ES2883343T3 - Polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae y conjugados de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para la preparación de un conjugado inmunogénico que comprende el polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteína portadora, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) componer un polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F con una proteína portadora, en el que dicho polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F se obtiene mediante un procedimiento que comprende las etapas de: i) hacer reaccionar un polisacárido capsular aislado de los serotipos 10A, 22F o 33F con peryodato; y ii) inactivar la reacción de oxidación mediante la adición de butano-2,3-diol, lo que da como resultado un polisacárido activado de Streptococcus pneumoniae de los serotipos 10A, 22F o 33F; y, b) hacer reaccionar el polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F compuesto y activado y la proteína portadora con un agente reductor para formar un conjugado de polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F: proteína portadora.

Description

DESCRIPCIÓN
Polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae y conjugados de los mismos
Campo de la invención
La invención se refiere a procedimientos para la preparación de polisacáridos activados de Streptococcus pne umoniae de los serotipos 10A, 22F o 33F, conjugados inmunogénicos que comprenden polisacáridos de Streptococcus pneumoniae de los serotipos 10A, 22F o 33F unidos covalentemente a una proteína portadora, y composiciones inmunogénicas y vacunas que los comprenden.
Antecedentes
Los Streptococcus pneumoniae son cocos Gram positivos con forma de lanceta que suelen verse en parejas (diplococos), pero también en cadenas cortas o como células individuales. Crecen fácilmente en placas de agar sangre con colonias brillantes y muestran hemólisis alfa a menos que se cultiven anaeróbicamente, donde muestran hemólisis beta. Las células de la mayoría de los serotipos de neumococo tienen una cápsula que es un revestimiento de polisacáridos que rodea a cada célula. Esta cápsula es un factor determinante de la virulencia en los seres humanos, ya que interfiere con la fagocitosis al impedir que los anticuerpos se adhieran a las células bacterianas. Actualmente se conocen más de 90 serotipos capsulares de neumococo, y los 23 serotipos más comunes son responsables de aproximadamente el 90 % de la enfermedad invasiva en todo el mundo. Como vacuna, la capa de polisacárido neumocócico puede conferir un grado razonable de inmunidad frente al Streptococcus pneumoniae en individuos con sistemas inmunitarios desarrollados o no deteriorados, pero el polisacárido capsular conjugado con una proteína portadora adecuada permite obtener una respuesta inmunitaria en los lactantes y los ancianos, que también son los que corren más riesgo de contraer infecciones neumocócicas.
Desde la introducción de la primera vacuna neumocócica conjugada de 7 valencias (PCV7 o Prevnar) en el año 2000, la enfermedad invasiva de esos siete serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F) casi ha desaparecido. La adición de los serotipos 1, 3, 5, 6A, 7F y 19A en Prevnar 13 disminuyó aún más el número de enfermedades neumocócicas invasivas.
Los documentos WO2008/157590, WO2011/110531, WO2012/119972, WO2007/071707, WO2014/027302, WO2014/097099 divulgan procedimientos para preparar conjugados que comprenden un sacárido conjugado con una proteína portadora.
Ninguna de las vacunas neumocócicas comercializadas actualmente proporciona una protección adecuada contra los serotipos 10A, 22F o 33F del Streptococcus pneumoniae en humanos y, en particular, en niños menores de 2 años. Por lo tanto, se necesitan composiciones inmunogénicas que puedan utilizarse para inducir una respuesta inmunitaria contra los serotipos 10A, 22F o 33F de la Streptococcus pneumonia.
sumario de la invención
La invención se refiere a las realizaciones definidas por las reivindicaciones.
La invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un conjugado inmunogénico que comprende el polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteína portadora, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
a) componer un polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F con una proteína portadora, en la que dicho polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F se obtiene mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
i) hacer reaccionar un polisacárido capsular aislado de los serotipos 10A, 22F o 33F con peryodato; y ii) inactivar la reacción de oxidación mediante la adición de butano-2,3-diol, lo que da como resultado un polisacárido activado de Streptococcus pneumoniae de los serotipos 10A, 22F o 33F;
y,
b) hacer reaccionar el polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F compuesto y activado y la proteína portadora con un agente reductor para formar un conjugado de polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F: proteína portadora. La invención se refiere además a un procedimiento que comprende además la etapa de formular el conjugado en una vacuna multivalente.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la estructura de la unidad de repetición del polisacárido capsular del serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae .
La figura 2 muestra la estructura de la unidad de repetición del polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae del serotipo 22F .
La figura 3 muestra la estructura de la unidad de repetición del polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae del serotipo 33F .
La figura 4 muestra el peso molecular del polisacárido del serotipo 22F activado en función de la cantidad de agente oxidante a 23 °C con y sin etapa de inactivación.
La figura 5 muestra el peso molecular del polisacárido del serotipo 22F activado en función de la cantidad de agente oxidante a 4 °C con y sin etapa de inactivación.
