FI116467B - Uudet peptidiligandit - Google Patents

Uudet peptidiligandit Download PDF

Info

Publication number
FI116467B
FI116467B FI20002159A FI20002159A FI116467B FI 116467 B FI116467 B FI 116467B FI 20002159 A FI20002159 A FI 20002159A FI 20002159 A FI20002159 A FI 20002159A FI 116467 B FI116467 B FI 116467B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
psa
seq
peptide
peptides
binding
Prior art date
Application number
FI20002159A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20002159A0 (fi
FI20002159A (fi
Inventor
Ulf-Haakan Stenman
Jari Leinonen
Erkki Koivunen
Original Assignee
Licentia Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Licentia Oy filed Critical Licentia Oy
Publication of FI20002159A0 publication Critical patent/FI20002159A0/fi
Priority to FI20002159A priority Critical patent/FI116467B/fi
Priority to AU2001293893A priority patent/AU2001293893B2/en
Priority to AU9389301A priority patent/AU9389301A/xx
Priority to PCT/FI2001/000856 priority patent/WO2002026777A1/en
Priority to CA002423966A priority patent/CA2423966A1/en
Priority to US10/363,662 priority patent/US7414023B2/en
Priority to JP2002531160A priority patent/JP4647882B2/ja
Priority to EP01974361A priority patent/EP1332152A1/en
Publication of FI20002159A publication Critical patent/FI20002159A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI116467B publication Critical patent/FI116467B/fi
Priority to US12/044,388 priority patent/US20080312141A1/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K7/00Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

