JP3506431B2 - ジフテリア毒素受容体結合領域 - Google Patents
ジフテリア毒素受容体結合領域Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
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- A—HUMAN NECESSITIES
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、合衆国国立衛生研究所によって認可（awar
ded）されたGM31299およびGM39558ならびに合衆国関節
炎・感染症研究所（National Institute of Arthritis
and Infectious Diseases）によって認可（awarded）さ
れたAI−22021およびAI−22848に基づいて、政府援助を
受けて考案されたものである。政府は、本発明に関し、
特定の権利を有する。
ded）されたGM31299およびGM39558ならびに合衆国関節
炎・感染症研究所（National Institute of Arthritis
and Infectious Diseases）によって認可（awarded）さ
れたAI−22021およびAI−22848に基づいて、政府援助を
受けて考案されたものである。政府は、本発明に関し、
特定の権利を有する。
本発明は、ジフテリア毒素に関する。
ジフテリアは、1920年代後半に一般大衆に集団免疫予
防接種を行うまでは、子供の主な死亡原因であった。ジ
フテリアを抑制する現在の方法には、病気自体に特異的
に作用する抗毒素としての抗体を治療の目的で投与する
方法や、トキソイドと呼ばれるホルムアルデヒド不活化
ジフテリア毒素の集団予防接種などがある。後者の集団
予防接種では、特異的に抗毒素抗体形成を誘導すること
ができるが、トキソイド製剤は30％から40％の高率で汚
染物を含むので、予防接種の副作用の原因になることが
ある（Rappouli,in New Generations Vaccines,ed.Wood
row,L.Dekker publ.1990.p.251−268）。
防接種を行うまでは、子供の主な死亡原因であった。ジ
フテリアを抑制する現在の方法には、病気自体に特異的
に作用する抗毒素としての抗体を治療の目的で投与する
方法や、トキソイドと呼ばれるホルムアルデヒド不活化
ジフテリア毒素の集団予防接種などがある。後者の集団
予防接種では、特異的に抗毒素抗体形成を誘導すること
ができるが、トキソイド製剤は30％から40％の高率で汚
染物を含むので、予防接種の副作用の原因になることが
ある（Rappouli,in New Generations Vaccines,ed.Wood
row,L.Dekker publ.1990.p.251−268）。
ジフテリア毒素は、tox遺伝子を持つバクテリオファ
ージによって溶源化されたCorynebacterium diphtheria
e菌株から得られる535残基の一本鎖として分泌される
（Greenfield et al.,1983,Proc Natl.Acad.Sci.USA 8
0:6853−6857）。in vitroでジフテリア毒素を弱トリプ
シン処理（mild trypsinization）および換言すると、
残基190番、192番、または193番が切断され、フラグメ
ントＡ（Ｎ末端〜21K）とフラグメントＢ（Ｃ末端〜37
K）の２つのフラグメントが生成される（Moskaug,et a
l.,1989、Biol Chem 264:15709−15713;Collier,et a
l.,1971,Biol Chem,246:1496−1503）。同様のタンパク
質が分解して切断する現象（ニッキング）は、毒素が感
受性細胞に結合する以前または直後にin vivoで起こる
（Sandvig,et al.,1981,J Biol Chem 256:9068−907
6）。
ージによって溶源化されたCorynebacterium diphtheria
e菌株から得られる535残基の一本鎖として分泌される
（Greenfield et al.,1983,Proc Natl.Acad.Sci.USA 8
0:6853−6857）。in vitroでジフテリア毒素を弱トリプ
シン処理（mild trypsinization）および換言すると、
残基190番、192番、または193番が切断され、フラグメ
ントＡ（Ｎ末端〜21K）とフラグメントＢ（Ｃ末端〜37
K）の２つのフラグメントが生成される（Moskaug,et a
l.,1989、Biol Chem 264:15709−15713;Collier,et a
l.,1971,Biol Chem,246:1496−1503）。同様のタンパク
質が分解して切断する現象（ニッキング）は、毒素が感
受性細胞に結合する以前または直後にin vivoで起こる
（Sandvig,et al.,1981,J Biol Chem 256:9068−907
6）。
ジフテリア毒素が感受性真核細胞を中毒させる過程に
は、少なくとも以下のステップが含まれる。すなわち、
（１）時に「Ｒ領域」と呼ばれるフラグメントＢのＣ末
端の領域であるジフテリア毒素の結合ドメインが、感受
性細胞の表面上の特異的受容体に結合する。Ｒ領域に結
合する受容体は、さまざまなタイプの真核細胞で認めら
れている（Middlebrook,J.L.,et al.,1977.Can J Micro
biol 23:183−189）。（２）その受容体に結合する間
に、毒素分子はエンドサイトーシス小胞にインターナリ
ゼーション（内在化）される。（３）イターナリゼーシ
ョン以前か、エンドサイトーシス小胞内で、毒素分子が
フラグメントＡとフラグメントＢの間でタンパク質分解
により切除される。（４）エンドサイトーシス小胞のpH
は６以下に低下する際に、毒素の転位ドメインであるフ
ラグメントＢのＮ末端領域で、毒素がエンドソーム膜に
自発的に入り込む。（５）膜に埋め込まれた後、毒素の
転位ドメインは、フラグメントＡのサイトゾルへの伝達
を促進する。（６）細胞質のフラグメントＡは、ニコチ
ンアミドアデニジンヌクレオチド（NAD+）のADPリボシ
ル基を真核生物のタンパク質合成に重大な因子である延
長因子２（EF−２）に伝達する触媒として機能する。こ
れによって、EF−２を不活性化し、タンパク質合成を中
断し、標的細胞を死滅させる。単一分子のフラグメント
Ａを細胞の細胞質に導入すると、細胞を十分死滅させる
ことができる（Yamaizumi,et al.,1978,Cell 15:245−2
50）。
は、少なくとも以下のステップが含まれる。すなわち、
（１）時に「Ｒ領域」と呼ばれるフラグメントＢのＣ末
端の領域であるジフテリア毒素の結合ドメインが、感受
性細胞の表面上の特異的受容体に結合する。Ｒ領域に結
合する受容体は、さまざまなタイプの真核細胞で認めら
れている（Middlebrook,J.L.,et al.,1977.Can J Micro
biol 23:183−189）。（２）その受容体に結合する間
に、毒素分子はエンドサイトーシス小胞にインターナリ
ゼーション（内在化）される。（３）イターナリゼーシ
ョン以前か、エンドサイトーシス小胞内で、毒素分子が
フラグメントＡとフラグメントＢの間でタンパク質分解
により切除される。（４）エンドサイトーシス小胞のpH
は６以下に低下する際に、毒素の転位ドメインであるフ
ラグメントＢのＮ末端領域で、毒素がエンドソーム膜に
自発的に入り込む。（５）膜に埋め込まれた後、毒素の
転位ドメインは、フラグメントＡのサイトゾルへの伝達
を促進する。（６）細胞質のフラグメントＡは、ニコチ
ンアミドアデニジンヌクレオチド（NAD+）のADPリボシ
ル基を真核生物のタンパク質合成に重大な因子である延
長因子２（EF−２）に伝達する触媒として機能する。こ
れによって、EF−２を不活性化し、タンパク質合成を中
断し、標的細胞を死滅させる。単一分子のフラグメント
Ａを細胞の細胞質に導入すると、細胞を十分死滅させる
ことができる（Yamaizumi,et al.,1978,Cell 15:245−2
50）。
発明の大要
一般に、本発明はジフテリアに対するワクチンの免疫
原としてジフテリア毒素のＲ領域を使用する方法に関す
る。ジフテリア毒素のＲ領域を含む製剤は、ジフテリア
の進行を阻害する治療剤としても使用できる。出願者ら
は、Ｘ線結晶学の見地から、ジフテリア毒素ポリペプチ
ド内に独特のドメインであり、配列番号:1の残基496番
から512番を構成する長いループ（受容体結合ループ）
としてＲ領域の境界を決定した。尚、この長いループ
は、受容体結合領域として適当である。この見識に基づ
き、Ｒ領域、或いは受容体結合ループ或いはＲ領域のＮ
末端境界から受容体結合ループのＣ末端領域でのポリペ
プチドまたは受容体結合ループのＮ末端領域からジフテ
リア毒素のＣ末端までのポリペプチドを、優れた安定
性、安全性、免疫特性を有する分離ポリペプト単位（se
parate peptide entities）として、または、調製およ
び投与が容易な合成ペプチドとして生成することができ
る。
原としてジフテリア毒素のＲ領域を使用する方法に関す
る。ジフテリア毒素のＲ領域を含む製剤は、ジフテリア
の進行を阻害する治療剤としても使用できる。出願者ら
は、Ｘ線結晶学の見地から、ジフテリア毒素ポリペプチ
ド内に独特のドメインであり、配列番号:1の残基496番
から512番を構成する長いループ（受容体結合ループ）
としてＲ領域の境界を決定した。尚、この長いループ
は、受容体結合領域として適当である。この見識に基づ
き、Ｒ領域、或いは受容体結合ループ或いはＲ領域のＮ
末端境界から受容体結合ループのＣ末端領域でのポリペ
プチドまたは受容体結合ループのＮ末端領域からジフテ
リア毒素のＣ末端までのポリペプチドを、優れた安定
性、安全性、免疫特性を有する分離ポリペプト単位（se
parate peptide entities）として、または、調製およ
び投与が容易な合成ペプチドとして生成することができ
る。
本発明は、ポリペプチドまたはポリペプチドを含む実
質的に純粋な調剤において、 図５に全て記載した配列番号:1の ａ）アミノ酸379番から535番まで ｂ）アミノ酸380番から535番まで ｃ）アミノ酸381番から535番まで ｄ）アミノ酸382番から535番まで ｅ）アミノ酸383番から535番まで ｆ）アミノ酸384番から535番まで ｇ）アミノ酸385番から535番まで ｈ）アミノ酸386番から535番まで ｉ）アミノ酸496番から512番まで ｊ）アミノ酸379番から512番まで ｋ）アミノ酸380番から512番まで ｌ）アミノ酸381番から512番まで ｍ）アミノ酸382番から512番まで ｎ）アミノ酸383番から512番まで ｏ）アミノ酸384番から512番まで ｐ）アミノ酸385番から512番まで ｑ）アミノ酸386番から512番まで ｒ）アミノ酸496番から535番まで、または、 ｓ）アミノ酸496番から524番まで を本質的に含むことを特徴とする。
質的に純粋な調剤において、 図５に全て記載した配列番号:1の ａ）アミノ酸379番から535番まで ｂ）アミノ酸380番から535番まで ｃ）アミノ酸381番から535番まで ｄ）アミノ酸382番から535番まで ｅ）アミノ酸383番から535番まで ｆ）アミノ酸384番から535番まで ｇ）アミノ酸385番から535番まで ｈ）アミノ酸386番から535番まで ｉ）アミノ酸496番から512番まで ｊ）アミノ酸379番から512番まで ｋ）アミノ酸380番から512番まで ｌ）アミノ酸381番から512番まで ｍ）アミノ酸382番から512番まで ｎ）アミノ酸383番から512番まで ｏ）アミノ酸384番から512番まで ｐ）アミノ酸385番から512番まで ｑ）アミノ酸386番から512番まで ｒ）アミノ酸496番から535番まで、または、 ｓ）アミノ酸496番から524番まで を本質的に含むことを特徴とする。
これらのポリペプチド各々は、本文では「Ｒ領域ポリ
ペプチド」と呼ぶ。実質的に純粋であるとは、製品中に
存在する少なくとも50重量％のタンパク質がＲ領域ポリ
ペプチドであることを意味する。好ましい態様では製品
中に存在する少なくとも75重量％のタンパク質が、より
好ましい態様では製品中に存在する少なくとも90重量％
のタンパク質が、最も好ましくは製品に存在する少なく
とも99重量％のタンパク質が、Ｒ領域ポリペプチドであ
る。
ペプチド」と呼ぶ。実質的に純粋であるとは、製品中に
存在する少なくとも50重量％のタンパク質がＲ領域ポリ
ペプチドであることを意味する。好ましい態様では製品
中に存在する少なくとも75重量％のタンパク質が、より
好ましい態様では製品中に存在する少なくとも90重量％
のタンパク質が、最も好ましくは製品に存在する少なく
とも99重量％のタンパク質が、Ｒ領域ポリペプチドであ
る。
本発明は、Ｒ領域ポリペプチドをコード化するが、Ｒ
領域ポリペプチドのアミノ末端終端に直接隣接する図５
の配列番号:1のアミノ酸291番から379番までに対応する
アミノ酸配列をコード化しないDNA、そのDNA配列を有す
るベクター、好ましくは、Ｒ領域ポリペプチドをコード
化するDNA配列が異種プロモーターの支配下にあるベク
ター、より好ましくは発現アミノ酸をシグナル配列に結
合するベクター、Ｒ領域ポリペプチドをコード化するDN
Aを含む細胞または均質な細胞集団を含有する。細胞
は、Ｒ領域ポリペプチドを発現できることが好ましく、
担体ワクチン微生物であることが最も好ましい。本文で
用いる「担体ワクチン微生物」とは、自然に存在する無
毒の生きた微生物または病原性が低いか弱毒化した生き
た微生物であり、免疫原を発現するものである。担体ワ
クチン微生物として機能する弱毒化したウイルス性ワク
チン株または細菌性ワクチン株の例を以下に記載した。
「異種プロモータ」とは、所定の遺伝子に対応する自然
に存在するプロモータ領域とは一致しないプロモータ領
域を言う。このプロモータ領域は、遺伝子の転写を開始
する以前にRNAポリメラーゼに結合する遺伝子の転写開
始部位までのDNA5′のセグメントである。
領域ポリペプチドのアミノ末端終端に直接隣接する図５
の配列番号:1のアミノ酸291番から379番までに対応する
アミノ酸配列をコード化しないDNA、そのDNA配列を有す
るベクター、好ましくは、Ｒ領域ポリペプチドをコード
化するDNA配列が異種プロモーターの支配下にあるベク
ター、より好ましくは発現アミノ酸をシグナル配列に結
合するベクター、Ｒ領域ポリペプチドをコード化するDN
Aを含む細胞または均質な細胞集団を含有する。細胞
は、Ｒ領域ポリペプチドを発現できることが好ましく、
担体ワクチン微生物であることが最も好ましい。本文で
用いる「担体ワクチン微生物」とは、自然に存在する無
毒の生きた微生物または病原性が低いか弱毒化した生き
た微生物であり、免疫原を発現するものである。担体ワ
クチン微生物として機能する弱毒化したウイルス性ワク
チン株または細菌性ワクチン株の例を以下に記載した。
「異種プロモータ」とは、所定の遺伝子に対応する自然
に存在するプロモータ領域とは一致しないプロモータ領
域を言う。このプロモータ領域は、遺伝子の転写を開始
する以前にRNAポリメラーゼに結合する遺伝子の転写開
始部位までのDNA5′のセグメントである。
本発明は、Ｒ領域ポリペプチドをコード化する配列を
有するが、Ｒ領域ポリペプチドのアミノ末端終端に直接
隣接する図５の配列番号:1のアミノ酸291番から379番ま
でに対応するアミノ酸配列をコード化しない核酸から成
る本質的に純粋な製品を特徴とする。「核酸から成る本
質的な純粋な製品」とは、本発明に係る核酸を含み、Co
rynebacterium diphtheriaeにおいてジフテリア毒素を
コード化するDNAと自然に結合するその他の核酸分子か
らは実質的に遊離している製品を意味する。Ｒ領域ポリ
ペプチドは、化学合成によって、すなわち、有機化学の
古典的方法もしくはオートメーション化した方法によっ
て、または、生物学的合成によって、すなわち、一連の
遺伝的指令（genetic instructions）に基づいて生産す
ることによって調製されることが好ましい。本発明に係
る細胞は、細胞を提供し、培地で細胞を増殖し、Ｒ領域
ポリペプチドを発現する細胞集団を形成し、細胞集団ま
たは培地からＲ領域ポリペプチドを得ることを含む方法
に使用できる。
有するが、Ｒ領域ポリペプチドのアミノ末端終端に直接
隣接する図５の配列番号:1のアミノ酸291番から379番ま
でに対応するアミノ酸配列をコード化しない核酸から成
る本質的に純粋な製品を特徴とする。「核酸から成る本
質的な純粋な製品」とは、本発明に係る核酸を含み、Co
rynebacterium diphtheriaeにおいてジフテリア毒素を
コード化するDNAと自然に結合するその他の核酸分子か
らは実質的に遊離している製品を意味する。Ｒ領域ポリ
ペプチドは、化学合成によって、すなわち、有機化学の
古典的方法もしくはオートメーション化した方法によっ
て、または、生物学的合成によって、すなわち、一連の
遺伝的指令（genetic instructions）に基づいて生産す
ることによって調製されることが好ましい。本発明に係
る細胞は、細胞を提供し、培地で細胞を増殖し、Ｒ領域
ポリペプチドを発現する細胞集団を形成し、細胞集団ま
たは培地からＲ領域ポリペプチドを得ることを含む方法
に使用できる。
本発明は、Ｒ領域ポリペプチドと製剤上許容できる担
体を有する治療組成物を特徴とする。例えば、この製剤
組成物をジフテリアの疑いがある患者を識別するステッ
プと、治療に効果的な量の治療用組成物を患者に投与す
るステップとを含むジフテリア罹患者の処置方法に使用
することができる。「製剤的に許容できる担体」とは、
治療用組成物の伝達体を形成する不活性物質を意味す
る。
体を有する治療組成物を特徴とする。例えば、この製剤
組成物をジフテリアの疑いがある患者を識別するステッ
プと、治療に効果的な量の治療用組成物を患者に投与す
るステップとを含むジフテリア罹患者の処置方法に使用
することができる。「製剤的に許容できる担体」とは、
治療用組成物の伝達体を形成する不活性物質を意味す
る。
別の態様では、本発明は、細胞を中毒を阻害する量の
Ｒ領域ポリペプチドに接触させて、ジフテリア毒素によ
る細胞の中毒を阻害する方法を特徴とする。
Ｒ領域ポリペプチドに接触させて、ジフテリア毒素によ
る細胞の中毒を阻害する方法を特徴とする。
患者に免疫原的に効果的な量で以下の本発明に係るワ
クチンの一つを投与することによってジフテリア毒素に
対して免疫することができる。すなわち、そのワクチン
とは、１）Ｒ領域のポリペプチドを含むが、Ｒ領域ポリ
ペプチドのアミノ末端終端に直接隣接する図５の配列番
号:1のアミノ酸291番からから379番までに対応するアミ
ノ酸配列を含まないワクチン、２）Ｒ領域ポリペプチド
をコード化するDNAを含む弱毒化ウイルス性ベクターを
有するワクチン［ただし、本文で用いる「弱毒化ワクチ
ン」とは、目的の付着遺伝子に複製機能を提供し、無毒
性であるか、病原性が低いか、または、ヒトにおける毒
性が自然に存在する同種のウイルスに比較して弱められ
たウイルスのことを言う］、３）Ｒ領域ポリペプチドを
コード化するDNAを含む弱毒化細菌［ただし、本文で用
いる「弱毒化細菌」とは、自然に存在する同種の細菌に
比較し、生存度を弱めた細菌を言う］、または、４）Ｒ
領域ポリペプチドをコード化するがＲ領域ポリペプチド
末端終端に直接隣接する図５の配列番号:1のアミノ酸29
1番から379番までに対応するアミノ酸配列をコード化し
ないDNA配列を有するベクターを有し、好ましくはDNA配
列が異種プロモータに転写制御されており、及び／また
は発現アミノ酸がシグナル配列に結合しているワクチン
である。ベクターを有するワクチンを投与する方法の一
つには、biolistic伝達による方法があり、この方法
は、目的の免疫原をコード化するDNAで微小投射体（マ
イクロプロジェクティル、microprojectile）を被覆す
るステップと、その被覆微小投射体（マイクロプロジェ
クティル、microprojectile）をレシピエントの細胞に
注入するステップを含む伝達方法があるが、この方法に
限らない。Ｒ領域ポリペプチドは、DNAから発現され、
レシピエントの免疫応答を刺激する（Tang,et al.1992.
