ES2542888T3 - Proaerolisina que contiene secuencias de activación de proteasa y métodos de uso para el tratamiento del cáncer de próstata - Google Patents

Abstract

Un péptido purificado que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia del 95% o superior con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SED. ID. Nº: 4, donde el péptido purificado comprende un sitio de clivaje específico prostático y un sitio de clivaje de furina sometido a deleción funcional, donde el sitio de clivaje específico prostático sustituye funcionalmente al sitio de clivaje de furina.

Description

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Neoplasia: Crecimiento anómalo de las células.

Célula normal: Célula no tumoral, no maligna y no infectada.

Oligonucleótido: Una secuencia de polinucleótidos lineal de hasta 200 bases de nucleótidos de longitud, por ejemplo, un polinucleótido (como ADN o ARN) que tiene al menos unos 6 nucleótidos, por ejemplo, al menos 15, 50, 100 o 200 nucleótidos de largo.

Operativamente unido: Una primera secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera mantiene una relación funcional con la segunda. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido a una secuencia de codificación si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia de codificación. Por lo general, las secuencias de ADN operativamente unidas se encuentran contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones que codifican proteínas, en el mismo marco de lectura.

ORF (marco abierto de lectura): Una serie de tripletes de nucleótidos (codones) que codifican aminoácidos sin ningún codón de terminación. Por lo general, estas secuencias se pueden traducir en un péptido.

Polinucleótido: Una secuencia de ácido nucleico lineal de cualquier longitud. Por tanto, un polinucleótido incluye moléculas que tienen al menos 15, 50, 100,200, 400, 500, 1000, 1100 o 1200 (oligonucleótidos) y también nucleótidos tan largos como un cromosoma o ADNc en toda su longitud.

Proaerolisina: La protoxina inactiva de la aerolisina. El ADNc y la proteína de una proaerolisina de tipo salvaje o nativa se muestran en las SEC. ID. Nº: 1 y 2, respectivamente.

En un ejemplo, una variante o modificación de una molécula de proaerolisina incluye un sitio de clivaje de proteasa específico prostático, como un sitio de clivaje específico de PSA, que permite la activación de la variante de PA en presencia de una proteasa específica prostática como PSA, PMSA o HK2 (véanse, por ejemplo, las FIG. 5C-I). En un ejemplo, se inserta un sitio de clivaje de proteasa específico prostático en el sitio de clivaje de furina nativo de PA, de forma que la PA se activa en presencia de una proteasa específica prostática, pero no de furina (véanse, por ejemplo, las FIG. 5D-I). Alternativamente, el sitio de clivaje de furina puede someterse a deleción funcional utilizando la mutagénesis de la secuencia de seis aminoácidos y a la inserción de una secuencia de clivaje de proteasa específica prostática (véase, por ejemplo, la FIG. 5C). En otro ejemplo, una variante de una molécula de PA incluye también la deleción o sustitución de uno o más, como al menos dos, de los aminoácidos de PA nativos. En otro ejemplo más, una variante de una molécula de PA incluye también otra molécula (como un anticuerpo o péptido) unida o añadida a (o dentro de) la variante de la molécula de PA. En otro ejemplo, una variante de una molécula de PA incluye un dominio de unión específico de tejido prostático.

En otro ejemplo, una variante de una molécula de PA incluye también un dominio de unión sometido a deleción funcional (aproximadamente los aminoácidos 1-83 de la SEC. ID. Nº: 2). Las deleciones funcionales se pueden hacer utilizando cualquier método conocido en la técnica, como deleciones, inserciones, mutaciones o sustituciones. Algunos ejemplos incluyen, a título meramente enunciativo, la deleción del dominio de unión completo (o partes del mismo (véanse, por ejemplo, las FIG. 5G-I), o la introducción de mutaciones puntuales (como las descritas anteriormente (véanse, por ejemplo, las FIG. 5D-F), que resultan en un dominio de unión con una funcionalidad reducida. Por ejemplo, una molécula de PA que tiene un dominio de unión sometido a deleción funcional (y ninguna secuencia de unión de sustitución del mismo) tiene una capacidad reducida para acumularse en una membrana celular y, por tanto, lisa las células a un ritmo más lento que una secuencia de PA de tipo salvaje (véase, por ejemplo, la FIG. 5D). También se divulgan variantes de moléculas de PA en las que el dominio de unión nativo está sometido a deleción funcional y sustituido por un dominio de unión específico del tejido prostático como se describe a continuación (véanse, por ejemplo, las FIG. 5E-I).

Algunos ejemplos concretos, ofrecidos a título meramente enunciativo, de una variante de las proteínas de PSA se muestran en las SEC. ID. Nº: 4, 7, 10, 13,24, y 25.

La actividad de PA modificada es la actividad de un agente en el que la lisis de las células se ve afectada. Las células incluyen, a título meramente enunciativo, las células secretoras de proteasa específica prostática, como las células secretoras de PSA, como las células cancerígenas prostáticas, como las células cancerígenas prostáticas de proliferación lenta. Los agentes incluyen, a título meramente enunciativo, proteínas de PA modificada, ácidos nucleicos, agentes de unión específicos, incluyendo variantes, mutantes, polimorfismos, fusiones y fragmentos de los mismos, divulgados en el presente. En un ejemplo, la actividad de la PA modificada se dice que está mejorada cuando los ácidos nucleicos o las proteínas de la PA modificada, en contacto con una célula secretora de PSA (como una célula cancerígena prostática), promueven la lisis y la muerte de la célula, por ejemplo, al menos un 10% o, por ejemplo, al menos un 25%, 50%, 100%, 200% o incluso un 500%, en comparación con la lisis de una célula que no produce PSA. En otros ejemplos, la actividad de la PA modificada se dice que está mejorada cuando los ácidos nucleicos y las proteínas de la PA modificada, en contacto con un tumor, reducen el volumen de las células tumorales, como un tumor prostático, por ejemplo, en al menos un 10%, por ejemplo, al menos un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o incluso un 100% (eliminación completa del tumor).

Los ensayos que se pueden utilizar para determinar si un agente tiene una actividad de PA modificada se describen en el presente, por ejemplo, en los Ejemplos 2-5 y 9. Por ejemplo, un péptido de PA modificado puede ser evaluado

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para determinar su capacidad para lisar específicamente las células que producen PSA (Ejemplos 2 y 5), ser estable en plasma humano (Ejemplo 3), ser un sustrato eficiente para la actividad enzimática de PSA (Ejemplo 9). La actividad de la proteína funcional se podría detectar mediante la lisis preferencial de células que producen PSA frente a las células que no producen PSA, reduciendo el volumen del tumor prostático, presentando una toxicidad reducida en comparación con la PA de tipo salvaje y una estabilidad incrementada en sangre en comparación con la PA de tipo salvaje.

Ensayos similares se pueden utilizar para determinar si cualquier agente de PA modificado divulgado en el presente puede reducir el volumen tumoral (tal como un tumor prostático) y lisar específicamente las células que producen PSA. Por ejemplo, los péptidos de PA modificados mostrados en las SEC. ID. Nº: 4, 24 y 25 se espera que reduzcan el volumen del tumor prostático. Cualquiera de estos ensayos puede ser modificado empleando la expresión in vivo de un gen de PA modificado, y variantes, fusiones y fragmentos del mismo, en lugar de la administración de proteínas purificadas.

Promotor: Un conjunto de secuencias de control de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Un promotor incluye secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripción, tales como, en el caso del promotor de la polimerasa tipo II, un elemento TATA. Un promotor también incluye opcionalmente un facilitador distal o elementos represores que pueden estar ubicados a varios miles de pares de bases del sitio de inicio de la transcripción.

Promotor específico prostático: Un promotor que reacciona a la testosterona y otros andrógenos y que, por tanto, promueve la expresión del gen en las células prostáticas. Algunos ejemplos incluyen, a título meramente enunciativo, el promotor de la probasina, el promotor del antígeno específico prostático (PSA), el promotor del antígeno prostático específico de membrana (PSMA) y el promotor de la calicreína glandular humana 2 (HK2).

Sitio de clivaje de proteasa específico prostático: Una secuencia de aminoácidos que es reconocida y específica y eficientemente hidrolizada (clivada) por una proteasa específica prostática. Algunos ejemplos incluyen, a título meramente enunciativo, un sitio de clivaje específico de PSA, un sitio de clivaje específico de PSMA y un sitio de clivaje específico de HK2.

Un sitio de clivaje específico de PSA es una secuencia de aminoácidos que es reconocida y específica y eficientemente hidrolizada (clivada) por un antígeno específico prostático (PSA). Estas secuencias de péptidos se pueden introducir en otras moléculas, como PA, para producir profármacos que son activados por el PSA. Tras la activación de la PA modificada por el PSA, la PA es activada y puede ejercer su citotoxicidad. Algunos ejemplos de sitios de clivaje específicos de PSA incluyen, a título meramente enunciativo, los mostrados en las SEC. ID. Nº: 5, 8, 11 y 14-21, los divulgados en las Patentes estadounidenses nº 5 866 679 de DeFeo-Jones et al., 5 948 750 de Garsky et al., 5 998 362 de Feng et al., 6 265 540 de Isaacs et al., 6 368 598 de D'Amico et al., y 6 391 305 de Feng et al.