1 116467
Uudet peptidiligandit Keksinnön tausta Keksinnön ala
Esillä oleva keksintö koskee uusia peptidiligandeja eturauhasen spesifisen antigeenin 5 sitomiseksi ja sen entsyymiaktiivisuuden tehostamiseksi. Esillä oleva keksintö koskee myös menetelmää näiden peptidien valmistamiseksi. Lisäksi esillä oleva keksintö koskee näitä peptidejä sisältäviä farmaseuttisia ja diagnostisia koostumuksia ja peptidien käyttöä farmaseuttisiin ja diagnostisiin valmisteisiin. Vielä lisäksi esillä oleva keksintö koskee näiden peptidien käyttöä lääkkeinä ja diagnostisina aineina, lääkkeiden ja diagnostisten 10 aineiden valmistukseen j a biokemiallisissa eristys- j a puhdistusmenetelmissä.
Vastaavan alan kuvaus
Eturauhasen spesifinen antigeeni (PSA) on eturauhasen epiteelisolujen hyvin spesifinen tuote (1). PSA on 30 kD:n seriiniproteaasi Jonka biologinen pääfunktio on seminaalisen geelin nesteyttäminen, joka on muodostunut ejakulaation jälkeen semenogeliinien 15 proteolyyttisellä hajotuksella, jotka ovat siemenhyytymän pääasialliset rakenneosat (2).
Siemennesteessä oleva PSA koostuu pääasiassa vapaasta PSA:sta, sisältäen PSA:n : : entsymaattisesti aktiivisia muotoja ja proteolyyttisesti hajotettuja tai NICKED muotoja (3).
♦ · i Ihmisen seerumissa PSA:n tärkeimmät immunoreaktiiviset muodot ovat PSA-al - :": antikymotrypsiinikompleksi (PSA-ACT) ja vapaa PSA (PSA-F) (4).
• · • · 1 • · . 1 ·. 20 Seerumin PSA:n mittaamista käytetään laajalti eturauhassyövän havaitsemiseen potilailla . ’ 1 ‘. ja hoitoon ja sitä käytetään enenevässä määrin tämän taudin seulontaan. Tärkein ongelma PSA:n käyttämisessä seulontaan on korkea väärien positiivisten määrä, jonka : ’ \: hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu aiheuttaa. Tätä voidaan vähentää mittaamalla joko 1 1 1: PS A-ACT :n tai vapaan PS A:n osuus suhteessa kokonais-PS A:han (4), mutta lisäparannus : ·. 25 PS A:n syöpäspesifisyydessä on toivottavaa. Tämä voidaan saavuttaa kehittämällä . ‘ · 1. spesifisiä määrityksiä PSA:n vähäisemmille muunnoksille. Eturauhassyöpäsolut erittävät • · · .!. ensisijaisesti PSA:n proentsyymimuotoa (5), kun taas NICKED-PSA:n on osoitettu i ; muodostuvan hyvänlaatuisessa kudoksessa (6). Näin ollen näiden PSA:n muotojen määrityksillä on potentiaalista kliinistä käyttöä, mutta näille muodoille spesifisten 30 monoklonaalisten vasta-aineiden (MAb) kehittäminen on olut vaikeata. Toinen määritys, 2 116467 jolla on diagnostista käyttöä, on PSA-alfa-2-makroblobuliinikompleksin (PSA-A2M) määritys (7). Tässä kompleksissa eivät suuren molekyylipainon omaavat sitoutumistekijät kuten vasta-aineet kuitenkaan pääse käsiksi PSA:han, koska inhibiittori kapseloi proteinaasin. Näin ollen PSA-A2M:n määritys vaatii kompleksin denaturoimista (7).
5 Suoran määrityksen kehittäminen PSA-A2M:lle vaatisi pienen sitoutumistekijän, joka tulee inhibiittoriin ja tunnistaa spesifisesti PSA:n.
PS A saattaa estää tuumorikasvua (8) ja sen on äskettäin osoitettu synnyttävän angiostatiinia plasminogeenistä (9). Koska angiostatiini estää tuumorikasvua estämällä uusien verisuonten muodostumista tuumoriin, voi angiostatiinin synnyttäminen hidastaa 10 tuumorin kehittymistä. PSA:n entsyymiaktiivisuutta moduloivat aineet voisivat näin ollen olla potentiaalisesti hyödyllisiä eturauhassyövän hoidossa.
MAb:t ovat laajalti käytettyjä työkaluja syövän kuvantamiseen ja hoitoon. MAb:iden suuri koko kuitenkin rajoittaa niiden kykyä diffundoitua verenkierrosta kudoksiin. Hiiren vasta-aineet ovat lisäksi immunogeenisiä ihmisissä, mikä rajoittaa niiden käyttöä hoitoon. MAb:t 15 voivat olla pitkään tarjolla verenkierrossa ja olla vuorovaikutuksessa Fc-reseptoreiden kanssa normaaleissa kudoksissa, vaarantaen potilaan, kun toksiineja tai radioisotooppeja on liitettynä (10). Nämä ongelmat voidaan eliminoida käyttämällä vaihtoehtoisia pienen molekyylipainon omaavia sitomistekijöitä.
• · ·
Vaihtoehto MAbiien käytölle spesifisten sitomistekijöiden kehityksessä on käyttää • · · · :**: 20 peptidikirjastoja ja faaginäyttötekniikka. PSA:ta sitovia peptidejä on ennen tuotettu : ’ \! polysomivalintamenetelmällä (11), mutta nämä peptidit eivät moduloineet PSA:n : : entsyymiaktiivisuutta, ja osoitettiin, etteivät ne olleet hyödyllisiä PSA-määritysten osana.
« · · :... · Denmeade ym. ovat kehittäneet peptidisubstraatteja PSA:lle semenogeliinin sekvenssin perusteella, joka on PSA:n substraatti siemennesteessä (12). Näitä peptidejä ei kuitenkaan •. ’ ·: 25 voida käyttää tekniikoissa, joissa vaaditaan pysyvää sitoutumista PSA:han.
.. ’ Vaikka edeltävä pohdinta osoittaa, että joitakin PSA:n kanssa reagoivia peptidejä on "... kehitetty, ei niiden ole osoitettu moduloivan PSA:n entsyymiaktiivisuutta tai olevan • · • funktionaalisia PSA:n detektoinnin sovellutuksissa. 1 » 3 116467
Keksinnön yhteenveto
Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on eliminoida aiemmin tunnetun alan ongelmat ja saada aikaan uusia PSA:ta sitovia kemiallisia aineita. Erityisesti keksinnön tavoitteena on saada aikaan uusia peptidiligandeja ja niiden funktionaalisia vastineita, jotka ovat 5 hoidollisesti ja diagnostisesti käyttökelpoisia etenkin sellaisten sairauksien hoidossa ja diagnosoinnissa, joihin sisältyy PSA:n vapautuminen seerumiin.
Toisena tarkoituksena on saada aikaan menetelmä uusien peptidiligandien valmistamiseksi eturauhasen spesifiselle antigeenille, jotka ligandit kykenevät moduloimaan sen entsyymiaktiivisuutta.
10 Kolmantena tarkoituksena on saada aikaan farmaseuttisia j a diagnostisia koostumuksia, jotka sisältävät uusia kemiallisia yhdisteitä, jotka kykenevät sitoutumaan PSA:han.
Lisäksi keksinnön neljäntenä tarkoituksena on saada aikaan uusia diagnostisia ja hoidollisia menetelmiä.
Nämä ja muut tarkoitukset, yhdessä niiden etujen kanssa tunnettuihin sitoutumistekijöihin 15 ja menetelmiin verrattuna, saavutetaan esillä olevalla keksinnöllä tässä jäljempänä kuvatulla ja patenttivaatimusten osoittamalla tavalla.
• · • · .' . Esillä oleva keksintö perustuu havaintoon, jonka mukaan ryhmä uusia peptidejä, joilla on ! spesifinen rakenne (spesifisiä aminohapposekvenssejä tai motiiveja), kykenee sitoutumaan • · . . selektiivisesti vapaaseen PSA:han tai PSA:han kompleksissa A2M:n kanssa ja . * · ·. 20 moduloimaan sen entsyymiaktiivisuutta. Keksinnön mukaiset peptidit sisältävät vähintään . · · ·. yhden kysteiinien parin, j oita erottaa toisistaan vähintään lukumäärältään kaksi • · • · · aminohappoa ja jotka kykenevät muodostamaan syklisen rakenteen, jossa on disulfidisidos .'. : mainitun vähintään yhden kysteiinien parin välillä. Johtuen disulfidisidoksesta kysteiinien • · välillä peptidin pääketju on taipunut ja sillä on 3-ulotteinen konformaatio, jotka voidaan : 25 käyttää perustana samanlaisen bioaktiivisuuden kuin peptideillä omaavien . · · ·. peptidyylianalogien tai peptidomimeettisten yhdisteiden kehitystyölle.
: : : Uudet peptidit, jotka ovat esimerkkeinä esillä olevista sitomistekijöistä, on löydetty :. ‘ * - käyttäen sellaisten peptidien faaginäyttökirj astoj a, j otka olivat suunniteltuj en disulfidisidosten konformationaalisesti rajoittamia. Yllättäen, ja täysin vastoin odotuksia 30 aktiivisimmat peptidit tehostavat PSA:n entsyymiaktiivisuutta pienimolekyylipainoisia 4 116467 kromogeenisiä substraatteja ja luonnollisia proteiinisubstraatteja kohtaan. Tätä PSA:n kasvanutta aktiivisuutta voidaan käyttää hyödyksi monissa sovellutuksissa, etenkin käytettäessä PSA:n entsymaattisen aktiivisuuden tehostamista hoidollisiin tarkoituksiin.
Tarkemmin sanoen, esillä olevan keksinnön mukaisille peptidiligandeille ja niiden 5 funktionaalisille vastineille on pääasiassa tunnusomaista se, mitä ilmoitetaan patenttivaatimusten 1-16 tunnusmerkkiosissa.
Esillä olevan keksinnön mukaiselle diagnostiselle koostumukselle on pääasiassa tunnusomaista se, mitä ilmoitetaan patenttivaatimuksen 17 tunnusmerkkiosassa.
Esillä olevan keksinnön mukaiselle farmaseuttiselle koostumukselle on pääasiassa 10 tunnusomaista se, mitä ilmoitetaan patenttivaatimuksen 18 tunnusmerkkiosassa.
Esillä olevan keksinnön mukaiselle peptidiligandien valmistusmenetelmälle on pääasiassa tunnusomaista se, mitä ilmoitetaan patenttivaatimuksen 19 tunnusmerkkiosassa.
Esillä olevan keksinnön mukaiselle hoitomenetelmälle on pääasiassa tunnusomaista se, mitä ilmoitetaan patenttivaatimuksen 20 tunnusmerkkiosassa.
15 Esillä olevien peptidimotiivien ja -sekvenssien käytölle on pääasiassa tunnusomaista se, ... mitä ilmoitetaan patenttivaatimusten 21-26 tunnusmerkkiosissa.
• · : ·. : Esillä olevan keksinnön avulla saadaan huomattavia etuja. Esillä oleva keksintö saa aikaan ensimmäistä kertaa PSA:ta sitovia ligandeja, jotka kykenevät moduloimaan ja jopa ‘ : spesifisesti tehostamaan PSA:n entsyymiaktiivisuutta. Esillä olevan keksinnön mukaiset ;" * 20 peptidit voivat sitoutua spesifisesti PSA:n erilaisiin muotoihin osana • · * * ’ immunopeptidimäärityksiä. Peptideillä on lisäksi sitoutumisspesifisyyksiä, joita ei ole . . saatu vasta-aineilla. Esillä olevat peptidit ja vastaavat peptidomimeettiset yhdisteet voidaan > » » !.. ’ formuloida farmaseuttisiksi koostumuksiksi PSA:ta erittävistä soluista riippuvaisten tautien [ · * hoitoa varten.
• * • · » :' ”: 25 Denmeaden ym. kehittämät peptidit on konjugoitu sytotoksiseen lääkeaineeseen . ·: ·. aihiolääkkeen muodostamiseksi, joka aktivoituu, kun PSA hajottaa sen (13). Analogisella . ’. ; tavalla voidaan käyttää esillä olevia peptidejä, jotka sitoutuvat PSA:n kanssa stabiilisti, selektiivisesti toimittamaan perille sytotoksisia lääkkeitä, geeniterapiavektoreita ja kuvantamisaineita eturauhassyöpäkudokseen, ilman minkään aktivaatiovaiheen tarvetta.
116467 5
Seuraavassa keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin yksityiskohtaisen kuvauksen avulla ja viittaamalla mukaan liitettyihin piirroksiin.
Piirrosten lyhyt kuvaus
Kuvio 1 esittää GST-peptidien sitoutumista immobilisoituun PSA:han.
5 Kuvio 2 esittää Zn2+:n vaikutusta GST-peptidien sitoutumiseen PSA:han.
Kuvio 3 kuvaa PSA:n vaikutusta liuoksessa GST-C-4:n sitoutumiseen kiinteän faasin PSA:n kanssa.
Kuviot 4a ja 4b esittävät, vastaavassa järjestyksessä, GST-peptidien reaktiivisuutta erilaisten PSA:n sukuisten proteinaasien ja PSA-serpiinikompleksien kanssa.
10 Kuvio 5 esittää GST-C-4:n fuusioproteiinin fraktiointia geelisuodatuksella.
Kuvio 6 kuvaa GST-peptidien sitoutumista PSA:n proentsyymimuodon ja aktiivisen PSA:n kanssa.
Kuvio 7 kuvaa kemiallisesti syntetisoitujen peptidien vaikutusta GST-C-4:n sitoutumiseen kiinteän faasin PSA:han.
15 Kuvio 8 esittää GST-C-4:n vaikutuksen PSA:n entsyymiaktiivisuuteen.
’ ’ Kuvio 9 kuvaa kemiallisesti syntetisoidun peptidin C-4 vaikutuksen PSA.n "· ; entsyymiaktiivisuuteen.
Kuvio 10 kuvaa kemiallisesti syntetisoidun peptidin C-4 ja A-l vaikutusta PSA.n :,. t · proteolyyttiseen aktiivisuuteen IGF-BP-3:a kohtaan.
20 Kuvio 11 esittää GST-C-4:n ja Zn2+:n yhteisvaikutuksen PSA:n entsyymiaktiivisuuteen.
‘;; _: Kuvio 12 kuvaa kemiallisesti syntetisoidun peptidin C-4 vaikutusta A2M:n kanssa ';' kompleksina olevan PSA:n entsyymiaktiivisuuteen.
6 116467
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Määritelmät:
Esillä olevan keksinnön tarkoitusta varten termi ’’ligandi” tarkoittaa kemiallista yhdistettä tai osaa kemiallisesta yhdisteestä, joka kykenee sitoutumaan suuressa 5 polypeptidimolekyylissä, kuten hormonissa, tai solun pinnalla läsnä olevaan sitoutumisdomeeniin. Esillä olevat peptidiligandit sitoutuvat PSA:han, ja moduloivat tai jopa monessa tapauksessa lisäävät sen entsyymiaktiivisuutta synteettistä ja luonnollista IGF-BP-3 -substraattia vastaan. Esillä olevassa yhteydessä ’’ligandia” käytetään synonyyminä ’’sitoutumistekijälle”.
10 Ligandi on yleensä kemiallinen yhdiste, esim. peptidi, joka on liukoinen fysiologisiin liuoksiin tai veden ja seerumin kanssa sekoittuva. Esillä olevien ligandien sitoutumista PSA:han voidaan luonnehtia ’’pysyväksi” (päinvastoin kuin esim. entsymaattinen reaktio) siinä suhteessa, että ligandi liittyy PSA:n sitoutumisdomeeniin siinä määrin, että sen sitoutuminen voidaan mitata ja määrittää esim. pintaplasmoniresonanssilla tai 15 immunopeptidomimeettisellä määrityksellä (IPMA-määritys). Sitoutunutta ligandia ei lisäksi voida pestä tai huuhdella pois fysiologisesti puskuroidulla vedellä. Esillä olevien ligandien sitoutumisvahvuus on vastaava kuin rintasyövän kohdentamiseen käytettyjen peptiditekij öiden (14).
: : Esillä olevien ligandien sitoutuminen PSA:han on ’’selektiivistä”, minkä osoittaa se : j 20 tosiseikka, että MAb.t (monoklonaaliset vasta-aineet), jotka ovat spesifisiä vapaalle *: ” PSA:lle ja seriiniproteinaasi-inhibiittoreille kompleksina PSA:n kanssa, estävät ligandien :. ’ · · sitoutumisen PSArhan. Esillä olevat ligandit näyttäisivät sitoutuvan PS A:n aktiivisen •... * kohdan läheisyydessä sijaitsevaan kohtaan, mutta tämä on vain teoria, jonka sitomia emme '* halua olla. Esillä olevat peptidit ja vastaavat peptidomimeettiset yhdisteet tyypillisesti 25 sitoutuvat ’’vapaaseen” PSArhan tai kompleksina a2-makroglobuliinin kanssa olevaan : : PSArhan. Vapaa PSA on PSArn muoto, jota eturauhasen epiteelisolut syntetisoivat ja •; · ’ erittävät.
* » * , · · *. ’’Peptidi” tarkoittaa usean toisiinsa amidisidoksin sitoutuneen aminohapon nauhaa peptidirungon muodostamiseksi. Yleensä peptidit käsittävät molekyylejä, joiden . 30 molekyylipaino on alle 10 kDa, s.o. sisältävät noin 90 aminohappoa tai vähemmän.
Peptidejä voidaan nimittää ’’pieniksi peptideiksi”, kun ne koostuvat noin 6-30 7 116467 aminohappoyksiköstä. Kuten edellä mainittiin, sisältävät esillä olevat peptidit yleensä vähintään yhden kysteiiniyksiköiden välisen disulfidisidoksen muodostaman ristisidoksen. Jos peptidit sisältävät useita kysteiinipareja, voi tällaisten ristisidosten lukumäärä olla moninkertainen. Disulfidisidosten lisäksi peptidien välillä voi olla muitakin ristisidoksia.
5 Joidenkin esimerkkipeptidien spesifisiä rakenteita pohditaan jäljempänä yksityiskohtaisemmin.
’’Peptidyylianalogit” ovat peptidien kemiallisia johdannaisia, jotka perustuvat peptidien modifiointiin erilaisin kemiallisin reaktioin, kuten sykloadditiot, kondensaatioreaktiot ja nukleofiiliset additiot.
10 ’’Peptidomimeettiset yhdisteet” ovat yhdisteitä, jotka muistuttavat edellä mainittuja alkuperäisiä peptidejä. Ne rakentuvat yleensä erilaisista kemiallisista rakenneyksiköistä kuin niistä aminohapoista, jotka muodostavat alkuperäiset peptidit. Voidaan esimerkiksi käyttää ei-peptidyyliyhdisteitä kuten bentsolaktaami- tai piperatsiiniperusteisia analogeja, jotka perustuvat alkuperäisten peptidien primaarisekvenssiin (15,16). Peptidomimeettisten 15 yhdisteiden j a alkuperäisten peptidien välinen samankaltaisuus perustuu rakenteellisiin j a funktionaalisiin yhtäläisyyksiin. Näin ollen peptidomimeettiset yhdisteet jäljittelevät alkuperäisten peptidien bioaktiivista konformaatiota ja, esillä olevan hakemuksen tarkoituksiin, niiden sitomisaktiivisuus PSA:n sitoutumiskohdan suhteen on samanlainen kuin peptidin, jota ne muistuttavat. Peptidomimeettiset yhdisteet voidaan koota 20 aminohapoista (kuten D-aminohapoista), joita ei esiinny alkuperäisissä peptideissä, tai ne ; ‘: voidaan valmistaa muista yhdisteistä, jotka muodostavat amidisidoksia tai jopa : *: esterisidoksia. Esimerkkeihin synteettisistä peptidomimeettisistä yhdisteistä kuuluvat ; \ j poly(esteri-imidi)t, polyesterit, N-alkyyliaminosyklinen urea, tiourea, bisykliset ; (,, · guanidiinit, imidatsolipyridinoindolit, hydantoiinit ja tiohydantoiinit (15, 16).
* « 25 Peptidomimeettisten yhdisteiden voidaan luonnehtia olevan ’’rakenteellisesti ja funktionaalisesti vastaavia” kuin peptidit.
I * · > « · > » '; · Yleensä uusi sitoutumistekijä eturauhasen spesifiselle antigeenille (PSA) sisältää joko j » · * * · . ’ * *. (a) peptidin, jossa on vähintään 6 aminohappoa sitoutuneena yhteen » * muodostaen peptidirungon ja joka sisältää vähintään yhden parin I · 30 kysteiinejä, jotka ovat erillään toisistaan lukumäärältään vähintään kahdella aminohapolla ja liittyneinä toisiinsa disulfidisidoksella 8 116467 kysteiinien, välissä olevien aminohappojen ja disulfidisidoksen määrittelemän syklisen rakenteen muodostamiseksi; tai (b) peptidomimeettisen yhdisteen, jolla on samanlainen spatiaalinen konformaatio kuin peptidillä (jäljitellen alkuperäisen peptidin 5 bioaktiivista konformaatiota).
Mainituista yhdisteistä molemmat osoittavat selektiivistä sitoutumista vapaaseen eturauhasen spesifiseen antigeeniin ja PSA-A2M:aan (kuten edellä on määritelty).
Esillä olevan keksinnön ensimmäisen edullisen suoritusmuodon mukaisesti uudet PSA:ta sitovat peptidiligandit perustuvat kaavan (I) mukaisten peptidimotiivien syklisiin 10 rakenteisiin (disulfidisidos kysteiinien välissä) CX‘X2XXXX6XXC (I) jossa X1 on V tai I, X2 on F, I, W tai P, X6 on Y, N tai L, 15 C on kysteiini, ja kukin X merkitsee riippumattomasti jotain aminohappotähdettä.