La figura 6 muestra el peso molecular del polisacárido del serotipo 33F activado en función de la cantidad de agente oxidante a 2-8 °C con o sin etapa de inactivación o a 23 °C sin etapa de inactivación.
Descripción detallada de la invención
La presente invención puede entenderse más fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención y los Ejemplos incluidos en el presente documento. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por una persona con conocimientos nprmales en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento puede utilizarse en la práctica o en las pruebas de la presente invención, en el presente documento se describen ciertos procedimientos y materiales preferidos. Al describir las realizaciones y la reivindicación de la invención, se utilizará cierta terminología de acuerdo con las definiciones que se exponen a continuación.
Tal y como se utiliza en el presente documento, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referencias plurales a menos que se indique otra cosa. Así, por ejemplo, las referencias a "el procedimiento" incluyen uno o más procedimientos, y/o pasos del tipo descrito en el presente documento y/o que serán evidentes para un experto en la técnica al leer esta divulgación.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "peso molecular" del polisacárido o del conjugado proteínapolisacárido portador se refiere al peso molecular calculado por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) combinada con un detector de dispersión de luz láser multiángulo (MALLS).
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "grado de oxidación" (DO) se refiere al número de unidades de repetición de azúcar por grupo aldehído generadas cuando el polisacárido aislado se activa con un agente oxidante. El grado de oxidación de un polisacárido puede determinarse mediante procedimientos rutinarios conocidos por el experto en la técnica.
Se observa que en la presente divulgación, términos tales como "comprende", "comprendido", "que comprende", "contiene", "que contiene" y similares pueden tener el significado que se les atribuye en la ley de patentes de EE.UU.; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "incluyendo" y similares. Estos términos se refieren a la inclusión de un determinado ingrediente o conjunto de ingredientes sin excluir ningún otro. Términos tales como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de Estados Unidos, es decir, permiten la inclusión de ingredientes o etapas adicionales que no desvirtúen las características novedosas o básicas de la invención, es decir, excluyen ingredientes o etapas adicionales no citados que desvirtúen las características novedosas o básicas de la invención. Los términos "consiste en" y "que consiste en" tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de EE.UU.; es decir, que estos términos son de terminación cerrada. En consecuencia, estos términos se refieren a la inclusión de un ingrediente o conjunto de ingredientes concretos y a la exclusión de todos los demás ingredientes.
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "conjugados" o "glicoconjugados" se refiere a un polisacárido conjugado covalentemente con una proteína portadora. Los glicoconjugados de la invención y las composiciones inmunogénicas que los comprenden pueden contener alguna cantidad de polisacárido libre.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "glicoconjugado del serotipo 10A" o "conjugado del serotipo 10A" se refiere a un polisacárido capsular aislado del serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae conjugado covalentemente con una proteína portadora.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "glicoconjugado del serotipo 22F" o "conjugado del serotipo 22F" se refiere a un polisacárido capsular aislado de Streptococcus pneumoniae del serotipo 22F conjugado covalentemente con una proteína portadora.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "glicoconjugado del serotipo 33F" o "conjugado del serotipo 33F" se refiere a un polisacárido capsular aislado de Streptococcus pneumoniae del serotipo 33F conjugado covalentemente con una proteína portadora.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "polisacárido del serotipo 10A" se refiere a un polisacárido capsular del serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae .
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "polisacárido del serotipo 22F" se refiere a un polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae del serotipo 22F .
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "polisacárido del serotipo 33F" se refiere a un polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae del serotipo 33F .
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "polisacárido libre" significa un polisacárido capsular que no está conjugado covalentemente con la proteína portadora, pero que sin embargo está presente en la composición de conjugado de polisacárido capsular-proteína portadora. El polisacárido libre puede estar asociado de forma no covalente (es decir, unido de forma no covalente a, adsorbido a, o atrapado en o con) el conjugado de polisacáridoproteína portadora.
El porcentaje de polisacárido libre se mide después de la purificación final del conjugado de polisacárido capsular del serotipo 10A, 22F o 33F. Preferentemente se mide en las 4 semanas siguientes a la purificación final. Se expresa en porcentaje del total de polisacáridos de la muestra.
Tal y como se utiliza en el presente documento, "conjugar", "conjugado" y "conjugando" se refieren a un procedimiento por el que un polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae , se une covalentemente a una proteína portadora.
El término "sujeto" se refiere a un mamífero, incluido el ser humano, o a un ave, pez, reptil, anfibio o cualquier otro animal. El término "sujeto" también incluye a los animales domésticos o de investigación. Ejemplos no limitativos de animales domésticos y de investigación son: perros, gatos, cerdos, conejos, ratas, ratones, jerbos, hámsters, cobayas, hurones, monos, pájaros, serpientes, lagartos, peces, tortugas y ranas. El término "sujeto" también incluye a los animales de ganado. Ejemplos no limitativos de animales de ganado incluyen: alpaca, bisonte, camello, ganado, ciervos, cerdos, caballos, llamas, mulas, burros, ovejas, cabras, conejos, renos, yaks, pollos, gansos y pavos.