Algunos ejemplos concretos de sitios de clivaje específicos de PSMA se pueden encontrar en WO/0243773 de Isaacs y Denmeade (incorporada al presente por referencia). Algunos ejemplos concretos de sitios de clivaje específicos de HK2 se divulgan en WO/0109165 de Denmeade et al.

Dominio de unión específico del tejido prostático: Una molécula, como un ligando del péptido, una toxina o anticuerpo, que tiene una especificidad superior para las células prostáticas que para otros tipos de células. En un ejemplo, un dominio de unión específico del tejido prostático tiene una KD inferior en células o tejidos prostáticos que en otros tipos de células (es decir, se une selectivamente a tejidos prostáticos en comparación con otros tejidos normales del sujeto), por ejemplo una KD al menos 10 veces inferior, como una KD al menos 20, 50, 75, 100 o incluso 200 veces inferior. Estas secuencias se pueden utilizar para dirigir un agente, como una variante de una molécula de PA, hasta la próstata. Algunos ejemplos incluyen, a título meramente enunciativo, los siguientes: anticuerpos que reconocen proteínas que son relativamente específicas prostáticas, como PSA, PSMA, hK2, prostasina y hepsina; ligandos que tienen receptores selectivos prostáticos como la hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH) natural y sintética, y endotelina (unión al receptor específico de endotelina).

Purificado: El término «purificado» no implica una pureza absoluta; pretende ser más bien un término relativo. Así, por ejemplo, una preparación de ácido nucleico o proteína sustancialmente purificada (como las toxinas de PA modificada divulgadas en el presente) es aquella en la que la proteína o el ácido nucleico al que se hace referencia es más puro que la proteína en su entorno natural dentro de una célula o dentro de una cámara de reacción de producción (según corresponda). Por ejemplo, una preparación de una proteína de PA modificada está purificada si la proteína representa al menos un 50%, por ejemplo al menos un 70%, del contenido total de proteína de la preparación. Los métodos para la purificación de proteínas y ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica. Algunos ejemplos de métodos que se pueden emplear para purificar una proteína, como una PA modificada, incluyen, a título meramente enunciativo, los métodos divulgados en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989, Capítulo 17).

Recombinante: Un ácido nucleico recombinante es aquel que tiene una secuencia que no se encuentra naturalmente presente o tiene una secuencia que se compone de una combinación artificial de dos segmentos de secuencia que de otro modo estarían separados. Por lo general, esta combinación artificial se realiza mediante síntesis química o, más frecuentemente, mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos

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nucleicos, por ejemplo mediante técnicas de ingeniería genética. Una proteína recombinante es aquella que resulta de la expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica la proteína.

Muestra: Muestras biológicas que contienen ARN, ADNc, ADN genómico o proteína obtenidos de las células de un sujeto, como los presentes en la sangre periférica, la orina, la saliva, el semen, la biopsia de un tejido, una muestra quirúrgica, el producto de las aspiraciones con aguja fina, muestras de amniocentesis y material de una autopsia. En un ejemplo, una muestra incluye células cancerígenas prostáticas obtenidas de un sujeto.

Similitud/identidad de la secuencia: La similitud/identidad entre dos o más secuencias de ácido nucleico, o dos o más secuencias de aminoácidos, se expresa en términos de la identidad o similitud entre las secuencias. La identidad de la secuencia se puede medir en términos de identidad porcentual; cuanto más elevado es el porcentaje, más idénticas son las secuencias. La similitud de la secuencia se puede medir en términos de similitud porcentual (que tiene en cuenta las sustituciones de aminoácidos conservadoras); cuanto más elevado es el porcentaje, más similares son las secuencias.

Los métodos de alineación de las secuencias para los fines de la comparación son bien conocidos en la técnica. Diversos programas y algoritmos de alineación se describen en: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989;Corpeteral., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computet Apph. in the Biosciences 8,155-65,1992; y Pearson et al.,Meth Mol. Bio 24:307-31,1994. Altschul et at, / Mol Biol. 215:403-10,1990, presenta una exposición detallada de los métodos de alineación de secuencias y cálculos de homología.

La herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) del NCBI (Altschul et al., J. Mol. Biol.215:403-10, 1990) está disponible en diversas fuentes, incluyendo el Centro Nacional de Información Biológica estadounidense (NCBI, National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894), y en Internet, y se puede emplear conjuntamente con los programas de análisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Se puede obtener información adicional en el sitio web del NCBI.

Para las comparaciones de secuencias de aminoácidos de más de unos 30 aminoácidos, se emplea la función de secuencias Blast 2, utilizando la matriz BLOSUM62 por defecto configurada conforme a los parámetros por defecto (penalización de espacio de 11 y penalización de espacio por residuo de 1). Para alinear péptidos cortos (menos de unos 30 aminoácidos), la alineación se debe realizar utilizando la función de secuencias Blast 2, empleando la matriz PAM30 configurada conforme a los parámetros por defecto (penalización por espacio abierto 9, penalización por extensión del espacio 1). Las proteínas con una similitud todavía mayor a la secuencia de referencia mostrarán identidades porcentuales mayores al evaluarlas con este método, tales como una identidad de la secuencia de al menos el 95% o incluso el 99%. Cuando se compara menos de la secuencia completa para determinar la identidad de la secuencia, los homólogos típicamente presentarán al menos un 75% de identidad de la secuencia en ventanas de comparación pequeñas de 10-20 aminoácidos, y pueden presentar identidades de la secuencia de al menos el 85%, 90%, 95% o 98%, dependiendo de su identidad con la secuencia de referencia. Los métodos para determinar la identidad de la secuencia en estas ventanas pequeñas se describen en el sitio web del NCBI.

Los homólogos de las proteínas se caracterizan típicamente por poseer al menos un 70%, como al menos un 75%, un 80%, un 85%, un 90%, un 95% o incluso un 98% de identidad de la secuencia, contada sobre la alineación de toda la longitud con la secuencia de aminoácidos utilizando el NCBI Basic Blast 2.0, gapped blastp con bases de datos como la nr o swissprot. Las búsquedas realizadascon el programa blastn se filtran con DUST (Hancock y Armstrong, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:67-70). Otros programas emplean SEG.

Una persona con conocimientos en la técnica apreciará que estos rangos de identidad de las secuencias se ofrecen únicamente a título orientativo; es posible obtener homólogos muy significativos que se encuentren fuera de los rangos proporcionados. En el presente se proporcionan los homólogos peptídicos anteriormente descritos, así como las moléculas de ácido nucleico que codifican estos homólogos.

Las secuencias de ácido nucleico que no muestran un elevado grado de identidad pueden, no obstante, codificar secuencias de aminoácidos idénticas o similares (conservadas), debido a la degeneración del código genético. Los cambios en una secuencia de ácido nucleico se pueden realizar utilizando esta degeneración para producir múltiples moléculas de ácido nucleico que codifican todas sustancialmente la misma proteína. Estos péptidos homólogos pueden, por ejemplo, poseer al menos un 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, o 99% de identidad de la secuencia determinada por este método. Cuando se compara menos de la secuencia completa para determinar la identidad de la secuencia, los homólogos pueden poseer, por ejemplo, al menos un 75%, 85% 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de la secuencia en ventanas de comparación pequeñas de 10-20 aminoácidos. Los métodos para determinar la identidad de la secuencia en estas ventanas pequeñas se pueden encontrar en el sitio web del NCBI. Una persona con conocimientos en la técnica apreciará que estos rangos de identidad de las secuencias se ofrecen únicamente a título orientativo; es posible obtener homólogos significativos u otras variantes que se encuentren fuera de los rangos proporcionados.

Sujeto: Organismo vertebrado multicelular vivo (una categoría que incluye tanto seres humanos como animales) que precisa un aumento del efecto biológico deseado. Algunos ejemplos incluyen, a título meramente enunciativo, los siguientes: seres humanos, monos, perros, gatos, ratones, ratas, conejos, caballos, cerdos y vacas.

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Mamífero transgénico: Mamífero transformado que contiene ADN extraño, no nativo En una realización, el ADN no nativo es una PA modificada que incluye un sitio de clivaje de PSA, como en la SEC. ID. Nº: 3, o una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína mostrada en las SEC. ID. Nº: 24 o 25.

Variantes o fragmentos o fusiones de proteínas: La producción de una proteína de PA modificada se puede realizar de diversas formas (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 12 y 16). Las secuencias de ADN que codifican una proteína de PA modificada o una proteína de fusión, o un fragmento o una variante de una proteína (por ejemplo, un fragmento o una variante que tiene un 80%, 90% o 95% de identidad de la secuencia con una PA modificada) se pueden crear para permitir que la proteína se exprese en las células eucarióticas o de organismos, bacterias, insectos y/o plantas. Para obtener la expresión, la secuencia de ADN puede ser modificada y operativamente unida a otras secuencias reguladoras. El producto final, que contiene las secuencias reguladoras y la proteína de PA modificada terapéutica, se denomina vector. Este vector se puede introducir en las células eucarióticas, de bacterias, insectos y/plantas. Una vez dentro de la célula, el vector permite la producción de la proteína.

Una proteína de fusión que incluye una PA modificada (o variantes, polimorfismos, mutantes o fragmentos de la misma) unida a otras secuencias de aminoácidos que no inhiben la actividad deseada de la proteína, por ejemplo la capacidad para lisar las células secretoras de PSA. En un ejemplo, las otras secuencias de aminoácidos no tienen más de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30 o 50 residuos de aminoácidos de longitud.