Erityisesti, kaavassa (I) X1 on V tai I, X2 on F tai I ja X6 on Y tai N. Kun X1 on V ja X2 on . * : F, on X6 silloin edullisesti Y ja kukin X on aminohappotähde, joka valitaan
: riippumattomasti ryhmästä, joka koostuu tähteistä T, S, D, Y A, F, E, P, ja L. Kun X1 on V
« 20 ja X2 on I, on X6 edullisesti N ja kukin X on aminohappotähde, joka valitaan • ·
• ' · riippumattomasti ryhmästä, joka koostuu tähteistä Y, D, G, H, W, P, ja V. Lisäksi kun X
;; · ’ on I ja X2 on edullisesti F, X6 on Y tai N, ja kukin X on aminohappotähde, joka valitaan • * · * riippumattomasti ryhmästä, joka koostuu tähteistä E, P, D, S, Y, G, F, I ja L.
| Esimerkkejä peptideistä edustavat seuraavien mukaiset sekvenssit; SEQ ID NO.t A-l (SEQ
25 ID NO 1), A-2 (SEQ ID NO 2), A-4 (SEQ ID NO 4), Z-6 (SEQ ID NO 20), Z-7 (SEQ ID : v: NO 21), Z-8 (SEQ ID NO 22), ja Z-10 (SEQ ID NO 24) taulukossa 1 ja SEQ ID NO:t A-3 ; ‘ ; (SEQ ID NO 3) ja Z-9 taulukossa 1 (SEQ ID NO 23).
I I
I ► « » 9 116467
Taulukko 1. PSA:ta sitovien peptidien aminohapposekvenssit.
SEQ ID Koodi Kirjasto Peptidisekvenssi Isolaattien luku I A-l* CX8C CV FTSDYAFC 2 5 2 A-2 CX8C CV IYDGNHWC 2 3 A-3 CX8C CIFEPDYSYC 2 4 A-4 CX8C CVFDDLYSFC 1 5 B-l CX10C CTFSVDYKYLMC 15 6 B-2* CX10C CVFAHNYDYLVC 2 10 7 B-3 CX,0C CRFDKEYRTLVC 1 8 C-l CX3CX4CX2C CVSYCLFEFCYVC 2 9 C-2 CX3CX4CX2C CVEYCWEGSCYVC 7 10 C-3 CX3CX4CX2C C VAYCEE WEC YVC 1 II C-4* CX3CX4CX2C CVAYCIEHHCWTC 3 15 12 C-5 CX3CX4CX2C CVSYCDGLQCWMC 1 13 D-l CX3CX3CX3C CLSTCAQSCRISC 7 14 D-2 CX3CX3CX3C CLLYCHDACWWVC 2
15 Z-l CX3CX4CX2C CVTYCYGEVCYYC
16 Z-2 CAAYCVAGLCYGC
: 20 17 Z-3 CVQYCIGGDC WFC
18 Z-4 C VV YCDSMKC WTC
• ·
;J 19 Z-5 CVAYCISSLC YYC
i t
20 Z-6 CX8C CVWYTGNTWC
21 Z-7 CVFDALYTFC
25 22 Z-8 CV1YPGNVWC
23 Z-9 CIFDGFYILC
V: 24 Z-10 CVPYLGLWLC
25 Z-l 1 CX10C CMFDPMYMWMTC
< · 116467 ίο
Yksijuosteinen DNA puhdistettiin faagiklooneista kolmen PSA:lla tehdyn selektiokerran jälkeen. Peptidisekvenssit pääteltiin faagigenomin vastaavan alueen DNA-sekvensseistä. Useissa klooneissa havaitut konsensustähteet on osoitettu lihavoidulla kirjasinlajilla. Glutationi-S-transferaasi (GST) -fuusioproteiineina ilmennetyt peptidit on osoitettu 5 tähdellä.
Esillä olevan keksinnön toisen edullisen suoritusmuodon mukaisesti uudet PSA:ta sitovat peptidiligand.it voivat lisäksi perustua kaavan (II) mukaisten peptidimotiivien sykliseen rakenteeseen CX1X2XXXX6XX8X9X,0C (II) 10 jossa X1 onV, TtaiR, X2 on F, X6 on Y,
X8 on Y tai T X9 onL
15 X10 on V tai M, ja X ja C merkitsevät samaa kuin edellä.
Edullisesti kaavassa (II) X1 on V, X2 on F, X6 on Y, X8 on Y, X9 on L, X10 on V ja X valitaan ryhmästä, jonka koostumus on A, H, N ja D. Edullisista sekvensseistä : T: erimerkkeinä ovat SEQ ID NO:t B-1 (SEQ ID NO 5), B-2 (SEQ ID NO 6) ja B-3 (SEQ ID
; : : 20 NO 7) taulukossa 1.
M* · 7 » I » * » · » > ,», : Esillä olevan keksinnön kolmannen edullisen suoritusmuodon mukaisesti uudet PSA:ta • ; · i · ,' · ·. sitovat peptidiligandit perustuvat kaavan (III) mukaisten peptidimotiivien sykliseen .'". rakenteeseen * » * f s , , CX1X2X3CXXXXCX8X9C (III) » * i i t \.,: 25 jossa X1 on V tai A, V: X2 on A, S, E, T, V tai Q, X3 onY, ' » »
! X8 onYtai W
i. t ; X9 on V, T, M, Y, G tai F ja 30 X ja C merkitsevät samaa kuin edellä.
116467 11
Erityisesti kaavan (II) mukaiset peptidimotiivit tai sekvenssit sisältävät seuraavat aminohappotähteet: X1 on V, X2 on A tai S, X3 on Y, X8 on Y tai W, X9 on Y, Y tai T, ja kukin X valitaan riippumattomasti ryhmästä, jonka koostumus on L, F, E, W, G, S, I, H, D, G, L, Q, Y, V, A, M ja K. Kuten jäljempänä tullaan pohtimaan yksityiskohtaisemmin, 5 saavutetaan vahva sitoutuminen PSA:han klooneilla, jotka sisältävät motiivin CVAYC (SEQ ID NO 11). Näin ollen kaavassa III X1 on edullisesti V, X2 on Aja X3 on Y.
Peptidit, joilla on kaava (III), esitetään seuraavilla sekvenssinumeroilla taulukossa I: SEQ ID C-l (SEQ ID NO 8)- C-5 (SEQ ID NO 12), Z-l (SEQ ID NO 15)- Z-6 (SEQ ID NO 20) jaZ-8 (SEQ ID NO 22).
10 Esillä olevan keksinnön neljännen edullisen suoritusmuodon mukaisesti uudet PSA:ta sitovat peptidiligandit perustuvat kaavan (IV) mukaisten peptidimotiivien sykliseen rakenteeseen CX,XX3CXXXCX7XXXC (IV) jossa X1 on L, 15 X3 on T tai Y, X7 on R tai W, ja X ja C merkitsevät samaa kuin edellä.
. ’ . Edullisesti X1 on L ja X3 on T. Vastaaville sekvensseille taulukossa 1 on annettu numerot SEQIDNO:tD-l (SEQ ID NO 13)jaD-2 (SEQ ID NO 14).
' · _': 20 Esillä oleva tutkimus koskee myös edellä kuvattujen motiivien käyttöä johtosekvensseinä ;;;' vaihtoehtoiset tunnuspiirteet omaavien sitomistekijöiden kehittämiselle.
:, * · · Esillä olevan keksinnön toisena tarkoituksena on saada aikaan uusia PS A:ta sitovia ’... · peptidiligandeja, jotka perustuvat taulukossa 1 lueteltuihin sekvensseihin. Peptidit, joilla
:' ·.. 25 on SEQ ID A-1 (SEQ ID NO 1)- A-4 (SEQ ID NO 4), B-1 (SEQ ID NO 5)- B-3 (SEQ ID
NO 7), C-l (SEQ ID NO 8)-C-5 (SEQ ID NO 12)jaD-l (SEQ ID NO 13)-D-2 (SEQ ID
. *: ·. NO 14), eristettiin kuten jäljempänä menetelmäosuudessa kuvataan. Peptidit Z-l (SEQ ID
.'. : NO 15) - Z-11 (SEQ ID NO 25) eristettiin kuten A-, B-, C- ja D-sarjan peptidit, mutta 200 μΜ ZnCl2 sisällytettiin puskuriin, jota käytettiin pännäykseen.
,2 1 1 6467
Esillä oleva keksintö koskee myös diagnostisia koostumuksia, jotka sisältävät jonkin määrän uusia PSA:ta sitovia peptidejä. Esillä olevia peptidejä ja diagnostisesti hyväksyttävää kantajaa sisältävää diagnostista koostumusta voidaan käyttää sellaisenaan tai määrityksen kiinteän faasin matriksiin immobilisoituna peptidikonjugaattina tai 5 leimattuna peptidijäljitysreagenssina. Esillä olevan keksinnön mukainen diagnostinen koostumus on käyttökelpoinen mittauksissa, jotka perustuvat PSA:n erilaisten molekulaaristen muotojen määritykseen. Diagnostiset koostumukset sisältävät aktiivisen komponentin nestefaasissa, edullisesti vesifaasissa, noin 0,1 -500 pg/l:n pitoisuudessa. Koostumukset voivat sisältää detergenttejä, kuten Tween tai polysorbaatit, ja 10 stabilointiaineita. Muiden komponenttien pitoisuudet voivat olla noin 0-50% koostumuksen painosta.
Esillä oleva keksintö koskee myös farmaseuttista koostumusta, joka sisältää jonkin määrän uusia PSA:ta sitovia peptidiligandeja. Esillä olevan keksinnön mukaisia uusia PSA:ta sitovia peptidejä sisältävää farmaseuttista koostumusta voidaan käyttää systeemisesti, 15 paikallisesti ja/tai topikaalisesti, ja voidaan antaa esim. parenteraalisesti, suonensisäisesti, ihonalaisesti, lihaksensisäisesti, nenänsisäisesti, keuhkoaerosolina tai depot-muodossa. Koostumukset voivat myös sisältää kaikkia mahdollisia peptidien yhdistelmiä leimausreagenssien, kuvantamisreagenssien, lääkkeiden ja muiden kemikaalien/molekyylien kanssa.
• · · « · ! ·:: 20 Esillä oleva keksintö koskee myös peptidien käyttöä välittämään geeninsiirtoa PSA:ta : · ·: ilmentäviin soluihin tai soluihin PSA:ta ilmentävien solujen läheisyydessä. Yleiskuvaus : ·. i peptidien käytöstä geeninsiirron välittämiseen on löydettävissä viitteestä 17.
, · · ·. Suonensisäiseen infuusioon tai injektioon sopivat farmaseuttiset koostumukset ovat erityisen edullisia ja ne sisältävät aktiivisen komponentin yleensä pitoisuuksina, jotka ovat . ·. : 25 noin 0,1 - 500 g/1, edullisesti noin 1 — 250 g/1. Jonkin verran korkeammat pitoisuudet ovat . ‘ . edullisia (esim. noin 20 - 200 g/1) mahdollistamaan antaminen potilaille liiallista ;.' tilavuustaakkaa aiheuttamatta. Valmiste voidaan lyofilisoida ja liuottaa uudelleen ennen , · · ·. antamista tai se voidaan säilyttää liuoksena valmiina annettavaksi. Liuostuotteen pH on alueella noin 5 - noin 8, edullisesti lähellä fysiologista pH:ta. Liuoksen osmolaalisuus ; . 30 voidaan säätää edulliseen vähintään 200 mosmol/l:n arvoon käyttäen natriumkloridia ja/tai sokereita, polyoleja tai aminohappoja tai vastaavanlaisia komponentteja. Koostumukset voivat lisäksi sisältää farmaseuttisesti hyväksyttäviä täyteaineita ja stabilointiaineita, kuten 116467 13 albumiinia, sokereita ja erilaisia polyoleja. Näiden komponenttien määrä voi vaihdella laajalti vaihteluvälillä, joka on noin 0-50 paino-% aktiivista komponenttia. Nestemäiset formulaatiot tarjoavat sen lisäedun, että ne ovat valmiita annettavaksi ilman uudelleen liuottamista.
5 Oraalista antamista varten voi olla tarpeen valmistaa esillä olevien peptidien johdannaisia.
Erityisen kiinnostavan suoritusmuodon mukaisesti peptidit (ja peptidomimeetit) sisällytetään liposomipakkaukseen, joka sisältää diagnostisia/hoidollisia yhdisteitä kuten sytotoksisia lääkkeitä doksorubisiini ja metotreksaatti. Liposomipakkauspeptidejä ilmaistaan viitteissä 18,19. Peptidien kytkeminen liposomin pintaan mahdollistaa sen 10 kohdentamisen PSA:ta tuottaviin soluihin.
Esillä oleva keksintö sisältää myös uusien PSA:ta sitovien peptidien käytön reagenssien valmistukseen hyvänlaatuisen ja pahanlaatuisen eturauhastaudin ja muista PSA:ta tuottavista kudoksista johtuvien tautien PSArhan perustuvaa diagnoosia varten.
Esillä oleva keksintö sisältää myös uusien PSA:ta sitovien peptidien käytön edellä 15 mainittujen farmaseuttisten valmisteiden valmistamiseen esillä olevan keksinnön käyttöön perustuvien sairauksien hoitoa ja kohdentamista varten. Esillä oleva keksintö sisältää myös uusien PSA:ta sitovien peptidien käytön sairauksien hoitoon, jotka perustuvat PSA:n ’: ’: entsyymiaktiivisuuden säätelyyn. Uusia peptidejä ja rakenteellisesti ja funktionaalisesti ; vastaavia peptidomimeettejä (=aktiiviset komponentit) voidaan näin ollen yleensä käyttää : 20 farmaseuttisissa koostumuksissa hoitamaan nisäkkään syöpiä sekä muita sairauksia :: antamalla tehokas annos peptidiä tai peptidomimeettiä tai niiden hoidollisesti :... * hyväksyttävää happoa tai suolaa tai johdannaista farmaseuttisessa kantajassa. Ne voidaan '* antaa farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan kanssa annoksina, jotka ovat noin 1 - noin 1 000 mikrogrammaa kg ruumiinpainoa kohden päivittäin. Kuten edellä mainittiin, ‘‘: 25 koostumus voidaan antaa parenteraalisesti, suonensisäisesti, ihonalaisesti,
♦ I
•: · * lihaksensisäisesti, nenänsisäisesti, keuhkoaerosolin välityksellä tai depot-muodossa.
. · * ’. Esillä oleva keksintö koskee myös uusien PSA:ta sitovien peptidien käyttöä PS A:n eri muotoj en biokemiallisiin eristämis- j a puhdistusmenetelmiin.
*. *: Esillä oleva keksintö koskee myös menetelmää näiden PSA:ta sitovien peptidien 30 valmistamiseksi tavanomaisella kiinteän faasin Merrifield-peptidisynteesillä.
1 1 6467 14
Esillä olevan keksinnön mukaisia peptidejä voidaan käyttää sellaisenaan tai leimattuina johdannaisina osana PSA:n eri molekulaaristen muotojen kvantitatiivisia määrityksiä, tai yhdisteinä PSA:n aktiivisuuden säätelemiseksi tai PSA:ta tuottavien solujen kohdentamiseksi.
5 Lisäksi näitä peptidejä voidaan käyttää johtoyhdisteinä peptidomimeettien suunnittelemiseksi edellä kuvattuihin tarkoituksiin. Peptidejä voidaan myös käyttää pylväskromato-grafisissa matriiseissa PSA:n eri muotojen biokemialliseen eristämiseen ja puhdistamiseen. Vielä lisäksi, esillä olevan keksinnön mukaisia motiiveja voidaan käyttää johto-sekvensseinä vaihtoehtoisia ominaispiirteitä omaavien sitomistekijöiden kehitystyölle.
10 Esillä olevia peptidejä voidaan myös käyttää menetelmissä PSA:n entsyymiaktiivisuuden ja PSA:n aktiivisuudesta riippuvaisten tilojen moduloimiseksi käyttämällä näitä peptidejä joko in vivo tai in vitro. Lisäksi esillä olevan keksinnön mukaisia peptidejä voidaan käyttää PSA:n biokemiallisissa eristys- ja puhdistusmenetelmissä.
Esillä olevan keksinnön mukaiset peptidit mytös lisäävät PSA:n aktiivisuutta IGF-BP-3:a 15 vastaan, ja näin ollen ne vaikuttavat PSA:n aktiivisuuteen luonnollisia substraatteja vastaan. Näin ollen esillä olevat peptidit ovat potentiaalisesti käyttökelpoisia PSA:n biologisen funktion moduloimiseksi eturauhasen patologiassa ja fysiologiassa. On mielenkiintoista, että yksikään tunnistetuista peptideistä ei inhiboinut • * * entsyymiaktiivisuutta.
20 PSA:n on osoitettu inhiboivan endoteelisolujen lisääntymistä ja invaasiota [8,1999 #626], • · :: ja halkaisevan plasminogeenin angiostatiinia vastaaviksi fragmenteiksi, joka estää :... · endoteelisolujen kasvua j a verisuonten muodostumista (9). Esillä olevat peptidit sitoutuvat :... · PSA:han, ja lisäävät sen entsyymiaktiivisuutta synteettistä ja luonnollista substraattia vastaan. Näin ollen peptidit voisivat myös lisätä PSA:n kykyä tuottaa angiostatiinia ja estää • '· 25 syövän etenemiseen liittyvää verisuonten kasvua.
» ·
Eturauhaselle hyvin spesifisen ilmentymisensä johdosta PSA on potentiaalinen kohde , · * ·. eturauhassyöpähoidolle. Denmeade ym. ovat kehittäneet peptidisubstraatteja (12), jotka .;. PSA spesifisesti hajottaa. Nämä peptidit on konjugoitu sytotoksiseen lääkkeeseen » · * ! . aihiolääkkeen muodostamiseksi, joka aktivoituu, kun PSA hajottaa sen (13). Analogisella 30 tavalla esillä olevan keksinnön mukaisia peptidejä voidaan käyttää selektiivisesti toimittamaan perille sytotoksisia lääkkeitä, geeniterapiavektoreita ja kuvantamisaineita 15 1 1 6467 eturauhassyöpäkudokseen. Näiden peptidien pieni koko mahdollistaa niiden tunkeutumisen tehokkaasti eturauhaskudokseen. Peptideitä, jotka ohjautuvat selektiivisesti spesifisten kohdekudosten endoteeliin, on aiemmin kehitetty faaginäytöllä (20). PSA:n sitomispeptidiemme eturauhasspesifisyys mahdollistaa samoin niiden paikallistumisen 5 spesifisesti PSA:ta tuottaviin soluihin.
Seuraavat ei-rajoittavat esimerkit kuvaavat keksintöä lisää.
Esimerkki 1. PSA:ta sitovan faagin tunnistaminen Kätevä tapa kehittää uusia sitomistekijöitä eri kohteita varten on seuloa sattumanvaraisten peptidien kirjastoja. Faaginäyttö on tehokas uusien ligandien selektiomenetelmä erilaisille 10 kohdeproteiineille (21), mukaan luettuna entsyymit, vasta-aineet ja reseptorit.
Faaginäyttökirjastot tarjoavat tavan tunnistaa spesifisiä ligandeja, joilla on vasta-aineiden sitoutumisspesifisyyksistä eroavia sitoutumisspesifisyyksiä.
F aaginävttökiri astot
Faaginäyttöpeptidikirjastojen rakentaminen fUSE 5 -faagissa on kuvattu (21). Käytettiin 15 kirjastoja rakentein CXgC, CXioC, CX3CX3CX3C ja CX3CX4CX2C, joissa C on kysteiini ja X on jokin 20 luonnollisesti esiintyvästä aminohaposta.
/ ‘ Vasta-aineet ja proteiinit
»M * · · I
...: MAb 5E4:n kehittäminen kuvataan erillisessä raportissa (Leinonen, käsikirjoitus • · : valmisteilla). MAb Hl 17 saatiin Abbott Diagnostics’lta (North Chicago, IL, USA) ja 5A10 • · :. 20 oli EG&G-Wallac’lta, Turku, Suomi. Anti-faagi-monoklonaalinen vasta-aine oli * · · :' ”: ystävällinen lahjoitus tri. Petri Savirannalta, Turun yliopisto, Turku, Suomi.
Polyklonaalinen anti-GST-vasta-aine oli Amersham Pharmacia Biotech.’Itä. PSA : * \: puhdistettiin ihmisen siemennesteestä aiemmin kuvatulla tavalla (3). HK2 oli ystävällinen ' · lahjoitus tri. Janita Lövgreniltä, Turun yliopisto, Turku, Suomi. Proteinaasit kymotrypsiini I ‘ > 25 ja katepsiini G olivat Athens Research and Technology’lta, Athens, Georgia, USA, :' ”: trypsiini puhdistettiin kuvatulla tavalla (22), ja kallikreiini oli Calbiochem’lta, CA, USA.
Vasta-aineet kymotrypsiiniä ja katepsiini G:tä vastaan olivat Fitzgerald’lta, MA, USA, » » · , ·. : vasta-aine ihmisen plasman kallikreiiniä vastaan Calbiochem’lta, CA, USA, ja vasta-aine • » trypsiiniä vastaan valmistettiin kuvatulla tavalla (23). Anti-ACT- ja anti-API-vasta-aineet "7 30 olivat Dako’lta, Glostrup, tanska.
116467 16
Faagipeptidien valikointi
Faaginäyttöpeptidikirjastojen seulonta suoritettiin olennaisesti kuten Koivunen ym. (21) ovat kuvanneet. Lyhyesti sanoen, jokainen faagikiijasto seulottiin erikseen PSA:lla, joka oli vangittu sekä vapaata että kompleksoitua PSA:ta (24) sitovalla monoklonaalisella vasta-5 aineella 5E4 päällystettyihin mikrottiitterikuoppiin. 33 nM PSA TBS-puskurissa, joka sisälsi 10 g/1 BSA:ta (BSA-TBS) inkuboitiin MAb 5E4:lla päällystetyissä kuopissa 1 h ajan, sitten kuopat pestiin sitoutumattoman PSA:n poistamiseksi. Osa kustakin faagikirjastosta (1011-1012 infektiivistä partikkelia) lisättiin kaivoihin ja inkuboitiin 3 h 22 °C:ssa ensimmäisen pännäyskierron aikana ja 1 h:n ajan myöhempien kiertojen aikana.
10 Faagiliuos poistettiin ja kuopat pestiin TBS:lla, joka sisälsi 0,5 % Tween 20. Pännäys suoritettiin myös 200 μΜ ZnC12:n läsnä ollessa. Sitoutunut faagi eluoitiin 0,1 M glysiinipuskurilla, pH 2,2 ja neutraloitiin 1 M Tris-emäksellä. Eluoitu faagi monistettiin E. coli K91 kan -solujen infektiolla, ja puhdistettiin saostamalla polyetyleeniglykolilla. Kolmen selektio-ja monistuskierron jälkeen valmistettiin yksijuosteinen DNA yksittäisistä 15 faagiklooneista ja peptidisekvenssit määritettiin sekvensoimalla relevantti osa viruksen DNA:sta. Sekvensointi suoritettiin ABI 310 Genetic analyzer’lla ja Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kiteillä (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) käyttäen oligonukleotidia 5’ CCCTCATAGTTAAGCGTAACG 3’ alukkeena.