En la preparación de vacunas neumocócicas conjugadas multivalentes dirigidas a la prevención de enfermedades invasivas causadas por el organismo Streptococcus pneumoniae (también conocido como neumococo), se cultivan serotipos seleccionados de Streptococcus pneumoniae para suministrar los polisacáridos necesarios para producir la vacuna. Las células se cultivan en fermentadores con lisis inducida al final de la fermentación mediante la adición de desoxicolato de sodio o un agente lisante alternativo. A continuación, el caldo lisado se recoge para la purificación posterior y la recuperación del polisacárido capsular que rodea a las células bacterianas. Tras su activación y conjugación con una proteína portadora, el polisacárido se incluye en el producto vacunal final y confiere inmunidad a la población diana de la vacuna frente a los serotipos de Streptococcus pneumoniae seleccionados.
La inmunogenicidad de un conjugado polisacárido:proteína portadora depende de varios factores, que incluyen el tamaño del polisacárido. El tamaño de los polisacáridos es un atributo de calidad que se evalúa en cada lote de preparación y debe controlarse adecuadamente. Los polisacáridos capsulares de alto peso molecular son capaces de inducir ciertas respuestas inmunitarias de anticuerpos debido a una mayor valencia de los epítopos presentes en la superficie antigénica. En general, es preferible evitar o limitar la reducción indeseable del tamaño del polisacárido durante la preparación del conjugado para conservar la inmunogenicidad del polisacárido. Además, es importante reducir la variabilidad de lote a lote del peso molecular del polisacárido durante la etapa de activación y la posterior conjugación para mantener la consistencia de los atributos de calidad del conjugado.
Los inventores han demostrado que la química de aminación reductora (RAC) es un procedimiento adecuado para preparar el conjugado de polisacárido capsular y portador de proteínas de Streptococcus pneumoniae de los serotipos 10A, 22F o 33F. El enfoque RAC implica la activación del polisacárido por oxidación y la posterior conjugación del polisacárido activado con un portador de proteínas por reducción. Los polisacáridos de los serotipos 10A, 33F y 22F han demostrado ser polisacáridos particularmente sensibles y son susceptibles de degradación y reducción de tamaño durante la etapa de oxidación de la preparación del conjugado. Además, el uso del procedimiento de activación conocido hasta ahora produjo polisacáridos activados de los serotipos 10A, 33F y 22F de pesos moleculares variables.
Por lo tanto, existe una importante necesidad de un procedimiento para preparar polisacáridos activados del serotipo 10A, 22F o 33F de Streptococcus pneumoniae que tengan un peso molecular controlado y consistente.
Un objeto de la presente divulgación es un procedimiento para preparar polisacáridos activados del serotipo 10A, 22F o 33F de Streptococcus pneumoniae . En particular, un objeto de la divulgación es un procedimiento para preparar un polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F de Streptococcus pneumoniae, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
a) hacer reaccionar el polisacárido aislado del serotipo 10A, 22F o 33F con un agente oxidante; y
b) inactivar la reacción de oxidación mediante la adición de un agente de inactivación que da como resultado un polisacárido activado de Streptococcus pneumoniae de los serotipos 10A, 22F o 33F.
Aislamiento y purificación del polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F
Las estructuras de los polisacáridos de los serotipos 10A, 22F y 33F se divulgan en la literatura (véase, por ejemplo Kamerling J P C. Pneumococcal polysaccharides: a chemical view. En: Tomasz A, editor. Streptococcus pneumoniae, molecular biology and mechanisms of disease Nueva York, N.Y: Mary Ann Liebert, Inc.; 2000. pp. 81-114).
Como se muestra en la figura 1, la unidad de repetición de polisacáridos del serotipo 22F consiste en una columna vertebral de pentasacáridos ramificada (un ácido glucurónico (GlcpA), una glucopiranosa (Glcp) y una galactofuranosa (Galf) y dos ramnopiranosas (Rhap)) con una rama aGlcp unida al grupo hidroxilo C3 de pRhap 45. Aproximadamente el 80 % de los grupos hidroxilos C2 del residuo pRhap en la unidad de repetición del polisacárido están O-acetilados.
Como se muestra en la figura 2, la unidad de repetición de polisacáridos del serotipo 10A consiste en dos D-galactosafuranosa, tres D-galactopiranosa, una N-acetilgalactosamina y un enlace fosfato unido a la cadena de sacáridos a través de un D-ribitol.
Como se muestra en la figura 3, la unidad de repetición de polisacáridos del serotipo 33F consiste en tres D-galactopiranosas, dos D-galactofuranosas y una D-glucopiranosa. En particular, los residuos de 5-D-galactofuranosilo están O-acetilados en aproximadamente el 90 % de las unidades de repetición del polisacárido 33F.
