JP2010500967A - コンビナトリアルターゲティングを通じたプロトキシンの選択的活性化のための方法、組成物、およびキット - Google Patents
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Abstract
Description
概して、本発明は、全身副作用を軽減しながら、細胞毒性剤または細胞増殖阻害剤を特定の細胞型に対する標的とするための治療方策に関する。より具体的には、本発明は、独立した標的原理を有する2つ以上の個別には不活性である成分を含む治療法の使用を含み、それらは標的細胞において、それら特有の相互作用を介して活性化される。本発明は、関連する方法および組成物もまた提供する。
特定の細胞型の選択的殺滅は、通常、悪性細胞の増殖および蓄積を通して現れる癌の治療を含む、様々な臨床的設定において望ましい。癌に対する従来の治療は、化学療法であり、DNA合成を阻害する、またはDNAを損傷することにより腫瘍細胞を殺滅する(ChabnerおよびRoberts, Nat. Rev. Cancer 5:65(2005)(非特許文献1))。しかしながら、このような治療は、正常細胞の無差別な殺滅によって、しばしば重度の全身毒性を引き起こす。多くの癌化学療法薬は増殖細胞の選択的な破壊を経て有効性を発揮するため、骨髄、消化管、および毛包等の増殖速度が速い正常組織への毒性の増加により、適量における使用が通常妨げられてきた。このような治療は、しばしば失敗に終わり、薬物耐性、疾病の再発、および/または転移をもたらす。全身毒性を軽減するために、特定の細胞集団を選択的に標的とするための異なる戦略が研究されている。腫瘍関連の抗原を認識する抗体および他のリガンドは、小分子の薬物またはタンパク質毒素と結合し、それぞれ、免疫複合体および抗毒素としばしば称される、コンジュゲートおよび融合タンパク質を生成する(Allen, Nat. Rev. Cancer 2:750(2002)(非特許文献2))。
本発明は、コンビナトリアルターゲティング法を使用して、標的となる細胞の選択的殺滅を介して様々な疾病を治療するための方法および組成物を提供する。一局面において、本発明は、細胞を標的とする部分を含むプロトキシン融合タンパク質と、標的細胞内、標的細胞上、またはその近傍において、天然に作用可能には見出されない活性化部分により活性化される修飾可能な部分とを特徴とする。これらの方法はまた、特定の細胞集団を標的にし、破壊するために、プロトキシンおよびプロトキシン活性化因子を少なくとも含む、2つ以上の治療薬の併用使用を含む。それぞれの薬剤は、標的細胞の独立した細胞表面標的に結合する少なくとも1つの、細胞を標的とする部分を含む。プロトキシンは、プロトキシン活性化因子によって作用され得る修飾可能な活性化部分を含む。プロトキシン活性化因子は、修飾可能な活性化部分に作用して、プロトキシンを活性毒素または天然で活性化可能な毒素に変換する、または変換させる、酵素活性を含む。該標的細胞は、その後、活性化毒素により抑制、または破壊される。
本発明のプロトキシン/毒素活性化因子の組み合わせは、密接に関連する細胞を回避しつつ、特定の細胞サブセットを標的とし、殺滅する。本発明の有用性は、望ましい治療効果を達成するための細胞のサブセットの選択的な排除にある。特に、本発明の組み合わせは、密接に関連する正常な細胞を回避しつつ、癌細胞を標的とすることが可能であり、これにより癌に対するさらに特定的で効果的な治療を提供する。細胞を標的とする部分は、標的とされる癌細胞上、または好ましくは治療上の利点を達成するために除去される、標的とされる非癌細胞上の細胞表面標的を標的とすることが可能である。
1つまたは両方の、細胞を標的とする部分は、例えば、細胞のサブセット上で見られ、かつ人体の様々な臓器、または該臓器内の特定の細胞種、または造血、神経、もしくは血管系細胞のマーカー等の、天然起源を表す系統特異的マーカーを認識することにより、特定の種類の細胞に特有である細胞表面標的を標的とすることが可能である。代替として、1つまたは両方の、細胞を標的とする部分は、癌細胞、または自己免疫の活性を誘発もしくは生じさせる細胞(例えば、B細胞、T細胞、樹状細胞、NK細胞、好中球、白血球、マクロファージ、血小板、マクロファージ、骨髄性細胞、および顆粒球)等の、病変組織上に異常に発現した細胞表面マーカーを標的とすることが可能である。1つまたは両方の薬剤は、癌細胞により異常に過剰発現された細胞表面マーカーを標的とすることが可能である。この複数の薬剤標的の方策は、正常な細胞、または望ましい細胞への深刻な損傷を伴わず、新生物、または望ましくない細胞を選択的に標的とするために使用され、これにより、白血病ならびにリンパ腫、例えば、B細胞性慢性白血病、マントル細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病、成人T細胞白血病、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫を含む癌、ならびに黒色腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、膵臓癌、腎癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、甲状腺癌、脳腫瘍、骨癌、睾丸癌、子宮癌、軟部組織腫瘍、神経系腫瘍および頭頚部癌を含む癌のための治療を提供する。
標的とされる癌:乳癌
標的とされる癌:結腸直腸癌(CRC)
標的とされる癌:非小細胞肺癌(NSCLC)
標的とされる癌:卵巣癌
標的とされる癌:膵臓癌
標的とされる癌:前立腺癌(Pca)
標的とする発癌性幹細胞
本発明は、それぞれが細胞を標的とする部分を含有する、プロトキシン融合タンパク質およびプロトキシン活性化因子融合タンパク質を特徴とする。本発明の該細胞を標的とする部分は、抗体、抗体模倣剤、標的細胞表面上に発現したある受容体に対して特定のリガンド、糖質、および細胞表面分子を特異的に結合するペプチドに由来するタンパク質を含む。
本発明のプロトキシンは、1つ以上の事前に選択した細胞表面標的を、独立して標的とするように設計される。活性化するためには、本発明のプロトキシンは、対応するプロトキシン活性化因子により修飾されなければならない。一態様においては、本発明は、1つの毒素の細胞傷害性ドメイン、ならびに同一あるいは別の毒素の転位ドメイン、および外因性プロテアーゼにより特異的に認識されるタンパク質分解切断の配列を含有する介在ペプチドを含有する、プロトキシンを特徴とする。代替として、またはさらに、毒素活性を、化学的部分またはペプチド部分により阻止してもよい。これらの場合において、毒素は、本化学的部分またはペプチド部分が、外因性酵素(すなわち、プロトキシン活性化因子)、または標的細胞上、あるいはその周囲に自然に存在する活性化因子のいずれかにより修飾される場合のみ、活性化する。毒素またはプロトキシン融合体は、当技術分野に既知のあらゆる毒素に由来することが可能であり、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素A、志賀毒素ならびに志賀様毒素、炭疽毒素、孔形成毒素もしくはプロアエロリシン、溶血素、肺炎球菌溶血素、Cry1毒素、ビブリオ属のプロ細胞溶解素、もしくはリステリオリシン等のプロトキシン、コレラ毒素、クロストリジウムセプチカムα毒素,破傷風毒素ならびにボツリヌス毒素を含むクロストリジウム属神経毒、ゲロニン;ピエリシン−1等の核酸変性剤、およびリシン、アブリン、ならびにモデシン等のリボソーム不活性化タンパク質(RIPs)を含むが、これらに限定されない。
多くのプロテアーゼは、インビボの標的とされる細胞の死に重要な役割を果たすため、これらは本発明の毒素部分として使用され得る。例えば、グランザイムは、細胞傷害性T細胞およびナチュラルキラー細胞内の細胞傷害性顆粒により放出され、ウイルス感染した細胞内でアポトーシスをもたらすことが可能で、それゆえそれらを破壊する、外因性セリンプロテアーゼである。カスパーゼは、アポトーシスの開始ならびに実行段階において中心的な役割を果たす、システインプロテアーゼである。補体活性化の間のタンパク質分解カスケードは、補体媒介性炎症、白血球遊走、および補体オプソニン化した粒子および細胞の食作用をもたらし、最終的に、膜穿通病変の結果として、標的細胞および微生物の直接溶解に至る。
米国特許第7,101,977号は、グランザイムB等のアポトーシス誘導因子を含むキメラタンパク質、および細胞特定標的部分は細胞死をもたらすことを開示する。GrBは、カスパーゼ(特にカスパーゼ−3)を切断することにより細胞死をもたらし、それに代わってカスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼを活性化する。該酵素はDNAを分解し、アポトーシスを起こした細胞を不可逆的に不活性化する。GrBはタンパク質Bidをも切断し、ミトコンドリアの膜浸透性を変化させるために、他のタンパク質の中でも、タンパク質BaxおよびBakを採用し、シトクロムc(カスパーゼ9を活性化する)、Smac/DiabloおよびOmi/HtrA2(アポトーシスタンパク質の阻害剤(IAP)を抑制する)の放出を生じる。
2種類のアポトーシスのカスパーゼがあり、それらは、イニシエーター(アピカル)カスパーゼ、およびエフェクター(エクセキューショナー)カスパーゼである。イニシエーターカスパーゼ(例えば、カスパーゼ−2、−8、−9および−10)は、エフェクターカスパーゼの不活性前駆体を切断し、それによって、これら前駆体を活性化する。エフェクターカスパーゼは(例えば、カスパーゼ−3、−6、−7)、代わりに細胞内の他のタンパク質基質を切断し、アポトーシス過程をもたらす。インビボにおいて、該カスケード反応の開始はカスパーゼ阻害剤により制限される。カスパーゼカスケードは、細胞傷害性Tリンパ球により放出され、カスパーゼ−3ならびに−7を活性化するグランザイムB、カスパーゼ−8ならびに−10を活性化する細胞死受容体(FAS、TRAIL受容体、およびTNF受容体のような)、およびカスパーゼ−9を活性化するシトクロムcならびにBcl−2ファミリーにより制限される、アポトゾームにより活性化され得る。
補体系は、生物から病原体を取り除くことを助ける、生化学的カスケードである。補体系は、血液中に見られる数多くの低分子タンパク質を含み、標的細胞の形質膜を破裂させることにより、標的細胞を殺滅するためにともに働く。血清タンパク質、漿膜タンパク質、および細胞膜受容体を含む、20以上のタンパク質およびタンパク質フラグメントは、補体系を構成する。補体系は、適合性が無く、個体の生涯を通じて変化せず、それ自体は先天性の免疫系に属する。しかしながら、適応可能な免疫系により採用され、作用させることが可能である。
本発明のプロトキシン融合タンパク質に用いられ得る細菌毒素の例を以下に述べる。
別の局面において、本発明は、孔形成毒素ドメインを含有するプロトキシン融合タンパク質を特徴とする。これらの毒素は細胞膜に結合し、活性化が起こると、必須イオンおよび代謝物が拡散し得るチャネル(孔)を生成する。活性化するために修飾を必要とする代表的な孔形成毒素には、アエロモナスハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila)のアエロリジン、ウェルシュ菌ε毒素、クロストリジウムセプチカムα毒素、大腸菌誘発性溶血素、コレラ菌の溶血素、および百日咳菌のAC毒素(CyaA)が含まれるが、これらに限定されない。
細菌性ADPRTの基には、タンパク分解性に活性されることで知られているものがある。コレラ毒素、百日咳毒素および大腸菌エンテロトキシンは、小さな調節Gタンパク質を標的にするAB5ファミリーのメンバーである。酵素的に活性なAサブユニットは、Bサブユニットの五量体に非共有結合的に結合する(Zhangら、J. Mol. Biol. 251:563−573(1995))。百日咳毒素、大腸菌熱不安定性エンテロトキシンおよびコレラ毒素を含むADPリボシル化毒素のAB5ファミリーのメンバーは、触媒ドメイン(A)が、ジスルフィド結合したA1−A2ドメインのタンパク質分解的切断を起こすことを必要とする。Aサブユニットのタンパク質分解的切断は、A1ドメインをA2−B5複合体から放出し、細胞補助因子の存在下においてA2−B5複合体を細胞毒性にする(Holboumら、FEBS J. 273:4579−4593(2006))。