PSA:ta sitovien peptidien eristämiseksi seuloimme neljä faagikiijastoa, jotka ilmensivät , ; · t 20 10, 12 tai 13 aminohappoa faagiproteiinin III N-terminuksessa sisältäviä syklisiä disulfidin i · t ; , ·, rajoittamia peptidejä. Kustakin kiijastosta eristetyt peptidit sisälsivät luonteenomaisia • · » · ,,,,: konsensusaminohappoja kiinteisiin asemiin järjestetyn kysteiinin lisäksi (taulukko 1).
> · , ‘. : Useimmat CX8C-, CX10C- ja CX3CX4CX2C-kirjastoista (9 12:sta) peräisin olevat peptidit sisälsivät valiinin asemassa X1. Fenyylialaniini esiintyi lisäksi usein CX8C-ja CX10C-25 kiijastojen X2-asemassa. X3-asemaa suosi tyrosiini ja X9-asemaa suosi V CX3CX4CX2C-kirjaston peptideissä. Faagi-IPMA:ssa (tuloksia ei esitetä) ja GST-peptidi-IPMA:ssa ; ; ‘: kloonit, jotka sisälsivät motiivin CVAYC (SEQ ID NO 29), osoittivat voimakkainta : : sitoutumista PSA:han (ks. kuvio 1, taulukko l).
Kuvio 1 esittää kokeiden tulokset, joissa eri määriä kutakin GST-peptidiä lisättiin MAb ‘; · 30 5E4:llä vangittua PS:ta sisältäviin kuoppiin. Pesun jälkeen GST-peptidin sitoutuminen : ·· kvantitoitiin IPMA.lla käyttäen Eu-leimattua anti-GST-vasta-ainetta merkkiaineena.
’ * Tulokset edustavat keskiarvoja kahdesta rinnakkaisesta kuopasta ± keskivirhe (SE).
116467 17
Peptidi vapautettiin GST-fuusiopartnerista trombiinihajotuksella. 20 yksikköä trombiinia (Amersham Pharmacia Biotech) inkuboitiin 1 mg:n kanssa GST-C-4:aa PBS-puskurissa 22 °C:ssa 12 h. Hajotetut ja koskemattomat GST-C-4 -fuusioproteiinit analysoitiin geelisuodatuksella Superdex 200 HR 10/30 -pylväässä käyttäen 50 mM natriumfosfaattia, 5 pH 7,4, joka sisälsi 150 mM NaCl, ja virtausnopeudella 30 ml/h. Absorbanssia seurattiin 280 nm:ssa ja proteiinia sisältävät tilavuudeltaan 0,5 ml:n fraktiot kerättiin ja analysoitiin GST-peptidi-IPMA:lla jäljempänä kuvattavalla tavalla.
Immunofluorometriset määritykset (LPMAt) IPMA-määrityksissä käytetyt kiinteän faasin vasta-aineet päällystettiin 10 mikrotitrauskuoppiin pitoisuudessa 5 pg/ml TBSissa 16 h 22 °C:ssa, liuos hylättiin ja kuopat kyllästettiin 10 g/l:lla naudan seerumialbumiinia TBS:ssa 3 h 22 °C:ssa. Merkkiaineina käytettävät vasta-aineet leimattiin Eu3+-kelaatilla aiemmin kuvatulla tavalla (26). Määrityspuskuri oli 50 mM Tris-HCL, pH 7,7,150 mM NaCI, 33,3 μΜ naudan seerumialbumiinia, 1 μΜ naudan globuliinia.
15 Yksittäisten faagikloonien sitoutuminen PSAihan testattiin IPMA:lla (faagi-IPMA). Faagi-IPMAissa noin 30 ng PSA:ta lisättiin MAb 5E4:lla päällystettyihin kuoppiin 1 h ajaksi. Pesun jälkeen (puskuri: 150 mM NaCl, 7,7 mM NaN3,0,2 g/1 Tween 20), 15 μΐ faagia ja 200 μΐ määrityspuskuria lisättiin. Kun oli inkuboitu 1 h, kuopat pestiin ja täytettiin 200 piillä määrityspuskuria, joka sisälsi 50 ng europium-leimattua faagin M13 vaippaproteiinin ’.' · 20 tunnistavaa anti-faagi-monoklonaalista vasta-ainetta. Kun oli inkuboitu 60 min, kuopat » * * ·’ · > ' pestiin 4 kertaa, ja tehostusliuosta (EG&G-Wallac) lisättiin. Fluoresenssi kvantitoitiin 1234 DELFIA Research -fluorometrillä (EG&G-Wallac).
• · * · · : : GST-peptidin sitoutuminen PSAihan määritettiin IPMAilla (GST-peptidi-IPMA), joka oli : : samanlainen kuin faagipeptideille käytetty, paitsi että käytettiin Eu3+-leimattua vasta- 25 ainetta GSTille. Eri määriä GST-peptidiä tai villityyppistä GST.ta lisättiin kuoppiin, jotka •, | | sisälsivät vangittua PSA:ta 200 piissä määrityspuskuria, ja inkuboitiin 1 h ajan. Zn2+:n •... * vaikutuksen testaamiseksi GST-peptidin ja PSAin väliseen sitoutumiseen erilaisia : V: pitoisuuksia Zn2+:a (1-200 μΜ) lisättiin puskuriin GST-peptidin ja PSAin : ’": inkubaatiovaiheessa. Kompetitiokokeissa GST-peptidiä (167 nM) tai villityyppistä GSTita . . 30 inkuboitiin ensin kasvavien määrien kanssa PSAita (0-333 nM) 0,5 % BSA-TBS- ...: puskurissa 60 min, sitten lisättiin kuoppiin, jotka sisälsivät MAb 5E4:lla vangittua PSAita.
,β 116467
Kun oli inkuboitu 1 h, kuopat pestiin ja Eu3+-leimattua anti-GST-vasta-ainetta lisättiin. Lisäinkuboinnin ja pesun jälkeen sitoutunut fluoresenssi mitattiin edellä kuvatulla tavalla. Arvioitaessa GST-peptidien sitoutumista muihin proteinaaseihin, mukaan luettuna kymotrypsiini, katepsiini G, trypsiini, ja kallikreiini, nämä proteinaasit vangittiin niiden 5 mikrotitrauskuoppiin päällystetyillä spesifisillä vasta-aineilla. Rekombinantti-hK2 vangittiin MAb 5E4:lla, jonka tiedetään sitovan hK2:a (24). GST-peptidien sitoutumisen arvioimiseksi PSA:n kompleksien kanssa, mukaan luettuina PSA-ACT ja PSA-al-proteaasi-inhibiittori (PSA-API)(28), kompleksit vangittiin vastaavasti vasta-aineilla ACT:taja API:a vastaan. Eri proteinaasien tai PSA-kompleksien vangitsemisen jälkeen 10 lisättiin GST-peptidi ja sitoutumista seurattiin kuten edellä kuvattiin GST-peptidi-IPMA:lle.
Pintaplasmoniresonanssi
Valikoitujen peptidien sitoutumiskinetiikka PSA:han tutkittiin pintaplasmoniresonanssilla (29) BIAcore 2000™ -laitteella (Biacore AB, Uppsala, Ruotsi). PSA vangittiin kiinteään 15 faasiin MAb Hl 17:11a, joka sitoutuu samaan epitooppiin kuin MAb 5E4 (30). Vangitseva vasta-aine kytkettiin kovalenttisesti CM5-sensorisirun pinnalle valmistajan ohjeiden mukaisesti, käyttäen 5 000 resonanssi yksikön (RU) kytkentätasoja. PSA vangittiin injektoimalla 416 nM PSA:ta PBSissa, 4 minuutin kontaktiajalla (5 μΐ/min) ja 60 minuutin pesulla (20 μΐ/min), mikä tuotti signaalitasoja alueella 500 - 600 RU. Kutakin analyyttiä 20 (GST-peptidi) injektoitiin eri pitoisuuksina 1 minuutin ajan virtausnopeudella 20 μΐ/min.
: , Zn2+:n vaikutuksen kuvaamiseksi peptidien affiniteettiin tallennettiin sensorigrammeja , ,: peptidin vakiomäärälle Zn2+:n läsnä ollessa sekä ajo- että näytepuskurissa (0 - 30 μΜ).
, \ ; PSA-sitoutuminen joko kemiallisesti aktivoidulle/deaktivoidulle tyhjälle pinnalle tai MAb .' ’'. Hl 17 yksin vähennettiin epäspesifisenä vuorovaikutuksena. Regenerointi jokaisen ; ; 25 mittaussyklin jälkeen tehtiin 3 x 0,5 min injektioilla 10 mM HC1. Sitoutumistiedot * » 1 analysoitiin käyttäen BIAEVALUATION-ohjelmistoa.
11,1 GST-fuusioproteiinista lohkaistun peptidin aktiivisuus määritettiin kompetitiokokeella.
’ · ’ Hajotetun fuusioproteiinin fraktioinnin jälkeen geelisuodatuksella fraktioita inkuboitiin ‘ | ’;' kuopissa, jotka sisälsivät MAb 5E4:n vangitsemaa PSA:ta 60 min. Kuoppien tyhjentämisen ; 1 1 30 jälkeen lisättiin GST-peptidi (167 nM) ja inkuboitiin 1 h. Lohkaistun peptidin vaikutusta : ’· GST-peptidin ja PSA.n väliseen sitoutumiseen seurattiin GST-peptidi-IPMA:lla.
19 1 1 6467
Peptidien sitoutumiskohdan PSArssa karakterisoimiseksi käytettiin erilaisia PSA:lla olevia erilaisia epitooppeja tunnistavia monoklonaalisia anti-PSA-vasta-aineita (30). Kutakin MAb:ta (33 nM) inkuboitiin kuopissa, jotka sisälsivät MAb 5E4:n vangitsemaa PSA:ta. Pesun jälkeen lisättiin 167 nM GST-peptidiä ja sitoutumista seurattiin GST-peptidi-5 IPMArlla, kuten edellä kuvattiin.
Peptidien reaktiivisuus vapaan PSA:n eri muotojen kanssa GST-peptidien reaktiivisuus proPSA:n ja intaktin PSA:n kanssa verrattiin käyttämällä aktiivista PSA:ta (3) ja proPSA:ta (31). 100 ng:n proPSA:ta tai intaktia PSA:ta annettiin reagoida mikrotitrauskuoppiin päällystetyn MAb 5E4:n kanssa. Pesun jälkeen lisättiin yksi 10 \ig kutakin GST-peptidiä immobilisoitua PSA:ta sisältäviin kuoppiin. GST-peptidin sitoutuminen kvantitoitiin IPMArlla käyttäen Eu-leimattua anti-GST-vasta-ainetta merkkiaineena.
Synteettisten peptidien sitoutuminen PSArn kanssa
Peptidit AI ja C4 syntetisoitiin tavanomaisella kiinteän faasin Merrifield-peptidisynteesillä 15 käyttäen fmoc-kemiaa. Peptidien sitoutuminen PSArn kanssa määritettiin tutkimalla synteettisen peptidin kykyä estää vastaavan GST-peptidin sitoutuminen PSArn kanssa. Synteettistä peptidiä (0 - 333 nM) ja vastaavaa GST-peptidiä (167 nM) inkuboitiin MAb 5E4:n vangitseman PSArn kanssa lh ajan. Tämän jälkeen kuopat pestiin, minkä jälkeen . ’:'; Eu3+-leimattua anti-GST-vasta-ainetta lisättiin. Lisäinkubaation ja pesun jälkeen sitoutunut • 20 fluoresenssi mitattiin edellä kuvatulla tavalla.
» t · · , . Rakensimme GST-fuusioproteiineja neljästä peptidistä, joiden sitoutuminen faagi- • < t
!,. * IPMArssa on vahvinta. Niiden joukossa vahvimmin PSArhan sitoutui peptidi C-4 (SEQ ID
• » NO 11), jonka sekvenssi oli CVAYCIEHHCWTC, sekä GST-peptidinä (kuvio 1, taulukko • · t · * 2) ja faagilla ilmennettynä (tuloksia ei esitetä).
} 25 • · » * · » · 116467 20
Taulukko 2. Kinetiikka ja affiniteetti GST-peptidien sitoutumiselle PSA:han
Peptidi nro. Maksimi- Ka x 103 kd x 10'3 KD 50 % sitoutuminen (1/Ms) (1/s) (μΜ) stimulaatio (CPS*) (μΜ)# ~ÄÄ 219 000 TÖ3 80 778 2^2 B-2 428 000 16,3 57 3,5 1,7 C-4 790 000 9,9 28 2,9 0,57
Assosiaationopeusvakio (ka), dissosiaationopeusvakio (kd) ja tasapainodissosiaatiovakio (Kd) GST-peptideille PSA:ta kohtaan mitattiin pintaplasmoniresonanssilla. Esitetyt arvot 5 ovat keskimääräinen ka, kd ja Kd analyytin (GST-peptidi) 3:ssa eri pitoisuudessa.
^Tulokset GST-peptidi-IPMA:sta. Kokeellinen menetelmä kuvataan kuvion 1 selityksessä.
#PSA:n entsyymiaktiivisuuden puolimaksimaaliseen stimulaatioon vaadittava peptidipitoisuus. Kokeellisten menetelmien osalta katso kuvio 6 selitystä.
Kaksi muuta valikoitua peptidiä, B-2 (SEQ ID NO 6) (CVFAHNYDYLVC) ja A-l (SEQ 10 ID NO 1) (CVFTSDYAFC) sitoutuivat PSA:han, mutta vähemmän tehokkaasti kuin C-4 (SEQ ID NO 11). Kun Zn2+, PSAiha sitoutuvaksi tiedetty kationi, sisällytettiin määrityspuskuriin, peptidien sitoutumisaktiivisuus lisääntyi. Zn2+:lla oli annoksesta . ’ . riippuvainen vaikutus, ja maksimaalinen sitoutumisvasteen nousu havaittiin 200 μΜ:η ! pitoisuudessa (kuvio 2). Kokeissa, joiden tulokset kuvataan kuviossa 2, kutakin GST- . . 15 peptidiä inkuboitiin PS Aita sisältävissä kuopissa erilaisten Zn2+-pitoisuuksien läsnä « * » t · · , ollessa. GST-peptidin sitoutuminen kvantitoitiin IPMAilla. Kontrolli osoittaa GST- » » * * * Il , · · ·. peptidin sitoutumisen ilman Zn :n läsnäoloa. Tulokset edustavat kahden rinnakkaisen * * * 2+ kuopan keskiarvoja ± SE. Tehokas Zn -pitoisuus on kuitenkin alempi, koska puskurissa : . ’, oleva BSA sisältää useita sitoutumiskohtia Zn2+:lle. Neljäs GST-fuusioproteiinina tuotettu . *". 20 peptidi, D-l (SEQ ID NO 13) (CLSTCAQSCRISC) ei osoittanut merkitsevää sitoutumista . ’. PSAihan, vaikkakin vastaava faagi sitoutui PSAihan (tuloksia ei esitetä). Villityyppinen , · · , GST ei sitoutunut PSAihan, mikä vahvisti sen, että fuusioproteiinin sitoutuminen oli t » insertoidun peptidin välittämä.
21 1 1 6.467 PSA:ta sitovia peptidejä karakterisoitiin edelleen arvioimalla PSA-pitoisuus, joka vaaditaan alentamaan peptidin sitoutumista immobilisoituun PSA:han 50 %:lla (IC50). Tässä yhteydessä viittaamme myös kuvioon 3. GST-C-4 esi-inkuboitiin nousevien PSA-pitoisuuksien kanssa liuoksessa 1 h ajan. Sitten näytteet seoksista lisättiin kuoppiin, joihin 5 PSA oli vangittu anti-PSA-MAb:lla. Sitoutuminen mitattiin IPMA:lla. Tulokset edustavat kahden rinnakkaisen kuopan keskiarvoja ± SE. Vastaavat arvot peptideille A-l (SEQ ID NO 1) ja B-2 (SEQ ID NO 6) olivat vastaavassa järjestyksessä 3,3 nM ja 1 nM (tuloksia ei esitetä). GST-peptidien esi-inkubointi vapaan PSA:n ylimäärän kanssa esti sitoutumisen kiinteän faasin PSA:han. Peptidin C-4 (SEQ ED NO 11) sitoutuminen vangittuun PSA:han 10 aleni 50 %:lla PSA-pitoisuudessa 0,7 nM. Nämä tulokset vahvistivat sen, että valikoidut peptidit eivät sitoudu pelkästään MAb 5E4:lla vangittuun PSA:han vaan myös vapaaseen PSA:han liuoksessa.
Peptidien spesifisyys tutkittiin antamalla niiden reagoida erilaisten proteinaasien ja mikrotitrauskuoppiin vasta-aineiden avulla vangittujen PSA-kompleksien kanssa. PSA, 15 kallikreiini, katepsiini G, kymotrypsiini, trypsiini-2, ja rekombinantti-hK2 vangittiin kuoppiin, jotka oli vastaavasti päällystetty vasta-aineilla kutakin proteinaasia vastaan. GST-peptidin sitoutuminen mitattiin IPMAdla. Saadut tulokset esitetään kuviossa 4a. Mikään testatuista proteinaaseista ei osoittanut merkitsevää GST-peptidien sitoutumista. PSA, PSA-ACT ja PSA-API vangittiin kuoppiin, jotka oli päällystetty vasta-aineilla 20 PSA:ta, ACT:ta ja API:a vastaan, vastaavassa jäijestyksessä. GST-peptidin sitoutuminen ’ PSA-komplekseihin mitattiin IPMAilla. Saadut tulokset esitetään kuviossa 4b. Peptidit ;.: : eivät myöskään sitoutuneet PSA-ACT:hen ja PSA-API:in, jotka oli vangittu vasta-aineilla ' ' ACT:ta ja API:a vastaan, vastaavassa järjestyksessä.
« I
; ”'; Peptidien sitoutumiskinetiikka ja affiniteetti PSA:han arvioitiin :" ’; 25 pintaplasmoniresonanssilla. Kasvavia pitoisuuksia GST-peptidejä injektoitiin MAb
Hl 17:11a vangitun PSA:n yli. Taustan suhteen korjatut sensorigrammit sovitettiin yhden ;, * kohdan vuorovaikutukseen GST-peptidin ja PSA:n välillä käyttäen kolmea eri GST- :,,,: peptidipitoisuutta ja nopeusyhtälöä: ':!: ’ d(GST-peptidi:PSA)/dt = ka(GST-peptidi) x (PSA) - kd(GST-peptidi:PSA).
j *·,. 30 Keskimääräiset tasapainodissosiaatiovakiot (KD) peptideille A-l, B-2 ja C-4 olivat 2,9 - : 7,8 μΜ (taulukko 2). Zn2+ pitoisuudessa 1-30 μΜ alensivat sekä assosiaatio- että 22 116467 dissosiaationopeuksia. Affiniteetti lisääntyi 3-7-kertaisesti, koska kd:n vähentyminen oli suurempaa kuin ka:n (taulukko 3). PSA:n hidas dissosioituminen vangitsevasta MAb:sta aiheutti pohjaviivan alenemisen, ja sitoutumisvakiot korjattiin pohjaviivan poikkeaman osalta. Geelisuodatuksessa GST-C-4 paljasti neljä piikkiä (taulukko 4, kuvio 5).
> ( > * » 1 1 6467
/—N
Cd c/} cd >> t; :5 ^ «T. e _ ™ w i i <n en :a .5 -----a _* rt rt
_ *-* M
I-il-1 U-i Έ C 3 O <N c rt d q § OS Q ON 9 «n Q °°, 5 § £ Π W 3 «n .S <n zL o zL © zL -f= 3 g a ^ 5 2 g Λ 2 _, I-, I—I I—I G- O c -S ^ en es -- ^
ί s 5 s 3 a Ϊ S S 5 S 1 j I
·-,--> ^s, = o ^ =7 | S :2
*3 "'ti^ovTi — SooQOQ S ? R
§ 0 » i rf i n S -t Z g =*· Ri 1 3 « | •tÄ Λ » | =S-
S & C 'S' * R
S :S 8 3 ^ ^ jd - - 1 _^^_ > o o ti o ’5 w Q« 1—I I—I '3 a g — — es m S d -I* e« Qr-cnoo.2 3^ H Q 2 lo Q -H © VO Q 00 Q S -2 rt ^ -a ^ 3 m S m Z o Z o S g — m vj Ή-----s D- '3 e O. ? g c J<ä .5 a> o i—i r-ι ft .5 3 a a ϋ r—, vo ts i—. .S e s en S · _ oo © © -* 3 e &o 3 ^ ί n ί ^ ?; ^ ί & is s *S d S^^ZLmZL^ZLoZL | § -a
£ rt ft <N
® 2 © —, en en es ^ sj rt ÄinoooOS^ •"^ n x 2 «n - vo >n _r en m -¾ rt e ^ s 5 \o ΐ °. S ^ 5 °°. S ^ 3 g rt CQ^wSzL^ZL<nZLoZL o ? .2 Λ------j2 o 3 J£ cd oo a) cd ä a > 3 ft ^ β rt =3 3 ft rt ft
2 >» tS ω g - S
.S S £ -I : = e
. :·. * sOi.en m t- g tf g S
S „ S M -rt ft : ’· s
. ; -m /—v ivO -h o —i --5 en O
·:·· i i ! ». ? s ?; s ?; s s i -i .= I
•s a » -s .& • . : w ^ - I ';3 Ή ;··'·: 1 ^ 5 = 3 S lellii .:::' 1 3 S g ä ? S -- S 5 I S 1 3 * £ 8 • · <-« cd cd > is > n '” S > e 3 5 3 .¾ Λ O r-S ^ ^ " SSiirt? «S ^ 5 en °- °- °- R H 2 8 b rt
:.:'! 3 4 ί I 2' 1 2 1 2 S ί S i 1 3 1 ϊ S
... o \a E 'S ft- ft SI
·“ ώί 3 .«e js .-h e o * S CS 3 ftr .2 rt 3 >— '3 ·2 O rt > © > " • S "r-oS * * rt-3u,C-3> « .£ .-a 1± <_ * o o j2-S<2<o _... H coclwO — — en < a m * m V) o ' f » * t 116467 24
Taulukko 4. GST-C-4:n eri molekyylikokomuotojen aktiivisuuksien vertailu.
Fuusioproteiini MW Proteiinia Sitoutumisaktiivisuus (kD) (% kaikesta) (% kaikesta) GST-C-4 ^3 3^4 ~ 30 83,4 53 - 100 11,4 26 >500 1,7 21
Trombiinilla ~ 3 17 hajotettu GST-C-4 ~ 30 83 5,2*
Geelisuodatuksessa GST-C-4 ja trombiinilla hajotettu GST-C-4 paljastivat vastaavasti neljä ja kaksi piikkiä. Kussakin piikissä olevan proteiinin prosenttiosuus arvioitiin 5 absorbanssilla 280 nm:n kohdalla. Sitoutumisaktiivisuus laskettiin GST-peptidi-IPMA-määrityksestä.
*Osoittaa sitoutumisaktiivisuuden, joka jää jäljelle trombiinikäsittelyn jälkeen.
GST-C-4:n tai trombiinilla käsitellyn GST-C-4:n fraktioinnin jälkeen 5 μΐ kustakin fraktiosta inkuboitiin ensin kuopissa, jotka sisälsivät MAb 5E4:lla vangittua PSA:ta.
10 Sitoutuminen mitattiin GST-peptidi-IPMA:lla. Nuolet osoittavat molekyylikokostandardien eluutiota (669 kD, 150 kD, 43 kD ja 1,3 kD).
Piikkien molekyylikoot olivat >500 kD, 100 kD, 30 kD ja noin 3 kD. Näistä muodoista kaikki paitsi 3 kD:n piikki sitoutuivat PSA:han (taulukko 4, kuvio 5). Tämä osoittaa, että :, : fuusioproteiini esiintyy 30 kD:n monomeerinä, oligomeerinä (noin 100 kD) ja ‘ · 15 polymeerinä. Polymeerinen fuusioproteiini osoitti vahvinta sitoutumista PSA:han, minkä • · '. ‘: osoittaa vaste suhteessa proteiinin absorbanssiin 280 nm:n kohdalla. GST-C-4:n '. * ·' trombiinikäsittely aiheutti sen lähes täydellisen lohkeamisen 30 kD:n ja 3 kD:n ’· *·' komponenteiksi. Jälkimmäinen koostui arvioidusta 31 tähteen pituisesta peptidistä, jonka trombiini oli lohkaissut GST-fuusioproiteiinista. 30 kD:n komponentilla oli vain noin 5 % ’;;. ’ 20 vasteesta GST-peptidi-IPMA:ssa verrattuna lohkaisemattomaan GST-C-4:aan (taulukko 4).