Los polisacáridos capsulares de los serotipos 10A, 22F y 33F pueden obtenerse directamente a partir de bacterias utilizando procedimientos de aislamiento conocidos por un experto en la técnica (véanse, por ejemplo, los procedimientos divulgados en las solicitudes de patente U.S. Pub. Nos. 20060228380, 20060228381, 20070184071, 20070184072, 20070231340 y 20080102498 o WO2008118752). Además, pueden producirse utilizando protocolos sintéticos.
Las cepas de Streptococcus pneumoniae de los serotipos 10A, 22F y 33F utilizadas para fabricar los respectivos polisacáridos que se utilizan en los conjugados inmunogénicos de la divulgación pueden obtenerse a partir de colecciones de cultivo establecidas o de muestras clínicas.
Los polisacáridos purificados de los serotipos 10A, 22F y 33F se obtienen por procedimientos bien conocidos por el experto en la técnica. Las células bacterianas se cultivan preferentemente en un medio a base de soja. Tras la fermentación de las células bacterianas que producen polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae de los serotipos 10A, 22F o 33F, las células bacterianas se lisan para producir un lisado celular. Las células bacterianas pueden ser lisadas utilizando cualquier agente lítico. Un "agente lítico" es cualquier agente que ayuda a la ruptura de la pared celular y a la liberación de autolisina que provoca la lisis celular, incluyendo, por ejemplo, los detergentes. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "detergente" se refiere a cualquier detergente aniónico o catiónico capaz de inducir la lisis de las células bacterianas. Ejemplos representativos de tales detergentes para su uso dentro de los procedimientos de la presente invención incluyen el desoxicolato de sodio (DOC), la N-lauroil sarcosina, el ácido quenodesoxicólico de sodio y las saponinas.
En una realización de la presente invención, el agente lítico utilizado para lisar las células bacterianas es DOC. El DOC es la sal sódica del ácido biliar desoxicólico, que suele proceder de fuentes biológicas tales como las vacas o los bueyes. El DOC activa la proteína LytA, que es una autolisina que participa en el crecimiento y la división de la pared celular en Streptococcus pneumoniae. La proteína LytA tiene dominios de unión a colina en su porción C-terminal, y se sabe que las mutaciones del gen lytA producen mutantes LytA que son resistentes a la lisis con DOC.
En una realización de la presente invención, el agente lítico utilizado para lisar las células bacterianas es un agente lítico no derivado de animales. Los agentes líticos no derivados de animales para su uso dentro de los procedimientos de la presente invención incluyen agentes de fuentes no animales con modos de acción similares a los del DOC (es decir, que afectan a la función LytA y dan lugar a la lisis de las células de Streptococcus pneumoniae ). Tales agentes líticos no derivados de animales incluyen, pero no se limitan a, análogos de DOC, surfactantes, detergentes y análogos estructurales de la colina. En una realización, el agente lítico no derivado de animales se selecciona del grupo que consiste en ácido decanosulfónico, tert-octilfenoxi poli(oxietileno)etanoles (por ejemplo, Igepal® CA-630, CAS #: 9002-93-1Louis, MO), condensados de óxido de etileno de octilfenol (por ejemplo, Triton® X-100, disponible en Sigma Aldrich, St. Louis, MO), N-lauroil sarcosina sódica, iminodipropionato de laurilo, dodecil sulfato de sodio, quenodesoxicolato, hiodesoxicolato, glicodesoxicolato, taurodesoxicolato, tauroquenodesoxicolato y colato. En otra realización, el agente lítico no derivado de animales es la N-lauroil sarcosina. En otra realización, el agente lítico es N-lauroil sarcosina sódica.
Los polisacáridos capsulares pueden entonces purificarse del lisado celular utilizando técnicas de purificación conocidas en el arte, incluyendo el uso de centrifugación, filtración en profundidad, precipitación, ultrafiltración, tratamiento con carbón activo, diafiltración y/o cromatografía en columna (Véase, por ejemplo, la solicitud de Patente U.S. Pub. Nos 20060228380, 20060228381, 20070184071, 20070184072, 20070231340 y 20080102498 o WO2008118752). Los polisacáridos purificados de los serotipos 10A, 22F o 33F pueden utilizarse entonces para la preparación de conjugados inmunogénicos.
Preferentemente, con el fin de generar conjugados del serotipo 22F o conjugados del serotipo 33F con características de filtrabilidad y/o rendimientos ventajosos, el dimensionamiento del polisacárido a un intervalo de peso molecular (MW) más bajo se realiza antes de la conjugación con una proteína portadora. Ventajosamente, el tamaño del polisacárido purificado del serotipo 22F o del polisacárido del serotipo 33F se reduce al tiempo que se conservan las características críticas de la estructura del polisacárido, como por ejemplo la presencia de grupos O-acetilo. Preferentemente, el tamaño del polisacárido purificado del serotipo 22F o del serotipo 33F se reduce mediante homogeneización mecánica.