治療剤として用いられる可能性がある多くのタンパク質毒素に共通する性質は、標的細胞内に見られるか、またはその近傍に存在するフリン/ケキシン(kexin)プロテアーゼ等の遍在性プロテアーゼの作用を介した、タンパク質分解的切断による活性化を必要条件とするということである。高活性タンパク質毒素の選択性を高めるための有望なアプローチの1つは、内因性の認識配列を、腫瘍内で濃縮されると仮定されるかまたは知られるプロテアーゼの配列と置き換えるために、タンパク質分解的切断部位を導入することである。例えば、変異型炭疽毒素は、内因性のフリン切断部位を、悪性細胞によって高度に発現されることが多いプロテアーゼであるウロキナーゼで容易に切断される部位と置き換えるために操作されてきた(Liuら、J Biol Chem. 2001 May 25;276(21):17976−84)。シュードモナス外毒素AのADPリボシル化ドメインに融合された、炭疽菌の致死因子から構成されるキメラ毒素の形成は、腫瘍細胞を選択的に死滅させる薬剤をもたらす結果となった(Liuら、J Biol Chem. 2001 May 25;276(21):17976−84.)。この場合の組換え毒素は、自然に標的にされた、すなわち、独立した腫瘍特異的な標的部分を含んでいなかった。様々なヒト固形腫瘍に幅広い適応性を持つ可能性のある、ウロキナーゼにより活性化可能な組換え炭疽毒素変異体が開示されている(Abi−Habibら、Mol Cancer Ther. 5(10):2556−62(2006))。SinghらのAnti Cancer Drugs. 18(7):809−16(2007)は、プロテアーゼ特異的抗原であるキモトリプシン様プロテアーゼにより活性化することが可能な、組換えアエロリジンの生成について開示している。
当該技術分野で周知である、本発明の目的に特に適した多種類の細菌毒素は、AB毒素として知られる。AB毒素は、細胞標的および転位ドメイン(Bドメイン)と、酵素的に活性なドメイン(Aドメイン)から構成され、活性化配列に対する内因性標的細胞プロテアーゼの作用に続いて、細胞質への転位を引き起こす。
上記の他に、凝集を防ぐ添加剤の存在下において変性剤の急速希釈または段階的な除去を行うことにより、不溶性毒素のリフォールディングを通して機能的毒素が生成され得る(Middelberg. 2002. Trends Biotechnol. 20:437−43)。
RIPは、リボソームおよび他の基質の触媒の不活性化を引き起こす酵素である。このような毒素は多数の植物中に存在し、また真菌類、藻類、および細菌類にも発見されている。現在RIPは、酵素活性を有する単一ポリペプチド鎖を含む1型、および2つの異なるポリペプチド鎖(1型RIPのポリペプチドに対応するA鎖、およびレクチン活性を有するB鎖)を含む2型の2種類のうち、1つに属すると分類されている。当該技術分野において既知である2型RIPは、式A−B、(A−B)2、(A−B)4および/またはA鎖1本あたり複数のB鎖を含むポリマー形態で表すことができる。A鎖とB鎖との連結は、ジスルフィド結合によるものである。RIPの毒素活性は、真核生物リボソームの28S rRNAの高度に保存されたループ領域における、特異的アデニン基のN−グリコシド結合の加水分解の結果である、翻訳阻害によるものである(Girbesら、Mini Rev. Med. Chem. 4(5):461−76(2004))。
再構築した孔形成毒素を様々な宿主系において発現させることは、当該技術分野において周知である。一態様においては、通常、天然毒素が見られる生物または関連する生物においてプロトキシンが生成され得る。生成プロセスを簡素化するために、標準的な分子生物学の手引書に記載されるように、大腸菌、酵母(例えば、ピキアパストリス、クルイベロミセスラクチス)、昆虫細胞、インビトロ翻訳システム、および哺乳類細胞(例えば、293、3T3、CHO、HeLa、Cos、BHK、MDCK)等の異種の発現系において、再構築された毒素を生成することもできる。転写制御因子および転写シグナルは、様々な異種の発現系を伴う市販のベクターシステム内に組み込むことが可能である。毒素の発現は、シグナルペプチドの操作によって宿主細胞の細胞内または細胞外区画を標的とすることができる。再構築された毒素は、異なった発現系におけるフラグメントにおいて発現されてもよく、または合成的に生成された後で、精製された成分を用いて機能的な再構築された孔形成毒素に再構成されてもよい。
上述のように、本発明は、細胞を標的とする部分および修飾ドメインを含有する、プロトキシン活性化因子融合タンパク質を特徴とする。好ましい態様において、修飾ドメインは外因性プロテアーゼの活性を含む。
外因性プロテアーゼおよび対応する切断部位は、以下の検討事項に基づいて本発明のために選択することができる。プロテアーゼは、好ましくは、プロトキシンまたはプロテアーゼ自体を著しく不活性化することなく、プロトキシン活性化部分を切断することができる。プロテアーゼは、好ましくは、残すことが所望される細胞中または細胞上に天然では認められないが、例外として、天然の位置が、外的に投与されたプロトキシンを活性化することを不可能にする場合には、このような細胞に天然で認められてもよいものとする。例えば、毒素が、細胞の表面または細胞内プロテアーゼ(エンドソーム、ゴルジ、または小胞体)を天然では含有しない細胞内小胞区画で活性化されなければならない場合には、カスパーゼ等の細胞内プロテアーゼを用い得る。このような場合には、残すことが所望される細胞はプロテアーゼを含有し得るが、そのプロテアーゼはプロトキシンを活性化させない。
組換えヒトグランザイムB(GrB)は、プロテアーゼ融合タンパク質内で外因性プロテアーゼとして用いられ得る。GrBは、IEPDのコンセンサスな認識配列に対する高い基質配列特異性を有し、限定された数の天然の基質のみを切断することで知られている。GrBは細胞毒性Tリンパ球および天然のキラー細胞の細胞質顆粒中に認められるため、これらの細胞が標的細胞ではない限り、本発明に有用であるはずである。GrB活性に最適なpHは約pH8であるが、pH5.5〜pH9.5の間でその活性を保持する(Fynboら、Protein Expr. Purif. 39:209(2005))。GrBは、IEPDを含有するペプチドを高い効率および特異性で切断する(Harrisら、J. Biol. Chem. 273:27364(1998))。GrBはプログラム細胞死の制御に関与するため、インビボにおいては厳重に制御される。また、GrBは一本鎖であり単一ドメインのセリンプロテアーゼであるため、融合タンパク質の簡素な複合構造に寄与することがあり得る。さらに、GrBは一般に非常に安定しており、異なる融合タンパク質の切断において非常によく機能することが最近明らかになっている(Fynboら、Protein Expr. Purif. 39:209(2005))。
カテプシンのいずれのメンバーも(Chwieralskiら、Apoptosis 11:143(2006))、例えば、カテプシンA、B、C、D、E、F、G、H、K、L、S、W、およびXが、本発明のための組換えプロテアーゼとして用いられ得る。カテプシンは、生理学的な条件下でリソソーム内に局在するプロテアーゼあり、したがって、酸性環境において最適な活性を有する。カテプシンは異なった酵素分類のプロテアーゼを含む。例えば、カテプシンAおよびGはセリンプロテアーゼであり、カテプシンDおよびEはアスパラギン酸プロテアーゼである。特定のカテプシンは、アポトーシスの開始および実行フェーズにおいて中心的役割を果たすシステインプロテアーゼの独特のファミリーであるカスパーゼである。既知の哺乳類プロテアーゼ全部の中で、セリンプロテアーゼグランザイムBのみが、カスパーゼに類似した基質特異性を有する。
疾病細胞によって分泌される特定の疾病マーカーとして同定された、または癌の浸潤および転移に関連するプロテアーゼを含む、多くのヒトプロテアーゼは、異種のプロテアーゼとして本発明に有用である可能性がある。これらのプロテアーゼは、十分に研究されており、タンパク質分解活性および配列選択性に関する詳細な情報が入手可能である。このようなプロテアーゼの例には、GSGR↓SA(配列番号:55)を認識して切断するウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子(uPA)、基質配列SS(Y/F)Y↓SG(配列番号:56)を好むプロテアーゼ特異的抗原(PSA)、HPFHL↓VIH(配列番号:57)で切断するレニン、およびHPVG↓LLAR(配列番号:58)で切断することができるMMP−2を含む。さらなる例には、カスパーゼ、エラスターゼ、カリクレイン、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)ファミリー、プラスミノーゲン活性化因子ファミリー、および線維芽細胞活性化タンパク質を含む。
組換えヒトレトロウイルスプロテアーゼも、本発明に用いられ得る。ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV−1)(Beckら、2002)、ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV)(Shukerら、Chem. Biol. 10:373(2003))、および重症急性呼吸器症候群(SARS)コロナウイルスのプロテアーゼを含むヒトレトロウイルスプロテアーゼは、抗ウイルス療法の標的として広範囲にわたって研究されてきた。これらのプロテアーゼは、長い認識配列および高い基質選択性を有することが多い。例えば、SQNY↓PIV(配列番号:60)は、HIV−1プロテアーゼの好ましい切断配列として確定され(Beckら、Curr. Drug Targets Infect. Disord. 2(l):37−50(2002)、HTLVプロテアーゼの好ましい切断配列はPVIL↓PIQA(配列番号:61)であると確定されている(Nakaら、Bioorg. Med. Chem. Lett. 16(14):3761−3764(2006)。
コロナウイルスまたはトロウイルスプロテアーゼは、動物ウイルスのファミリーであるコロナウイルス科のメンバーによってコードされ、高い切断特異性を示す。このようなプロテアーゼは、本発明の別の好ましい態様である。SARS3C様プロテアーゼは、AVLQ↓SGF(配列番号:62)で選択的に切断するということが分かっている(Fanら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 329(3):934−940(2005))。
ピコルナウイルスプロテアーゼも、本発明に用いられ得る。例えば、ヒトライノウイルス(HRV)等のこのようなピコルナウイルスプロテアーゼは、抗ウイルス療法の標的として研究されてきた(Binfordら、Antimicrob. Agents Chemother. 49:619(2005))。HRV3Cプロテアーゼは、ALFQ↓GP(配列番号:63)を認識して切断する(Cordingleyら、J. Biol. Chem. 265(16):9062−9065(1990))。
ポティウイルスプロテアーゼは、動物ウイルスのファミリーであるポティウイルス科のメンバーによってコードされ、高い切断特異性を示す、本発明の別の好ましい態様である。例えば、タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼは、非常に高い基質特異性および触媒効率を有しており、過剰発現した組換えタンパク質からペプチドタグを除去するためのツールとして幅広く使用されている(Nunnら、J. Mol. Biol. 350:145(2005))。TEVプロテアーゼは、タンパク質の接合部に存在する、拡張された7つのアミノ酸残基の長いコンセンサス配列E−X−X−Y−X−Q↓S/G(Xは任意の残基である)(配列番号:59)を認識する。当業者は、その配列特異性が別の基質配列を好むように変更されるよう、特定のプロテアーゼを操作することが可能であることを理解するであろう(Tozserら、FEBS J. 272:514 (2005))。
プロテアーゼは、生理学的に生命体にとって必要であるため、遍在性であり、植物、動物、および肉眼で見える生物等、多種多様な源に認められる(Raoら、Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(3):597−635(1998))。これらのプロテアーゼはすべて、本発明のための潜在的な候補である。好ましい態様において、本発明のための融合プロテアーゼ(特に非ヒト由来である)の免疫学的潜在性を低下させるために、PEG化が利用されてもよい。PEG化は、血漿中残留性の改良や非特異的細胞結合の減少等、プロテアーゼ融合タンパク質に付加的な利益を与える可能性がある。
DT融合タンパク質等の融合タンパク質の構築および配列修飾について上述した方法は、特異的にジフテリア毒素向けの技術を除いて、一般にプロテアーゼ融合タンパク質の構築にも適用可能である。天然で認められる多くのプロテアーゼは、チモーゲンとして、すなわち、阻害ペプチドが活性部位に結合してその活性部位をマスクする、または阻害ペプチドの存在が活性部位の構造を変更するために活性部位が非機能的になりかねない、触媒的に不活性な形態として合成されている。チモーゲンは、典型的には、阻害ペプチドの切断および放出によって活性化される。本発明の一態様においては、プロトキシン活性化因子の外因性プロテアーゼは、チモーゲンの形態であり、別の外因性プロテアーゼまたは内因性のプロテアーゼによって活性化され得る。一次配列における阻害ペプチドの位置に依存して、このようなチモーゲンは有利にN末端に位置するか(阻害ペプチドがチモーゲンのN末端に位置する場合)またはC末端に位置する(阻害ペプチドがチモーゲンのC末端に位置する場合)かのいずれである。プロトキシン活性化因子のプロテアーゼ部分が、細胞を標的とする部分に化学的または酵素的結合によって連結している場合は、NまたはC末端以外の位置で起こる細胞を標的とする部分への作用可能な連結の結果として、末端のいずれかまたは両方が遊離している可能性があるため、阻害ペプチドはN末端またはC末端のいずれかに位置している場合がある。
