DE19542404A1 - Chimäre Oligomere mit RNA-Spaltungsaktivität - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft chimäre Oligomere mit RNA- Spaltungsaktivität sowie deren Verwendung zur Spaltung von RNA- Substraten in vitro und in vivo.

Ein Beispiel für katalytische RNA-Moleküle, welche ein gegebenes spezifisches RNA-Substrat erkennen und spalten können, sind die Hammerkopf-Ribozyme (Hotchins et al, Nucleic Acids Res. 14 (1986) 3627; Keese und Symons in: Viroids and viroid - like pathogens, J.J. Semanchik, Hrsg. (CRC-Press, Boca Raton, Florida, (1987), S.1-47). Das katalytische Zentrum der Hammerkopf-Ribozyme enthält drei Stämme und kann durch benachbarte Sequenzbereiche der RNA oder aber auch durch Bereiche gebildet werden, die durch viele Nukleotide voneinander getrennt sind. Fig. 1 zeigt schematisch eine solche katalytisch aktive Hammerkopf-Struktur. Die Stämme sind mit den Bezeichnungen I, II und III versehen. Die Numerierung der Nukleotide erfolgt gemäß der Standardnomenklatur für Hammer­ kopf-Ribozyme (Hertel et al., Nucleic Acids Res. 20 (1992), 3252).

Die Konsensus-Sequenz der katalytischen Kernstruktur ist bei Ruffner und Uhlenbeck (Nucleic Acids Res. 18 (1990), 6025-6029) angegeben. Von Perriman et al. (Gene 113 (1992), 157-163) wurde mittlerweile gezeigt, daß diese Struktur auch Variationen enthalten kann, z. B. natürlich vorkommende Nukleotidinsertionen, z. B. N⁹^λ und N^λ¹², oder tolerierbare Modifikationen, wie etwa R^15.1=G. So enthält der positive Strang der Satelliten-RNA von Tabak-Ringspotvirus keine der beiden Nukleotidinsertionen, während der +RNA-Strang des Virusoids von Luzernen-Transient-Streak-Virus (vLTSV) eine N⁹^λ = U-Insertion enthält, die ohne Aktivitätsverlust zu C oder G mutiert werden kann (Sheldon und Symons, Nucleic Acids Res. 17 (1989), 5679-5685) . Weiterhin ist in diesem speziellen Fall N⁷= A und R^15.1=A. Andererseits ist der Minusstrang des Carnation-Stunt associated Viroid (- CarSV) ziemlich ungewöhnlich, da er beide Nukleotidinsertionen, d. h. N^λ¹²= A und N⁹^λ = C enthält (Hernandez et al. Nucleic Acids Res. 20 (1992), 6323-6329). In diesem Viroid ist N⁷= A und R^15.1= A. Weiterhin zeigt diese spezielle Hammerkopf-Struktur trotz des offeneren Zentralstamms eine sehr wirksame selbstkatalytische Spaltung.

Die Einsatzmöglichkeiten für Hammerkopf-RNA-Enzyme reichen von der Gewinnung von RNA-Restriktionsenzymen bis zur spezifischen Inaktivierung der Expression von Genen in Zellen, z. B. in tierischen, menschlichen oder pflanzlichen Zellen und in Prokary­ onten, Hefen und Plasmodien. Ein besonderes biomedizinisches Interesse beruht auf der Tatsache, daß viele Krankheiten ein­ schließlich vieler Tumorformen im Zusammenhang mit der Expression spezifischer Gene stehen. Die Inaktivierung solcher Gene durch Spaltung der zugehörigen mRNA würde einen möglichen Weg zur Kontrolle und schließlich Behandlung solcher Krankheiten dar­ stellen. Ferner besteht ein großes Bedürfnis zur Entwicklung von antiviral oder antimikrobiell wirksamen Arzneimitteln, wobei die RNA-Enzyme möglicherweise solches Mittel sein könnten, da die virale Expression selektiv durch Spaltung von viralen oder mikrobiellen RNA-Molekülen blockiert werden kann.

Die derzeit vielversprechendsten Varianten von Arzneimitteln zur spezifischen Inaktivierung der Expression von Genen sind modifi­ zierte Oligonukleotide, die einen Block von Deoxyribonukleotiden im mittleren Bereich des Moleküls enthalten (Giles et al., Nucleic Acids Res. 20 (1992), 763-770). Diese Deoxyribonukleotide bilden mit RNA ein DNA-RNA-Hybrid, dessen RNA-Strang von der zellulären RNAse H gespalten wird. Ein Nachteil dieser Oligonukleotide für in vivo-Anwendungen besteht jedoch in ihrer geringen Spezifität, da eine Hybridbildung und somit eine Spaltung auch an uner­ wünschten Positionen von RNA-Molekülen stattfinden kann. Weiterhin gehen die DNA-Sequenzen unerwünschte Wechselwirkungen mit zellulären Proteinen ein.

Bisherige Versuche zur rekombinanten Expression von katalytisch wirksamen RNA-Molekülen der Zelle durch Transfektion der Zelle mit dem entsprechenden Gen haben sich als nicht sehr wirksam erwiesen, da zur Inaktivierung von spezifischen RNA-Substraten eine sehr hohe Expression erforderlich war. Außerdem ist eine allgemeine Anwendbarkeit durch die derzeit zur Verfügung stehenden Vektorsy­ steme nicht möglich. Auch die direkte Verabreichung von unmodifi­ zierten RNA-Enzymen ist aufgrund der Sensitivität von RNA gegenüber Abbau durch RNAsen und ihren Wechselwirkungen mit Proteinen unmöglich.

Zur exogenen Verabreichung von Hammerkopf-Ribozymen müssen daher chemisch modifizierte Wirksubstanzen verabreicht werden (vgl. z .B. Heidenreich et al., J. Biol. Chem. 269 (1994), 2131-2138; Kiehntopf et al., EMBO J. 13 (1994), 4645-4652; Paolella et al., EMBO J. 11 (1992), 1913-1919 und Usman et al., Nucleic Acids Symp. Ser. 31 (1994), 163-164).

DE-OS 42 16 134 beschreibt derartige chemisch modifizierte Wirksubstanzen auf Basis synthetischer katalytischer Oligonu­ kleotidstrukturen mit einer Länge von 35-40 Nukleotiden, die zur Spaltung einer Nukleinsäure-Zielsequenz geeignet sind und modifizierte Ribonukleotide enthalten, die am 2′-O-Atom der Ribose eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinyl­ gruppe mit 1-10 Kohlenstoffatomen enthalten. Weiterhin werden Oligonukleotide beschrieben, welche die zuvorgenannten modifizier­ ten Nukleotidbausteine enthalten, und eine Hammerkopf-Struktur ausbilden. Diese Oligonukleotide sind zur Spaltung spezifischer RNA-Substrate in der Lage. Es werden Beispiele für Oligonukleotide mit einem aktiven Zentrum beschrieben, das eine Länge von 14 Nukleotiden aufweist. Dieses aktive Zentrum enthält mehrere Ribonukleotide, welche die Empfindlichkeit gegenüber RNA-spalten­ den Enzymen erhöhen. Ein weiterer Nachteil ist die Länge des aktiven Zentrums, die oft zu einer unspezifischen Hybridisierung führen kann.

WO 95/11304 beschreibt RNA-spaltende Nukleinsäuren mit einem aktiven Zentrum, das frei von Ribonukleotid-Bausteinen ist, aber dafür Deoxyribonukleotide enthält. Die im aktiven Zentrum verwendeten Deoxyribonukleotide bewirken jedoch eine sehr geringe RNA-Spaltungsaktivität. So wurde berichtet, daß ein 13-mer Deoxyribozym des "GAAA"-Typs auf Basis von LTSV nicht in der Lage war, ein 41-mer Oligoribonukleotidsubstrat zu spalten, während das entsprechende 13-mer Ribozym eine hervorragende katalytische Aktivität zeigte (Jeffries und Symons, Nucleic Acids Res. 17 (1989), 1371-1377).

Weiterhin führt die Verwendung einer größeren Anzahl von Deoxy­ ribonukleotidbausteinen in den Hybridisierungsarmen oder im aktiven Zentrum aufgrund einer Aktivierung von RNAse H zu einem Verlust der Spezifität, da auch mit der gewünschten Zielsequenz verwandte Sequenzen gespalten werden können. Darüber hinaus sind katalytische DNA-Oligomere aufgrund von Wechselwirkungen mit Proteinen für in vivo-Anwendungen nicht besonders gut geeignet.

Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand somit darin, RNA-spaltende chimäre Oligomere bereitzustellen, bei denen die Nachteile des Standes der Technik mindestens teilweise beseitigt sind. Insbesondere sollten RNA-spaltende chimäre Oligomere bereitgestellt werden, die gleichzeitig eine hohe Stabilität und eine hohe Wirksamkeit und Spezifität aufweisen sowie für in vivo-Anwendungen geeignet sind.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein chimäres Oligomer mit RNA- Spaltungsaktivität, das eine Struktur der Formel (I) aufweist:

5′-X-Z-Y-3′ (I)

worin X und Y oligomere Sequenzen darstellen, die Bausteine aus Nukleotiden oder/und Nukleotidanaloga enthalten und zur Ausbildung einer spezifischen Hybridisierung des Oligomers mit einem RNA- Substrat beitragen,
worin X und Y jeweils mindestens einen Baustein enthalten, der von Deoxyribonukleotiden und Ribonukleotiden verschieden ist, worin Z das aktive Zentrum des chimären Oligomers darstellt, das eine Struktur der Formeln (IIIa), (IIIb), (IVa) oder (IVb) aufweist:

5′-G¹²A¹³A¹⁴R^15.1-3′ (IIIa)

5′-N^g¹²G¹²A¹³A¹⁴R^15.1-3′ (IIIb)

5,-C³U⁴G⁵A⁶N⁷G⁸A⁹-3′ (IVa)

