tipo selvagem. Isto pode permitir à PSA-PA 1 uma distribuição mais generalizada pelo tumor. Assim sendo, melhores substratos de PSA no local de activação, paradoxalmente, podem resultar numa diminuição do efeito antitumoral global in vivo.

Para avaliar a distribuição da proaerolisina activada por PSA versus PA de tipo selvagem intratumoralmente ou em tecido normal, podem usar-se proteínas PSA-PA 1 e PA com uma marcação fluorescente (como FITC). Xeno enxertos de LNCAP produtores de PSA são injectados com PSA-PAI e PA com marcação fluorescente. Decorridas 24 horas sobre a injecção intratumoral, os tumores são colhidos, fixado e seccionados para análises ao microscópio. As proteínas de proaerolisina com marcação fluorescente que se inseriram nas membranas celulares são 63 retidas ao longo do processo de fixação. Estas lâminas são então analisadas usando um microscópio de fluorescência equipado com o conjunto adequado de filtros para determinar o grau de distribuição das toxinas de proaerolisina por todo o espécime tumoral.

Subsequentemente, toxinas de variantes de PA são injectadas em xeno enxertos de LNCaP, sendo a resposta antitumoral avaliada após 48 horas por medição do tumor, recorrendo aos métodos descritos no Exemplo 5. As toxinas de variantes de PA são classificadas com base no efeito antitumoral in vivo subsequente à injecção intratumoral. Adicionalmente, as toxinas de variantes de PA podem ser testadas quanto à toxicidade sistémica global por determinação da dose que mata 100% dos ratos (ou seja, LDioo) subsequente a uma única injecção intravenosa, usando os métodos descritos no Exemplo 4 .

Usando estes métodos, são identificadas as toxinas de variantes de PA activadas por PSA que são mais eficiente e especificamente activadas por PSA, são as menos tóxicas sistemicamente e são as que produzem o efeito antitumoral in vivo, mais pronunciado. Tais toxinas de variantes de PA activadas por PSA podem também ser modificadas usando os métodos descritos no Exemplo 6. EXEMPLO 10

Redução da antigenicidade de toxinas de proaerolisina modificada activada por PSA

Este exemplo descreve métodos adicionais que podem ser usados para produzir e caracterizar a antigenicidade e a 64 eficácia antitumoral de outras protoxinas activadas por proteases formadoras de poros modificadas.

Um método para ultrapassar a potencial antigenicidade das toxinas de variantes de PA divulgadas consiste em administrar protoxinas estruturalmente associadas que são de igual modo activadas por PSA, mas que não são reconhecidas por anticorpos de proaerolisina. Exemplos de tais protoxinas incluem, entre outras, a alfa toxina Clostridium septicum (Ballard et al., Infect. Immun. 63:340-4, 1995; Gordon et al. J. Biol. Chem. 274:27274-80, 1999; Genbank Accession N°. S75954), a delta toxina Bacillus Thuringiensis (Genbank Accession N°. D00117), e a perforina humana (Genbank Accession N°. NM005041). Embora mecanicamente similares à aerolisina, estas protoxinas apresentam diferentes sequências de péptidos de tal modo que os anticorpos específicos da proaerolisina não os reconhecem. Estas protoxinas foram clonadas, sendo produzidas formas recombinantes (Imagawa et al., FEMS. Microbiol. Lett. 17:287-92, 1994; Meza et al. FEMS Microbiol. Lett. 145:333-9, 1996).

Estas protoxinas, tal como a proaerolisina, contêm um péptido inibidor terminal C- que tem de ser removido por clivagem proteolitica para que a activação ocorra. O local de activação dentro de cada uma destas toxinas da proteína foi definido. Para a alfa toxina Clostridium septicum , o local de activação é um local de clivagem de furina (Gordon et al, Infect. Immun. 65:4130-4, 1997). O local de activação da delta toxina

Bacillus Thuringiensis é clivado por proteases no mesentério de certos insectos (Miranda et al, Insect Biochem. Mol. Biol. 31:1155-63, 2001) . Para a perforina humana, a sequência de activação foi definida mas a protease de activação não foi ainda identificada (Uellner et al, EMBOJ. 16:7287-96, 1997). O local de activação de cada uma destas protoxinas pode ser modificado para conter um local de clivagem de protease específico da próstata (como os locais de clivagem 65 apresentados nas Tabelas 1-2) usando os métodos descritos no Exemplo 1. Se desejado, o domínio de ligação da protoxina original pode ser funcionalmente suprimido e substituído por um domínio de ligação específico do tecido prostático, usando os métodos descritos no Exemplo 6. Em alternativa, o local de activação não é modificado, mas o domínio de ligação original é funcionalmente suprimido e substituído por um domínio de ligação específico de tecido prostático, usando os métodos descritos no Exemplo 6. Estas protoxinas modificadas são ensaiadas para activação de protease, usando por exemplo o ensaio de hemólise de RBC (Exemplo 3) , para actividade in

vitro contra linhagens de células produtoras de PSA e não produtoras de PSA (Exemplo 2) e estabilidade no soro humano (Exemplo 3). Se estas toxinas forem específica e eficientemente activadas por PSA, então são testadas in vivo quanto à actividade contra xeno enxertos produtores de PSA usando os métodos descritos no Exemplo 5. Adicionalmente, a cinética e a magnitude da produção de anticorpos é determinada usando os métodos descritos no Exemplo 7. 0 soro de animais tratados com cada toxina é rastreado para detecção de reactividade cruzada com cada um dos restantes membros da família de toxinas para definir o grau de reconhecimento cruzado.

Um outro método para reduzir a resposta imunitária sistémica consiste em administrar terapias imunossupressoras. Exemplos de terapias imunossupressoras incluem, entre outras, corticóides sistémicos ou tópicos (Suga et al, Ann. Thorac.

Surg. 73:1092-7, 2002), ciclosporina A (Fang et al., Hum. Gene

Ther. 6:1039-44, 1995), ciclofosfamida (Smith et al, Gene

Ther. 3:496-502, 1996), deoxispergualina (Kaplan et al., Hum.

Gene Ther. 8:1095-1104, 1997) e anticorpos para células T e/ou B [por exemplo, ligando anti-CD40, anticorpos anti CD4, anticorpo anti-CD20 (Rituximab)] (Manning et al., Hum. Gene

Ther. 9:477-85,1998). Tais agentes podem ser administrados

antes, durante ou após a administração de moléculas de PA 66 modificadas e/ou lisados de células produzidos por incubação com PA (de tipo selvagem ou variante). EXEMPLO 11

Produção de variantes de sequências

No presente documento divulgam-se agentes e métodos para tratar o cancro da próstata por administração de um péptido de proaerolisina modificada que inclui um local de clivagem de protease especifica da próstata. Os especialistas compreendem que o uso de outras sequências de proaerolisina, PSA, LHRH, e PSMA (como polimorfismos, fragmentos, ou variantes) é possível para praticar os métodos da presente divulgação, na condição de as características funcionais específicas da sequência serem mantidas. Por exemplo, as variantes de proaerolisina podem ser usadas para praticar os métodos aqui divulgados se mantiverem a sua capacidade de serem activadas por uma protease específica da próstata e formar poros nas membranas celulares, de que resulta a morte das células. Esta actividade pode ser facilmente determinada usando os ensaios aqui divulgados, por exemplo os descritos nos EXEMPLOS 2-5. Noutras configurações, as moléculas de proaerolisina modificadas possuem a característica de lisar especificamente células produtoras de PSA (por exemplo, a lise de células produtoras de PSA em maior extensão do que de células não produtoras de PSA) . A presente divulgação facilita o uso de moléculas de DNA, e deste modo de proteínas, derivadas de uma proteína original mas que diferem da sequência original na respectiva sequência precisa de nucleótidos ou aminoácidos. Tais variantes podem ser obtidas através de técnicas laboratoriais normais de biologia molecular e a informação da sequência aqui divulgada. 67

As moléculas de DNA e as sequências de nucleótidos resultantes de uma molécula de DNA original podem também se definida como sequências de DNA as quais hibridizam em condições rigorosas para as sequência de DNA divulgadas, ou fragmentos da mesmas. As condições de hibridização originam, em particular, graus de rigor variáveis consoante a natureza do método de hibridização e a composição e o comprimento do DNA de hibridização usado. Geralmente, a temperatura de hibridização e a força iónica (sobretudo a concentração de Na+) do tampão de hibridização determinam o rigor da hibridização. Os cálculos relativos às condições de hibridização necessárias para se alcançarem determinados niveis de rigor são analisados por Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989, Capitulo 9 e 11), incluídos no presente a título de referência. A hibridização com uma sonda alvo marcada com [ P]-dCTP e geralmente efectuada num solução de elevada força iónica tal como 6xSSC a uma temperatura que está cerca de 5-25°C abaixo da temperatura de fusão, Tm. Um exemplo de condições rigorosas é constituído por uma concentração de sal próxima de pelo menos 0,01 a 1,0 M de concentração de ião Na (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3 e a uma temperatura próxima de pelo menos 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleótidos). Condições rigorosas podem também ser obtidas com a adição de agentes desestabilizantes como formamida. A título de exemplo, condições de 5X SSPE (750 mM de NaCI, 50 mM de fosfato de Na, 5 mM de EDTA, pH 7,4) a 25-30°C são adequadas para hibridizações de sondas específicas de alelos. A degeneração do código genético alarga ainda mais o âmbito da presente divulgação já que possibilita maiores variações na sequência de nucleótidos de uma molécula de DNA ao mesmo tempo que mantém a sequência de aminoácidos da proteína codificada.

Por exemplo, o aminoácido Ala é codificado pelo codão tripleto de nucleótidos GCT, GCG, GCC e GCA. Deste modo, a sequência de nucleótidos pode ser alterada sem afectar a composição de 68 aminoácidos da proteína codificada ou as características da proteína. Com base da degeneração do código genético, é possível obter variantes de moléculas de DNA a partir de moléculas de cDNA usando técnicas normais de mutagénese de DNA como se descreve acima, ou por síntese de sequências de DNA. As sequências de DNA que não hibridizam em condições rigorosas para as sequências de cDNA divulgadas em virtude da variação de sequências baseada na degeneração do código genético são também incluídas na presente divulgação.

Variantes, fragmentos, fusões, e polimorfismos de PA devem reter a capacidade para a lise de células produtoras de PSA, como determinado usando os ensaios divulgados no presente (por exemplo, ver Exemplos 2 e 5). As variantes e os fragmentos das sequências divulgadas retêm pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ou mais da identidade das sequências para uma sequência de aminoácidos das proteínas e mantêm a actividade funcional da proteína como os especialistas conhecem. EXEMPLO 12

Expressão recombinante de proteínas

Com o cDNA publicamente disponível e as correspondentes sequências de aminoácidos, bem como a presente divulgação de variantes, fragmentos e fusões de PA, a expressão e purificação de qualquer proteína por técnicas laboratoriais normais é possibilitada. A proteína purificada pode ser usada para terapia em doentes. Um especialista compreenderá que as toxinas de PA modificada divulgadas podem ser produzidas em qualquer célula ou organismo de interesse, e purificadas antes da administração a um sujeito.

Os métodos para produzir proteínas recombinantes são bem conhecidos na especialidade. Por conseguinte, o âmbito da presente divulgação inclui a expressão recombinante de 69 qualquer proteína. Ver, por exemplo, a Patente dos EUA N°: 5.342.764 de Johnson et al; Patente dos EUA N°: 5.846.819 de Pausch et al; Patente dos EUA N°: 5.87 6.969 de Fleer et al. e Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,New York, 1989, Cap. 17 EXEMPLO 13

Modificações de péptidos

As proteínas de PA modificada que são activadas por uma protease específica da próstata, como o PSA, podem ser modificadas usando uma variedade de técnicas químicas para produzir derivados que possuem no essencial a mesma actividade como os péptidos modificados, e possuindo opcionalmente outras propriedades desejáveis (tais como menor antigenicidade). A título de exemplo, os grupos ácido carboxílico do péptido, com um terminal carboxilo ou uma cadeia lateral, podem ser apresentados na forma de um sal ou de um catião aceitável do ponto de vista farmacêutico ou esterifiçados para formar um éster C1-C16, ou convertidos numa amida de fórmula NRiR2 em que Ri e R2 são cada um independentemente H ou alquilo C1-C16, ou combinados para formar um anel heterocíclico, como um anel de 5- ou 6-membros. Os grupos amino do péptido, com um terminal amino ou uma cadeia lateral, pode ter a forma de um sal de adição ácida aceitável do ponto de vista farmacêutico, tal como os ácidos HC1, HBr, acético, benzóico, tolueno sulfónico, maleico, tartárico e outros sais orgânicos, ou pode ser modificado para alquil ou dialquilamina C1-C16 ou ainda convertidos numa amida.