選択したプロテアーゼに、設計された毒素活性化の他に意図しない生物学的作用を引き起こす能力がある場合、免疫毒素活性化のためのヒトプロテアーゼの適用が合併症を起こす可能性がある。例えば、グランザイムやカスパーゼを含む多くのプロテアーゼは、アポトーシスカスケードへの関与を通して細胞死を促進することが可能である。グランザイムBおよび細胞表面標的ドメインから成る免疫毒素は、特定の疾病細胞集団に対する細胞毒性薬剤として開発されてきた(Liuら、Neoplasia 8:125−135(2006), Dalkenら、Cell Death Differ. 13:576−585, Zhaoら、J. Biol. Chem. 279:21343−21348(2004), US07101977)。本発明に即してこのような潜在的副作用を排除するためには、プロテアーゼ融合タンパク質のために意図する標的として、結合の際に内部移行しない細胞表面標的を用いることが好ましい。このような場合において、プロトキシンの活性化は細胞表面上で達成されてもよいが、単独で作用するプロトキシン活性化因子によって有毒作用は生成されない。
本発明のプロテアーゼ融合を設計および活用するにあたり、プロテイナーゼ阻害物質が、プロテアーゼ融合タンパク質のタンパク質分解活性を妨害する可能性があることを留意しなければならない。例えば、GrBは、主に細胞毒性リンパ球中に存在するセルピンスーパーファミリーのメンバーであり、ヒト血漿中に検出されてきた、細胞内プロテイナーゼ阻害物質9(PI−9)によって特異的に阻害される(Sunら、J. Biol. Chem. 271:27802(1996))。GrBは、ヒト血漿中に存在するα1−プロテアーゼ阻害物質(α1PI)によっても阻害され得る(Poeら、J. Biol. Chem. 266:98(1991))。GrMは、α1−抗キモトリプシン(ACT)およびα1PIによって阻害され(Mahrusら、J. Biol. Chem. 279:54275(2004))、GrAはプロテアーゼ阻害物質である抗トロンビンIII(ATIII)およびα2−マクログロブリン(α2M)によりインビトロで阻害される(Spaeny−Dekkingら、Blood 95:1465 (2000))。これらのプロテイナーゼ阻害物質は、ヒト血漿中にも存在する(TravisおよびSalvesen, Annu. Rev. Biochem. 52:655(1983))。
大きい融合タンパク質の過剰発現のための方法は、当該技術分野において周知であり、本発明のプロテアーゼ融合タンパク質の過剰発現に適用することができる。本発明の融合タンパク質の構築において用いられてもよい発現系の例は、大腸菌、昆虫細胞におけるバキュロウイルス、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)およびピキアパストリス(Pichia pastoris)における酵母系、哺乳類細胞、およびワクシニアにおける一過性発現である。上述したDT融合タンパク質の発現のための方法は、ジフテリア毒素に単独で適用可能なものを除いて、概してプロテアーゼ融合タンパク質に適用することができる。
本発明の一態様は、PEG化融合タンパク質の利用である。好ましい態様は、部位特異的にPEG化された融合タンパク質である。PEG化タンパク質は、PEG付着の部位、数、サイズ、および種類にしたがって幅広い生物活性を示すことが、当該技術分野において既知である(HarrisおよびChess Nat. Rev. Durg Discov. 2(3):214−221(2003))。本発明における融合タンパク質の好ましい組成物は、所望のインビトロまたは体内生物活性に寄与する、または抗体の形成、細胞もしくは生物表面への非特異的粘着性、あるいは分解もしくは欠失等、融合タンパク質の活性を低下させる天然の作用の影響を受けにくい、PEG化タンパク質である。
現在入手可能なPEG化タンパク質のほとんどは、タンパク質あたり1つまたは複数のPEGを有する一方で、PEG部分に2つまたはそれ以上のタンパク質が付着したタンパク質のコンジュゲートを構築することも可能である。ヘテロ官能性のPEGが市販されており、2つのタンパク質、またはタンパク質の任意の2つの部分を共有結合的に連結するために用い得る。
毒素と活性因子の両方が、それぞれの機能にとって重要な領域またはドメインを有するため、これらのドメイン上に大きなPEG置換基が付着することは、それらの機能にとって有害である可能性がある。したがって、本発明の好ましい態様は、PEG置換基が活性化因子(プロトキシン活性化因子またはプロアクチベーターのいずれか)の触媒部位および細胞を標的とする部分の細胞表面標的認識表面から遠隔に位置するPEG化融合タンパク質であり、プロトキシンの場合は、これらのドメインは、血漿膜を介した転位に関与することおよび/または細胞質中に移入されてPEG化がこのような転位を防ぐ可能性があることが予測されるため、プロトキシンの転位および触媒ドメイン内にはPEG置換基は位置しない。
本発明は、毒素融合タンパク質を投与する前の、合成プロテアーゼ融合タンパク質の除去を促進するための洗浄剤の使用も任意選択的に含む。ADEPT療法における洗浄剤の使用は、当該技術分野において周知であり(例えば、SyrigosおよびEpenetos, AntiCancer Res. 19:605(1999)を参照)、本発明において利用することができる。
本発明によると、プロトキシン融合タンパク質中の各部分(例えば、1つまたは複数の細胞を標的とする部分、1つまたは複数の選択的に修飾可能な活性ドメイン、1つまたは複数の天然で活性化可能なドメイン、および1つまたは複数の毒素ドメイン)またはプロトキシン活性化因子融合体中の各部分(例えば、1つまたは複数の細胞を標的とする部分、1つまたは複数の修飾ドメイン、1つまたは複数の天然で活性化可能なドメイン、および1つまたは複数の毒素ドメイン)は、独立して機能してもよいが、各々は作用可能に連結されている。各融合タンパク質において、2つの機能的部分の間の作用可能な連結は、共有結合的または非共有結合的であってもよい、分子の橋としての役割を果たす。各融合タンパク質の部分は、互いに任意の方向に、すなわち、1つのC末端から他方のN末端へ、または1つのC末端から他方のC末端へ、または1つのN末端から他方のN末端へ、または内側残基から末端残基へ、または内側残基から末端残基へ、作用可能に連結していてもよい。任意選択的なリンカーは、空間的独立を可能にする分離体として、または互いに追加の機能を提供するための手段として、またはそれらの組み合わせとして、2つの部分を物理的に結びつける糊の役割を果たすことができる。例えば、互いの活性を妨害することを防ぐために、作用可能に連結した酵素から細胞を標的とする部分を分離することが望ましい場合がある。この場合、リンカーは作用可能に連結した部分間における立体的競合からの解消を提供する。リンカーは、例えば、2つの部分間の接続に対する不安定性、酵素切断部位(例えば、プロテアーゼのための切断部位またはエステラーゼのための加水分解部位)、安定化配列、分子タグ、検出可能な標識、またはそれらの様々な組み合わせを提供する可能性もある。
A.組換えタンパク質精製のための一般的方策
Current Protocols in Protein Science (Coliganら、eds. 2006)に記載される方策等、当業者に既知である組換えタンパク質を単離および精製するための、確立された方策が数多く存在する。所望の組換えタンパク質と混入物との物理化学的特性の違いを利用するイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用(逆相)クロマトグラフィー、およびサイズ排除(ゲル濾過)クロマトグラフィー等、従来のクロマトグラフィーが広く用いられている。HPLCも用いることができる。
多くの組換え融合タンパク質は、大腸菌中の封入体として、すなわち、主に非天然状態にある所望の組換えタンパク質から構成される密度の高い集合体として、発現される。事実、最も多く報告されている大腸菌に発現するDT−ScFv融合タンパク質は、不溶性の形態で得られる。通常、封入体は次の理由から形成する。(a)標的タンパク質が、生成された濃度では不溶性である、(b)標的タンパク質が、細菌環境において正しくフォールディングする能力がない、または(c)標的タンパク質が、還元する細胞内環境において正しいジスルフィド結合を形成することができない。
組換えタンパク質は、可溶性形態で発現および精製することもできる。封入体で発現されない組換えタンパク質は、細胞内で可溶性であるか、または排出ベクターを用いた場合に細胞外で可溶性である(あるいは大腸菌が宿主である場合には、おそらく周辺質である)。可溶性タンパク質は、上記で説明した従来の方法を用いて精製することができる。
細胞増殖および細胞死を測定するアッセイ法等、当該技術分野において周知である様々なアッセイ法が、本発明のタンパク質製剤の有効性を決定するために有用である。例えば、細胞のサイトゾルに導入されたジフテリア毒素触媒フラグメント(DTA)の1つの分子が、細胞が増殖してコロニーを形成するのを防ぐために十分であることが分かっている(Yamaizumiら、Cell 15:245(1978))。以下は、本発明における試薬の細胞毒性を分析するために、単独でまたは組み合わせて用いることができる多くのアッセイ法の例である。
多くの毒素(例えばDT)が、タンパク質合成の阻害を介してそれらの細胞毒性を発揮するため、毒素に曝露された後で細胞によって合成されるタンパク質を直接的に定量化するアッセイ法が特に有用である。このアッセイ法では、細胞が毒素に曝露された後で、[3H]−Leu、[35S]−Metもしくは[35S]−Met−Cys等の放射性アミノ酸で一時的に培養される。どのくらいのタンパク質が合成されたかの直接測定の場合は、通常、細胞および沈殿タンパク質を10%トリクロロ酢酸(TCA)で溶解させて、タンパク質に取り入れられる放射性アミノ酸の量が決定される。このようなアッセイ法を用いて、DTの細胞への進入がタンパク質合成の即時的ブロックには関係していないものの、単一のDT触媒フラグメント分子がサイトゾル中で長期間作用(4〜24時間)することは、低い毒素濃度で完全にタンパク質合成の阻害するためには十分であることが、実証された(Falnesら、J. Biol. Chem. 275:4363(2000))。
細胞の増殖率は、[3H]−チミジンの細胞核酸への取り込みを決定することによって測定することができる。このアッセイ法は、毒素(例えば、DTに基づく免疫毒素)の細胞毒性を分析するために用いられてもよい。この方法を用いて、DT−IL3免疫毒素は、骨髄性白血病の細胞株を有するIL3受容体の成長の阻害において活性であることが分かった(Frankelら、Leukemia. 14:576(2000))。本発明の毒素融合物およびプロテアーゼ融合タンパク質は、このようなアッセイ法を用いて別個にまたは組み合わせて、試験することができる。
コロニー形成は、一般的に採用される他の方法よりも、はるかに高感度な測定法を提供することができる。この感度向上の理由は、細胞が増殖状態にある間にコロニー形成が評価されるため、毒性作用をより受けやすいという事実があげられる場合がある。コロニー形成アッセイ法の感度、そして用量および時間に依存する効果が検出可能であることが、調査されるべき急性および慢性曝露期間を可能にするとともに、回復研究を可能にする。例えば、ヒト骨髄腫細胞株に対する組換えDT−IL6融合タンパク質の細胞毒性を、U266骨髄腫細胞によるメチルセルロースコロニー形成を用いて調査した。正常な骨髄とU266細胞DT−IL−6の両方を含有する培養液中で、U266骨髄腫コロニーの成長を効率的に阻害したが、正常な骨髄赤血球、顆粒球および混合された赤血球/顆粒球コロニーの成長には、ほとんど影響を及ぼさなかった(Chadwickら、Haematol. 85:25(1993))。
特定の融合タンパク質または融合タンパク質の連結の細胞毒性は、MTT細胞毒性アッセイ法を用いて評価することができる。ヒトGMCSFに高い親和性を持つ受容体を有するヒト白血病細胞株に対するDT−GMCSF融合タンパク質の特異的細胞毒性を、このようなMTTアッセイ法、コロニー形成アッセイ法、およびタンパク質阻害アッセイ法を用いて実証した(Bendelら、Leuk. Lymphoma. 25:257(1997))。典型的なMTTアッセイ法では、黄色テトラゾリウム塩(MTT)は、代謝的に活性のある細胞内で還元されて不溶性紫色ホルマザン結晶を形成し、界面活性剤を加えることにより可溶化され、UV−VIS分光法を用いて定量化される。細胞は、80〜100%コンフルエンスまで成長した後で無血清緩衝液で洗浄され、細胞毒性薬で処理される。MTT試薬で細胞を約2〜4時間培養した後、界面活性剤溶液を加えて細胞を溶解し、着色された結晶を可溶化する。570nmの波長でサンプルが分析され、生成された色の量は生存細胞数に直接的に比例する。