Nature 356:152−154、本文に参考として採用）。ジフ
テリア毒素と反応する免疫原を取り込むことによって、
本発明に係るワクチンは、ジフテリアの進行に免疫性を
付与し、さらに、細菌Corynebacterium diphthriaeによ
って感染に対する免疫性を付与する。
クチンの一つを投与することによってジフテリア毒素に
対して免疫することができる。すなわち、そのワクチン
とは、１）Ｒ領域のポリペプチドを含むが、Ｒ領域ポリ
ペプチドのアミノ末端終端に直接隣接する図５の配列番
号:1のアミノ酸291番からから379番までに対応するアミ
ノ酸配列を含まないワクチン、２）Ｒ領域ポリペプチド
をコード化するDNAを含む弱毒化ウイルス性ベクターを
有するワクチン［ただし、本文で用いる「弱毒化ワクチ
ン」とは、目的の付着遺伝子に複製機能を提供し、無毒
性であるか、病原性が低いか、または、ヒトにおける毒
性が自然に存在する同種のウイルスに比較して弱められ
たウイルスのことを言う］、３）Ｒ領域ポリペプチドを
コード化するDNAを含む弱毒化細菌［ただし、本文で用
いる「弱毒化細菌」とは、自然に存在する同種の細菌に
比較し、生存度を弱めた細菌を言う］、または、４）Ｒ
領域ポリペプチドをコード化するがＲ領域ポリペプチド
末端終端に直接隣接する図５の配列番号:1のアミノ酸29
1番から379番までに対応するアミノ酸配列をコード化し
ないDNA配列を有するベクターを有し、好ましくはDNA配
列が異種プロモータに転写制御されており、及び／また
は発現アミノ酸がシグナル配列に結合しているワクチン
である。ベクターを有するワクチンを投与する方法の一
つには、biolistic伝達による方法があり、この方法
は、目的の免疫原をコード化するDNAで微小投射体（マ
イクロプロジェクティル、microprojectile）を被覆す
るステップと、その被覆微小投射体（マイクロプロジェ
クティル、microprojectile）をレシピエントの細胞に
注入するステップを含む伝達方法があるが、この方法に
限らない。Ｒ領域ポリペプチドは、DNAから発現され、
レシピエントの免疫応答を刺激する（Tang,et al.1992.
Nature 356:152−154、本文に参考として採用）。ジフ
テリア毒素と反応する免疫原を取り込むことによって、
本発明に係るワクチンは、ジフテリアの進行に免疫性を
付与し、さらに、細菌Corynebacterium diphthriaeによ
って感染に対する免疫性を付与する。
この観点から、本発明は、別のポリペプチドにペプチ
ド結合によって連結されたＲ領域ポリペプチドから成る
が、Ｒ領域ポリペプチドのアミノ末端終端に直接隣接す
る配列番号:1の図５のアミノ酸291番から379番、好まし
くは310番から379番、より好ましくは335番から379番、
最も好ましくは360番から379番までに対応する配列を含
まない融合ポリペプチドを特徴とする。この融合ポリペ
プチドは、ワクチンに含まれ、これを使用して患者にジ
フテリア毒素に対する免疫性を付与できることが好まし
い。融合ポリペプチドをコード化するDNAは、細胞に取
り込むことができるが、、担体ワクチン微生物などの細
胞に融合ポリペプチドを発現できることが好ましい。本
文で用いられる「融合ポリペプチド」とは、Ｒ領域ポリ
ペプチドをコード化するDNAを遺伝子工学的手段によっ
て第２のポリペプチド配列をコード化する第２のDNAに
連結するハイブリッドDNAの発現によって生成されるタ
ンパク質分子を言う。
ド結合によって連結されたＲ領域ポリペプチドから成る
が、Ｒ領域ポリペプチドのアミノ末端終端に直接隣接す
る配列番号:1の図５のアミノ酸291番から379番、好まし
くは310番から379番、より好ましくは335番から379番、
最も好ましくは360番から379番までに対応する配列を含
まない融合ポリペプチドを特徴とする。この融合ポリペ
プチドは、ワクチンに含まれ、これを使用して患者にジ
フテリア毒素に対する免疫性を付与できることが好まし
い。融合ポリペプチドをコード化するDNAは、細胞に取
り込むことができるが、、担体ワクチン微生物などの細
胞に融合ポリペプチドを発現できることが好ましい。本
文で用いられる「融合ポリペプチド」とは、Ｒ領域ポリ
ペプチドをコード化するDNAを遺伝子工学的手段によっ
て第２のポリペプチド配列をコード化する第２のDNAに
連結するハイブリッドDNAの発現によって生成されるタ
ンパク質分子を言う。
同様の観点から、本発明は、化学基に付着したＲ領域
ポリペプチドを特徴とする。治療用組成物は、化学基に
付着したＲ領域ポリペプチドと、製剤的に許容できる担
体を有することができる。患者のジフテリアを治療する
方法は、ジフテリアの疑いがある患者を識別するステッ
プと、化学基に付着したＲ領域ポリペプチドを含み治療
に効果的な量の組成物を患者に投与するステップとを含
む。「化学基」とは、通常は自然に存在するジフテリア
毒素に結合しない分子を言う。適切な化学基の例には、
例えばインフルエンザ菌、髄膜炎菌、肺炎球菌など、さ
まざまな病原体の多糖類、あるいは、さまざまな細菌性
もしくは病原体ウイルス性病原体の表面成分または病原
性因子に対応するペプチドなどがある。化学基は、Ｒ領
域ペプチドの担体物質として機能することができる。逆
に、Ｒ領域ポリペプチドは、このようなあらゆる化学基
または（酵素やその他の病原体の免疫原などの）他の化
学基に対する担体物質として機能することもできる。
「担体物質」は、結合分子に安定性を付与し、及び／或
いは結合分子の伝達もしくは免疫原性を補助する物質で
ある。
ポリペプチドを特徴とする。治療用組成物は、化学基に
付着したＲ領域ポリペプチドと、製剤的に許容できる担
体を有することができる。患者のジフテリアを治療する
方法は、ジフテリアの疑いがある患者を識別するステッ
プと、化学基に付着したＲ領域ポリペプチドを含み治療
に効果的な量の組成物を患者に投与するステップとを含
む。「化学基」とは、通常は自然に存在するジフテリア
毒素に結合しない分子を言う。適切な化学基の例には、
例えばインフルエンザ菌、髄膜炎菌、肺炎球菌など、さ
まざまな病原体の多糖類、あるいは、さまざまな細菌性
もしくは病原体ウイルス性病原体の表面成分または病原
性因子に対応するペプチドなどがある。化学基は、Ｒ領
域ペプチドの担体物質として機能することができる。逆
に、Ｒ領域ポリペプチドは、このようなあらゆる化学基
または（酵素やその他の病原体の免疫原などの）他の化
学基に対する担体物質として機能することもできる。
「担体物質」は、結合分子に安定性を付与し、及び／或
いは結合分子の伝達もしくは免疫原性を補助する物質で
ある。
最後に、Ｒ領域はアジュバントに結合される。結合し
たポリペプチドおよびアジュバントをワクチンに用いる
ことができる。ワクチンは、患者にジフテリア毒性に対
する免疫性を付与する方法で用いられる。アジュバント
は、アルミニウム塩、細菌性エンドトキシン、カルメッ
トゲランウシ型結核菌（BCG）、リポソームやフロイン
トアジュバントなどに限らず、既知のタイプのアジュバ
ントであればよい。本文で用いられる「アジュバント」
とは、抗原の免疫原性を高めることができる物質であ
る。
たポリペプチドおよびアジュバントをワクチンに用いる
ことができる。ワクチンは、患者にジフテリア毒性に対
する免疫性を付与する方法で用いられる。アジュバント
は、アルミニウム塩、細菌性エンドトキシン、カルメッ
トゲランウシ型結核菌（BCG）、リポソームやフロイン
トアジュバントなどに限らず、既知のタイプのアジュバ
ントであればよい。本文で用いられる「アジュバント」
とは、抗原の免疫原性を高めることができる物質であ
る。
出願者らは、ジフテリア毒素のＲ領域の境界と、受容
体結合に必要な配列に適していると思われるＲ領域内の
ループの境界とを決定し、ジフテリア毒素に対する新規
のワクチンに安全で安定した免疫原としてジフテリア毒
素のこれらの部分に基づいてポリペプチドを使用する方
法を認めた。このようにして、出願者らはＲ領域または
これらのループの一つである配列を、分離単位（separa
te entity）として発現させることを可能にした。本発
明に係るＲ領域ポリペプチドを用いて免疫化することに
よって、ジフテリア毒素ポリペプチド全体を用いて免疫
化する場合よりも優れた特定の利益が得られる。例え
ば、患者は毒素（フラグメントＡの部分）の有毒な酵素
活性を保持する分子部分に晒されることは決してなく、
酵素活性形態に可逆するリスクもなく、患者はフラグメ
ントＡに晒されることもTMドメインに晒されることもな
いので、抗毒素の一部としてこれらの領域の一方または
両方を続いて使用しても、二次免疫応答を誘導すること
はない。Ｘ線結晶学的分析方法で正確に定義されたＲ領
域の境界を用いて、本発明に係るＲ領域のポリペプチド
は、その固有の機能的コンホーメションを再生自在に構
成することができる。
体結合に必要な配列に適していると思われるＲ領域内の
ループの境界とを決定し、ジフテリア毒素に対する新規
のワクチンに安全で安定した免疫原としてジフテリア毒
素のこれらの部分に基づいてポリペプチドを使用する方
法を認めた。このようにして、出願者らはＲ領域または
これらのループの一つである配列を、分離単位（separa
te entity）として発現させることを可能にした。本発
明に係るＲ領域ポリペプチドを用いて免疫化することに
よって、ジフテリア毒素ポリペプチド全体を用いて免疫
化する場合よりも優れた特定の利益が得られる。例え
ば、患者は毒素（フラグメントＡの部分）の有毒な酵素
活性を保持する分子部分に晒されることは決してなく、
酵素活性形態に可逆するリスクもなく、患者はフラグメ
ントＡに晒されることもTMドメインに晒されることもな
いので、抗毒素の一部としてこれらの領域の一方または
両方を続いて使用しても、二次免疫応答を誘導すること
はない。Ｘ線結晶学的分析方法で正確に定義されたＲ領
域の境界を用いて、本発明に係るＲ領域のポリペプチド
は、その固有の機能的コンホーメションを再生自在に構
成することができる。
本発明に係る別の利益は、Ｒ領域ポリペプチドを治療
に使用してその受容体に結合し、自然のジフテリア毒素
が受容体に付着するのを競合的に阻害することができる
ことにある。さらに、Ｒ領域ポリペプチドは多種多様な
細胞タイプで認められるその受容体に極めて効果的に結
合するので、Ｒ領域ポリペプチドは薬物伝達に安定で効
果的な担体分子となる。さらに、Ｒ領域ポリペプチド
は、安定性の低い免疫原に代わる安定な担体分子として
機能することができるが、これについては本文に例を記
載してある。
に使用してその受容体に結合し、自然のジフテリア毒素
が受容体に付着するのを競合的に阻害することができる
ことにある。さらに、Ｒ領域ポリペプチドは多種多様な
細胞タイプで認められるその受容体に極めて効果的に結
合するので、Ｒ領域ポリペプチドは薬物伝達に安定で効
果的な担体分子となる。さらに、Ｒ領域ポリペプチド
は、安定性の低い免疫原に代わる安定な担体分子として
機能することができるが、これについては本文に例を記
載してある。
本発明に係るその他の特徴および利益は、以下の詳細
な説明と請求の範囲から明らかであろう。
な説明と請求の範囲から明らかであろう。
詳細な説明
図面について簡単に説明する。
図面
図１は、ジフテリア毒素タンパク質のＸ線結晶学的構
造を示す図式表現である。
造を示す図式表現である。
ａ）各二次構造セグメントを標識化するジフテリア毒
素のリボン状図（Ribbon drawing）である。最初の文字
は領域を示し、Ｃは触媒領域、Ｔは貫膜領域、Ｒは受容
体結合領域である。２番目の文字は二次構造クラスを示
し、Ｈはヘリックス、Ｂはβ鎖、Ｌはループである。３
番目の記号は各ドメインのＮ末端からの各二次セグメン
トの配列番号でりある。各セグメントの残基番号は、CH
1:2−７、CB1:11−14、CB2:16−24、CH2:28−34、CB3:5
2−57、CH3:58−66、CB4:76−86、CB5:88−96、CH4:99
−106、CH5:120−126、CB6:130−136、CB7:147−152、C
B8:159−166、CH6:168−173、CH7:176−186、TH1:205−
221、TH2:225−231、TH3:238−257、TH4:258−269、TH
5:274−288、TH6:297−307、TH7:310−315、TH8:326−3
46、TH9:356−378、RB1:386−390、RB2:393−399、RB3:
412−424、RB4:428−438、RB5:447−453、RB6:455−46
5、RB7:467−480、RB8:483−495、RB9:513−520、およ
びRB10:525−534である。ｂ）パネルａと同じ観点から
のジフテリア毒素のＣαスケルトン（skelton）の立体
図である。ApUp分子は、ジフテリア毒素の活性部位を占
める。Ｃ）（2Fob−Fc）から2.5オングストロームで算
出した電子密度マップの立体対（stereo pairs）および
精製モデル相である。ｄ）形態４の結晶内で認められる
ジフテリア毒素二量体である。二つの単量体は、鉛直で
結晶学的に二つ折り回転軸（２−fold rotation axis）
によって関連づけられている。太線で示す左の分子は、
図（パネル）ａと同じ方向である。
素のリボン状図（Ribbon drawing）である。最初の文字
は領域を示し、Ｃは触媒領域、Ｔは貫膜領域、Ｒは受容
体結合領域である。２番目の文字は二次構造クラスを示
し、Ｈはヘリックス、Ｂはβ鎖、Ｌはループである。３
番目の記号は各ドメインのＮ末端からの各二次セグメン
トの配列番号でりある。各セグメントの残基番号は、CH
1:2−７、CB1:11−14、CB2:16−24、CH2:28−34、CB3:5
2−57、CH3:58−66、CB4:76−86、CB5:88−96、CH4:99
−106、CH5:120−126、CB6:130−136、CB7:147−152、C
B8:159−166、CH6:168−173、CH7:176−186、TH1:205−
221、TH2:225−231、TH3:238−257、TH4:258−269、TH
5:274−288、TH6:297−307、TH7:310−315、TH8:326−3
46、TH9:356−378、RB1:386−390、RB2:393−399、RB3:
412−424、RB4:428−438、RB5:447−453、RB6:455−46
5、RB7:467−480、RB8:483−495、RB9:513−520、およ
びRB10:525−534である。ｂ）パネルａと同じ観点から
のジフテリア毒素のＣαスケルトン（skelton）の立体
図である。ApUp分子は、ジフテリア毒素の活性部位を占
める。Ｃ）（2Fob−Fc）から2.5オングストロームで算
出した電子密度マップの立体対（stereo pairs）および
精製モデル相である。ｄ）形態４の結晶内で認められる
ジフテリア毒素二量体である。二つの単量体は、鉛直で
結晶学的に二つ折り回転軸（２−fold rotation axis）
によって関連づけられている。太線で示す左の分子は、
図（パネル）ａと同じ方向である。
図２。ＣドメインのＣαスケルトン（skeleton）の立
体対。活性部位への入口（entrance）は、右下にある。
４つのループCL1からCL4を太線で示した。これらの形態
は、Ｃドメインをさらに伸張した構造にすることができ
るヒンジであることに留意すること。
体対。活性部位への入口（entrance）は、右下にある。
４つのループCL1からCL4を太線で示した。これらの形態
は、Ｃドメインをさらに伸張した構造にすることができ
るヒンジであることに留意すること。
図３。図１のジフテリア毒素の右側から眺めたＴドメ
インのＣαスケルトン（skeleton）の立体対である。ヘ
リックスTH1は、裏側にあり、残基205番から出発する。
ヘリックスTH2は、左下部に流れ、ヘリックスTH3に続
き、右に流れる。前方中央にはヘリックスTH5があり、
左に流れているが、その上にヘリックスTH6およびTH7が
ある。これらの逆平行のらせんの裏側には、別の逆平行
らせん対TH8およびTH9があり、TH9は上方に流れ、残基3
78が終点になる。ａ）Asp側鎖とGlu側鎖を示す。２つの
らせん層の先端TL3およびTL5は、合計６個の酸性基を左
側に含むことに留意すること。ｂ）Lys側鎖、Arg側鎖お
よびHis側鎖を示す。TH5とTH6の間のループTL3付近のLy
s299を除き、ドメイン底部と後部の全ての電荷が左右不
対称に正に帯電していることに留意すること。
インのＣαスケルトン（skeleton）の立体対である。ヘ
リックスTH1は、裏側にあり、残基205番から出発する。