Una persona con conocimientos en la técnica apreciará que el ADN se puede alterar de numerosas maneras, sin afectar a la actividad biológica de la proteína codificada. Por ejemplo, la PCR se puede utilizar para producir variaciones en la secuencia de ADN que codifica una variante de la toxina de PA. Estas variantes pueden ser variantes optimizadas para la preferencia codónica en una célula hospedadora utilizada para expresar la proteína u otros cambios en la secuencia que facilitan la expresión.

Vector: Una molécula de ácido nucleico introducida en una célula hospedadora, que produce así una célula hospedadora transformada. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permiten replicarse en la célula hospedadora, como un origen de la replicación. Un vector también puede incluir uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos conocidos en la técnica.

Otras definiciones de términos utilizados habitualmente en genética molecular se pueden encontrar en Benjamin Lewin, Genes V publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Variantes de moléculas de proaerolisina

Las toxinas bacterianas, como la aerolisina producida por Aeromonas hydrophilia y una alfa-hemolisina producida por Staph aureus, son proteínas beta lámina que se oligomerizan en la membrana plasmática para producir poros y provocar la muerte celular citolítica rápida (FIG. 1). La formación de poros rompe físicamente las membranas celulares y provoca la muerte de las células en todas las fases del ciclo celular, incluyendo las células no proliferativas (es decir, reposo G0). No obstante, la aerolisina de tipo salvaje mata las células de forma indiscriminada. En el presente se divulga una forma de protoxina inactiva de la aerolisina (una variante de PA) que se puede dirigir hacia las proteínas específicas del cáncer de próstata y ser activada por las mismas. Una ventaja de las variantes de las moléculas de PA divulgadas para el tratamiento del cáncer de próstata localizado y metastásico es que combinan una terapia independiente de la proliferación con la administración de un fármaco específico prostático, lo que resulta en unos efectos secundarios mínimos para los pacientes. Una persona con conocimientos en la técnica entenderá que otras protoxinas, como la toxina alfa Clostridium septicum, la toxina delta Bacillus thuringiensis y la perforina humana, pueden ser sustituidas por proaerolisina.

En el presente se divulgan variantes de moléculas de PA, incluyendo secuencias de ADN y proteína, que incluyen una secuencia de clivaje de proteasa específica prostática. Algunos ejemplos de secuencias de clivaje de proteasa específicas prostáticas incluyen, a título meramente enunciativo, los siguientes: secuencias de clivaje de PSA, PSMA y HK2. La secuencia de clivaje de proteasa específica prostática sustituye funcionalmente al sitio de clivaje de furina nativa de la PA (véanse, por ejemplo, las FIG. 5B-I). Esta sustitución resulta en una variante de proaerolisina que solamente se vuelve citolíticamente activa en presencia de proteasa enzimáticamente activa, como PSA, PSMA

o hK2. El PSA es una serina proteasa con la capacidad para reconocer e hidrolizar secuencias de péptidos específicas. Es secretada por las células prostáticas normales y malignas en una forma enzimáticamente activa y se inactiva tras entrar en la circulación. Dado que ni la sangre ni el tejido normal, salvo la próstata, contienen PSA enzimáticamente activo, la actividad proteolítica del PSA se utiliza para activar protoxinas en los sitios del cáncer de próstata. Se puede utilizar cualquier sitio de clivaje de PSA, PSMA o hK2. Algunos ejemplos de sitios de clivaje de PSA incluyen, a título meramente enunciativo, los mostrados en las SEC. ID. Nº: 5, 8, 11, y 14-21. En un ejemplo concreto, el sitio de clivaje de PSA incluye la SEC. ID. Nº: 5.

En algunos ejemplos, el sitio de clivaje de furina de la PA (aminoácidos 427-432 de la SEC. ID. Nº: 2) está sometido a deleción y se ha insertado un sitio de clivaje de proteasa específico prostático, como un sitio de clivaje de PSA (véase, por ejemplo, la FIG. 5B). En otros ejemplos, el sitio de clivaje de la furina de la PA está mutado y se ha

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insertado o añadido al extremo N-terminal o C-terminal de la furina un sitio de clivaje de la proteasa específico prostático, como un sitio de clivaje de PSA (véase, por ejemplo, la FIG. 5C).

También se divulgan variantes de moléculas de PA en las que el dominio de unión de PA está sometido a deleción funcional (véanse, por ejemplo, las FIG. 5D-M). Estas variantes de moléculas de PA pueden contener un sitio de clivaje de furina nativo (véanse, por ejemplo, las FIG. 5J-M), en las que se consigue llegar a las células prostáticas sustituyendo funcionalmente el dominio de unión de PA por un dominio de unión específico del tejido prostático. Alternativamente, las variantes de moléculas de PA contienen un sitio de clivaje de proteasa específico prostático (véanse, por ejemplo, las FIG. 5D-I), donde la activación de la protoxina se produce principalmente en las células que secretan una proteasa específica prostática. El dominio de unión de PA incluye los aminoácidos 1-83 de la SEC. ID. Nº: 2. El dominio de unión se puede someter a deleción funcional utilizando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo mediante la deleción de todos o algunos de los aminoácidos del dominio de unión, como la deleción de los aminoácidos 1-83 de la SEC. ID. Nº: 2 o 4 (véase, por ejemplo, la FIG. 5G), o a la deleción de uno o más de los aminoácidos 45-66 de la SEC. ID. Nº: 2 o 4 (véase, por ejemplo, la FIG. 5D, donde el * representa una o más deleciones). En otros ejemplos, el dominio de unión está sometido a deleción funcional mediante la introducción de una o más mutaciones específicas del sitio en la variante de la secuencia de PA, como W45A, I47E, M57A.Y61A y K66Q de la SEC. ID. Nº: 2 o 4 (véase, por ejemplo, la FIG. 5D, donde el * representa una o más mutaciones).

Se divulgan variantes de moléculas de PA que incluyen un dominio de unión específico del tejido prostático que sustituye funcionalmente al dominio de unión de PA nativa (véanse, por ejemplo, las FIG. 5E, 5F, 5H y 5I-M). El uso de uno o más dominios de unión específicos del tejido prostático puede mejorar la focalización en las células prostáticas y sus metástasis por parte de las variantes de moléculas de PA divulgadas. Hay varios dominios de unión específicos del tejido prostático conocidos. Algunos ejemplos incluyen, a título meramente enunciativo, la secuencia de la hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH), como las mostradas en las SEC. ID. Nº: 22 y 23, y los anticuerpos que reconocen el PSA y/o PSMA.

Uno o más de los dominios de unión específicos del tejido prostático se pueden enlazar con uno o más aminoácidos de las variantes de moléculas de PA divulgadas, aunque idealmente, no interfieren de forma significativa en la capacidad de la variante de PA para ser activada por una proteasa específica prostática, como el PSA, ni en la capacidad para formar poros en las membranas celulares. Por ejemplo, los dominios de unión específicos del tejido prostático se pueden enlazar o insertar en un extremo N-terminal o C-terminal de una variante de PA (véanse, por ejemplo, las FIG. 5E y 5H). En algunos ejemplos, el dominio de unión nativo de la PA está sometido a deleción (es decir, los aminoácidos 1-83 de la SEC. ID. Nº: 2 o 4), de forma que la unión o el enlace de un dominio de unión específico del tejido prostático en el extremo N-terminal resulta en la unión al aminoácido 84 de la SEC. ID. Nº: 2 o 4 (véanse, por ejemplo, las FIG. 5H y 5L). En otros ejemplos, se introducen deleciones más pequeñas o mutaciones puntuales en el dominio de unión nativo de la PA, de forma que la unión o el enlace de un dominio de unión específico del tejido prostático en el extremo N-terminal resulta en una unión al aminoácido 1 de la SEC. ID. Nº: 2 o 4 (o en cualquier aminoácido N-terminal tras la deleción funcional del dominio de unión de la PA nativa) (véanse, por ejemplo, las FIG. 5E y 5I). En algunos ejemplos, el aminoácido N-terminal de la PA se cambia por un Cys u otro aminoácido antes de unir un dominio de unión específico del tejido prostático, para ayudar al enlace del dominio de unión específico del tejido prostático a la variante de la proteína de PA.

Alternativa o adicionalmente, uno o más dominios de unión específicos del tejido prostático se pueden unir o enlazar con otros aminoácidos de una variante de una molécula de PA, como el aminoácido 215 o 300 de la SEC. ID. Nº: 2 o 4 (véanse, por ejemplo, las FIG. 5F, 5I,5K y 5M). En algunos ejemplos, un aminoácido Cys sustituye al aminoácido nativo en esa posición. Por ejemplo, se pueden realizar los siguientes cambios en la SEC. ID. Nº: 2 o 4: Tyr215Cys

o Ala300Cys. En un ejemplo, donde el dominio de unión específico del tejido prostático es un anticuerpo, se puede utilizar el enlace cruzado para unir anticuerpos a una variante de PA, por ejemplo haciendo reaccionar los grupos amino del anticuerpo con la cisteína que se encuentra en la variante de PA (como los aminoácidos Cys19, Cys75, Cys159 y/o Cys164 de la SEC. ID. Nº: 2).

También se divulgan variantes concretas de las moléculas de PA, como las mostradas en las SEC. ID. Nº: 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 24 y 25.