A.インビトロでのタンパク質合成阻害アッセイ法
真核細胞では、サイトゾルへのエンドサイトーシス後に、その触媒ドメインがADPリボシル化を触媒することによって、伸長因子2(EF−2)を不活性化することができるため、DTがタンパク質の合成を阻害する。真核生物のインビトロ翻訳系(例えば、ウサギ網状赤血球溶血液と小麦胚芽抽出物を用いた)は、組換えDT融合タンパク質の触媒機能を調べるのに潜在的に適している。例えば、TNTとカップリングさせた小麦胚芽抽出物(NAD+、アミノ酸、[35S]−Met、DNAテンプレート、およびRNAポリメラーゼを添加した)が、組換えによって発現させたDTの触媒フラグメントによるタンパク質合成の阻害を試験するために用いられる(EpinatおよびGilmore, Biochim. Biophys. Acta. 1472:34(1999))。35S標識した翻訳されたタンパク質のレベルが、DT毒性の程度の目安となる。
DTは、NADのADP−リボース部分が、翻訳後に修飾されたジフタミドと称されるEF−2のHis715へと伝達されるのを触媒することにより、タンパク質合成を阻害する。よって、DT融合の機能も、その触媒活性を放射標識されたADP−リボースが組換えEF−2に伝達される速度と関係付けることにより、インビトロで直接的にアッセイすることができる。(ParikhおよびSchramm, Biochemistry 43:1204(2004))。このアッセイ法は、ADPリボシルトランスフェラーゼ活性の阻害を試験するために適用されてきており、DTに基づく免疫毒素のためのアッセイ法の1つとして多く用いられる(Frankelら、Leukemia. 14:576(2000))。ビオチン化NADまたはエテノ−NAD等の非放射標識化NADも、基質として用いられ得る(Zhang. Method Enzymol. 280:255−265(1997))。
組換えプロテアーゼ融合タンパク質の機能活性は、プロテアーゼの認識配列を含有するペプチドまたはタンパク質基質のいずれかを用いて、インビトロでアッセイされてもよい。様々なプロトコルが当該技術分野において周知である。
本発明の融合タンパク質は、典型的には、くも膜下腔内、皮下、粘膜下、または腔内注射によって、また静脈内もしくは動脈内注射によって、任意の投与経路を用いた注射手段によって対象に投与される。よって、融合タンパク質は、例えば、患者の血流内への融合タンパク質の皮下注射により全身に注射されてもよく、または代替として、融合タンパク質は特異的部位で直接注射されてもよい。
A.融合タンパク質および細胞株の構築
ヒトグランザイムB抗CD19 ScFv (GrB−抗CD19)融合遺伝子の構築
成熟したヒトグランザイムB(アミノ酸21〜247)に対応する配列を、OriGene Inc.から調達した全長グランザイムB cDNAクローンから増殖して、3者ライゲーション(three−piece ligation)を用いて、合成抗CD19 ScFv DNAフラグメントとともにpEAK15ベクターに挿入した(pEAK 15 GrB−抗CD19L)。融合遺伝子のプロモーターはCMV/ニワトリβ−アクチンハイブリッドポリマーであった。融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、ガウシアプリンケプス(Gaussia princeps)のルシフェラーゼに由来するシグナルペプチド、合成N結合型グリコシル化部位、FLAGタグおよび成熟したヒトグランザイムB配列が後に続くエンテロキナーゼ切断配列、可動性リンカー(Gly−Gly−Gly−Ser)3、抗CD19 ScFv、およびC末端6Hisタグの形成を司る(融合タンパク質の概略的な描写については図1Aを参照。)。すべての融合タンパク質をコードするDNA配列はDNA配列決定によって確かなものとなる。
ピキアパストリスおよびヒトの細胞株における発現に最適化したコドンを用いて、Retrogen Co.(サンディエゴ)でDT−抗CD5融合遺伝子を人工的に生成した。フリン認識部位をコードする配列(190 RVRRSVG196(配列番号:66))を、コンセンサスなグランザイムB認識配列(190 IEPDSG195(配列番号:13))で置き換えた。潜在的な2つのN−グリコシル化部位を、記載されるように突然変異させ(Thompsonら、Protein Eng. 14(12):1035−41(2001))、6Hisタグ配列を検出および精製のために融合遺伝子のC末端に加えた。α因子ペプチドシグナルおよびKex2切断部位を維持しつつ、融合遺伝子をpPIC9ベクター(Invitrogen)のXholおよびNotl部位にクローニングした。
Jurkat SVT35細胞は、ウシ胎仔血清10%(Hyclone)を添加したIMDM(Invitrogen)中に維持した。JVM−3(DSMZ、ドイツ)は、ウシ胎仔血清10%(Hyclone)、2mMのL−グルタミンを添加したRPMI1640(Invitrogen)中に維持した。
細胞表面上でのCD5およびCD19の存在を、間接蛍光免疫染色を用いて分析した。最初に、100万細胞あたり0.5μgの濃度で、細胞をマウス抗ヒトCD5またはマウス抗ヒトCD19(eBioscience)でインキュベートした。RPEA(Southern Biotechnology)とコンジュゲートされたヤギF(ab’)2抗マウスIgGlを、100万細胞あたり0.25μgの濃度で二次抗体として用いた。染色された細胞をフローサイトメトリー(FAXCaliber)により分析した。
293ETN細胞を10cmプレートあたり5 106〜6 106細胞で播種し、12μgのpEAK15 GrB−抗CDI9Lおよび25μlのTransFectin(Bio−Rad)を用いて、製造業者のプロトコルにしたがってトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をOpti−MEM(Invitrogen)中で3日間培養して融合タンパク質を蓄積させた。上清を収集して事前に平衡化しておいたNi−NTA樹脂(Qiagen)を用いてインキュベートし、50mMのHEPES(pH7.5)、150mMのNaCl、250mMのイミダゾールおよび5%グリセロールを含有する緩衝液で融合タンパク質を溶出した。精製したGrB−抗CD19融合タンパク質をエンテロキナーゼ(New England Biolabs)を用いて室温で一晩インキュベートして、グランザイムBのタンパク質分解活性を活性化させた。エンテロキナーゼから放出されたエンテロキナーゼおよびN末端ペプチドを除去するために、反応混合物をNi−NTA樹脂を用いて親和性精製した。別の調製の形態では、エンテロキナーゼから放出されたエンテロキナーゼおよびN末端ペプチドをゲル濾過精製(superdex 200、GE Healthcare)で除去した。精製したペプチドを蛍光発生ペプチド基質(Ac−IEPD−AMC、Sigma Aldrich)でインキュベートすることにより、グランザイムB−抗CD19 ScFvのタンパク質分解活性を測定した。蛍光産物の蓄積は、励起および発光波長380および460nmで、それぞれ15分間30秒ごとにモニタリングした。
電気穿孔により、ピキアパストリスKM71細胞(Invitrogen)を発現プラスミドで形質転換させた。製造業者のプロトコルにしたがって、陽性クローンを選択した。大規模精製には、単一コロニーを緩衝グリセロール最小培地(BMG)10ml(pH6.0)中で、28℃で一晩培養した。一晩培養液を1LのBMG(pH6.0)に移し、OD600が6.0に到達するまで28℃で培養した。タンパク質発現を誘発するために、培養液を遠心沈殿させ、1%カザミノ酸(BMMYC)を含有する緩衝(pH6.6)メタノール複合培地100mlで再懸濁し、15℃で48時間培養した。上清を収集し、pH7.6になるまでNaOH5%で調節した。澄んだ上清をGrB−抗CD19融合タンパク質精製のために上述の通り親和性精製した。
αCD5−PEA、αCD5−VCEおよびそれらの変異体に対応するDNA配列を、pET28ベクター(Novagen)のNcolおよびNotlにクローニングした。形質転換させた細菌細胞(BL21)を、LB培地を用いて37℃で培養した。不溶性融合タンパク質の発現を誘発するために、タンパク質発現を1mMのIPTGを用いて、37℃で4時間OD600=0.8〜1.0で誘発した。採取した細胞ペレット40mlを、B−PER II(Pierce)5ml中で再懸濁させ、製造業者の指示にしたがってB−PER IIで封入体を精製した。精製した封入体を20mMのTris8.0、150mMのNaCl、6MのGuClおよび1mMのβ−MEで溶解し、Ni−NTA樹脂でさらに精製した。最終精製した融合タンパク質を、以前に記載されたプロトコル(Umetsu M.ら、J. Biol. Chem. 278:8979−8987(2003))を用いて、濃度0.2mg/mlでリフォールディングした。可溶性ScFv−VCE融合タンパク質の発現を誘発するために、合成遺伝子をpET22bベクターのNcolおよびNotlにクローニングした。タンパク質の発現を0.2mMのIPTGを用いて17℃で一晩OD600=0.3〜0.5で誘発した。細菌の周辺質フラクションを、記載される通りに収集し(Malikら、Prot. Exp. Pur. Advanced electronic publication(2007))、融合タンパク質をNi−NTA樹脂で精製した。
精製されたGrB−抗CD19融合タンパク質の酵素活性を評価するために、蛍光発生ペプチド基質(Ac−IEPD−AMC)(配列番号:9)を使用して、融合タンパク質の活性をSigma社より購入した精製マウスグランザイムBの活性と比較した。精製されたGrB−抗CD19は、市販のマウスグランザイムB製剤の活性と類似する活性を示し、ヒトグランザイムBのC末端にScFv部分を加えることがタンパク質分解活性を低下させないこと、またエンテロキナーゼ処理が、成熟したグランザイムBの最初のイソロイシンよりも前にある末端配列を効率的に除去して、融合タンパク質の酵素活性の発現を可能にすることを示唆した。
触媒ポケットを取り囲む残基の突然変異変更による、プロテアーゼのタンパク質分解特異性の変換は、当技術分野において周知である。特に、グランザイムBの部位特異的突然変異誘発に関与する以前の研究、および異なる種に由来するグランザイムBタンパク質の研究は、酵素の基質特異性を決定する残基を同定し、変更された切断特異性を有する突然変異形態を提供してきた(Harrisら、J. Biol. Chem. 273:27364−27373(1998)、Rugglesら、J. Biol. Chem. 279:30751−30759(2004); Casciola−Rosenら、J biol. Chem. 282:4545−4552(2007))。同様に、マウスグランザイムBのアイソフォームは、ヒトBid、マウスBidおよびヒトカスパーゼ3に対して、ヒトグランザイムBよりもはるかに低い切断活性を示すことが明らかになっている。結果として、マウスグランザイムBは、ヒト細胞におけるアポトーシスを誘導しにくいと考えられる(Casciola−Rosenら、J Biol. Chem. 282:4545−4552(2007))。Harrisらの研究におけるグランザイムBの突然変異形態には、変更された切断配列特異性のためにアポトーシス経路を開始する能力が低下しているものがあった。本発明者らは、このようなグランザイムBの突然変異形態の1つである、Asn218がThr(N218T)と置き換えられたものから融合タンパク質を生成し、N218TグランザイムBが野生型グランザイムBにとって好ましい基質とは認められない配列であるIAPD(配列番号:48)に対して切断部位選択性を示すことを示した。さらに、IAPD(配列番号:48)配列に対するN218Tの切断活性が、IEDP(配列番号:9)に対する野生型グランザイムBの切断活性よりも高いことが分かった。よって、本発明の一つの態様においては、グランザイムB融合タンパク質は、最適な切断配列に対する完全な(または向上した)タンパク質分解活性を所有する一方で、標的細胞のアポトーシスを誘導する能力を低下/抑止するために修飾され得る。
CD5およびCD19の両方を発現する細胞株および対応する親細胞株で、組み合わせ免疫毒素の細胞毒性を試験した。細胞は、ロイシン不含RPMI培地90μl中にウェルあたり5 104細胞で96ウェルプレートに配置し、様々な濃度のGrB−抗CD19 ScFvおよび/またはDT−抗CD5 ScFv融合タンパク質を含有するロイシン不含RPMI培地10μlと、37℃で20時間、5%CO2中でインキュベートした。0.33μCiの[3H]−ロイシンを37℃で1時間加えることにより、タンパク質合成の阻害を測定した。細胞ハーベスター(harvester)(InoTek社製96ウェル細胞ハーベスター)を用いてガラス繊維濾紙上に濾過により細胞を採取し、[3H]−ロイシン取り込みの速度をシンチレーション測定により決定した。タンパク質保存緩衝液で処理した対照ウェルに対して、細胞生存率を標準化した。[3H]−ロイシンを加える前に1mMのシクロヘキシミドで細胞を30分処理することにより、[3H]取り込みのバックグラウンドを得た。示した各ポイントは、2つ組ウェルの平均値を表す。