ヘリックスTH2は、左下部に流れ、ヘリックスTH3に続
き、右に流れる。前方中央にはヘリックスTH5があり、
左に流れているが、その上にヘリックスTH6およびTH7が
ある。これらの逆平行のらせんの裏側には、別の逆平行
らせん対TH8およびTH9があり、TH9は上方に流れ、残基3
78が終点になる。ａ）Asp側鎖とGlu側鎖を示す。２つの
らせん層の先端TL3およびTL5は、合計６個の酸性基を左
側に含むことに留意すること。ｂ）Lys側鎖、Arg側鎖お
よびHis側鎖を示す。TH5とTH6の間のループTL3付近のLy
s299を除き、ドメイン底部と後部の全ての電荷が左右不
対称に正に帯電していることに留意すること。
図４。ジフテリア毒素のＲドメインの分子配列（左）
をIg可変ドメインの分子配列（中央）（Marquart,et a
l.,1980,J Mol Biol 141:369）と、腫瘍壊死因子（TN
F、右）（Eck,et al.,1989,J Biol Chem,264:17595）と
比較した図である。Ｒドメインは、図１のジフテリア毒
素を裏側から眺めたものである。Ｒドメインの２から10
までの番号は、ジフテリア毒素のRB2鎖からRB10鎖まで
を示す。Ｒドメインの鎖２、３、４、８、９および10
は、Ig可変ドメインの鎖Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、ＦおよびＧと
良く一致することに留意すること。Ｒドメインの３、
４、５、６、７、８および９は、古典的ゼリーロール
（jellyroll）であるTNFの鎖Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈお
よびＩに良く一致する（Jones,et al.,1989,Nature 33
8:225−228）。
をIg可変ドメインの分子配列（中央）（Marquart,et a
l.,1980,J Mol Biol 141:369）と、腫瘍壊死因子（TN
F、右）（Eck,et al.,1989,J Biol Chem,264:17595）と
比較した図である。Ｒドメインは、図１のジフテリア毒
素を裏側から眺めたものである。Ｒドメインの２から10
までの番号は、ジフテリア毒素のRB2鎖からRB10鎖まで
を示す。Ｒドメインの鎖２、３、４、８、９および10
は、Ig可変ドメインの鎖Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、ＦおよびＧと
良く一致することに留意すること。Ｒドメインの３、
４、５、６、７、８および９は、古典的ゼリーロール
（jellyroll）であるTNFの鎖Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈお
よびＩに良く一致する（Jones,et al.,1989,Nature 33
8:225−228）。
図５は、配列番号:1の成熟ジフテリア毒素の野生型ヌ
クレオチドおよび対応するアミノ酸配列と、矢印で示さ
れた本発明に係るさまざまなポリペプチドのアミノ末端
である。アミノ酸Gly １は、Ｎ末端シグナル配列除去
後の野生型の成熟ポリペプチドの第１のアミノ酸を示
す。
クレオチドおよび対応するアミノ酸配列と、矢印で示さ
れた本発明に係るさまざまなポリペプチドのアミノ末端
である。アミノ酸Gly １は、Ｎ末端シグナル配列除去
後の野生型の成熟ポリペプチドの第１のアミノ酸を示
す。
出願者らの目的は、ワクチンを遺伝子工学的に処理し
ワクチン内でトキソイドを発現する生きた弱毒化ウイル
スまたは細菌の形態であっても、安全に患者に投与する
ことができるジフテリア毒素を生成することにある。こ
のように生（きた）ワクチンでは、ワクチン株がin viv
oで増殖する際に、トキソイドをコード化するDNAは突然
変異に敏感な状態を保つ。ワクチンDNAは不活性形態の
ジフテリア毒素の活性フラグメントＡのコピーを含んで
いる場合は、突然変異を起こしその細胞死滅能力が失わ
れているが、そのような突然変異がin vivoで後に起こ
る自然突然変異によって後退すなわち抑制され得る恐れ
がある。ワクチンがフラグメントＡを全く有しない場合
に限り、このリスクはゼロになる。
ワクチン内でトキソイドを発現する生きた弱毒化ウイル
スまたは細菌の形態であっても、安全に患者に投与する
ことができるジフテリア毒素を生成することにある。こ
のように生（きた）ワクチンでは、ワクチン株がin viv
oで増殖する際に、トキソイドをコード化するDNAは突然
変異に敏感な状態を保つ。ワクチンDNAは不活性形態の
ジフテリア毒素の活性フラグメントＡのコピーを含んで
いる場合は、突然変異を起こしその細胞死滅能力が失わ
れているが、そのような突然変異がin vivoで後に起こ
る自然突然変異によって後退すなわち抑制され得る恐れ
がある。ワクチンがフラグメントＡを全く有しない場合
に限り、このリスクはゼロになる。
ジフテリア毒素は３つの構造ドメインから成る。３つ
の中で、Ｒ領域は分子を受容体を持つ細胞（receptor b
earing cells）に結合することによって受容体認識機能
を果たす。このＲ領域は、ジフテリア毒素分子の残りの
部分から分離した単位として生成され、ジフテリアに対
するワクチンでは良質のトキソイドとして役立つ。出願
者らが定義したＲ領域は、安定なドメインで、ジフテリ
ア毒素タンパク質全体の一次抗原決定基である。この概
念は、Rolfらの結果とともにジフテリア毒素の結晶学的
構造に基づいており、競合的に毒素特異受容体（toxin
−specific recptors）に結合することによってジフテ
リア毒素のカルボキシル末端ペプチド（HA6DT）の毒素
活性を阻害する。このペプチドは、アミノ酸482番から5
35番まで（MW 5982 Da）から成り、ジフテリア毒素のヒ
ドロキシルアミン処置によって調製されたものである
（Rolf,et al.,991,FASEB 75th Annual Meeting,5:A82
1、本文に参考として採用）。ただし、このようなフラ
グメントは、ワクチンの優れた候補になる抗原特異性お
よびin vivo安定性を備えているとは思われない。本文
で定義されるＲ領域ポリペプチドは、安定した三次構造
を有するので、完全なジフテリア毒素を標的にする効率
のよい形態の抗体を誘導することができる。さらに、本
発明に係るＲ領域は、in vivoのタンパク質分解に相対
的に安定である。
の中で、Ｒ領域は分子を受容体を持つ細胞（receptor b
earing cells）に結合することによって受容体認識機能
を果たす。このＲ領域は、ジフテリア毒素分子の残りの
部分から分離した単位として生成され、ジフテリアに対
するワクチンでは良質のトキソイドとして役立つ。出願
者らが定義したＲ領域は、安定なドメインで、ジフテリ
ア毒素タンパク質全体の一次抗原決定基である。この概
念は、Rolfらの結果とともにジフテリア毒素の結晶学的
構造に基づいており、競合的に毒素特異受容体（toxin
−specific recptors）に結合することによってジフテ
リア毒素のカルボキシル末端ペプチド（HA6DT）の毒素
活性を阻害する。このペプチドは、アミノ酸482番から5
35番まで（MW 5982 Da）から成り、ジフテリア毒素のヒ
ドロキシルアミン処置によって調製されたものである
（Rolf,et al.,991,FASEB 75th Annual Meeting,5:A82
1、本文に参考として採用）。ただし、このようなフラ
グメントは、ワクチンの優れた候補になる抗原特異性お
よびin vivo安定性を備えているとは思われない。本文
で定義されるＲ領域ポリペプチドは、安定した三次構造
を有するので、完全なジフテリア毒素を標的にする効率
のよい形態の抗体を誘導することができる。さらに、本
発明に係るＲ領域は、in vivoのタンパク質分解に相対
的に安定である。
構造決定方法
Ｒ領域境界を決定するデータは、図１のＸ線結晶学的
構造から得られる。この構造は、形態１、形態３および
形態４の結晶分析に基づいている。アデニリル−3',5'
−ウリジン−リン酸（ApUp）と錯体を形成するジフテリ
ア毒素の形態１の結晶は、ａ＝70.4オングストローム、
ｂ＝70.6オングストローム、ｃ＝65.4オングストロー
ム、α＝94.9゜、β＝91.0゜、γ＝99.6゜の単位細胞寸
法を有し、非対称単位当たり二本鎖を有する三斜晶空間
群P1に属する。この二量体非対称単位は、出願者らの初
期の結晶化に関する報告（Collier,et al.,1982,J Biol
Chem 257:5283−5285）後、この結晶がタンパク質の粗
製或いは精製製品で確認されることがある二量体形態の
ジフテリア毒素であったとの発見と一致するものであ
る。二量体ジフテリア毒素自体には毒性がないが、これ
は恐らく受容体に結合しないからであるがしかしながら
それは完全な毒性単量体に徐々に解離する（Carroll et
al.,1986,Biochemistry 25:2485−2430）。この二量体
は、生物学的活性のある単量体毒素の立体配座的に変更
した形態である。形態１の結晶を得る再現不可能な結晶
化条件は、３種の新しい結晶形態が得られるまで、構造
決定に関する結晶学的研究の妨げになった（Fujii et a
l.,1991,J Mol Biol 222:861−864）。形態３および形
態４は、形態３についてはａ＝107.3オングストロー
ム、ｂ＝91.7オングストローム、ｃ＝66.3オングストロ
ーム、β＝94.7゜、形態４についてはａ＝108.3オング
ストローム、ｂ＝92.3オングストローム、ｃ＝66.1オン
グストローム、β＝90.4゜単位細胞寸法を有する単斜晶
空間群C2に属する。この形態の両方には非対称単位当た
り一本のジフテリア毒素鎖があり、ジフテリア毒素鎖対
は２つ折り回転軸（２−fold rotatin axis）によって
関連づけられる。
構造から得られる。この構造は、形態１、形態３および
形態４の結晶分析に基づいている。アデニリル−3',5'
−ウリジン−リン酸（ApUp）と錯体を形成するジフテリ
ア毒素の形態１の結晶は、ａ＝70.4オングストローム、
ｂ＝70.6オングストローム、ｃ＝65.4オングストロー
ム、α＝94.9゜、β＝91.0゜、γ＝99.6゜の単位細胞寸
法を有し、非対称単位当たり二本鎖を有する三斜晶空間
群P1に属する。この二量体非対称単位は、出願者らの初
期の結晶化に関する報告（Collier,et al.,1982,J Biol
Chem 257:5283−5285）後、この結晶がタンパク質の粗
製或いは精製製品で確認されることがある二量体形態の
ジフテリア毒素であったとの発見と一致するものであ
る。二量体ジフテリア毒素自体には毒性がないが、これ
は恐らく受容体に結合しないからであるがしかしながら
それは完全な毒性単量体に徐々に解離する（Carroll et
al.,1986,Biochemistry 25:2485−2430）。この二量体
は、生物学的活性のある単量体毒素の立体配座的に変更
した形態である。形態１の結晶を得る再現不可能な結晶
化条件は、３種の新しい結晶形態が得られるまで、構造
決定に関する結晶学的研究の妨げになった（Fujii et a
l.,1991,J Mol Biol 222:861−864）。形態３および形
態４は、形態３についてはａ＝107.3オングストロー
ム、ｂ＝91.7オングストローム、ｃ＝66.3オングストロ
ーム、β＝94.7゜、形態４についてはａ＝108.3オング
ストローム、ｂ＝92.3オングストローム、ｃ＝66.1オン
グストローム、β＝90.4゜単位細胞寸法を有する単斜晶
空間群C2に属する。この形態の両方には非対称単位当た
り一本のジフテリア毒素鎖があり、ジフテリア毒素鎖対
は２つ折り回転軸（２−fold rotatin axis）によって
関連づけられる。
初期のモデルは、多重同形置換（multiple isomorpho
us replacement、MIR）方法を使用した後、溶媒を偏平
（flattening）にして、3.0オングストローム分解能（r
esolution）での形態４の結晶の構造決定に基づいた（W
ang,1985,Methods of Enzymol 115:90−112）。初期の
モデルによって、形態１および形態３の構造は、分子置
換によって容易に解決され（Brnger,1991,Acta Cryst
A47:195−204、Rossman et al.,1962,Acta Cryst 15:2
4−31）。単回同形置換（single isomorphous replacem
ent、SIR）相は形態３に関して得られた。2.5オングス
トローム分解能（resolution）までの自然のデータを収
集し、相をZhangおよびMainの方法によって拡張および
修正した後、形態３（SIR）および形態４（MIR）を用い
てモデルを2.5オングストロームのマップに再構成した
（Zhang et al.,1991,Acta Cryst A46:377−381）。こ
れに次いで、二つの形態間の実空間密度を平均化した。
受容体結合ドメインまたＲドメインの一部であるl20個
までのＣ末端残基では、配列は適合し難く、408番と510
番の残基付近の領域が最もあいまいな（ambiguous）領
域であった。密度マップに有用なマーカーには、W50、W
153、W281、W398と、５−残基セグメントのM178、
Y179、E180、Y181、M182と、４−残基クラスターの
F355、Y358、H372、Y375と、図1CのＣ末端付近の大型側
鎖を有するクラスターのY514、F530、F531と、C186とC
201、C461およびC471との間の２つのジスルフィド結合
もあった。Ｒドメインの初期の不適切な適合をプロフィ
ールウィンドウプロット（profile window plot）（Ｌ
thy,et al.,1992,Nature 356:83−85）で検知し調整
した。精製反復サイクルを各データセットに対して2.5
オングストロームで独立して行った。各形態の原子モデ
ルは、本質的に結晶パッキングを除き一致する。相修飾
と精製については別途説明する。モデルの評価精度は、
MIRおよび密度修正マップに対するモデルの適合と、結
晶学的Ｒ因子と、実空間Ｒ因子（Jones et al.,1991,Ac
ta Cryst A47:110−119）と、わずか４％だけ結晶学的
Ｒ因子より高い自由Ｒ値（free R−value）（Brnger,
1992,Nature 355:472−475）と、プロフィールウィンド
ウプロット（profile window plots）（Ｌthy et a
l.,1992,Nature 356:83−85）に依存する。精製の目下
の段階では、原子モデルと結晶学的モデルとの一致は、
形態１、形態３および形態４各々に対して21.1％、21.6
％、21.9％のＲ因子によって特徴付けられ、観察された
すべてのデータは、６オングストロームから2.5オング
ストロームまでの分解能では１σ（Fob）を超えるFobで
ある。
us replacement、MIR）方法を使用した後、溶媒を偏平
（flattening）にして、3.0オングストローム分解能（r
esolution）での形態４の結晶の構造決定に基づいた（W
ang,1985,Methods of Enzymol 115:90−112）。初期の
モデルによって、形態１および形態３の構造は、分子置
換によって容易に解決され（Brnger,1991,Acta Cryst
A47:195−204、Rossman et al.,1962,Acta Cryst 15:2
4−31）。単回同形置換（single isomorphous replacem
ent、SIR）相は形態３に関して得られた。2.5オングス
トローム分解能（resolution）までの自然のデータを収
集し、相をZhangおよびMainの方法によって拡張および
修正した後、形態３（SIR）および形態４（MIR）を用い
てモデルを2.5オングストロームのマップに再構成した
（Zhang et al.,1991,Acta Cryst A46:377−381）。こ
れに次いで、二つの形態間の実空間密度を平均化した。
受容体結合ドメインまたＲドメインの一部であるl20個
までのＣ末端残基では、配列は適合し難く、408番と510
番の残基付近の領域が最もあいまいな（ambiguous）領
域であった。密度マップに有用なマーカーには、W50、W
153、W281、W398と、５−残基セグメントのM178、
Y179、E180、Y181、M182と、４−残基クラスターの
F355、Y358、H372、Y375と、図1CのＣ末端付近の大型側