En algunos ejemplos, la variante de las moléculas de PA divulgadas está enlazada o inmovilizada en una superficie, como un gránulo. El gránulo también puede incluir un ligando específico prostático para mejorar la focalización en una célula prostática, como una célula cancerígena prostática localizada o metastásica.

Tratamiento del cáncer de próstata utilizando proaerolisina modificada

Las variantes de moléculas de PA divulgadas y comentadas anteriormente se activan específicamente como potentes citotoxinas dentro de los sitios del cáncer de próstata gracias a la actividad proteolítica de proteasas específicas prostáticas, como el PSA, PSMA y hK2. En algunos ejemplos, la focalización se consigue incluyendo uno o más dominios de unión específicos del tejido prostático, como el péptido de LHRH que se puede unir a su receptor específico de LHRH expresado por las células cancerígenas prostáticas, o anticuerpos de LHRH o PSMA, que se pueden unir al PSMA o la LHRH expresada en la superficie de las células cancerígenas prostáticas. Una persona con conocimientos en la técnica reconocerá que el uso de una variante de una molécula de PA que incluye un sitio de clivaje de furina y un anticuerpo o péptido de LHRH puede servir para tratar otros tipos de cáncer que expresan receptores de LHRH, como el melanoma y el cáncer de mama, ovario y pulmón, utilizando las variantes de

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las moléculas de PA y los métodos divulgados en el presente. Por otra parte, una persona con conocimientos en la técnica reconocerá que el uso de una variante de una molécula de PA que incluye un sitio de clivaje de furina o PSMA y/o un anticuerpo de PSMA puede servir para tratar otros tipos de cáncer en los que se expresa el PSMA (p. ej., en la vasculatura del tumor), como el cáncer de mama, colon, riñón, vejiga y cerebro, utilizando las variantes de moléculas de PA y los métodos divulgados en el presente.

Las variantes de moléculas de PA divulgadas, como ácidos nucleicos y/o proteínas, se pueden administrar local o sistémicamente, utilizando cualquier método conocido en la técnica, a los sujetos que padecen un cáncer de próstata localizado o metastásico. Por otra parte, las variantes de moléculas de PA divulgadas se pueden administrar a un sujeto para la terapia inmunoestimuladora. Debido a la especificidad de la unión y activación de las variantes de las moléculas de PA divulgadas, la administración local y sistémica debería tener un efecto mínimo sobre los tejidos normales del paciente e, idealmente, producir escasos o ningún efecto secundario.

En un ejemplo, las variantes de moléculas de PA divulgadas se inyectan en la glándula prostática (intraprostáticamente) y/o en el tumor prostático (intratumoralmente) en un sujeto que padece cáncer de próstata, como un tumor localizado. Esta inyección localizada y la posterior lisis de las células cancerígenas prostáticas dentro de la glándula prostática pueden producir un efecto inmunoestimulador que provoque una reducción o eliminación de la enfermedad micrometastásica en los sujetos tratados. De este modo, la enfermedad sistémica es tratada o reducida a través de una terapia aplicada localmente y mínimamente tóxica.

Adicional o alternativamente, las variantes de moléculas de PA divulgadas se pueden administrar sistémicamente, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea u oral, a un sujeto que padece cáncer de próstata, como un tumor de próstata metastásico. La terapia sistémica también puede tener un efecto antitumoral inmunoestimulador. Las variantes de moléculas de PA divulgadas que incluyen un sitio de clivaje de PSA no están hidrolizadas con proteasas séricas ni inactivan enzimáticamente el PSA dentro de la sangre. En su lugar, las variantes de moléculas de PA divulgadas no hidrolizadas se administran a través de la sangre en el fluido extracelular de los depósitos del cáncer metastásico, donde pueden ser hidrolizadas para convertirse en la toxina terapéutica activa a través del PSA enzimáticamente activo secretado por estas células cancerígenas prostáticas. Una vez hidrolizada, la toxina liberada entra en las células espectadoras que producen y que no producen PSA de la vecindad inmediata debido a su elevada capacidad de penetrar en la membrana y provoca la muerte citolítica de estas células.

También se divulga un método adicional para tratar sistémicamente el cáncer de próstata en un sujeto. En este método, las células cancerígenas prostáticas se eliminan del sujeto que padece cáncer de próstata, como un tumor de próstata metastásico. Alternativa o adicionalmente, se pueden utilizar líneas de células cancerígenas prostáticas establecidas. Algunos ejemplos de líneas de células cancerígenas prostáticas que se pueden utilizar incluyen, a título meramente enunciativo, los siguientes: células que producen PSA, como LNCaP (como las ATTC nº CRL-1740 y CRL-10995) y CWR22R (ATCC nº CRL-2505 y Nagabhushan et al, Cancer Res. 56(13):3042-6, 1996), o células que no producen PSA, como PC-3 (ATCC nº CRL-1435) y DU 145 (ATCC nº HTB-81). Las líneas celulares o células eliminadas se incuban o ponen en contacto con las variantes de moléculas de PA divulgadas. Esta incubación provoca la lisis de las células por parte de las variantes de moléculas de PA y la producción de un lisado celular que se administra al sujeto. En un ejemplo, el método incluye también la administración de factores inmunoestimuladores, lisados de células cancerígenas prostáticas diseñados para producir factores inmunoestimuladores y/o células cancerígenas prostáticas irradiadas (incluyendo células cancerígenas prostáticas diseñadas para producir factores inmunoestimuladores). Algunos ejemplos de factores inmunoestimuladores incluyen, a título meramente enunciativo, los siguientes: el factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF); miembros de la familia de proteínas de la interleucina, como, a título meramente enunciativo, la interleucina-2 y la interleucina-6, el factor estimulante de la colonia de granulocitos (G-CSF); y miembros de la familia del interferón, como el interferón alfa, beta o gamma. La administración de estos materiales a un sujeto puede ser simultánea al lisado celular (administración conjunta), anterior a la administración del lisado celular y/o posterior a la administración del lisado celular.

En un ejemplo, esta administración aumenta la capacidad de un sujeto para reducir el volumen de un tumor de próstata y/o tumor metastásico. Por ejemplo, los métodos divulgados pueden reducir el volumen de la célula tumoral prostática y/o el volumen de la célula tumoral metastásica, en al menos un 10%, como por ejemplo al menos un 20%

o más. Por otra parte, los métodos divulgados pueden provocar una reducción de los síntomas asociados al tumor de próstata y/o al tumor de próstata metastásico.

Las variantes de moléculas de PA divulgadas se pueden administrar como una terapia de modalidad única o emplearse en combinación con otras terapias, como la terapia de radiación y/o terapias de ablación androgénica (como agonistas/antagonistas del receptor de LHRH, antiandrógenos, estrógenos, inhibidores de la síntesis de esteroides adrenales, como ketoconazol y aminoglutetimida). Por otra parte, la administración de las variantes de las moléculas de PA divulgadas puede ser aislada o combinada con un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o combinada con otros compuestos terapéuticos, tales como los que reducen la producción de anticuerpos de las variantes de las proteínas de PA administradas (como Rituximab y esteroides), así como otros agentes antitumorales.

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La divulgación de determinados ejemplos específicos no tiene por objeto excluir otras realizaciones. Asimismo, todos los tratamientos descritos en el presente no excluyen necesariamente otros tratamientos, sino que pueden ser combinados con otros agentes bioactivos u otras modalidades de tratamiento.

EJEMPLO 1

Generación de toxinas de proaerolisina activadas por PSA

Este ejemplo describe los métodos empleados para producir las variantes de las toxinas de proaerolisina recogidas en la Tabla 1, que son activadas por el PSA. Una persona con conocimientos en la técnica entenderá que se pueden emplear métodos similares para producir otras variantes de proteínas de proaerolisina que son activadas por el PSA

o cualquier otra proteasa específica prostática. Estas proteínas se pueden producir sustituyendo la secuencia de furina de la proaerolisina por un sitio de clivaje de proteasa específico prostático, como una secuencia de clivaje específica de PSA (véase el Ejemplo 9).

Tabla 1: Variantes de proaerolisina específicas de PSA

Mutante (SEC. ID Nº)

Cambio(s) hecho(s) (SEC. ID. Nº) Comparación con proaerolisina de tipo salvaje ADSKVRRARSVDGAGQGLRLEIPLD (aa 424-448 de SEC. ID. Nº: 2)

PSA-PA1 (3&4)

KVRRAR (aa 427-432 de SEC. ID. Nº: 2) cambiado por HSSKLQ(5) ADSHSSKLQSVDGAGQGLRLEIPLD (aa 424-448 de SEC. ID Nº: 4)

PSA-IK. (6 & 7)

KVRRARSV (aa 427-434 de SEC. ID Nº: 2) cambiado por HSSKLQSA (8) ADSHSSKLQSADGAGQGRLEIPLD (aa 424-48 de SEC. ID. Nº: 7)

PSA-PA2 (9& 10)

KVRRAR (aa 427-432 de SEC. ID. Nº: 2) cambiado por QFYSSN(U) ADSQFYSSNSVDGAGQGLRLEIPLD (aa 424-448 de SEC. ID. Nº: 10)

PSA-PA3 (12 & 13)

KVRRAR (aa 427-432 de SEC. ID. Nº: 2) cambiado por GISSFQS (14) ADSGISSFQSS VDGAGQGIRLEIPLD (aa 424-448 de SEC. ID. Nº: 13)

Las variantes o modificaciones de las proaerolisinas (PA) mostradas en la Tabla 1 incluyen una secuencia de proaerolisina (PA de tipo salvaje mostrada en las SEC. ID. Nº: 1 y 2) en la que el sitio de reconocimiento de proteasa de la furina de seis aminoácidos (aminoácidos 427-432 de la SEC. ID. Nº: 2) fue sustituido por un sustrato de PSA. Por ejemplo, la toxina de la variante de proaerolisina (PA) denominada PSA-PA 1 (SEC. ID. Nº: 3 y 4), incluye una secuencia de PA en la que el sitio de clivaje de furina fue sustituido por el sustrato de PSA HSSKLQ (SEC. ID. Nº: 5).