5′-C³U⁴G⁵A⁶N⁷G⁸A⁹N⁹^g-3′ (IVb)

worin die Bausteine der Strukturen (IIIa), (IIIb), (IVa), (IVb) ausgewählt sind aus Nukleotiden oder/und Nukleotidanaloga,
worin die Bausteine eine Struktur der Formel (II) aufweisen:

worin B einen Rest bedeutet, der insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Adenin-9-yl (A), Cytosin-1-yl (C), Guanin-9- yl (G), Uracil-1-yl (U), Uracil-5-yl (ψ), Hypoxanthin-9-yl (I), Thymin-1-yl (T), 5-Methylcytosin-1-yl (5MeC), 2, 6-Diaminopurin-9- yl (AminoA), Purin-9-yl (P), 7-Deazaadenin-9-yl (c⁷A), 7-Deazagua­ nin-9-yl (c⁷G), 5-Propinylcytosin-1-yl (5-pC) und 5-Propinylura­ cil-1-yl (5-pU),
V unabhängig eine O, S, NH oder CH₂-Gruppe ist,
W unabhängig H oder OH oder ein gerad- oder verzweigtkettiges Alkyl, Alkoxy, Alkenyl, Alkenyloxy, Alkinyl oder Alkinyloxy mit 1 bis 10 C-Atomen ist, das gegebenenfalls durch eine oder mehrere Halogen-, Cyano-, Amino-, Carboxy-, Ester-, Ether-, Carboxamid- Hydroxyl- oder/und Mercaptogruppen substituiert sein kann, oder aus -COOH, -CONH₂, -CONHR¹, -CONR¹R², -NH₂, -NHR¹, -NR¹R², -NHCOR¹, -SH, -SR¹, -F, -ONH₂, -ONHR¹, -ONR¹R², -NHOH, -NHOR¹, -NR²OH und NR²OR¹ ausgewählt ist, wobei R¹ und R² unabhängig unsubstituierte oder substituierte Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppen wie zuvor definiert bedeuten,
D und E Reste bedeuten, die zusammen eine Phosphodiester oder Phosphorothioatdiesterbindung zwischen benachbarten Nukleosiden oder Analoga bilden oder zusammen ein Analog einer internukleosi­ dischen Bindung bilden,
worin die Strukturen (IIIa) oder (IIIb) nicht mehr insgesamt als zwei Deoxyribonukleotide enthalten und
die Strukturen (IVa) oder (IVb) nicht mehr insgesamt als vier Deoxyribonukleotide enthalten und
worin G jeweils unabhängig einen Baustein gemäß Formel (II) bedeutet, worin B aus G, I und c⁷G ausgewählt ist;
A jeweils unabhängig einen Baustein gemäß Formel (II) bedeutet, worin B aus A, AminoA, P und c⁷A ausgewählt ist;
U jeweils unabhängig einen Baustein gemäß Formel (II) bedeutet, worin B aus U, ψ, T und 5-pU ausgewählt ist;
C jeweils unabhängig einen Baustein gemäß Formel (II) bedeutet, worin B aus C, 5MeC und 5-pC ausgewählt ist;
R jeweils unabhängig einen Baustein gemäß Formel (II) bedeutet, worin B aus G, I, c⁷G, A, AminoA, P und c⁷A ausgewählt ist,
N jeweils unabhängig einen Baustein gemäß Formel (II) bedeutet.

Die monomeren Bausteine der das aktive Zentrum flankierenden Sequenzen X und Y sind Nukleotide oder/und Nukleotidanaloga und werden so gewählt, daß sie mit einem gegebenen RNA-Substrat spezifisch hybridisieren und zusammen mit dem aktiven Zentrum Z eine Struktur, insbesondere eine Hammerkopf-Struktur, ausbilden können, die eine spezifische Spaltung des RNA-Substrats bewirkt.

Die Nukleotidbausteine können einerseits aus Ribonukleotiden ausgewählt werden. Die Zahl von Ribonukleotiden soll jedoch möglichst gering sein, da die Anwesenheit von Ribonukleotid- Bausteinen die Stabilität des Oligomers in vivo stark reduziert. Insbesondere sollten die flankierenden Bereiche X und Y (und auch das aktive Zentrum Z) an den von Pyrimidinnukleotiden eingenomme­ nen Positionen keine natürlichen Ribonukleotid-Bausteine, sondern modifizierte Bausteine enthalten.

Auch die Verwendung einer größeren Zahl von Deoxyribonukleotiden ist für die flankierenden Sequenzen X und Y weniger bevorzugt, da ansonsten unerwünschte Wechselwirkungen mit Proteinen auftreten bzw. die Ausbildung einer RNAse H-sensitiven DNA-RNA-Hybrids erfolgen kann. Vorzugsweise enthalten daher die flankierenden Sequenzen höchstens jeweils 1 und besonders bevorzugt gar kein Ribonukleotid und höchstens eine kontinuierliche Abfolge von maximal 3 und insbesondere maximal 2 Deoxyribonukleotiden.

Vorzugsweise werden die Bausteine der flankierenden Sequenzen X und Y aus Nukleotiden oder/und Nukleotidanaloga ausgewählt, z. B. aus Bausteinen der Struktur (II), die auch für das aktive Zentrum Z verwendet werden. Bevorzugte modifizierte Bausteine sind solche, worin W jeweils unabhängig aus gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkoxy-, Alkenyl-, Alkenyloxy-, Alkinyl- oder Alkinyl­ oxyresten mit 1-10 C-Atomen ausgewählt ist. Besonders bevorzugte Substituenten sind beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Allyl, Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Allyloxy, Hydroxyethyloxy und Methoxy­ ethyloxy. Es können jedoch auch andere modifizierte Bausteine verwendet werden, z. B. Nukleotidanaloga, die an der 2′-Position der Pentose Aminogruppen, substituierte Aminogruppen, Halogen­ gruppen oder Sulfhydrylgruppen enthalten.

Die internukleosidische Verbindung zwischen zwei Nukleosid- Bausteinen kann durch Phosphodiesterbindungen oder durch modi­ fizierte Phosphobindungen erfolgen, z. B. durch Phosphothioat­ gruppen oder andere Bindungen, wie sie z. B. in DE-OS 42 16 134 beschrieben sind.

Darüber hinaus können die flankierenden Bereiche X und Y auch Nukleotidanaloga, wie etwa peptidische Nukleinsäuren, (siehe z. B. Nielsen et al., Science 254 (1991), 1497-1500 und Dueholm et al., J. Org. Chem. 59 (1994), 5767-5773), enthalten. In diesem Fall kann die Verknüpfung der einzelnen Bausteine beispielsweise durch Säureamidbindungen erfolgen. Die Verknüpfung von flankierenden Bereichen X und Y, die auf peptidischen Nukleinsäuren basieren, mit einem auf Nukleotidbausteinen basierendem aktiven Zentrum Z kann entweder durch geeignete Linker erfolgen (siehe z. B. Petersen et al., BioMed. Chem. Lett. 5 (1995), 1119-1121) oder direkt (Bergmann et al., Tetrahedron Lett. 36 (1995), 6823-6826).

Die flankierenden Bereiche X und Y enthalten vorzugsweise jeweils unabhängig voneinander 3-40 und besonders bevorzugt 5-10 Nukleo­ tid- bzw. Nukleotidanaloga-Bausteine.

Die Bausteine der flankierenden Bereiche X und Y enthalten Nukleobasen oder Analoga, die mit den in natürlichen RNA-Molekülen vorkommenden Basen hybridisieren können. Die Nukleobasen werden vorzugsweise ausgewählt aus den natürlich vorkommenden Basen (Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin und Uracil) sowie Analoga davon, z. B. 2,6-Diaminopurin, Hypoxanthin, 5-Methylcytosin, Pseudouracil, 5-Propinyluracil, 5-Propinylcytosin etc., die eine spezifische Anbindung an die Ziel-RNA ermöglichen.

In den Bereichen X und Y ist eine feste Bindung an das RNA- Substrat bevorzugt, so daß folgende Nukleobasen als Bausteine besonders bevorzugt sind: 2,6-Diaminopurin anstelle von Adenin; Thymin oder 5-Propinyluracil anstelle von Uracil; 5-Methylcytosin oder 5-Propinylcytosin anstelle von Cytosin. Weiterhin bevorzugt sind 2-Amino-2′-O-Alkyladenosine (Lamm et al., Nucleic Acids Res. 19 (1991), 3193-3198). Außerdem können aromatische Systeme mit den Positionen 4 und 5 von Uracil verknüpft werden, wie etwa B = Phenoxazin, wodurch dramatische Verbesserungen in der Doppel­ strangstabilität erhalten werden (Lin et al., J.Am. Chem.Soc. 117 (1995), 3873-3874).

Das 3′-Ende des erfindungsgemäßen Oligomers kann gegen einen Abbau durch Exonukleasen zusätzlich geschützt werden, z. B. durch Verwendung eines modifizierten Nukleotidbausteins, der auch an der 3′-Position des Ribosezuckers modifiziert ist, z. B. durch eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Alkoxy-, Alkenyl-, Alkenyl­ oxy-, Alkinyl- oder Alkinyloxygruppe, wie oben definiert. Eine weitere Möglichkeit zur zusätzlichen Stabilisierung am 3′-Ende der erfindungsgemäßen Oligomere gegen Exonukleaseabbau ist eine 3′-3′- verknüpfte Dinukleotidstruktur oder/und die Anwesenheit von zwei modifizierten Phosphobindungen, z . B. zwei Phosphothioatbindungen.

Weiterhin kann die erfindungsgemäße chimäre Oligomerstruktur mit einer prosthetischen Gruppe verknüpft werden, um ihre zelluläre Aufnahme zu verbessern oder/und eine spezifische zelluläre Lokalisierung zu ermöglichen. Beispiele solcher prosthetischer Gruppen sind Polyaminosäuren (z. B. Polylysin), Lipide, Hormone oder Peptide. Die Verknüpfung dieser prosthetischen Gruppen wird üblicherweise über das 3′- oder 5′-Ende des Oligomers entweder direkt oder mittels geeigneter Linker (z. B. Linker auf Basis von 6-Aminohexanol oder 6-Mercaptohexanol etc.) durchgeführt. Diese Linker sind kommerziell erhältlich und die zur Verknüpfung der prosthetischen Gruppen mit dem Oligomer geeigneten Techniken sind dem Fachmann geläufig.

Die Vergrößerung der Hybridisierungsgeschwindigkeit ist für die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Oligomere besonders bedeutsam, da auf diese Weise eine hohe Aktivität bei geringen Konzentrationen erreicht wird. Dies ist insbesondere für kurzle­ bige oder wenig häufig auftretende RNA-Substrate von Bedeutung. Eine starke Beschleunigung der Hybridisierung kann beispielsweise durch Kopplung positiv geladener Peptide, die z. B. mehrere Lysinreste enthalten, an das Ende eines Oligonukleotids erreicht werden (Corey, J. Am. Chem. Soc. 117 (1995), 9373-9374). Ein erfindungsgemäßes chimäres Oligomer kann unter Verwendung der oben beschriebenen Linker auf einfache Weise derart modifiziert werden. Alternativ kann die Hybridisierungsgeschwindigkeit auch durch Einbau von Bausteinen erhöht werden, die Sperminylreste enthalten (Schmid und Behr, Tetrahedron Lett. 36 (1995), 1447-1450). Solche Modifikationen der chimären Oligomere verbessern auch die Bindefähigkeit an RNA-Substrate, die Sekundärstrukturen aufweisen.

