JPWO2013137328A1 - 抗がん剤のスクリーニング方法、並びにｇｒａｎｚｙｍｅＭの活性を増大する物質を有効成分とする、細胞死を誘導する抗がん剤 - Google Patents

抗がん剤のスクリーニング方法、並びにｇｒａｎｚｙｍｅＭの活性を増大する物質を有効成分とする、細胞死を誘導する抗がん剤 Download PDF

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Abstract

本発明の目的は、新規な治療機構を利用した抗がん剤のスクリーニング方法、並びにｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性を増大する物質を有効成分とする、細胞死を誘導する抗がん剤を提供することである。本発明に係る抗がん剤のスクリーニング方法は、被検物質をがん細胞に投与する工程と、がん細胞が発現するｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性を検出し、活性の増大が確認された被検物質を選択する工程、及び／又は、がん細胞が発現するｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性化により誘導されるがん細胞の細胞死の有無を検出し、細胞死が確認された被検物質を選択する工程と、を有する。

Description

本発明は、抗がん剤のスクリーニング方法、並びにｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性を増大する物質を有効成分とする、細胞死を誘導する抗がん剤に関する。
がんは、多くの国で３大死因の１つであり、新規のがん治療薬の開発は社会的に切望されている。これまでに、多くの抗がん剤が開発され、がん治療に貢献してきた。
免疫学の分野ですでに確立されている生体内の機構として、がん細胞やウイルス感染細胞を、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞や細胞障害性Ｔ細胞が攻撃し、細胞死を誘導する機構が挙げられる。この機構では、まず、ＮＫ細胞や細胞障害性Ｔ細胞がｐｅｒｆｏｒｉｎを分泌し、がん細胞やウイルス感染細胞の細胞膜に穴をあけさせ、この状態でｇｒａｎｚｙｍｅを分泌し細胞内へと侵入させ、種々の細胞内タンパク質を分解することで、細胞死を誘導する（図１５参照）。
ｇｒａｎｚｙｍｅは、セリンプロテアーゼであり、ヒトでは、Ａ、Ｂ、Ｈ、Ｋ、Ｍの５種類が存在することが知られている（非特許文献１）。このうち、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂについて、膀胱がん細胞で発現され、周囲の細胞の細胞外マトリクスを分解することで、がんの浸潤に関与することが示されている（非特許文献２）。
ＣＬ Ｅｗｅｎ，Ｋ Ｐ Ｋａｎｅ，ａｎｄ ＲＣＢｌｅａｃｋｌｅｙ．Ｒｅｖｉｅｗ．Ａ ｑｕａｒｔｅｒ ｃｅｎｔｙｒｙ ｏｆ ｇｒａｎｚｙｍｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． ａｄｖａｎｃｅ ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ４ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１１ Ｄ’Ｅｌｉｓｅｏ Ｄ， Ｐｉｓｕ Ｐ， Ｒｏｍａｎｏ Ｃ， Ｔｕｂａｒｏ Ａ， Ｄｅ Ｎｕｎｚｉｏ Ｃ， Ｍｏｒｒｏｎｅ Ｓ， Ｓａｎｔｏｎｉ Ａ， Ｓｔｏｐｐａｃｃｉａｒｏ Ａ， Ｖｅｌｏｔｔｉ Ｆ． Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １２７， １２８３−１２９４（２０１０）．
しかし、がんの種類は多様であり、新規な抗がん剤の開発は、今後も不可欠である。そして、新規な抗がん剤を開発するためには、従来にない治療機構を利用したスクリーニング方法が必要である。
本発明は、以上の実情に鑑み、新規な治療機構を利用した抗がん剤のスクリーニング方法、並びにｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性を増大する物質を有効成分とする、細胞死を誘導する抗がん剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、ＮＫ細胞、細胞障害性Ｔ細胞にしか存在しないと考えられていたｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍが、意外にもヒト血液がん細胞（培養白血病細胞）に活性を持って発現していることを発見した。さらに、ＡｒａＣがｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍを活性化して、細胞生存因子であるＮＰＭ（ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ）を分解して、白血病細胞（Ｕ９３７及びＨＬ６０）の細胞死を惹起することを明らかにした。即ち、本発明者らは、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍを活性化すると、がん細胞の細胞死（アポトーシス）が誘導されることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的に、本発明は以下のものを提供する。
（１） 被検物質をがん細胞に投与する工程と、
前記がん細胞が発現するｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性を検出し、前記活性の増大が確認された前記被検物質を選択する工程と、を有する抗がん剤のスクリーニング方法。
（２） 被検物質をがん細胞に投与する工程と、
前記がん細胞が発現するｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性化により誘導される前記がん細胞の細胞死の有無を検出し、前記細胞死が確認された前記被検物質を選択する工程と、を有する抗がん剤のスクリーニング方法。
