CN111041025B - 基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制备方法 - Google Patents

基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于结合N‑乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制备方法，含有启动子、目的基因、特异性蛋白酶剪切序列、能结合N‑乙酰半乳糖胺的多肽GBD序列依次连接而成的DNA片段的质粒载体通过转录得到mRNA，在T4连接酶的作用下与DNA‑嘌呤霉素连接体相连接，通过蛋白翻译，并采用特异性蛋白酶进行剪切，得到mRNA‑嘌呤霉素‑GBD复合物，在N‑乙酰半乳糖胺转移酶作用下，与GBD蛋白序列结合形成mRNA‑嘌呤霉素‑GBD‑GalNAc复合物，从而对mRNA进行GalNAc修饰，在mRNA药物递送过程中，达到精准给药的目的，增加了mRNA药物分子的药效。

Description

基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制备方法。
背景技术
去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是数量丰富的一种异源低聚物的内吞型受体，主要存在于肝脏实质细胞朝向窦状隙一侧的细胞膜表面，具有对糖的特异性，是肝细胞特异性表达的一种内吞型受体。近年来，利用ASGPR的高亲和性配体N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)作为靶向分子，在核酸药物，如小干扰RNA(Small interferingRNA，siRNA)的肝靶向递送方面取得了突破性进展。尽管该受体已被发现多年，但基于该受体及其配体的信使RNA(Messenger RNA,mRNA)递送系统未能取得突破，原因在于，现有技术手段无法实现mRNA与GalNAc的有效耦合。
目前，mRNA向细胞内的递送可以通过不同的方法实现，例如电穿孔，声孔效应，显微注射或基于高分子化合物的细胞转染，但这些方法对细胞是相对有毒的，临床转化具有一定难度。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制备方法，通过全新的mRNA合成与修饰策略，实现对成熟mRNA分子的GalNAc修饰，从而实现mRNA肝脏靶向性药物递送对创新基础研究、新型药物设计与开发均具有十分重要的意义。
对此，本发明采用的技术方案为：
一种用于构建基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子的DNA片段，其特征在于：所述DNA片段包括启动子、目的基因、特异性蛋白酶剪切序列、能结合N-乙酰半乳糖胺的多肽GBD(GlaNAc Binding Domain,GBD)序列依次连接而成。
采用此技术方案，该DNA片段可以用于构建基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子。
作为本发明的进一步改进，所述GBD序列为SEQ ID No.1-5中的一种或几种的组合。
作为本发明的进一步改进，所述目的基因的序列如SEQ ID No.6或7所示。其中，所述的目的基因可以替换为其他的基因，可以根据治疗不同的疾病进行选择相应的目的基因。
作为本发明的进一步改进，所述特异性蛋白酶剪切序列为带有GBD序列的T2A、P2A、E2A、F2A、TEV、VLP1和/或SUMO特异性蛋白酶酶切序列中的一种或几种。
作为本发明的进一步改进，所述启动子为T3或T7或SP6启动子。
本发明还公开了一种基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子，其包括mRNA分子，所述mRNA分子为采用包含如上所述的DNA片段的质粒通过体外转录得到，所述mRNA分子的序列依次包含5’帽子、目的基因序列、特异性蛋白酶剪切序列、多肽GBD蛋白；所述多肽GBD蛋白为所述GBD序列通过核糖体翻译得到；所述mRNA分子的GBD序列端通过嘌呤霉素连接GBD蛋白，所述GBD蛋白通过酶催化反应连接N-乙酰半乳糖胺。
采用此技术方案，以上述DNA片段为模板在体外转录合成含有5’帽子、目的基因序列、特异性蛋白酶剪切序列、GBD序列的mRNA分子；在T4连接酶的作用下，mRNA分子与DNA-嘌呤霉素连接体结合，并形成mRNA-嘌呤霉素复合体；通过体外翻译系统，嘌呤霉素通过核糖体A位连接到融合蛋白序列的尾部，形成mRNA-嘌呤霉素-GBD-特异性蛋白酶剪切序列-基因功能蛋白复合物；对此产物进行特异性蛋白酶剪切，得到mRNA-嘌呤霉素-GBD复合物。