En una realización preferida, el tamaño del polisacárido purificado se reduce mediante homogeneización a alta presión. La homogeneización a alta presión logra altas tasas de cizallamiento bombeando la corriente del procedimiento a través de un camino de flujo con dimensiones suficientemente pequeñas. La tasa de cizallamiento se incrementa utilizando una mayor presión de homogeneización aplicada y el tiempo de exposición puede aumentarse recirculando la corriente de alimentación a través del homogeneizador.
El procedimiento de homogeneización a alta presión es particularmente apropiado para reducir el tamaño del polisacárido purificado del serotipo 22F o del serotipo 33F, preservando al mismo tiempo las características estructurales del polisacárido, como la presencia de grupos O-acetilo.
El polisacárido aislado del serotipo 22F obtenido mediante la purificación del polisacárido capsular del serotipo 22F a partir del lisado de Streptococcus pneumoniae y, opcionalmente, el dimensionamiento del polisacárido purificado, puede caracterizarse por diferentes parámetros que incluyen, por ejemplo, el peso molecular, y el mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F.
En una realización preferida, el polisacárido del serotipo 22F tiene un peso molecular comprendido entre 400 y 700 kDa.
El polisacárido aislado del serotipo 33F obtenido mediante la purificación del polisacárido capsular del serotipo 33F a partir del lisado de Streptococcus pneumoniae y, opcionalmente, el dimensionamiento del polisacárido purificado, puede caracterizarse por diferentes parámetros, incluyendo, por ejemplo, el peso molecular, y los mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F.
El grado de O-acetilación del polisacárido puede determinarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, por RMN de protones (Lemerciniery Jones (1996) Carbohydrate Research 296; 83-96, Jones and Lemercinier (2002) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30; 1233-1247, WO 05/033148 o WO00/56357. Otro procedimiento comúnmente utilizado se describe en Hestrin (1949) J. Biol. Chem. 180; 249-261. Preferentemente, la presencia de grupos O-acetilo se determina mediante un análisis de HPLC iónico.
En una realización preferida, el polisacárido aislado del serotipo 22F se obtiene mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
preparar un cultivo de fermentación de células bacterianas del serotipo 22F de Streptococcus pneumonía ; lisar las células bacterianas en dicho cultivo de fermentación; y,
purificar el polisacárido del serotipo 22F a partir del cultivo de fermentación.
En una realización preferida, el polisacárido aislado del serotipo 22F se obtiene mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
preparar un cultivo de fermentación de células bacterianas del serotipo 22F de Streptococcus pneumonía ; lisar las células bacterianas de dicho cultivo de fermentación;
purificar el polisacárido del serotipo 22F a partir del cultivo de fermentación; y
dimensionar el polisacárido del serotipo 22F por medio de un dimensionamiento mecánico, preferentemente por homogeneización a alta presión.
En una realización preferida, el polisacárido aislado del serotipo 22F se obtiene mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
preparar un cultivo de fermentación de células bacterianas del serotipo 22F de Streptococcus pneumonía ; lisar las células bacterianas de dicho cultivo de fermentación;
purificar el polisacárido del serotipo 22F a partir del cultivo de fermentación; y
dimensionar el polisacárido del serotipo 22F por medio de un dimensionamiento mecánico, preferentemente por homogeneización a alta presión,
en el que el polisacárido aislado del serotipo 22F tiene un peso molecular comprendido entre 400 y 700 kDa.
En una realización preferida, el polisacárido aislado del serotipo 33F se obtiene mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
preparar un cultivo de fermentación de células bacterianas del serotipo 33F de Streptococcus pneumonía ; lisar las células bacterianas de dicho cultivo de fermentación; y,
purificar el polisacárido del serotipo 33F a partir del cultivo de fermentación.
En una realización preferida, el polisacárido aislado del serotipo 33F se obtiene mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
preparar un cultivo de fermentación de células bacterianas del serotipo 33F de Streptococcus pneumonía ; lisar las células bacterianas de dicho cultivo de fermentación;
purificar el polisacárido del serotipo 33F a partir del cultivo de fermentación; y
dimensionar el polisacárido del serotipo 33F mediante un dimensionamiento mecánico, preferentemente por homogeneización a alta presión.
El polisacárido aislado del serotipo 10A obtenido mediante la purificación del polisacárido capsular del serotipo 10A a partir del lisado de Streptococcus pneumoníae y, opcionalmente, el dimensionamiento del polisacárido purificado, puede caracterizarse por diferentes parámetros, incluyendo, por ejemplo, el peso molecular. Preferentemente, el polisacárido aislado del serotipo 10A no está dimensionado.
En una realización preferida, el polisacárido aislado del serotipo 10A se obtiene mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
preparar un cultivo de fermentación de células bacterianas del serotipo 10A de Streptococcus pneumonía ; lisar las células bacterianas de dicho cultivo de fermentación; y,
purificar el polisacárido del serotipo 10A a partir del cultivo de fermentación.