Das aktive Zentrum Z des erfindungsgemäßen chimären Oligomers enthält Nukleotid-Bausteine, die modifiziert sind sowie gegebe­ nenfalls eine geringe Anzahl von natürlichen Nukleotiden, d. h. Ribonukleotiden oder/und Deoxyribonukleotiden.

Vorzugsweise werden die Nukleotid-Bausteine im Bereich Z ausge­ wählt aus Verbindungen, die nur schwach mit Ribonukleotiden hybridisieren können, z. B. modifizierte Nukleotide, die am 2′-C- Atom der Ribose eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe, mit vorzugsweise 1-5 C-Atomen enthalten. Weiterhin bevorzugt sind auch Substituenten, ausgewählt aus gegebenenfalls substituierten Alkoxy-, Alkenyloxy- oder Alkinyl­ oxygruppen mit 1-5 C-Atomen. Besonders bevorzugte Nukleobasen im Bereich Z sind A oder P, U, C und G oder I.

Gemäß der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das aktive Zentrum Z des chimären Oligomers eine Struktur der Formeln (IIIa) oder (IIIb). Ein derartiges Oligomer kann ein RNA-Substrat spalten, das eine Struktur der Formeln (Va) oder (Vb) enthält:

5′-U^16.1H¹⁷-S-C³U⁴G⁵A⁶N⁷G⁸A⁹R^10.1-3′ (Va)

5′-U^16.1H¹⁷-S-C³U⁴G⁵A⁶N⁷G⁸A⁹N⁹^λR^10.1-3′ (Vb)

worin N, H, R, S, G, A, U und C Ribonukleotide darstellen und
N G, A, U oder C bedeutet;
H A, C oder U bedeutet;
R A oder G bedeutet und
S eine zur Bildung einer Haarnadelstruktur fähige RNA- Sequenz mit einer Länge von vorzugsweise 6-60, beson­ ders bevorzugt von 6-20 Basen ist.

Ein Oligomer mit einem aktiven Zentrum (IIIa) oder (IIIb) kann mit einem RNA-Substrat, das eine Struktur der Formeln (Va) oder (Vb) enthält, die in Fig. 2 dargestellte Hammerkopf-Struktur bilden, wobei die Numerierung der Nukleotide entsprechend der Standard- Nomenklatur ist. Vorzugsweise enthält das aktive Zentrum Z (IIIa) oder (IIIb) nicht mehr als vier, besonders bevorzugt nicht mehr als zwei und am meisten bevorzugt nicht mehr als ein Ribonukleo­ tid.

Besonders gute Ergebnisse wurden für Oligomere enthalten, in denen G¹² ein Deoxyribonukleotid, ein Ribonukleotid oder ein Baustein ist, worin W eine gegebenenfalls mit OH substituierte C₁-C₄-Alkyl-, Alkenyl-, Alkoxy- oder Alkenyloxygruppe, insbesondere eine (2- Hydroxyethyloxy)-Gruppe ist. A¹³, A¹⁴ oder/und R^15.1werden vorzugs­ weise aus Bausteinen ausgewählt, worin W eine gegebenenfalls mit OH substituierte C₁-C₄-Alkyl-, Alkenyl-, Alkoxy- oder Alkenyl­ oxygruppe, besonders bevorzugt eine Methoxy-, (2 -Hydroxyethyloxy) und Allyloxy ausgewählt ist. Weiterhin konnte auch ein Oligomer synthetisiert werden, das kein Ribonukleotid und kein Deoxy­ ribonukleotid im aktiven Zentrum Z enthält. Dieses Oligomer enthält an Position G¹² ein 2′-O-(2-Hydroxyethyl)guanosin und an den Positionen A¹³, A¹⁴ und R^15.1jeweils ein 2′-O-(2-Hydroxy­ ethyl) adenosin.

Gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das aktive Zentrum des Oligomers eine Struktur der Formeln (IVa) oder (IVb) und weist Spaltungsaktivität gegenüber einem RNA- Substrat auf, das eine Struktur der Formeln (VIa) oder (VIb) enthält:

5′-Y^11.1G¹²A¹³A¹⁴R^15.1-S-U^16.1H¹⁷-3′ (VIa)

5′-Y^11.1N^λ¹²G¹²A¹³A¹⁴R^15.1-S-U^16.1H¹⁷-3 (VIb)

worin N, H, Y, R, S, G, A, U und C Ribonukleotide darstellen und
N G, A U oder C bedeutet,
H A, C oder U bedeutet,
R A oder G bedeutet,
Y C oder U bedeutet und
S eine zur Bildung einer Haarnadelstruktur fähige RNA- Sequenz mit einer Länge von vorzugsweise 6-60, besonders bevorzugt von 6-20 Basen ist.

Ein Oligomer mit einem aktiven Zentrum (IVa) oder (IVb) bildet mit einem RNA-Substrat, das eine Struktur der Formeln (VIa) oder (VIb) enthält, die in Fig. 3 dargestellte Hammerkopf-Struktur, wobei die Numerierung der Nukleotide entsprechend der Standard-Nomenklatur ist. Das aktive Zentrum Z enthält vorzugsweise keine Pyrimidin- Ribonukleotide. Vorzugsweise enthält Z nicht mehr als sechs, besonders bevorzugt nicht mehr als drei Ribonukleotide.

Falls das aktive Zentrum Z Ribonukleotide enthält, sind somit vorzugsweise ein oder mehrere Bausteine an den Positionen G⁵, A⁶, N⁷ (wenn N⁷ ein Purin ist), G⁸, A⁹ und N⁹λ (wenn N⁹^λ vorhanden und ein Purin ist) Ribonukleotide. Die Bausteine an den Positionen C³, U⁴, N⁷ (wenn N⁷ ein Pyrimidin ist) und N⁹^λ (wenn N⁹^λ vorhanden und ein Pyrimidin ist) sind vorzugsweise Nukleotidanaloga-Bausteine, insbesondere solche Bausteine, worin W eine gegebenenfalls OH- substituierte C₁-C₄ Alkyl-, Alkenyl-, Alkoxy- oder Alkenyloxygruppe oder eine NH₂-Gruppe ist. Besonders bevorzugt sind Bausteine, die nur sehr schwach mit Ribonukleotiden im Substrat hybridisieren können, z. B. solche Nukleotidanaloga, die am 2′-C-Atom der Ribose eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinyl­ gruppe gemäß Formel (II), z. B. eine Allylgruppe, enthalten. Andererseits sind aber auch 2′-O-Nukleotidanaloga bevorzugt. Spezifische Beispiele für geeignete Substituenten sind Methoxy-, (2-Hydroxyethyloxy) -, Allyl, Allyloxy und NH2. Weiterhin werden N⁷ und N⁹^λ, sofern vorhanden, derart ausgewählt, daß ein Minimum an internen Strukturen durch interne Wechselwirkungen entstehen kann. Die bevorzugten Nukleobasen im Bereich Z sind A oder P, U, C und G oder I.

Im folgenden werden Beispiele für geeignete Bausteine innerhalb des aktiven Zentrums der erfindungsgemäßen chimären Oligomere basierend auf Ergebnissen von Standard-Hammerkopf-Ribozymen angegeben: Für chimäre Oligomere des "CUGANGA"-Typs mit einem aktiven Zentrum der Formel (IVa) oder (IVb) sind folgende Bausteine bevorzugt:

Position C³ B=C, V=O, W=Allyloxy; B=C, V=O, W=Allyl
Position U⁴ B=U, V=O, W=Allyloxy; B=U, V=O, W=Allyl
Position G⁵ B=G, V=O, W=Amino,
Position A⁶ B=A, V=O, W=H; B=P, V=O, W=OH
Position N⁷ B=U, V=O, W=Allyloxy; B=C, V=O, W=Allyl
Position G⁸ B=G, V=O, W=Amino; B=I, V=O, W=OH
Position R⁹ B=A, V=O, W=H; B=P, V=O, W=OH; B=A, V=O, W=Allyloxy

Bevorzugt für chimäre Oligomere des "GAAR"-Typs mit einem aktiven Zentrum der Formel (IIIa) oder (IIIb) sind folgende Bausteine:

Position G¹² B=G, V=O, W=H; B=c⁷G, V=O, W=OH; B=G, V=O, W=2-Hydro­ xyethyloxy
Position A¹³ B=A, V=O, W=Allyloxy; B=A, V=O, W= 2-Hydroxyethyloxy;
Position A¹⁴ B=A, V=O, W=Allyloxy; B=P, V=O, W=OH; B=A, V=O, W=2- Hydroxyethyloxy
Position R^15.1 B=A, V=O, W=OH; B=A, V=O, W=2-Hydroxyethyloxy

Zur Identifizierung von RNA-Substraten in Sequenzdatenbanken für die erfindungsgemäßen oligomeren Chimäre können Computeral­ gorithmen verwendet werden. Für oligomere Chimäre mit einem aktiven Zentrum GAAR ist ein derartiger Algorithmus beispielsweise wie folgt (Numerierung gemäß Fig. 2):

i: finde alle C³ UGANGA(N)R-Sequenzen in einer gegebenen mRNA.
ii: identifiziere N^2.1 und finde potentielle N^1.1-N^2.1-Basenpaare (wobei N^1.1 Teil einer N^16.2, U^16.1, H¹⁷, N^1.1-Sequenz sein muß) in einer ca. 30 Nukleotide in 3′-Richtung gelegenen Region von C³.
iii: berechne Stamm-Stabilitäten für Stämme mit den obigen abschließenden N^1.1-N^2.1-Basenpaaren.
iv: sortiere gemäß Stamm-Stabilitäten.

Für chimäre Oligomere mit dem aktiven Zentrum CUGANGA können RNA- Substrate beispielsweise wie folgt ermittelt werden (Numerierung gemäß Fig. 3):

i: finde alle Y(N)GAAR^15.1-Sequenzen in einer gegebenen mRNA.
ii: finde potentielle R^15.1-U^16.1-Basenpaare in einem Bereich ca. 30 Nukleotide in 5′-Richtung von R^15.1, wobei N¹⁷ nicht G sein darf.
iii: berechne Stamm-Stabilitäten für Stämme zu dem obigen ab­ schließenden Basenpaar.
iv: sortiere gemäß Stamm-Stabilitäten.

Ein auf diese Algorithmen basierendes Programm erlaubt eine effiziente Suche in Datenbanken oder Einzelsequenzen. Als Ergebnis enthält man neben einer geeigneten RNA-Zielsequenz auch die Sequenz des zur Spaltung dieser Zielsequenz erforderlichen chimären Oligonukleotids.

Dabei ist es wichtig, auch Motive mit unvollständigen Basenpaaren im Bereich der Stamm-Strukturen I und III zu berücksichtigen, da in diesen Abschnitten mehrere inkomplette Basenpaare (Mismatches) toleriert werden können.