鎖を有するクラスターのY514、F530、F531と、C186とC
201、C461およびC471との間の２つのジスルフィド結合
もあった。Ｒドメインの初期の不適切な適合をプロフィ
ールウィンドウプロット（profile window plot）（Ｌ
thy,et al.,1992,Nature 356:83−85）で検知し調整
した。精製反復サイクルを各データセットに対して2.5
オングストロームで独立して行った。各形態の原子モデ
ルは、本質的に結晶パッキングを除き一致する。相修飾
と精製については別途説明する。モデルの評価精度は、
MIRおよび密度修正マップに対するモデルの適合と、結
晶学的Ｒ因子と、実空間Ｒ因子（Jones et al.,1991,Ac
ta Cryst A47:110−119）と、わずか４％だけ結晶学的
Ｒ因子より高い自由Ｒ値（free R−value）（Brnger,
1992,Nature 355:472−475）と、プロフィールウィンド
ウプロット（profile window plots）（Ｌthy et a
l.,1992,Nature 356:83−85）に依存する。精製の目下
の段階では、原子モデルと結晶学的モデルとの一致は、
形態１、形態３および形態４各々に対して21.1％、21.6
％、21.9％のＲ因子によって特徴付けられ、観察された
すべてのデータは、６オングストロームから2.5オング
ストロームまでの分解能では１σ（Fob）を超えるFobで
ある。
最終モデルは、個々の等方性温度因子を有する4137の
非水素原子から成る。このモデルは、触媒Ｃドメインの
活性部位の裂け目（クレフト、cleft）にApUpも有する
が、溶媒原子は含まない。電子密度マップでほは定義が
不十分な領域があり、残基170番から172番、190番から1
95番、389番から390番および500番から503番に対する主
鎖密度は、旨く定義されていない。残基190番から195番
は、第一のジスルフィドループのタンパク質分解酵素感
応領域の一部であり、ニッキングが行われる。この領域
は、本質的に可変し得る。貫膜（Ｔ）ドメインとＲドメ
インとの間のループは残基389番から390番を有するが、
同様に可変し得る。
非水素原子から成る。このモデルは、触媒Ｃドメインの
活性部位の裂け目（クレフト、cleft）にApUpも有する
が、溶媒原子は含まない。電子密度マップでほは定義が
不十分な領域があり、残基170番から172番、190番から1
95番、389番から390番および500番から503番に対する主
鎖密度は、旨く定義されていない。残基190番から195番
は、第一のジスルフィドループのタンパク質分解酵素感
応領域の一部であり、ニッキングが行われる。この領域
は、本質的に可変し得る。貫膜（Ｔ）ドメインとＲドメ
インとの間のループは残基389番から390番を有するが、
同様に可変し得る。
表１は、データ収集、相決定、精製の観点から纏めた
ものである。
ものである。
表１の説明
結晶形態１、３および４を本発明の試験に用いた（Fu
jii,et al.,1991,J Mol Biol,222:861−864）。
jii,et al.,1991,J Mol Biol,222:861−864）。
回析データが、Xuong−Hamlin設計の２パネルエリア
検出器（２−panel area detector）を備え、8.5kWで動
作するRigaku AFC−６回折計に収集された（San Diego
Multiwire Systems,San Diego,CA）。画像は、0.1゜の
振動フレーム（oscillation frames）として記録され、
50フレーム（５゜）のバッチに集約され合わせられる。
集約した強度は、FOURIER変倍方法（scaling method）
で変倍し合併する（Weissman,L.1979.博士論文，ロサン
ゼルス、カリフォルニア州立大学）。形態４固有のデー
タおよび誘導体データ（derivative data）は、2.5オン
グストロームまでRAXISイメージングプレート装置（ima
ging plate system）を用いて収集された。
検出器（２−panel area detector）を備え、8.5kWで動
作するRigaku AFC−６回折計に収集された（San Diego
Multiwire Systems,San Diego,CA）。画像は、0.1゜の
振動フレーム（oscillation frames）として記録され、
50フレーム（５゜）のバッチに集約され合わせられる。
集約した強度は、FOURIER変倍方法（scaling method）
で変倍し合併する（Weissman,L.1979.博士論文，ロサン
ゼルス、カリフォルニア州立大学）。形態４固有のデー
タおよび誘導体データ（derivative data）は、2.5オン
グストロームまでRAXISイメージングプレート装置（ima
ging plate system）を用いて収集された。
重原子誘導体。KOSすなわちK2OSO4を３日間、人工母
液（12％PEG8000、0.43Mの塩化ナトリウム、43mMのトリ
ス塩化水素、pH7.8）を飽和濃度にして浸軟させた。CNP
すなわち４−クロロ−２−ニトロ−水銀フェノールを人
工母液を飽和濃度にして５日間浸漬させた。KNPはKOSと
CNPの１対１混合物である。CAP、すなわちトランス−ジ
クロロジアミン白金（II）を３日間2mg/mlで人工母液に
浸漬した。KAPはKOSとCAPの１対１混合物である。GCL
（HgCl2）は人口母液に３日間2mg/mlで浸漬した。
液（12％PEG8000、0.43Mの塩化ナトリウム、43mMのトリ
ス塩化水素、pH7.8）を飽和濃度にして浸軟させた。CNP
すなわち４−クロロ−２−ニトロ−水銀フェノールを人
工母液を飽和濃度にして５日間浸漬させた。KNPはKOSと
CNPの１対１混合物である。CAP、すなわちトランス−ジ
クロロジアミン白金（II）を３日間2mg/mlで人工母液に
浸漬した。KAPはKOSとCAPの１対１混合物である。GCL
（HgCl2）は人口母液に３日間2mg/mlで浸漬した。
重原子パラメータを改善し、プログラムHEAVY（Terwi
lliger et al.,1987,Acta Cryst,A431−５）を用いてMI
R相を算出した。出願者らは、初期に形態３の結晶に対
するOs誘導体を得た。3.5オングストロームに溶媒を偏
平化（flattening）した後、単回同形置換（single iso
morphous replacement、SIR）相に基づいて電子密度か
ら分子の形状を３つの領域を有するものと解釈した。
lliger et al.,1987,Acta Cryst,A431−５）を用いてMI
R相を算出した。出願者らは、初期に形態３の結晶に対
するOs誘導体を得た。3.5オングストロームに溶媒を偏
平化（flattening）した後、単回同形置換（single iso
morphous replacement、SIR）相に基づいて電子密度か
ら分子の形状を３つの領域を有するものと解釈した。
ただし、二次構造は容易に解釈できず、ポリペプチド鎖
の経路を定義することは難しかった。良質の形態３の結
晶がなかったので、さらに重原子誘導体を研究すること
ができなかった。したがって、出願者らは形態４の結晶
について研究することにした。形態４のMIR相は、同形
の差異と異形の差異とを利用して、得られた形態である
６個の重原子誘導体であった。Os誘導体およびPt誘導体
は同形差パターソンマップ（Patterson functions）に
よって、Hg誘導体は差フーリエ合成（difference Fouri
er synthesis）によって、それぞれ解決された。形態４
および形態３のOs誘導体は、単一点結合が同じであっ
た。
の経路を定義することは難しかった。良質の形態３の結
晶がなかったので、さらに重原子誘導体を研究すること
ができなかった。したがって、出願者らは形態４の結晶
について研究することにした。形態４のMIR相は、同形
の差異と異形の差異とを利用して、得られた形態である
６個の重原子誘導体であった。Os誘導体およびPt誘導体
は同形差パターソンマップ（Patterson functions）に
よって、Hg誘導体は差フーリエ合成（difference Fouri
er synthesis）によって、それぞれ解決された。形態４
および形態３のOs誘導体は、単一点結合が同じであっ
た。
溶媒偏平化（flattening）。形態４の初期の電子密度
マップは、3.0オングストロームから3.2オングストロー
ムまで拡張された相など、相を修飾して、Wangの相拡張
アルゴリズムによって、反復溶媒偏平化プロシージャ
（iterative solvent flattening procedure）（Wang,1
985,Methods in Enzymol,115:90−112）を利用し、3.0
オングストロームで算出された。溶媒容量の45％を使用
して、すべてのタンパク質密度がタンパク質マスクに含
まれるようにしたが、分子量から概算した57％よりも幾
分少なかった。これらのマップから、すべての二次構造
を識別し、初期のモデルをポリアラニン鎖を用いて構成
した。
マップは、3.0オングストロームから3.2オングストロー
ムまで拡張された相など、相を修飾して、Wangの相拡張
アルゴリズムによって、反復溶媒偏平化プロシージャ
（iterative solvent flattening procedure）（Wang,1
985,Methods in Enzymol,115:90−112）を利用し、3.0
オングストロームで算出された。溶媒容量の45％を使用
して、すべてのタンパク質密度がタンパク質マスクに含
まれるようにしたが、分子量から概算した57％よりも幾
分少なかった。これらのマップから、すべての二次構造
を識別し、初期のモデルをポリアラニン鎖を用いて構成
した。
モデル構成は、プログラムFRODO（Jones,1985,Method
s in Enzymol 115:157−171）とプログラムＯのフラグ
メント適合ルーチン（Jones et al.,1991,Acta Cryst,A
47）とを利用して手早く行った。人為的に構成したα炭
素配位から着手し、主鎖原子を34の十分に精製したタン
パク質構造のデータベースを用いて加えた。次に、側鎖
を回転異性体データベースを利用して加えた（Ponder e
t al.,1987,J Mol Biol,193;775−791）。
s in Enzymol 115:157−171）とプログラムＯのフラグ
メント適合ルーチン（Jones et al.,1991,Acta Cryst,A
47）とを利用して手早く行った。人為的に構成したα炭
素配位から着手し、主鎖原子を34の十分に精製したタン
パク質構造のデータベースを用いて加えた。次に、側鎖
を回転異性体データベースを利用して加えた（Ponder e
t al.,1987,J Mol Biol,193;775−791）。
精製。この初期のモデルは、電子密度マップを目視検
査して調整した後、プログラムXPLORの刺激アニーリン
グプロトコル（simulated annealing protocol）（Br
ger,1990,Acta cryst,A46:585−593）によって精製され
た。形態１、３および４のジフテリア毒素の相対的配向
は、形態１および形態３のデータに対する形態４の精製
モデルをパターソンの空間回転翻訳サーチ（Patterson
−space roration and translation search）によって
決定された。形態１のデータに対する２種のトップソリ
ューション（９σ）は、非対称単位の非結晶学的対称に
よって関連づけられる２本のジフテリア毒素鎖に対応し
た。形態４から形態１への形質転換は、本質的にはC2か
らP1への配位系の変化であり、C2の結晶学的回転軸は、
P1の軸（110）にほぼ平行なP1の非結晶学的回転対称軸
になる。形態３に対するトップソリューションの１つ
（７σ）は、方向を問わず0.5゜未満の回転に対応し
た。形態４から形態３への形質転換は、本質的には、軸
ａに沿った５オングストロームの翻訳である。この結果
は、形態３と形態４の間の0kl反射の構造因子の最大反
応（amplitudes）の平均絶対差は、15％であり、hk0ま
たはh0Lの場合の差は不規則に近い（Ｒ＝48％）。ま
た、モデルをSIR相に基づく形態３に対する溶媒偏平化
電子密度マップに重ね合わせた場合、二次構造の大半
は、ガイドとしてのモデルとともに認められた。3.0オ
ングストロームでMIR相とSIR相を用いた場合、形態４と
形態３の間の密度の実空間平均によって、この段階で密
度マップは改善された。続いて、形態３および形態４に
ついて、溶媒偏平化（flattening）、ヒストグラム適
合、およびSayreの式に基づいたアルゴリズムによっ
て、実験相を2.5オングストロームに拡張した（Zhongお
よびMain,1991,Acta Cryst,A46:377−381）。2.5オン
グストロームでの形態３のマップは、さらに、形態４の
マップでスキュー（skew）され、平均化された。これら
は、最も解釈しやすいマップであった。原子モデルの精
製は、６オングストロームから2.5オングストロームま
でFobが１σ（Fob）を超えるデータをすべて利用して、
形態１、形態３および形態４について別々に行われた。
査して調整した後、プログラムXPLORの刺激アニーリン
グプロトコル（simulated annealing protocol）（Br
ger,1990,Acta cryst,A46:585−593）によって精製され
た。形態１、３および４のジフテリア毒素の相対的配向
は、形態１および形態３のデータに対する形態４の精製
モデルをパターソンの空間回転翻訳サーチ（Patterson
−space roration and translation search）によって
決定された。形態１のデータに対する２種のトップソリ
ューション（９σ）は、非対称単位の非結晶学的対称に
よって関連づけられる２本のジフテリア毒素鎖に対応し
た。形態４から形態１への形質転換は、本質的にはC2か
らP1への配位系の変化であり、C2の結晶学的回転軸は、
P1の軸（110）にほぼ平行なP1の非結晶学的回転対称軸
になる。形態３に対するトップソリューションの１つ
（７σ）は、方向を問わず0.5゜未満の回転に対応し
た。形態４から形態３への形質転換は、本質的には、軸
ａに沿った５オングストロームの翻訳である。この結果
は、形態３と形態４の間の0kl反射の構造因子の最大反
応（amplitudes）の平均絶対差は、15％であり、hk0ま
たはh0Lの場合の差は不規則に近い（Ｒ＝48％）。ま
た、モデルをSIR相に基づく形態３に対する溶媒偏平化
電子密度マップに重ね合わせた場合、二次構造の大半
は、ガイドとしてのモデルとともに認められた。3.0オ
ングストロームでMIR相とSIR相を用いた場合、形態４と
形態３の間の密度の実空間平均によって、この段階で密
度マップは改善された。続いて、形態３および形態４に
ついて、溶媒偏平化（flattening）、ヒストグラム適
合、およびSayreの式に基づいたアルゴリズムによっ
て、実験相を2.5オングストロームに拡張した（Zhongお
よびMain,1991,Acta Cryst,A46:377−381）。2.5オン
グストロームでの形態３のマップは、さらに、形態４の
マップでスキュー（skew）され、平均化された。これら
は、最も解釈しやすいマップであった。原子モデルの精
製は、６オングストロームから2.5オングストロームま
でFobが１σ（Fob）を超えるデータをすべて利用して、
形態１、形態３および形態４について別々に行われた。
ジフテリア毒素の構造−結果
ジフテリア毒素は、インタードメインリンカー（inte
rdomain linker）によって接続させた３つの隣接領域か
ら成る。Ｎ末端Ｃドメインは残基１番から193番まで、
中間のＴドメインは残基205番から378番まで、Ｃ末端Ｒ
ドメインは残基386番から535番までから各々成る。ジフ
テリア毒素は、Ｔドメインで形成された塩基で形づくら
れたＹ型をしており、Ｙの一方の腕はＣドメインで形成
され、他方はＲドメインで形成されている。このＹは、
約90オングストロームの高さで、Ｙの腕の頂点間の距離
は約50オングストロームであるが、厚さは30オングスト
ロームしかない（図１）。
rdomain linker）によって接続させた３つの隣接領域か
ら成る。Ｎ末端Ｃドメインは残基１番から193番まで、
中間のＴドメインは残基205番から378番まで、Ｃ末端Ｒ
ドメインは残基386番から535番までから各々成る。ジフ
テリア毒素は、Ｔドメインで形成された塩基で形づくら