（３） 前記がん細胞は、固形がん細胞又は血液がん細胞である（１）又は（２）記載の方法。
（４） 前記がん細胞にｐｅｒｆｏｒｉｎを投与しない（１）から（３）いずれか記載の方法。
（５） 前記被検物質は、低分子化合物である（１）から（４）いずれか記載の方法。
（６） ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性を増大する物質を有効成分とする、細胞死を誘導する抗がん剤。
（７） ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性を増大する物質がＡｒａＣで、血液がん細胞の細胞死を誘導する（６）記載の抗がん剤。
（８） 血液がんが白血病である（７）記載の抗がん剤。
（９） ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性を増大する物質がシスプラチンで、固形がん細胞の細胞死を誘導する（６）記載の抗がん剤。
（１０） 固形がんが子宮頸がんである（９）記載の抗がん剤。
本発明によれば、新規な治療機構を利用した抗がん剤のスクリーニング方法、並びにｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性を増大する物質を有効成分とする、細胞死を誘導する抗がん剤が提供される。
本発明に係るスクリーニング方法により得られる候補物質ががんを治療又は予防すると想定される機構を示す図である。 ＡｒａＣが、がん細胞（白血病細胞）の細胞増殖抑制（細胞死）に及ぼす影響を調べた結果である（Ａ〜Ｂ）。また、ＡｒａＣの投与によるがん細胞（白血病細胞）中のアポトーシス関連タンパク質の存否を示す写真である（Ｃ）。 ＡｒａＣががん細胞（白血病細胞）の細胞生存因子（抗アポトーシス因子）に及ぼす影響を調べた写真（Ａ）、及び細胞生存因子（抗アポトーシス因子）の断片の位置を示す図である（Ｂ）。 がん細胞（白血病細胞）におけるｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの発現量を示す写真である。 がん細胞（白血病細胞）におけるｐｅｒｆｏｒｉｎの発現量を示す写真である。 がん細胞（白血病細胞）におけるｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍ及びｐｅｒｆｏｒｉｎの発現量を示す写真である。 ＡｒａＣの投与と、がん細胞におけるｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性との関係を示すグラフである。 セリンプロテアーゼ阻害剤（ＴＰＣＫ）の投与と、ＡｒａＣの投与を介したがん細胞（白血病細胞）におけるｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性との関係を示すグラフである。 ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍ特異的阻害剤の投与と、ＡｒａＣの投与を介したがん細胞（白血病細胞）の生細胞数との関係を示すグラフである。 ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍ特異的阻害剤の投与と、ＡｒａＣの投与を介したがん細胞（白血病細胞）の生細胞数との関係を示すグラフである。 ＣＤＤＰの投与と、がん細胞（固形がん）におけるｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性との関係を示すグラフである。 ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍ特異的阻害剤の投与と、ＣＤＤＰの投与を介したがん細胞（固形がん）の生細胞数との関係を示すグラフである。 がん細胞におけるｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性を示すグラフである。 がん細胞におけるｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの局在を示す写真である。 従来、免疫学で確立されているがん細胞の細胞死の機構を示す図である。
以下、本発明の実施形態について説明するが、これらに本発明が限定されるものではない。
（投与）
本発明に係る抗がん剤の候補物質のスクリーニング方法では、まず、被検物質をがん細胞に投与する。投与の方法は、特に限定されず、例えば、がん細胞を、被検物質を含むがん細胞用培地（少なくとも、がん細胞の最少栄養を含む）で培養すればよい。
次に述べるように、本発明は、外部からのｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍをがん細胞の内部に導入させるのではなく、がん細胞が発現するｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性に注目したスクリーニング方法である。
（選択）
本発明は、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍががん細胞に活性を持って発現しているという、新規な発見に基づき、がん細胞が発現するｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍを活性化させることで、がん細胞の細胞死を誘導する抗がん剤を得ようとするものである（図１参照）。その結果、本発明は、がん細胞が発現するｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性を検出し、その活性の増大が確認された被検物質を選択する工程、及び／又は、がん細胞が発現するｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性化により誘導されるがん細胞の細胞死の有無を検出し、その細胞死が確認された被検物質を選択する工程を有する。なお、本発明における細胞死とは、アポトーシスを含む広い概念である。
ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍ自体は、周知なセリンプロテアーゼであり、活性及びその検出方法も非特許文献１や、Ｓａｍｉ Ｍａｈｒｕｓ， Ｗａｌｔｅｒ Ｋｉｓｉｅｌ， ａｎｄ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｓ． Ｃｒａｉｋ． Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍ ｉｓ ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｔｈａｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ９， ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９， ｐｐ．５４２７５−５４２８２，２００４等に開示される通り、周知である。特に限定されないが、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍによって特異的に切断されるアミノ酸配列（例えば、ＫＶＰＬ）を含むペプチドをｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍと併存させ、そのアミノ酸配列において切断されたペプチドの断片を検出する（例えば電気泳動法、必要に応じて更に、断片のアミノ酸配列解析）ことで、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性を検出することができる。
本発明では、特に限定されないが、被検物質の投与が終了した後のがん細胞から常法でタンパク質群を回収（例えば抽出）し、そのタンパク質群を、上記特異的に切断されるアミノ酸配列（例えば、ＫＶＰＬ）を含むペプチドとともに、適切な環境（ｐＨ、温度、緩衝剤等）下で併存させ、そのアミノ酸配列において切断されたペプチドの断片を検出すればよい。この場合、ペプチド断片が、対照区（典型的には、被検物質を投与しなかった試験区）から回収される同等量のタンパク質群に比べて多量／及び又は短時間に検出される、及び／又は、被検物質の濃度に依存すること等の事実により、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性の増大が確認された被検物質を特定することができる。
あるいは、がん細胞におけるｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性の検出は、がん細胞が発現するタンパク質のうち、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍによって特異的に切断されることが示されたタンパク質（例えば、後述のＮｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ等の抗アポトーシス因子）について、その断片を、がん細胞から回収したタンパク質群において検出する（例えば、ウェスタン解析）ことによって行ってもよい。Ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎについては、Ｃｕｌｌｅｎ ＳＰ， Ａｆｏｎｉｎａ ＩＳ， Ｄｏｎａｄｉｎｉ Ｒ， Ｌｕｔｈｉ ＡＵ， Ｍｅｄｅｍａ ＪＰ， Ｂｉｒｄ ＰＩ， Ｍａｒｔｉｎ ＳＪ． Ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ ｉｓ ｃｌｅａｖｅｄ ａｎｄ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｇｒａｎｕｌｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍ ｄｕｒｉｎｇ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｋｉｌｌｉｎｇ． Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２８４，５１３７−５１４７，２００９．を参照することができる。この場合、ペプチド断片が、対照区（典型的には、被検物質を投与しなかった試験区）から回収される同等量のタンパク質群に比べて多量に検出される、及び／又は、被検物質の濃度に依存すること等の事実により、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性の増大が確認された被検物質を特定することができる。
後述のように、がん細胞におけるｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性は、がん細胞におけるｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの発現量（ｍＲＮＡの転写量、タンパク質の合成量）と必ずしも一致しない。つまり、がん細胞におけるｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの発現量が増大しなくても、がん細胞におけるｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性が増大する場合があり得る。このため、がんの治療又は予防薬の候補物質を幅広くスクリーニングする観点で、がん細胞におけるｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの発現量の増大よりも、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性の増大を確認することが好ましい。ただし、このことは、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性の増大とともに、がん細胞におけるｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの発現量の増大も併せて確認することを本発明から除外する趣旨ではない。