Unter Verwendung eines auf dem obigen Algorithmus basierenden Computerprogramms konnten für Oligomere mit dem aktiven Zentrum "GAAR" etwa 12 000 geeignete Motive in humanen Sequenzen (4,1 × 107 Nukleotide), und etwa 4 000 Motive in viralen Sequenzen (2 × 107 Nukleotide) identifiziert werden. Die Anzahl der Motive für Oligomere mit dem aktiven Zentrum CUGANGA ist ca. 50 000 Motive in humanen Sequenzen, wenn R^15.1= A.

Das minimale Stabilitätserfordernis für die Hammerkopf-Struktur sind drei Basenpaare in Stamm I und drei Basenpaare für Stamm III. Obwohl alle Motive, welche diese Minimalerfordernisse erfüllen, gespalten werden können, hängt die Spaltungseffizienz von der Wechselwirkung der tatsächlichen Erkennungssequenzen und kon­ servierten Nukleotide im aktiven Zentrum ab.

Von den erfindungsgemäßen Oligomeren scheinen die GAAR enthal­ tenden chimären Oligonukleotide weniger sensitiv gegenüber Störungen durch unerwünschte Wechselwirkungen zu sein und sind daher bevorzugt.

RNA-Substrate von chimären Oligomeren mit einem aktiven Zentrum, das eine Struktur der Formeln (IIIa< oder (IIIb) aufweist, sind vorzugsweise humane zelluläre Transkripte und Transkripte von Humanviren. Besonders bevorzugt wird das RNA-Substrat ausgewählt aus der Gruppe, umfassend humane Interleukin-2 mRNA, humane ICAM-1 mRNA, humane TGF-β mRNA, humane Gewebefaktor Prä-mRNA, humane Proteinkinase C-α mRNA, humane Faktor KBF1 mRNA, humane 5- Lipoxygenase mRNA, humane Interleukin-8 RNA, humane Interleukin-5 RNA, humane Interleukin-1 Rezeptor mRNA, humane Interleukin-1-α mRNA, humane 12-Lipoxygenase mRNA, das Transkript des humanen Cytomegalovirus DNA-Polymerase-Gens und ein Transkript des humanen Papillomavirus Typ 8.

Besonders bevorzugte Spaltmotive für Oligomere des "GAAR"-Typs finden sich an folgenden Positionen dieser RNA-Substrate (in Klammern ist die Bezeichnung der betreffenden Sequenz in der EMBL Nucleotide Sequence Database, Ausgabe 43, angegeben):

• - humane Interleukin-2 mRNA (HSIL2R) mit C³ an Position 490 und einer Spaltung nach der Sequenz AUU;
• - humane ICAM-1 (interzelluläres Adhäsionsmolekül-1) mRNA (HSICAM01) mit C³ an Position 1933 und einer Spaltung nach der Sequenz AUU;
• - humane TGF-P (transformierender Wachstumsfaktor β) mRNA (HSTGFB1) mit C³ an Position 1313 und einer Spaltung nach der Sequenz CUC;
• - humane Gewebefaktor Prä-mRNA (HSTFPB) mit C³ an Position 6781 und einer Spaltung nach der Sequenz GUU oder mit C³ an Position 8831 und einer Spaltung nach der Sequenz AUC oder CUU;
• - humane PKC-α (Proteinkinase C-α)mRNA (HSPKCA1) mit C³ an Position 823 und einer Spaltung nach der Sequenz UUC oder UUU;
• - humane Faktor KBF-1 mRNA (HSNFKB34) mit C³ an Position 2619 und einer Spaltung nach der Sequenz UUA;
• - humane 5-Lipoxygenase mRNA (HSLOX5A) mit C³ an Position 296 und einer Spaltung nach der Sequenz GUA;
• - humane Interleukin-8 RNA (HSIL8A) mit C³ an Position 4978 und einer Spaltung nach der Sequenz AUA;
• - humane Interleukin-5 RNA (HSIL5) mit C³ an Position 1896 und einer Spaltung nach der Sequenz AUU oder UUU;
• - humane Interleukin-1 Rezeptor mRNA (HSIL1RA) mit C³ an Position 1485 und einer Spaltung nach der Sequenz AUC;
• - humane Interleukin-1-α mRNA (HSIL1ALPH) mit C³ an Position 1272 und einer Spaltung nach der Sequenz CUU;
• - humane 12-Lipoxygenase mRNA (HSLIPXYG) mit C³ an Position 940 und einer Spaltung nach der Sequenz AUA;
• - Transkript des humanen Cytomegalovirus DNA-Polymerasegens (HEHS5POL) mit C³ an Position 3919 und einer Spaltung nach der Sequenz UUA;
• - ein Transkript des humanen Papillomavirus Typ 8 (PAPPPH8C) mit C³ an Position 3221 und einer Spaltung nach der Sequenz CUU.

Ein besonders bevorzugtes Beispiel für eine Spaltungsstelle in einer humanen mRNA ist die Interleukin-2 mRNA. Die Spaltungsstelle weist die in SEQ ID No. 1 dargestellte Nukleotidsequenz auf. Ein Oligomer des "GAAR"-Typs mit der in SEQ ID No. 2 dargestellten Nukleotidsequenz ist in der Lage, ein entsprechendes RNA-Substrat effizient zu spalten. Auch ein 1,6 Kb langes IL-2 Transkript kann von diesem erfindungsgemäßen Oligomer gespalten werden.

Ein weiteres besonders bevorzugtes Beispiel für ein RNA-Substrat, welches mit chimären Oligomeren des "GAAR"-Typs gespalten werden kann, ist die humane ICAM-1 mRNA. Der für die Spaltung sensitive Bereich weist die in SEQ ID No. 3 dargestellte Nukleotidsequenz auf. Ein RNA-Substrat mit dieser Sequenz kann von einem Oligomer mit der in SEQ ID No. 4 dargestellten Nukleotidsequenz effizient gespalten werden.

Bevorzugte RNA-Substrate für erfindungsgemäße Oligomere des "CUGANGA"-Typs sind ebenfalls humane zelluläre Transkripte und Transkripte von Humanviren. Besonders bevorzugt wird das RNA- Substrat ausgewählt aus der Gruppe, umfassend humane Interleukin-6 mRNA, humane Multiple Drug Resistance (MDR-1) mRNA, humane Monocyten-Chemotaktisches Protein RNA, humane Makrophagen- Scavenger-Rezeptor Typ II mRNA, humane Makrophagen-Scavenger- Rezeptor Typ I mRNA, humane Makrophagen-Inflammatorisches Protein- 1- mRNA, humane p53 RNA, humane jun-B mRNA, humane c-jun RNA, humane Interferon-γ Typ II mRNA, humane Hepatocyten-Wachstums­ faktor mRNA, humane HER2 mRNA, humane Alzheimer′sche Krankheit- Amyloid mRNA, humane Interleukin-1 mRNA, humane 3-Hydroxy-3- methylglutaryl-Coenzym A-Reduktase RNA, humane Angiotensinogen mRNA, humane Angiotensin-konvertierendes Enzym mRNA, humane Acyl- Coenzym A: Cholesterin-Acyltransferase mRNA, humane PDGF-Rezeptor mRNA, humane TNF-Rezeptor mRNA, humane TGF β mRNA, humane NF- Kappa-B p65 Untereinheit mRNA, humane c-myc RNA, humane 12- Lipoxygense mRNA, humane Interleukin-4 RNA, humane Interleukin-10 mRNA, humane basischer FGF mRNA, humane EGF-Rezeptor mRNA, humane c-myb mRNA, humane c-fos RNA, humane bcl-2 mRNA, humane bcl-1 mRNA, humane ICAM-1 mRNA, ein Transkript von humanem Papillomavi­ rus Typ 11 und Transkripte von humanem Papillomavirus Typ 16 und Typ 18.

Spezifische Beispiele für geeignete Substrate sind wie folgt:

• - humane Monocyten-Chemotaktisches Protein RNA (HSMCHEMP) mit Y^11.1 an Position 2183 und einer Spaltung nach der Sequenz GUU,
• - humane Makrophagen-Scavenger-Rezeptor Typ II RNA (HSPHSR2) mit Y^11.1an Position 833 und einer Spaltung nach der Sequenz CUC;
• - humane Makrophagen-Scavenger-Rezeptor Typ I mRNA (HSPHSR1) mit Y^11.1an Position 813 und einer Spaltung nach der Sequenz CUC;
• - humane Makrophagen-Inflammatorisches Protein-1-α mRNA (HSRANTES) mit Y^11.1an Position 629 und einer Spaltung nach der Sequenz CUC;
• - humane p53 RNA (HSP53G) mit Y^11.1an Position 19145 und einer Spaltung nach der Sequenz GUC;
• - humane jun-B mRNA (HSJUNB) mit Y^11.1an Position 357 und einer Spaltung nach der Sequenz GUC;
• - humane C-jun RNA (HSJUNA) mit Y^11.1an Position 3066 und einer Spaltung nach der Sequenz CUC;
• - humane Interferon-γ Typ II mRNA (HSIFNGAMM) mit Y^11.1an Position 720 und einer Spaltung nach der Sequenz GUU;
• - humane Hepatocyten-Wachstumsfaktor mRNA (HSHGF) mit Y^11.1an Position 1197 und einer Spaltung nach der Sequenz GUC oder mit Y^11.1an Position 1603 und einer Spaltung nach der Sequenz GUA;
• - humane HER2 (Tyrosinkinase-Rezeptor) mRNA (HSHER2A) mit Y^11.1an Position 2318 und einer Spaltung nach der Sequenz CUU;
• - humane Alzheimer′sche Krankheit-Amyloid mRNA (HSAMY) mit Y¹¹¹an Position 427 und einer Spaltung nach der Sequenz AUC oder mit Y^11.1an Position 1288 und einer Spaltung nach der Sequenz CUA;
• - humane Interleukin-1 mRNA (HSIL1) mit Y^11.1an Position 113 und einer Spaltung nach der Sequenz AUU;
• - humane3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym A-Reduktase mRNA (HSHMGCOB) mit Y^11.1an Position 257 und einer Spaltung nach der Sequenz CUC;
• - humane Angiotensinogen mRNA (HSANG) mit Y^11.1an Position 2012 und einer Spaltung nach der Sequenz UUC;
• - humane Angiotensin-konvertierendes Enzym mRNA (HSACE) mit Y^11.1 an Position 1818 und einer Spaltung nach der Sequenz GUA;
• - humane Acyl-Coenzym A: Cholesterin-Acyltransferase mRNA (HSACYLCOA) mit Y^11.1an Position 374 und einer Spaltung nach der Sequenz CUA oder mit Y^11.1an Position 830 und einer Spaltung nach der Sequenz GUA;
• - humane PDGF-Rezeptor mRNA (HSPDGFRA) mit y^11.1 an Position 1513 und einer Spaltung nach der Sequenz CUA;
• - humane Tumornekrosefaktor-Rezeptor mRNA (HSTNFRB) mit Y^11.1an Position 502 und einer Spaltung nach der Sequenz CUU oder UUC;
• - humane TGF β mRNA (HSTGFBC) mit Y^11.1an Position 545 und einer Spaltung nach der Sequenz AUC oder mit Y^11.1an Position 2428 und einer Spaltung nach der Sequenz CUC;
• - humane NF-Kappa-B p65 Untereinheit mRNA (HSNFKB65A) mit Y^11.1an Position 937 und einer Spaltung nach der Sequenz UUC oder mit Y^11.1an Position 2195 und einer Spaltung nach der Sequenz CUC;
• - humane c-myc RNA (HSMYCC) mit Y^11.1an Position 4336 und einer Spaltung nach der Sequenz CUU oder mit Y^11.1an Position 3799 und einer Spaltung nach der Sequenz CUA;
• - humane c-myc mRNA (HSMYC1) mit Y^11.1an Position 484 und einer Spaltung nach der Sequenz CUU;
• - humane MDR-1 mRNA (HSMDR1) mit Y^11.1an Position 1513 und einer Spaltung nach der Sequenz AUA;
• - humane 12-Lipoxygenase mRNA (HSLIPXYG) mit Y^11.1an Position 566 und einer Spaltung nach der Sequenz CUC;
• - humane Interleukin-6 mRNA (HSIL6CSF) mit Y^11.1an Position 13 und einer Spaltung nach der Sequenz CUA oder mit Y^11.1an Position 902 und einer Spaltung nach der Sequenz GUA;
• - humane Interleukin-4 RNA (HSIL4A) mit Y^11.1an Position 2500 und einer Spaltung nach der Sequenz GUC;
• - humane Interleukin-10 mRNA (HSIL10) mit Y^11.1an Position 1125 und einer Spaltung nach der Sequenz CUU;
• - humane basischer FGF mRNA (HSGFBF) mit Y^11.1an Position 260 und einer Spaltung nach der Sequenz CUA;
• - humane EGF-Rezeptor mRNA (HSEGFPRE) mit Y^11.1an Position 4778 und einer Spaltung nach der Sequenz AUA oder mit Y^11.1an Position 5508 und einer Spaltung nach der Sequenz UUC;
• - humane c-myb mRNA (HSCMYBLA) mit Y^11.1an Position 448 und einer Spaltung nach der Sequenz GUU;
• - humane c-fos RNA (HSCFOS) mit Y^11.1an Position 1065 und einer Spaltung nach der Sequenz GUU oder mit Y^11.1an Position 3349 und einer Spaltung nach der Sequenz UUU;
• - humane bcl-2 mRNA (HSBCL2C) mit Y^11.1an Position 5753 und einer Spaltung nach der Sequenz UUA;
• - humane bcl-1 mRNA (HSBCL1) mit Y^11.1an Position 3725 und einer Spaltung nach der Sequenz GUC;
• - humane ICAM-1 mRNA (HSICAM01) mit Y^11.1an Position 1998 und einer Spaltung nach der Sequenz GUA;
• - ein Transkript des humanen Papillomavirus Typ 11 (PAPPPH11) mit Y^11.1an Position 2941 und Spaltung nach der Sequenz AUU;
• - ein Transkript des humanen Papillomavirus Typ 16 (PA16) mit Y^11.1 an Position 37 und Spaltung nach der Sequenz GUU;
• - ein Transkript des humanen Papillomavirus Typ 16 (PA16) mit Y^11.1 an Position 1126 und Spaltung nach der Sequenz UUA;
• - ein Transkript des humanen Papillomavirus Typ 16 (PA16) mit Y^11.1 an Position 1322 und Spaltung nach der Sequenz GUA;
• - ein Transkript des humanen Papillomavirus Typ 16 (PA16) mit Y^11.1 an Position 1982 und Spaltung nach der Sequenz AUU;
• - ein Transkript des humanen Papillovavirus Typ 16 (PA16) mit Y^11.1 an Position 6440 und Spaltung nach der Sequenz UUA;
• - Transkript des humanen Papillomavirus Typ 16 L1 Proteingens (PAPHPU111) mit Y^11.1an Position 99 und Spaltung nach der Sequenz GUA;
• - ein Transkript des humanen Papillomavirus Typ 18 (PAPPPH18) mit Y^11.1an Position 896 und Spaltung nach der Sequenz AUA;
• - Transkript des humanen Papillomavirus Typ 18 E6 Proteingens (PARHPVE6) mit Y^11.1an Position 172 und Spaltung nach der Sequenz AUA.

Ein besonders bevorzugtes RNA-Substrat für ein chimäres Oligomer des "CUGANGA"-Typs ist die humane Interleukin-6 mRNA. Der für die Spaltung sensitive Bereich weist die in SEQ ID No. 5 dargestellte Nukleotidsequenz auf. Ein Oligomer mit der in SEQ ID No. 6 dargestellten Nukleotidsequenz kann ein derartiges Substrat effizient spalten.

Noch ein weiteres besonders bevorzugtes Beispiel für ein RNA- Substrat, das durch ein Oligomer des "CUGANGA"-Typs gespalten werden kann, ist die humane MDR-1 mRNA. Der für die Spaltung sensitive Bereich weist die in SEQ ID No. 7 dargestellte Nukleo­ tidsequenz auf. Ein Oligomer mit der in SEQ ID No. 8 dargestellten Nukleotidsequenz kann ein derartiges RNA-Substrat effizient spalten. Auch ein 1,6 kb langes MDR-1 Transkript kann durch dieses Oligomer gespalten werden.

Die erfindungsgemäßen chimären Oligomere weisen gegenüber den Strukturen des Standes der Technik signifikante Vorteile auf. So besitzen die kürzesten, bisher verwendeten Ribozyme eine minimale Länge von 15+N+M Nukleotiden, wobei das aktive Zentrum 15 Nukleotide lang ist und N und M die Länge der Erkennungssequenzen ist (Benseler et al, J. Am. Chem. Soc. 115 (1993), 8483-8484), und enthalten darüber hinaus Ribonukleotide an mindestens fünf Positionen des katalytischen Zentrums (Paolella et al., EMBO J. 11 (1992), 1913-1919 und Yang et al.₁ Biochemistry 31 (1992), 5005-5009).

Die erfindungsgemäßen Oligomere enthalten hingegen nur 4+N+M bzw. 5+N+M Nukleotide (im Falle des "GAAR"-Typs) oder 7+N+M bzw. 8+N+M Nukleotide (im Falle des "CUGANGA"-Typs), wobei N und M vorzugs­ weise jeweils Zahlen im Bereich von 5-10 sind. Weiterhin können sie eine erheblich geringe Zahl von natürlichen Nukleotiden ohne Verlust der Aktivität enthalten. Aufgrund der geringeren Länge und geringeren Anzahl von Ribonukleotiden ergeben sich erhebliche Vorteile sowohl hinsichtlich der Herstellung der Moleküle als auch hinsichtlich der Stabilität in vivo. So besitzt das in Beispiel 2 der vorliegenden Anmeldung beschriebene chimäre Oligomer des "GAAR"-Typs eine Halbwertszeit in aktivem 10%igem humanem Serum von mehreren Tagen. Durch eine weitere Verringerung der Zahl von Ribonukleotiden kann die Stabilität in vivo noch zusätzlich erhöht werden.

Darüber hinaus besitzen die erfindungsgemäßen Oligomere eine sehr hohe in vivo-Aktivität, da die RNA-Spaltung durch Proteinfaktoren unterstützt wird, die im Nukleus oder Cytoplasma der Zelle vorliegen. Beispiele derartiger Proteinfaktoren, die die Aktivität von Hammerkopf-Ribozymen erhöhen können, sind z. B. das Nukleo­ kapsidprotein NCp7 von HIV1 (Müller et al., J. Mol. Biol. 242 (1994), 422-429) und das heterogene nukleäre Ribonukleoprotein A1 (Heidenreich et al., Nucleic Acids Res. 23 (1995), 2223-2228). Somit können lange RNA-Transkripte durch die erfindungsgemäßen Oligomere innerhalb der Zelle höchst effizient gespalten werden.

Noch ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen chimären Oligomere ist das statistisch seltene Auftreten von Spaltmotiven der Formeln (Va) oder (Vb) bzw. (VIa) oder (VIb) (etwa ein Motiv/5000 bp). Dies hat zusammen mit den individuell ausgewählten Erkennungs­ sequenzen zur Folge, daß mittels des entsprechenden chimären Oligomers statistisch nur die gewünschte Spaltung der Ziel-RNA innerhalb im gesamten humanen RNA-Pools stattfindet, während an anderen möglichen Bindungsstellen nur eine unproduktive Bindung, aber keine Spaltung erfolgt. Weiterhin aktivieren die erfindungs­ gemäßen Oligomere aufgrund ihres geringen Gehalts an Deoxyribonu­ kleotiden nicht die RNAse H und verursachen deshalb keine unspezifischen Spaltungen.

Ein weiterer überraschender Vorteil gegenüber Ribozymen des Standes der Technik ist, daß bei den erfindungsgemäßen Strukturen das RNA-Substrat einen großen Teil der Hammerkopf-Struktur bildet, wodurch die Abhängigkeit der Spaltungsaktivität von der Mg²+- Konzentration positiv beeinflußt wird.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff ein- oder mehrere chimäre Oligomere und gegebenenfalls pharmazeutisch verträgliche Hilfs-, Zusatz- und Trägerstoffe enthält. Diese pharmazeutische Zusammensetzung eignet sich hervorragend zur Herstellung eines Mittels für die spezifische Inaktivierung der Expression von Genen in Eukaryonten, Prokaryonten und Viren, insbesondere-von humanen Genen, wie etwa Tumorgenen, oder viralen Genen oder RNA-Molekülen in einer Zelle. Weitere Anwendungsgebiete sind die Inaktivierung der Expression von Pflanzengenen oder Insektengenen. Somit können die erfindungsgemäßen Oligomere als Heilmittel für Menschen und Tiere sowie als Pestizide für Pflanzen eingesetzt werden.

Für therapeutische Anwendungen wird der Wirkstoff vorzugsweise in einer Konzentration von 0,01 bis 10000 µg/kg Körpergewicht, besonders bevorzugt von 0,1 bis 1000 µg/kg Körpergewicht ver­ abreicht. Die Verabreichung kann beispielsweise durch Injektion, Inhalation (z. B. als Aerosol), Spray, oral (z. B. als Tabletten, Kapseln, Dragees etc.), topisch oder rektal (z. B. als Supposito­ rien) erfolgen.