Os grupos hidroxilo da cadeia lateral do péptido podem ser convertidos em alcoxi CiCi6 ou num éster CiCi6 usando técnicas bem conhecidas. Os anéis fenilo e fenólico da cadeia lateral do péptido podem ser substituídos por um ou mais átomos de halogénio, tais como F, Cl, Br ou I, ou com alquilo C1-C16, 70 alcoxi C1-C16, ácidos carboxílicos e ésteres do mesmo, ou amidas de tais ácidos carboxílicos. Os grupos metileno das cadeias laterais do péptido podem ser prolongadas para alquilenos C2-C4 homólogos. Os tióis podem ser protegidos com qualquer um dos vários grupos protectores bem conhecidos, tais como grupos acetamida. Os especialistas conhecem igualmente métodos para introduzir estruturas cíclicas nos péptidos aqui divulgados para seleccionar e definir restrições conf ormacionais para a estrutura de que resulta uma maior estabilidade. A titulo de exemplo, um resíduo de cisteína com terminal carboxilo ou terminal amina pode ser adicionado ao péptido, para que quando oxidado o péptido contenha uma ligação dissulfureto, gerando um péptido cíclico. Outros métodos de ciclização de péptidos incluem a formação de tioéteres e amidas com terminais carboxilo- e amino- e ésteres.

Para manter um péptido funcional, variantes particulares de péptidos diferem de um péptido de apenas um pequeno número de aminoácidos. Tais variantes podem apresentar deleções (por exemplo, de 1-3 ou mais aminoácidos) , inserções (por exemplo, de 1-3 ou mais resíduos) , ou substituições que não interferem com a desejada actividade do péptido. Variantes substitutivas são aquelas em que pelo menos um resíduo na sequência de aminoácidos foi removido sendo introduzido no seu lugar um resíduo diferente. Em configurações específicas, tais variantes possuem substituições de aminoácidos de resíduos singulares, por exemplo 1, 3, 5 ou mesmo 10 substituições numa proteína. São igualmente divulgadas no presente configurações peptidornimético e organomimético, pela qual a disposição tridimensional dos constituintes químicos de tais péptido- e organorniméticos mimetizam a disposição tridimensional da estrutura principal do péptido e as cadeias laterais dos aminoácidos componentes no péptido, resultando em tais 71 péptido- e organorniméticos de uma toxina de PA modificada que possui a capacidade para lisar células produtoras de PSA. Para aplicações modeladas em computador, um farmacóforo constitui uma definição tridimensional idealizada dos requisitos estruturais para actividade biológica. Podem ser concebidos péptido- e organorniméticos adaptáveis a cada farmacóforo com software de modelação informática corrente (usando a técnica da concepção de medicamentos por computador ou CADD [de "Computer assisted drug design"]). Consultar em Walters, "Computer-Assisted Modeling of Drugs", in Klegerman & Groves, eds., 1993, Pharmaceutical Biotechnology, Interpharm Press: Buffalo Grove, IL, pp. 165-174 e Principies of Pharmacology (ed. Munson, 1995), Capitulo 102, uma descrição das técnicas usadas no CADD. EXEMPLO 14 Métodos para expressar péptidos de proaerolisina modificada

Em alternativa (ou adicionalmente) à administração de um péptido de proaerolisina modificada para tratar o cancro da próstata, é possível obter um tratamento de longa duração ou sistémico (para, por exemplo, tratar ou evitar as metástases do tumor) expressando in vivo as toxinas da proaerolisina modificada divulgada. A presente divulgação apresenta métodos de expressar um péptido de proaerolisina modificada numa célula ou num tecido in vivo. Num exemplo, a transfecção da célula ou do tecido ocorre in vitro. Neste exemplo, a célula ou o tecido (como um enxerto) é removido de um sujeito sendo depois transfectado com um vector de expressão que contém um cDNA que codifica a proteína relevante. As células transfectadas produzem proteína funcional e podem ser reintroduzidas no sujeito. Num outro exemplo, um ácido nucleico que codifica a proteína relevante é administrado a um sujeito directamente (por via intravenosa, 72 intratumoral ou intraprostática), e a transfecção ocorre in vivo.

Os péptidos da proaerolisina modificada e os métodos aqui divulgados podem ser usados para tratar um sujeito com um tumor prostático. Um tal método reduz o volume do tumor, e em algumas configurações, evita ou trata metástases do tumor prostático.

Os procedimentos científicos e médicos necessários para a transfecção das células humanas são hoje rotineiros. A disponibilidade pública de proaerolisina, domínios de ligação, e proteína de protease específica da próstata e sequências de cDNA permite o desenvolvimento da expressão genética in vivo em humanos (e outros mamíferos) com base nestes procedimentos. Adicionalmente, variantes específicas da molécula de proaerolisina são aqui divulgadas. A imunoterapia de doentes de melanoma recorrendo a linfócitos infiltrantes do tumor (TIL) geneticamente fabricados foi reportada por Rosenberg et al. (N. Engl. J. Med. 323:570-8, 1990). Nesse estudo, usou-se um vector de retrovírus para introduzir nos TIL um gene de neomicina resistente. Uma abordagem similar pode ser usada para introduzir um péptido de proaerolisina modificada cDNA num sujeito com cancro da próstata.

Uma estratégia geral para transferir genes para células doadoras é divulgada na Patente dos EUA N° 5.529.774, aqui incluída a título de referência. Genericamente, um gene que codifica uma proteína com efeitos terapêuticos desejados é clonado num vector de expressão virai, e este vector é depois introduzido no organismo alvo. O vírus infecta as células, e produz a sequência da proteína in vivo, onde tem o seu efeito terapêutico desejado (Zabner et al. Cell 75:207-16, 1993).

Pode ser apenas necessário introduzir os elementos do DNA ou da proteína em certas células ou tecidos. Por exemplo, se o 73 sujeito tiver apenas um tumor da próstata, introduzir a proteína ou o DNA apenas na próstata (ou tumor) pode ser suficiente. Contudo, em alguns casos, pode ser mais eficaz e simples do ponto de vista terapêutico tratar todas as células de um sujeito, ou de uma forma mais abrangente disseminar o vector, por exemplo por administração intravascular (i.v.) ou oral. A título de exemplo, se um sujeito tiver um tumor da próstata metastizado, pode ser necessário introduzir sistemicamente a proteína ou o DNA. A sequência de ácidos nucleicos que codifica pelo menos um agente terapêutico, como um toxina de proaerolisina modificada, está sob controlo de um promotor adequado. Promotores adequados que podem ser usados incluem, entre outros, o promotor original do gene, promotor LTR retroviral, ou promotores adenovirais, tais como o promotor tardio principal do adenovírus; o promotor CMV; o promotor de RSV; promotores induzíveis, como o promotor de MMTV; o promotor de metalotioneína; promotores de choque térmico; o promotor de albumina; o promotor de histona; o promotor de a-actina; promotores de TK; promotores de parvovírus BI 9; e o promotor de ApoAI. Num exemplo, o promotor é um promotor específico da próstata, como um promotor de probasina. Contudo, a divulgação não está limitada a genes ou promotores estranhos específicos. 0 ácido nucleico recombinante pode ser administrado a um sujeito por qualquer método que permite ao ácido nucleico recombinante atingir as células adequadas. Estes métodos incluem injecção, infusão, deposição, implantação ou administração tópica. As injecções podem ser intradérmicas ou subcutâneas. 0 ácido nucleico recombinante pode ser administrado como parte de um vector virai, tal como vírus avipox, vírus vaccinia recombinante, estirpes de adenovírus com deficiência de replicação ou poliovírus, ou sob uma forma não infecciosa como um DNA nu ou DNA encapsulado em lipossomas, como se descreve em detalhe no EXEMPLO 15. 74 EXEMPLO 15

Vectores virais para expressão genética in vivo

Os vectores adenovirais incluem essencialmente o genoma adenoviral completo (Shenk et ai., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 111: 1-39, 1984). Em alternativa, o vector adenoviral é um vector adenoviral modificado no qual pelo menos uma porção do genoma adenoviral foi suprimida. Num exemplo, o

vector inclui um ITR 5' adenoviral; um ITR 3' adenoviral; um sinal de encapsidação adenoviral; uma sequência de DNA codificadora de um agente terapêutico; e um promotor para expressar a sequência de DNA codificadora de um agente terapêutico. 0 vector está livre de pelo menos a maioria das sequência de DNA EI e E3 adenovirais, mas não está necessariamente livre de todas as sequência de DNA E2 e E4, e das proteínas adenovirais codificadoras de sequências de DNA transcritas pelo promotor tardio principal do adenovirus. Noutro exemplo, o vector é um virus adeno-associado (AAV) tal como descrito na Patente dos EUA N°.4.797.368 (Cárter et al.) e em McLaughlin et al. (J. Virol. 62:1963-73, 1988) e AAV tipo 4 (Chiorini et al. J. Virol. 71:6823-33, 1997) e AAV tipo 5 (Chiorini et al. J. Virol. 73:1309-19, 1999).

Um tal vector pode ser construído em conformidade com as técnicas normais, usando um plasmideo shuttle que contém, a partir da extremidade 5', um 5' ITR adenoviral, um sinal de encapsidação adenoviral, e uma sequência de reforço Ela; um promotor (que pode ser um promotor adenoviral ou um promotor estranho); uma sequência lider tripartida, um local de clonagem múltipla (que pode ser tal como aqui descrito) ; um sinal poli A; e um segmento de DNA que corresponde a um segmento do genoma adenoviral. O segmento de DNA serve como substrato para recombinação homóloga com modificação ou mutação de um adenovirus, e pode abranger, por exemplo, um segmento do genoma 5' do adenovirus a uma distância não 75 superior à base da 3329 até à base 6246. 0 plasmídeo pode também incluir um marcador seleccionável e uma origem de replicação. A origem de replicação pode ser uma origem bacteriana de replicação. Uma sequência de DNA desejada que codifica um agente terapêutico pode ser inserida no local de clonagem múltipla do plasmídeo

Exemplos de vectores que podem ser usados para praticar os métodos aqui divulgados incluem, entre outros, os divulgados em: WO 95/27512 de Woo et al.; WO 01/127303 de Walsh et al. ; Patente dos EUA N°: 6.221.349 de Couto et al.; Patente dos EUA N°: 6.093.392 de High et al EXEMPLO 16

Geração e expressão de proteínas de fusão

Os métodos para produzir proteínas de fusão são bem conhecidos dos especialistas. A título de exemplo, a Patente dos EUA N°. 6.057.133 de Bauer et al. divulga métodos para proceder à fusão de moléculas constituídas por uma variante de interleucina-3 (hIL-3) humana ou proteínas mutantes funcionalmente ligada a um segundo factor de estimulação da colónia, citoquina, linfoquina, interleucina, factor de crescimento hematopoiético ou variante de IL-3. A Patente dos EUA N°. 6.072.041 de Davis et al divulga a produção de proteínas de fusão que compreendem um molécula Fv de cadeia singular direccionada contra um receptor transcitótico ligado a uma proteína terapêutica por uma ligação covalente.