スクリーニング精度を高める観点で、必要に応じ、がん細胞から回収したタンパク質群にｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの阻害剤を混ぜることで、ペプチド断片の存在量が低減することを更に確認してもよい。この態様で使用し得るｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの阻害剤としては、必要とされる精度向上の程度に応じ、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍに特異的な阻害剤、又は非特異的なセリンプロテアーゼ阻害剤を使用し得る。
ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性化により誘導されるがん細胞の細胞死について、まず、がん細胞の細胞死の有無は、被検物質を含む培地で培養するがん細胞の増殖速度（例えば細胞の脱水素酵素活性に基づく）が、対照区に比べて低いこと、及び／又は、被検物質の濃度に依存すること等により検出することができる。また、その細胞死がｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性化により誘導されることは、例えば、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍに特異的な阻害剤のがん細胞への投与（典型的には、被検物質の投与より前又は同時に行う）により細胞死が抑制されることを検出する、及び／又は、がん細胞が発現する細胞死に関与するタンパク質のうち、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍによって特異的に切断されるタンパク質（例えば、後述のＮｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ等の抗アポトーシス因子）について、その断片を、がん細胞から回収したタンパク質群において検出する（例えば、ウェスタン解析）ことによって行ってもよい。
なお、スクリーニング精度を高める観点で、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性化により誘導されるがん細胞の細胞死に加え、必要に応じ、がん細胞におけるｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの発現量／活性の増大に基づき、被検物質を選択してもよい。
（がん細胞）
用いるがん細胞は、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍを発現する限りにおいて、特に限定されない。がんは大別して、血液がん（白血病など）と、固形がんとに分類され、各種類のがんに対応してがん細胞が従来知られている。後述のように、血液がん細胞のうちＵ９３７細胞及びＨＬ６０細胞という代表的なＢ細胞系のがん細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＫＹＳＥ細胞（食道がん）、ＨＴ２９細胞（大腸がん）、ＨＭＹ−１細胞（メラノーマ）、Ａ５４９細胞（肺がん）、ＬＫ２細胞（肺がん）という代表的な固形がん細胞において、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍが発現レベルは低いが発現されることが本発明者により証明され、また、Ｔ細胞及びＮＫ細胞系のがん細胞がｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍを発現することは技術常識である。従って、多くのがん細胞が本発明で使用され得ると考えられる。なお、後述のＫＹＳＥ１８０およびＫＹＳＥ４５０細胞は富山大学 消化器・腫瘍・総合外科 嶋田 裕教授より供与を受けた。ＨＴ２９細胞、ＨＭＹ−１細胞、Ａ５４９細胞、ＬＫ２細胞は、ヒューマンサイエンス研究資源バンク（大阪府泉南市りんくう南浜２−１１）より購入した。
血液がんとは、血液中に含まれている細胞（赤血球、白血球、血小板）が、がん化した疾患であり、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫がその代表例である。白血病は、骨髄中の造血幹細胞ががん化した疾患であり、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病の４つに分類される。悪性リンパ腫は、リンパ球が悪性化する病気であり、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ホジキンリンパ腫以外のＢ細胞腫瘍とＴ／ＮＫ細胞腫瘍の総称）等が代表例である。多発性骨髄腫は、骨髄中の形質細胞（抗体を産生する細胞）ががん化した疾患である。
有望ながんの治療又は予防薬が得られる確率を高める観点で、がんの治療又は予防薬の対象とする種類のがんに対応するがん細胞を用いることが好ましい。また、がん細胞は、哺乳動物由来であることが好ましく、がんの治療又は予防薬が投与される動物と同じ哺乳動物由来であることがより好ましい。通常、ヒト由来のがん細胞が好ましい。ただし、上記説明は、スクリーニングの効率を向上する趣旨であり、用いたがん細胞と対応しないがんの治療薬として候補物質を使用することを除外する趣旨ではない。
（被検物質）
被検物質は、特に限定されず、天然又は合成の有機又は無機の低分子又は高分子物質等の任意の物質であってよい。本発明は、従来のスクリーニング方法とは異なる機構に着目するため、従来のスクリーニング方法でポジティブと判断された物質、及びネガティブと判断された物質の双方とも、被検物質として使用し得る。
本発明で選択される候補物質は、ｐｅｒｆｏｒｉｎの有無にかかわらず、がん細胞が発現するｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性を調節する機能を有する。このため、新規な候補物質として有望な被検物質は、がん細胞の細胞膜における穴の存否にかかわらず、がん細胞の細胞膜を透過できる物質、典型的には低分子化合物であると考えられる。従って、被検物質として低分子化合物を用いることは、スクリーニング効率の観点で好ましい。ただし、がん細胞が発現するｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性の調節は、がん細胞の細胞表面に提示されたレセプタ等への結合等を介してなされる可能性もあり、高分子物質も被検物質として使用し得る。