嘌呤霉素(Puromycin)是转运RNA(tRNA,transfer RNA)的类似物，在转录过程中能够结合到核糖体的A位并与正在合成的多肽片段形成肽键并阻止肽段的延伸。此外嘌呤霉素还可以结合到RNA或DNA的3’端，利用这些性质，通过将带有嘌呤霉素的特殊肽段结合到RNA分子3’端，可以形成一个肽段-RNA的融合分子(peptide-RNA fusion product)。本发明的技术方案，基于这一原理，设计并合成mRNA-肽段融合分子，通过在特殊肽段上进行GalNAc修饰实现mRNA分子与GalNAc的耦合，在N-乙酰半乳糖胺转移酶作用下，N-乙酰半乳糖胺特异性的与GBD蛋白序列结合，形成mRNA-嘌呤霉素-GBD-GalNAc复合物，使得mRNA分子能靶向性肝脏细胞，从而实现mRNA药物分子的特异性递送。
本发明还公开了一种如上所述的基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1，根据所递送的组织、器官或细胞选取特异性细胞表面受体，并设计能结合N-乙酰半乳糖胺的多肽GBD序列，并将启动子序列、目的基因序列、特异性蛋白酶剪切序列、GBD序列组合克隆到质粒载体中，得到质粒DNA；
步骤S2，以步骤S1的质粒DNA为模板进行体外转录，得到含有5’帽子、目的基因序列、特异性蛋白酶剪切序列、GBD序列的mRNA序列；
步骤S3，在T4连接酶的作用下，所述mRNA分子与DNA-嘌呤霉素连接体结合，并形成mRNA-嘌呤霉素复合体；
步骤S4，将步骤S3得到的mRNA-嘌呤霉素复合体进行体外翻译，所述mRNA-嘌呤霉素复合体被核糖体翻译出基因功能蛋白-特异性蛋白酶剪切序列-GBD的融合蛋白序列；
步骤S5，翻译结束时，嘌呤霉素通过核糖体A位连接到所述融合蛋白序列的尾部，形成mRNA-嘌呤霉素-GBD-特异性蛋白酶剪切序列-基因功能蛋白复合物；
步骤S6，对步骤S5得到的产物采用特异性蛋白酶进行剪切，mRNA-嘌呤霉素-GBD-特异性蛋白酶剪切序列-基因功能蛋白复合物中特异性蛋白酶剪切序列-基因功能蛋白部分被剪切，得到mRNA-嘌呤霉素-GBD复合物；
步骤S7，在N-乙酰半乳糖胺转移酶作用下，N-乙酰半乳糖胺特异性的与GBD蛋白序列结合，形成mRNA-嘌呤霉素-GBD-GalNAc复合物。
作为本发明的进一步改进，所述GBD序列如SEQ ID No.1-5所示。
SEQ ID No.1
GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGC
SEQ ID No.2
GGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGC
SEQ ID No.3
GGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGC
SEQ ID No.4
GGCAGCGGCAGCGGCAGC
SEQ ID No.5
AGCAGCAGC
作为本发明的进一步改进，所述DNA-嘌呤霉素连接体的DNA的序列如SEQ ID No.8所示；
SEQ ID No.8
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACC
作为本发明的进一步改进，步骤S1中，所述质粒载体改造自pCDNA3.1。
本发明还公开了一种如上所述的基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子的应用，所述基于N-乙酰半乳糖胺的mRNA组织特异性递送物质用于制备特异性药物递送的mRNA药物中，3’端连接有N-乙酰半乳糖胺，通过N-乙酰半乳糖胺与肝脏细胞表面唾液酸糖蛋白受体特异性结合引物细胞内吞，从而使mRNA进入细胞进行表达。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
采用本发明的技术方案，通过将mRNA药物分子3’端连接一段能耦合GalNAc的多肽序列，将GalNAc连接到mRNA-多肽复合物中，实现对成熟mRNA分子的GalNAc修饰；解决了现有的GalNAc缀合技术只能实现GalNAc直接与短片段RNA耦合的难题。进一步的，利用肝脏细胞上N-乙酰半乳糖胺形成连接有能特异性结合特定的目标细胞，从而增加mRNA药物分子的药效，解决了核酸药物在药物递送过程中的靶向递送的技术难题，实现了不依赖于物理方法和化学转染试剂的方式，通过对mRNA进行GalNAc修饰达到组织特异性递送的目的。
附图说明
图1是本发明一种基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子的制备方法的流程示意图；其中a)为质粒DNA中DNA片段的示意图；b)为以质粒DNA为模板进行体外转录得到的mRNA与DNA-嘌呤霉素连接体待结合的示意图；c)为mRNA-嘌呤霉素复合体的示意图；d)mRNA-嘌呤霉素复合体进行体外翻译的示意图；e)为翻译结束后得到的mRNA-嘌呤霉素-GBD-特异性蛋白酶剪切得到mRNA-嘌呤霉素-GBD复合物的示意图；f)为mRNA-嘌呤霉素-GBD复合物与GalNAc耦合的示意图；g)为最终得到的mRNA-嘌呤霉素-GBD-GalNAc复合物的示意图。