Podem ser usados métodos similares para produzir proteínas de fusão que compreendem PA (ou variantes, fragmentos, etc. da mesma) ligada a outras sequências de aminoácidos, tais como um domínio de ligação específico da próstata (por exemplo LHRH ou um anticorpo). Podem ser usadas regiões de ligação para espaçar as duas porções da proteína entre si e para criar 76 flexibilidade entre elas. A região de ligação é genericamente um péptido de comprimento compreendido entre 1 e 500 aminoácidos, com por exemplo menos de 30 aminoácidos de comprimento. A ligação que une as duas moléculas pode ser concebida para (1) permitir que as duas moléculas se dobrem e funcionem independentemente uma da outra, (2) não apresentar propensão para desenvolver uma estrutura secundária ordenada susceptivel de interferir com domínios funcionais das duas proteínas, (3) apresentar uma característica hidrofóbica ou carregada mínima que possa interagir com os domínios funcionais da proteína, e (4) estabelecer uma separação estérica das duas regiões. Habitualmente, os aminoácidos da superfície nas regiões flexíveis da proteína incluem Gly, Asn e Ser. Outros aminoácidos neutros como Thr e Ala podem também ser usados na sequência de ligação. Podem ser incluídos aminoácidos adicionais na ligação pela adição de locais de restrição exclusivos na sequência de ligação para facilitar a construção das fusões. Podem também ser incluídos outros meios, se necessário. Estes podem incluir uma região ligante, tal como avidina ou um epítopo, tal como uma cauda de polihistidina, a qual pode ser útil para a purificação e o processamento da proteína de fusão. Adicionalmente, podem ser fixados marcadores detectáveis nas proteínas de fusão, para que a circulação da proteína de fusão por um organismo ou célula possa ser convenientemente monitorizada. Tais marcadores incluem radionuclídeos, enzimas, fluoróforos, e outros. A fusão das sequências de ácido nucleico de PA (ou variante, fragmento, etc. da mesma), com a sequência de ácido nucleico de outra proteína (ou variante, fragmento, etc. da mesma), pode concretizar-se pelo uso de vectores intermediários. Em alternativa, um gene pode ser directamente clonado num vector que contenha o outro gene. Podem usar-se ligantes e adaptadores para juntar as sequências de ácido nucleico, bem como substituir sequências perdidas, onde no interior da 77 região relevante havia um local de restrição. 0 material genético (DNA) que codifica um polipéptido, péptido de ligação, e o outro polipéptido é inserido num vector de expressão adequado o qual é usado para transformar células procarióticas ou eucarióticas, por exemplo bactérias, leveduras, células de insectos ou células de mamíferos. 0 organismo transformado cresce e a proteina é isolada por técnicas correntes, por exemplo usando um marcador detectável tal como cromatografia de afinidade de quelato de niquel, se se usar uma cauda de polihistidina. 0 produto resultante é, pois, uma nova proteina, uma proteina de fusão, que tem PA modificada aglutinada a uma segunda proteína por uma região ligante. Para confirmar que a proteína de fusão está expressa, a proteína purificada é submetida a electroforese em géis de SDS-poliacrilamida, e transferida para filtros de membrana de nitrocelulose usando métodos definidos. Os produtos proteicos podem ser identificados por análise Western Blot recorrendo a anticorpos dirigidos contra os componentes individuais, ou seja, cauda de polihistidina e PA. EXEMPLO 17

Composições farmacêuticas e modos de administração

Os portadores eficazes do ponto de vista farmacêutico úteis no caso presente são convencionais. Remington's Pharmaceutical Sciences, por Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15a Edição (1975), descreve composições e formulações adequadas para administração farmacêutica.

Administração de péptidos

Numa configuração na qual uma toxina de PA modificada, como a das SEQ N° ID: 4, 24 e 25, é administrada a um sujeito, a proteína é aplicada por qualquer via conhecida dos especialistas. Entre os exemplos apontados contam-se: 78 intravenosa, intratumoral, oral, intraprostática, intramuscular, injecção subcutânea, transdérmica, etc. A presente divulgação apresenta igualmente composições farmacêuticas que incluem uma quantidade com eficácia terapêutica de uma toxina de PA modificada sozinha ou com um portador aceitável do ponto de vista farmacêutico. Adicionalmente, as composições farmacêuticas ou métodos de tratamento podem ser administrados em combinação (ou separadamente) com outro (s) tratamento(s) terapêutico (s). Exemplos de outras terapias incluem, entre outros, agentes antitumorais, células lisadas (como as produzidas por incubação com uma toxina de PA modificada), células não lisadas (como as que foram mortas por radiação), imunossupressores (como o Rituximab, esteróides), e/ou citoquinas (como GM-CSF). Podem ser preparadas configurações da divulgação, incluindo medicamentos, com portadores convencionais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, adjuvantes e contra-iões já conhecidos dos especialistas. A toxina de PA modificada pode ser administrada em combinação com pelo menos um, podendo ser mais do que um, portador eficaz do ponto de vista farmacêutico, como um fluido aceitável do ponto de vista farmacêutico e fisiológico. Exemplos de portadores eficazes do ponto de vista farmacêutico incluem, entre outros, água, soro fisiológico, soluções salinas equilibradas, dextrose aquosa, óleo de sésamo, glicerol, etanol, combinações dos mesmos, ou semelhantes, como um veiculo. 0 portador e a composição podem ser esterilizados, e a formulação deve adaptar-se ao modo de administração. Para além dos portadores biologicamente neutros, as composições farmacêuticas a administrar podem conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares não tóxicas, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, conservantes, agentes tamponadores de pH e outros, por exemplo acetato de sódio ou monolaurato de sorbitano. 79 A composição pode ter a forma de solução líquida, suspensão, emulsão, comprimido, pastilha, cápsula, formulação de libertação controlada, ou pó. Para composições sólidas (por exemplo, pó, pastilha, comprimido, ou cápsula), os portadores convencionais sólidos não tóxicos podem incluir, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, sacarinato de sódio, celulose, carbonato de magnésio, ou estearato de magnésio. A composição pode ser formulada como um supositório, com portadores e ligantes tradicionais como triglicerídeos. A quantidade de toxina de PA modificada, como a das SEQ N° ID: 4, 24 e 25, eficaz no tratamento de uma perturbação ou

condição específica, como é o caso do cancro da próstata, depende da natureza da perturbação ou condição, e pode ser determinada por técnicas clínicas correntes. Adicionalmente, é possível recorrer a ensaios in vitro para identificar os intervalos de dosagem óptima (ver Exemplos 2, 4 e 5) . A dosagem precisa a utilizar na formulação depende igualmente da gravidade da doença ou perturbação, e deve ser decidida em conformidade com o parecer do médico e as circunstâncias de cada caso. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas dose-resposta obtidas de sistemas de ensaios in vitro ou de modelo animal. Exemplos de doses iv eficazes de uma toxina de PA modificada para um humano de 7 0 kg são de cerca de 1-10 mg de toxina de PA modificada, por exemplo cerca de 1-5 mg, por exemplo cerca de 1-3 mg, por exemplo cerca de 2,8 mg. Exemplos de doses intraprostáticas ou intratumorais eficazes de uma toxina de PA modificada para um humano de 70 kg são de cerca de 10-100 mg de toxina de PA modificada, por exemplo cerca de 10-50 mg, por exemplo cerca de 10-30 mg, por exemplo cerca de 28 mg. A divulgação apresenta também um conjunto ou kit farmacêutico que compreende um ou mais recipientes cheios com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas. Associado opcionalmente a este(s) recipiente(s) pode haver um aviso na 80 forma indicada pela entidade governamental que regule o fabrico, o uso ou a venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, no qual se deve reflectir a aprovação por essa entidade do fabrico, uso ou venda para administração em humanos. Podem também ser incluídas instruções para o uso da composição.

Administração de moléculas de ácidos nucleicos

Num exemplo em que se usa um ácido nucleico para permitir a expressão de um ácido nucleico numa célula, o ácido nucleico é administrado por via intracelular (por exemplo, por expressão de um vector de ácido nucleico ou por mecanismos mediados por receptor). Numa configuração, um ácido nucleico codifica uma PA modificada, como na SEQ N° ID: 4,24 ou 25. São conhecidos vários sistemas para administrar um ácido nucleico, e incluem encapsulação em lipossoma, micropartícuias, microcápsulas, endocitose mediada por receptor (Wu e Wu, J. Biol. Chem. 1987, 262:4429-32), e construção de ácidos nucleicos terapêuticos como parte de um retroviral ou outro vector. Os métodos de introdução incluem, entre outras vias, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, e oral. Os compostos podem ser administrados por qualquer via conveniente, por exemplo por infusão ou injecção em bólus, por absorção através dos revestimentos epitelial ou mucocutâneo (por exemplo, mucosa oral, rectal, vaginal, intestinal, etc.) e podem ser administrados em conjunto com outros agentes biologicamente activos. A administração pode ser sistémica ou local.

Os lipossomas fundem-se com o local alvo e libertam intracelularmente o conteúdo do lúmen. Os lipossomas são mantidos em contacto com as células alvo por um periodo de tempo suficiente para que a fusão ocorra, usando vários meios 81 para manter o contacto, tais como agentes de isolamento e de ligação. Os lipossomas podem ser preparados com proteínas ou péptidos purificados que mediam a fusão de membranas, tais como o virus Sendai ou o virus da gripe. Os lipidos podem ser qualquer combinação útil de lipidos conhecidos formadores de lipossomas, incluindo lipidos catiónicos, como a fosfatidilcolina. Outros lipidos potenciais incluem lipidos neutros, como colesterol, fosfatidil serina, fosfatidil glicerol, e outros. Para a preparação dos lipossomas. pode usar-se o procedimentos descrito por Kato et al. (J. Biol. Chem. 1991, 266:3361).

Se a molécula terapêutica for um ácido nucleico, a administração pode ser feita por um vector de expressão de ácido nucleico adequado que se j a administrado de forma a tornar-se intracelular, por exemplo usando um vector retroviral (ver Patente dos EUA N° . 4.980.286), ou por injecção directa, ou recorrendo a um bombardeamento de microparticulas (por exemplo, uma "arma de genes"; Biolistic, Dupont), ou revestindo com lipidos ou receptores da superfície celular ou agentes de transfecção, ou administrando-a em ligação a um péptido do tipo homeobox que seja conhecido por entrar no núcleo (ver, por exemplo, Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1991, 88 : 1864-8), etc. Em alternativa, o ácido nucleico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado no DNA da célula hospedeira para expressão por recombinação homóloga. 0 pcDNA vector constitui um exemplo de um método de introdução do cDNA estranho numa célula sob o controlo de um forte promotor virai (CMV) para forçar a expressão. Contudo, podem ser usados outros vectores (ver Exemplo 15) . Outros vectores retrovirais (tais como pRETRO-ON, Clontech), usam também este promotor mas têm as vantagens de entrar nas células sem qualquer auxiliar de transfecção, integrando-se no genoma das células alvo só quando a célula alvo se divide (como as 82 células cancerígenas fazem, sobretudo durante as primeiras remissões após a quimioterapia) e são reguladas. É também possível ligar a expressão de um ácido nucleico administrando tetraciclina quando se usam estes plasmídeos.

Outros vectores plasmídicos, como ρΜΔΜ-neo (Clontech) ou pMSG (Pharmacia) usam o promotor MMTV-LTR (que pode ser regulado com esteróides) ou o promotor tardio SV10 (pSVL, Pharmacia) ou o promotor sensível à metalotioneína (pBPV, Pharmacia) e outros vectores virais, incluindo retrovirus. Exemplos de outros vectores virais incluem adenovirus, AAV (virus adeno-associado), HSV recombinante, poxvirus (vaccinia) e lentivirus recombinante (como o HIV). Estes vectores concretizam o objectivo básico de colocarem na célula alvo a sequência de cDNA e os elementos de controlo necessários para a transcrição. A presente divulgação inclui todas as formas de administração de ácido nucleico, incluindo oligos sintéticos, DNA nu, plasmidica e virai, integrada no genoma ou não.

Tendo exemplificado e descrito novas toxinas de proaerolisina modificada, e métodos de utilização destas moléculas para tratar o cancro da próstata e suas metástases, um especialista pode constatar que a divulgação é susceptível de ser modificada em termos genéricos e no detalhe sem que tais princípios sejam abandonados. Tendo em vista as inúmeras configurações às quais os princípios da nossa divulgação se podem aplicar, há que reconhecer que as configurações exemplificadas constituem apenas exemplos particulares da divulgação e não devem ser considerados como uma limitação do âmbito da divulgação. Ou melhor, o âmbito da divulgação está de acordo com as reivindicações que se seguem. Por conseguinte, reivindicamos como nossa invenção tudo o que está abrangido no âmbito destas reivindicações 83

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> University of Victoria Innovation and Development Corporation e Johns Hopkins University.