Activación del polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F
El polisacárido aislado del serotipo 10A, 22F o 33F se activa mediante un procedimiento que comprende la etapa de:
a) hacer reaccionar un polisacárido aislado de los serotipos 10A, 22F o 33F con un agente oxidante; y b) inactivar la reacción de oxidación mediante la adición de un agente de inactivación que dé como resultado un polisacárido activado de Streptococcus pneumoníae de los serotipos 10A, 22F o 33F.
En una realización preferida, la concentración del polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F en la etapa (a) está entre 0,1 y 10 mg/ml. En una realización preferida, la concentración del polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F en el paso (a) está entre 0,5 y 5 mg/ml. En una realización preferida, la concentración del polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F en la etapa (a) está entre 1 y 3 mg/ml. En una realización preferida, la concentración del polisacárido del serotipo 22F o 33F en la etapa (a) es de aproximadamente 2 mg/ml. En una realización preferida, la concentración del polisacárido del serotipo 10A en la etapa (a) es de aproximadamente 2,5 mg/ml.
En una realización preferida, el agente oxidante es peryodato. El peryodato oxida los grupos hidroxilos vecinos para formar grupos carbonilo o aldehído y provoca la escición de un enlace C-C. El término "peryodato" incluye tanto el peryodato como el ácido peryódico. Este término también incluye el metaperyodato (IO4") y el ortoperyodato (IO65"). El término "peryodato" también incluye las diversas sales de peryodato, incluyendo el peryodato de sodio y el peryodato de potasio. En una realización preferida, el agente oxidante es peryodato de sodio. En una realización preferida, el peryodato utilizado para la oxidación del polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F es el metaperyodato. En una realización preferida, el peryodato utilizado para la oxidación del polisacárido del serotipo 10a , 22F o 33F es metaperyodato de sodio.
En una realización preferida, el polisacárido se hace reaccionar con 0,01 a 10, 0,05 a 5, 0,1 a 1, 0,5 a 1, 0,7 a 0,8, 0,01 a 0,2, 0,05 a 0,5, 0,05 a 0,2, 0,1 a 0,3 equivalentes molares de agente oxidante. En una realización preferida, el polisacárido se hace reaccionar con aproximadamente 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, En una realización preferida, el polisacárido se hace reaccionar con aproximadamente 0,10 equivalente molar de agente oxidante. En una realización preferida, el polisacárido se hace reaccionar con un equivalente molar de aproximadamente 0,15 de agente oxidante. En una realización preferida, el polisacárido se hace reaccionar con un equivalente molar de aproximadamente 0,25 de agente oxidante. En una realización preferida, el polisacárido se hace reaccionar con un equivalente molar de aproximadamente 0,5 de agente oxidante. En una realización preferida, el polisacárido se hace reaccionar con un equivalente molar de aproximadamente 0 ,8 de agente oxidante.
En una realización preferida, la duración de la reacción en la etapa (a) está entre 1 y 50, 1 y 40, 1 y 30, 1 y 25, 1 y 20, 1 y 10, 10 a 50, 10 a 40, 10 a 30, 10 a 20 horas. En una realización preferida, cuando el polisacárido es el polisacárido del serotipo 10A, la duración de la reacción en la etapa (a) está entre 1 y 10 horas. En una realización preferida, cuando el polisacárido es del serotipo 10A, la duración de la reacción en la etapa (a) es de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 horas. En una realización preferida, cuando el polisacárido es del serotipo 10A, la duración de la reacción en la etapa (a) es de unas 4 horas. En una realización preferida, cuando el polisacárido es el polisacárido del serotipo 22F, la duración de la reacción en la etapa (a) está entre 10 y 20 horas. En una realización preferida, cuando el polisacárido es del serotipo 22F, la duración de la reacción en la etapa (a) es de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 horas. En una realización preferida, cuando el polisacárido es el polisacárido del serotipo 33F, la duración de la reacción en la etapa (a) está entre 15 y 25 horas. En una realización preferida, cuando el polisacárido es el polisacárido del serotipo 33F, la duración de la reacción en la etapa (a) es de aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25 horas. En una realización preferida, cuando el polisacárido es del serotipo 33F, la duración de la reacción en la etapa (a) es de unas 20 horas.
En una realización preferida, la temperatura de la reacción en la etapa (a) se mantiene entre 1 a 30 °C, 1 a 10 °C, 10 a 20 °C, 20 a 30 °C, 2 a 8 °C. En una realización preferida, la temperatura de la reacción en la etapa (a) se mantiene a aproximadamente 5 °C.
En una realización preferida, la etapa (a) se lleva a cabo en un tampón seleccionado entre fosfato de sodio, fosfato de potasio, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) o Bis-Tris. En una realización preferida, la etapa (a) se lleva a cabo en tampón de fosfato de potasio. En una realización preferida, la etapa (a) se lleva a cabo en tampón de fosfato de sodio.