图2是本发明的GalNAc介导的mRNA肝脏细胞递送系统的原理示意图，其中，GalNAc-mRNA耦合物通过结合肝脏细胞表面ASGPR引起细胞内吞，从而使得mRNA进入细胞。
图3是本发明的GalNAc-mRNA肝脏细胞递送系统的优化的示意图。其中，三联GalNAc-mRNA耦合物对肝脏细胞的转染效率最高。
图4是本发明的GalNAc-mRNA肝脏细胞递送系统与对比例在肝脏细胞中表达绿色荧光蛋白(GFP)的对比示意图。
图5是本发明的GalNAc-mRNA肝脏细胞递送系统与对比例在体内递送荧光素酶(Luc)到肝脏组织的结果示意图。
具体实施方式
为了本发明更容易理解，下面对本发明的具体实施方式结合附图作进一步的详细说明。
一种用于构建基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子的DNA片段，所述DNA片段包括启动子、目的基因、特异性蛋白酶剪切序列、能结合N-乙酰半乳糖胺的多肽GBD序列依次连接而成。
进一步的，所述GBD序列为SEQ ID No.1-5中的一种或几种的组合。
所述目的基因的序列如SEQ ID No.6或7所示。
所述特异性蛋白酶剪切序列为带有GBD序列的T2A、P2A、E2A、F2A、TEV、VLP1和/或SUMO特异性蛋白酶酶切序列中的一种或几种。
所述启动子为T3或T7或SP6启动子。
基于上述构件的DNA片段，本发明公开了基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子，其包括mRNA分子，所述mRNA分子为采用包含如上所述的DNA片段的质粒通过体外转录得到，所述mRNA分子的序列依次包含5’帽子、目的基因序列、特异性蛋白酶剪切序列、多肽GBD蛋白；所述多肽GBD蛋白为所述GBD序列通过核糖体翻译得到；所述mRNA分子的GBD序列端通过嘌呤霉素连接GBD蛋白，所述GBD蛋白通过酶催化反应连接N-乙酰半乳糖胺。
所述基于N-乙酰半乳糖胺的mRNA组织特异性递送物质采用以下步骤制备得到：
步骤S1，如图1所示，根据所递送的组织，器官或细胞选取特异性细胞表面受体，并设计一段能结合N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的多肽序列(GBD)，并将相关克隆元件组合克隆到pCDNA3.1质粒载体中。
步骤S2，以步骤S1的质粒DNA为模板进行体外转录，体外转录后生成的mRNA序列含有5’帽子、基因序列、带有GBD序列的T2A、P2A、E2A、F2A、TEV、VLP1和/或SUMO特异性蛋白酶酶切序列中的一种或几种的序列。
步骤S3，在T4连接酶的作用下mRNA分子可与DNA-嘌呤霉素连接体(DNAPuromycine Linker)结合，形成mRNA-嘌呤霉素复合体；
步骤S4，将步骤S3得到的mRNA-嘌呤霉素复合体进行体外翻译，所述mRNA-嘌呤霉素复合体被核糖体翻译出基因功能蛋白-特异性蛋白酶剪切序列-GBD的融合蛋白序列。
步骤S5，翻译结束时，嘌呤霉素通过核糖体A位连接到所述融合蛋白序列的尾部，形成mRNA-嘌呤霉素-GBD-特异性蛋白酶剪切序列-基因功能蛋白复合物。
步骤S6，对步骤S5得到的产物采用特异性蛋白酶进行剪切，在2A肽自我剪切作用下或TEV、VLP1、SUMO特异性蛋白酶作用下，mRNA-嘌呤霉素-GBD-特异性蛋白酶剪切序列-基因功能蛋白复合物中特异性蛋白酶剪切序列-基因功能蛋白部分被剪切，得到mRNA-嘌呤霉素-GBD复合物。
步骤S7，在N-乙酰半乳糖胺转移酶作用下，N-乙酰半乳糖胺特异性的与GBD蛋白序列结合，形成mRNA-嘌呤霉素-GBD-GalNAc复合物。
其中，所述DNA-嘌呤霉素连接体的序列如SEQ ID No.8所示；所述GBD序列如SEQIDNo.1-5所示。
进一步的，步骤S1中，所述质粒载体改造自pCDNA3.1。
上述基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子用于制备特异性药物递送的mRNA药物中，形成GalNAc介导的mRNA肝脏细胞递送系统，该系统中，3’端连接有N-乙酰半乳糖胺，通过N-乙酰半乳糖胺与肝脏细胞表面唾液酸糖蛋白受体特异性结合引物细胞内吞，从而使mRNA进入细胞进行表达，如图2所示。
GBD-GalNAc序列中的GBD有多种设计方案，基于不同的设计，可以根据需要只结合1个GalNAc的GBD，结合2个GalNAc的GBD，结合3个GalNAc的GBD，或结合n个GalNAc的GBD；进一步优选的，采用三联GalNAc-mRNA耦合物对肝脏细胞的转染效率最高，对比结果如图3所示。