* ;‘. Inhibitiokokeessa 3 kD:n piikki vähensi GST-peptidin sitoutumista PSA:han noin 30 %:lla ; ‘"; (kuvio 5), osoittaen, että trombiinin lohkaisema peptidi säilytti PSA.ta sitovaa : aktiivisuutta. Ristisymboli (x) osoittaa GST-peptidistä lohkaistun peptidin indusoiman ....: GST-peptidin sitoutumisen inhibition. 200 μΐ kutakin fraktiota, joka sisälsi vapaata 25 1 1 6467 peptidiä, inkuboitiin ensin kuopissa, jotka sisälsivät MAb 5E4:lla vangittua PSArta. 1 h kuluttua kuopat tyhjennettiin ja GST-C-4:a lisättiin (167 nM). Kun oli inkuboitu 1 h, GST-peptidin sitoutuminen mitattiin GST-peptidi-IPMA:lla. Tulokset edustavat keksimääräisiä arvoja kahdesta rinnakkaisesta kuopasta.
5 Peptidien sitoutumiskohdan määrittämiseksi PSArlla suoritettiin inhibitiokokeita MAb:eilla, jotka sitoutuvat erilaisiin PSA:lla oleviin epitooppeihin. Vasta-aineet, jotka sitoutuvat epitooppialueisiin, jotka kompleksoidussa PSA:ssa ovat seriiniproteinaasi-inhibiittoreiden peittämiä (niin kutsutut vapaaspesifiset vasta-aineet), estivät peptidien sitoutumista voimakkaimmin (>80 %). MAb:t, jotka sitoutuvat PSA:n aktiivisesta kohdasta 10 kaukana sijaitseviin epitooppeihin, osoittivat alemman tason estoa (taulukko 5).
Taulukko 5. GST-peptidien PSArhan sitoutumisen inhibitio anti-PSA-Mab:eilla.
ISOBM-MAb Epitooppiryhmä__GST-peptidi _ ___A-l__B-2__C-4 25 1 ++ ++ ++ 26 1 ++ ++ ++ 40 2-a + + + 90 2-b + + + 57 3-a + + + 89 3-b + + + 86 5 + + +
Kontrolli__6__-__-_ > ·
Neljää PSA:lla olevaa epitooppiryhmää edustavia PSAMAb:eja käytettiin kilpailemaan » • ‘: GST-peptidien kanssa sitoutumisesta PSA:n kanssa. Vasta-ainetta ryhmästä 6, johon MAb ;;;’ 15 5E4 kuuluu, käytettiin negatiivisena kontrollina. Kutakin MAb:ia (33,3 nM) inkuboitiin “ * ’ mikrotiitterikuoppiin päällystetyn 5E4:n vangitseman PSA:n kanssa. Pesun jälkeen lisättiin , , GST-peptidi. GST-peptidien sitoutuminen kvantitoitiin IPMA:lla.
• ♦ * •.,,: GST-peptidin sitoutumisen väheneminen kiinteän faasin PSA:han (%) ++ = >80% 20 + = 60-80% . ’ - = ei inhibitiota 1 1 6467 26 GST-peptidit osoittivat merkitsevästi alempaa sitoutumista proPSA:han verrattuna aktiiviseen PSA:han. Näissä kokeissa 100 ng proPSA:ta tai intaktia PSA:ta annettiin reagoida mikrotitrauskuoppiin päällystetyn MAb 5E4:n kanssa. Pesun jälkeen 1 μg kutakin GST-peptidiä (SEQ ID A-l (SEQ ID NO 1), B-2 (SEQ ID NO 6) ja C-4 (SEQ ID NO 11), 5 Taulukko 1) lisättiin immobilisoitua PSA:ta sisältäviin kuoppiin. GST-peptidien sitoutuminen kvantitoitiin IPMA.lla käyttäen Eu-leimattua anti-GST-vasta-ainetta merkkiaineena.
Reaktiivisuus proPSArn kanssa oli 30 - 60 % aktiivisen PSA:n kanssa havaitusta (kuvio 6). 80 MAb:n tutkimisen jälkeen niiden kyvyn osalta sitoutua valikoivasti PSA:n jomman 10 kumman muodon kanssa ei voitu löytää yhtään proPSA:ta tai intaktia PSA:ta valikoivasti tunnistavaa MAB:ia. Näin ollen peptidit voivat tarjota uusia sitomisspesifisyyksiä PSA:lle.
Tavanomaisella kiinteän faasin Merrifield -peptidisynteesillä kemiallisesti syntetisoidut peptidit estivät tehokkaasti GST-peptidien sitoutumista PSA:han (kuvio 7), mikä osoittaa niiden sitoutuvan PSA:n kanssa samalla tavalla kuin GST-peptidit. Kemiallisesti 15 syntetisoitu peptidi C-4 (SEQ ID NO 11)(GACVAYCIEHHCWTCGA) 20-kertaisena molaarisena ylimääränä esti vastaavan GST-peptidin sitoutumista PSA:han noin 70 %:lla. Myös C-4:n lyhyempi johdannainen, josta puuttui peptidin N- ja C-päissä oleva reunustava GA-motiivi, esti tehokkaasti GST-peptidin sitoutumista PSA:han (kuvio 7). PSA oli vangittu anti-PSA-MAb:lla mikrotitrauskuoppiin. Sitoutuminen mitattiin IPMA:lla.
‘: 20 Esimerkki 3. Peptidien vaikutus PSA:n entsyymiaktiivisuuteen PSA:n entsyymiaktiivisuus tutkittiin yksin peptidien läsnä ollessa tai yhdessä Zn2+:n ,· ; kanssa käyttämällä kymotrypsiinisubstraattia S-2586 (MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA) . *·, (Chromogenix, Mölndal, Ruotsi). Lisäksi entsyymiaktiivisuus tutkittiin tavanomaisella , · · ·. fmoc-kemiaa käyttävällä kiinteän faasin Merrifield -peptidisynteesillä syntetisoitujen * · * » » 25 peptidien läsnä ollessa, mukaan luettuna peptidin biotiinikonjugoitu muoto. PSA:ta (333 : . nM) inkuboitiin GST-peptidin 1 - 100-kertaisen molaarisen ylimäärän tai synteettisen i i I «
;1 ’ ‘; peptidin 100-kertaisen ylimäärän kanssa TBS-puskurissa, pH 7,8, joka sisälsi 0,5 g/I BSA
_ · ’ · t 1 h ajan 22 °C:ssa. Zn2+:n vaikutus PSA:n entsyymiaktiivisuuteen tutkittiin sisällyttämällä • , 1 - 200 μΜ ZnC12 reaktiopuskuriin. Peptidien ja Zn2+:n yhteisvaikutus PSA:n 30 entsyymiaktiivisuuteen tutkittiin inkuboimalla PSA:ta (333 nM) peptidin (333 nM) kanssa puskurissa, joka sisälsi 1 - 200 μΜ Zn2+ 1 h ajan. Substraatin lisäämisen jälkeen 0,2 mM:n 116467 27 loppupitoisuudeksi seurattiin absorbanssia 5 minuutin välein 2 h ajan 405 nm:n aallonpituudella Labsystems Multiskan MCC/340 -fotometrillä (Labsystems, Helsinki, Suomi). Kontrollina testattiin villityyppisen GST:n vaikutus PSA:n entsyymi akti i vi suuteen.
5 Peptidien vaikutus kymotrypsiinin, katepsiini G:n ja trypsiinin entsyymiaktiivisuuteen tutkittiin kuten edellä kuvattiin PSA:n osalta. Substraatteina käytettiin S-2586:a kymotrypsiinille ja katepsiini G:lle, ja S-2222:a (CO-Ee-Glu-(OR)-Gly-Arg-pNA) (Chromogenix) trypsiinille.
Peptidien vaikutus entsyymiaktiivisuuteen korkeamman molekyylipa!non omaavia 10 proteiinisubstraatteja vastaan tutkittiin käyttämällä PSA:ta proteolyyttisesti hajottamaan insuliinin kaltaista kasvutekijää sitovaa proteiinia 3 (IGF-BP-3) (32) yksin tai synteettisen peptidin C-4 ja A-l läsnä ollessa. Substraatin hajoamisen määrä kvantitoitiin seuraamalla IGF-BP-3:n immunoreaktiivisuuden alenemista, joka johtuu sen proteolyyttisestä hajoamisesta. PSA:ta (5 pg/ml) inkuboitiin IGF-BP-3:n (70 ng/ml) kanssa 16 h 37 °C:ssa 15 peptidien 100-kertaisen molaarisen ylimäärän kanssa suhteessa PSAihan ja mitattiin IGF-BP-3:n immunoreaktiivisuuden osalta IPMAilla, kuten on kuvattu (33). Kontrollina peptidiä myös lisättiin reaktioseokseen, joka sisälsi PSA:ta ja IGF-B3:a juuri ennen immmunomäärityksen aloittamista peptidin mahdollisen häiritsevän vaikutuksen kvantifioimi seksi IGF-BP-3 -IPMA:ssa.
20 Kemiallisesti syntetisoidun peptidin C-4 vaikutus PSA:n entsyymiaktiivisuuteen kompleksina alfa-2-makroglobuliinin kanssa (A2M) analysoitiin käyttäen kuvatulla tavalla ! valmistettua (7) puhdistettua PSA-A2M-kompleksia. 1 pg PSA:ta kompleksina A2M:n .: kanssa inkuboitiin yksin tai 2,5 pg:n kanssa tavanomaisella kiinteän faasin Merrifield- • synteesillä syntetisoitua peptidiä C4 (SEQ ID NO 11) (GACVAYCIEHHCWTCGA) 1 h •., 25 22 °C:ssa 100 pl:ssa TBS-puskuria, joka sisälsi 1 g/1 BSA. 10 pg monoklonaalista vasta- ainetta 4G10 sisällytettiin estämään kompleksista vapautuneen PSA:n aiheuttamaa » i : aktiivisuutta. Kontrollina mitattiin 1 pg:n vapaata PSA:ta entsyymiaktiivisuus.
Entsyymiaktiivisuutta seurattiin kuten edellä käyttäen S-2586:tta (Chromogenix) ; : substraattina.
t 30 PSA:n entsyymiaktiivisuus tehostui merkitsevästi GST-peptidien vaikutuksesta, ja GST-C-4 oli aktiivisin, stimuloiden PSA-aktiivisuutta kromogeenistä substraattia kohtaan noin 5- 116467 28 kertaisesti (kuvio 8). Kokeissa PSA:ta (0,33 μΜ) inkuboitiin nousevien GST-C-4-pitoisuuksien kanssa (0 - 100-kertainen molaarinen ylimäärä) 1 h ajan, minkä jälkeen lisättiin kromogeeninen substraatti S-2586, ja entsyymiaktiivisuutta seurattiin mittaamalla absorbanssia 405 nm:n aallonpituudella. Tulokset edustavat kahden rinnakkaisen kuopan 5 keskiarvoja ± SE.
Vaikutus oli riippuvainen GST-peptidin pitoisuudesta ja puolet maksimaalisesta stimulaatiosta havaittiin mikromolaarisella alueella olevilla pitoisuuksilla (taulukko 2). Pienin peptidipitoisuus, joka vaikutti aktiivisuuteen vaihteli välillä 20 nM C-4:lle ja 300 nM A-l:lle ja B-2:lle. Villityyppinen GST ei vaikuttanut PSA:n aktiivisuuteen (tuloksia ei 10 esitetä). Peptideillä ei olut mitään vaikutusta muiden testattujen proteinaasien entsyymiaktiivisuuteen, mukaan luettuina kymotrypsiini, katepsiini G ja trypsiini (tuloksia ei esitetä). Tavanomaisella peptidisynteesillä valmistetut peptidit tehostivat entsyymiaktiivisuutta samalla tavalla (kuvio 9). Lisäksi biotiinikonjugoitu peptidi C-4 myös tehosti entsyymiaktiivisuutta samalla tavalla kuin C-4:n konjugoimaton muoto 15 (kuvio 9). Kuviossa 9 testattuihin C-4:n johdannaisiin kuuluu peptidejä, joissa on GA-reunustähteet N- ja C-päissä tai joista ne puuttuvat, ja C-4:n biotiinikonjugoitu muoto. PSA:ta (0,33 μΜ) inkuboitiin kemiallisesti syntetisoitujen peptidien kanssa (100-kertainen molaarinen ylimäärä) 1 h ajan, minkä jälkeen lisättiin kromogeeninen substraatti S-2586, ja entsyymiaktiivisuutta seurattiin mittaamalla absorbanssia 405 nm:n aallonpituudella.
20 Peptidien vaikutus entsyymiaktiivisuuteen korkean molekyyli painon omaavia proteiini substraatteja kohtaan määritettiin tutkimalla PSA:n kykyä proteolyyttisesti ; hajottaa insuliinin kaltaista kasvutekijää sitovaa proteiinia 3 (IGF-BP-3) yksin tai synteettisten peptidien läsnä ollessa (SEQ ID C-4 (SEQ ID NO 11) ja A-l (SEQ ID NO 1), i,, * taulukko 1). Kokeissa PSA:ta (5 pg/ml) TBS-puskurissa, pH 7,8, yksinään tai 100- ..! 25 kertaisen molaarisen peptidiylimäärän kanssa, inkuboitiin IGF-BP-3:n kanssa (70 ng/ml) 16 h 37 °C:ssa, minkä jälkeen intaktin IGF-BP-3:n pitoisuus määritettiin IPMA:lla.
Kontrollina peptidiä lisättiin myös PSA:ta ja IGF-BP3:a sisältävään reaktioseokseen juuri • ·. ennen immunomäärityksen aloittamista peptidin mahdollisen häiritsevän vaikutuksen
kvantifioimiseksi IPMA:ssa IGF-BP-3:lle (leimattu BP-3+PSA+(C-4/A-l 0 h ajan). PSA
. I 30 yksin hajotti IGF-BP-3:a hitaasti, kuten immunoreaktiivisuuden 30 %:n alenemisena » ‘' (kuvio 10). Peptidit C-4 ja A-l tehostivat PSA:n aktiivisuutta IGF-BP-3:a kohtaan, johtaen noin 70-prosenttiseen IGF-BP-3:n hajoamiseen.
29 1 1 6467
Koska sinkin tiedetään estävän PSA:n entsyymiaktiivisuutta, karakterisoimme lisäksi GST-peptidien vaikutuksen PSA:n entsyymiaktiivisuuteen määrittämällä peptidien ja Zn2+:n yhteisvaikutuksen. Zn2+ kumosi C-4:n tehostavan vaikutuksen ja vähensi PSA:n aktiivisuutta annoksesta riippuvaisella tavalla. GST-C-4:n ja Zn2+:n vaikutus 5 entsyymiaktiivisuuteen määritettiin inkuboimalla PSA:ta (0,33 μΜ) saman molaarisen pitoisuuden GST-C-4:aa ja en Zn -pitoisuuksien kanssa. Reaktiota seurattiin mittaamalla absorbanssi 405 nm:n aallonpituudella kromogeenisen substraatin S-2586 lisäämisen jälkeen. Kontrolli osoittaa PSA:n aktiivisuuden ilman peptidin ja Zn2+:n läsnäoloa.
Tulokset edustavat kahden rinnakkaisen kuopan keskiarvoja ± SE. Zn2+-pitoisuudessa 75 10 μΜ aktiivisuus oli sama kuin PSA:n aktiivisuus ilman sinkin ja peptidin läsnäoloa, ja pitoisuudessa 200 μΜ havaittiin lähes täydellinen entsyymiaktiivisuuden estyminen (kuvio 11).
Kemiallisesti syntetisoidun peptidin C-4 vaikutus PSA:n entsyymiaktiivisuuteen kompleksina analysoitiin käyttäen puhdistettua PSA-A2M-kompleksia. Muilla 15 proteinaaseilla on osoitettu, että A2M:aan sitoutumisen jälkeen ne voivat yhä hajottaa pienen molekyylipainon omaavia substraatteja (34). 1 pg PSArta kompleksina A2M:n kanssa inkuboitiin yksin tai 50-kertaisen molaarisen ylimäärän kanssa kemiallisesti syntetisoitua peptidiä C-4 (taulukko 1) 1 h ajan 22 °C:ssa 100 plrssa TBS-puskuria, joka sisälsi 1 g/1 BSA. 10 pg monoklonaalista vasta-ainetta 4G10 sisällytettiin kompleksista .· · 20 vapautuvan PSA:n aiheuttaman aktiivisuuden estämiseksi. Kontrollina mitattiin 1 pg:n ' ,1, f r- ;.. : vapaata PSArta entsyymiaktiivisuus. Entsyymiaktiivisuutta seurattiin mittaamalla optinen * ' tiheys 405 nmrn aallonpituudella 0,2 mM S-2586:n (MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA) ’ · ': (Chromogenix, Mölndal, Ruotsi) kanssa substraattina. Kompleksina A2M:n kanssa olevan ‘’ PSArn entsyymiaktiivisuus aleni noin 4-kertaisesti verrattuna vapaan PSArn aktiivisuuteen, ' · · * * 25 mutta merkitsevää aktiivisuutta voitiin yhä havaita (kuvio 12). Näin ollen ei PSArn , . aktiivinen kohta kompleksina A2M:n kanssa ole tukittu. Mahdollisuus, jonka mukaan aktiivisuus voisi johtua kompleksista vapautuneesta PS Arsta suljettiin pois sisällyttämällä ' ^ ’ mukaan MAb, joka estää vapaan PSArn aktiivisuuden täydellisesti (kuvio 12). C-4- : " peptidin lisäämisen jälkeen A2M-kompleksoidun PSArn entsyymiaktiivisuus tehostui noin * ·; * ’ 30 2-kertaisesti osoittaen sen, että peptidi kykeni sitoutumaan inhibiittorin kapseloiman PSArn •. · · kanssa ja aiheuttamaan saman vaikutuksen AM2-kompleksoidulle PS Arlle kuin vapaalle \ ·: PSArlle (kuvio 12).
30 1 1 6467
Esillä oleva keksintö saa ensi kertaa aikaan PSArta sitovia ligandeja, jotka voivat spesifisesti tehostaa PSA:n entsyymiaktiivisuutta. Useita PSArta sitovia peptidejä tunnistettiin käyttämällä satunnaisia faaginäyttöpeptidikiqastoja seulomalla monoklonaalisen vasta-aineen kautta sidotulla PSArlla. Kun PSA aluksi päällystettiin 5 suoraan mikrotitrauskuoppiin, ei voitu eristää mitään PSArta sitovaa faagia. Kuitenkin vangitsemalla PSA monoklonaaliseen kiinteän faasin vasta-aineeseen, voitiin eristää spesifinen PSArta sitova faagi. PSArn vangitsemiseen käytetty monoklonaalinen vasta-aine ei tuki PSArn aktiivista kohtaa (27) ja näin ollen helpotti PSArta sitovan faagin eristämistä. Ilmeisesti PSArn suora päällystäminen muoville muuttaa sen rakennetta tai aiheuttaa 10 biopännäyksen kannalta epäsuotuisan orientaation.
Joitakin tyypillisiä aminohappotähteitä voitiin tunnistaa useimmissa valikoiduista peptideistä. Aminohapposekvenssit CVF tai CVA olivat läsnä 5:ssäl2 peptidistä, jotka oli johdettu degeneroiduista CX8C-, CX10C- ja CX3CX4CX2C-kiqastoista, ja tyrosiini löydettiin 12:ssa 14 peptidistä. Peptidit, joilla oli korkein affiniteetti, sisälsivät neljä 15 kysteiiniä. Peptidit ilmennettiin ja karakterisoitiin GST-fuusioproteiineina, jotka helpottivat sitoutumisaffiniteetin ja spesifisyyden tutkimuksia. Fuusioproteiineina ilmennettäessä peptidit säilyttivät sitoutumisaktiivisuutensa, ja suhteelliset affiniteetit, IFMArlla arvioituna, olivat samanlaiset faagilla ja fuusioproteiineilla. Pintaplasmoniresonanssikokeet osoittivat, että peptidit sitoutuivat PSArhan huomattavalla • t · ·’ * 20 affiniteetilla (taulukko 2).
• · • · · » * · * : · · PSArn on osoitettu sitovan Zn2+:a, ja valikoidut peptidit myös sisältävät sekvenssejä, jotka : ’ ·. : muistuttavat Zn2+:n sitoutumiskohtia sinkkisormiproteiineissa (35). Zn2+:n läsnä ollessa : : GST-peptidien affiniteettivakiot kasvoivat 3-7-kertaisesti, mikä viittaa Zn :n osallisuuteen :PSA.n ja peptidien välisessä sitoutumisessa. Affiniteetin nousu selittyy peptidin ja PSArn 25 välisen kompleksin dissosiaationopeuden voimakkaammalla alenemisella verrattuna sen .' ·: assosiaationopeuteen. Tämä voi olla PS Am j a peptidin aminohappotähteiden väliin . · · ‘ kelatoidun Zn :n välittämä. On mielenkiintoista, että Zn :n on osoitettu välittävän j ' ·. korkea-affiniteettista sitoutumista toisen seriiniproteinaasin, trypsiinin, ja sen
• · * Λ I
:: pienimolekyylipainoisen inhibiittorin välillä (36). Toinen mahdollisuus on, että Zn ; ’; ‘; 30 stabiloi peptidin 3 -D-rakennetta samalla tavalla kuin j olla Zn2+ toimii vuorovaikutuksessa : * ·. · DNArta sitovien sinkkisormiproteiinien kanssa.
31 1 1 6467 PSA:ta sitovia peptidejä on tuotettu aiemmin polysomiselektiomenetelmällä (11). Nämä peptidit ovat lineaarisia eivätkä syklisiä, eikä niillä ole mitään samankaltaisuutta esillä olevassa tutkimuksessa eristettyjen peptidien kanssa. Lisäksi näiden peptidien ei osoitettu vaikuttavan PSA:n entsyymiaktiivisuuteen, ja biotiinin kanssa konjugoituna peptidit eivät 5 osoittaneet johdonmukaista sitoutumista PSA:n kanssa. Peptidiemme affiniteetti on faaginäyttöpeptideille melko tyypillinen (37), mutta alempi kuin polysomitekniikalla kehitettyjen peptidien affiniteetit (11). Affiniteetin erot voivat kuitenkin selittyä mittaustekniikan eroavaisuuksilla.
Faaginäyttöpeptidit valikoitiin mikrotitrauskuopan seinällä olevaan anti-PSA-MAb:hen 10 vangittua PSA:ta vastaan. Vangitsemiseen käytetty vasta-aine tehostaa PSA:n entsyymiaktiivisuutta, ilmeisesti vaikuttamalla entsyymin konformaatioon (30). Tämä on saattanut vaikuttaa peptidisitoutumisen lisääntymiseen. Kuitenkin liuoksessa oleva PSA esti täysin GST-peptidien sitoutumisen kiinteän faasin PSA:n kanssa. Näin ollen vangitsemisvasta-aineen indusoima konformaation muutos ei ollut tarpeen GST-peptidien 15 sitoutumiselle.
Kun peptidejä ilmennettiin GST-fuusioproteiineina, havaittiin kolme molekyylikokomuotoa: polymeeri, oligomeeri ja monomeeri. Polymeerillä oli voimakkain sitoutuminen PSA:han, ja oligomeeri myös sitoutui innr>kkaammin kuin monomeeri. Tämä ':'; tulos osoittaa, että monivalenttinen sitoutuminen tehostaa sitoutumisen aviditeettia. Koska ·:; 20 faagi fUSE 5 ilmentää kolmesta viiteen kopiota peptidi-inserteistä, joilla on sama : * : sekvenssi, on sen sitoutuminen myös monivalenttista (38). Huolimatta GST-peptidien : ·.: näennäisestä monivalenttisesta sitoutumisesta, esti GST-fuusiopartnerista lohkaistu : t : monomeerinen peptidi GST-peptidin sitoutumista PSA:han huomattavasti.