Durch die vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zur spezifi­ schen Inaktivierung der Expression von Genen bereitgestellt, bei dem ein chimäres Oligomer in einer wirksamen Konzentration in eine Zelle aufgenommen wird (Lyngstadaas et al., EMBO J. 14 (1995) in Druck), so daß das Oligomer spezifisch ein vorbestimmtes, in der Zelle vorliegendes RNA-Molekül spaltet, wobei die Spaltung vorzugsweise katalytisch erfolgt. Dieses Verfahren läßt sich sowohl an Zellkulturen in vitro als auch in vivo an lebenden Organismen (Prokaryonten oder Eukaryonten wie etwa Menschen, Tieren oder Pflanzen) durchführen.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der chimären Oligomere als RNA-Restriktionsenzyme sowie ein Reagenzienkit zur Restriktionsspaltung von RNA-Molekülen, der ein chimäres Oligomer sowie geeignete Puffersubstanzen enthält. Das Oligomer und die Puffersubstanzen können dabei in Form von Lösungen, Suspensionen oder Feststoffen, wie etwa Pulvern oder Lyophilisaten, vorliegen. Die Reagenzien können gemeinsam, voneinander getrennt oder gegebenenfalls auch auf einem geeigneten Träger vorliegen. Auch als diagnostisches Mittel oder zur Identifizierung der Funktion unbekannter Gene können die erfin­ dungsgemäßen Oligomere eingesetzt werden.

Weiterhin wird die Erfindung durch folgende Abbildungen und Sequenzprotokolle erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 die schematische Darstellung einer Hammerkopf-Struktur und die entsprechende Nomenklatur;

Fig. 2 eine Hammerkopf-Struktur mit einem erfindungsgemäßen Oligomer des "GAAR"-Typs;

Fig. 3 eine Hammerkopf-Struktur mit einem erfindungsgemäßen Oligomer des "CUGANGA"-Typs;

Fig. 4a eine Hammerkopf-Struktur, die aus einem Interleukin-2 mRNA-Substrat und einem erfindungsgemäßen Oligomer gebildet ist, wobei kleine Buchstaben Ribonukleotide bedeuten;

Fig. 4b die Reaktion der in Fig. 4a dargestellten Strukturen;

Fig. 5a eine Hammerkopf-Struktur, die aus einem ICAM-1 mRNA- Substrat und einem erfindungsgemäßen Oligomer gebildet ist, wobei kleine Buchstaben Ribonukleotide bedeuten;

Fig. 5b die Reaktion der in Fig. 5a dargestellten Strukturen;

Fig. 5c die Reaktion der Fig. 5a dargestellten Strukturen, wenn das chimäre Oligomer 2′-Allyloxynukleotidanaloga in den flankierenden Bereichen aufweist und U durch 2′-Allyl­ oxythymidin ersetzt ist;

Fig. 6a eine Hammerkopf-Struktur, die aus einem Interleukin-6 mRNA-Substrat und einem erfindungsgemäßen Oligomer gebildet ist, wobei kleine Buchstaben Ribonukleotide bedeuten;

Fig. 6b die Reaktion der in Fig. 6a dargestellten Strukturen;

Fig. 7a eine Hammerkopf-Struktur, die aus einem MDR-1 mRNA- Substrat und einem erfindungsgemäßen Oligomer gebildet ist, wobei die kleinen Buchstaben Ribonukleotide bedeu­ ten;

Fig. 7b die Reaktion der in Fig. 7a dargestellten Strukturen;
SEQ ID No. 1 die Nukleotidsequenz des in Fig. 4a dargestellten Interleukin-2 RNA-Substrats;
SEQ ID No. 2 die Sequenz des in Fig. 4a dargestellten RNA-spal­ tenden Oligomers;
SEQ ID No. 3 die Nukleotidsequenz des in Fig. 5a dargestellten ICAM-1 RNA-Substrats;
SEQ ID No. 4 die Nukleotidsequenz des in Fig. 5a dargestellten RNA-spaltenden Oligomers;
SEQ ID No. 5 die Nukleotidsequenz des in Fig. 6a dargestellten Interleukin-6 RNA-Substrats;
SEQ ID No. 6 die Nukleotidsequenz des in Fig. 6a dargestellten RNA-spaltenden Oligomers;
SEQ ID No. 7 die Nukleotidsequenz des in Fig. 7a dargestellten MDR-1 RNA-Substrats und
SEQ ID No. 8 die Nukleotidsequenz des in Fig. 7a gestellten RNA- spaltenden Substrats.

Bei den in SEQ. ID. No. 1-8 angegebenen Sequenzen ist das T am Ende des Nukleotids jeweils über seine 3′-Position mit der 3′- Position des vorletzten Nukleotids gekoppelt (iT).

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern.

Beispiel 1 Spaltung eines Interleukin 2 RNA-Substrats

Es wurde ein Interleukin 2 RNA-Substrat mit der in SEQ ID No. 1 dargestellten Nukleotidsequenz durch chemische Festphasensynthese hergestellt. Weiterhin wurde ein chimäres Oligomer mit der in SEQ ID No. 2 dargestellten Nukleotidsequenz synthetisiert. Synthese und Schutzgruppenentfernung erfolgten beim RNA-Substrat sowie beim chimären Oligomer durch Festphasen-Techniken (Wincott et al., Nucleic Acids Res. 23 (1995), 2677-2684). Die Reinigung erfolgte durch Anionenaustausch-HPLC (Sproat et al., Nucleosides und Nucleotides 14 (1995), 255-273). Die Synthese erfolgte auf einem inversen Thymidinträger (Ortigao et al., Antisense Research and Development 2 (1992), 129-146) basierend entweder auf Aminopropyl­ modifiziertem Controlled Pore Glas oder vorzugsweise Aminomethyl­ polystyrol (McCollum und Andrus, Tetrahedron Letters 32 (1991), 4069-4072). Geeignete geschützte 2′-Methoxynukleosid-3′-O- Phosphoramidite wurden wie von Sproat und Lamond in Oligonucleoti­ des and Analogs - A practical approach, F. Eckstein, Hrsg. (IRL- Press, Oxford, UK, (1991), 49-86) beschrieben, synthetisiert. Die 2′ -Allyloxynukleotidmonomere für die Festphasensynthese wurden ebenfalls nach Standardprozeduren (Sproat in: Methods in Molecular Biology, Vol 20: Protocols for Oligonucleotides und Analogs - Syn­ thesis and Properties, S. Agrawal, Hrsg. (Humana Press, Totowa, New Jersey, (1993), 115-141)) hergestellt.

Die Sequenzen des chimären Oligomers außerhalb des aktiven Zentrums sind aus Nukleotidanalogon-Bausteinen aufgebaut, welche am 2′-C-Atom der Ribose mit einer Methoxygruppe modifiziert sind. Im aktiven Zentrum "GAAA" des Oligonukleotids ist das G¹² an Position 1 ein Ribonukleotid, die Reste A¹³ und A¹⁴ an den Positio­ nen 2 und 3 2′-Methoxy-modifizierte Nukleotide und das M⁵¹ an Position 4 ein Ribonukleotid.

400 pmol Interleukin-2 Substrat wurden mit 400 pmol des Oligomers in Gegenwart von 10 mmol/l MgCI₂ bei pH 7,5 und 37°C in einem Reaktionsvolumen von 100 µl umgesetzt. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und zur Verhinderung einer weiteren Spaltung mit EDTA versetzt. Das zu den verschiedenen Zeitpunkten vorliegende Oligomergemisch wurde dann durch Elektrophorese auf einem 20%-Polyacrylamidgel in Gegenwart von 7 M Harnstoff aufgetrennt und durch Anfärbung mit "Stains-all" sichtbar gemacht.

Das Ergebnis dieser Reaktion ist in Fig. 4b gezeigt. Dort ist ersichtlich, daß mit zunehmender Inkubationsdauer die dem Substrat zugeordnete Bande (40-mer) verschwindet und die Intensität der Banden der Spaltungsprodukte (31-mer und 9-mer) zunehmen.

Ähnliche Ergebnisse, wie in Fig. 4b gezeigt, wurden mit einem Oligomer erhalten, das an Position G¹² ein Deoxyguanosin anstelle eines Guanosins enthält. Auch die folgenden zwei Sequenzen des aktiven Zentrums Z führten zu einer wirksamen Spaltung des 40-mer RNA-Substrats, aber mit einer etwas geringeren Spaltungsrate:

(i) Position G¹²: Guanosin;
Positionen A¹³ und A¹⁴: 2′-O-Methyladenosin;
Position A^15.1: 2′-O-(2-Hydroxyethyl) -Adenosin;
(ii) Position G¹²: Guanosin;
Positionen A¹³, A¹⁴ und A^15.1: 2′-O-(2-Hydroxyethyl)-Adenosin.

Beispiel 2 Spaltung eines ICAM-1 RNA-Substrats

Auf analoge Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden ein ICAM- 1 RNA-Substrat mit der in SEQ ID No. 3 dargestellten Nukleotidse­ quenz und ein RNA-spaltendes Oligomer mit der in SEQ ID No. 4 dargestellten Nukleotidsequenz synthetisiert. Die für das Oligomer verwendeten Nukleotidbausteine waren ebenfalls wie in Beispiel 1 beschrieben, außer daß A¹³ und A¹⁴ Ribonukleotide waren.

Das Ergebnis der Reaktion ist in Fig. 5b dargestellt. Die Reaktionsbedingungen waren wie in Beispiel 1 beschrieben, außer daß 1 nmol Substrat und 100 pmol chimäres Oligomer eingesetzt wurden. Es ist ersichtlich, daß mit zunehmender Inkubationsdauer die Bande des Substrats (43-mer) verschwindet, während die Intensität der Banden der Produkte (34-mer und 9-mer) zunehmen.

Auf analoge Weise wurde ein chimäres Oligomer synthetisiert, das vier Ribonukleotide im aktiven Zentrum Z und 2′-Allyloxy-Nukleo­ tide in den flankierenden Bereichen X und Y enthielt. In den mit U bezeichneten Positionen von X und Y wurde 2′-Allyloxythymidin anstelle von 2′-O-Allyl-Uridin verwendet. Die Ergebnisse der Spaltung des 43-mer-RNA-Substrats durch dieses Oligomer sind in Fig. 5c gezeigt.

Insbesondere für therapeutische Anwendungen sind Oligomere auf Basis von 2′-O-Allyloxy-Nukleotiden aufgrund ihrer stark ver­ ringerten unspezifischen Bindung gegenüber Oligomeren auf Basis von 2′-Methoxy-Nukleotiden stark bevorzugt (Iribarren et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 7747-7751).