La PCR recombinante fue utilizada para sustituir el sitio de la furina de la aerolisina (aminoácidos 427-432 de la SEC. ID. Nº: 2) por un sitio de clivaje específico de PSA (SEC. ID. Nº: 5, 8, 11 o 14), empleando métodos anteriormente descritos (Vallette et al., Nucl. Acids Res. 17:723-33, 1988). En resumen, la PCR recombinante se realizó en un volumen final de 50 μl que contenía 0,2 mM de deoxinucleósido trifosfato (dNTPs), 0,5 μu de cebadores directos e inversos, 0,1 μg de ADN de plantilla y 2,5 unidades de polimerasa de pfu clonada en un tampón de reacción de pfu [20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KC1, 10 mM (NH4)2S04, 2 mM MgS04, 0,1% Triton X100, y 0,1 mg/ml BSA].

La detección de las células transformadas para detectar el elemento insertado de proaerolisina se realizó mediante PCR utilizando polimerasa de Taq. Se preparó un cóctel en el tampón de reacción de la PCR [50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2) y 10mM Tris-HCl (pH 9.0)] que contenía 0,2 mM dNTPs, 0,5 μuM de cebadores directos e inversos, y 5 unidades de polimerasa de Taq. Las muestras de 10 μl de este cóctel se repartieron en partes alícuotas en tubos de 0,2 ml y se añadieron las células transformadas utilizando palillos estériles.

Los productos finales de la PCR fueron digeridos utilizando enzimas de restricción apropiadas y posteriormente unidas al vector de clonación pTZ18u (BioRad) para la amplificación. En resumen, las digestiones de restricción se realizaron a 37ºC durante 90 minutos en una solución tampón de Pharmacia One-Phor-All buffer [10 mM Tris-acetato (pH 7.5), 10 mM Mg-acetato, y 50 mM K-acetato] que contenía aproximadamente una unidad de enzima de restricción por cada μg de ADN. El elemento insertado resultante y el ADN del vector pTZl 8u se mezclaron en una

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absorbancia de la muestra a 540 nm con respecto a la absorbancia de la muestra tratada con Triton. La preincubación de la toxina de PSA-PA 1 (10-8 M) con PSA en una solución tampón acuosa solamente durante una hora antes de añadir los RBC resultó en una hemolisis aproximadamente del 45% (FIG. 2).

Para determinar si la PSA-PA 1 se activa en plasma humano, la toxina de PSA-PA 1 (10-8 M) fue incubada en plasma humano al 50% durante una hora. En un experimento relacionado, el exceso de PSA (10.000 ng/ml) se añadió primero al plasma humano y se dejó incubar durante varias horas. La PSA-PA1 que contenía plasma ± PSA fue posteriormente incubada con RBC humanos (2% en peso). La adición de PSA-PA 1 al plasma humano, o plasma humano al que se le ha añadido una elevada concentración de PSA, resultó en una hemolisis inapreciable (es decir, menos del 1% del control de Triton) (FIG. 2). Estos resultados demuestran que la PSA-PA1 se puede administrar sistémicamente sin ninguna activación significativa en la sangre, incluso cuando la sangre contenga una cantidad mensurable de PSA.

EJEMPLO 4

Toxicidad in vitro e in vivo de las variantes de proaerolisina

Este ejemplo describe métodos empleados para determinar la toxicidad in vitro e in vivo de las proteínas de proaerolisina modificada. Estos métodos se pueden utilizar para medir la toxicidad de cualquier variante de proteína de proaerolisina clivable por proteasa específica prostática.

Para determinar la toxicidad in vitro, se realizó un ensayo de viabilidad celular como sigue. Las células T de linfoma murino E14 (ATCC TIB-39) se cultivaron a 10+5 células por pocillo en MTS/PMS Cell Titer 96 (Promega). Las variantes de proaerolisina a 1 x 10-13 M-1 x 10-7 M se añadieron como se muestra en la FIG. 3 y se incubaron con las células durante cuatro horas a 37°C. Posteriormente se determinó la viabilidad celular leyendo la placa en un lector de placas, conforme a las instrucciones del fabricante del kit MTS/PMS. Como se muestra en la FIG. 3, las variantes de proaerolisina son menos tóxicas que la proaerolisina de tipo salvaje, con una LC50 de 4 x 10-9(PSA-PA 1), 1 x 10-9(PSA-1K), y 1 x 10-7 (PSA-PA2), frente a la LC50 de 1.5 x 10-10 la de tipo salvaje.

Para determinar la toxicidad in vivo, las variantes de proaerolisina se administraron a los ratones por vía intravenosa. La proaerolisina de tipo salvaje (SEC. ID. Nº: 2) fue altamente tóxica para los ratones; una dosis de 1 μg causó la muerte en una hora y la LD100 a las 24 horas (es decir, la dosis que mata al 100% de los animales en el plazo de 24 horas) tras una única inyección intravenosa fue de 0,1 /μg. Por lo contrario, la LD100 de PSA-PA1 (SEC. ID. Nº: 4) 24 horas después de la inyección fue 25 veces superior (es decir, 2,5 /μg de dosis total).

EJEMPLO 5

PSA-PA1 reduce el volumen de las células tumorales que secretan PSA

Sobre la base de los datos de toxicidad descritos en el Ejemplo 4, a una serie de ratones portadores de LNCaP (xenoinjertos del cáncer de próstata de LNCaP humano que producen PSA) y a una serie de ratones portadores de SN12C (ratones de control que tienen un xenoinjerto de carcinoma renal humano que no produce PSA) se les administró una única inyección intratumoral de 100 μl con 0,25 -25 μg de PSA-PA1 (0,1-10 veces la dosis de LD100). A las 48 horas después de la inyección, se extirparon los tumores, se fijaron y tiñeron con H&E para determinar el Ki-67 (índice proliferativo) y Tunel (índice apoptótico). El porcentaje de tumor dentro de la muestra se determinó calculando el ratio de tumor viable frente al área tumoral total siguiendo el análisis de las imágenes de secciones tumorales finas.

Como se muestra en la FIG. 4, la administración de 2,5 -25 μg de PSA-PA 1 redujo el volumen de la célula tumoral en un 85-99%, mientras que con 25 μg de PSA-PA se observó una reducción inferior al 20%. Por lo contrario, cuando a los ratones portadores de xenoinjertos de carcinoma renal humano SN12C que no produce PSA (células proporcionadas por el Dr. Isaiah Fidler, Anderson Cancer Center, Houston TX) se les inyectó PSA-PA1 intratumoralmente, no se observó ninguna reducción significativa (es decir, inferior al 25%) en el porcentaje de tumor viable con el mismo régimen de dosis (FIG. 4).

En los tumores de control (ratones SN12C), el índice proliferativo fue aproximadamente del 40%, 48 horas después de la administración de la PSA-PA 1 intratumoral. Por lo contrario, en los tumores tratados con PSA-PA 1 que respondieron al tratamiento, el porcentaje de células Ki-67 positivas fue inferior al 1% a las 48 horas. Por otra parte, en los tumores de control el índice apoptótico fue inferior al 1%, 48 horas después de la administración de la PSA-PA1 intratumoral, mientras que en los tumores tratados con PSA-PA1 todas las células fueron positivas antes de 48 horas (es decir, índice apoptótico >99%).

Estos resultados demuestran que la toxina PSA-PA1 mata eficiente y rápidamente a las células productoras de PSA y que esta citotoxicidad in vivo es específica y dependiente de la presencia de PSA en el fluido extracelular de los tumores.

EJEMPLO DE REFERENCIA 6

Focalización de la protoxina a través de dominios de unión específicos prostáticos

Este ejemplo describe métodos para generar y utilizar variantes de toxinas de proaerolisina activadas por proteasa específicas prostáticas en las que el dominio de unión de PA de tipo salvaje (o nativa) (aproximadamente los

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aminoácidos 1-83 de la SEC. ID. Nº: 2) es sustituido funcionalmente por un dominio de unión específico del tejido prostático, como el péptido de LHRH. El dominio de unión nativo de PA puede ser sometido a deleción funcional por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo mediante la deleción aproximadamente de los aminoácidos 183 de la SEC. ID. Nº: 2 (o fragmentos de la misma, como los 45-66), o mediante la inserción de mutaciones que reducen la capacidad de la PA para concentrarse en las membranas celulares.