• · ·
Peptidit eivät sitoutuneet kymotrypsiiniin ja ketepsiini G:hen, vaikka näiden . ·. : 25 entsyymispesifisyys on samanlainen kuin PSA:n. Ne eivät myöskään sitoutuneet trypsiiniin * I < * ♦ .' * *. ja hK2:een, jotka hajottavat C-terminaalin arginiini- tai lysiinitähteiksi. HK2 on .. ‘ rakenteellisesti läheistä sukua PSA:lle, osoittaen 79 %:n identtisyyttä aminohappotasolla.
Näin ollen valikoimamme peptidit osoittautuvat hyvin spesifisiksi PSA:lle. GST-peptidit > · t; > eivät myöskään sitoutuneet seerumissa esiintyviin PSA-serpiinikomplekseihin, s.o. PSA-
) · I
; , 30 ACT ja PSA-API, joissa serpiinit peittävät PSA:n peptidiä sitovan alueen. Peptidien * · · sitoutuminen estyi myös vasta-aineilla, jotka reagoivat vapaan PSA:n kanssa PSA-serpiinikomplekseissa peitettyinä olevien epitooppien kautta. Nämä MAb:t myös estävät 116467 32 entsyymiaktiivisuutta (30). Jotkut muihin PSA:ssa oleviin epitooppeihin sitoutuvat MAb:t pystyivät myös estämään sitoutumista, mutta vähemmässä määrin. Yhteenvetona nämä tulokset viittaavat siihen, että peptidit sitoutuvat lähelle PSA:n aktiivista kohtaa.
PSA:lla on rajoitettu kymotrypsiinin kaltainen entsyymiaktiivisuus, joka hajottaa C-5 terminaalisesti tyrosiini- ja leusiinitähteisiin semenogeliini I:ssa, joka on PSA:n luonnollinen substraatti (39). PSA on kuitenkin kymotrypsiiniä riippuvaisempi näitä aminohappoja ympäröivistä sekvensseistä, ja useat edullisia P1-tähteitä, tyrosiiniaja leusiinia, ympäröivät tähteet näyttelevät tärkeätä osaa substraattispesifisyyden ja tehokkuuden määräämisessä (40). PSA voi myös hajottaa glutamiinin jälkeen, ja tämän 10 tyyppinen peptidisubstraatti on spesifisempi PSAdle kuin ne, jotka sisältävät tyrosiiniaja leusiinia P1 :ssa (12). Kaikki faaginäytöllä valikoituneet peptidit sisältävät tyrosiini-ja leusiinitähteitä, usein yhdessä muiden aminohappojen kanssa (Y-S, Y-A, Y-D, L-V), jotka muodostavat hajotuskohtia semeneogeliini I:ssa (39). Mikään peptidi ei kuitenkaan sisältänyt enempää kuin kolme semenogeliini I:ssa olevan hajotuskohdan kanssa identtistä 15 aminohappoa. Kaikki peptidit sisälsivät joko kaksi tai neljä kysteiiniä. Näin ollen ne mahdollisesti muodostivat tiukkoja silmukoita, kun taas luonnollinen substraatti, semenogeliini I, ei sisällä yhtään disulfidisiltaa.
Kolme neljästä tutkitusta GST-peptidistä tehostivat PSA:n entsyymiaktiivisuutta •: ·. synteettistä peptidisubstraattia S-2586 vastaan, ja vaikutus korreloi affiniteetin kanssa.
• .:. 20 Siksi peptidit eivät näytä toimivan vuorovaikutuksessa PSA:n katalyyttisen triadin kanssa, ...: vaan paremminkin sitoutuvat aktiivisen kohdan läheisyyteen muuttaen konformaatiota ja ;, f mahdollisesti tehden katalyyttisen taskun helppopääsyisemmäksi synteettiselle :" ‘: substraatille. Vaikutus entsyymiaktiivisuuteen oli peptidispesifinen, koska villityyppisellä :' ”: GST:11a ja GST-D-1:11a ei ollut vaikutusta. Zn2+, joka estää PSA:n entsyymiaktiivisuutta, 25 kumosi peptidien stimuloivan vaikutuksen annoksesta riippuvaisella tavalla.
33 1 1 6467
Viitteet 1. Wang, MC, Valenzuela LA, Murphy GP, Chu TM. Purification of human prostate specific antigen. Invest. Urol. 17,1979,159-163.
2. Lilja, H, Oldbrink J, Rannevik G, Laurell C-B. Seminal vesicle secreted proteins and 5 their reactions during gelation and liquefaction of human semen. J. Clin. Invest.
1987;80:281-285.
3. Zhang, WM, Leinonen J, Kalkkinen N, Dowell B, Stenman UH. Purification and characterization of different molecular forms of prostate-specific antigen in human seminal fluid. Clin Chem 1995;41:1567-73.
10 4. Stenman, UH, Leinonen J, Alithan H, Rannikko S, Tuhkanen K, Alithan O. A complex between prostate-specific antigen and alpha 1-antichymotrypsin is the major form of prostate-specific antigen in serum of patients with prostatic cancer: assay of the complex improves clinical sensitivity for cancer. Cancer Res 1991;51:222-6.
5. Mikolajczyk, SD, Grauer LS, Millar LS, Hill TM, Kumar A, Rittenhouse HG, Wolfert 15 RL, Saedi MS. A precursor form of PSA (pPSA) is a component of the free PSA in prostate cancer serum. Urology 1997;50:710-4.
: : 6. Chen, Z, Chen H, Stamey TA. Prostate specific antigen in benign prostatic hyperplasia: i//\ purification and characterization. J Urol 1997; 157:2166-70.
. ·. : 7. Zhang, WM, Finne P, Leinonen J, Vesalainen S, Nordling S, Rannikko S, Stenman . · 1 1. 20 UH. Characterization and immunological determination of the complex between . 1". prostate-specific antigen and alpha2-macroglobulin. Clin Chem 1998;44:2471-9.
• · · . . 8. Fortier, AH, Nelson BJ, Grella DK, Holaday JW. Antiangiogenic activity of prostate- i..' specific antigen. J Natl Cancer Inst 1999;91:1635-40.
: .. 9. Heidtmann, HH, Nettelbeck DM, Mingels A, Jager R, Welker HG, Kottermann RE.
: : 25 Generation of angiostatin-like fragments from plasminogen by prostate-specific . : ·. antigen. Br J Cancer 1999;81:1269-73.
1 10. Adams, GP, Schier R. Generating improved single-chain Fv molecules for tumor targeting. J Immunol Methods 1999;231:249-60.
34 1 1 6 4 6 7 11. Gersuk, GM, Corey MJ, Corey E, Stray JE, Kawasaki GH, Vesseliä RL. High-affinity peptide ligands to prostate-specific antigen identified by polysome selection. Clin Invest Med 1997;20:119-26.
12. Denmeade, SR, Lou W, Lovgren J, Malm J, Lilja H, Isaacs JT. Specific and efficient 5 peptide substrates for assaying the proteolytic activity of prostate-specific antigen.
Cancer Res 1997;57:4924-30.
13. Denmeade, SR, Nagy A, Gao J, Lilja H, Schally AV, Isaacs JT. Enzymatic activation of a doxorubicin-peptide prodrug by prostate-specific antigen. Cancer res 1998;58:2537-40.
10 14. Arap, W, Pasqualini, R, Ruoslahti E. Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse model [see comments]. Science 1998;279:377-80.
15. Nargund, RP, Patchett AA, Bach MA, Murphy MG, Smith RG. Peptidomimetic growth hormone secretagogues. Design considerations and therapeutic potential. J Med Chem 1998;41:3103-27.
15 16. Houghten, RA, Pinilla C, Appel JR, Blondelle SE, Dooley CT, Eichler J, Nefzi A,
Ostresh JM. Mixture-based synthetic combinatorial libraries. J Med Chem 1999;42:3743-78.
:. ‘ * j 17. Harbottle, RP, Cooper RG, Hart SL, Ladhoff A, McKay T, Knight AM, Wagner E, ·"· Miller AD, Coutelle C. An RGD-oligolysine peptide: a prototype construct for 20 integrin-mediated gene delivery [see comments]. Hum Gene Ther 1998;9:1037-47.
: ; 18. Zalipsky, S, Puntambekar B, Boulikas P, Engbers CM, Woodle MC. Peptide attachment to extremities of liposomal surface grafted PEG chains: preparation of the long-circulating form of laminin pentapeptide, YIGSR. Bioconjug Chem 1995;6:705-8.
19. Slepuskin, VA, Salem, II, Andreev SM, Dazin P, Duzgunes N. Targeting of liposomes · " 25 to HIV-1 -infected cells by peptides derived from the CD4 receptor. Biochem Biophys ‘ Res Commun 1996;227:827-33.
• I
116467 35 20. Rajotte, D, Arap W, Hagedom M, Koivunen E, Pasqualini R, Ruoslahti E. Molecular heterogeneity of the vascular endothelium revealed by in vivo phage display. J Clin Invest 1998;102:430-7.
21. Koivunen, E, Wang B, Dickinson CD, Ruoslahti E. Peptides in cell adhesion research.
5 Methods Enzymol 1994;245:346-69.
22. Koivunen, E, Huhtala ML, Stenman UH. Human ovarian tumor-associated trypsin. Its purification and characterization from mucinous cyst fluid and identification as an activator of pro-urokinase. J Biol Chem 1989;264:14095-9.
23. Itkonen, O, Koivunen E, Hurme M, Alithan H, Schroder T, Stenman UH. Time-10 resolved immunofluorometric assays for trypsinogen-1 and 2 in serum reveal preferential elevation of trypsinogen-2 in pancreatitis. J Lab Clin Med 1990;115:712-8.
24. Leinonen, J, Zhang W-M, Paus E, Stenman U-H. Reactivity of 77 antibodies to prostate-specific antigen (PSA) with isoenzymes and complexes of PSA. Tumor Biol 1999;20:Suppl 1:28-34.
15 25. Smith, DB, Johnson KS. Single-step purification of polypeptides expressed in
Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene 1988;67:31-40.
*; ’: 26. Leinonen, J, Lovgren T, Vornanen T, Stenman UH. Double-label time-resolved ! * *; immunofluorometric assay of prostate-specific antigen and of its complex with alpha 1 - ”” antichymotrypsin. Clin Chem 1993;39:2098-103.
. · · ·. 20 27. Leinonen, J, Leinimaa M, Zhang W-M, Piironen T, Pettersson K, Lilja H, Dowell B, . . Stenman U-H. Reactivity of anti-PSA monoclonal antibodies with recombinant human kallikrein-2. Tumor Biol 1999;20:Suppl 1:35-7.
;.. ’ 28. Zhang, W-M, Leinonen J, Stenman U-H. Prostate-specific antigen forms a complex with and cleaves alpha-1-protease inhibitor in vitro. Prostate 1997;33:87-96.
:: 25 29. Fisher, RJ, Fivash M. Surface plasmon resonance based methods for measuring the , . kinetics and binding affinities of biomolecular interactions. Curr Opin Bitechnol : 1994;5:389-95.
36 1 1 6 4 6 7 30. Stenman, UH, Paus E, Allard WJ, Andersson I, Andres C, Bamett TR, Becker C, Belenky A, Bellanger L, Pellegrino CM, Bormer OP, Davis G, Dowell B, Grauer LS, Jette DC, Karlsson B, Kreutz FT, van der Kwast TM, Lauren L, Leinimaa M, Leinonen J, Lilja H, Linton HJ, Nap M, Hilgers J, et ai. Summary report of the TD-3 workshop: 5 characterization of 83 antibodies against prostate-specific antigen. Tumour Biol 1999;20:1-12.
31. Lovgren, J, Piironen T, Overmo C, Dowell B, Karp M, Pettersson K, Lilja H, Lundwall A. Production of recombinant PSA and HK2 and analysis of their immunologic crossreactivity. Biochem Biophys Res Commun 1995;213:888-95.
10 32. Cohen, P, Graves HC, Peehl DM, Kamarei M, Giudice LC, Rosenfeld RG. Prostate- specific antigen (PSA) is an insulin-like growth factor binding protein-3 protease found in seminal plasma. J Clin Endocrinol Metab 1992;75:1046-53.
33. Koistinen, H, Seppälä M, Koistinen R. Different forms of insulin-like growth factor binding protein-3 detected in serum and seminal plasma by immunofluorometric assay 15 with monoclonal antibodies. Clin Chem 1994;40:531 -6.
34. Sottrup-Jensen, L. Alpha-macroglobulins: structure, shape, and mechanism of proteinase complex formation. J Biol Chem 1989;264:11539-42.
• 1 1 35. Berg, JM, Shi Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of *' 1 j zinc. Science 1996;271:1081-5.
:.' · 1 20 36. Katz, BA, Clark JM, Finer-Moore JS, Jenkins TE, Johnson CR, Ross MJ, Luong C, :...: Moore WR, Stroud RM. Design of potent selective zinc-mediated serine protease :...; inhibitors. Nature 1998;391:608-12.
:\· 37. Feng, S, Kasahara C, Rickies RJ, Schreiber SL. Specific interactions outside the • »
• ’ “: proline-rich core of two classes of Src homology 3 ligands. Proc Natl Acad Sei U S A
:·! 25 1995;92:12408-15.
•; · ’ 38. Scott, JK, Smith GP. Searching for peptide ligands with an epitope library. Science :‘j’: 1990;249:386-90.
• 1 · • » 1 37 1 1 6 4 6 7 39. Lilja, H, Abrahamsson PA, Lundwall A. Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa. J Biol Chem 1989;264:1894-900.
40. Coombs, GS, Bergstron RC, Pellequer JL, Baker SI, Navre M, Smith MM, Tainer JA, 5 Madison EL, Corey DR. Substrate specificity of prostate-specific antigen (PSA). Chem Biol 1998;5:475-488.
• · · • · 1 · * » t • · 38 1 1 6467
SEQUENCE LISTING
<110> Helsinki University Licensing Ltd Oy 5 <120> Novel peptide ligands <130> hul3 <14 0> 10 <141> <160> 29 <170> Patentin Ver. 2.1 15
<210> 1 <211> 10 <212> PRT
<213> Artificial Sequence 20 <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptide <400> 1 25 Cys Val Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Phe Cys 15 10 <210> 2 30 <211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence <220> 35 <223> Description of Artificial Sequence: peptide • · · : <400> 2 ' .:. Cys Val lie Tyr Asp Gly Asn His Trp Cys :.. : 1 5 10 :*·! 40 \'-l <210> 3 .···. <211> 10
<212> PRT
45 <213> Artificial Sequence <220> , . <223> Description of Artificial Sequence: peptide .···! 50 <400> 3 ···* Cys lie Phe Glu Pro Asp Tyr Ser Tyr Cys 1 5 10 ···’ 55 <210> 4 ; X <211> 10 :.: i <2i2> prt <213> Artificial Sequence 60 <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptide 39 1 1 6 4 6 7 <400> 4
Cys Vai Phe Asp Asp Leu Tyr Ser Phe Cys 15 10 5
<210> 5 <211> 12 <212> PRT
10 <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptide 15 <400> 5
Cys Thr Phe Ser Val Asp Tyr Lys Tyr Leu Met Cys 15 10
20 <210> 6 <211> 12 <212> PRT
<213> Artificial Sequence 25 <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptide <400> 6
Cys Val Phe Ala His Asn Tyr Asp Tyr Leu Val Cys 30 1 5 10
<210> 7 <211> 12 35 <212> PRT
·”. <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptide :··: 40 ... : <400> 7 *. Cys Arg Phe Asp Lys Glu Tyr Arg Thr Leu Val Cys .*··. 15 10 45 <210> 8 <211> 13
.-, : <212> PRT
’· '1 <213> Artificial Sequence ·-; 50 <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptide <400> 8 *1’ 55 Cys Val Ser Tyr Cys Leu Phe Glu Phe Cys Tyr Val Cys : 1 5 10 <210> 9 60 <211> 13
<212> PRT
40 1 1 6 4 6 7 <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptide <400> 9
Cys Vai Glu Tyr Cys Trp Glu Gly Ser Cys Tyr Val Cys 15 10 10
<210> 10 <211> 13 <212> PRT
<213> Artificial Sequence 15 <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptide <400> 10 20 Cys Val Ala Tyr Cys Glu Glu Trp Glu Cys Tyr Val Cys 15 10 <210> 11 25 <211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence <220> 30 <223> Description of Artificial Sequence: peptide <4 00> 11
Cys Val Ala Tyr Cys lie Glu His His Cys Trp Thr Cys 15 10 35 ‘ <210> 12 ; <211> 13
; <212> PRT
I": 40 <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptide * · · 45 <400> 12
Cys Val Ser Tyr Cys Asp Gly Leu Gin Cys Trp Met Cys 15 10 * · · * · * ····. 50 <210> 13
<211> 13 <212> PRT
’·’·* <213> Artificial Sequence 55 <220> : .·, <223> Description of Artificial Sequence: peptide <400> 13
Cys Leu Ser Thr Cys Ala Gin Ser Cys Arg lie Ser Cys 60 1 5 10 4i 1 1 6467
<210> 14 <211> 13 <212> PRT
5 <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptide 10 <400> 14
Cys Leu Leu Tyr Cys His Asp Ala Cys Trp Trp Val Cys 15 10 15 <210> 15
<211> 13 <212> PRT
<213> Artificial Sequence 20 <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptide <4 00> 15
Cys Val Thr Tyr Cys Tyr Gly Glu Val Cys Tyr Tyr Cys 25 1 5 10
<210> 16 <211> 13 30 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptide 35 ·:·. <400> 16 ·* * Cys Ala Ala Tyr Cys Val Ala Gly Leu Cys Tyr Gly Cys ; 15 10 :··: 40 ... . <210> 17
<211> 13 <212> PRT
···’ <213> Artificial Sequence 45 <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptide <400> 17 50 Cys Val Gin Tyr Cys lie Gly Gly Asp Cys Trp Phe Cys ·;·’ 15 10 <210> 18 55 <211> 13
: .·. <212> PRT
··· · <213> Artificial Sequence ’···' <220> 60 <223> Description of Artificial Sequence: peptide 42 1 1 6467 <400> 18
Cys Vai Vai Tyr Cys Asp Ser Met Lys Cys Trp Thr Cys 15 10 5
<210> 19 <211> 13 <212> PRT
<213> Artificial Sequence 10 <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptide <400> 19 15 Cys Vai Ala Tyr Cys Ile Ser Ser Leu Cys Tyr Tyr Cys 15 10
<210> 20 20 <211> 10 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220> 25 <223> Description of Artificial Sequence: peptide <400> 20
Cys Vai Trp Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Cys 15 10 30
<210> 21 <211> 10 <212> PRT
35 <213> Artificial Sequence * <220> . ··; <223> Description of Artificial Sequence: peptide 40 <400> 21 ; Cys Vai Phe Asp Ala Leu Tyr Thr Phe Cys is ίο 45 <210> 22 <211> 10
<212> PRT
.·, : <213> Artificial Sequence 50 <220> ’* <223> Description of Artificial Sequence: peptide <400> 22
Cys Vai Ile Tyr Pro Gly Asn Vai Trp Cys *;·" 55 i 5 io
<210> 23 <211> 10 60 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220> 43 1 1 6467 <223> Description of Artificial Sequence: peptide 5 <400> 23
Cys lie Phe Asp Gly Phe Tyr lie Leu Cys 15 10 10 <210> 24
<211> 10 <212> PRT
<213> Artificial Sequence 15 <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptide <400> 24
Cys Val Pro Tyr Leu Gly Leu Trp Leu Cys 20 1 5 10
<210> 25 <211> 12 25 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptide 30 <400> 25
Cys Met Phe Asp Pro Met Tyr Met Trp Met Thr Cys 15 10 35 *:·. <210> 26 <211> 21
·:; <212> DNA
' <213> Artificial Sequence :··: 40 . <220> . " <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide 45 <400> 26 ccctcatagt taagcgtaac g 21 <210> 27 .*··. 50 <211> 29
·;·’ <212> DNA
_·ι·ι <213> Artificial Sequence .*·*. <220> ·;· 55 <223> Description of Artificial Sequence: ; ,·. oligonucleotide <400> 27 aggctcgagg atcctcggcc gacggggct 29 60 44 1 1 6467
<210> 28 <211> 27 <212> DNA
<213> Artificial Sequence 5 <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide 10 <400> 28 aggtctagaa ttcgccccag cggcccc 27 <210> 29 15 <211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence <220> 20 <223> Description of Artificial Sequence-.peptide <400> 29
Cys Val Ala Tyr Cys 1 5 25 »II *