（抗がん剤）
本発明は、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性を増大する物質を有効成分とする、細胞死を誘導する抗がん剤も包含する。具体的に、本発明に係る抗がん剤は、特に限定されないが、上記スクリーニング方法によって選択された候補化合物（必要に応じて更なるスクリーニングを行ってもよい）、例えばＡｒａＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）等の１又は２以上からなる。具体的には、有効成分がＡｒａＣで、血液がん（具体的には白血病）細胞の細胞死を誘導する抗がん剤、有効成分がＣＤＤＰで、固形がん（具体的には子宮頸がん）細胞の細胞死を誘導する抗がん剤が挙げられる。
本発明の抗がん剤は、各種製剤形態に調製し、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。本剤を経口投与する場合、本剤を、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等に製剤化するか、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本剤を非経口投与する場合、本剤は、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤、腫瘍内直接投与剤などに製剤化し、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供されてよい。
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等を適宜用い、常法により製造することができる。
本発明の抗がん剤の投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数、症状、剤型等により異なるが、タンパク質又はポリペプチドの治療的有効量（すなわち、有効量）は、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、さらにより好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇ又は５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、１日１回から数回に分けて１日以上投与される。また、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを遺伝子治療等の方法によって導入する場合、前記の範囲量のタンパク質を発現しうるポリヌクレオチドを投与すればよい。
（試験例１）
ヒト白血病細胞であるＵ９３７細胞及びＨＬ６０細胞、ヒト大腸がん細胞であるＣｏｌｏ２０１（すべて細胞バンクより購入）を用い、各々３×１０３個の細胞を９６ウェルプレートに播種し、１ウェルあたり１００μｌのＲＰＭＩ培地（１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、２ｍＭＬ−グルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２５０ｎｇ／ｍｌアンフォテリンＢを含有する）にて培養した。このとき、培地に、従来臨床で急性骨髄性白血病の治療に用いられているＡｒａＣ（キロサイド）を、１、５、１０、５０μＭの各濃度で添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で、２４時間培養した。その後、１ウェルあたり１０μｌのＷＳＴ−８溶液を入れ、３７℃で４時間培養した。
細胞の増殖は、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ ８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用いて測定した。この方法は、生細胞内の脱水素酵素活性を指標とする測定法であり、テトラゾリウム塩であるＷＳＴ−８［２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，モノソジウム塩］が還元されて、ホルマザンが生成されることに基づき、生細胞数の測定を行うものである。具体的に、ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＪＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定し、リファレンスには６９０ｎｍの吸光度を使用した。この結果を、図２Ａに示す。図２Ａのグラフの縦軸は、細胞生存率の程度を相対値で表す。
図２Ａに示されるように、Ｕ９３７、ＨＬ６０の細胞死が、ＡｒａＣの濃度依存的に誘導された（＊＊ｐ＜０．０１）。なお、いずれの図面においても「＊＊」はｐ＜０．０１を指し、「＊」はｐ＜０．０５を指す。一方、ＡｒａＣの治療効果が知られていない大腸がん細胞であるＣｏｌｏ２０１の細胞死はＡｒａＣにより誘導されなかった。
上記培地に、５μＭのＡｒａＣとともに、公知のセリンプロテアーゼ阻害剤（５０μＭ ＴＰＣＫ、５μＭ ３，４−ＤＣＩ）を添加し、ＡｒａＣによる細胞死が回復するかどうかを解析した。この結果を図２Ｂに示す。図２Ｂの縦軸は、細胞の生存率を相対値で表す。
図２Ｂに示されるように、セリンプロテアーゼ阻害剤の添加により、有意に細胞死が回復した（＊＊Ｐ＜０．０１）。これにより、ＡｒａＣによるがん細胞の細胞死へのセリンプロテアーゼの関与が示唆された。
５μＭのＡｒａＣの投与下での培養開始の直後（０ｈ）、３時間後、及び６時間後において、Ｕ９３７細胞のアポトーシス関連蛋白の発現を測定した。この結果を図２Ｃに示す。