プロテアーゼ融合タンパク質がインビトロで機能的であることを確立した本発明者らは、次に、一対の融合タンパク質が、CD5およびCD19の両方を発現する細胞を特異的に標的化することが可能であるかどうかを検討した。この目的のために、本発明者らは、ヒトRaji B細胞株由来でCD5を発現する、受容体細胞のB細胞株であるCD5+Rajiを生成した。抗CD5および抗CD19抗体を用いたサイトメトリー解析により、CD5+Raji細胞株からCD5およびCD19の両方が発現されたのに対し(図2)、親Raji細胞はCD19のみを発現することが示唆された。CD5+Raji細胞株からのCD5の発現は、長時間の培養に渡ってCD5レベルにおける有意な変化は認められず、安定しているように見られた。
コンビナトリアルターゲティングの方策の範囲を広げるために、本発明者らは、異なる細菌毒素であるシュードモナス外毒素A(PEA)のこのような状況における使用について調べた。PEAは、DTに類似した様式で標的細胞を中毒化する。受容体媒介のエンドサイトーシスによる内部移行時には、PEAは標的細胞でフリンによって切断される。ADPリボシルトランスフェラーゼドメインが、PEAの転位ドメインの補助によりサイトゾルに転位され、ADPリボシル化伸長因子2により標的細胞のタンパク質翻訳機構を障害する。本発明者らは、出版されている方策に一部基づいて、抗CD5−PEA融合タンパク質を設計し(Di Paolo C.ら、Clin. Cancer Res. 9:2837−48(2003))、さらには、フリン切断部位(RQPR↓SW)をグランザイムB切断配列(IEPD↓SG)(図7A)で置き換えた。Umetsu M.らによって記載されたリフォールディングプロトコルを用いて細菌性封入体由来の凝集融合タンパク質をリフォールディングすることによって、抗CD5−PEA融合タンパク質を調製した(J. Biol. Chem. 278:8979−8987(2003))。Coomassieブルー染色を用いて、SDS−PAGEによりリフォールディングされた抗CD5−PEAを判断したところ、精製した抗CD5−PEA融合タンパク質は高度に純粋であった(図7B)。マウスグランザイムBによるタンパク質分解的切断の影響を受けやすく、予想された生成物を生じた(図7C)。
抗CD5−PEAの研究を行う内に、本発明者らは、コレラ菌の環境分離株(TP株)に見られる推定上の毒素(GenBankアクセッション番号AY876053)を同定した(Purdy A.ら、J. of Bacteriology 187:2992−3001(2005))。この推定コレラ菌外毒素(VCE)は、PEA(同一性33%および陽性49%)に中程度のタンパク質配列相同性を共有するのみであるが、活性部位残基(PE中のH440、Y481、E553)、ドメインII内のフリン切断部位、およびC末端のER保持シグナルを含む、PEAの機能に欠かせない残基はVCE中に保存される(図9)。さらに、分子シミュレーションツールを用いて、VCE触媒ドメイン配列をPEA触媒ドメインの構造にスレッディングすることに成功し、VCEはPEAの構造と類似する構造内にフォールディングするため、類似する酵素活性を有する可能性があるという考えと一致した(Yates S.P., TIBS 31:123−133(2006))。
天然のペプチドは、それらの同族の受容体を高い選択性および親和性で結合することが明らかになっている。このような例の1つは、uPAの受容体であるuPARへの結合である。uPARへの高親和性結合(Kd≒0.5nM)の原因であるu−PAの領域は、N末端成長因子様ドメイン(N−GFD)と称される最初の46アミノ酸内に、完全に局在化されることが分かっている(Appella E.,ら、J. Biol. Chem. 262:4437(1987))。N−GFDのような天然のタンパク質の配列が、コンビナトリアルターゲティング方策の標的原理としての役目を果たすのに適合しているかどうかを調べるために、抗CD5−VCE融合タンパク質のScFvドメインをN−GFDで置き換えてN−GFD−VCEを生成し、GrB−抗CD19融合タンパク質と組み合わせてuPAR+細胞の選択的死滅における有効性を試験した。Jurkat細胞が適度なレベルのuPARを発現すること、そしてuPAR+細胞を標的にするDTAT、ジフテリア毒素/ウロキナーゼ融合タンパク質に対して感受性を有することが明らかになっているため、CD19+Jurkat細胞を細胞毒性アッセイに用いることを選択した(Ramage J.G.ら、Leukemia Res. 27:79−84(2003))。天然のフリン切断部位を有するN−GFD−VCEはCD19+Jurkat細胞に毒性を示すが、u−PAR陰性のRaji細胞には毒性を示さないことが明らかになり、細胞標的化選択性は排他的にN−GFD−VCEのN−GFDドメインを通して達成されることを示唆するものであった。グランザイムB部位を有する融合タンパク質は、単独では高い濃度で限られた毒性のみを示し、N−GFD−VCE自体は標的細胞に毒性を示さない濃度で、GrB−抗CD19の存在下においてCD19+Jurkat細胞株を死滅させることができた(図12)。これらの結果は、天然のリガンドが、コンビナトリアルターゲティングのための標的化機構としての役割を果たすことができることを実証するものである。
コンビナトリアルターゲティング剤が、B細胞−慢性リンパ性白血病細胞を特異的に死滅させることができるかどうかを試験するために、B−CLL患者由来の精製された末梢血単核球(PBMNC)を用いて細胞毒性アッセイを行った。FACS分析は、約30%のPBMNCがCD5+B細胞であることを示唆した(図13A)。ターゲティング剤のそれぞれの成分はPBMNCに毒性を示さないことが分かった(図13Bおよび13C)。さらに、コンビナトリアルターゲティング剤が、報告された細胞株(CD5+Raji)すべてのタンパク質合成活性を停止した濃度で、PBMNCのタンパク質合成活性全体の約30%が停止された。重要なのは、DT−抗CD5の濃度を増加しても、それ以上はタンパク質合成の阻害が観察されなかったことであり、コンビナトリアルターゲティング剤は、標的細胞集団(すなわち、CD5+B細胞)のタンパク質合成活性のみを停止させる可能性があるという見解と一致した。総合すると、本発明者らのデータは、細胞の異種混合物からの特異的な細胞集団を排除するために、他の細胞種にごく僅かな毒性を有するコンビナトリアルターゲティング剤が採用され得るということを示すものである。
タグ付き、修飾したアエロリジンの大葉、タグ付き抗CD5 ScFv、およびタグ付き抗CD19 ScFvの遺伝子構築
アエロモナスハイドロフィラのゲノムDNA(ATCC:7965D)から、Faststart high fidelity PCRミックス(Roche)を用いてアエロリジンを増幅した。NcoIおよびXhoIでPCR産物を消化し、pET22b(Novagen)にクローン化した。続いてクローンの3’端を増幅によって修正し、NcoIおよびSalIで消化して、NcoIおよびXhoI部位を用いてpET22bに再度クローン化した。多くの異なるアエロリジンの変異体が存在するが、本発明者らが得た配列はアエロリジンクローンaer4(GenBank:X65043)に最も密接に類似していた。本発明者らのクローンとaer4との間の最も有意な類似性は、成熟した孔形成毒素とプロペプチドを分離する活性化ペプチド配列中にある。これは、フリン(DSKVRRAR↓SVDG)によって活性化されると考えられる元々のaerA遺伝子から同定された配列とは大きく異なる。本発明者らのクローンの活性化部分を、天然活性化部分(ASHSSRARNLS)から、ヒトグランザイムB(ESKGIEPD↓SGVEG)およびタバコエッチウイルスプロテアーゼTEV(ESKENLYFQ↓GVEG)によって認識され得る配列に突然変異させた。本発明者らは、Phusionポリメラーゼに基づくPCR突然変異誘発法(New England Biolabs)を用いて、部位特異的突然変異誘発を行った。部位特異的突然変異誘発を用いて天然タンパク質の小葉を欠失させ、ソルターゼの基質配列(GKGGSNSAAS)と置き換えるために、これらの変異体をさらに修飾した。得られたクローンは、それぞれGK−アエロリジンGrBおよびGK−アエロリジンTEVと称する。
GK−アエロリジンGrB(図16)およびGK−アエロリジンTEVを、0.2mMのIPTGで5時間誘導した後に、BL21 star細胞において25℃で発現させた。細胞をペレット化して溶解緩衝液(20mMトリス(pH8)、150mM NaCl、0.3M NH4Cl、0.1% Triton X−100、0.2mg/mLリゾチーム)中に再懸濁させ、4℃で1時間インキュベートした。その後、超音波処理を施して細菌細胞を溶解し、混合物を遠心沈殿させて上清をNi−NTAアガロース(Qiagen)でインキュベートした。HS緩衝液(20mMトリス(pH8)、150mM NaCl、1M NH4Cl、0.1% Triton X−100)および20mMイミダゾール洗浄緩衝液(20mMトリス(pH8)、150mM NaCl、20mMイミダゾール)でカラムを洗浄し、250mMのイミダゾール溶出緩衝液(20mMトリス(pH8)、150mM NaCl、250mMイミダゾール)を用いて溶出した。タンパク質を透析20mMトリス(pH7.5)および150mM NaClに対して透析した。同様のプロトコルを用いてソルターゼAを精製した。
黄色ブドウ球菌のソルターゼAは、大腸菌から可溶性形態で発現させる(Zong Y.ら、J. Biol. Chem. 279:31383(2004))。aminolink plus couplingキット(Pierce)を用いて、精製されたソルターゼAを10mg/mLでアガロース上に固定化する。GK−アエロリジンタンパク質およびリフォールディングしたscFvをそれぞれ1:2の比率で混合し、0.1M トリス(pH9)5mM CaCl2、0.01% Tween−20の存在下においてソルターゼA−アガロースとインキュベートし、室温で一晩インキュベートした。コンジュゲーション混合物を0.2ミクロンのスピンフィルターを通して濾過し、混合物をQ−アニオン交換カラム(GE Healthcare)上で精製してコンジュゲート型アエロリジンを余剰ScFvから分離する(図17C)。細胞に基づくアッセイのための調製において、タンパク質を濃縮してUV光吸収により定量化する。
細胞生存率を決定するために、PromegaのCell Titer 96 Aqueous Non−radioactive Cell Proliferation Assayを使用した。10%仔ウシ血清(Hyclone、Fe2+で強化済)を含む90μl RPMI中の96ウェルプレートに、ウェルあたり5 104細胞で細胞を設置した。様々な濃度のGrB−抗CD19 ScFvおよび/または抗CD5−アエロリジンGrB融合タンパク質10μlを細胞に加え、CO25%のインキュベーター内において37℃で48時間インキュベートした。MTS試薬(25μl、Promega、G358A)を各ウェルに加え、4時間に渡り37℃でインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、SPECTRAmax ELISAプレートリーダー(Molecular Devices)を用いてA490を記録した。タンパク質保存緩衝液または1mMシクロヘキシミドで処理した対照ウェルに対して、細胞生存率を標準化した。報告されたデータは、2つ組ウェルからの平均的な読取り値を表す。
GrB切断部位およびCD5結合部分を含有する操作されたアエロリジン融合タンパク質を、CD5+/CD19+細胞のコンビナトリアルターゲティングという状況において毒素の原理として用いることができるかどうかを調べるために、抗CD5−アエロリジンGrBのCD5+RajiおよびCD19+Jurkat細胞に対する細胞毒性を、2nMのGrB−抗CDI9の存在下または不在下においてアッセイした。図18に示すように、GrB−抗CD19が存在する時のみ強力な細胞毒性が観察され、CD5+Raji細胞およびCD19+Jurkat細胞のEC50は、それぞれおよそ0.3〜0.4nMおよび6.5nMであった。GrB−抗CD19を追加しなければ、事実上毒性は観察されなかった。アエロリジンに基づくプロトキシンによるこのような程度の副作用は、細胞外タンパク質分解活性化とそれに続く細胞表面上での孔形成に関与する中毒機構に起因するものである可能性がある(Howard and Buckley, J. Bateriol. 163:336−340(1985))。それに対して、DT、PE、またはVCEに基づくプロトキシンは、転位プロセス中に標的細胞内で活性化され(Ogataら、J. Biol. Chem. 267:25396−25401(1992))、その間に細胞内における内因性のタンパク質分解活性が、標的化された活性因子によって特異的に活性化された場合よりはるかに低い程度であるが、異種のプロテアーゼ切断部位を切断して活性化する可能性がある。