En una realización preferida el tampón tiene una concentración de entre 1 a 500 mM, 1 a 300 mM, 50 a 200 mM. En una realización preferida, el tampón tiene una concentración de aproximadamente 100 mM.
En una realización preferida el pH en la etapa (a) está entre 4 y 8, 5 y 7, 5,5 y 6,5. En una realización preferida, el pH en la etapa (a) es de aproximadamente 6. En una realización preferida, el pH en la etapa (a) es de aproximadamente 5,8.
De acuerdo con la invención, el agente de inactivación es el butan-2,3-diol.
En una realización de la divulgación, el agente de inactivación se selecciona entre dioles vecinos, 1,2-aminoalcoholes, aminoácidos, glutatión, sulfito, bisulfato, ditionito, metabisulfito, tiosulfato, fosfitos, hipofosfitos o ácido fosforoso. En una realización de la divulgación, el agente de inactivación es un 1,2-aminoalcoholes de fórmula
Figure imgf000008_0001
en la que R1 se selecciona entre H, metilo, etilo, propilo o isopropilo.
En una realización de la divulgación, el agente de inactivación se selecciona entre las sales de sodio y potasio de sulfito, bisulfato, ditionito, metabisulfito, tiosulfato, fosfitos, hipofosfitos o ácido fosforoso.
En una realización de la divulgación, el agente de inactivación es un aminoácido. En una realización, dicho aminoácido se selecciona entre serina, treonina, cisteína, cistina, metionina, prolina, hidroxiprolina, triptófano, tirosina e histidina. En una realización de la divulgación, el agente de inactivación es un sulfito tales como el bisulfato, el ditionito, el metabisulfito o el tiosulfato.
En una realización de la divulgación, el agente de inactivación es un compuesto que comprende dos grupos hidroxilos vecinos (dioles vecinos), es decir, dos grupos hidroxilos unidos covalentemente a dos átomos de carbono adyacentes. Preferentemente, el agente de inactivación es un compuesto de fórmula (II)
Figure imgf000008_0002
en el que R1 yR2 se seleccionan cada uno de forma independiente entre H, metilo, etilo, propilo o isopropilo.
En una realización preferida de la divulgación, el agente de inactivación es glicerol, etilenglicol, propan-1,2-diol, butan-1,2-diol o butan-2,3-diol, ácido ascórbico. En una realización preferida, el agente de inactivación es butan-2,3-diol.
En una realización preferida, el agente oxidante se neutraliza mediante la adición de 0,1 a 10, 0,5 a 5, 0,5 a 3, 0,5 a 2 equivalentes molares de agente de inactivación. En una realización preferida, el agente oxidante se neutraliza mediante la adición de aproximadamente 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 equivalentes molares de agente de inactivación. En una realización preferida, el agente oxidante se neutraliza mediante la adición de unos 2 equivalentes molares de agente de inactivación.
En una realización preferida, la duración de la etapa (b) está entre 0,1 y 10, 0,5 y 5, o 0,5 y 2 horas. En una realización preferida, la duración de la etapa (b) es de aproximadamente 0,5, 1, 1,5, 2,5 o 3 horas.
En una realización preferida, la temperatura de la reacción en la etapa (b) se mantiene entre 1 y 30 °C, 1 y 25 °C, 1 y 20 °C, 1 y 10 °C, 10 y 20 °C, 2 y 8 °C. En una realización preferida, la temperatura de la reacción en la etapa (b) se mantiene a aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 °C.
En una realización preferida el pH en la etapa (b) está entre 4 y 8, 5 y 7, 5,5 y 6,5. En una realización preferida, el pH en la etapa (a) es de aproximadamente 6.
En una realización preferida, se purifica el polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F. El polisacárido activado de los serotipos 10A, 22F o 33F puede purificarse de acuerdo con procedimientos conocidos por el experto en la técnica, tales como la cromatografía de permeación en gel (GPC), la diálisis o la ultrafiltración/diafiltración. Por ejemplo, el polisacárido activado se purifica por concentración y diafiltración utilizando un dispositivo de ultrafiltración.
En una realización preferida, el polisacárido aislado del serotipo 10A se activa mediante un procedimiento que comprende la etapa de:
a) hacer reaccionar el polisacárido aislado del serotipo 10A con peryodato; y
(b) inactivar la reacción de oxidación mediante la adición de butano-2,3-diol, lo que da como resultado un polisacárido del serotipo 10A activado.
En una realización preferida, el polisacárido aislado del serotipo 10A se activa mediante un procedimiento que comprende la etapa de:
a) haciendo reaccionar el polisacárido aislado del serotipo 10A con peryodato a una temperatura comprendida entre 2 y 8 °C; y
b) inactivar la reacción de oxidación mediante la adición de butano-2,3-diol a una temperatura comprendida entre 2 y 8 °C, lo que da como resultado un polisacárido del serotipo 10A activado.