El dominio de unión a las proteínas ancladas a GPI del extremo N-terminal de la PA (aproximadamente los aminoácidos 1-83 de la SEC. ID. Nº: 2) puede ser sometido a deleción funcional (por ejemplo, mediante la deleción de los aminoácidos 1-83 o mediante la inserción de mutaciones que dejan el dominio no funcional) sin afectar de forma significativa a la formación de poros. No obstante, se necesita un dominio de unión para concentrar la toxina en la membrana celular. Las proteínas mutantes que carecen del dominio de unión son citolíticas, pero solamente cuando las células están expuestas a diversos órdenes de concentraciones de magnitud superior de toxina. La mayor parte de la toxicidad in vivo de la variante y del tipo salvaje de la PA activada por PSA anteriormente descrita en el Ejemplo 4 se debe a la unión no específica a las proteínas ancladas a GPI expresadas por la mayoría de las células de los mamíferos. Para generar una protoxina más específica y menos tóxica a nivel sistémico, el dominio de unión a las proteínas ancladas a GPI no específico de la proaerolisina puede ser sometido a deleción funcional y sustituido por un dominio de unión específico del tejido prostático.

Anticuerpos

Un ejemplo de un fragmento de unión que se puede utilizar para focalizar una proteína de proaerolisina modificada con una alta especificidad para el tejido prostático es una proteína de fusión que incluye un anticuerpo de cadena única para una proteína de membrana específica prostática y anticuerpos que reconocen el PSMA o la LHRH fusionada a los dominios de la toxina. Idealmente, la unión del anticuerpo a una molécula de PA modificada no interferirá de forma significativa en la capacidad de la molécula para unirse a la membrana celular y concentrarse en la misma, provocando la muerte de la célula. Los anticuerpos se pueden unir al extremo N-terminal o C-terminal de una PA modificada empleando métodos de fusión de genes bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Debinski y Pastan, Clin. Cancer Res. 1:1015-22, 1995). Por ejemplo, el anticuerpo podría sustituir al pequeño lóbulo nativo de proaerolisina (aminoácidos 1-83 de la SEC. ID. Nº: 2), o se podría añadir el anticuerpo a una molécula de PA con mutaciones en el dominio de unión nativo. Esta proaerolisina modificada también puede incluir una secuencia de activación de PSA para aumentar la especificidad. En un ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo de cadena única del PSMA fusionado en el dominio de la toxina de PA.

Alternativamente, los anticuerpos o fragmentos FAB se pueden unir a una PA modificada mediante enlaces cruzados covalentes (véase, por ejemplo, Woo et al., Arch. Pharm. Res. 22(5):459-63, 1999 y Debinski and Pastan, Clin. Cancer Res. 1(9): 1015-22, 1995). Los enlaces cruzados pueden ser no específicos, por ejemplo, utilizando un agente de enlace cruzado reactivo a lisina homobifuncional, o pueden ser específicos, por ejemplo utilizando un agente de enlace que reacciona con los grupos amino del anticuerpo y con la cisteína que se encuentra en la variante de proaerolisina (como los aminoácidos Cysl9, Cys75, Cysl59, y/o Cysl64 de la SEC. ID. Nº: 2).

Ligandos

Otros fragmentos de unión que se pueden emplear son pequeños ligandos de péptidos que se unen a su receptor específico expresado en la membrana de las células cancerígenas prostáticas. Un ejemplo incluye, a título meramente enunciativo, los péptidos agonistas de la hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH) natural y sintética (véase, por ejemplo, el número de acceso Genbank CAA25526 y las SEC. ID. Nº: 22 y 23), que se unen con gran afinidad a los receptores de LHRH y péptidos que se unen selectivamente a PMSA. Los receptores de LHRH se expresan en un elevado porcentaje de los cánceres prostáticos humanos, pero no en las células hematopoyéticas. Esta expresión diferencial proporciona la especificidad de unión.

Se sabe que determinados residuos de LHRH, como Gly en la sexta posición (Gly6), pueden ser sustituidos sin comprometer la afinidad de unión del receptor (Janaky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:972-6, 1992; Nechushtan et al./ Biol Chem , 272:11597-603, 1997). Por tanto, se puede producir una variante de la toxina de PA (en la que el dominio de unión nativo está sometido a deleción funcional) que está covalentemente enlazada con una LHRH purificada D-Lys6 (en la amina épsilon de esta lisina).

La LHRH D-Lys6 (SEC. ID. Nº: 23) se puede unir a diversas porciones de una proteína de proaerolisina modificada que tiene un dominio de unión sometido a deleción funcional. No obstante, idealmente, esto no interferirá de forma significativa en la capacidad de la toxina de insertarse en la membrana para formar un poro. Por ejemplo, la amina épsilon del análogo de D-Lys6 se puede unir al extremo amino de la proaerolisina modificada a través de un enlace de ácido dicarboxílico. El clivaje mediante furina o una proteasa específica prostática (dependiendo del sitio de clivaje presente en el péptido de la proaerolisina) provocará la liberación de la porción inhibidora C-terminal mientras que la toxina permanecerá unida al receptor de LHRH.

Alternativa o adicionalmente, la amina épsilon del análogo de D-Lys6 de LHRH se puede unir directamente al carboxilo C-terminal de la proaerolisina modificada que carece de un dominio de unión de tipo salvaje funcional, mediante la adición de Cys al extremo C-terminal de la PA modificada y, a continuación, realizando un enlace cruzado de este Cys con la amina épsilon del análogo de D-Lys6 de la LHRH. Esta unión producirá un derivado de la proteína de PA en el que el péptido de LHRH se une al dominio inhibidor C-terminal de PA. El clivaje con furina o

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con una proteasa específica prostática, como PSA, liberará la toxina y dejará el fragmento inhibidor unido al receptor del LHRH. Por tanto, la formación de poros no se vería inhibida por una firme unión al receptor. Por otra parte, se pueden producir proteínas de fusión recombinantes en las que los péptidos de LHRH modificada se fusionan tanto con el extremo N-terminal como con el extremo C-terminal de la toxina de PA modificada que carece de un dominio de unión nativo funcional.

En otros ejemplos, se introduce un residuo de cisteína en la sexta posición del péptido de LHRH y el péptido unido a las toxinas de PA modificada a través de un puente de disulfuro, por ejemplo en los aminoácidos 215 y/o 300 de la SEC. ID. Nº: 2, donde los aminoácidos 215 y/o 300 han sido mutados a una cisteína. En otro ejemplo, se produce una proteína recombinante en la que el péptido de LHRH se fusiona con el extremo amino-terminal de la toxina de PA modificada.

Las proteínas de proaerolisina modificada resultantes que incluyen un dominio de unión específico del tejido prostático funcionalmente sustituido por el dominio de unión de PA nativa son testadas in vitro e in vivo para determinar la especificidad de la unión y la activación de la toxina, empleando los métodos descritos en los Ejemplos 1-5.

Para demostrar que los dominios de unión específicos del tejido prostático, como LHRH o PSMA, pueden ser funcionalmente sustituidos por el dominio de unión de PA nativa, se pueden realizar los siguientes experimentos. Los métodos descritos a continuación describen el uso de una molécula en la que el dominio de unión de PA nativa ha sido sometido a deleción y se ha unido la LHRH a la proaerolisina resultante. No obstante, se pueden emplear métodos similares para testar cualquier variante de molécula de PA, como las moléculas en las que se emplean otros dominios de unión específicos del tejido prostático y en las que el dominio de unión de PA está mutado (por ejemplo mediante la inserción de una o más de las siguientes mutaciones: W45A, I47E, M57A, Y61 A, K66Q, y W324A), en lugar de sometido a deleción.

Se producen proteínas de LHRH-proaerolisina que contienen la secuencia de activación de furina de la PA nativa. La especificidad de la unión de estas toxinas a las células de receptor de LHRH positivo (LNCaP) y negativo (TSU) se compara empleando los métodos descritos en el Ejemplo 2. Ambas líneas celulares activan la PA que contiene el sitio de activación de furina de tipo salvaje. Por tanto, a pesar de que cada una de las líneas puede activar las proteínas de LHRH-proaerolisina, el péptido ideal es uno que es tóxico a bajas concentraciones para las células de receptor de LHRH positivo. Utilizando estos métodos, se identifican las regiones de la proaerolisina a las que se puede unir el péptido LHRH sin interferir en la formación de canales por parte de la toxina.

Para demostrar que las proteínas LHRH-proaerolisina se unen al receptor de LHRH y también son activadas por el PSA, se generan toxinas que contienen un sitio de activación de PSA en lugar del sitio de la furina, utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 1. La activación de estas toxinas por parte de las células LNCaP productoras de PSA de receptor de LHRH positivo se compara con la activación de las células TSU no productoras de PSA de receptor de LHRH negativo, utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 2.

Las toxinas de proaerolisina activadas por LHRH-PSA son testadas in vivo para demostrar que la introducción del fragmento de unión de LHRH resulta en un descenso de la toxicidad no específica y en un incremento de la capacidad de focalización. Como se ha descrito anteriormente, la LD100 de estas toxinas tras una única inyección intravenosa se determina y compara con la correspondiente toxina activada por PSA que no contiene LHRH, utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 4. Posteriormente, la toxina se administra a diversas dosis, como de 0,1 μg a 1 mg, por vía intravenosa, a animales portadores de LNCaP para demostrar que a unas dosis más elevadas y menos tóxicas de toxina se observa un efecto antitumoral mejorado.

EJEMPLO 7

Determinación de la antigenicidad de la proaerolisina

Este ejemplo proporciona métodos para determinar si los péptidos de proaerolisina modificados divulgados en el presente son antigénicos. Por otra parte, se divulgan métodos para reducir la potencial antigenicidad.