細胞を標的化するために、CD5が抗CD5−アエロリジンGrBと結合することが必要であることは、抗CD5 ScFvドメインを持たないGK−アエロリジンGrBが、試験条件下においてCD5+Raji細胞に対して毒性を示さないことにより確認された。抗CD5 ScFvと細胞表面CD5との間の特異的相互作用のための必要条件は、GrB−抗CD19と組み合わせた抗CD5−アエロリジンGrBが、CD5表面マーカーを持たないRaji細胞に毒性を示さないことが観察されたことで、さらに証明された(図18B)。抗CD5−scFV部分が、抗CD5−アエロリジンGrB融合タンパク質をCD5+Raji細胞に誘導することができるということは驚くべきことではないが、抗CD5−scFV部分が単純にアエロリジンの小葉を置き換えて、アエロリジンに不可欠な箇所として上手く機能することができるかは明白ではない。野生型アエロリジンの小葉は、GPIアンカータンパク質上のNグリカンによって認識されること、またそれに特異的に結合することが知られており、NグリカンおよびGPIグリカンコアの両方が結合に寄与する部位を認識することを示唆している(MacKenzieら、J. Biol. Chem. 274:22604−22609(1999))。反対に、アエロリジンの大葉内にあるドメイン2は、GPIコアの結合の一因であると考えられる。抗CD5−アエロリジンGrB/GrB−抗CD19によって達成されるCD5+/CD19+細胞に対する特異的な細胞毒性は、Nグリカンと対応するGPIグリカンコアとの結合に対する小葉の寄与は、認識するバインダーと表面抗原との間の他の相互作用によって置き換えられてもよく、表面マーカーはGPIアンカータンパク質でなくてもよいということを実証した。
JVM−3は、CD5−でありながら、B−CLL様異種移植マウスモデルを確立するために用いられてきた細胞株である(Loisel S.ら、Leuk. Res. 29:1347−1352(2005))。上述の通り、コンビナトリアルターゲティング剤を試験するために、本発明者らはCD5+JVM3細胞株を生成した。Jeko−1細胞株は、CD5+/CD19+のマントル細胞リンパ腫細胞株である(Jeonら、Brit. J. Haematol. 102:1323−1326(1998))。これらの細胞に対する抗CD5−アエロリジンGrBの強力な細胞毒性が、2nMのGrB−抗CD19の存在下において観察され(図19)、推定EC50はそれぞれ2.1nMおよび22.4nMであった。Jeko−1細胞は、自然にCD5およびCD19両方の表面抗原を有するため、これらのデータは、コンビナトリアルターゲティング試薬が、天然レベルで細胞表面上に存在する細胞表面標的を認識することによって、選択的に癌細胞を破壊する能力を持つことを示すものである。
全長DTをコードする遺伝子(Genscript Corporationにより合成)をpBAD102/D−TOPO(Invitrogen Corporation)にクローン化した。フリン切断部位での単一アミノ酸の挿入は、Stratagene社の部位特異的突然変異誘発キット(QuikChange(登録商標) 11 Site−Directed Mutagenesis Kit)を用いて実現した。PCR法を用いて、ベクタープラスミド中の元々のエンテロキナーゼ認識配列をTEVプロテアーゼ認識配列に変化させた。
Trx−DT融合タンパク質DT、DTA、DTS、およびDTATの部位特異的リン酸化の有効性および特異性を調べるために、市販される多くのキナーゼをスクリーンした。タンパク質キナーゼA(PKA)が、これらの融合体に最も有効であると同定された。リン酸化反応は、タンパク質1μg、タンパク質キナーゼA1μl、および1mM ATP (New England Biolabs)2μlを含有する、50mM トリス−HCl/10mM MgCl2緩衝液(pH7.5)20μl中で行われた。混合物は30℃で20分インキュベートした。リン酸化生成物を可視化するために、いくつかのリン酸化実験においてγ−32P−ATPをATPに添加し(3000Ci/mmol、Perkin Elmer Life and Analytical Science)、32P標識Trx−DTを得た。PKAは、すべての融合タンパク質に放射性リン酸塩基を加え、SDS−PAGE分析で示されるように単一の生成物を生成することが分かった(図22B、上パネル)。Trx−DT融合体の標識有効性(リン酸化の有効性に相当)は、DTA>DTS>DTAT≒DTであった。
Trx−DT融合タンパク質内のフリン切断部位でのリン酸化が、フリン切断効率にいずれかの影響を与えるのかどうかを分析するために、非標識かつリン酸塩標識の融合タンパク質をフリンを用いて37℃でインキュベートした。各フリン消化には、合計反応体積20μl中でタンパク質2μgを2ユニットのフリン(New England Biolabs)と37℃で混合した。反応緩衝液は、100mMトリス−HCl、0.5% Triton X−100、1mM CaCl2および0.5mMジチオスレイトールをpH7.5で含有していた。フリン処理なしのサンプルを対照として用いてSDS−PAGEによって、反応混合物を分析した。対照サンプルは、切れ目の入った生成物(35kDおよび41kD)をいくつか含有しており、フリン切断部位のフラグメント化と一致していることが分かった。この現象は以前にも他者によって観察されており、タンパク質精製中の望ましくないタンパク質分解的切断の結果だと考えられている。20分のフリン処理後、DT、DTA、DTS、およびDTATサンプルは、実質上より多くの切断生成物(35kDおよび41kD)を示し(図21B)、予想した通り、非リン酸化サンプルの部位特異的切断を実証した。しかしながら、リン酸化タンパク質pDTA、pDTS、およびpDTATは、フリン切断に対して感受性の低下を示した。1時間後にpDTの有意な消化が見られたが、pDTA、pDTS、およびpDTATについては明白な消化は観察できなかった。その後、一晩消化を続けた。20時間のフリン処理後、pDTの切断はほぼ完璧であったが、pDTA、pDTATおよびpDTSのわずか5%、10%、および50%がフラグメント化されたのみであった(図22B)。リン酸化によって、pDTA、pDTATおよびpDTSのフリンに対する不安定さが有意に軽減したことは、それらを潜在的に、脱リン酸化により活性化され、天然に活性化可能な毒素を提供する、すなわち、内因性のフリン/ケキシン様プロテアーゼによって活性化され得るプロトキシンとして、用いることができる可能性を提案するものである。
フリン切断部位190RVRR↓ASV195でアラニン挿入を含有するTrx−DTA−抗CD19融合遺伝子を、対応するTrx−DT(図21AのDTA)およびDTGrB−抗CD19融合遺伝子から構築した。Trx−DTA−抗CD19融合タンパク質を大腸菌に発現させ、可溶性画分を収集し、標準的なHisタグ精製を用いて精製した。精製したTrx−DTA−抗CD19をTEVプロテアーゼで処理してTrxタグを除去し、DTA−抗CD19を得た。
融合タンパク質pDTA−抗CD19を大腸菌中で生成した組換えタンパク質ホスファターゼ2C(PP2C)で処理し、SDS−PAGEを用いてその脱リン酸化を観察した。得られたDTA−抗CD19は、哺乳動物細胞に存在するフリンによって活性化されるRVRR↓AS配列を含有する。PP2Cを脱リン酸化に選択したのは、pDTA−抗CD19内の修飾されたフリン切断部位と非常に類似するRRATPVAまたはRRASPVA上のリン酸塩基を効率的に除去することが可能だからである(Deanaら、Biochim. Biophy. Acta, 1051 :199−202(1990))。
CD5およびCD19表面抗原の両方を含有する細胞、すなわち、Jeko−1、CD5+JVM3、CD5+Raji、およびCD19+Jurkat細胞を用いて、DTA−抗CD19およびpDTA−抗CD19の両方を上述の通りタンパク質合成阻害細胞毒性アッセイを用いて試験した。様々な濃度のDTA−抗CD19およびpDTA−抗CD19を試験して、各細胞株にシクロヘキシミドを加えることにより陽性阻害対照を得た。その結果(図23B)、非リン酸化DTA−抗CD19融合体は、試験したすべての細胞に対して非常に毒性が高い(IC50〜0.01〜0.1nM)のに対し、リン酸化pDTA−抗CDl9融合体は同様の条件下においてこれらの細胞に毒性を示さなかったことが分かった。
CTLおよびNK細胞において、GrBは最初は不活性前駆体タンパク質として発現される。このプレプロGrBは、分泌顆粒にタンパク質を内包するよう指示するN末端シグナルペプチドを有する。GrBの酵素活性は、貯蔵ビヒクルへの輸送中にジペプチジルペプチダーゼ/カテプシンCによって切断される活性化ジペプチドGly−Gluにより厳密にコントロールされている。本発明者らは、GrBの第1の残基IleのN末端に位置する余剰残基のタンパク質分解除去の個々の段階、または宿主細胞に天然に存在するプロテアーゼによって与えられるインサイチューでの活性化のいずれかによって成熟させることができる、プロ形態の組換えGrBを構築した。
特別な一例において、本発明のプロトキシンとプロトキシン活性化因子との融合タンパク質は、EphA3およびクローディン3/4を発現する乳癌細胞に向けられた。
DTGrB−抗CD5遺伝子からのDTの転位ドメインおよび触媒ドメインを、His−Patchチオレドキシンを含有するpBAD/D−TOPOベクター(Invitrogen)にクローン化した。後に融合タンパク質からチオレドキシンを除去する機会を提供するために、第Xa因子部位もDTのすぐ上流に導入した。C−CPEをコードする遺伝子を合成した(Genscript Corporation)。ポリヒスチジンタグ(H6)をC末端で含有するC−CPE挿入断片を、上述のpBAD/D−TOPO−DTベクターにライゲーションして融合遺伝子を生成した。PCR法に基づく突然変異誘発およびPhusion(商標) High−Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)を用いて、TEVプロテアーゼ切断部位を導入した。使用した認識部位はELNYFQ↓Gであり、元々の構築物中の第Xa因子部位(I−E−G−R)を置き換えた。
pBAD/D−TOPO−Trx−DTGrB−CCPEプラスミドを含有する大腸菌培養液1Lを、LB含有アンピシリン中でOD600=0.6まで増殖させた。0.02%のアラビノースを用いて18℃で一晩培養物を誘導した。Ni−NTAアガロース樹脂(Qiagen)を用いて融合タンパク質を精製し、PBSに対して透析した。
配列YSAYPDSVPMMSを有する12残基のペプチドであるYSAは、EphA2受容体(Koolpe,ら、J Biol Chem. 280:17301−11(2005))に対する特異的バインダーであると報告されており、多くの癌において過剰発現している。2つのYSAペプチドの融合体をコードするDNAを合成し、3者ライゲーション(3−piece ligation)反応でGrB遺伝子とともにpIC9ベクターにクローン化した。得られたプラスミドは所望のGrB−(YSA)2DNAを含有することが確認され、その後、上述のGrB−抗CD19融合体の哺乳動物発現に用いられたpEAKl5−GrB−CD19Lベクターにサブクローン化した。pEAKl5−GrB−(YSA)2構築物は、発現タンパク質の分泌のためのリーダー配列、およびグランザイムBのすぐ上流にあるエンテロキナーゼ部位を含有する。
推奨される手順にしたがってTransFectin(商標)脂質試薬(BioRad)を用いて、pEAKl5−GrB−(YSA)2プラスミドを293ETN細胞にトランスフェクトした。細胞をOptiMEM(Gibco)内で2日間インキュベートし、上清を収集した。Ni−NTA樹脂(Qiagen)を用いて分泌されたタンパク質を培地の上清から精製してから、Tris−Cl緩衝液に対して透析した。
プロトキシンDTGrB−CCPE融合タンパク質を、細胞に曝露する前にマウスGrB(Sigma)を用いてインビトロで活性化した。クローディン−3/−4を発現する同数のHT−29細胞を96ウェルプレートに播種し、24時間定着させた。0.03nMから0.6μMまでの異なる濃度(各濃度で3つ組)の活性化したDTGrB−CCPEをウェルに直接加えた。シクロヘキシミドを細胞成長阻害対照として用い、緩衝液の対照としてPBSをウェルに加えた。活性化したDTGrB−CCPE融合体の存在下で細胞を48時間インキュベートし、CellTiter 96(登録商標) AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)(Promega)を用いて、製品マニュアルに概説される通りに細胞毒性を測定した。GraphPad Prism 4を用いて結果を分析した。
本発明は、プロトキシンの様々なドメインとプロトキシン活性化因子融合タンパク質との間における分岐化学リンカーの使用を特徴とする。このようなリンカーの合成例を以下に示す。