Beispiel 3 Spaltung eines Interleukin 6-RNA-Substrats

Es wurden ein Interleukin-6 RNA-Substrat mit der in SEQ ID No. 5 dargestellten Nukleotidsequenz und ein chimäres Oligomer mit der in SEQ ID No. 6 dargestellten Nukleotidsequenz auf analoge Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, synthetisiert. Zur Herstellung des Oligomers wurden 2′-Methoxy-modifizierte Nukleotide bei den Sequenzen außerhalb des aktiven Zentrums verwendet. Für das aktive Zentrum "CUGAUGA" wurden Ribonukleotide verwendet.

Die Durchführung der Reaktion erfolgte wie im Beispiel 1 be­ schrieben. Das Ergebnis ist in Fig. 6b gezeigt. Mit zunehmender Inkubationsdauer wird die Intensität der Bande des Substrats (32- mer) geringer und die Intensität der Banden der Spaltungsprodukte (23-mer und 9-mer) höher.

Beispiel 4 Spaltung eines MDR-1 RNA-Substrats

Es wurden ein MDR-1 RNA-Substrat mit der in SEQ ID No. 7 darge­ stellten Nukleotidsequenz und ein RNA-spaltendes Oligomer mit der in SEQ ID No. 8 dargestellten Nukleotidsequenz auf analoge Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, synthetisiert. Die Synthese des Oligomers erfolgte unter Verwendung der in Beispiel 3 angegebenen Nukleotid-Bausteine.

Die Durchführung der Reaktion war wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Ergebnis ist in Fig. 7b dargestellt.

Beispiel 5 Synthese, Schutzgruppenentfernung und Reinigung eines chimären Oligomers des "GAAA"-Typs zur Spaltung eines RNA-Motivs auf humaner ICAM-1 RNA

Das chimäre Oligomer 5′-CCCCT*CgaaaT*CAT*GT*C-iT, wobei große Buchstaben 2′-Allyloxy-Nukleotide (T* ist 2′-Allyloxythymidin) bedeuten, kleine Buchstaben Ribonukleotide bedeuten und -iT eine 3′-3′-Phosphodiesterbindung zu Deoxythymidin bedeutet, wurde nach der "Trityl-off" -Technik durch Festphasen-ß-Cyanoethyl-Phosphor­ amidit-Technik (Sinha et al., Nucleic Acids Res. 12 (1984), 4539- 4557) in einem 1 µmol Maßstab unter Verwendung eines inversen Thymidinträgers (Ortigao et al., Supra), geschützter 2′-Allyloxy- Nukleotidmonomere (Sproat in Methods in Molecular Biology, Supra) und kommerziell erhältlicher 2′-O-tert. -Butyl-Dimethyl-silyl­ geschützter Ribonukleotidmonomere mit einer verlängerten Kopp­ lungsdauer von 15 min synthetisiert. Am Ende der Synthese wurde das Oligomer vom Controlled Pore Glas - oder Polystyrol-Träger während einer Zeitspanne von 2 h mit 2 ml 33% wäßrigem Ammoni­ ak/Ethanol (3 : 1 v/v) im Synthesegerät abgespalten. Die Lösung wurde dann 6-8 h bei 60°C in einem abgedichteten Reaktionsgefäß gehalten, um alle basenlabilen Schutzgruppen zu entfernen. Das Reaktionsgefäß wurde gekühlt und die Lösung zur Trockene einge­ dampft.

Der Rückstand wurde in 300 µl Ethanol/Wasser (1 : 1 v/v) aufgenommen und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Anschließend wurde die Lösung erneut lyophilisiert.

Die Entfernung von Silylschutzgruppen erfolgte durch Resuspen­ dierung des Rückstands in 200 µl trockenem Triethylamin/Triethyl­ amin · 3 HF/N-Methyl-2-Pyrrolidinon (3 : 4 : 6 v/v/v) und Inkubation für 2 h bei 60°C (Wincott et al., Supra). Das vollständig von Schutzgruppen befreite chimäre Oligomer wurde dann durch Zugabe von 20 µl 3 M wäßrigem sterilem Natriumacetat und nachfolgend 1 ml 1-Butanol präzipitiert. Das Reaktionsgefäß wurde für 15 min bei -20°C gehalten und das Präzipitat durch Zentrifugation für 10 min gesammelt. Der Überstand wurde sorgfältig durch Dekantieren entfernt, das Pellet wurde in 300 µl 80% Ethanol aufgenommen, und die resultierende Lösung wurde lyophilisiert.

Das Rohprodukt wurde zunächst analysiert und dann in vier Aliquots durch Anionenaustauscher-HPLC auf einer Dionex Nukleopak PA-100 Säule (9 × 250 mm) bei 55°C unter Verwendung eines Lithium­ perchloratgradienten von 70-230 mM in Wasser/ Acetonitril (9 : 1 v/v) mit 25 mM Tris pH 7,0 während 30 min gereinigt. Der Hauptpeak wurde gesammelt und das chimäre Oligomer wurde durch Zugabe von 4 Volumina 1- oder 2-Propanol (Sproat et al., (1995) Supra) präzipitiert. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt, gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an gereinigtem Produkt war 2,8 mg.

Claims (47)

1. Chimäres Oligomer mit RNA-Spaltungsaktivität, das eine Struktur der Formel (I) aufweist: 5′-X-Z-Y-3′ (I)worin X und Y oligomere Sequenzen darstellen, die Bausteine aus unmodifizierten Nukleotiden oder/und Nukleotidanaloga enthalten und zur Ausbildung einer spezifischen Hybridisierung des Oligomers mit einem RNA- Substrat beitragen,
worin X und Y jeweils mindestens einen Baustein enthalten, der von Deoxyribonukleotiden und Ribonu­ kleotiden verschieden ist,
worin Z das aktive Zentrum des chimären Oligomers dar­ stellt, das eine Struktur der Formeln (IIIa), (IIIb), (IVa) oder (IVb) aufweist:5′-G¹²A¹³A¹⁴R^15.1-3′ (IIIa)5′-N^λ¹²G¹²A¹³A¹⁴R^15.1-3′ (IIIb)5′-C³U⁴G⁵A⁶N⁷G⁸A⁹-3′ (IVa)5′-C³U⁴G⁵A⁶N⁷G⁸A⁹N⁹^λ-3′ (IVb)worin die Bausteine der Strukturen (IIIa), (IIIb), (IVa), (IVb) ausgewählt sind aus unmodifizierten Nukleotiden oder/und Nukleotidanaloga,
worin die Bausteine eine Struktur der Formel (II) aufweisen: worin B einen Rest bedeutet, der insbesondere ausge­ wählt ist aus der Gruppe, umfassend Adenin-9-yl (A), Cytosin-1-yl (C), Guanin-9-yl (G), Uracil-1-yl(U), Uracil-5-yl (ψ), Hypoxanthin-9-yl (I), Thymin-1-yl (T), 5-Methylcytosin-1-yl (5MeC), 2, 6-Diaminopurin-9- yl (AminoA), Purin-9-yl (P), 7-Deazaadenin-9-yl (c⁷A), 7-Deazaguanin-9-yl (c⁷G), 5-Propinylcytosin-1-yl (5- pC) und 5-Propinyluracil-1-yl (5-pU),
V unabhängig eine O, S, NH oder CH₂-Gruppe ist,
W unabhängig H oder OH oder ein gerad- oder verzweigt­ kettiges Alkyl, Alkoxy, Alkenyl, Alkenyloxy, Alkinyl oder Alkinyloxy mit 1 bis 10 C-Atomen ist, das gegebe­ nenfalls durch eine oder mehrere Halogen-, Cyano-, Amino-, Carboxy-, Ester-, Ether-, Carboxamid-, Hy­ droxyl- oder/und Mercaptogruppen substituiert sein kann, oder aus -COOH, -CONH₂, -CONHR¹, -CONR¹R², -NH₂, -NHR¹, -NR¹R², -NHCOR¹, -SH, -SR¹, -F, -ONH2, -ONHR¹, -ONR¹R², -NHOH, -NHOR¹, -NR²OH und -NR²OR¹ ausgewählt ist, wobei R¹ und R² unabhängig unsubstituierte oder substituierte Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppen wie zuvor definiert bedeuten,
D und E Reste bedeuten, die zusammen eine Phosphodi­ ester oder Phosphorothioatdiesterbindung zwischen benachbarten Nukleosiden oder Analoga bilden oder zusammen ein Analog einer internukleosidischen Bindung bilden,
worin die Strukturen (IIIa) oder (IIIb) nicht mehr insgesamt als zwei Deoxyribonukleotide enthalten und die Strukturen (IVa) oder (IVb) nicht mehr insgesamt als vier Deoxyribonukleotide enthalten und
worin G jeweils unabhängig einen Baustein gemäß Formel (II) bedeutet, worin B aus G, I und c⁷G ausgewählt ist;
A jeweils unabhängig einen Baustein gemäß Formel (II) bedeutet, worin B aus A, AminoA, P und c⁷A ausgewählt ist;
U jeweils unabhängig einen Baustein gemäß Formel (II) bedeutet, worin B aus U, ψ, T und 5-pU ausgewählt ist;
C jeweils unabhängig einen Baustein gemäß Formel (II) bedeutet, worin B aus C, 5MeC und 5-pC ausgewählt ist;
R jeweils unabhängig einen Baustein gemäß Formel (II) bedeutet, worin B aus G, I, c⁷G, A, AminoA, P und c⁷A ausgewählt ist,
N jeweils unabhängig einen Baustein gemäß Formel (II) bedeutet.

2. Oligomer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bereiche X und Y an Pyrimidinpositionen keine Ribonukleotide enthalten.

3. Oligomer nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bereiche X und Y keine Ribonukleotide enthal­ ten.

4. Oligomer nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Bereiche X und Y im wesentlichen aus Baustei­ nen der Struktur (II) bestehen, worin W jeweils unabhängig aus gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkoxy-, Alkenyl-, Alkenyloxy-, Alkinyl- oder Alkinyl­ oxyresten mit 1-10 C-Atomen ausgewählt ist.

5. Oligomer nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Bereiche X und Y jeweils unabhängig 3 bis 40 Bausteine enthalten.

6. Oligomer nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß das aktive Zentrum Z einen oder mehrere Bausteine der Struktur (II) enthält, worin W jeweils unabhängig aus gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkoxy-, Alkenyl-, Alkenyloxy-, Alkinyl- oder Alkinyloxyresten mit 1-5 C-Atomen ausgewählt ist.

7. Oligomer nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine des aktiven Zentrums Z durch Phos­ phodiesterbindungen verknüpft sind.