れたＹ型をしており、Ｙの一方の腕はＣドメインで形成
され、他方はＲドメインで形成されている。このＹは、
約90オングストロームの高さで、Ｙの腕の頂点間の距離
は約50オングストロームであるが、厚さは30オングスト
ロームしかない（図１）。
３ドメイン各々の層は異なっている。Ｃドメインは、
CB1からCB8までの８本のβ鎖とCH1からCH7までの７つの
αヘリックスとの混合構造である。これらの８本のβ鎖
は、各々３本鎖と５本鎖から成るβシートを形成する。
このβシートは、７個のショートヘリックスに囲まれた
コアを形成する。Ｃドメイン全体の重なりは、緑膿菌外
毒素Ａ（ETA）と、特に活性部位に近い点が似ている（A
llured et al.,1986,Proc Natl Acad Sci USA 83:1320
−1324）が、この結果はアミノ酸配列の類似性が低いこ
とから予想されていた（Carroll et al.,1988,Mol Micr
obiol 2:293−296、Brandhuber et al.,1988,Proteins
３:146−154）。Sixmaら、（Sixma et al.,1991,Nature
351 371−377）は、最近、E.col熱不安定性エンテロト
キシンの活性部位の重なりが、ETAの重なりと非常に密
接に類似していることを証明した。Ｔドメインは、TH1
からTH9までの９個のヘリックスを含み、それらは３つ
のヘリックス層に折り重ねられている。各層は、２つ以
上の逆平行ヘリックスによって形成されている。同様の
特徴は、コリシンＡのチャネル形成ドメインの構造にも
認められている（Parker et al.,1989,Nature 377:93−
96）。Ｒドメインは、RB1からRB10までの10本のβ鎖を
含み、そのうちRB2からRB10までの９本は、２つのβシ
ートを構成する。これら２つのβシートは、ゼリーロー
ル層と同様のトポロジーでβサンドイッチを形成する
（Richardson,1981,Adv Protein Chem 34:167−339）。
ジフテリア毒素の３ドメインの構成は、他の二つの細菌
性毒素すなわちETAとBacillus thuringiensis由来のδ
−エンドトキシンが共有している（Li et al.,1991,Nat
ure 353:815−821）。ジフテリア毒素およびETAの触媒
ドメインは、構造および機能においてこれらのドメイン
すべての中で最も良く似ている。
CB1からCB8までの８本のβ鎖とCH1からCH7までの７つの
αヘリックスとの混合構造である。これらの８本のβ鎖
は、各々３本鎖と５本鎖から成るβシートを形成する。
このβシートは、７個のショートヘリックスに囲まれた
コアを形成する。Ｃドメイン全体の重なりは、緑膿菌外
毒素Ａ（ETA）と、特に活性部位に近い点が似ている（A
llured et al.,1986,Proc Natl Acad Sci USA 83:1320
−1324）が、この結果はアミノ酸配列の類似性が低いこ
とから予想されていた（Carroll et al.,1988,Mol Micr
obiol 2:293−296、Brandhuber et al.,1988,Proteins
３:146−154）。Sixmaら、（Sixma et al.,1991,Nature
351 371−377）は、最近、E.col熱不安定性エンテロト
キシンの活性部位の重なりが、ETAの重なりと非常に密
接に類似していることを証明した。Ｔドメインは、TH1
からTH9までの９個のヘリックスを含み、それらは３つ
のヘリックス層に折り重ねられている。各層は、２つ以
上の逆平行ヘリックスによって形成されている。同様の
特徴は、コリシンＡのチャネル形成ドメインの構造にも
認められている（Parker et al.,1989,Nature 377:93−
96）。Ｒドメインは、RB1からRB10までの10本のβ鎖を
含み、そのうちRB2からRB10までの９本は、２つのβシ
ートを構成する。これら２つのβシートは、ゼリーロー
ル層と同様のトポロジーでβサンドイッチを形成する
（Richardson,1981,Adv Protein Chem 34:167−339）。
ジフテリア毒素の３ドメインの構成は、他の二つの細菌
性毒素すなわちETAとBacillus thuringiensis由来のδ
−エンドトキシンが共有している（Li et al.,1991,Nat
ure 353:815−821）。ジフテリア毒素およびETAの触媒
ドメインは、構造および機能においてこれらのドメイン
すべての中で最も良く似ている。
触媒ドメイン
我々は、Ｃドメインは、活性部位クレフト（cleft）
の境界を定める２つのβシートサブドメインから形成さ
れていると考えている（図２）。これらのβシートは、
互いに概ね垂直に配向され、ドメインの中核を成してい
る。サブドメインの一つは、β鎖CB2、CB4およびCB8か
ら成り、αヘリックスCH2、CH3、CH6およびCH7によって
囲まれている。他のサブドメインは、ヘリックスCH1、C
H4、およびCH5によって囲まれたβ鎖CB1、CB3、CB5、CB
6、およびCB7から成る。２つのサブドメインは、伸張ル
ープCL1からCL4によって接続され、これによって２つの
サブドメインは連結されている。これらの４ループは、
潜在的に柔軟性があり、細長い形状に拡張すらできると
思われる。Ｃドメインは、膜輸送中でこの部分的に重な
らない構造になり得ると考えられる。
の境界を定める２つのβシートサブドメインから形成さ
れていると考えている（図２）。これらのβシートは、
互いに概ね垂直に配向され、ドメインの中核を成してい
る。サブドメインの一つは、β鎖CB2、CB4およびCB8か
ら成り、αヘリックスCH2、CH3、CH6およびCH7によって
囲まれている。他のサブドメインは、ヘリックスCH1、C
H4、およびCH5によって囲まれたβ鎖CB1、CB3、CB5、CB
6、およびCB7から成る。２つのサブドメインは、伸張ル
ープCL1からCL4によって接続され、これによって２つの
サブドメインは連結されている。これらの４ループは、
潜在的に柔軟性があり、細長い形状に拡張すらできると
思われる。Ｃドメインは、膜輸送中でこの部分的に重な
らない構造になり得ると考えられる。
Ｃドメインの活性部位クレフト（cleft）は、ジヌク
レオチドApUpの結合によって識別され、β鎖CB2、CB3、
CH3、CB7とループ、CL2によって一次的に構成され、Ｒ
ドメインのβ鎖RB6によって結合される。活性部位クレ
フト（cleft）内にあるのは、触媒の重要な役割を果た
すと思われるGlu148（Carroll et al.,1984,Acad Sci U
SA 81:3307−3311）と、NAD+結合に関与したHis21（Pap
ini et al.,1989,J Biol Chem 264:12685−12388）およ
びTyr65（Papini et al.,1991,J Biol Chem,266:2494−
2498）および、Gly52（Carroll et al.,1984,Proc Natl
Acad Sci USA,81:3307−3311、Giannini et al.,1984,
Nuc Acid Res,12:4063−4069）、Trp50（Collins et a
l.,1985,Biochim Biophys Acta 828:138−143）、Lys39
（Zhao et al.,1988,Biochemistry,27:3398−3403）やL
ys474（Proia,1980,J Biol Chem,255:12025−12033）な
どの活性部位またはその付近にあることが示唆されるそ
の他のさまざまな残基である。ジフテリア毒素およびET
AのＣドメインのα炭素配位の方形重複が最小になれ
ば、85残基（ジフテリア毒素の16番から33番まで、34番
から38番まで、49番から66番まで、75番から90番まで、
91番から96番まで、131番から136番まで、147番から164
番までと、ETAの437番から452番まで、454番から458番
まで、465番から482番まで、493番から508番まで、511
番から516番まで、540番から545番まで、552番から569
番まで）の間のr.m.s.差は、1.44オングストロームにな
る。
レオチドApUpの結合によって識別され、β鎖CB2、CB3、
CH3、CB7とループ、CL2によって一次的に構成され、Ｒ
ドメインのβ鎖RB6によって結合される。活性部位クレ
フト（cleft）内にあるのは、触媒の重要な役割を果た
すと思われるGlu148（Carroll et al.,1984,Acad Sci U
SA 81:3307−3311）と、NAD+結合に関与したHis21（Pap
ini et al.,1989,J Biol Chem 264:12685−12388）およ
びTyr65（Papini et al.,1991,J Biol Chem,266:2494−
2498）および、Gly52（Carroll et al.,1984,Proc Natl
Acad Sci USA,81:3307−3311、Giannini et al.,1984,
Nuc Acid Res,12:4063−4069）、Trp50（Collins et a
l.,1985,Biochim Biophys Acta 828:138−143）、Lys39
（Zhao et al.,1988,Biochemistry,27:3398−3403）やL
ys474（Proia,1980,J Biol Chem,255:12025−12033）な
どの活性部位またはその付近にあることが示唆されるそ
の他のさまざまな残基である。ジフテリア毒素およびET
AのＣドメインのα炭素配位の方形重複が最小になれ
ば、85残基（ジフテリア毒素の16番から33番まで、34番
から38番まで、49番から66番まで、75番から90番まで、
91番から96番まで、131番から136番まで、147番から164
番までと、ETAの437番から452番まで、454番から458番
まで、465番から482番まで、493番から508番まで、511
番から516番まで、540番から545番まで、552番から569
番まで）の間のr.m.s.差は、1.44オングストロームにな
る。
ApUpであるジヌクレオチドは競合的にNAD+に結合する
ので、活性部位の基質NAD+の位置を概ね推定することが
できる。ApUp（NAD+について８μＭまでから16μＭまで
と比較して0.3nM）の親和力が高い場合（Carroll et a
l.,1986,Biochemistry,25:2425−2430）、Ｃドメインと
多重接触し、ApUpの3'−末端リン酸とThr42およびＲド
メインの残基であるArg458'の側鎖との間に塩橋が生じ
る可能性がある。結合ApUpの構造はNAD+に類似している
が、NAD+とApUpの共有構造には、クレフト（cleft）に
おけるNAD+のコンホメーションの予測が困難であるとい
う十分な差異がある。NAD+のリン酸アデニン部分がApUp
の同じコンホメーション部分に結合すると仮定すると、
ニコチンアミド環がウリジン環の部位に近接することに
なる。これによってニコチンアミド環はHis21、Tyr65お
よびGlu148の側鎖に隣接する。
ので、活性部位の基質NAD+の位置を概ね推定することが
できる。ApUp（NAD+について８μＭまでから16μＭまで
と比較して0.3nM）の親和力が高い場合（Carroll et a
l.,1986,Biochemistry,25:2425−2430）、Ｃドメインと
多重接触し、ApUpの3'−末端リン酸とThr42およびＲド
メインの残基であるArg458'の側鎖との間に塩橋が生じ
る可能性がある。結合ApUpの構造はNAD+に類似している
が、NAD+とApUpの共有構造には、クレフト（cleft）に
おけるNAD+のコンホメーションの予測が困難であるとい
う十分な差異がある。NAD+のリン酸アデニン部分がApUp
の同じコンホメーション部分に結合すると仮定すると、
ニコチンアミド環がウリジン環の部位に近接することに
なる。これによってニコチンアミド環はHis21、Tyr65お
よびGlu148の側鎖に隣接する。
ドメインの接合点
ジフテリア毒素の分子内の２カ所のジスルフィド結合
は、分子表面上でハンドル様のループTL1を架橋する
（図1a）。この187番から200番までの14残基ループは、
フラグメントＡをフラグメントＢに連結する。このルー
プは、Argに富んでおり、容易にプロテアーゼによって
ニッキングされることが知られている（Moskaug et a
l.,1989,J Biol Chem 264:15709−15713、Collier et a
l.,1971,J Biol Chem 246:1496−1503）。このループを
ニッキングすると、フラグメントＡおよびＢは、ジスル
フィド結合によってのみ共有結合をする。ニッキングが
ジフテリア毒素の細胞障害作用に役割を果たす証拠はあ
り（Sandvig et al.,1981,J Biol Chem 256:9068−907
6）、ニッキングされたジフテリア毒素は、毒素の膜輸
送中に、このジスルフィド結合がエンドソームを減少さ
せる環境に晒される場合、遊離フラグメントＡとフラグ
メントＢに分離すると考えられている。第２のジスルフ
ィド結合では、フラグメントＢ内で残基461番と471番の
間に９残基ループが形成される。このループ付近の残基
456番、458番、460番、472番、474番は、正の電荷に富
み、活性部位クレフト（cleft）に面し、恐らくは、い
わゆるリン酸結合である「Ｐ部位」（Lory et al.,198
0,Proc Natl Acad Sci USA 77:267−271）を形成してい
る。
は、分子表面上でハンドル様のループTL1を架橋する
（図1a）。この187番から200番までの14残基ループは、
フラグメントＡをフラグメントＢに連結する。このルー
プは、Argに富んでおり、容易にプロテアーゼによって
ニッキングされることが知られている（Moskaug et a
l.,1989,J Biol Chem 264:15709−15713、Collier et a
l.,1971,J Biol Chem 246:1496−1503）。このループを
ニッキングすると、フラグメントＡおよびＢは、ジスル
フィド結合によってのみ共有結合をする。ニッキングが
ジフテリア毒素の細胞障害作用に役割を果たす証拠はあ
り（Sandvig et al.,1981,J Biol Chem 256:9068−907
6）、ニッキングされたジフテリア毒素は、毒素の膜輸
送中に、このジスルフィド結合がエンドソームを減少さ
せる環境に晒される場合、遊離フラグメントＡとフラグ
メントＢに分離すると考えられている。第２のジスルフ
ィド結合では、フラグメントＢ内で残基461番と471番の
間に９残基ループが形成される。このループ付近の残基
456番、458番、460番、472番、474番は、正の電荷に富
み、活性部位クレフト（cleft）に面し、恐らくは、い
わゆるリン酸結合である「Ｐ部位」（Lory et al.,198
0,Proc Natl Acad Sci USA 77:267−271）を形成してい
る。
この構造は、ＣドメインがフラグメントＡとフラグメ
ントＢの形態に解離するまでの間、EF−２のADPのリボ
シル化を触媒する際に、どうしてジフテリア毒素全体は
不活性であるのかということを示唆する。図1bに示すよ
うに、活性部位は、ＣドメインとＲドメインのインタフ
ェースで形成されている。活性部位へのエントリーは、
18残基ループCL2とＲドメインによって遮蔽されてい
る。このため、ジフテリア毒素全体では、活性部位への
EF−２（Mr＝〜100K）のアプローチは遮断されている。
ジフテリア毒素全体の中で活性部位はNAD+に接近できる
が、生理学的には重要ではないと思われる低速度の側鎖
反応であるNAD-糖加水分解（glycohydrolysis）を触媒
する。ループCL2内で二次構成要素が不足すれば、その
ループの主鎖原子が実質的に移動できるので、活性部位
に基質を侵入させることができる。
ントＢの形態に解離するまでの間、EF−２のADPのリボ
シル化を触媒する際に、どうしてジフテリア毒素全体は
不活性であるのかということを示唆する。図1bに示すよ
うに、活性部位は、ＣドメインとＲドメインのインタフ
ェースで形成されている。活性部位へのエントリーは、
18残基ループCL2とＲドメインによって遮蔽されてい
る。このため、ジフテリア毒素全体では、活性部位への
EF−２（Mr＝〜100K）のアプローチは遮断されている。