CH3CN(15mL)中の2,2’−(エタン−l,2−ジイルビス(オキシ))ジエタンアミン(1.4830g、l0.0mmol)溶液に、CH3CN(5mL)中の1,4−ジオキサン−2,6−ジオン(1.1560g、10.0mmol)溶液を5分間かけて滴下して加え、混合物を室温で5時間撹拌した。デカンテーションにより無色の上清を処分した。5mLのCH3CNを加えて、混合物を30秒ボルテックスした。上清をデカントした。残りの残渣を1MのHCl(20mL)に溶解させ、Dowex50W8イオン交換樹脂(樹脂15mL、H+の形態)を用いてクロマトグラフィーを行った。一酸(mono−acid)生成物を水で溶出し、その後0.15MのNH4OHで溶出した。反応により、収量37%の一塩酸生成物を淡黄色のゴムとして得た(JL01)。
水(10mL)中の14−アミノ−5−オキソ−3,9,12−トリオキサ−6−アザテトラデカン−l−カルボン酸(0.9650g、3.7mmol)溶液に、NaHCO3(0.3739g、4.4mmol)を加え、混合物を室温で10分撹拌した。ジオキサン(5mL)中のBoc2O(0.9834g、4.5mmol)溶液を混合物に加えて、室温で一晩撹拌した。反応粗液を減圧下で濃縮した。残渣を水中で再度溶解させて、ジエチルエーテルで洗浄した。エーテル層を処分して残渣を1MのHClで酸性化し、酢酸エチルで抽出した。有機層を保存してNa2SO4上で乾燥させた。減圧下にて酢酸エチルを除去した後で、1.3111gの微黄色のゴムを生成物として得た(JL02)。
化合物JL02(1.2540g、3.44mmol)およびN−ヒドロキシスクシンイミド(0.5140g、4.47mmol)を、CH2CI2(10mL)およびDMF(5mL)に溶解した。混合物を室温で撹拌し、CH2Cl2(10mL)中のDCC(0.8020g、3.88mmol)溶液を加えた。混合物を一晩撹拌し、白色沈殿物を濾過によって除去した。減圧下で濾液を濃縮してNHSエステルを得た。NHSエステルを再度DMFに溶解して、氷浴中で撹拌した。アミノトリエチルエステルJL05(JL03、1.5520g、3.68mmol)溶液をDMF(5mL)に加えた後で、氷浴を除去して混合物を室温で63時間撹拌した。反応粗液を濾過し、酢酸エチルで洗浄して、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラム上で精製して、94%の収量で微黄色のゴム生成物を得た(JL04)。
THF(30mL)中の化合物JL04(2.2230g、2.90mmol)の溶液に、1MのNaOH水溶液(15mL)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、減圧下でTHFを除去した。6MのHClでpH2まで水溶液を酸性化し、CH2Cl2で抽出した。有機層を保存してNa2SO4上で乾燥させた。微黄色のゴムを76%の収量で生成物として得た(JL06)。
DMF(100mL)および水(20mL)中の1−クロロ−2−(2−(2−(2−クロロエトキシ)エトキシ)エトキシ)エタン(13.2310g、57.2mmol)溶液にNaN3(11.353g、175mmol)を加え、混合物を80℃で40時間撹拌した。濾過の後で濾液を保存して、減圧下で濃縮した。白色スラリを酢酸エチルおよびヘキサン(v/v1:1、200mL)で希釈して、沈殿物を濾過により除去した。濾液を保存して水(30mL)と鹹水(30mL)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させた。微黄色の液体を99%の収量で生成物として得た(JL07)。
酢酸エチル(45mL)およびジエチルエーテル(45mL)中の化合物JL07(14.4g,〜57.2mmol)の溶液に、5%のHCl(60mL)を加えた後でPh3P(14.04g、53.5mmol)を加え、混合物を氷浴中で1時間撹拌した。その後氷浴を除去し、反応混合物を室温で14時間撹拌した。反応粗液を分液ロートに移して、有機相を除去した。水相を酢酸エチルで洗浄して、氷浴中で冷却した。1MのNaOHを加えてpHが13になるまで調節した。生成物をCH2Cl2中に抽出して、Na2SO4上で乾燥させた。微黄色の液体を、82%の収量で生成物として得た(JL08)。
CH2Cl2(4mL)中の化合物JL06(0.1367g、0.2mmol)の溶液に、CH2Cl2(4mL)中の化合物JL08(0.2619g、1.2mmol)の溶液を加えてから、DIEA(209μL、1.2mmol)を加え、混合物を室温で撹拌した。CH2Cl2(4mL)中のDEPC(182μL、l.2mmol)の溶液に、上記混合物を1分間滴下して加え、室温で一晩さらに撹拌した。減圧下で溶媒を除去した後、残渣をシリカゲルカラム上で精製して0.2047g(収量80%)の生成物JL09を微黄色の液体として得た。
MeOH(0.64mL)中の化合物JL09(0.2047g、0.16mmol)の溶液を、50mLの二口フラスコに加えた。真空/アルゴンのサイクルを2回行ってフラスコ内の空気をアルゴンと交換した。フラスコにPd/Cを迅速に加えた後、真空/水素サイクルを2回行い、アルゴンを水素と交換した。反応混合物を水素圧1atm(バルーン)下で72時間、室温で勢いよく撹拌した。Pd/Cを濾過して、減圧下で微黄色のゴムを、99%の収量で生成物として得た(JL10、0.1915g)。
CH2Cl2中の化合物JL10(0.1206g、0.1mmol)の溶液に、CH2Cl2中のN末端および側鎖保護YSAペプチド溶液(0.6mmol)を加え、続いてDIEA(105μL、0.6mmol)を加えてから混合物を室温で撹拌した。CH2Cl2中のDEPC(91μL、0.6mmol)の溶液を、上記混合物に1分間に渡り滴下して加え、室温で一晩撹拌した。減圧下で溶媒を除去した後、クロマトグラフィーにより残渣を精製した。DEA(塩基不安定性の保護基を除去するため)およびTFA(酸不安定性の保護基を除去するため)の連続処理により保護基を除去し、得られたコンジュゲートを酵素ライゲーション反応に用いた。
C末端タグLPETGまたはLLQGタグを有するグランザイムB融合タンパク質を構築して、上述の方法を用いて調製した。各GrB融合体を、完全に脱保護したJL10−(YSA)3(1:2の比率で混合)と混合し、0.1Mのトリス(pH9)、5mMのCaCl2、0.01% Tween−20の存在下においてソルターゼA−アガロースとインキュベートしてから、室温で一晩インキュベートした。低MWカットオフ回転濃縮器を用いて各コンジュゲーション混合物を濃縮してから、余分なJL10−(YSA)3を除去するために緩衝液で徹底的に洗浄した。カラムクロマトグラフィーを用いてコンジュゲートをさらに精製することができる。得られた融合タンパク質は、曝露されたN末端を持つ3つのYSAペプチド、および曝露されたN末端を持つ活性型GrB部分を有する(図24)。
二重特異性を持つscFv融合タンパク質DT2219は、CD19およびCD22を認識する2つの繰り返しsFvサブユニットに融合されたジフテリア毒素の触媒および転位ドメインから構成されると、以前に報告されている。DT2219は、抗CD19および抗CD22 scFv単独で作られた単量体または二価の免疫毒素よりもはるかに高い抗癌活性を有することが示され、抗CD19および抗CD22の親モノクローナル抗体に比べて、患者の白血病細胞およびCD19+CD22+DaudiまたはRaji細胞に対して高レベルの結合を示した(Valleraら、Clin. Cancer Res. 11(10):3879−88(2005))。同様にして、標的化されたB−CLL細胞(CD19+/CD22+)への結合を強化するために、プロトキシンDTGrB−抗CD2219およびGrB−抗CD1919を設計した。GrB−抗CD1919は、2つの結合モチーフの単純な相乗的な結合によりB細胞の親和性を高めることが予測される一方で、DTGrB−抗CD2219は、CD19+/CD22+B細胞上のCD19およびCD22集団の両方を利用するようにも設計される。
プロテアーゼ活性化因子の別の例を提供するために、内因性のフリン切断部位をTEV切断部位(ENLYFQ7↓G)で置き換えることにより、NGFD−VCEからNGFD−VCETEVを構築し、同様の手順を用いて発現させた。各部分は異なる条件下で最適に発現された(すなわち、それぞれ大腸菌中での周辺質および細胞質発現)ため、TEVを標的とする抗CD5 scFvの調製は、黄色ブドウ球菌のソルターゼAで触媒したライゲーションを用いて実現した。図26に示すように、LPETGタグ付き抗CD5 scFvは、標準的なソルターゼAライゲーションの手順を用いてGKGGタグ付きTEVにコンジュゲートされた。
図27Aに示すように、完全には精製されていないが、NGFD−VCETEV融合タンパク質は組換えTEV(Invitrogen)の基質であり、予想されるサイズのフラグメントを生成するために切断された。図27Bは、CD19+Jurkat細胞を用いた細胞毒性試験の結果を示す。15nMのNGFD−VCETEVと1.5nMの抗CD5−TEVは、組み合わせて用いられた時に、同じ濃度で各試薬が単独で用いられた場合よりもはるかに効果的にタンパク質合成を阻害した。観察された2つの試薬の相乗効果は、NGFD−VCETEVが同じ細胞上の抗CD5−TEVによって選択的に活性化可能であることを実証するものであった。
上述の構築物およびタンパク質についてのポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を表3に示す。
すべての刊行物、特許出願、本明細書に記載の特許は、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。
Claims (81)
- 1つ以上の非天然の、細胞を標的とする部分、1つの選択的に修飾可能な活性化ドメイン、および1つの毒素ドメインを含む、プロトキシン融合タンパク質であって、前記修飾可能な活性化ドメインが、外因性酵素に対する基質を含む、プロトキシン融合タンパク質。
- 前記酵素が、プロテアーゼである、請求項1に記載のプロトキシン融合タンパク質。
- 前記プロテアーゼが、外因性ヒトプロテアーゼである、請求項2に記載のプロトキシン融合タンパク質。
- 前記プロテアーゼが、非ヒトプロテアーゼである、請求項2に記載のプロトキシン融合タンパク質。
- 前記プロテアーゼが、非哺乳類プロテアーゼである、請求項2に記載のプロトキシン融合タンパク質。
- 前記プロテアーゼが、ウイルスプロテアーゼである、請求項2に記載のプロトキシン融合タンパク質。
- 前記修飾可能な活性化ドメインが、プロテアーゼ切断部位の翻訳後修飾を含む、請求項1に記載のプロトキシン融合タンパク質。
- 前記修飾可能な活性化ドメインが、翻訳後修飾を除去することが可能な酵素に対する基質を含む、請求項1に記載のプロトキシン融合タンパク質。
- 前記修飾可能な活性化ドメインが、翻訳後修飾を除去することが可能な外因性酵素に対する基質を含む、請求項1に記載のプロトキシン融合タンパク質。
- 前記1つ以上の非天然の、細胞を標的とする部分が、癌細胞を認識する、請求項1に記載のプロトキシン融合タンパク質。
- 前記1つ以上の非天然の、細胞を標的とする部分が、造血細胞、リンパ球、および侵害受容ニューロンから成る群から選択される細胞を認識する、請求項1に記載のプロトキシン融合タンパク質。
- 少なくとも1つの非天然の、細胞を標的とする部分が、ポリペプチドである、請求項1に記載のプロトキシン融合タンパク質。
- 少なくとも1つの非天然の、細胞を標的とする部分が、受容体のためのリガンドである、請求項1に記載のプロトキシン融合タンパク質。
- 少なくとも1つの非天然の、細胞を標的とする部分が、抗体または抗体フラグメントである、請求項1に記載のプロトキシン融合タンパク質。
- 少なくとも1つの非天然の、細胞を標的とする部分が、人工的に多様化された結合タンパク質である、請求項1に記載のプロトキシン融合タンパク質。
- 前記プロトキシンが、活性化可能な毒素である、請求項1に記載のプロトキシン融合タンパク質。
- 前記活性化可能な毒素が、活性化可能な孔形成毒素または活性化可能な酵素毒素から成る群から選択される、請求項16に記載のプロトキシン融合タンパク質。
- 前記毒素が、AB毒素、細胞壊死因子毒素、皮膚壊死毒素、および活性化可能なADPリボシル化毒素から成る群から選択される、請求項1に記載のプロトキシン融合タンパク質。
- 前記毒素が、アエロリジン、コレラ菌外毒素、緑膿菌外毒素、およびジフテリア毒素から成る群から選択される、請求項1に記載のプロトキシン融合タンパク質。
- 前記毒素が、アエロリジンである、請求項19に記載のプロトキシン融合タンパク質。
- 前記毒素が、コレラ菌外毒素である、請求項19に記載のプロトキシン融合タンパク質。
- 1つ以上の、細胞を標的とする部分、1つの天然で活性化可能なドメイン、および1つの修飾ドメインを含む、プロトキシン活性化因子融合タンパク質であって、前記修飾ドメインが、前記天然で活性化可能なドメインの活性化前には、不活性である、プロトキシン活性化因子融合タンパク質。
- 前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質が、標的細胞に対して非毒性である、請求項22に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