下面通过具体的实施例进行进一步的举例说明，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子，其为具有肝脏细胞特异性结合能力的新型mRNA药物。其中，mRNA分子的GalNAc修饰通过N-乙酰半乳糖胺转移酶结合到mRNA-嘌呤霉素-GBD分子的GBD蛋白序列上，形成mRNA-嘌呤霉素-GBD-GalNAc分子。嘌呤霉素连接GBD多肽序列；所述mRNA分子为采用包含上述DNA片段的质粒通过体外转录得到，所述mRNA分子的序列依次包含5’帽子、目的基因序列、特异性蛋白酶剪切序列、能结合N-乙酰半乳糖胺的多肽GBD序列，所述GBD多肽为所述GBD序列通过核糖体翻译得到，其采用如下步骤制备得到：
步骤S1，根据递送组织为在肝脏细胞，选取目的基因为绿色荧光蛋白mWasabi，并设计一段能结合N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的多肽序列(GBD)。将启动子序列、目的基因序列、特异性蛋白酶剪切序列、GBD序列组合克隆到pCDNA3.1质粒载体中，得到质粒DNA。
本实施例中，所述GBD序列为SEQ ID No.1-5中的一种或几种的组合。
SEQ ID No.1
GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGC
SEQ ID No.2
GGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGC
SEQ ID No.3
GGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGC
SEQ ID No.4
GGCAGCGGCAGCGGCAGC
SEQ ID No.5
AGCAGCAGC
本实施例采用如SEQ ID No.2序列所示的GBD。
所述目的基因的序列如SEQ ID No.6所示。
SEQ ID No.6
GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGAAGCTTAGCCATGGCTTCCCGCCGGCGGTGGCGGCGCAGGATGATGGCACGCTGCCCATGTCTTGTGCCCAGGAGAGCGGGATGGACCGTCACCCTGCAGCCTGTGCTTCTGCTAGGATCAATGTG
所述特异性蛋白酶剪切序列为带有GBD序列的T2A、P2A、E2A、F2A、TEV、VLP1和/或SUMO特异性蛋白酶酶切序列中的一种或几种。本实施例中，采用的特异性蛋白酶剪切序列为Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)，如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示。
所述启动子为T3或T7或SP6启动子。本实施例采用T7启动子，序列如SEQ ID No.11所示：
SEQ ID No.11：TAATACGACTCACTATAGG
所述DNA-嘌呤霉素连接体的DNA的序列如SEQ ID No.8所示；
SEQ ID No.8：AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACC
步骤S2，以步骤S1的质粒DNA为模板进行体外转录，体外转录后生成的mRNA序列含有5’帽子、基因序列、带有GBD序列的T2A、P2A、E2A、F2A、TEV、VLP1和/或SUMO特异性蛋白酶酶切序列中的一种或几种序列。
步骤S3，在T4连接酶的作用下，mRNA分子可与DNA-嘌呤霉素连接体(DNAPuromycine Linker)结合，形成mRNA-嘌呤霉素复合体；
步骤S4，将步骤S3得到的mRNA-嘌呤霉素复合体进行体外翻译，所述mRNA-嘌呤霉素复合体被核糖体翻译出基因功能蛋白-特异性蛋白酶剪切多肽序列-GBD多肽的融合蛋白序列。
步骤S5，翻译结束时，嘌呤霉素通过核糖体A位连接到所述融合蛋白序列的尾部，形成mRNA-嘌呤霉素-GBD-特异性蛋白酶剪切序列-基因功能蛋白复合物。
步骤S6，对步骤S5得到的产物采用特异性蛋白酶进行剪切，在2A肽自我剪切作用下或TEV、VLP1、SUMO特异性蛋白酶作用下，mRNA-嘌呤霉素-GBD-特异性蛋白酶剪切序列-基因功能蛋白复合物中特异性蛋白酶剪切序列-基因功能蛋白部分被剪切，得到mRNA-嘌呤霉素-GBD多肽复合物。
步骤S7，在N-乙酰半乳糖胺转移酶作用下，N-乙酰半乳糖胺特异性的与GBD蛋白序列结合，形成mRNA-嘌呤霉素-GBD-GalNAc复合物。
采用mRNA-嘌呤霉素-GBD-GalNAc复合物，能与肝脏细胞表面ASGPR受体特异性结合，实现mRNA的特异性肝脏递送。