Claims (22)

  1. 45 1 1 6467
  2. 1. Kaavan (I) mukaiset peptidimotiivit tai sekvenssit
  3. 5 CX,X2XXXX6XXC (I) jossa X1 on V tai I, X2 on F, I, W tai P, X6 on Y, N tai L, 10. onkysteiinija kukin X merkitsee riippumattomasti jotain aminohappotähdettä.
  4. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset peptidimotiivit tai sekvenssit, t u n n e t u t siitä, että X1 on V tai I, X2on F tai I ja X6on Y tai N. 15
  5. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset peptidimotiivit tai sekvenssit, tunnetut siitä, että X on V, X on F, X on Y ja kukin X on aminohappotähde, joka on toisista tähteistä riippumattomasti T, S, D, Y, A, F, E ,P tai L. ; ‘; 20 4. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset peptidimotiivit tai sekvenssit, tunnetut siitä, että ; ; X onV, X onl, X on N ja kukin X on aminohappotähde, joka on toisista tähteistä • · riippumattomasti Y, D, G, H, W, P tai V. » i *
  6. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset peptidimotiivit tai sekvenssit, tunnetut siitä, että ,: 25 X1 on I, X2 on F, X6 on Y tai N ja kukin X on aminohappotähde, joka on toisista tähteistä riippumattomasti E, P D, S, Y, G, F, I tai L. • · ‘ 6. Kaavan (II) mukaiset peptidimotiivit tai sekvenssit
  7. 30 CX1X2XXXX6XX8X9X10C (II) »Il < « ·:·· jossa X1 onV, TtaiR, X2 on F, 46 1 1 6467 X6 on Y, X8 on Y tai T X9 onL X10 on V tai M, ja 5. ja C merkitsevät samaa kuin patenttivaatimuksessa 1,
  8. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukaiset peptidimotiivit tai sekvenssit, tunnetut siitä, että X1 on V, X2 on F, X6 on Y, X8 on Y, X9 on L, X10 on V ja X on A, H, N tai D.
  9. 8. Kaavan (III) mukaiset peptidimotiivit tai sekvenssit CX'X2X3CXXXXCX8X9C (III) jossa X1 on V tai A,
  10. 15 X2 on A, S, E, T, V tai Q, X3 on Y, X8 on Y tai W X9 on V, T, M, Y, G tai F ja X ja C merkitsevät samaa kuin patenttivaatimuksessa 1. 20
  11. 9. Patenttivaatimuksen 8 mukaiset peptidimotiivit tai sekvenssit, tunnetut siitä, että ; X1 on V, X2 on A tai S, X3 on Y, X8 on Y tai W, X9 on V, Y tai T, ja kukin X on toisista tähteistä riippumattomasti L, F, E, W, G, S, I, H, D, G, L, Q, Y, V, A, M tai K. » » ! 25 10. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukaiset peptidimotiivit tai sekvenssit, tunnetut siitä, että X1 on V, X2 on A ja X3 on Y. . · · ·. 11. Kaavan (IV) mukaiset peptidimotiivit tai sekvenssit
  12. 30 CX1XX3CXXXCX7XXXC (IV) » » » · * » * • ·’ jossa X1 onL, " : X3 on T tai Y, X7 on R tai W, ja 47 1 1 6467 X ja C merkitsevät samaa kuin patenttivaatimuksessa 1.
  13. 12. Patenttivaatimuksen 11 mukaiset peptidimotiivit tai sekvenssit, tunnetut siitä, että X1 onLjaX3on T. 5
  14. 13. Peptidimotiivi tai sekvenssi, tunnettu siitä, että se on CVFTSDYAFC (SEQ ID NO 1), CVIYDGNHWC (SEQ ID NO 2), CIFEPDYSYC (SEQ ID NO 3),
  15. 10 CVFDDLYSFC (SEQ ID NO 4), CTFSVDYKYLMC (SEQ ID NO 5), CVFAHNYDYLVC (SEQ ID NO 6), CRFDKEYRTLVC (SEQ ID NO 7), CVSYCLFEFCYVC (SEQ ID NO 8),
  16. 15 CVEYCWEGSCYVC (SEQ ID NO 9), CVAYCEEWECYVC (SEQ ID NO 10), CVAYCIEHHCWTC (SEQ ID NO 11), CVSYCDGLQCWMC (SEQ ID NO 12), CLSTCAQSCRISC (SEQ ID NO 13),
  17. 20 CLLYCHDACWWVC (SEQ ID NO 14), CVTYCYGEVCYYC (SEQ ID NO 15), : CAAYCVAGLCYGC (SEQ ID NO 16), .* CVQYCIGGDCWFC (SEQ ID NO 17), .; CVVYCDSMKCWTC (SEQ ID NO 18), , :. 25 CVAYCISSLCYYC (SEQ ID NO 19), CVWYTGNTWC (SEQ ID NO 20), .:. CVFDALYTFC (SEQ ID NO 21), : ’ *:. CVIYPGNVWC (SEQ ID NO 22), CIFDGFYILC (SEQ ID NO 23), . ’.. ’ 30 CVPYLGLWLC (SEQ ID NO 24) tai CMFDPMYMWMTC (SEQ ID NO 25). 48 1 1 6467
  18. 14. Diagnostinen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää vähintään yhden jonkin patenttivaatimuksen 1 - 13 mukaisen peptidimotiivin ja/tai sekvenssin ja diagnostiscsti hyväksyttävän kantajan ja/tai leimausaineen.
  19. 15. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää vähintään yhden jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukaisen peptidimotiivin ja/tai sekvenssin ja farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan ja/tai leimausaineen.
  20. 16. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukaisten peptidimotiivien ja 10 sekvenssien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää kiinteän faasin Merrifield-tyyppisen peptidisynteesin.
  21. 17. Jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukaisen peptidimotiivin tai sekvenssin käyttö lääkkeen valmistamiseksi sellaisten sairauksien hoitamiseksi, jotka perustuvat PS A- 15 entsyymiaktiivisuuden säätelyyn.
  22. 18. Jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukaisen peptidimotiivin tai sekvenssin käyttö sellaisen reagenssin valmistamiseksi, jota käytetään PSA.han perustuvassa hyvänlaatuisten tai pahanlaatuisten eturauhassairauksien ja muista PSA:ta tuottavista kudoksista johtuvien 20 sairauksien diagnoosissa. »· > · • ; 19. Jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukaisen peptidimotiivin tai sekvenssin käyttö PSA:n erilaisten molekyylimuotojen biokemiallisessa eristämiseen ja puhdistamiseen. * » » • » * * » * · • · • t » · I · 1 t I · * · t Φ » » » t » 116467
FI20002159A 2000-09-29 2000-09-29 Uudet peptidiligandit FI116467B (fi)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20002159A FI116467B (fi) 2000-09-29 2000-09-29 Uudet peptidiligandit
CA002423966A CA2423966A1 (en) 2000-09-29 2001-10-01 Peptide ligands for prostate specific antigen
AU9389301A AU9389301A (en) 2000-09-29 2001-10-01 Peptide ligands for prostate specific antigen
PCT/FI2001/000856 WO2002026777A1 (en) 2000-09-29 2001-10-01 Peptide ligands for prostate specific antigen
AU2001293893A AU2001293893B2 (en) 2000-09-29 2001-10-01 Peptide ligands for prostate specific antigen
US10/363,662 US7414023B2 (en) 2000-09-29 2001-10-01 Peptide ligands for prostate specific antigen
JP2002531160A JP4647882B2 (ja) 2000-09-29 2001-10-01 前立腺癌特異抗原についてのペプチドリガンド
EP01974361A EP1332152A1 (en) 2000-09-29 2001-10-01 Peptide ligands for prostate specific antigen
US12/044,388 US20080312141A1 (en) 2000-09-29 2008-03-07 Peptide ligands for prostate specific antigen