ジフテリア毒素全体の中で活性部位はNAD+に接近できる
が、生理学的には重要ではないと思われる低速度の側鎖
反応であるNAD-糖加水分解（glycohydrolysis）を触媒
する。ループCL2内で二次構成要素が不足すれば、その
ループの主鎖原子が実質的に移動できるので、活性部位
に基質を侵入させることができる。
膜内外ドメイン
ジフテリア毒素について解決できていない大きな疑問
は、pHが低い環境のエンドソームがどのようにジフテリ
ア毒素のエンドソーム膜への挿入を誘発し、この挿入に
よってＣドメインへの細胞質輸送がどのように容易にな
るのかである。Ｔドメインの構造には、膜へのpH誘発に
よる挿入がどのように行われるかを示唆する２つの特徴
がある。第１の特徴は、Ｔドメインが完全にαヘリック
ス状であり、既知および提案された膜内外タンパク質に
類似し、αヘリックスの中には球状タンパク質よりも膜
内外ヘリックスに典型的に見られる疎水特性を示すもの
があることである（Ress et al.,1989,Science 245:510
−513）。９個のヘリックスは、ほぼ３層に配置され、
各層はヘリックスの逆平行対から成る。２つの長いＣ末
端ヘリックスTH8およびTH9は、通常無極性であり、中心
のコア層を構成する。ヘリックスTH5からTH7までから成
るフランキング層は、疎水ヘリックスTH6およびTH7も含
む。対照的に、残りの層はヘリックスTH1からTH3までか
ら成り、球状タンパク質と比較しても極めて疎水性があ
る。Ｔドメインに関する第２の注目すべき特徴は、これ
らのらせん対を接続するループの酸の組成である。すな
わち、ヘリックスTH5とTH6の間のループTL3と、疎水ヘ
リックスTH8とTH9の間のループTL5は、合計６個のAsp残
基とGlu残基を含む（図3a）。pHが中性の場合、これら
のループは非常に帯電しており、水溶性である。しか
し、酸性pHでは、これらの残基は少なくとも部分的にプ
ロトン化されているので、特に、表面の電位によってさ
らにプロトン濃度が高い膜表面付近では、さらに中性に
近くなり、膜に溶けやすくなる（McLaughlin,1977,Curr
Topics Memb Transport ９:71−144）。このため、エ
ンドソーム内側の低いpHは、これらのチップ形状のルー
プを膜溶性「ダガー（dagger）」にする傾向があり、２
つの無極性らせん対が膜に導かれることになる。
は、pHが低い環境のエンドソームがどのようにジフテリ
ア毒素のエンドソーム膜への挿入を誘発し、この挿入に
よってＣドメインへの細胞質輸送がどのように容易にな
るのかである。Ｔドメインの構造には、膜へのpH誘発に
よる挿入がどのように行われるかを示唆する２つの特徴
がある。第１の特徴は、Ｔドメインが完全にαヘリック
ス状であり、既知および提案された膜内外タンパク質に
類似し、αヘリックスの中には球状タンパク質よりも膜
内外ヘリックスに典型的に見られる疎水特性を示すもの
があることである（Ress et al.,1989,Science 245:510
−513）。９個のヘリックスは、ほぼ３層に配置され、
各層はヘリックスの逆平行対から成る。２つの長いＣ末
端ヘリックスTH8およびTH9は、通常無極性であり、中心
のコア層を構成する。ヘリックスTH5からTH7までから成
るフランキング層は、疎水ヘリックスTH6およびTH7も含
む。対照的に、残りの層はヘリックスTH1からTH3までか
ら成り、球状タンパク質と比較しても極めて疎水性があ
る。Ｔドメインに関する第２の注目すべき特徴は、これ
らのらせん対を接続するループの酸の組成である。すな
わち、ヘリックスTH5とTH6の間のループTL3と、疎水ヘ
リックスTH8とTH9の間のループTL5は、合計６個のAsp残
基とGlu残基を含む（図3a）。pHが中性の場合、これら
のループは非常に帯電しており、水溶性である。しか
し、酸性pHでは、これらの残基は少なくとも部分的にプ
ロトン化されているので、特に、表面の電位によってさ
らにプロトン濃度が高い膜表面付近では、さらに中性に
近くなり、膜に溶けやすくなる（McLaughlin,1977,Curr
Topics Memb Transport ９:71−144）。このため、エ
ンドソーム内側の低いpHは、これらのチップ形状のルー
プを膜溶性「ダガー（dagger）」にする傾向があり、２
つの無極性らせん対が膜に導かれることになる。
Ｔドメインのその他の構造的特性は、膜への挿入能力
があり、Ｃドメインの輸送を支援できることである。第
１の特性は、他の層が挿入された場合には、ヘリックス
３層のほぼ平行なパッキングを第１のヘリックス層（TH
1〜TH3）の膜表面に拡散させることができることであ
る。この挿入では、ループが局部的にコンホメーション
変化しなければならないが、らせん自体は変化しなくて
良い。顕著な疎水非対称性は提案された再配置と適合
し、16のLys残基の15およびArg残基とＴドメインの全て
の6His残基は、「ダガー（dagger）」先端から反対側に
位置し（図3b）、Asp残基とGlu残基が中性化されれば、
ドメイン全体を疎水双極子にする。つまり、我々は、ヘ
アピンループTL5と恐らくはTL3とを、膜に交差させ、As
p残基とGlu残基を再び中性pHの細胞質に充填することを
提案しているのである。
があり、Ｃドメインの輸送を支援できることである。第
１の特性は、他の層が挿入された場合には、ヘリックス
３層のほぼ平行なパッキングを第１のヘリックス層（TH
1〜TH3）の膜表面に拡散させることができることであ
る。この挿入では、ループが局部的にコンホメーション
変化しなければならないが、らせん自体は変化しなくて
良い。顕著な疎水非対称性は提案された再配置と適合
し、16のLys残基の15およびArg残基とＴドメインの全て
の6His残基は、「ダガー（dagger）」先端から反対側に
位置し（図3b）、Asp残基とGlu残基が中性化されれば、
ドメイン全体を疎水双極子にする。つまり、我々は、ヘ
アピンループTL5と恐らくはTL3とを、膜に交差させ、As
p残基とGlu残基を再び中性pHの細胞質に充填することを
提案しているのである。
受容体結合ドメイン
Ｒドメインは、２つのβシートから形成される。β鎖
RB2、RB3、RB5およびRB8は、４連鎖（four−stranded）
βシートを形成し、β鎖RB4、RB6、RB7、RB9およびRB10
を含む５連鎖（five−stranded）βシートに面する。RB
6は水素結合によって両方のβシートに相互作用する。
これらの鎖の接続は、Ｒドメインが逆平行β鎖からのみ
形成される多くのタンパク質で見られるゼリーロールト
ポロジーに類似しているようなものである（Richardso
n,1981,J Adv Protein Chem 34:167−339）。ゼリーロ
ールドメインは、ウイルス性被覆タンパク質と、腫瘍壊
死因子と、ETAの受容体結合ドメインを有する。このド
メインは、「前方」のシートに鎖２があり「後方」には
鎖10がある点が厳密なゼリーロールトポロジーとは幾分
異なる（図４）。Ｒドメインは、免疫グロブリン（Ig）
の可変ドメインと良く似ているが、鎖４と７との間に鎖
５と６が「挿入」し、４と５の間の２本の短い鎖（図４
ではＣ′とC"）が内点がIg層とは異なる。トポロジーが
ゼリーロールと厳密に似ているＲ領域のタンパク質は、
図４の右側であり、Ig可変ドメインに似たタンパク質
は、左側である。左側は、ジフテリア毒素単量体の残部
から離れている。このIg可変様の半分が受容体認識に関
与していると思われる。
RB2、RB3、RB5およびRB8は、４連鎖（four−stranded）
βシートを形成し、β鎖RB4、RB6、RB7、RB9およびRB10
を含む５連鎖（five−stranded）βシートに面する。RB
6は水素結合によって両方のβシートに相互作用する。
これらの鎖の接続は、Ｒドメインが逆平行β鎖からのみ
形成される多くのタンパク質で見られるゼリーロールト
ポロジーに類似しているようなものである（Richardso
n,1981,J Adv Protein Chem 34:167−339）。ゼリーロ
ールドメインは、ウイルス性被覆タンパク質と、腫瘍壊
死因子と、ETAの受容体結合ドメインを有する。このド
メインは、「前方」のシートに鎖２があり「後方」には
鎖10がある点が厳密なゼリーロールトポロジーとは幾分
異なる（図４）。Ｒドメインは、免疫グロブリン（Ig）
の可変ドメインと良く似ているが、鎖４と７との間に鎖
５と６が「挿入」し、４と５の間の２本の短い鎖（図４
ではＣ′とC"）が内点がIg層とは異なる。トポロジーが
ゼリーロールと厳密に似ているＲ領域のタンパク質は、
図４の右側であり、Ig可変ドメインに似たタンパク質
は、左側である。左側は、ジフテリア毒素単量体の残部
から離れている。このIg可変様の半分が受容体認識に関
与していると思われる。
Ｒ領域構造は、ジフテリア残基496番から512番から成
るβ鎖RB8とRB9との間の大型ループを示す。このループ
は、HA6DTペプチド内で唯一有意なサイズの柔軟なルー
プであり（上述のRolf et al）、疎水性があり表出され
ているので、このループは受容体結合領域の候補として
相応しい。アミノ酸残基521番から524番を有し、Ig可変
領域に類似する有意なループもある。このループは、49
6番から512番残基のループと組み合わせるか、別の結合
受容体領域として受容体結合において機能する。ループ
に対して、コンホメーションを修正するには、521番か
ら524番を囲む別のアミノ酸、例えば、残基517番から52
8番、517番から525番、517番から528番などを含む必要
もある。
るβ鎖RB8とRB9との間の大型ループを示す。このループ
は、HA6DTペプチド内で唯一有意なサイズの柔軟なルー
プであり（上述のRolf et al）、疎水性があり表出され
ているので、このループは受容体結合領域の候補として
相応しい。アミノ酸残基521番から524番を有し、Ig可変
領域に類似する有意なループもある。このループは、49
6番から512番残基のループと組み合わせるか、別の結合
受容体領域として受容体結合において機能する。ループ
に対して、コンホメーションを修正するには、521番か
ら524番を囲む別のアミノ酸、例えば、残基517番から52
8番、517番から525番、517番から528番などを含む必要
もある。
さらに、Ｔドメインの二次構造の最後の要素を接続す
るループ（残基378で終わるヘリックスTH9）とＲ領域の
第１の要素（残基386から始まるβ鎖RB1）がある。この
ループは、アミノ酸であるアラニン379番とトレオニン3
86番の間に存在するＲ領域の境界を定義する。この位置
から開始しジフテリア毒素のカルボキシ末端に及ぶＲ領
域のポリペプチドは、157アミノ酸（予想MWは、17,22
1）から150アミノ酸（予想MWは、16,480）までを含むと
考えらる（表２）。
るループ（残基378で終わるヘリックスTH9）とＲ領域の
第１の要素（残基386から始まるβ鎖RB1）がある。この
ループは、アミノ酸であるアラニン379番とトレオニン3
86番の間に存在するＲ領域の境界を定義する。この位置
から開始しジフテリア毒素のカルボキシ末端に及ぶＲ領
域のポリペプチドは、157アミノ酸（予想MWは、17,22
1）から150アミノ酸（予想MWは、16,480）までを含むと
考えらる（表２）。
ジフテリア毒素二量体
２つの単量体は、密接に結合し、一方のジフテリア毒
素分子のRB1/RB2と２つ折り回転対称（２−fold rotati
on symmetry）によって関連づけられる他方のジフテリ
ア毒素分子のRB2/RB1との間にインタフェースを有する
二量体を形成する（図1d）。このインタフェースは、結
晶パッキング時の主な３つのタンパク質−タンパク質接
触（protein−protei contct）の一つであり、単量体あ
たり３つの水素結合が関与する。これらの水素結合は、
RB1およびRB2の主鎖ＮおよびＣの原子との間で形成され
るので、十分に定義される。その他のインタフェース
は、３つの異なる結晶形態では共通点がない。二量体が
ジフテリア毒素受容体に結合できないこと（Carroll et
al.,1986,Biochemistry 25:2425−2430）は、二量体の
相互作用が立体的に標的細胞の表面の受容体から各単量
体の受容体結合ドメインを遮断することを示唆してい
る。二量体内の単量体と自然の単量体ジフテリア毒素の
コンホメーションの違いは、わかっていないが、生物化
学的な証拠から、大きな違いはないことが示唆される。
結合データから、ApUpに対する二量体の親和定数が単量
体の定数と同じであり、二量体は２つのApUpを結合する
ことがわかる（Carroll et al.,1986,Biochemistry,25:
2425−2430）。さらに、NAD−糖加水分解酵素（glycohy
drolase）活性の比較可能な特異活性とNAD+に対する親
和性が、単量体と二量体に認められた。還元後、二量体
から放出されたフラグメントＡの特異的なADP−リボシ
ル転移酵素活性は、単量体の活性と同じであった（Carr
oll et al.,1989,Biochemistry 25:2425−2430）。これ
らの所見は、ＣドメインのコンホメーションとＣドメイ
ンをインタフェースするＲドメイン部分のコンホメーシ
ョンは、二量体で相対的に摂動されない。
素分子のRB1/RB2と２つ折り回転対称（２−fold rotati
on symmetry）によって関連づけられる他方のジフテリ
ア毒素分子のRB2/RB1との間にインタフェースを有する
二量体を形成する（図1d）。このインタフェースは、結
晶パッキング時の主な３つのタンパク質−タンパク質接
触（protein−protei contct）の一つであり、単量体あ
たり３つの水素結合が関与する。これらの水素結合は、
RB1およびRB2の主鎖ＮおよびＣの原子との間で形成され
るので、十分に定義される。その他のインタフェース
は、３つの異なる結晶形態では共通点がない。二量体が
ジフテリア毒素受容体に結合できないこと（Carroll et
al.,1986,Biochemistry 25:2425−2430）は、二量体の
相互作用が立体的に標的細胞の表面の受容体から各単量
体の受容体結合ドメインを遮断することを示唆してい
る。二量体内の単量体と自然の単量体ジフテリア毒素の
コンホメーションの違いは、わかっていないが、生物化
学的な証拠から、大きな違いはないことが示唆される。
結合データから、ApUpに対する二量体の親和定数が単量
体の定数と同じであり、二量体は２つのApUpを結合する
ことがわかる（Carroll et al.,1986,Biochemistry,25:
2425−2430）。さらに、NAD−糖加水分解酵素（glycohy
drolase）活性の比較可能な特異活性とNAD+に対する親
和性が、単量体と二量体に認められた。還元後、二量体
から放出されたフラグメントＡの特異的なADP−リボシ
ル転移酵素活性は、単量体の活性と同じであった（Carr
oll et al.,1989,Biochemistry 25:2425−2430）。これ
らの所見は、ＣドメインのコンホメーションとＣドメイ
ンをインタフェースするＲドメイン部分のコンホメーシ
ョンは、二量体で相対的に摂動されない。
使用
ジフテリア毒素の３次元構造によって、Ｒドメインと
Ｔドメインとの境界が定義され、受容体結合機能は孤立
性の小型ドメインであるＲ領域に対応し、残基496番か
ら512番まで、および／または残基521番から524番まで
そのいずれかに最も位置付けられやすい（図５、配列番
号１）。このＲ領域ポリペプチドは、ジフテリアに対す
る新規のワクチンまたは治療剤の開発に用いることがで
きる。
Ｔドメインとの境界が定義され、受容体結合機能は孤立
性の小型ドメインであるＲ領域に対応し、残基496番か
ら512番まで、および／または残基521番から524番まで
そのいずれかに最も位置付けられやすい（図５、配列番
号１）。このＲ領域ポリペプチドは、ジフテリアに対す
る新規のワクチンまたは治療剤の開発に用いることがで
きる。
例えば、本発明に係るポリペプチドは、ジフテリア毒
素に反応する免疫原として使用することができる。これ
のみを精製タンパク質生成物として投与したり、安定性
または体内を輸送する能力を高める破傷風毒素などの担
体物質に化学的に結合して投与することができる。本発
明に係るポリペプチドは、アジュバントに組み合わせて
免疫原性を増大させることもできる。考えられるアジュ
バントは、アルミニウム塩、BCGまたは百日咳菌などの
細菌性内毒素または弱毒化ウイルス性株、弱毒化ウイル
ス、リポソーム、または、水性および油性エマルション