Como se describe en los Ejemplos anteriores, la inyección intratumoral de PSA-PA1 (SEC. ID. Nº: 4) demuestra la utilidad de la toxina como terapia para el cáncer de próstata localizado a través de una inyección intraprostática. No obstante, esta terapia también se puede administrar por otras vías, como intravenosa (iv), intramuscular, oral, etc., como terapia sistémica para el cáncer de próstata metastásico. No obstante, la administración sistémica de las variantes de péptidos de PA divulgadas en el presente puede provocar el desarrollo de una reacción del anticuerpo neutralizador que limitaría la dosificación repetida.

La cinética y magnitud de la reacción del anticuerpo a cualquiera de las variantes de PA divulgadas en el presente se pueden determinar como sigue. Por ejemplo, la respuesta antigénica a PSA-PA1 (SEC. ID. Nº: 4) se puede determinar en ratones inmunocompetentes, para determinar un régimen de dosificación que se puede emplear en un ser humano inmunocompetente. A los ratones inmunocompetentes (C57-BL6) se les administran dosis intravenosas de PSA-PA1 (SEC. ID. Nº: 5) tanto diariamente x 5 como semanalmente x 3 a un régimen de dosis de 0,1 μg a 5 μg. Los ratones son sacrificados a diversos intervalos (p. ej., tras una única dosis, tras múltiples dosis) y se obtiene suero. Se puede utilizar un ensayo basado en ELISA para detectar la presencia de anticuerpos contra la proaerolisina. En este ensayo, se fija una cantidad definida de proaerolisina a la superficie de poliestireno en placas

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ejemplos de líneas de células cancerígenas prostáticas humanas incluyen la LNCaP productora de PSA (como ATTC nº CRL-1740 y CRL-10995) o células CWR22R (ATCC nº CRL-2505 y Nagabhushan et al, Cancer Res. 56(13):3042-6,1996), o PC-3 no productoras de PSA (ATCC No. CRL-1435) y DU 145 (ATCC nº HTB-81). Aproximadamente, 107-103 células de cualquier fuente (paciente o líneas celulares) se incuban con 1 μg de PA (tipo salvaje o variante) durante una hora a 37ºC en PBS estéril. El lisado resultante se mezcla bien agitando fuertemente las pipetas y la suspensión se administra a un sujeto mediante inyección subcutánea de unos 0,5 ml. Los pacientes pueden ser tratados semanalmente con tres dosis. Se controla de cerca de los pacientes, con exploraciones físicas semanales. La respuesta inmunológica a la PA subcutánea se puede controlar testando la presencia de anticuerpos para PSA, PSMA y hK2, y testando la respuesta de las células B y T, utilizando la metodología anteriormente descrita (Simons et al. Cancer Res. 59:5160-8, 1999).

Alternativa o adicionalmente, las células cancerígenas prostáticas de un paciente o las líneas de células cancerígenas prostáticas diseñadas para expresar proteínas inmunoestimuladoras (como GM-CSF) son incubadas con PA (de tipo salvaje o variante) y utilizadas para producir el lisado (véase, por ejemplo, Simons et al. Cancer Res. 59:5160-8, 1999). Las células cancerígenas prostáticas lisadas con PA pueden ser administradas conjuntamente con las células cancerígenas prostáticas irradiadas que producen moléculas inmunoestimuladoras. La irradiación provoca la apóptosis de las células. Se espera que la combinación de células matadas mediante citolisis y células matadas mediante inducción de la apóptosis produzca efectos inmunoestimuladores superiores (Sauter et al. J. Exp. Med 191:423-33, 2000). En un ejemplo, a un sujeto se le administran conjuntamente células cancerígenas prostáticas lisadas con PA combinadas con proteína inmunoestimuladora. En otro ejemplo, las células cancerígenas prostáticas lisadas con PA se administran subcutáneamente y una proteína inmunoestimuladora, como GM-CSF, interleucinas, interferones, G-CSF (Dranoff et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3539-43, 1993) se administra sistémicamente.

Administración intraprostática de proaerolisina modificada

Otro método que se puede emplear para estimular una respuesta inmunológica sistémica en un sujeto que padece cáncer de próstata consiste en administrar las toxinas de proaerolisina modificada divulgadas en el presente directamente en la glándula prostática del sujeto. Por ejemplo, las toxinas de proaerolisina modificada se pueden administrar directamente en la glándula prostática (o el propio tumor) de un sujeto humano que tiene un tumor de próstata o en ratones ProHA transgénicos seguida de una transferencia adoptiva de células T sensibilizadas a la hemaglutinina (HA). Se espera que la citolisis tras la inyección intraprostática de toxinas de proaerolisina modificada provoque la respuesta inmunológica a la HA en la glándula prostática del ratón ProHA o a los antígenos tumorales prostáticos en los seres humanos. El ratón transgénico ProHA expresa la HA de la proteína de la influenza bajo el control del promotor de probasina específico prostático. El ratón ProHA expresa la HA solamente en la glándula prostática. En este sistema, las células T CD4 y CD8 específicas de un ratón donante diferente son sensiblizadas mediante exposición a HA y posteriormente sometidas a transferencia adoptiva al ratón transgénico de HA.

A los sujetos se les administra una dosis intraprostática subletal de proaerolisina modificada (por ejemplo, determinada empleando los métodos descritos en el Ejemplo 4). Dado que los ratones ProHA no producen PSA ni un homólogo enzimáticamente equivalente, se utiliza la aerolisina de tipo salvaje. No obstante, en seres humanos se administran una o más de las toxinas de proaerolisina modificada divulgadas. Veinticuatro horas después de la inyección intraprostática, algunos ratones son sacrificados y se les extirpan las próstatas para analizar el grado de necrosis. A un segundo grupo de ratones inyectados se les administrarán células T CD4 y CD8 específicas de HA, que han sido obtenidas de donantes transgénicos TCR inoculados con 109 pfu de hemaglutinina recombinante que expresa el virus de las vacunas anteriormente descrito (Staveley-O'Carroll et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 95:117883,1998). Estas células T son Thy 1.1 y son transferidas a los ratones ProHA que son Thyl.2+. Cuatro días después de la transferencia adoptiva a los ratones ProHA tratados con proaerolisina, los ratones receptores son sacrificados para extirpar, disociar y lavar el bazo, los nódulos drenantes prostáticos y axilares (irrelevantes).

Para evaluar la activación de las células T específicas, se pueden realizar los siguientes ensayos: un millón de células aisladas se tiñen utilizando un anticuerpo anti-Thy 1.1. marcado con ficoeritrina y un anticuerpo anti-CD4 o CD8 marcado con citocromo (Pharmingen, San Diego, CA). Las células aisladas son analizadas utilizando FacsScan (Becton Dickinson). El índice de expansión de las células T específicas de HA se calcula dividiendo el porcentaje de células clonotípicas (Thy 1.1+) de los animales tratados con ProHA por el porcentaje de células clonotípicas en una ubicación tisular idéntica de los controles ProHA no tratados. Por otra parte, el ratio del porcentaje de células clonotípicas en el drenaje prostático frente a los nódulos linfáticos irrelevantes proporciona un índice de proliferación específica prostática tras el tratamiento con PA. En otro ensayo, la proliferación específica del antígeno se mide como se ha descrito anteriormente (Adler et al. J. Exp. Med. 187:1555-64, 1998). En resumen, el grupo de linfocitos

o esplenocitos es incubado con el péptido de clase II HA (proliferación específica de células CD4) o con el péptido de clase I HA (proliferación específica de células CD8). Las células son cultivadas durante tres días y después pulsadas con timidina tritiada durante una noche; posteriormente, son cosechadas y se determinan los recuentos. Los recuentos incorporados mayores con respecto al control significan la activación de células T específica.

Las glándulas prostáticas de los ratones ProHA tratados con PA que han recibido células T Thy 1.1 específicas de HA se analizan como sigue. Las secciones prostáticas fijadas de los ratones tratados se tiñen con el anticuerpo de Thy 1.1 biotinilado (Pharmingen) y se contratiñen con peroxidasa de estreptavidina empleando procedimientos

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Los péptidos fueron marcados por fluorescencia (aminometil cumarina). Se realizaron ensayos en 50 mM Tris, 0,1 M NaCl, pH 7.8.

Las secuencias mostradas en la Tabla 2 incluyen sustratos que fueron eficiente, aunque no específicamente, hidrolizados con PSA (KGISSQY; SEC. ID. Nº: 15) y SRKSQQY; SEC. ID. Nº: 16), y los que no fueron eficiente, aunque sí específicamente, hidrolizados con PSA (ATKSKQH; SEC. ID. Nº: 17 y LGGSSQL; SEC. ID. Nº: 19). Las características de estas toxinas modificadas se pueden comparar con la secuencia de PSA-PA 1 que contiene la secuencia HSSKLQ (SEC. ID: Nº: 5). Como control, se produce una toxina modificada en la que el sitio de activación está completamente sometido a deleción (EX–PA).

Estas toxinas purificadas son estudiadas para detectar la presencia de hidrolisis de PSA utilizando el ensayo de hemolisis descrito en el Ejemplo 3. La proaerolisina de tipo salvaje no es activada o es citolítica para los eritrocitos. No obstante, la activación de la proaerolisina con proteasas provoca una rápida hemolisis. En resumen, para testar la activación de PSA, se incuban diversas concentraciones de variantes de toxinas de PA purificadas con PSA durante una hora, se lavan y se les añaden glóbulos rojos (RBC) libres de suero (2% en peso). Cuando ha transcurrido otra hora, las mezclas de la incubación se centrifugan y se determina la absorbancia del supernatante a 540 nm. La concentración mínima de toxina modificada necesaria para lisar el 50% de los RBC se determina para clasificar las toxinas en función de la eficiencia para la hidrólisis de PSA.