- 1つ以上の、細胞を標的とする部分および1つの修飾ドメインを含む、プロトキシン活性化因子融合タンパク質であって、標的細胞に対して非毒性である、プロトキシン活性化因子融合タンパク質。
- 前記修飾ドメインが、プロテアーゼドメインである、請求項22、23、または24に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
- 前記プロテアーゼドメインが、ヒトプロテアーゼの触媒ドメインである、請求項25に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
- 前記ヒトプロテアーゼが、外因性ヒトプロテアーゼである、請求項26に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
- 前記プロテアーゼドメインが、非ヒトプロテアーゼの触媒ドメインである、請求項25に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
- 前記非ヒトプロテアーゼが、ウイルスプロテアーゼである、請求項28に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
- 前記ウイルスプロテアーゼが、レトロウイルスプロテアーゼ、ポティウイルスプロテアーゼ、ピコルナウイルスプロテアーゼ、およびコロナウイルスプロテアーゼから成る群から選択される、請求項29に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
- 前記修飾ドメインが、ホスファターゼドメインである、請求項22、23、または24に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
- 前記1つ以上の、細胞を標的とする部分が、抗体または抗体フラグメントである、請求項22、23、または24に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
- 前記1つ以上の、細胞を標的とする部分が、受容体のためのリガンドである、請求項22、23、または24に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
- 前記1つ以上の、細胞を標的とする部分が、細菌源に由来する結合ドメインである、請求項22、23、または24に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
- 前記1つ以上の、細胞を標的とする部分が、細菌毒素に由来する結合ドメインである、請求項22、23、または24に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
- 前記1つ以上の、細胞を標的とする部分が、人工的に多様化された結合タンパク質である、請求項22、23、または24に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
- 記プロトキシン活性化因子融合タンパク質と、プロトキシン活性化因子融合タンパク質が作用するプロトキシンとの組み合わせの、10%未満の細胞毒性または細胞増殖抑制作用を有する、請求項22、23、または24に記載のプロトキシン活性化因子融合タンパク質。
- 1つ以上の、細胞を標的とする部分、1つの選択的に修飾可能な活性化ドメイン、および1つの活性化因子ドメインを含む、プロアクチベーター融合タンパク質であって、前記修飾可能な活性化ドメインが、酵素に対する基質を含む、プロアクチベーター融合タンパク質。
- 前記酵素が、プロテアーゼである、請求項38に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
- 前記修飾可能な活性化ドメインが、プロテアーゼ切断部位の翻訳後修飾を含む、請求項38に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
- 前記修飾可能な活性化ドメインが、翻訳後修飾を除去することが可能な酵素に対する基質を含む、請求項38に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
- 前記1つ以上の、細胞を標的とする部分が、癌細胞を認識する、請求項38に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
- 前記1つ以上の、細胞を標的とする部分が、造血細胞、および侵害受容ニューロンから成る群から選択される細胞を認識する、請求項38に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
- 前記1つ以上の、細胞を標的とする部分が、リンパ球を認識する、請求項43に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
- 前記プロテアーゼが、外因性ヒトプロテアーゼである、請求項39に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
- 前記プロテアーゼが、非ヒトプロテアーゼである、請求項39に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
- 前記プロテアーゼが、非哺乳類プロテアーゼである、請求項39に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
- 前記非哺乳類プロテアーゼが、ウイルスプロテアーゼである、請求項39に記載のプロアクチベーター融合タンパク質。
- 少なくとも1つの非天然の、細胞を標的とする部分が、ポリペプチドである、請求項38に記載の組成物。
- 少なくとも1つの非天然の、細胞を標的とする部分が、受容体のためのリガンドである、請求項38に記載の組成物。
- 少なくとも1つの非天然の、細胞を標的とする部分が、抗体または抗体フラグメントである、請求項38に記載の組成物。
- 少なくとも1つの非天然の、細胞を標的とする部分が、人工的に多様化された結合タンパク質である、請求項38に記載の組成物。
- 標的細胞を、(i)第1の、細胞を標的とする部分、選択的に修飾可能な活性化ドメイン、および毒素ドメインを含む、プロトキシン融合タンパク質、ならびに(ii)第2の、細胞を標的とする部分および修飾ドメインを含む、プロトキシン活性化因子融合タンパク質に接触させるステップを含む、標的細胞を破壊または抑制する方法であって、前記プロトキシン融合タンパク質の前記第1の細胞標的ドメインおよび前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質の前記第2の細胞標的ドメインが、それぞれ、前記標的細胞を認識し、それに結合し、前記標的細胞への双方の融合タンパク質の結合後、前記修飾可能な活性化部分が、前記修飾ドメインにより選択的に活性化され、毒素活性をもたらし、それによって、前記標的細胞を破壊または抑制する、方法。
- 前記選択的に修飾可能な活性化ドメインが、前記標的細胞とは異種であるプロテアーゼの切断部位である、請求項53に記載の方法。
- 前記毒素が、AB毒素、細胞壊死因子毒素、皮膚壊死毒素、および活性化可能なADPリボシル化毒素から成る群から選択される、請求項53に記載の方法。
- 前記毒素が、活性化可能な孔形成毒素および活性化可能な酵素毒素から成る群から選択される、請求項53に記載の方法。
- 前記毒素が、コレラ菌外毒素である、請求項56に記載の方法。
- 前記毒素が、アエロリジンである、請求項56に記載の方法。
- 前記毒素が、カスパーゼ、リシン、アブリン、およびモデッシン(Modeccin)から成る群から選択される、請求項53に記載の方法。
- 前記修飾ドメインが、前記細胞とは異種のプロテアーゼを含む、請求項53に記載の方法。
- 前記異種プロテアーゼが、ヒトプロテアーゼを含む、請求項60に記載の方法。
- 前記異種プロテアーゼが、ヒトグランザイムBである、請求項61に記載の方法。
- 前記異種プロテアーゼが、アミノ酸21〜247を含む、前記ヒトグランザイムBプロテアーゼのタンパク質分解ドメインを含む、請求項62に記載の方法。
- 前記選択的に修飾可能な活性化ドメインが、IEPDである、請求項62に記載の方法。
- 前記異種プロテアーゼが、ウイルスプロテアーゼである、請求項60に記載の方法。
- 前記毒素が、ジフテリア毒素である、請求項53に記載の方法。
- 前記ジフテリア毒素フリン切断部位が、前記標的細胞とは異種であるプロテアーゼの切断部位により置き換えられる、請求項66に記載の方法。
- 前記毒素ドメインが、ジフテリア毒素のアミノ酸1〜389を含む、請求項67に記載の方法。
- 融合タンパク質のうちの1つまたは両方が、PEG化、グリコシル化、またはその両方により修飾される、請求項53に記載の方法。
- 前記第1の細胞を標的とする部分もしくは前記第2の細胞を標的とする部分、またはその両方が、抗体、抗体様分子、抗体フラグメント、および単一抗体ドメインから成る群から選択される、請求項53に記載の方法。
- 前記第1の、細胞を標的とする部分、もしくは前記第2の、細胞を標的とする部分、またはその両方が、可溶性メディエーター、サイトカイン、成長因子、可溶性受容体フラグメント、人工的に多様化されたポリペプチドバインダー、およびマトリックスフラグメントから成る群から選択される、請求項53に記載の方法。
- 前記第1の、細胞を標的とする部分、もしくは前記第2の、細胞を標的とする部分、またはその両方が、糖質、脂質、および合成リガンドから成る群から選択される、請求項53に記載の方法。
- 前記第1の、細胞を標的とする部分、もしくは前記第2の、細胞を標的とする部分、またはその両方が、抗CD5 ScFv、抗CD19 ScFv、およびCD22 ScFvから成る群から選択される、請求項53に記載の方法。
- 前記標的細胞を、前記プロトキシン融合タンパク質および前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質に同時に接触させる、請求項53に記載の方法。
- 前記標的細胞を、前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質との接触の前に、前記プロトキシン融合タンパク質に接触させる、請求項53に記載の方法。
- 前記標的細胞を、前記プロトキシン融合タンパク質との接触の前に、前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質に接触させる、請求項53に記載の方法。
- 前記標的細胞が、ヒト細胞である、請求項53に記載の方法。
- 前記標的細胞が、癌細胞である、請求項53に記載の方法。
- 前記修飾可能な活性化ドメインの選択的活性化がない場合、前記プロトキシン融合タンパク質は、前記標的細胞または前記標的細胞を取り囲む環境により天然に活性化可能ではなく、前記修飾可能な活性化ドメインの前記選択的活性化が、前記プロトキシン融合タンパク質を天然に活性化可能にする、請求項53に記載の方法。
- (i)第1の、細胞を標的とする部分、選択的に修飾可能な活性化ドメイン、および毒性ドメインを含む、プロトキシン融合タンパク質、ならびに(ii)第2の、細胞を標的とする部分、天然で活性化可能なドメイン、および修飾ドメインを含む、プロトキシン活性化因子融合タンパク質を前記対象に投与するステップを含む、対象における標的細胞を破壊または抑制する方法であって、前記天然で活性化可能なドメインが、前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質を前記対象へ投与すると活性化し、それにより、前記天然で活性化可能なドメインの活性が、前記修飾ドメインの活性化をもたらし、前記プロトキシン融合タンパク質の前記第1の細胞標的ドメインおよび前記プロトキシン活性化因子融合タンパク質の前記第2の細胞標的ドメインが、それぞれ、前記標的細胞を認識して結合し、両方の融合タンパク質が前記標的細胞に結合すると、前記修飾可能な活性化部分が、前記修飾ドメインにより選択的に活性化され、毒素活性をもたらし、それによって、前記標的細胞を破壊または抑制する、方法。
- (i)第1の、細胞を標的とする部分、選択的に修飾可能な活性化ドメイン、および毒性ドメインを含む、プロトキシン融合タンパク質、ならびに(ii)第2の、細胞を標的とする部分、天然で活性化可能なドメイン、および修飾ドメインを含む、プロトキシン活性化因子融合タンパク質を含む、組成物であって、前記修飾ドメインが、前記天然で活性化可能なドメインの活性化前には、不活性であり、前記プロトキシン融合タンパク質の前記第1の細胞標的ドメインおよび前記活性なプロトキシン活性化因子融合タンパク質の前記第2の細胞標的ドメインが、それぞれ、標的細胞を認識して結合し、両方の融合タンパク質が前記標的細胞に結合すると、前記修飾ドメインが、前記選択的に修飾可能な活性化ドメインを活性化し、毒素活性をもたらす、組成物。
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