±加熱殺菌結核菌（water and oil emulsion ± heat−
killed Mycobacterium tuberculosis）であるフロイン
トの完全アジュバントもしくは不完全アジュバントなど
がある。Ｒ領域ポリペプチドは、Ｒ領域ポリペプチドを
コードする生物分解性伝達DNAによって投与後in situで
発現させることもできる（Tang et al.上述）。本発明
に係る免疫原は、ジフテリアの進行またはジフテリア菌
による感染からレシピエント（recipient）を保護する
ことができる抗体反応を高める。
素に反応する免疫原として使用することができる。これ
のみを精製タンパク質生成物として投与したり、安定性
または体内を輸送する能力を高める破傷風毒素などの担
体物質に化学的に結合して投与することができる。本発
明に係るポリペプチドは、アジュバントに組み合わせて
免疫原性を増大させることもできる。考えられるアジュ
バントは、アルミニウム塩、BCGまたは百日咳菌などの
細菌性内毒素または弱毒化ウイルス性株、弱毒化ウイル
ス、リポソーム、または、水性および油性エマルション
±加熱殺菌結核菌（water and oil emulsion ± heat−
killed Mycobacterium tuberculosis）であるフロイン
トの完全アジュバントもしくは不完全アジュバントなど
がある。Ｒ領域ポリペプチドは、Ｒ領域ポリペプチドを
コードする生物分解性伝達DNAによって投与後in situで
発現させることもできる（Tang et al.上述）。本発明
に係る免疫原は、ジフテリアの進行またはジフテリア菌
による感染からレシピエント（recipient）を保護する
ことができる抗体反応を高める。
Ｒ領域ポリペプチドを含む融合タンパク質は、ジフテ
リア毒素に対して、従ってジフテリア感染によって引き
起こされた疾患状態に対して、能動免疫を付与するさま
ざまな担体ワクチン微生物によって発現することができ
る。融合タンパク質の一部として、Ｒ領域ポリペプチド
を、Hemophilus、インフルエンザ菌（influenzae）、髄
膜炎菌（menigococci）、肺炎球菌（pneumococci）など
に止まらず、病原体由来の多糖または細胞表面ペプチド
などの、その他の安定性が低い免疫原に対する担体とし
て使用することができる。ＴドメインおよびＣドメイン
とＲドメインとの間の境界を明らかにすることによっ
て、ジフテリア毒素のより効果的なキメラを設計するこ
とができるようになる。
リア毒素に対して、従ってジフテリア感染によって引き
起こされた疾患状態に対して、能動免疫を付与するさま
ざまな担体ワクチン微生物によって発現することができ
る。融合タンパク質の一部として、Ｒ領域ポリペプチド
を、Hemophilus、インフルエンザ菌（influenzae）、髄
膜炎菌（menigococci）、肺炎球菌（pneumococci）など
に止まらず、病原体由来の多糖または細胞表面ペプチド
などの、その他の安定性が低い免疫原に対する担体とし
て使用することができる。ＴドメインおよびＣドメイン
とＲドメインとの間の境界を明らかにすることによっ
て、ジフテリア毒素のより効果的なキメラを設計するこ
とができるようになる。
さらに、予防接種に用いるには、ジフテリア毒素のＲ
領域のポリペプチドを別の薬化学的に有用なポリペプチ
ドに融合するハイブリッドタンパク質技術は、不安定な
治療剤を別の方法で輸送し、安定化し、伝達させる方法
に役立つと思われる。ポリペプチドを治療剤に付着させ
る遺伝的方法とは別に、Ｒ領域ポリペプチドを化学的に
付着し、担体として機能させ、非ペプチド剤をジフテリ
ア毒素受容体を保持する細胞へ伝達させることができ
る。化学基を還元アルキル化によって付着させることも
できる。
領域のポリペプチドを別の薬化学的に有用なポリペプチ
ドに融合するハイブリッドタンパク質技術は、不安定な
治療剤を別の方法で輸送し、安定化し、伝達させる方法
に役立つと思われる。ポリペプチドを治療剤に付着させ
る遺伝的方法とは別に、Ｒ領域ポリペプチドを化学的に
付着し、担体として機能させ、非ペプチド剤をジフテリ
ア毒素受容体を保持する細胞へ伝達させることができ
る。化学基を還元アルキル化によって付着させることも
できる。
本発明に係るＲ領域ポリペプチドは、臨床的にジフテ
リアを処置する際に治療上有用になる。抗毒素抗体のよ
うに、ジフテリア毒素受容体への毒素の結合を遮断し、
抗毒素療法を不要にし、あるいは、必要な抗毒素の量を
低減することができる。HIVなどの輸血感染症を引き起
こすリスクやヒト以外の抗体を使用して誘導された抗−
抗毒素抗体などの抗毒素抗体の使用に関する問題を考え
ると、本発明に係るポリペプチドの使用は、非常に有望
である。
リアを処置する際に治療上有用になる。抗毒素抗体のよ
うに、ジフテリア毒素受容体への毒素の結合を遮断し、
抗毒素療法を不要にし、あるいは、必要な抗毒素の量を
低減することができる。HIVなどの輸血感染症を引き起
こすリスクやヒト以外の抗体を使用して誘導された抗−
抗毒素抗体などの抗毒素抗体の使用に関する問題を考え
ると、本発明に係るポリペプチドの使用は、非常に有望
である。
Ｒ領域ポリペプチドの調製
本発明に係るポリペプチドは、有機化学合成によって
合成し、生合成ポリペプチドとして生産し、あるいは、
本発明に係るアミノ酸配列を含む大型のタンパク質から
切除することができる。例えば、有機化学合成を従来の
自動ペプチド合成方法によって行ったり、古典的な有機
化学合成技術によって行うことができる。Ｒ領域ポリペ
プチドは、完全なジフテリア毒素またはフラグメントＢ
から切除するか、Ｒ領域ポリペプチドを含む融合タンパ
ク質から切除することができる。これは、自然のジフテ
リア毒素を用いて行うことができるが、この代わりに、
ジフテリア毒素をコードするDNAをTM/R領域境界にプロ
テアーゼ感応部位などを含ませるなどの方法で突然変異
させることができる。次にジフテリア毒素タンパク質ま
たはフラグメントＢをCarrollらの方法（Carroll et a
l.,1988.Meth Enzymol 165:68−76）で精製し、導入さ
れたプロテアーゼ感応部位に特異的なプロテアーゼによ
って切断することができる。
合成し、生合成ポリペプチドとして生産し、あるいは、
本発明に係るアミノ酸配列を含む大型のタンパク質から
切除することができる。例えば、有機化学合成を従来の
自動ペプチド合成方法によって行ったり、古典的な有機
化学合成技術によって行うことができる。Ｒ領域ポリペ
プチドは、完全なジフテリア毒素またはフラグメントＢ
から切除するか、Ｒ領域ポリペプチドを含む融合タンパ
ク質から切除することができる。これは、自然のジフテ
リア毒素を用いて行うことができるが、この代わりに、
ジフテリア毒素をコードするDNAをTM/R領域境界にプロ
テアーゼ感応部位などを含ませるなどの方法で突然変異
させることができる。次にジフテリア毒素タンパク質ま
たはフラグメントＢをCarrollらの方法（Carroll et a
l.,1988.Meth Enzymol 165:68−76）で精製し、導入さ
れたプロテアーゼ感応部位に特異的なプロテアーゼによ
って切断することができる。
本発明に係るＲ領域ポリペプチドは、Ｒ領域ポリペプ
チドをコード化する遺伝子工学的に処理したDNAから生
物学的に合成することができる。本発明に係るポリペプ
チドをコードするDNA配列は、原核宿主細胞で発現させ
ることができる。Ｒ領域ポリペプチドをコードするDNA
は、ベクターに操作自在に連結され、原核宿主での発現
に影響を与える信号を調節する。必要に応じて、このコ
ード化配列は、5'−末端で、発現タンパク質宿主細胞の
周辺腔に効果的に分泌することができる全ての既知のシ
グナル配列をコードする配列を含み、タンパク質の回収
を容易にすることができる。最も多く使用される原核生
物は、大腸菌（E.Coli）の様々な株によって表現される
が、ジフテリア菌などのその他の微生物株を用いること
もできる。複製起点、選択マーカー、微生物の宿主とし
て適合する種由来の制御配列（control sequence）を含
むプラスミドベクターが使用される。例えば、大腸菌
は、２つをサルモネラ属の種から単離し、１つを大腸菌
から単離した計３つの天然に存在するプラスミドを用い
て、Bolivarらによって構成されたプラスミドであるpBR
322の誘導体（1977,Gene ２:95）を使用し形質転換する
ことができる。pBR322は、アンピシリン耐性およびテト
ラサイクリン耐性の遺伝子を含み、所望の発現ベクター
を構成する際に保持または破壊することができる複数の
選択マーカーを提供する。一般に用いられる原核発現制
御配列（control sequences）は、「調節」要素とも呼
ばれ、本文では、リボソーム結合部位配列とともに、任
意にオペレータを用いて転写開始をするためのプロモー
タを有するものとして定義されている。タンパク質発現
させるために一般に使用されるプロモータには、βラク
タマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース（lac）（Cha
ng et al.,198 Nature 1056,1977）およびトリプトファ
ン（trp）プロモータ系（Goeddel et al.,8 Nucl.Acids
Res.4075,1980）などのほか、λ誘導PLプロモータやＮ
遺伝子リボソーム結合部位（Shimatake et al.,292 Nat
ure 128,1981）。微生物性株、ベクター、関連調節配列
は、あくまでも本発明の説明のために記載したものであ
ってこれに限定するものではない。
チドをコード化する遺伝子工学的に処理したDNAから生
物学的に合成することができる。本発明に係るポリペプ
チドをコードするDNA配列は、原核宿主細胞で発現させ
ることができる。Ｒ領域ポリペプチドをコードするDNA
は、ベクターに操作自在に連結され、原核宿主での発現
に影響を与える信号を調節する。必要に応じて、このコ
ード化配列は、5'−末端で、発現タンパク質宿主細胞の
周辺腔に効果的に分泌することができる全ての既知のシ
グナル配列をコードする配列を含み、タンパク質の回収
を容易にすることができる。最も多く使用される原核生
物は、大腸菌（E.Coli）の様々な株によって表現される
が、ジフテリア菌などのその他の微生物株を用いること
もできる。複製起点、選択マーカー、微生物の宿主とし
て適合する種由来の制御配列（control sequence）を含
むプラスミドベクターが使用される。例えば、大腸菌
は、２つをサルモネラ属の種から単離し、１つを大腸菌
から単離した計３つの天然に存在するプラスミドを用い
て、Bolivarらによって構成されたプラスミドであるpBR
322の誘導体（1977,Gene ２:95）を使用し形質転換する
ことができる。pBR322は、アンピシリン耐性およびテト
ラサイクリン耐性の遺伝子を含み、所望の発現ベクター
を構成する際に保持または破壊することができる複数の
選択マーカーを提供する。一般に用いられる原核発現制
御配列（control sequences）は、「調節」要素とも呼
ばれ、本文では、リボソーム結合部位配列とともに、任
意にオペレータを用いて転写開始をするためのプロモー
タを有するものとして定義されている。タンパク質発現
させるために一般に使用されるプロモータには、βラク
タマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース（lac）（Cha
ng et al.,198 Nature 1056,1977）およびトリプトファ
ン（trp）プロモータ系（Goeddel et al.,8 Nucl.Acids
Res.4075,1980）などのほか、λ誘導PLプロモータやＮ
遺伝子リボソーム結合部位（Shimatake et al.,292 Nat
ure 128,1981）。微生物性株、ベクター、関連調節配列
は、あくまでも本発明の説明のために記載したものであ
ってこれに限定するものではない。
当業者は、沈殿法、クロマトグラフィー、免疫吸着、
またはアフィニティー技術などに限らず、タンパク質を
単離する従来の方法を用いて本発明に係るＲ領域ポリペ
プチドを精製することができる。このポリペプチドは、
プロテアーゼ処置したジフテリア毒素または、Ｒ領域ポ
リペプチドを発現するよう遺伝子工学的に処理された微
生物株の細胞、細胞培地を用いて出発材料から精製する
ことができる。上述の方法と同様に、Ｒ領域のポリペプ
チドを、マルトース結合タンパク質のフラグメントやグ
ルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質などの
別の組換えタンパク質に融合させて精製することができ
る。これらの融合構成物は、ベクターpMAL（New Englan
d Biolabs）またはベクターpGEX−3Xもしくは−2T（Pha
rmacia）などで構成することができ、これらは、各々、
マルトース結合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼタンパク質に特異な親和カラムで精製
される。
またはアフィニティー技術などに限らず、タンパク質を
単離する従来の方法を用いて本発明に係るＲ領域ポリペ
プチドを精製することができる。このポリペプチドは、
プロテアーゼ処置したジフテリア毒素または、Ｒ領域ポ
リペプチドを発現するよう遺伝子工学的に処理された微
生物株の細胞、細胞培地を用いて出発材料から精製する
ことができる。上述の方法と同様に、Ｒ領域のポリペプ
チドを、マルトース結合タンパク質のフラグメントやグ
ルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質などの
別の組換えタンパク質に融合させて精製することができ
る。これらの融合構成物は、ベクターpMAL（New Englan
d Biolabs）またはベクターpGEX−3Xもしくは−2T（Pha
rmacia）などで構成することができ、これらは、各々、
マルトース結合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼタンパク質に特異な親和カラムで精製
される。
Ｒ領域ポリペプチドの発現
例では、本発明に係るポリペプチドを発現するベクタ
ーまたは本発明に係るポリペプチドを有する融合タンパ
ク質は、（ｉ）プラスミドpBR322由来の大腸菌に官能的
な複製起点と、（ii）pBR322由来の選択可能なテトラサ
イクリン耐性遺伝と、（iii）テトラサイクリン耐性遺
伝子末端に位置しtrpプロモータ領域への転写リードス
ルーを阻止する大腸菌trpオペロンなど、転写端末領域
と、（iv）trpオペロンプロモータまたはジフテリア毒
素プロモータなどの転写プロモータと、（ｖ）配列をコ
ード化するＲ領域タンパク質と、（vi）大腸菌のリボソ
ームRNA（rrnB）遺伝子座から得られた配列T1T2を有す
る。担体分子の配列、DNA配列の合成に用いられる方
法、適切なベクターおよび発現系は、当業者らに周知の
ものである。同様の発現系を融合ポリペプチド用および
非融合ポリペプチド用に、すなわち、Ｒ領域ポリペプチ
ドのみを発現するために設計することができる。これら
のプロシージャは、一例であり、本発明に係る方法を限
定するものではない。
ーまたは本発明に係るポリペプチドを有する融合タンパ
ク質は、（ｉ）プラスミドpBR322由来の大腸菌に官能的
な複製起点と、（ii）pBR322由来の選択可能なテトラサ
イクリン耐性遺伝と、（iii）テトラサイクリン耐性遺
伝子末端に位置しtrpプロモータ領域への転写リードス
ルーを阻止する大腸菌trpオペロンなど、転写端末領域
と、（iv）trpオペロンプロモータまたはジフテリア毒
素プロモータなどの転写プロモータと、（ｖ）配列をコ
ード化するＲ領域タンパク質と、（vi）大腸菌のリボソ
ームRNA（rrnB）遺伝子座から得られた配列T1T2を有す
る。担体分子の配列、DNA配列の合成に用いられる方
法、適切なベクターおよび発現系は、当業者らに周知の
ものである。同様の発現系を融合ポリペプチド用および
非融合ポリペプチド用に、すなわち、Ｒ領域ポリペプチ
ドのみを発現するために設計することができる。これら
のプロシージャは、一例であり、本発明に係る方法を限
定するものではない。
治療用組成物の投与
本発明に係るポリペプチドを哺乳類、特にヒトに、経
口、非経口、経皮、経粘膜などの適切な方法で投与する
ことができる。投与は、生物分解性の生物学的に適合し
たポリマーを使用して、ミセル、ゲル、リポソームの形
態で現場に運んでまたは形質転換形態で、遊離した形態
で行う。治療投与量は、必ずというわけではないが、0.