Para determinar tanto la activación de PSA como la especificidad de la activación, se realizan ensayos de citotoxicidad exponiendo las toxinas de PSA-proaerolisina purificadas a líneas de células cancerígenas que producen PSA (LNCaP) y que no producen PSA (TSU) in vitro, utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 2. La concentración necesaria para matar el 50% de las células (IC50) se puede determinar para cada variante de toxina de PA con respecto tanto a las líneas de LNCaP como a las de TSU. La diferencia porcentual en la citotoxicidad se emplea para clasificar las toxinas activadas por PSA en función de la especificidad.

Las variantes de las toxinas de PA también se pueden estudiar in vivo para determinar la actividad antitumoral mediante una inyección intratumoral en los xenoinjertos de LNCaP que producen PSA en los ratones desnudos, utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 5. Como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 5, la inyección intratumoral de la toxina de PAS-PA 1 reduce el tumor en el plazo de 48 horas. Por lo contrario, la proaerolisina de tipo salvaje, que es activada más eficientemente tanto por las líneas celulares que producen PSA como por las que no producen PSA in vitro, tuvo un efecto mínimo sobre los xenoinjertos de LNCaP. Esto indica que la cinética de la activación de la toxina puede ser importante para el efecto antitumoral general. La PSA-PA 1 es activada más específicamente por el PSA, aunque la cinética de la activación es más lenta que con la toxina de tipo salvaje. Esto puede permitir que la PSA-PA 1 se distribuya más ampliamente por todo el tumor. Por tanto, paradójicamente, los mejores sustratos de PSA del sitio de activación pueden provocar un efecto antitumoral general reducido in vivo.

Para evaluar la distribución de la proaerolisina activada por PSA frente a la PA de tipo salvaje, intratumoralmente o en el tejido normal, se pueden emplear las proteínas de PA y PSA-PA 1 marcadas fluorescentemente (como FITC). Los xenoinjertos de LNCAP que producen PSA son inyectados con la PA y la PSA-PA1 marcadas fluorescentemente. A las 24 horas de la inyección intratumoral, los tumores son extirpados, fijados y seccionados para el análisis microscópico. Las proteínas de la proaerolisina marcadas fluorescentemente que se han insertado en las membranas celulares son retenidas durante todo el proceso de fijación. Estas secciones son posteriormente analizadas utilizando un microscopio fluorescente equipado con el correspondiente conjunto de filtros para determinar el grado de distribución de las toxinas de proaerolisina en toda la muestra tumoral.

Posteriormente, las variantes de toxinas de PA son inyectadas en los xenoinjertos de LNCaP y se valora la respuesta antitumoral mediante la medición del tumor una vez transcurridas 48 horas, empleando los métodos descritos en el Ejemplo 5. Las variantes de las toxinas de PA son clasificadas en función del efecto antitumoral in vivo tras la inyección intratumoral.

Por otra parte, las variantes de toxinas de PA pueden ser testadas para valorar la toxicidad sistémica general, determinando la dosis que mata al 100% de los ratones (es decir, la LD100) tras una única inyección intravenosa, utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 4.

Utilizando estos métodos, se identifica que las variantes de toxinas de PA activadas por PSA son más eficiente y específicamente activadas por PSA, menos tóxicas a nivel sistémico y que producen el efecto antitumoral más pronunciado in vivo. Estas variantes de toxinas de PA activadas por PSA también se pueden modificar utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 6.

EJEMPLO 10

Reducción de la antigenicidad de la toxina de proaerolisina modificada activada por PSA

Este ejemplo describe otros métodos que se pueden utilizar para producir y caracterizar la antigenicidad y la eficacia antitumoral de otras protoxinas activadas por proteasa formadora de poros modificada.

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presente, al objeto de seleccionar y proporcionar restricciones conformacionales en la estructura que permitan una estabilidad mejorada. Por ejemplo, se puede añadir un residuo de cisteína carboxi-terminal o amino-terminal al péptido, de forma que, una vez oxidado, el péptido contenga un enlace de disulfuro, generando un péptido cíclico. Otros métodos de ciclación de péptidos incluyen la formación de tioéteres, y amidas y ésteres carboxi-terminales y amino-terminales.

Para mantener un péptido funcional, determinadas variantes del péptido diferirán solamente en un pequeño número de aminoácidos de un péptido. Estas variantes pueden tener deleciones (por ejemplo de 1-3 o más aminoácidos), inserciones (por ejemplo de 1-3 o más residuos) o sustituciones, que no interfieran con la actividad deseada del péptido. Las variantes sustitutivas son aquellas en las que al menos un residuo de la secuencia de aminoácidos ha sido eliminado y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. En determinadas realizaciones, estas variantes tienen sustituciones de aminoácidos de residuos únicos, por ejemplo 1, 3, 5 o incluso 10 sustituciones en una proteína.

Las realizaciones peptidomiméticas y organomiméticas también se divulgan en el presente, en las que la disposición tridimensional de los componentes químicos de estos peptidomiméticos y organomiméticos imita la disposición tridimensional del segmento principal del péptido y de las cadenas laterales de aminoácidos que componen el péptido, resultando en peptidomiméticos y organomimétidos de una toxina de PA modificada que tiene la capacidad de lisar células productoras de PSA. Para las aplicaciones de modelización informática, un farmacóforo es una definición tridimensional idealizada de los requisitos estructurales para la actividad biológica. Los peptidomiméticos y organomiméticos pueden ser diseñados para adaptarse a cada farmacóforo con el software de modelización informática actual (utilizando el diseño de fármacos asistido por ordenador o CADD). Véase Walters, "Computer-Assisted Modeling of Drugs", en Klegerman & Groves, eds., 1993, Pharmaceutical Biotechnology, Interpharm Press: Buffalo Grove, IL, pp. 165-174 and Principles of Pharmacology (ed. Munson, 1995), capítulo 102, para obtener una descripción de las técnicas utilizadas en CADD.

EJEMPLO 14

Métodos para expresar péptidos de proaerolisina modificada

Alternativamente (o adicionalmente) a la administración de un péptido de proaerolisina modificada para tratar el cáncer de próstata, el tratamiento a largo plazo o sistémico (por ejemplo, para tratar o prevenir la metástasis del tumor) se puede conseguir expresando las toxinas de proaerolisina modificada divulgadas in vivo.

La presente divulgación proporciona métodos para expresar un péptido de proaerolisina modificada en una célula o tejido in vivo. En un ejemplo, la transfección de la célula o el tejido se produce in vitro. En este ejemplo, la célula o el tejido (como un injerto) se extirpa de un sujeto y posteriormente se transfecta en un vector de expresión que contiene un ADNc que codifica la proteína de interés. Las células transfectadas producirán proteína funcional y pueden ser reintroducidas en el sujeto. En otro ejemplo, un ácido nucleico que codifica la proteína de interés se administra a un sujeto directamente (por ejemplo, por vía intravenosa, intratumoral o intraprostática) y la transfección se produce in vivo.

Los métodos y péptidos de proaerolisina modificada divulgados en el presente se pueden utilizar para tratar a un sujeto con un tumor de próstata. Este método reduciría el volumen del tumor y, en algunas realizaciones, evitaría o trataría la metástasis del tumor prostático.

Los procedimientos científicos y médicos necesarios para la transfección de células humanas son ahora rutinarios. La disponibilidad pública de proaerolisina, dominios de unión y proteína de proteasa específica prostática, así como secuencias de ADNc, permite desarrollar la expresión genética in vivo en seres humanos (y otros mamíferos) basándose en estos procedimientos. Por otra parte, en el presente se divulgan determinadas variantes de moléculas de proaerolisina. La inmunoterapia de pacientes con melanoma utilizando linfocitos de infiltración tumoral (TIL) diseñados genéticamente ha sido documentada por Rosenberg et al. (N. Engl. J. Med. 323:570-8,1990). En ese estudio, se empleó un vector de retrovirus para introducir un gen para la resistencia a neomicina en los TIL. Se puede emplear un planteamiento similar para introducir el ADNc de un péptido de proaerolisina modificada en un sujeto que padece cáncer de próstata.

Una estrategia general para transferir genes en células de un donante se divulga en la Patente estadounidense nº

5.529.774. Por lo general, un gen que codifica una proteína que tiene efectos terapéuticamente deseados es clonado en un vector de expresión viral y ese vector es posteriormente introducido en el organismo diana. El virus infecta las células y produce la secuencia de proteína in vivo, donde tiene su efecto terapéutico deseado (Zabner et al. Cell 75:207-16, 1993).

Puede que sólo sea necesario introducir el ADN o los elementos de la proteína en determinadas células o tejidos. Por ejemplo, si un sujeto solamente tiene un tumor de próstata, la introducción de la proteína o el ADN solamente en la próstata (o el tumor) puede ser suficiente. No obstante, en algunos ejemplos, puede resultar más terapéuticamente efectivo y sencillo tratar todas las células de un sujeto o diseminar de forma más amplia el vector, por ejemplo mediante administración intravascular (i.v.) u oral. Por ejemplo, si un sujeto padece un tumor de próstata metastásico, la introducción sistémica de la proteína o el ADN puede resultar necesaria.

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