采用上述基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子用于制备特异性药物递送的mRNA药物，形成GalNAc介导的mRNA肝脏细胞递送系统，3’端连接有N-乙酰半乳糖胺，通过N-乙酰半乳糖胺与肝脏细胞表面唾液酸糖蛋白受体特异性结合引物细胞内吞，从而使mRNA进入细胞进行表达。通过对比实验显示，如图4所示，采用包含该基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子的递送系统与现有mRNA、mRNA/LNP递送系统相比，在肝脏细胞中能更加高效的表达绿色荧光蛋白(GFP)。
实施例2
一种基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子，其采用如下步骤制备得到：
步骤S1，根据递送组织为在肝脏细胞，选取目的基因为荧光素酶(Luc)，并设计一段能结合N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的多肽序列(GBD)，并将相关克隆元件组合克隆到pCDNA3.1质粒载体中。其中，质粒DNA中DNA片段包括启动子、目的基因、特异性蛋白酶剪切序列、能结合N-乙酰半乳糖胺的多肽GBD序列依次连接而成。
本实施例中，所述GBD序列采用如SEQ ID No.2序列所示的GBD。
所述目的基因的序列如SEQ ID No.7所示。
SEQ ID No.7
GTGAGCAAGGGCGAGGAGACCACAATGGGCGTAATCAAGCCCGACATGAAGATCAAGCTGAAGATGGAGGGCAACGTGAATGGCCACGCCTTCGTGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCAAGCCCTACGACGGCACCAACACCATCAACCTGGAGGTGAAGGAGGGAGCCCCCCTGCCCTTCTCCTACGACATTCTGACCACCGCGTTCAGTTACGGCAACAGGGCCTTCACCAAGTACCCCGACGACATCCCCAACTACTTCAAGCAGTCCTTCCCCGAGGGCTACTCTTGGGAGCGCACCATGACCTTCGAGGACAAGGGCATCGTGAAGGTGAAGTCCGACATCTCCATGGAGGAGGACTCCTTCATCTACGAGATACACCTCAAGGGCGAGAACTTCCCCCCCAACGGCCCCGTGATGCAGAAGGAGACCACCGGCTGGGACGCCTCCACCGAGAGGATGTACGTGCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGACGTCAAGATGAAGCTGCTGCTGGAGGGCGGCGGCCACCACCGCGTTGACTTCAAGACCATCTACAGGGCCAAGAAGGCGGTGAAGCTGCCCGACTATCACTTTGTGGACCACCGCATCGAGATCCTGAACCACGACAAGGACTACAACAAGGTGACCGTTTACGAGATCGCCGTGGCCCGCAACTCCACCGACGGCATGGACGAGCTGTACAAG
本实施例中，采用的特异性蛋白酶剪切序列为
Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)，如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示。所述启动子为T3或T7或SP6启动子。
本实施例采用T7启动子，序列如SEQ ID No.11所示：
SEQ ID No.11：TAATACGACTCACTATAGG
所述DNA-嘌呤霉素连接体中的DNA的序列如SEQ ID No.8所示；
SEQ ID No.8
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACC
步骤S2，以步骤S1的质粒DNA为模板进行体外转录，体外转录后生成的mRNA序列含有5’帽子，基因序列，带有GBD序列的T2A、P2A、E2A、F2A、TEV、VLP1和/或SUMO特异性蛋白酶酶切序列中的一种或几种序列。
步骤S3，在T4连接酶的作用下mRNA分子可与DNA-嘌呤霉素连接体(DNAPuromycine Linker)结合，形成mRNA-嘌呤霉素复合体；
步骤S4，将步骤S3得到的mRNA-嘌呤霉素复合体进行体外翻译，所述mRNA-嘌呤霉素复合体被核糖体翻译出基因功能蛋白-特异性蛋白酶剪切序列-GBD的融合蛋白序列。
步骤S5，翻译结束时，嘌呤霉素通过核糖体A位连接到所述融合蛋白序列的尾部，形成mRNA-嘌呤霉素-GBD-特异性蛋白酶剪切序列-基因功能蛋白复合物。
步骤S6，对步骤S5得到的产物采用特异性蛋白酶进行剪切，在2A肽自我剪切作用下或TEV、VLP1、SUMO特异性蛋白酶作用下，mRNA-嘌呤霉素-GBD-特异性蛋白酶剪切序列-基因功能蛋白复合物中特异性蛋白酶剪切序列-基因功能蛋白部分被剪切，得到mRNA-嘌呤霉素-GBD复合物。
步骤S7，在N-乙酰半乳糖胺转移酶作用下，N-乙酰半乳糖胺特异性的与GBD蛋白序列结合，形成mRNA-嘌呤霉素-GBD-GalNAc复合物。