<120> PROAEROLISINA CONTENDO SEQUÊNCIA DE ACTIVAÇÃO DE PROTEASES E MÉTODOS DE USO PARA O TRATAMENTO DO CANCRO DA PRÓSTATA <130> 2847-63499 <140> <141> <150> 60/314, 613 <151> 2001-08-24 <160> 25 <170> PatentIN versão 3.1

<2 010> 1 <211> 1410 <212> DNA <213> Aeromonas hydrophilia <22 0>

<221> CD <222> (1) .. (1410) 84 <223> <400» 1 gea gag ccc gtc tat cca gac cag ctt ege ttg ttt tea ttg ggc caa 48 Ala Glu Pro Val Tyr Pro Asp Gin Leu Arg Leu Phe Ser Leu Gly Gin 1 S 10 15 999 gfcc tgt 99c gac aag tat ege ccc gtc aat cga gaa gaa gee caa 96 Gly Val Cys Gly Asp Lys Tyr Arg Pro Val Asn Arg Glu Glu Ala Gin 20 25 30 age gtt aaa age aat att gtc 9SC atg atg 999 caa tgg caa ata age 144 Ser Val Lys Ser Asn Ile val Gly «et Met Gly Gin Trp Gin Ile Ser 35 40 45 999 ctg gee aac ggc tgg gtc att atg 999 ccg sgt tat aac ggt gaa 192 Gly Leu Ala Asn Gly Trp Val Ile Met Gly Pro Gly Tyr Asn Gly Glu 50 55 60 ata aaa cca 999 aca 9cg tcc aat acc tgg tgt tat ccg acc aat cct 240 Ile Lys Pro Gly Thr Ala Ser Asn Thr Trp Cys Tyr Pro Thr Asn Pro 65 70 75 80 gtt acc 99* gaa ata ecg aca ctg tet gee ctg gat att cca gafe 99* 288 Val Thr Gly Glu Ile Pro Thr Leu Ser Ala Leu Asp Ile Pro Asp Gly $5 90 95 gac gaa gtc gat gtg eag tgg cga ctg gta cat 9ac agt gcg aat ttc 336 Aso Glu Val ASO Val Gin Trp Arg Leu val Hls Asp Ser Ala Asn Phe 85 100 110 105 ate aaa cca acc age tat ctg gee eat tac etc ggt tat gee tgg gtg 384 Ile Lys Pro Thr Ser Tyr Leu Ala His Tyr Leu Gly Tyr Ala Trp val 115 120 125 ggc ggc aat cac age caa tat gte ggc gaa gac atg gat gtg acc cgt 432 Gly Gly Aen His Ser Gin Tyr Val Gly Glu Asp Met Asp val Thr Arg 130 135 140 gat ggc gac ggc tgg gtg ate cgt ggc aac aat gac ggc ggc tgt gac 480 Asp Gly Asp Gly Trp val Ile Arg Gly Asn Asn Asp Gly Gly Cys Asp 145 150 155 160 ggc tat ege tgt ggt gac aag acg gee ate aag gte age aac ttc gee 528 Gly Tyr Arg cys Gly Asp Lys Thr Ala Ile Lys Val Ser Asn Phe Ala 165 170 175 tat aac ctg gat CCC gac age ttc aag eat ggc gat gte acc cag tcc 576 Tyr Asn Leu Asp Pro Asp Ser Phe Lys His Gly Asp Val Thr Gin Ser ISO 185 190 gac ege cag ctg gte aag act gtg gtg ggc tgg gcg gte aac gac age 624 Asp Arg Gin Leu Vai Lys Thr Val Val Gly Trp Ala Val Asn Asp Ser 195 200 205 gac acc CCC caa tcc ggt tat gac gte acc ctg ege tac gac aca gee 672 Asp Thr Pro Gin Ser Gly Tyr Asp Val Thr Leu Arg Tyr Asp Thr Ala 210 215 220 acc aac tgg tcc aag acc aac acc tat ggc ctg age g®9 aag gtg aee 720 Thr Asn Trp Ser Lys Thr Asn Thr Tyr Gly Leu Ser Glu Lys val Thr 225 230 235 240 acc aag aac aag ttc aag tgg cca ctg gtg 999 gaa acc caa etc tcc 768 Thr Lys Asn Lys Phe Lys Trp Pro Leu Val Gly Glu Thr Gin Leu Ser 245 250 255 ate gag att gct gee aat cag tcc tgg gcg tcc cag aac ggg ggc teg 816 Ile Glu ile Ala Ala Asn Gin Ser Trp Ala Ser Gin Asn Gly Gly Ser 250 265 270 aee acc acc tcc ctg tet cag tcc gtg cga ecg act gtg ecg gee ege 864 Thr Thr Thr Ser Leu Ser Gin Ser Val Arg Pro Thr Val Pro Ala Arg 275 280 285 tcc aag ate ecg gtg aag ata gag etc tac aag gee gac ate tcc tat 912 Ser Lys Ile Pro Val Lys Ile Glu Leu Tyr Lys Ala Asp Ile Ser Tyr 290 295 300 ccc tat gag ttc aag gee gat gte age tat gac ctg acc ctg age ggc 960 Pro Tyr Glu Phe Lys Ala Asp Val Ser Tyr ASp Leu Thr Leu Ser Gly 305 310 315 320 ttc ctg ege tgg ggc ggc aac gee tgg tat acc cac ecg gac aac cgt 1008 Phe Leu Arg Trp Gly Giy Asn Ala Trp Tyr Thr His Pro ASp Asn Arg 325 330 335 ecg aac tgg aac cac acc ttc gte ata ggt ecg tac aag gac aag gcg 1056 Pro Asn Trp Asn His Thr Phe val Ile Gly Pro Tyr Lys Asp Lys Ala 86 340 345 350 age age att cgg tac cag tgg gac aag cgt tac ate ceg ggt gaa gtg 1104 Ser Ser lie Arg Tyr Gla Trp Asp Lys Arg Tyr He Pro Gly Glu val 3SS 360 365 aag *99 tgg gac tgg aac tgg acc ata cag cag aac ggt ctg tefc acc 1152 Lys Trp Trp Asp Trp Asn Trp Thr Xle Gin Gin Asn Gly Leu Ser Thr 370 375 380 atg cag aac aac ctg gee aga 9*9 ctg ege ceg gtg cgg gcg ggg ate 1200 Met Gla Asa Asa Leu Ma Arg Vai Leu Arg Pro Vai Arg Ala Gly Ile 385 390 3 95 400 acc ggt gat ttc agt gee gag age cag fctt gee ggc aac ata gag ato 1248 Thr Gly Asp Phe Ser Ala Glu Ser Gin Phe Ala Gly Asn Ile Glu Ile 405 410 43.5 3St gct ccc gtg ceg ctc g<=g gct gac age aag gtg cgt cgt gct ege 1296 Qly Ala Pro Val Pro Leu Ala Ala Asp ser Lys vai Arg Arg Ala Arg 420 425 430 agt gtg gac ggc gct ggt caa ggc ctg agg ctg gag ate ceg ctc gat 1344 Ser Vãl Asp Gly Ala Gly Gin Gly Leu Arg Leu Glu Ile Pro Leu Asp 435 440 445 303 caa gag ctc tce ggg ctt ggc ttc aac aac gtc age ctc age Stg 1392 Ala Gin Glu Leu Ser Gly Leu Gly Phe Asn Asn vai Ser Leu Ser val 450 455 460 acc cct gct gee a&t caa 1410 Thr Pro Ala Ala Asa Gin 455 470

<210> 2 <211> 470 <212> PRT <213> Aeromonas hydrophilia 87 <400» 2

Ala Glu Pro Vai Tyr Pro Asp Gin Leu Arg Leu Phe Ser Leu Gly Gin 1 5 10 15

Gly Vai Cys Gly Asp Lys Tyr Arg Pro Vai Asn Arg Giu Glu Ala Gin 20 25 30

Ser Vai Lys Ser Asn Ile Vai Gly Met Met Gly Gin Trp Gin Ile Ser 35 40 45

Gly Leu Ala Asn Gly Trp Vai Ile Met Gly Pro Gly Tyr Asn Gly Glu 50 55 60

Ile Lys Pro Gly Thr Ala Ser Asn Thr Trp Cys Tyr Pro Thr Asn Pro €5 70 75 80 88

Vai Thr Qly Olu Xle Pro Thr Leu Ser Ala Leu Asp lie Pro Asp Gly 85 90 95

Asp Glu Vai Asp Vai Gin Trp Arg Leu Vai His Asp Ser Ala Asn Phe 100 10S no lie Lys Pro Thr Ser Tyr Leu Ala His Tyr Leu Gly Tyr Ala Trp Vai 11S 120 125

Gly Gly Asn His Ser Gin Tyr Vai Gly Glu Asp Wet Asp Vai Thr Arg 130 135 140

Asp Gly Asp Gly Trp Vai lie Arg Gly Asn Asn Asp Gly Gly Cys Asp 145 150 155 160

Gly Tyr Arg Cys Gly Asp Lys Thr Ala Xle Lys Vai Ser Asn Phe Ala 165 170 175

Tyr Asn Leu Asp Pro Asp Ser Phe Lys His Gly Asp Vai Thr Gin Ser 180 185 190

Asp Arg Gin Leu Vai Lys Thr Vai Vai Gly Trp Ala Vai Asn Asp Ser 195 200 205

Asp Thr Pro Gin Ser Gly Tyr Asp Vai Thr Leu Arg Tyr Asp Thr Ala 210 215 220

Thr Asn Trp Ser Lys Thr Asn Thr Tyr Gly Leu Ser Glu Lys Vai Thr 225 230 235 240

Thr Lys Asn Lys Phe Lys Trp Pro Leu Vai Gly Glu Thr Gin Leu Ser 245 250 255

Ile Glu Ile Ala Ala Asn Gin Ser Trp Ala Ser Gin Asn Gly Gly Ser 260 265 270

Thr Thr Thr Ser Leu Ser Gin Ser Vai Arg Pro Thr Vai Pro Ala Arg 275 280 285

Ser Lys Ile Pro Vai Lys Ile Glu Leu Tyr Lys Ala Asp Ile Ser Tyr 290 295 300

Pro Tyr Glu Phe Lys Ala Asp Vai Ser Tyr Asp Leu Thr Leu Ser Gly 305 310 315 . 320 89

Phe Leu Arg Trp Gly Gly Asn Ala Trp Tyr Thr His Pro Asp Asn Arg 325 330 335

Pro Asn Trp Asn His Thr Phe Vai Xle Gly Pro Tyr Lys Asp Lys Ala 340 345 350

Ser Ser Ile Arg Tyr Gin Trp Asp Lys Arg Tyr Ile Pro Gly GX« Vai 355 350 355

Lys Trp Trp Asp Trp Asn Trp Thr Ile Gin Gin Asn Gly Leu Ser Thr 370 375 380

Met Gin Asn Asa Leu Ala Arg Vai Leu Arg Pro vai Arg Ala Gly Ile 385 390 395 400

Thr Gly Asp Phe Ser Ala Glu Ser Gin phe Ala Gly Asn Ile Glu Ile 405 410 415

Gly Ala Pro vai Pro Leu Ala Ala Asp Ser Lys Vai Arg Arg Ala Arg 420 425 430

Ser Vai Asp Gly Ala Gly Gin Gly Leu Arg Leu Glu Ile Pro Leu Asp 435 440 445

Ala Gin Glu Leu Ser Gly Leu Gly Phe Asn Asn Vai Ser Leu Ser Vai 450 455 460

Thr Pro Ala Ala Asn Gin 465 470

<210> 3 <211> 1410 <212> DNA <213> Sequência artificial 90 <22 0> <223> Proaerolisina com uma sequência de PSA substituída pelo local de furina. <22 0> <221> CDS <222> (1) . . (1410) <400> 3 gca gag ccc gtc tat cca gac cag ctt cgc ttg ttt tca ctg ggc caa 48