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20002159A FI116467B (fi) 2000-09-29 2000-09-29 Uudet peptidiligandit
FI20002159 2000-09-29

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI20002159A0 FI20002159A0 (fi) 2000-09-29
FI20002159A FI20002159A (fi) 2002-03-30
FI116467B true FI116467B (fi) 2005-11-30

Family

ID=8559201

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20002159A FI116467B (fi) 2000-09-29 2000-09-29 Uudet peptidiligandit

Country Status (7)

Country Link
US (2) US7414023B2 (fi)
EP (1) EP1332152A1 (fi)
JP (1) JP4647882B2 (fi)
AU (2) AU2001293893B2 (fi)
CA (1) CA2423966A1 (fi)
FI (1) FI116467B (fi)
WO (1) WO2002026777A1 (fi)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003018611A2 (en) 2001-08-24 2003-03-06 University Of Victoria Innovation And Development Corporation Proaerolysin containing protease activation sequences and methods of use for treatment of prostate cancer
EP1718759A1 (en) * 2004-02-19 2006-11-08 Bayer HealthCare AG Diagnostics and therapeutics for diseases associated with kallikrein 3 (klk3)
JP5220594B2 (ja) 2005-06-14 2013-06-26 プロトクス セラピューティックス インコーポレイティッド ポア形成修飾タンパク質を用いて良性前立腺肥大症を治療または予防する方法
JP5278873B2 (ja) * 2008-05-14 2013-09-04 国立大学法人九州工業大学 癌診断用試薬
WO2012106671A1 (en) * 2011-02-03 2012-08-09 Integrated Diagnostics, Inc. Psa capture agents, compositions, methods and preparation thereof

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3904689B2 (ja) 1997-09-24 2007-04-11 日本ケミカルリサーチ株式会社 前立腺特異抗原の阻害剤

Also Published As

Publication number Publication date
US7414023B2 (en) 2008-08-19
AU2001293893B2 (en) 2006-12-07
JP2004509976A (ja) 2004-04-02
FI20002159A0 (fi) 2000-09-29
EP1332152A1 (en) 2003-08-06
FI20002159A (fi) 2002-03-30
WO2002026777A1 (en) 2002-04-04
US20080312141A1 (en) 2008-12-18
AU9389301A (en) 2002-04-08
CA2423966A1 (en) 2002-04-04
US20040106557A1 (en) 2004-06-03
JP4647882B2 (ja) 2011-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wu et al. Identification of novel prostate‐specific antigen‐binding peptides modulating its enzyme activity
JP6567577B2 (ja) Tfpiインヒビターおよび使用法
Li et al. Design and synthesis of novel and potent inhibitors of the type II transmembrane serine protease, matriptase, based upon the sunflower trypsin inhibitor-1
KR101958964B1 (ko) 항종양 및 항혈관생성 활성을 갖는 사이클릭 펩타이드
FI116467B (fi) Uudet peptidiligandit
EP1799701B1 (en) Peptide inhibitors of hk2 and their use.
Manabe et al. Development of a diketopiperazine-forming dipeptidyl Gly-Pro spacer for preparation of an antibody–drug conjugate
US7879792B2 (en) Synthetic peptide inhibitors of thrombin and thrombin activation of protease activated receptors 1 and 4
Colman et al. The plasma kallikrein-kinin system in sepsis, inflammatory arthritis, and enterocolitis
Koistinen et al. Development of peptides specifically modulating the activity of KLK2 and KLK3
US20040220110A1 (en) Synthetic peptide analogs of Arg-Pro-Pro-Gly-Phe as selective inhibitors of thrombin and thrombin activation of protease activated receptors 1 and 4
AU2001293893A1 (en) Peptide ligands for prostate specific antigen
KR20000070256A (ko) 라미닌의 니도겐-결합 도메인에 결합하는 항체, 이의 제조방법및 용도
Leinonen, P. Wu, UH Stenman, E. Koivunen, A. Närvänen Development of novel peptide ligands modulating the enzyme activity of prostate-specific antigen
JPH06505496A (ja) 活性因子x111の活性化を阻害するための組成物と方法
CN101160133A (zh) 治疗用途的来自人血浆的内-α抑制剂蛋白质的制备和组合物
WO2015073538A2 (en) Interaction with metalloenzymes
Kaplan Mechanisms of bradykinin formation
WO2009000971A2 (en) A novel peptide
CN101027316A (zh) 肿瘤靶向剂及其应用
CA2284137A1 (en) Prostate specific antigen substrates
CN100365014C (zh) 肿瘤靶向剂及其应用
CN103142650A (zh) 治疗用途的来自人血浆的内-α抑制剂蛋白质的制备和组合物
Végh et al. of June 13, 2013.

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 116467

Country of ref document: FI

MM Patent lapsed