采用上述基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子用于制备特异性药物递送的mRNA药物，形成GalNAc-mRNA递送系统。通过对比实验显示，如图5所示，该GalNAc-mRNA递送系统与现有mRNA、mRNA/LNP递送系统相比，能更加高效的递送荧光素酶(Luc)到肝脏组织。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳市瑞吉生物科技有限公司
<120> 基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制备方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagc 45
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcggcggca gcggcggcgg cagcggcggc ggcagc 36
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcggcagcg gcggcagcgg cggcagc 27
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcagcggca gcggcagc 18
<210> 5
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agcagcagc 9
<210> 6
<211> 840
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60
gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120
aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180
gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240
cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300
aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360
aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420
ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480
atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540
cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600
ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660
ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagaagctt 720
agccatggct tcccgccggc ggtggcggcg caggatgatg gcacgctgcc catgtcttgt 780
gcccaggaga gcgggatgga ccgtcaccct gcagcctgtg cttctgctag gatcaatgtg 840
<210> 7
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgagcaagg gcgaggagac cacaatgggc gtaatcaagc ccgacatgaa gatcaagctg 60
aagatggagg gcaacgtgaa tggccacgcc ttcgtgatcg agggcgaggg cgagggcaag 120
ccctacgacg gcaccaacac catcaacctg gaggtgaagg agggagcccc cctgcccttc 180
tcctacgaca ttctgaccac cgcgttcagt tacggcaaca gggccttcac caagtacccc 240
gacgacatcc ccaactactt caagcagtcc ttccccgagg gctactcttg ggagcgcacc 300
atgaccttcg aggacaaggg catcgtgaag gtgaagtccg acatctccat ggaggaggac 360
tccttcatct acgagataca cctcaagggc gagaacttcc cccccaacgg ccccgtgatg 420