Ala Glu Pro Vai Tyr Pro Asp Gin Leu Arg Leu Phe Ser Leu Gly Gin 1 S 10 15 91 333 gtc tgt ggc gac aag tat ege ccc gtc aat cga gaa gaa gee caa 96 Gly vai Cys Gly Asp Lys Tyr Arg Pro Val Asn Arg Glu Glu Ala Gin 20 25 30 age gtt aaa age aat att gtc sgc atg atg ggg caa tgg caa ata age 144 Ser Vai Lys Ser Asn Ile Vai Gly «êt Met Gly Gin Trp Gin lie Ser 35 40 45 333 ctg gee aac ggc tgg gtc att atg ggg ceg ggt tat aac ggt gaa 192 Gly leu Ala Asn Gly Trp Vai Ile Met Gly Pro Gly Tyr Asn Gly Glu 50 55 60 ata aaa cca ggg aca gcg tcc aat aec tgg tgt tat ceg aec aat CCt 240 Ile Lys Aro Gly Thr Ala Ser Asn Thr Trp Cys Tyr Pro Thr Asn Pro 65 70 75 80 gtfc aec ggt gaa ata ceg aca ctg tet gee ctg gat att cca gat ggt 288 Vai Thr Gly Glu Ile Pro Thr Leu Ser Ala Leu Asp Ile Pro Asp Gly 85 90 95 gac gaa gtc gat gtg cag tgg cga ctg gta cat gac agt gcg aat ttc 336 Asp Glu Vai Asp Vai Gin Trp Arg Leu Val His Asp Ser Ala Asn Phe 100 105 110 ate aaa cca aec age tat ctg gee cat tac etc ggt tat gee tgg gtg 384 Ile Lys Pro Thr Ser Tyr Leu Ala His Tyr Leu Gly Tyr Ala Trp Val 115 120 125 ggc ggc aat cac age caa tat gtc ggc gaa gac atg gat gtg aec cgt 432 Gly Gly Asn His Ser Gin Tyr Vai Gly Glu Asp Met Asp Val Thr Arg 130 135 140 gat ggc gac ggc tgg Stg ate cgt ggc aac aat gac ggc ggc tgt gac 480 Asp Gly Asp Gly Trp Vai Ile Arg Gly Asn Asn Asp Gly Gly Cys Asp 145 150 155 160 ggc tat ege tgt ggt gac aag acg gee ate aag gtc age aac ttc gee 528 Gly Tyr Arg Cys Gly Asp Lys Thr Ala Ile Lys val Ser Asn Phe Ala 165 170 175 tat aac ctg gat cee gac age ttc aag cat ggc gat gtc aec cag tcc 576 Tyr Asn Leu Asp Pro Asp Ser Phe Lys His Gly Asp Val Thr Gin Ser 180 185 190 gac ege cag ctg gtc aag act gtg gtg ggc tgg gcg gtc aac gac age 624 Asp Arg Gin Leu Vai Lys Thr Vai Vai Gly Trp AXa Val Asn Asp Ser 195 200 205 gac aec cee caa tcc ggc tat gac gtc aec ctg ege tac gac aca gee 672 Asp Thr Pro Gin Ser Gly Tyr Asp Val Thr Leu Arg Tyr Asp Thr Ala 210 215 220 aec aac tgg tcc aag aec aac aec tat ggc ctg age gag aag gtg aec 720 Thr Asn Trp Ser Lys Thr Asn Thr Tyr Gly Leu Ser Glu Lys Val Thr 225 230 235 240 aec aag aac aag ttc aag tgg cca ctg gtg ggg gaa aec caa etc tcc 768 Thr Lys Asn Lys Phe Lys Trp Pro Leu Val Gly Glu Thr Gin Leu ser 24S 250 255 92 816 ate gag att gct gee aat cag tcc tgg Ile Glu Ile Ala Ala Asn Gin Ser Trp 260 265 acc acc acc tcc ctg tet cag tcc gtg Thr Thr Thr Ser Leu Ser Gin Ser Val 275 280 tcc aag ate ccg gtg aag ata gag ctc Ser lys Ile Pro Val Lys Ile Glu Leu 290 295 ccc fcat gag ttc aag gee gat gtc age Pr© Tyr Glu Phe Lys Ala Asp val Ser 305 310 ttc ctg cg c tgg ggc ggc aac gee tgg Phe leu Arg Trp Gly Giy Asn Ala Trp 325 ccg aac tgg aac cac acc ttc gtc ata Pro As» Trp Asn His Thr Phe Val Ile 340 345 âgc age att cgg tac cag tgg gac aag Ser Ser lie Arg Tyr Gin Trp Asp Lys 355 360 aag tgg tgg gac tgg aac tgg acc ata Lys Trp Trp Asp Trp Asn Trp Thr Ile 370 375 atg cag aac aac ctg gee aga gtg ctg Met Gin Asn Asn Leu Ala Arg Val Leu 385 330 acc ggt gat ttc agt gee gag age cag Thr Gly Asp Phe Ser 405 Ala Glu Ser Gin ggt gct ccc gtg ccg ctc gcg gct gac Gly Ala Pro Val Pro Leu Ala Ala Asp 420 425 agt gtg gac ggc gct ggt caa ggc ctg Ser Val Asp Gly Ala Gly Gin Gly Leu 435 440 gcg caa gag ctc tcc ggg ctt ggc ttc Ala Gin Glu Leu Ser Gly Leu Gly Phe 450 455 acc cet gct gee aat caa Thr Pro Ala Ala Asn. Gin 465 470 gcg tcc cag aac ggg ggc tcg Ala Ser Gin Asn Gly Gly Ser 270 cga Arg ccg Pro act Thr gtg Val 285 ccg Pro gee Ala ege Arg 864 tac Tyr aag Lys gee Ala 300 gac Asp ate lie tcc Ser tat Tyr 912 tat Tyr gac Asp 315 ctg Leu acc Thr ctg Leu age Ser ggc Gly 320 960 tat Tyr 330 acc Thr cac His ccg Pro gac Asp aac Asn 335 cgt Arg 1008 ggt Gly ccg Pro tac Tyr aag Lys gac Asp 350 aag Lys gcg Ala 1056 cgt Arg tac Tyr ate Ile ccg Pro 365 ggt Gly gaa Glu gtg Val 1104 cag Gin cag Gin aac Asn 380 ggt Gly ctg Leu tet Ser acc Thr 1152 ege Arg ccg Pro 395 gtg Val cgg Arg gcg Ala 999 Gly ate Ile 400 1200 ttt Phe 410 gee Ala ggc Gly aac Asa ata Ile gag Glu 415 <iÈ-C Ile 1248 age Ser cat His tcc Ser tcc Ser aag Lys 430 ctg Leu cag Gin 1296 agg Arg ctg Leu gag Glu ate Ile 445 ccg Pro ctc Leu gat Asp 1344 aac Asn aac Asn gtc Val 460 age Ser ctc Leu age Ser gtg Val 1392 1410 <210> 4 <211» 470 93

<212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Proaerolisina com uma sequência de PSA substituída pelo local de furina. <400> 4 94

Ala Glu Pro Vai Tyr Pro Asp Gin Leu Arg Leu Phe Ser Leu Gly Gin 1 5 10 15

Gly Vai Cys Gly Asp Lys Tyr Arg Pro Vai Asn Arg Glu Glu Ala Gin 20 25 30

Ser Val Lys Ser Asn Ile Vai Gly Met Met Gly Gin Trp Gin Ile Ser 35 40 45

Gly Leu Ala Asn Gly Trp val Ile Met Gly Pro Gly Tyr Asn Gly Glu 50 55 60

Ile Lys Pro Gly Thr Ala Ser Asn Thr Trp Cys Tyr Pro Thr Asn Pro 65 70 75 80

Val Thr Gly Glu Ile Pro Thr Leu Ser Ala Leu Asp Ile Pro Asp Gly 85 50 95

Asp Glu Val Asp Val Gin Trp Arg Leu Val Mis Asp Ser Ala Asn Phe 100 105 110

Ile Lys Pro Thr Ser Tyr Leu Ala His Tyr Leu Gly Tyr Ala Trp Val 115 120 125

Gly Gly Asn His Ser Gin Tyr Val Gly Glu Asp Met Asp Val Thr Arg 130 135 140

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Gly Tyr Arg Cys Gly Asp Lys Thr Ala Ile Lys Val Ser Asn Phe Ala 165 170 175

Tyr Asn Leu Asp Pro Asp Ser Phe Lys His Gly Asp Val Thr Gin Ser 180 185 190

Asp Arg Gin Leu Val Lys Thr Val Val Gly Trp Ala Val Asn Asp Ser 195 200 205 95 100 105 110 ate aaa cca acc age tat ctg gee cat tac etc ggt tat gee tgg gtg 384 Ile Lys Pro Thr Ser Tyr Leu Ala His Tyr Leu Gly Tyr Ala Trp Val 115 120 125 ggc ggc aat cac age caa tat gtc ggc gaa gac atg gat gtg acc cgt 432 Gly Gly Asn His Ser Gin Tyr Vai Gly Glu Asp Met Asp Val Thr Arg 130 135 140 gat ggc gac ggc tgg gtg ate cgt ggc aac aat gac ggc ggc tgt gac 480 Asp Gly Asp Gly Trp Vai Ile Arg Gly Asn Asn Asp Gly Gly Cys Asp 145 150 155 160 ggc tat ege tgt ggt gac aag acg gee ate aag gtc age aac ttc gee 528 Gly Tyr Arg Cys Gly Asp Lys Thr Ala Ile Lys Val Ser Asn Phe Ala 165 170 175 tat aac ctg gat ccc gac age ttc aag cat ggc gat gtc acc cag tcc 576 Tyr Asn Leu Asp Pro Asp Ser Phe Lys His Gly Asp Val Thr Gin Ser 180 185 190 gac ege cag ctg gtc aag act gtg gtg ggc tgg gcg gtc aac gac age 624 Asp Arg Gin Leu Vai Lys Thr Vai Val Gly Trp Ala Val Asn Asp Ser 195 200 205 gac acc ccc caa tcc ggc tat gac gtc acc ctg ege tac gac aca gee 672 Asp Thr Pro Gin Ser Gly Tyr Asp Val Thr Leu Arg Tyr Asp Thr Ala 210 215 220 acc aac tgg tcc aag acc aac acc tat ggc ctg age gag aag gtg acc 720 Thr Asn Trp Ser Lys Thr Asn Thr Tyr Gly Leu Ser Glu Lys Val Thr 225 230 235 240 acc aag aac aag ttc aag tgg cca ctg gtg ggg gaa acc caa etc tcc 768 Thr Lys Asn Lys Phe Lys Trp Pro Leu Val Gly Glu Thr Gin Leu Ser 245 250 255 ate gag att gct gee aat cag tcc tgg gcg tcc cag aac ggg ggc teg 816 Ile Glu Ile Ala Ala Asn Gin Ser Trp Ala Ser Gin Asn Gly Gly Ser 260 265 270 acc acc acc tcc ctg tet cag tcc gtg cga ccg act gtg ccg gee ege 864 Thr Thr Thr Ser Leu Ser Gin Ser Val Arg Pro Thr Val Pro Ala Arg 275 280 285 tcc aag ate ccg gtg aag ata gag etc tac aag gee gac ate tcc tat 912 Ser Lys Ile Pro Vai Lys Ile Glu Leu Tyr Lys Ala Asp Ile Ser Tyr 290 295 300 ccc tat gag ttc aag gee gat gtc age tat gac ctg acc ctg age ggc 960 Pro Tyr Glu Phe Lys Ala Asp Val Ser Tyr Asp Leu Thr Leu Ser Gly 305 310 315 320 ttc ctg ege tgg ggc ggc aac gee tgg tat acc cac ccg gac aac cgt 1008 Phe Leu Arg Trp Gly Gly Asn Ala Trp Tyr Thr His Pro Asp Asn Arg 325 330 335 ccg aac tgg aac cac acc ttc gtc ata ggt ccg tac aag gac aag gcg 1056 Pro Asn Trp Asn His Thr Phe Val Ile Gly Pro Tyr Lys Asp Lys Ala 96 340