図２Ｃに示されるように、ＡｒａＣ投与後の時間経過とともに、ＰＡＲＰ及びｃａｓｐａｓｅ−３が分解され、それらの細胞死への関与が示唆された。これにより、図２Ａ及びＢで示されたＡｒａＣにより誘導される細胞死が、アポトーシスであることが明らかとなった。
（試験例２）
図２Ｃと同様の方法で、Ｕ９３７、ＨＬ６０、Ｃｏｌｏ２０１の各細胞から抽出したタンパク質群を、常法の電気泳動法により分子量分画し、更に常法のウェスタンブロット法により、細胞生存因子（抗アポトーシス因子）であるＮｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ（ＮＰＭ）の挙動を調べた。なお、抗ＮＰＭ抗体であるｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−Ｂ２３（Ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ／ＮＰＭ）（カタログ番号 Ｂ０５５６）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）から購入した。この結果を図３Ａに示す。
図３Ａに示されるように、Ｕ９３７、ＨＬ６０では、ＡｒａＣ投与後の時間経過とともに、ＮＰＭの断片が検出されたが、Ｃｏｌｏ２０１では検出されなかった。これにより、細胞生存因子（抗アポトーシス因子）の機能を阻害することが、ＡｒａＣにより誘導させるがん細胞の細胞死の機構であると考えられた。
ＮＰＭ断片を免疫沈降法により回収し、ＮＰＭの切断部位のＮ末端のアミノ酸を解析し、ＮＰＭの切断に関与したプロテアーゼの同定を行った。この結果を図３Ｂに示す。なお、図３Ｂにおける「ＬＣ」は、免疫沈降に用いた抗体の軽鎖である。
図３Ｂに示されるように、断片のＮ末端のアミノ酸配列はＡＡＥＤであり、ＮＰＭのＬｅｕ−１５８で切断されたことが確認された。この部位で切断を引き起こす酵素はｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍである（Ｃｕｌｌｅｎ ＳＰ， Ａｆｏｎｉｎａ ＩＳ， Ｄｏｎａｄｉｎｉ Ｒ， Ｌｕｔｈｉ ＡＵ， Ｍｅｄｅｍａ ＪＰ， Ｂｉｒｄ ＰＩ， Ｍａｒｔｉｎ ＳＪ． Ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ ｉｓ ｃｌｅａｖｅｄ ａｎｄ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｇｒａｎｕｌｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍ ｄｕｒｉｎｇ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｋｉｌｌｉｎｇ． Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２８４，５１３７−５１４７，２００９．）ことから、ＡｒａＣ投与によるＮＰＭの切断は、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性化によるものであると考えられた。なお、図示はしないが、ＨＬ６０細胞から得られたタンパク質群でも、同様の結果が得られた。
（試験例３）
Ｕ９３７細胞、Ｃｏｌｏ２０１細胞（陰性対照）、及びヒトＮＫ細胞であるＫＨＹＧ−１細胞（陽性対照）を用い、５μＭのＡｒａＣを培地に添加し、培養を行った。培養開始の直後（０ｈ）、１時間後、３時間後、及び５時間後に、培地から細胞を回収し、細胞からタンパク質群を抽出した。タンパク質群の量を測定し、一定量のタンパク質群を常法の電気泳動法により分子量分画した。
常法のウェスタンブロット法により、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの発現を検出した。この結果を図４に示す。図４に示されるように、ｇｒａｎｚｙｍｅ ＭがＵ９３７細胞において発現されていることが分かった。がん細胞であるＵ９３７細胞におけるｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの発現は、従来知られていない新規な発見である。なお、Ｕ９３７細胞におけるｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの発現量は、ＡｒａＣの投与時間の経過とは無関係であった。なお、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍ抗体としては、Ａｂｇｅｎｔ社のＧＺＭＭ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（カタログ番号：ＡＰ６７９２ｃ）を用いた。
常法のウェスタンブロット法により、ｐｅｒｆｏｒｉｎの発現を検出した。この結果を図５に示す。図５に示されるように、Ｕ９３７細胞においてＡｒａＣによるｐｅｒｆｏｒｉｎの発現が誘導されないことが確認された。なお、ｐｅｒｆｏｒｉｎ抗体としては、Ｍａｂｔｅｃｈ社のＭｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ Ｐｅｒｆｏｒｉｎ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（カタログ番号：３４６５−６−２５０）を用いた。
従って、ＡｒａＣ投与によるＮＰＭの切断は、Ｕ９３７細胞が発現するｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍによるものであるが、ｐｅｒｆｏｒｉｎの発現誘導とは無関係であるものと考えられた。
（試験例４）
ＨＬ６０細胞、及びＫＨＹＧ−１細胞（陽性対照区）を用いた点を除き、試験例３と同様の条件で、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍ及びｐｅｒｆｏｒｉｎの発現を検討した。この結果を図６に示す。図６に示されるように、ＨＬ６０細胞でも、ｐｅｒｆｏｒｉｎの発現は認められなかったが、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍが発現されていることが確認された。なお、ＨＬ６０細胞におけるｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍは、ＡｒａＣ投与後の時間経過に依存して発現量が亢進される傾向を示した。