cagaaggaga ccaccggctg ggacgcctcc accgagagga tgtacgtgcg cgacggcgtg 480
ctgaagggcg acgtcaagat gaagctgctg ctggagggcg gcggccacca ccgcgttgac 540
ttcaagacca tctacagggc caagaaggcg gtgaagctgc ccgactatca ctttgtggac 600
caccgcatcg agatcctgaa ccacgacaag gactacaaca aggtgaccgt ttacgagatc 660
gccgtggccc gcaactccac cgacggcatg gacgagctgt acaag 705
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaacc 29
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser
1 5
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
taatacgact cactatagg 19

Claims (4)

1.基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子，其特征在于：其包括mRNA分子，所述mRNA分子采用DNA片段的质粒通过体外转录得到，所述mRNA分子的序列依次包含5’帽子、目的基因序列、特异性蛋白酶剪切序列、多肽GBD蛋白序列；多肽GBD蛋白为所述多肽GBD蛋白序列通过核糖体翻译得到；所述mRNA分子的GBD序列端通过嘌呤霉素连接体连接GBD蛋白，GBD蛋白通过酶催化反应连接N-乙酰半乳糖胺；
所述DNA片段包括启动子、目的基因、特异性蛋白酶剪切序列、能结合N-乙酰半乳糖胺的多肽GBD序列依次连接而成；
所述GBD序列如SEQ ID No.2所示；
所述目的基因的序列如SEQ ID No.6或7所示；
所述特异性蛋白酶剪切序列为Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)，如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；
所述启动子为T3或T7或SP6启动子；
所述嘌呤霉素连接体的序列如SEQ ID No.8所示。
2.一种如权利要求1所述的基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤S1，根据所递送的组织、器官或细胞选取特异性细胞表面受体，并设计能结合N-乙酰半乳糖胺的多肽GBD序列，并将启动子序列、目的基因序列、特异性蛋白酶剪切序列、GBD序列组合克隆到质粒载体中，得到质粒DNA；
步骤S2，以步骤S1的质粒DNA为模板进行体外转录，得到含有5’帽子、目的基因序列、特异性蛋白酶剪切序列、GBD序列的mRNA序列；
步骤S3，在T4连接酶的作用下，所述mRNA分子与DNA-嘌呤霉素连接体结合，并形成mRNA-嘌呤霉素复合体；
步骤S4，将步骤S3得到的mRNA-嘌呤霉素复合体进行体外翻译，所述mRNA-嘌呤霉素复合体被核糖体翻译出基因功能蛋白-特异性蛋白酶剪切序列-GBD的融合蛋白序列；
步骤S5，翻译结束时，嘌呤霉素通过核糖体A位连接到所述融合蛋白序列的尾部，形成mRNA-嘌呤霉素-GBD-特异性蛋白酶剪切序列-基因功能蛋白复合物；
步骤S6，对步骤S5得到的产物采用特异性蛋白酶进行剪切，mRNA-嘌呤霉素-GBD-特异性蛋白酶剪切序列-基因功能蛋白复合物中特异性蛋白酶剪切序列-基因功能蛋白部分被剪切，得到mRNA-嘌呤霉素-GBD复合物；
步骤S7，在N-乙酰半乳糖胺转移酶作用下，N-乙酰半乳糖胺特异性的与GBD蛋白序列结合，形成mRNA-嘌呤霉素-GBD-GalNAc复合物；
步骤S3中所述DNA-嘌呤霉素连接体的序列如SEQ ID No.8所示；
步骤S6中特异性蛋白酶为Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)，如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示。
3.根据权利要求2所述的基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述质粒载体改造自pCDNA3.1。
4.一种如权利要求1所述的基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子的应用，其特征在于：用于制备特异性递送的mRNA药物中，3’端连接有N-乙酰半乳糖胺，通过N-乙酰半乳糖胺与肝脏细胞表面唾液酸糖蛋白受体特异性结合引物细胞内吞，从而使mRNA进入细胞进行表达。
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