34S 350 age age att cgg tac cag tgg gae aag cgt tac ate ccg ggt gaa gtg 1104 Ser Ser Ile Arg Tyr Gin Trp Asp Lys Arg Tyr lie Pro Gly Glu Vai 355 360 365 aag tgg C99 gae tgg aac tgg acc ata cag cag aac ggt ctg tet acc 13.52 i*ys Trp Trp Asp Trp Asn Trp Thr Ile Gin Gin Asn Gly Leu Ser Thr 370 375 380 atg cag aac aac ctg gee aga gtg ctg ege ccg gtg cgg gcg ggg ate 1200 Met Gin Asn Asn Leu Ala Arg vai Leu Arg Pro vai Arg Ala Gly lie 385 390 395 400 acc ggt gat ttc agt gee gag age cag ttt gee ggc aac ata gag ate 1248 Thr Gly Asp Phe Ser Ala Glu Ser Gin Phe Ala Gly Asn lie Glu Ile 403 410 415 ggt gct ccc gtg ccg etc gcg gct gae age cat tcc tcc aag ctg cag 1296 Gly Ala Pro Vai Pro Leu Ala Ala Asp Ser His Ser Ser Lys Leu Gin 420 425 430 agt 0CC gae ggc gct ggt caa 33° ctg agg cfcg gag ate ccg etc gat 1344 Ser Asp Gly Ala Gly Gin Gly Leu Arg Leu Glu Ile Pro Leu Asp 435 440 445 9cg caa g&g ctc tcc ggg ctt ggc ttc aac aac gtc age ctc age gtg 1392 Ala Gin Glu Leu Ser Gly Leu Gly Phe Asn Asn Vai Ser Leu Ser vai 450 455 460 acc cct gct gee aat caa 1410 Thr Pro Ala Ala Asn Gin * 465 470

<210> 7 <211> 470 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Proaerolisina com uma sequência de PSA substituída pelo local de furina 97 <40Ô> 7

Ala Glu Pro Vai Tyr Pro Asp Gin Leu Arg Leu Phe Ser Leu Gly Gin i 5 10 15

Gly Vai Cys Gly Asp Lys Tyr Arg Pro Vai Asn Arg Glu Glu Ala Gin 20 25 30

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Thr Trp Cys Tyr Pro Thr Asn Pro 75 80

Ser Ala Leu Asp Ile Pro Asp <31y 90 95

Leu Vai His Asp Ser Ala Asn Phe 105 1X0

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Gly Glu Asp Met Asp Vai Thr Arg 140

Gly Asn Asn Asp Gly Gly Cys Asp 155 ISO

Ala Ile Lys Vai Ser Asn Phe Ala 170 175

Lys His Gly Asp Vai Thr Gin Ser 185 190

Vai Gly Trp Ala vai Asn Asp Ser 20S

Vai Thr Leu Arg Tyr Asp Thr Ala 220

Tyr Gly Leu Ser Glu Lys Vai Thr 225 240

Leu Vai Gly Glu Thr Gin Leu Ser 250 255

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Vai Arg Pro Thr Vai Pro Ala Arg 285

Leu Tyr Lys Ala Asp Ile Ser Tyr 300 99

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Ser Ser Ile Arg Tyr Gin Trp Asp Lys Arg Tyr Ile Pro Gly Glu Vai 355 350 365

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Met Gin Asn Asn Leu Ala Arg Vai Leu Arg Pro Vai Arg Ala Gly Ile 385 390 395 400

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Gly Ala Pro Vai Pro Leu Ala Ala Asp Ser His Ser Ser Lys Leu Gin 420 425 430

Ser Ala Asp Gly Ala Gly Gin Gly Leu Arg Leu Glu Ile Pro Leu Asp 435 440 445

Ala Gin Glu Leu Ser Gly Leu Gly Phe As» Asn Vai Ser Leu Ser Vai 450 455 460

Thr Pro Ala Ala Asn Gin 465 470 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial 100 <220>

<223> local de clivagem de PSA

<4O0> S

His Ser Ser ϊ/ys teu Gin Ser Ala 1 5 <210> ? <211> 1410

<212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223>Proaerolisina com uma sequência de PSA substituída pelo local de furina <22 0>

<221> CDS <222> (1)...(1410) <223> 101 <4oe» i 9 gca gag ccc gtc tat cea gac cag cfct ege ttg ttt tea ttg ggc caa 48 Ala Gly Pro vai Tyr Pro Asp Gin Leu Arg Leu Phe Ser Leu Gly Gin 1 5 10 15 999 gtc tgt 99« gac aag tat ege cce gtc aat cga gaa gaa gee caa 96 Sly Vai cys Gly Asp Lys Tyr Axg Pro Val Asn Arg Glu Glu Ala Gin 20 25 30 age gtt âââ age aat att gtc ggc atg atg 999 caa «99 caa ata age 144 Ser Vai Lys Ser Asn Ile vai Gly «et «et Gly Gin Trp ôln Ile Ser 35 40 45 999 ctg gee aac ggc tgg gtc att atg 999 ccg 99t tat aac 99« gaa 192 Gly Leu Ala Asn Gly Trp Vai Ile «et Gly Pro Gly Tyr Asn. Gly Glu 50 55 60 ata aaa cea 999 aea 9«9 tCG aat acc tgg tgt tat c«9 acc aat cct 240 Ile Lys Pro Gly Thr Ala Ser Asn Thr Trp Cys Tyr Pro Thr Asn Pro 65 70 75 80 gtt acc ggt gaa ata ceg aca ctg tet gee ctg gat att cca gat ggt 2S8 Vai Thr Gly Glu ile Pro Thr Leu Ser Ala Leu Asp Sle Pro Asp Gly 85 , 90 95 gac gaa gtc gat 3tg cag tgg cga ctg gta cat gac agt 9«S aat ttc 336 Asp Glu vai Asp vai Gin Trp Arg Leu Val His Asp Ser Ala Asn Phe 100 105 110 ate aaa cca acc age tat ctg gee cat tac etc ggt tat gee tgg gtg 384 Ile Lys Pro Thr Ser Tyr Leu Ala His Tyr Leu Gly Tyr Ala Trp Val 115 120 125 gge ggc aat cac age caa tat gtc ggc gaa gac atg gat 9tg acc cgt 432 Gly Gly Asn Hís Ser Gin Tyr Vai Gly Glu Asp Mefc Asp Val Thr Arg 130 135 140 gat 39« gac 99« tgg gtg ate cgfc 99« aac aat gac ggc 99c tgt gac 480 Asp Gly Asp Gly Trp Vai lie Arg Gly Asn Asn Asp Gly Gly Cys Asp 145 150 155 168 ggc tat çgç tgt ggt gac aag aeg gee ate aag gtc age aae ttc gee 528 Gly Tyr Arg Cys Gly Asp Lys Thr Ala Ile Lys Val Ser Asn Phe Ala 165 170 175 tat aac ctg gat ccc gac age tfcc aag cat 99« gat gtc acc cag tcc 576 Tyr Asn Leu Asp Pro Asp Ser Phe Lys His Gly Asp val Thr Gin Ser 102

ISO 185 ISO gac ege cag ctg gtc aag act gtg gtg ggc tgg gcg gtc aac gac age 624 Asp Arg Gin Leu Vai Lys Thr vai Val Gly Trp Ala Val Asn Asp Ser 19S 200 205 gac acc ccc caa tcc ggt tat gac gtc acc ctg ege tac gac âCâ gee 672 Asp Thr Pro Gin Ser Gly Tyr Asp Val Thr Leu Arg Tyr Asp Thr Ala 210 215 220 acc aac tgg tcc aag acc aac acc tat ggc ctg age gag aag gtg acc 720 Thr Asn Trp Ser Lys Thr Asn Thr Tyr Gly Leu Ser Glu Lys Val Thr 225 230 235 240 âcc aag aac aag ttc aag tgg cca ctg gtg gss gaa âcc caa etc tcc 768 Thr Lys Asn Lys Phe Lys Trp Pro Leu Val Gly Glu Thr Gin Leu Ser 245 250 255 ate gag att gct gee aat cag tcc tgg gcg tcc cag aac ggg ggc teg 816 lie Glu Ile Ala Ala Asn Gin Ser Trp Ala Ser Gin Asn Gly Gly Ser 260 265 270 acc acc acc tcc ctg tet cag tcc gtg cga ccg act gtg ccg gee ege 864 Thr Thr Thr Ser Leu Ser Gin Ser Val Arg Pro Thr Val Pro Ala Arg 275 280 285 tcc aag ate ccg gtg aag ata gag etc tac aag gee gac ate tcc tat 912 Ser Lys Ile Pro Vai Lys Ile Glu Leu Tyr Lys Ala Asp Ile Ser Tyr 290 295 300 ccc tat gag ttc aag gee gat gtc age tat gac ctg acc ctg age ggc 960 Pro Tyr Glu Phe Lys Ala Asp Vai Ser Tyr Asp Leu Thr Leu Ser Gly 305 310 315 320 ttc ctg ege tgg ggt ggc aac gee tgg tat acc cac ccg gac aac cgt 1008 Phe Leu Arg Trp Gly Gly Asn Ala Trp Tyr Thr Hls Pro Asp Asn Arg 325 330 335 ceg aac tgg aac cac acc ttc gtc ata ggt ccg tac aag gac aag gcg 1056 'Pro Asn Trp Asn Kis Thr Phe Vai Ile Gly Pro Tyr Lys Asp Lys Ala 340 345 350 age age att tgg tac cag tgg gac aag egfc tac ate ccg ggt gaa gtg 1104 Ser Ser Ile Arg Tyr Gin Trp Lys Arg Tyr lie Pro Gly Glu Val 355 360 365 aag tgg tgg gac tgg aac tgg acc ata cag cag aac ggt ctg tet acc 1152 Lys Trp Trp Asp Trp Asn Trp Thr Ile Gin Gin Asn Gly Leu Ser Thr 370 375 380 atg cag aac aac ctg gee aga gtg ctg ege ccg gtg cgg gcg ggg ate 1200 Met Gin Asn Asn Leu Ala Arg Val Leu Arg Pro Val Arg Ala Gly Ile 385 390 395 400 acc ggt gat ttc agt gee gag age cag ttt gee ggc aac ata gag ate 1248 Thr Gly Asp Phe Ser Ala Glu ser Gin Phe Ala Gly Asn ile Glu Ile 405 410 415 99* gct ccc gtg ccg etc gcg gct gac tcc cag ttc tat age age aat 1296 Gly Ala Pro vai Pro Leu Ala Ala Asp Ser Gin Phe Tyr Ser Ser Asn 103 420 425 430 agt 3fcg 9SC gct ggt caa ggc ctg agg ctg 9*g ate ccg etc gat 1344 Ser Vai Asp Gly Ala Gly Gin Gly Leu Arg Leu Glu lie Pro Leu Asp 435 440 445 caa gag ctc tcc ggg cct ggc ttc aac aac gtc age ctc age 9tg 1352 Ala Gin Glu Leu Ser Gly Leu Gly Phe Asn Asn vai Ser Leu Ser Val 450 455 460 acc cct gcfc gcc aafc caa 1410 Thr Pro Ala Ala Asn Gin 465 470

<210> 10 <211> 470 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Proaerolisina com uma sequência de PSA substituída pelo local de furina 104 <400> 10

Ala Glu pro Vai Tyr Pro Asp Gin Leu Arg Leu Phe Ser Leu Gly Gin 1 5 10 15

Gly Vai Cys Gly Asp Lys Tyr Arg Pro vai Asn Arg,Glu Glu Ala Gin 20 25 30

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Asp Arg Gin Leu Vai Lys Thr Vai 195 200 val Gly Trp Ala vai Asn Asp Ser 205

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Leu Tyr Lys Ala Asp Ile Ser Tyr 300

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<212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> local de clivagem de PSA <400> 11 GIr Phe Tyr Ser Ser Asn i s

<210> 12 <211> 1410 <212> DNA 107 <213> Sequência artificial <22 0> <223> Proaerolisina com uma sequência de PSA substituída pelo local de furina