従って、ＡｒａＣ投与によるＮＰＭの切断は、ＨＬ６０細胞が発現するｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性化によるものであるが、従来知られているｐｅｒｆｏｒｉｎが関与しないことが示唆された。
（試験例５）
試験例１と同様の条件（５μＭ ＡｒａＣ）で、Ｕ９３７細胞、ＨＬ６０細胞、及びＫＨＹＧ−１細胞（陽性対照区）を培養し、培養開始の直後（０ｈ）、３時間後、５時間後及び７時間後に、培地から細胞を回収し、細胞からタンパク質群を抽出した。
タンパク質群３０μｇを、測定用バッファ（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）に導入し、基質を濃度２００μＭの量で添加した後、３７℃で１時間インキュベートし、ＯＤ４０５ｎｍの吸光度を測定した。なお、基質は、Ｓａｍｉ Ｍａｈｒｕｓ， Ｗａｌｔｅｒ Ｋｉｓｉｅｌ， ａｎｄ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｓ． Ｃｒａｉｋ． Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍ ｉｓ ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｔｈａｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ９， ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９， ｐｐ．５４２７５−５４２８２，２００４を参考にして、合成したものである。この結果を図７に示す。図７における縦軸は、吸光度に基づき算出されたｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性相対値である。
図７に示されるように、ＡｒａＣ投与後の時間経過とともに、Ｕ９３７細胞及びＨＬ６０細胞におけるｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性が増大することが分かった。
次に、セリンプロテアーゼ阻害剤（５０μＭ ＴＰＣＫ）を培地に投与し、同じ条件でＵ９３７細胞を７時間培養し、回収したタンパク質群を用い、上と同様に吸光度を測定した。この結果を図８に示す。図８における縦軸は、吸光度に基づき算出されたｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性相対値である。
図８に示されるように、ＡｒａＣ投与によるＵ９３７細胞中のｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性増大は、セリンプロテアーゼ阻害剤で有意に（＊＊Ｐ＜０．０１）抑制されることから、実際にｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍであることが推察された。
（試験例６）
ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍに特異的な阻害剤であるＡｃ−ＫＶＰＬ−ＣＭＫを終濃度０．７５ｍｇ／ｍｌとなる量で培地（５μＭ ＡｒａＣ）に添加し、プレインキュベートした。各々５×１０５個の細胞（Ｕ９３７細胞及びＨＬ６０細胞）を４８ウェルプレートに播種し、１ウェルあたり２００μｌの培地にて培養を開始した。培養開始１４時間後に、トリパンブルー法（細胞懸濁液とトリパンブルー溶液とを１：１で混合し、血算盤にのせて、光学顕微鏡を用いて細胞数をカウントする）で、生細胞の数を測定した。なお、Ａｃ−ＫＶＰＬ−ＣＭＫは、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの３次構造に基づき、合成したものである（Ｌ． Ｗｕ ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００９； １８３：４２１−４２９．）。この結果を図９及び１０に示す。
図９及び１０に示されるように、ＨＬ６０細胞及びＵ９３７細胞のいずれにおいても、ＡｒａＣとともにｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍ特異的阻害剤を投与した群では、ＡｒａＣ単独を投与した群に比べ、生細胞数の有意な回復（ＨＬ６０細胞では＊＊Ｐ＜０．０１、Ｕ９３７細胞では＊Ｐ＜０．０５）が見られた。これにより、ＡｒａＣによるＵ９３７細胞及びＨＬ６０細胞における細胞死は、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性化により誘導されるものであることが証明された。なお、特異的阻害剤の単独投与群と、対照群との間で、生細胞数に有意差が確認されなかったことから、単独で細胞数に影響を与えない濃度の特異的阻害剤が投与されていることが確認された。
（試験例７）
ヒト固形がん細胞であるＨｅｌａ細胞を用いて、固形がんの治療薬として従来使用されているＣＤＤＰ５０μＭのｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍ活性に及ぼす作用を、試験例５と同様の条件で、Ｈｅｌａ細胞を２４時間培養して検討した。この結果を図１１に示す。図１１における縦軸は、吸光度に基づき算出されたｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性相対値であり、横軸において、「ｃｏｎｔｒｏｌ」は基質ありかつＣＤＤＰなし、「ＣＤＤＰ」は基質ありかつＣＤＤＰ添加、インキュベーション時間が「１０ｍｉｎ」（１０分）、「８ｈｒ」（８時間）、「２１ｈｒ」（２１時間）の試験群である。８時間と２１時間の試験群で、それぞれの時間のｃｏｎｔｒｏｌと比較し、それぞれ有意な差（８時間で＊Ｐ＜０．０５、２１時間で＊＊Ｐ＜０．０１）が認められ、時間経過でｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性が増大することが分かった。