1−10.0mg/kg体重の範囲または当業者によって臨床的に
適切と判断された範囲であれば良い。
口、非経口、経皮、経粘膜などの適切な方法で投与する
ことができる。投与は、生物分解性の生物学的に適合し
たポリマーを使用して、ミセル、ゲル、リポソームの形
態で現場に運んでまたは形質転換形態で、遊離した形態
で行う。治療投与量は、必ずというわけではないが、0.
1−10.0mg/kg体重の範囲または当業者によって臨床的に
適切と判断された範囲であれば良い。
ワクチン投与
本発明に係るＲ領域ポリペプチドは、患者に直接ジフ
テリア毒性に対するワクチンの免疫原として投与するこ
とができる。また、ポリペプチドを生きた弱毒ワクチン
株の状態で投与することもできる。投与した弱毒化組織
は、増殖し、クローン化した保護タンパク質抗原を発現
し、弱毒化組織自体とＲ領域ポリペプチドなどのクロー
ン抗原から保護することができる。生きた弱毒ワクチン
株は、BCG、サルモネラ種、コレラ菌などがあるが、こ
れに限るものではない。Ｒ領域ポリペプチドをコード化
する核酸を有するこれらの株の形質転換の一つは、当業
者に既知の従来の方法で行うことができる。
テリア毒性に対するワクチンの免疫原として投与するこ
とができる。また、ポリペプチドを生きた弱毒ワクチン
株の状態で投与することもできる。投与した弱毒化組織
は、増殖し、クローン化した保護タンパク質抗原を発現
し、弱毒化組織自体とＲ領域ポリペプチドなどのクロー
ン抗原から保護することができる。生きた弱毒ワクチン
株は、BCG、サルモネラ種、コレラ菌などがあるが、こ
れに限るものではない。Ｒ領域ポリペプチドをコード化
する核酸を有するこれらの株の形質転換の一つは、当業
者に既知の従来の方法で行うことができる。
ワクチンは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワ
クシニアウイルスなどの弱毒化ウイルスによって保持す
ることができる。また、ワクチンは、Ｒ領域ポリペプチ
ドの発現可能な形態をコードするDNAをワクチンの細胞
に直接取り込む生物分解性伝達によって投与することが
できる。患者へのポリペプチドの効果的な最終投与量
は、1.0−500μg/kg体重か、当業者らによって臨床的に
適切と定められた範囲であれば良い。
クシニアウイルスなどの弱毒化ウイルスによって保持す
ることができる。また、ワクチンは、Ｒ領域ポリペプチ
ドの発現可能な形態をコードするDNAをワクチンの細胞
に直接取り込む生物分解性伝達によって投与することが
できる。患者へのポリペプチドの効果的な最終投与量
は、1.0−500μg/kg体重か、当業者らによって臨床的に
適切と定められた範囲であれば良い。
その他の態様は、以下の請求の範囲に含まれる。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願者:R.John Collier
David Eisenberg
Haian Fu
Seunghyon Choe
（ii）発明の名称：ジフテリア毒素受容体結合領域
（iii）配列の数:1
（iv）連絡先：
（Ａ）ADDRESS:Fish ＆ Richardson
（Ｂ）STREET:225 Franklin Street
（Ｃ）市：ボストン
（Ｄ）州：マサチューセッツ
（ｅ）国：アメリカ合衆国
（ｆ）郵便番号:02110−2804
（ｖ）コンピュータ読取形式：
（Ａ）媒体型:3.5インチディスク、1.44Mb
（Ｂ）コンピュータ:IBM PS/2 Model 50Zまたは55S
X （Ｃ）オペレーティングシステム:IBM P.C.DOS（Ve
rsion 3.0） （Ｄ）ソフトウェア:WordPerfect（Version 5.0） （vi）現在の出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）提出日： （Ｃ）分類： （vii）従来の出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）提出日： （viii）代理人／弁理士情報： （Ａ）氏名:Janis K.Fraser （Ｂ）登録番号:34,819 （Ｃ）参照／事件番号:00246/143001 （ix）通信情報： （Ａ）電話：（617）542−5070 （Ｂ）テレファクス：（617）542−8906 （Ｃ）テレックス:200154 （２）配列番号に対する情報:1 （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:1942 （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数:2本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号:1 配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願者:R.John Collier David Eisenberg Haian Fu Seunghyon Choe （ii）発明の名称：ジフテリア毒素受容体結合領域 （iii）配列の数:1 （iv）連絡先： （Ａ）ADDRESS:Fish ＆ Richardson （Ｂ）STREET:225 Franklin Street （Ｃ）市：ボストン （Ｄ）州：マサチューセッツ （ｅ）国：アメリカ合衆国 （ｆ）郵便番号:02110−2804 （ｖ）コンピュータ読取形式： （Ａ）媒体型:3.5インチディスク、1.44Mb （Ｂ）コンピュータ:IBM PS/2 Model 50Zまたは55S
X （Ｃ）オペレーティングシステム:IBM P.C.DOS（Ve
rsion 3.0） （Ｄ）ソフトウェア:WordPerfect（Version 5.0） （vi）現在の出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）提出日： （Ｃ）分類： （vii）従来の出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）提出日： （viii）代理人／弁理士情報： （Ａ）氏名:Janis K.Fraser （Ｂ）登録番号:34,819 （Ｃ）参照／事件番号:00246/143001 （ix）通信情報： （Ａ）電話：（617）542−5070 （Ｂ）テレファクス：（617）542−8906 （Ｃ）テレックス:200154 （２）配列番号に対する情報:1 （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:1942 （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数:2本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号:1
X （Ｃ）オペレーティングシステム:IBM P.C.DOS（Ve
rsion 3.0） （Ｄ）ソフトウェア:WordPerfect（Version 5.0） （vi）現在の出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）提出日： （Ｃ）分類： （vii）従来の出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）提出日： （viii）代理人／弁理士情報： （Ａ）氏名:Janis K.Fraser （Ｂ）登録番号:34,819 （Ｃ）参照／事件番号:00246/143001 （ix）通信情報： （Ａ）電話：（617）542−5070 （Ｂ）テレファクス：（617）542−8906 （Ｃ）テレックス:200154 （２）配列番号に対する情報:1 （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:1942 （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数:2本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号:1 配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願者:R.John Collier David Eisenberg Haian Fu Seunghyon Choe （ii）発明の名称：ジフテリア毒素受容体結合領域 （iii）配列の数:1 （iv）連絡先： （Ａ）ADDRESS:Fish ＆ Richardson （Ｂ）STREET:225 Franklin Street （Ｃ）市：ボストン （Ｄ）州：マサチューセッツ （ｅ）国：アメリカ合衆国 （ｆ）郵便番号:02110−2804 （ｖ）コンピュータ読取形式： （Ａ）媒体型:3.5インチディスク、1.44Mb （Ｂ）コンピュータ:IBM PS/2 Model 50Zまたは55S
X （Ｃ）オペレーティングシステム:IBM P.C.DOS（Ve
rsion 3.0） （Ｄ）ソフトウェア:WordPerfect（Version 5.0） （vi）現在の出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）提出日： （Ｃ）分類： （vii）従来の出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）提出日： （viii）代理人／弁理士情報： （Ａ）氏名:Janis K.Fraser （Ｂ）登録番号:34,819 （Ｃ）参照／事件番号:00246/143001 （ix）通信情報： （Ａ）電話：（617）542−5070 （Ｂ）テレファクス：（617）542−8906 （Ｃ）テレックス:200154 （２）配列番号に対する情報:1 （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:1942 （Ｂ）配列の種類：核酸 （Ｃ）鎖の数:2本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号:1
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ０７Ｋ 1/12 Ｃ０７Ｋ 19/00
19/00 Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
15/09 Ｃ１２Ｒ 1:19
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02
//(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 コリアー アール ジョーン
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州
ウェルスレイ ヒルズ ガーデン ロー
ド 43
(72)発明者 エイゼンバーグ デビッド
アメリカ合衆国 カリフォルニア州 ロ
サンゼルス コムストック アベニュー
342
(72)発明者 エフユー ハイアン
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州
オールストン フランクリン ストリー
ト 65
(72)発明者 チョー ションヤン
アメリカ合衆国 カリフォルニア州 レ
セダ ダービィー プレイス 7311
(56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（1990）,
265（23），ｐ．7331−7337
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
Claims (32)
- 【請求項１】配列番号:1の ａ）アミノ酸379番から535番まで、 ｂ）アミノ酸380番から535番まで、 ｃ）アミノ酸381番から535番まで、 ｄ）アミノ酸382番から535番まで、 ｅ）アミノ酸383番から535番まで、 ｆ）アミノ酸384番から535番まで、 ｇ）アミノ酸385番から535番まで、 ｈ）アミノ酸386番から535番まで、 ｌ）アミノ酸381番から512番まで、 ｍ）アミノ酸382番から512番まで、 ｎ）アミノ酸383番から512番まで、 ｏ）アミノ酸384番から512番まで、 ｐ）アミノ酸385番から512番まで、または ｑ）アミノ酸386番から512番まで、 からなるポリペプチド。
- 【請求項２】精製されたポリペプチドである、請求の範
囲第１項記載のポリペプチド。 - 【請求項３】請求の範囲第１項記載のポリペプチドをコ
ードするDNAであって、請求の範囲第１項記載の前記ポ
リペプチドのアミノ末端終端に直接隣接する配列番号:1
のアミノ酸291番から379番に対応するアミノ酸配列をコ
ードしない前記DNA。 - 【請求項４】請求の範囲第３項記載の前記DNAを含むベ
クター。 - 【請求項５】請求の範囲第３項記載の前記DNAを含む細
胞。 - 【請求項６】前記細胞が前記ポリペプチドを発現するこ
とができることを特徴とする請求の範囲第５項記載の細
胞。 - 【請求項７】前記細胞が担体ワクチン微生物であること
を特徴とする請求の範囲第６項記載の細胞。 - 【請求項８】前記DNA配列が異種プロモータの転写制御
下にあることを特徴とする請求の範囲第４項記載のベク
ター。 - 【請求項９】前記アミノ酸がシグナル配列に連結してい
ることを特徴とする請求の範囲第４項記載のベクター。 - 【請求項１０】各々が請求の範囲第３項記載のDNAを含
む細胞から成る細胞集団。 - 【請求項１１】請求の範囲第１項記載のポリペプチドを
コード化する配列を含む核酸であり、請求の範囲第１項
記載の前記ポリペプチドのアミノ末端終端に直接隣接す
る配列番号:1のアミノ酸291番から379番に対応するアミ
ノ酸配列をコードしないことを特徴とする核酸。 - 【請求項１２】ポリペプチドの調製方法において、 請求の範囲第６項記載の細胞を提供し、 前記細胞を培地で育成し、前記ポリペプチドを発現させ
る細胞母集団を形成し、前記細胞母集団または前記培地
から前記ポリペプチドを取得することを特徴とする調製
方法。 - 【請求項１３】請求の範囲第１項記載のポリペプチドを
形成する方法において、前記ポリペプチドを化学合成に
よって調製することを特徴とする方法。 - 【請求項１４】請求の範囲第１項記載のポリペプチドを
形成する方法において、前記ポリペプチドを生物学的合
成によって調製することを特徴とする方法。 - 【請求項１５】ジフテリア治療用組成物において、 請求の範囲第１項記載のポリペプチドと、薬化学的に許
容できる担体と、 を含むことを特徴とする治療用組成物。 - 【請求項１６】非ヒト細胞の中毒をジフテリア毒素によ
って阻止する方法において、 前記細胞の中毒を阻止する量の請求の範囲第１項記載の
ポリペプチドに接触させることを特徴とする方法。 - 【請求項１７】請求の範囲第１項記載のポリペプチドを
含むジフテリアに対するワクチン。 - 【請求項１８】請求の範囲第３項記載のDNAを含む弱毒
化ウイルスベクターを含むことを特徴とするジフテリア
に対するワクチン。 - 【請求項１９】請求の範囲第３項記載のDNAを含む弱毒
化細菌を含むことを特徴とするジフテリアに対するワク
チン。 - 【請求項２０】請求の範囲第４項記載のベクターを含む
ことを特徴とするジフテリアに対するワクチン。 - 【請求項２１】別のポリペプチドに結合したペプチドに
よって連結される請求の範囲第１項記載のポリペプチド
から成る融合ポリペプチドにおいて、前記融合ポリペプ
チドが請求の範囲第１項記載の前記ポリペプチドのアミ
ノ末端終端に直接隣接する配列番号:1のアミノ酸291番
から379番に対応するアミノ酸配列をコードしないこと
を特徴とする融合ポリペプチド。 - 【請求項２２】請求の範囲第21項記載の融合ポリペプチ
ドを含むことを特徴とするジフテリアに対するワクチ
ン。 - 【請求項２３】請求の範囲第21項記載の融合ペプチドを
コード化するDNA。 - 【請求項２４】請求の範囲第23項記載のDNAを含む細
胞。 - 【請求項２５】前記細胞が前記ポリペプチドを発現する
ことができることを特徴とする請求の範囲第24項記載の
細胞。 - 【請求項２６】前記細胞が担体ワクチン微生物であるこ
とを特徴とする請求の範囲第25項記載の細胞。 - 【請求項２７】前記ポリペプチドが化学基に付着してい
ることを特徴とする請求の範囲第１項記載のポリペプチ
ド。 - 【請求項２８】請求の範囲第27項記載のポリペプチド
と、薬化学的に許容できる担体と、を有することを特徴
とするジフテリア治療用組成物。 - 【請求項２９】前記化学基は、担体物質を含むことを特
徴とする請求の範囲第27項記載のポリペプチド。 - 【請求項３０】前記ポリペプチドが前記化学基の担体と
して機能することを特徴とする請求の範囲第27項記載の
ポリペプチド。 - 【請求項３１】請求の範囲第１項記載のポリペプチド
と、アジュバントを含むことを特徴とするジフテリアに
対して免疫化するための組成物。 - 【請求項３２】請求の範囲第31項記載の組成物を含むこ
とを特徴とするジフテリアに対するワクチン。
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| US88139492A | 1992-05-06 | 1992-05-06 | |
| US881,394 | 1992-05-06 | ||
| PCT/US1993/004166 WO1993021769A1 (en) | 1992-05-06 | 1993-05-03 | Diphtheria toxin receptor-binding region |
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|---|---|
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| JP3506431B2 true JP3506431B2 (ja) | 2004-03-15 |
Family
ID=25378382
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51958493A Expired - Fee Related JP3506431B2 (ja) | 1992-05-06 | 1993-05-03 | ジフテリア毒素受容体結合領域 |
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|---|---|
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| GR (1) | GR3030141T3 (ja) |
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| US5843462A (en) * | 1995-11-30 | 1998-12-01 | Regents Of The University Of Minnesota | Diphtheria toxin epitopes |
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