<22 0> <221> CD <222> (1) . . (1410) <223> i400> 12 gca gag ccg gtc tat- CÇ& 3a c eag etc cgc ttg cfct cea ttg ggc c&a 48 Ala alu Fro Vsl Tyr Pro Asp Gin h&H Arg Leu Phe Ser Leu Gly Gin 1 5 10 15 999 gto tgt ggc qãC à&g tat cgc ccc gtc aat ega gaa gaa gee caa Gly Vai Cys Gly Asp IjVB Tyr Arg Fro Vai Aso Arg Glu Glu Ala Gin 108 25 30 20 age gtt aaa age aat att gtc ggc atg atg 993 caa tgg caa ata age 144 Ser Vai Lys Ser Asn Ile Val Gly Met Met Gly Gin Trp Gin Ile Ser 35 40 45 933 etg gee aac ggc tgg gtc att atg ggg ccg ggt tat aac ggt gaa 192 Gly Leu Ala Asn Gly Trp Val Ile Met Gly Pro Gly Tyr Asn Gly Glu 50 55 60 ata aaa cca ggg aca gcg tcc aat acc tgg tgt tat ccg acc aat ccfc 240 Ile Lys Pro Gly Thr Ala Ser Asn Thr Trp Cys Tyr Pro Thr Asn Pro 65 70 75 80 gtt acc ggt gaa ata ccg aca etg tet gee etg gat att cca gat ggt 288 Vai Thr Gly Glu Ile Pro Thr Leu Ser Ala Leu Asp Ile Pro Asp Gly 85 90 95 gac gaa gtc gat Stg cag tgg cga etg gta cat gac age gcg aat ttc 336 Asp Glu Val Asp Val Gin Trp Arg Leu Val His Asp Ser Ala Asn Phe 100 105 110 ate aaa cca acc age tat etg gee cat tãC etc ggt tat gee tgg gtg 384 Ile hys Pro Thr Ser Tyr Leu Ala His Tyr Leu Gly Tyr Ala Trp Val 115 120 125 ggc ggc aat cac age caa tat gtc ggc gaa gac atg gat gtg acc cgt 432 Gly Gly Asn His Ser Gin Tyr Val Gly Glu Asp Met Asp Val Thr Arg 130 135 140 gat ggc gac ggc tgg 9tg ate cgt ggc aac ââfc gac ggc ggc tgt gac 480 Asp Gly Asp Gly Trp Val Ile Arg Gly Asn Asn Asp Gly Gly Cys Asp 145 150 155 160 ggc tat ege tgt ggt gac aag acg gee ate aag gtc age aac ttc gee 528 Gly Tyr Arg Cys Gly Asp Lys Thr Ala Ile Lys Val Ser Asn Phe Ala 165 170 175 tat aac etg gat CCC gac age ttc aag cat ggc gat gtc acc cag tcc 576 Tyr Asn Leu Asp Pro Asp Ser Phe Lys His Gly Asp val Thr Gin Ser 180 185 190 gac ege cag etg gtc aag act gtg gtg 99e tgg gcg gtc aac gac age 624 Asp Arg Gin Leu Val Lys Thr val Val Gly Trp Ala Val Asn Asp Ser 195 200 205 gac acc ccc caa tcc S9C tat gac gtc acc etg ege tac gac aca gee 672 Asp Thr Pro Gl» Ser Gly Tyr Asp Val Thr Leu Arg Tyr Asp Thr Ala 210 215 220 acc aac tgg tcc aag acc aac acc tat ggc etg age 3*9 aag gtg acc 720 Thr Asn Trp Ser Lys Thr Asn Thr Tyr Gly Leu Ser Glu Lys Val Thr 225 230 235 240 acc aag aac aag ttc aag tgg cca etg gtg ggg gaa acc caa etc tcc 768 Thr Lys Asn Lye Phe Lys Trp Pro Leu val Gly Glu Thr Gin Leu Ser 245 250 255 ate 9*9 att gct gee aat cag tcc tgg 9C9 tcc cag aac 399 ggc teg 816 Ile Gin Ile Ala AXâ Asn GXn Ser Trp Ala Ser Gin Asn Gly Gly Ser 109 260 265 270 acc acc acc tcc ctg tet cag tcc gtg cga ccg act gtg ccg gee ege 864 Thr Thr Thr Ser Leu Ser Gin ser val Arg Pro Thr Val Pro Ala Arg 275 280 285 tcc aag ate ccg gtg aag ata gag ctc tac aag gee gac ate tcc tat 912 Ser Lys Ile Pro val Lys Ile Glu Leu Tyr Lys Ala Asp Ile Ser Tyr 290 295 300 ccc tat gag ttc aag gee gat gtc age tat gac ctg acc ctg age ggc 960 Pro Tyr Gin Phe Lys Ala Asp Val Ser Tyr Asp Leu Thr Leu Ser Gly 305 310 315 320 ttc ctg ege tgg gge ggc aac gee tgg tat acc cac ccg gae aac cgt 1008 Phe Leu Arg Trp Gly Gly Asn Ala Trp Tyr Thr HÍS Pro Asp Asn Arg 325 330 335 ccg aac tgg aac cac acc ttc gtc ata ggt ccg tac aag gac aag gcg 1056 Pro Asn Trp Asn Hls Thr Phe Val Ile Gly Pro Tyr Lys Asp Lys Ala 340 345 350 age age att cgg tac cag tgg gac aag cgt tac ate ccg ggt gaa gtg 1104 Ser Ser Ile Arg Tyr Gin Trp Asp Lys Arg Tyr Ile Pro Gly Glu Val 355 360 365 aag tgg tgg gac tgg aac tgg acc ata cag cag aac ggt ctg tet acc 1152 Lys Trp Trp Asp Trp Asn Trp Thr Ile Gin Gin Asn Gly Leu ser Thr 370 375 380 atg cag aac aac ctg gee aga gtg ctg ege ccg gtg cgg gcg ggg ate 1200 fí6t Gin Asn Asn Leu Ala Arg Val Leu Arg Pro Val Arg Ala Gly Ile 385 390 39S 400 acc ggt gat ttc agt gee gag age cag ttt gee ggc aac ata gag ate 1248 Thr Gly Asp Phe Ser Ala Glu Ser Gin Phe Ala Gly Asn Ile Glu Ile 405 410 415 ggt gct cec gtg ccg ctc gcg gct gac ggt ata agt agt ttc cag agt 1296 Gly Ala Pro Val Pro Leu Ala Ala Asp Gly Ile Ser Ser Phe Gin Ser 420 425 430 agt gtg gae ggc gct ggt caa ggc ctg agg ctg gag ate ccg ctc gat 1344 Ser Val Asp Gly Ala Gly Gin Gly Leu Arg Leu Glu Ile Pro Leu Asp 435 440 445 gcg caa gag etc tcc 999 ctt ggc ttc aac aac gtc age ctc age gtg 1392 Ala Gin Olu Leu Ser Gly Leu Gly Phe Asn Asn val Ser Leu Ser val 450 455 460 acc cet gct gee aat caa 1410 Thr Pro Ala Ala Asn Gin 465 470 <210> 13

<211> 470 <212> PRT 110 <213> Sequência artificial <22 0> <223> Proaerolisina com uma sequência de PSA substituída pelo local de furina 111 «400> 13

Ala Glu Pro Vai Tyr Pro Asp Gin Leu Arg Leu Phe Ser Leu Gly Gin 1 S 10 IS

Gly Vai Cys Gly Asp Lys Tyr Arg Pro Vai Asn Arg Glu Glu Ala Gin 20 25 30

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Asp Glu Vai Asp Vai Gin Trp Arg Leu Vai His Asp Ser Ala Asn Phe 100 105 110

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Gly Gly Asa His Ser Gin Tyr Vai Gly Glu Asp Met Asp Vai Thr Arg 130 135 140

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Thr Asn Trp Ser Lys Thr Asn Thr Tyr Gly Leu Ser Glu Lys Vai Thr 225 230 235 240 thr Lys Asn Lys Phe Lys Trp Pro Leu Vai Gly Glu Thr Gin Leu Ser 245 250 255

Ile Glu Ile Ala Ala Asn Gin Ser Trp Ala Ser Gin Asn Gly Gly Ser 260 265 270

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Ser Lys Ile Pro Vai Lys ile Glu Leu Tyr Lys Ala Asp Ile Ser Tyr 280 295 300

Pro Tyr Glu Phe Lys Ala Asp Vai Ser Tyr Asp Leu Thr Leu Ser Gly 305 310 315 320

Phe Leu Arg Trp Gly Gly Asn Ala Trp Tyr Thr His Pro Asp Asn Arg 325 330 335

Pro Asn Trp Asn His Thr Phe Vai Ile Gly Pro Tyr Lys Asp Lys Ala 340 345 350

Ser Ser

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Ala Gly Asn Ile Glu Ile 415

Gly Ala Pro Vai 420

Pro Leu Ala Ala Asp Gly Ile 425

Ser Ser Phe Gin Ser 430

Ser Vai Asp Gly Ala Gly Gin 435 Ala Gin Glu Leu Ser Gly Leu 450 455

Gly Leu Arg Leu 440 Gly Phe Asn Asn

Glu Ile Pro Leu Asp 445

Vai Ser Leu Ser Vai 460 113

Thr Pro Ala Ala Asn Gin 465 470 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> local de clivagem de <400> 14 Gly lie Ser Ser Phe Gin Ser 1 s <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 15 Lys 1 Gly Ile Ser Ser Gin Tyr 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens 114 <400> 16

Ser Arg Lys Ser Gin Gin Tyr 1 S

<210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 17

Ala Thr Lys Ser Lys Gin H.is 1 5

<210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 18

Lys Gly Leu Ser Ser Gin Cys

<210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens 115 <4 Ο 0> 19

Leu Gly Gly Ser Ser Gin Leu 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 20 Glu Kis Ser 1 Ser Lys S <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 21 Ser Lys Leu Gin 1 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens 116 <4Ο0> 22

Gin His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10

<210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <22 0> <223> sequência de variante de LHRH <22 0>

<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Glu é um piroglutamato <22 0>

<221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Lys é uma D-Lys 117 <400> 23

Giu His Trp Ser Tyr Lys Leu Arg Pro Gly i S 10

<210> 34 <211> 397 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de péptido da proaerolisina <22 0>

<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> piroglutamato <22 0>

<221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> D-Lys 118 <40Ο> 24

Glu His Trp Ser Tyr Lys Leu Arg 1 5

Pro Gly Glu Ile Pro Thr Leu Ser 10 15

Ala Leu Asp Ile Pro Asp Gly Asp 20

Glu Vai Asp Vai Gin Trp Arg Leu 25 30

Vai His Asp Ser Ala Asn Phe Ile 35 40

Lys Pro Thr Ser Tyr Leu Ala His 45

Tyr Leu Gly Tyr Ala Trp Vai Gly 50 5S

Gly Asn His Ser Gin Tyr Vai Gly 60

Glu Asp Met Asp Vai Thr Arg Asp 65 70

Gly Asp Gly Trp Vai Ile Arg Gly 75 80

Asn Asn Asp Gly Gly Cys Asp Gly 85

Tyr Arg Cys Gly Asp Lys Thr Ala 90 95

Ile Lys vai Ser Asn Phe Ala Tyr

Asn Leu Asp Pro Asp Ser Phe Lys 119 100 105 110

His Gly Asp Vai Thr Gin Ser Asp Arg Gin Leu Vai Lys Thr Vai Vai 11S 120 125

Gly Trp Ala Vai Asn Asp Ser Asp Thr Pro Gin Ser Gly Tyr Asp Vai 130 135 140

Thr Leu Arg Tyr Asp Thr Ala Thr Asn Trp Ser Lys Thr Asn Thr Tyr 145 ISO 155 ISO

Gly Leu Ser Glu Lys Vai Thr Thr Lys Asn Lys Phe Lys Trp Pro Leu 165 170 175

Vai Gly Glu Thr Gin Leu Ser Xle Glu lie Ala Ala Asn Gin Ser Trp 160 185 190

Ala Ser Gin Asn Gly Gly Ser Thr Thr Thr Ser Leu Ser Gin Ser Vai 195 200 205

Arg Pro Thr Vai Pro Ala Arg Ser Lys Ile Pro Vai Lys Ile Glu Leu 210 215 220

Tyr Lys Ala Asp Xle Ser Tyr Pro Tyr Glu Phe Lys Ala Asp Vai Ser 225 230 235 240

Tyr Asp Leu Thr Leu Ser Gly Phe Leu Arg Trp Gly Gly Asn Ala Trp 245 250 255

Tyr Thr His Pro Asp Asn Arg Pro Asn Trp Asn His Thr Phe Vai Ile 260 265 270

Gly Pro Tyr Lys Asp Lys Ala Ser Ser Ile Arg Tyr Gin Trp Asp Lys 275 280 285

Arg Tyr Ile Pro Gly Glu Vai Lys Trp Trp Asp Trp Asn Trp Thr lie 290 295 300

Gin Gin Asn Gly Leu Ser Thr Het Gin Asn Asn Leu Ala Arg Vai Leu 305 310 315 320

Arg Pro Vai Arg Ala Gly Ile Thr Gly Asp Phe Ser Ala Glu Ser Gin 325 330 335

Phe Ala Gly Asn Ile Glu ile Gly Ala Pro Vai Pro Leu Ala Ala Asp 120 540 350 345

Ser His Ser Ser Lys Leu Gin Ser Vai Asp Gly Ala Gly Gin Gly Leu 355 360 365

Arg Leu Glu Ile Pro Leu Άβρ Ala Gin Glu Leu Ser Gly Leu Gly Phe 370 375 380

Asn Asn Vai Ser Leu Ser Vai Thr Pro Ala Ala Asn Gin 385 350 385

<210> 25 <211> 397 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Variante de péptido da proaerolisina <220> <223> variante de péptido da proaerolisina <220> <221> MISC-FEATURE <222> (1) .. (1) <223> piroglutamato <220> <221> MISC-FEATURE <222> (6)..(6) <223> D-lys 121 <4Q0> 25