Ｈｅｌａ細胞を２４時間培養し、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍ特異的阻害剤によるＣＤＤＰによる細胞死の回復について検討した。この結果を図１２に示す。図１２に示すように、Ｈｅｌａ細胞においても、ＣＤＤＰとともにｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍ特異的阻害剤を投与した群では、ＣＤＤＰ単独を投与した群に比べ、生細胞数の有意な回復（＊Ｐ＜０．０５）が見られた。これにより、ＣＤＤＰによるＨｅｌａ細胞の細胞死も、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性化により誘導されるものであることが証明された。
（試験例８）
段落００５９に記載した条件で、ＫＹＳＥ１８０細胞、ＫＹＳＥ４５０細胞、ＨＴ２９細胞、ＨＭＹ−１細胞、Ａ５４９細胞、ＬＫ２細胞を７時間培養し、回収したタンパク質群を用い、吸光度を測定した。この結果を図１３に示す。図１３における縦軸は、吸光度に基づき算出されたｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性相対値である。
図１３に示されるように、いずれの細胞においても、発現レベルは低いがｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性が確認された。この結果は、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍが多種多様のがん細胞において発現されており、多くのがん細胞が本発明で使用され得ることを裏付けるものである。
（試験例９）
Ｕ９３７細胞およびＨｅｌａ細胞で、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの存在（細胞内局在）を明らかにする実験（ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの特異的抗体を用いた免疫組織染色）を行った。
具体的に、Ｕ９３７細胞を冷メタノール処理した後、１０％ＦＢＳ入りのＰＢＳ溶液をブロッキングバッファとしてブロッキングを行った。その後、１次抗体として抗Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍ抗体（ブロッキングバッファにて２５倍に希釈）を、２次抗体として抗ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ４８８（ブロッキングバッファにて１，０００倍に希釈）を用いて免疫染色を行った。また、対照として、抗ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ４８８のみ（ブロッキングバッファにて１，０００倍に希釈）で染色した。いずれにおいても、ＤＡＰＩ溶液（同人化学社製、Ｄ５２３）の２００倍希釈液を用いて細胞核を免疫染色した。この結果を図１４Ａ及びＢにそれぞれ示す。また、同様の処理をＨｅｌａ細胞について行った結果を図１４Ｃ及びＤにそれぞれ示す。なお、図１４において、強い白色で見られる部分がＡｌｅｘａ４８８（つまりｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍタンパク質）、弱い白色（灰色）で見られる部分がＤＡＰＩ染色部分（つまり細胞核）、にそれぞれ相当する。
図１４に示されるように、Ｕ９３７細胞およびＨｅｌａ細胞のいずれにおいても、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍタンパク質が細胞内に局在することが分かった。このことは、本発明で奏されるがん細胞の細胞死誘導が、がん細胞内に存在するｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性化によるという機構を裏付けるものである。

Claims (10)

  1. 被検物質をがん細胞に投与する工程と、
    前記がん細胞が発現するｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性を検出し、前記活性の増大が確認された前記被検物質を選択する工程と、を有する抗がん剤のスクリーニング方法。
  2. 被検物質をがん細胞に投与する工程と、
    前記がん細胞が発現するｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性化により誘導される前記がん細胞の細胞死の有無を検出し、前記細胞死が確認された前記被検物質を選択する工程と、を有する抗がん剤のスクリーニング方法。
  3. 前記がん細胞は、固形がん細胞又は血液がん細胞である請求項１又は２記載の方法。
  4. 前記がん細胞にｐｅｒｆｏｒｉｎを投与しない請求項１から３いずれか記載の方法。
  5. 前記被検物質は、低分子化合物である請求項１から４いずれか記載の方法。
  6. ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性を増大する物質を有効成分とする、細胞死を誘導する抗がん剤。
  7. ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性を増大する物質がＡｒａＣで、血液がん細胞の細胞死を誘導する請求項６記載の抗がん剤。
  8. 血液がんが白血病である請求項７記載の抗がん剤。
  9. ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｍの活性を増大する物質がシスプラチンで、固形がん細胞の細胞死を誘導する請求項６記載の抗がん剤。
  10. 固形がんが子宮頸がんである請求項９記載の抗がん剤。
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