8. Oligomer nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß das 3′-Ende gegen Exonukleaseabbau geschützt ist.

9. Oligomer nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß das aktive Zentrum Z die Struktur (IIIa) oder (IIIb) aufweist und Spaltungsaktivität gegenüber einem RNA-Substrat besitzt, das eine Struktur der Formeln (Va) oder (Vb) enthält: 5′-U^16.1H¹⁷-S-C³U⁴G⁵A⁶N⁷G⁸A⁹R^10.1-3′ (Va)5′-U^16.1H¹⁷-S-C³U⁴G⁵A⁶N⁷G⁸A⁹N^{9 λ}R^10.1-3′ (Vb)worin N, H, R, S, G, A, U und C Ribonukleotide darstellen und
N G, A, U oder C bedeutet;
H A, C oder U bedeutet;
R A oder G bedeutet und
S eine zur Bildung einer Haarnadelstruktur fähige RNA-Sequenz ist.

10. Oligomer nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß Z die Struktur (IIIa) oder (IIIb) aufweist und nicht mehr als zwei Ribonukleotide enthält.

11. Oligomer nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß Z die Struktur (IIIa) oder (IIIb) aufweist und nicht mehr als ein Ribonukleotid enthält.

12. Oligomer nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß Z die Struktur (IIIa) oder (IIIb) aufweist und kein Ribonukleotid und kein Deoxyribonukleotid ent­ hält.

13. Oligomer nach einem der Ansprüche 9-12, dadurch gekennzeichnet, daß G¹² ein Ribonukleotid, ein Deoxyribonukleotid oder ein Baustein ist, worin W eine gegebenenfalls mit OH substituierte C₁-C₄-Alkyl-, Alkenyl-, Alkoxy- oder Alkenyloxygruppe ist.

14. Oligomer nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß W ein (2-Hydroxyethoxy)-Rest ist.

15. Oligomer nach einem der Ansprüche 9-14, dadurch gekennzeichnet, daß A¹³, A¹⁴ oder/und R^15.1aus Bausteinen ausgewählt sind, worin W eine gegebenenfalls mit OH substitu­ ierte C₁-C₄-Alkyl-, Alkenyl-, Alkoxy- oder Alkenyl­ oxygruppe ist.

16. Oligomer nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß W aus Methoxy-, (2-Hydroxyethoxy)- und Allyloxy- Resten ausgewählt ist.

17. Oligomer nach einem der Ansprüche 9-16, dadurch gekennzeichnet, daß das RNA-Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend humane Interleukin-2 mRNA, humane ICAM-1 mRNA, humane TGF-β mRNA, humane Gewebefaktor Prä- mRNA, humane Proteinkinase C-α mRNA, humane Faktor KBF1 mRNA, humane 5-Lipoxygenase mRNA, humane Inter­ leukin-8 RNA, humane Interleukin-5 RNA, humane In­ terleukin-1 Rezeptor mRNA, humane Interleukin-1-α mRNA, humane 12-Lipoxygenase mRNA, das Transkript des humanen Cytomegalovirus DNA-Polymerase-Gens und ein Transkript des humanen Papillomavirus Typ 8.

18. Oligomer nach einem der Ansprüche 9-17, dadurch gekennzeichnet, daß das RNA-Substrat einen Bereich aus humaner In­ terleukin-2 mRNA mit der in SEQ ID No. 1 dargestell­ ten Nukleotidsequenz enthält.

19. Oligomer nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligomer die in SEQ ID No. 2 dargestellte Nukleotidsequenz enthält.

20. Oligomer nach einem der Ansprüche 9-17, dadurch gekennzeichnet, daß das RNA-Substrat einen Bereich aus humaner ICAM- 1 mRNA mit der in SEQ ID No. 3 dargestellten Nukleo­ tidsequenz enthält.

21. Oligomer nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligomer die in SEQ ID No. 4 dargestellte Nukleotidsequenz enthält.

22. Oligomer nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß das katalytische Zentrum Z die Strukturen (IVa) oder (IVb) aufweist und Spaltungsaktivität gegenüber einem RNA-Substrat besitzt, das eine Struktur der Formeln (VIa) oder (VIb) enthält: 5′-Y^11.1G¹²A¹³A¹⁴R^15.1-S-U^16.1H¹⁷-3′ (VIa)5′-Y^11.1N^g¹²G¹²A¹³A¹⁴R^15.1-S-U^16.1H¹⁷-3′ (VIb)worin N, H, Y, R, S, G, A, U und C Ribonukleotide darstellen und
N G, A, U oder C bedeutet,
H A, C oder U bedeutet,
R A oder G bedeutet
Y C oder U bedeutet und
S eine zur Bildung einer Haarnadelstruktur fähige RNA-Sequenz ist.

23. Oligomer nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß Z die Struktur (IVa) oder (IVb) aufweist und nicht mehr als sechs Ribonukleotide enthält.

24. Oligomer nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß Z keine Pyrimidin-Ribonukleotide enthält.

25. Oligomer nach einem der Ansprüche 22-24, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Bausteine an den Positionen G⁵, A⁶, N⁷, G⁸ und A⁹ Ribonukleotide sind, wobei N⁷ eine Purinbase, insbesondere A ist.

26. Oligomer nach einem der Ansprüche 22-25, dadurch gekennzeichnet, daß C³, U⁴ und N^λ¹² aus Bausteinen ausgewählt sind, worin W eine gegebenenfalls OH-substituierte C₁-C₄ Alkyl-, Alkenyl-, Alkoxy- oder Alkenyloxygruppe oder eine NH₂-Gruppe ist.

27. Oligomer nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß W aus Methoxy-, (2-Hydroxyethyloxy)-, Allyloxy-, Allyl- und NH₂-Resten ausgewählt ist.

28. Oligomer nach einem der Ansprüche 22-27, dadurch gekennzeichnet, daß das RNA-Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend humane Interleukin-6 mRNA, humane MDR-1 mRNA, humane Monocyten-Chemotaktisches Protein RNA, humane Makrophagen-Scavenger-Rezeptor Typ II mRNA, humane Makrophagen-Scavenger-Rezeptor Typ I mRNA, humane Makrophagen- Inflammatorisches Protein-1α mRNA, humane p53 RNA, humane jun-B mRNA, humane c­ jun RNA, humane Interferon-γ Typ II mRNA, humane Hepatocyten-Wachstumsfaktor mRNA, humane HER2 mRNA, humane Alzheimer′sche Krankheit-Amyloid mRNA, humane Interleukin-1 mRNA, humane 3-Hydroxy-3-methylgluta­ ryl-Coenzym A-Reduktase RNA, humane Angiotensinogen mRNA, humane Angiotensin-konvertierendes Enzym mRNA, humane Acyl-Coenzym A: Cholesterin-Acyltransferase mRNA, humane PDGF-Rezeptor mRNA, humane TNF-Rezeptor mRNA, humane TGF β mRNA, humane NF-Kappa-B p65 Un­ tereinheit mRNA, humane c-myc RNA, humane 12-Lipoxy­ genase mRNA, humane Interleukin-4 RNA, humane Inter­ leukin-10 mRNA, humane basischer FGF mRNA, humane EGF-Rezeptor mRNA, humane c-myb mRNA, humane c-fos RNA, humane bcl-2 mRNA, humane bcl-1 mRNA, humane ICAM-1 mRNA, ein Transkript von humanem Papillomavi­ rus Typ 11 und Transkripte von humanem Papillomavi­ rus Typ 16 und Typ 18.

29. Oligomer nach einem der Ansprüche 22-28, dadurch gekennzeichnet, daß das RNA-Substrat einen Bereich aus humaner In­ terleukin-6 mRNA mit der in SEQ ID No. 5 dargestell­ ten Nukleotidsequenz enthält.

30. Oligomer nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligomer die in SEQ ID No. 6 dargestellte Nukleotidsequenz enthält.

31. Oligomer nach einem der Ansprüche 22-28, dadurch gekennzeichnet, daß das RNA-Substrat einen Bereich aus humaner MDR-1 mRNA mit der in SEQ ID No. 7 dargestellten Nukleo­ tidsequenz enthält.

32. Oligomer nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligomer die in SEQ ID No. 8 dargestellte Nukleotidsequenz enthält.

33. Oligomer nach einem der Ansprüche 1-32, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einer prosthetischen Gruppe verknüpft ist.

34. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff ein oder mehrere chimäre Oligomere nach einem der Ansprüche 1-33 und gegebenenfalls pharmazeutisch verträgliche Hilfs-, Zusatz- und Trägerstoffe ent­ hält.

35. Verwendung eines chimären Oligomers nach einem der Ansprüche 1-33 oder einer pharmazeutischen Zusammen­ setzung nach Anspruch 34 zur Herstellung eines Mit­ tels für die spezifische Inaktivierung der Expres­ sion von Genen in Eukaryonten, Prokaryonten und Viren.

36. Verwendung nach Anspruch 35 zur spezifischen Inakti­ vierung der Expressionen von humanen Genen in einer Zelle.

37. Verwendung nach Anspruch 36 zur spezifischen Inakti­ vierung der Expression von Tumorgenen.

38. Verwendung nach Anspruch 35 zur spezifischen Inakti­ vierung der Expression von viralen Genen oder RNA- Molekülen in einer Zelle.

39. Verwendung nach Anspruch 35 zur spezifischen Inakti­ vierung der Expression von Pflanzengenen.

40. Verwendung nach einem der Ansprüche 35-39, dadurch gekennzeichnet, daß man den Wirkstoff in einer Konzentration von 0,01 bis 10000 µg/kg Körpergewicht verabreicht.

41. Verwendung nach einem der Ansprüche 35-40, dadurch gekennzeichnet, daß man den Wirkstoff durch Injektion, Inhalation, Spray, oral, topisch oder rektal verabreicht.

42. Verfahren zur spezifischen Inaktivierung der Expres­ sion von Genen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein chimäres Oligomer nach einem der An­ sprüche 1-33 in einer wirksamen Konzentration in eine Zelle einbringt, so daß das Oligomer spezifisch ein vorbestimmtes, in der Zelle vorliegendes RNA- Molekül spaltet.

43. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß die Spaltung katalytisch erfolgt.

44. Verwendung eines chimären Oligomers nach einem der Ansprüche 1-33 als RNA-Restriktionsenzym.

45. Regenzienkit zur Restriktionsspaltung von RNA-Mole­ külen, dadurch gekennzeichnet, daß er ein chimäres Oligomer nach einem der Ansprüche 1-33 sowie geeig­ nete Puffersubstanzen enthält.

46. Verwendung eines chimären Oligomers nach einem der Ansprüche 1-33 als diagnostisches Mittel.

47. Verwendung eines chimären Oligomers nach einem der Ansprüche 1-33 zur Identifizierung der Funktion unbekannter Gene.