Olu His Trp Ser Tyr Lys Leu Arg X 5

Pro Gly Glu Ile Pro Thr Leu Ser 10 15

Ala Leu Asp Ile Pro Asp Gly Asp 20

Olu Vai Asp Vai Gin Trp Arg Leu 25 30

Vai His Asp Ser Ala Asn Phe Ile 35 40

Lys Pro Thr Ser Tyr Leu Ala His 45

Tyr Leu Gly Tyr Ala Trp Vai Gly 50 55

Gly Asn His Ser Gin Tyr Vai Gly 60

Glu Asp Met Asp Vai Thr Arg Asp 65 70

Gly Asp Gly Trp Vai Ile Arg Gly 75 80

Asn Asn Asp Gly Gly Cys Asp Gly 85

Tyr Arg Cys Gly Asp Lys Thr Ala 90 95 122

Ile Lys Val Ser Asn Phe Ala Tyr Asn Leu Asp Pro Asp Ser Phe Lys 100 105 110

Hís Gly Asp Val Thr Gin. Ser Asp Arg Gin Leu Val Lys Thr Val val 115 ISO 12S

Giy Trp Ala Val Asn Asp Ser Asp Thr Pro Gin Ser Gly Tyr Asp Val 130 135 140

Thr Leu Arg Tyr Asp Thr Ala Thr Asn Trp Ser Lys Thr Asn Thr Tyr 145 ISO 1S5 160

Gly Leu Ser Glu Lys Val Thr Thr Lys Asn Lys Phe Lys Trp Pro Leu 165 170 175

Val Gly Glu Thr Gin Leu Ser Ile Glu Ile Ala Ala Asn Gin Ser Trp 180 185 ISO

Ala Ser Gin Asn Gly Gly Ser Thr Thr Thr Ser Leu Ser Gin Ser Val 195 200 205

Arg Pro Thr Val Pro Ala Arg Ser Lys Ile Pro Val Lys Ile Glu Leu 210 215 220

Tyr Lys Ala Asp Ile Ser Tyr Pro Tyr Glu Phe Lys Ala Asp Val Ser 225 230 235 240

Tyr Asp Leu Thr Leu Ser Gly Phe Leu Arg Trp Gly Gly Asn Ala Trp 245 250 255

Tyr Thr Ris Pro Asp Asn Arg Pro Asn Trp Asn His Thr Phe Vai Ile 260 265 270

Gly Pro Tyr Lys Asp Lys Ala Ser Ser lie Arg Tyr Gin Trp Asp Lys 275 280 285

Arg Tyr Ile Pro Gly Glu Val Lys Trp Trp Asp Trp Asn Trp Thr Ile 290 295 300

Gin Gin Asn Gly Leu Ser Thr Met Gin Asn Asn Leu Ala Arg Val Leu 305 310 315 320

Arg Pro Val Arg Ala Gly Ile Thr Gly Asp Phe Ser Ala Glu Ser Gin 325 330 335 123

Phe Ala Gly Asn IXe Glu Ile Gly Ala Pro Vai Pro Leu Ala Ala Asp 340 345 350

Ser Lys vai Arg Arg Ala Arg Ser Vai Asp Gly Ala Gly Gin Gly Leu 355 350 365

Arg Leu Giu Ile Pro Leu Asp Ala Gin Glu Leu Ser Gly Leu Gly Pile 370 375 380

Asn Asn Vai Ser Leu Ser Vai Thr Pro Ala Ala Asn Gin 385 330 395

Lisboa, 14 de Agosto de 2012. 124

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um péptido purificado que compreende uma sequência de aminoácidos da variante da sequência de aminoácidos da proaerolisina, em que a variante da sequência de aminoácidos da proaerolisina compreende um local de clivagem de protease especifico da próstata e um local de clivagem de furina funcionalmente suprimido, no qual o local de clivagem de protease especifico da próstata substitui funcionalmente o local de clivagem de furina. 2. 0 péptido da reivindicação 1, no qual o local de clivagem de protease especifico da próstata compreende um local de clivagem do antigénio especifico da próstata (PSA), um local de clivagem do antigénio específico da membrana da próstata (PSMA), ou um local de clivagem da calicreina glandular humana 2 (hK2). 3. 0 péptido da reivindicação 2, no qual o local de clivagem de PSA compreende as SEQ N° ID: 5, 8, 11, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou 21. 4. O péptido da reivindicação 3, no qual o local de clivagem de PSA compreende as SEQ N° ID: 5. 5. 0 péptido da reivindicação 1, no qual a sequência de aminoácidos da variante de proaerolisina compreende ainda um domínio de ligação funcionalmente suprimido. 6. O péptido da reivindicação 5, no qual o domínio de ligação é funcionalmente suprimido por deleção de aminoácidos 1-83 da SEQ N° ID: 2 ou 4. 7. O péptido da reivindicação 4, no qual o domínio de ligação é funcionalmente suprimido por inserção de pelo menos uma 1 mutação seleccionada do grupo composto por W45A, I47E, M57A.Y61A, e K66Q da SEQ N° ID: 2 ou 4. 8. 0 péptido da reivindicação 5, no qual o péptido compreende ainda um domínio de ligação específico do tecido prostático. 9. 0 péptido da reivindicação 8, no qual o domínio de ligação específico do tecido prostático compreende uma sequência da hormona libertadora da hormona luteinizante (LHRH). 10. O péptido da reivindicação 9, no qual a sequência de LHRH compreende a SEQ N° ID: 22 ou 23. 11. 0 péptido da reivindicação 6, no qual o péptido compreende ainda uma sequência de LHRH ligada a um terminal N- da variante de proaerolisina. 12. O péptido da reivindicação 7, no qual a sequência de LHRH está ligada aos aminoácidos 215 ou 300 das SEQ N° ID: 2 ou 4, nas quais os aminoácidos 215 ou 300 sofreram uma mutação para uma cisteína. 13. 0 péptido da reivindicação 8, no qual o domínio de ligação específico do tecido prostático compreende um anticorpo que reconhece PSA. hK2, PSMA ou LHRH. 14. O péptido da reivindicação 13, no qual o anticorpo está ligado a um terminal N- da variante de proaerolisina. 15. O péptido da reivindicação 13, no qual o anticorpo está ligado a um terminal C- da variante de proaerolisina. 16. O péptido da reivindicação 9, no qual a sequência de péptidos compreende a SEQ N° ID: 24 ou 25. 17. O péptido da reivindicação 1, no qual o péptido está imobilizado numa superfície. 2 18. 0 péptido da reivindicação 17, no qual a superfície tem a forma de uma conta. 19. 0 péptido da reivindicação 18, no qual a conta compreende ainda um ligando especifico da próstata. 20. Um péptido em conformidade com a reivindicação 1 para uso no tratamento do cancro da próstata de um sujeito. 21. para administração intratumoral e/ou intraprostática. 22. O péptido da reivindicação 20, para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea ou oral. 23. Uma sequência de ácidos nucleicos que encodes o péptido da reivindicação 1 para uso no tratamento do cancro da próstata de um sujeito. 24. O péptido da reivindicação 20, para tratar o cancro da próstata por contacto das células prostáticas cancerígenas do sujeito com o referido péptido. 25. O péptido da reivindicação 20, em que o sujeito tem um tumor prostático localizado. 26. Um péptido conforme com a reivindicação 1 para usar num método de tratamento sistémico de cancro da próstata num sujeito, em que o método compreende: remoção de células prostáticas cancerígenas do sujeito; contactar as células com o péptido da reivindicação 1, produzindo assim um lisado de células; e administrar o lisado de células ao sujeito. 27. O péptido da reivindicação 26, em que o sujeito tem um tumor prostático metastático. 28. O péptido da reivindicação 26, em que o método compreende ainda a administração ao sujeito de GM-CSF. 3 29. 0 péptido da reivindicação 28, em que o método compreende ainda a administração ao sujeito de células prostáticas cancerígenas irradiadas. 30. O péptido da reivindicação 20, em que a administração resulta numa redução do volume das células prostáticas tumorais. em que o volume das células redução de pelo menos 10%. em que o volume das células redução de pelo menos 50%. 31. 0 péptido da reivindicação 30, prostáticas tumorais sofre uma 32. O péptido da reivindicação 30, prostáticas tumorais sofre uma 33. O péptido da reivindicação 26, em que a administração resulta numa redução do volume das células prostáticas tumorais. 34. O péptido da reivindicação 33, em que a administração resulta ainda numa redução do tumor prostático metastático. 35. O péptido da reivindicação 33, em que a administração resulta ainda no tratamento de um tumor prostático metastático. 36. Uma sequência de ácidos nucleicos purificados que codificam o péptido da reivindicação 1. Lisboa, 14 de Agosto de 2012. 4 f!G 1 Proaeroiisina Domínio de ligação Toxina Local de clivagem da íudna(KVRRAR) J Pêptido inihidor □i vagem peia fu ri na Remove pêptido inífatdor Aerctlisíoa Domínio de ligação Toxina Local de clivagem da furina (KVRRAR), Aeroiisina introdux-se na membrana da céiuSa, formando poros Morte da célula FÍG 2

1 FÍG 3 Variantes de PA em células ÉL4

Concefitraçâo de toxina (M) F-tG 4 % de Redução do volume do tumor

2 F!G SÀ* ’ Proaerolísina de tipo selvagem (SEQ. N°IEfct e 2} Dominío de ligação Toxina Loca! de divagem éa (urina {KVRRAR) Péptido inibida r PíGSB; Dominío de ligação Toxinas Locai dedívagemda protease especifica da próstata ,· ípof ex., HSSKLQ) Péptido inibidor se Porriírsio de ligação Toxina Local de clivagem da fu riria com. mutação (isto.é, AAAAAA! Péptido tntbidor

Locai de divagem especifico da próstata ou

Locai de clivagem especifico da próstata FfG SB Exemplo de uma variante de ProaefdlSsina com dm dominíO de íígaçãò fúrtdonaímente suprimido Domínio de ligação com mutação * j toxina Local de clivagem da protease especifica da próstata (por ex, HSSKLQ} Péptido inibidor f Kr SE Exemplo de uma variante de Praaerpfisina com um domínio de figaçáo ficcionalmente substituído Domínio de ligação j Toxmâ com mutação* Local deciivagem da protease específica da próstata (poreje, HSSKLQ} Péptido inibidor 1

Dominío de íígaçâo específico do tecido prostático (por ex,, LHRH) e/Ou Domínio de ligação específico da iecidc prostático (por ex, LHfiH) ) inserção num terminai N- de uma PA modificada Inserção num terminai C- de uma Pft modificada

3 RS Jp Exemplo de um* variante de Pioaerofisina com um domínio de ligação ionciorialmente substituído

Fixação tio emífiífckiíio Ύ215 de um» PA modificada l-tsaçBO no amirwãíido A3Q0 fie uma PA modificada FiG 5<j Exemplo da uma variante de Proaerciístns tom em domínio de ligação funtionãiroente suprimido (aminoâddos 1 -8ϊ suprimidos) Lotai do clivagem da prottsase Toxina especifica da próstata ípor ex., HSSKlOj Péptido inibídor F® SM E>»mpio de uma variante de Preaeroitsína com dm domínio de ligação íuncfcmaimente substituído

FIG 5i Exemplo de u ma variante de Proaoroilsina com um domínio de ligação funcionalmente substituído

Domín io de ligação especifico do tetidoj | prosfático {por ex H-hrhí__ Fixação no aminoádrfo Y3i S de ume PA modificada RxaçSo no aminoáctóo A30B de uma PA modificada 4