En una realización preferida, el polisacárido aislado del serotipo 10A se activa mediante un procedimiento que comprende la etapa de:
a) hacer reaccionar el polisacárido aislado del serotipo 10A con peryodato equivalente a 0,2 a 0,3 molares a una temperatura entre 2 y 8 °C; y
b) inactivar la reacción de oxidación mediante la adición de un equivalente molar de 0,5 a 2 de butano-2,3-diol a una temperatura comprendida entre 2 y 8 °C, lo que da como resultado un polisacárido del serotipo 10A activado. En una realización preferida, el polisacárido aislado del serotipo 22F se activa mediante un procedimiento que comprende la etapa de:
a) haciendo reaccionar el polisacárido aislado del serotipo 22F con peryodato; y
(b) inactivar la reacción de oxidación mediante la adición de butano-2,3-diol, lo que da como resultado un polisacárido del serotipo 22F activado.
En una realización preferida, el polisacárido aislado del serotipo 22F se activa mediante un procedimiento que comprende la etapa de:
a) hacer reaccionar el polisacárido aislado del serotipo 22F con peryodato a una temperatura comprendida entre 2 y 8 °C; y
b) inactivar la reacción de oxidación mediante la adición de butano-2,3-diol a una temperatura entre 2 y 8 °C, lo que da como resultado un polisacárido del serotipo 22F activado.
En una realización preferida, el polisacárido aislado del serotipo 22F se activa mediante un procedimiento que comprende la etapa de:
a) hacer reaccionar el polisacárido aislado del serotipo 22F con peryodato equivalente a 0,05 a 0,2 molares a una temperatura entre 2 y 8 °C; y
(b) inactivar la reacción de oxidación mediante la adición de 2 a 3, preferentemente 2, equivalentes molares de butano-2,3-diol a una temperatura entre 2 y 8 °C, lo que da como resultado un polisacárido del serotipo 22F activado.
En una realización preferida, el polisacárido aislado del serotipo 33F se activa mediante un procedimiento que comprende la etapa de:
a) haciendo reaccionar el polisacárido aislado del serotipo 33F con peryodato; y
(b) inactivar la reacción de oxidación mediante la adición de butano-2,3-diol, lo que da como resultado un polisacárido del serotipo 33F activado.
En una realización preferida, el polisacárido aislado del serotipo 33F se activa mediante un procedimiento que comprende la etapa de:
a) haciendo reaccionar el polisacárido aislado del serotipo 33F con peryodato a una temperatura comprendida entre 2 y 8 °C; y
b) inactivar la reacción de oxidación mediante la adición de butano-2,3-diol a una temperatura entre 2 y 8 °C, lo que da como resultado un polisacárido del serotipo 33F activado.
En una realización preferida, el polisacárido aislado del serotipo 33F se activa mediante un procedimiento que comprende la etapa de:
a) hacer reaccionar el polisacárido aislado del serotipo 33F con peryodato equivalente a 0,05 a 0,2 molares a una temperatura entre 2 y 8 °C; y
b) inactivar la reacción de oxidación mediante la adición de un equivalente molar de 0,5 a 1,5 de butano-2,3-diol a una temperatura de entre 2 y 8 °C, lo que da como resultado un polisacárido activado del serotipo 33F.
En una realización preferida, la divulgación se refiere a un polisacárido capsular activado del serotipo 10A obtenido u obtenible mediante el procedimiento divulgado anteriormente.
En una realización preferida, la divulgación se refiere a un polisacárido capsular activado del serotipo 22F obtenido u obtenible mediante el procedimiento divulgado anteriormente.
En una realización preferida, la divulgación se refiere a un polisacárido capsular activado del serotipo 33F obtenido u obtenible mediante el procedimiento divulgado anteriormente.
En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 10A obtenido en la etapa (b) tiene un peso molecular entre el 20 y el 100 %, el 30 y el 95 %, el 40 y el 95 %, el 60 y el 95 %, el 85 y el 95 %, o aproximadamente el 90 %, del peso molecular del polisacárido aislado utilizado en la etapa (a).
En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 10A obtenido en la etapa (b) tiene un peso molecular de al menos 20, 25, 30, 35, 40 o 45 % del peso molecular del polisacárido aislado utilizado en la etapa (a). En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 10A obtenido en la etapa b) tiene un peso molecular de al menos 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ,99 % del peso molecular del polisacárido aislado utilizado en la etapa (a).
En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 22F obtenido en la etapa (b) tiene un peso molecular entre el 50 y el 100 %, el 60 y el 95 %, el 85 y el 95 % o aproximadamente el 90 % del peso molecular del polisacárido aislado utilizado en la etapa (a).
En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 22F obtenido en la etapa (b) tiene un peso molecular de al menos 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6667, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ,99 % del peso molecular del polisacárido aislado utilizado en la etapa (a).
En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 33F obtenido en la etapa (b) tiene un peso molecular entre el 50 y el 100 %, el 60 y el 95 %, el 85 y el 95 %, o aproximadamente el 90 % del peso molecular del polisacárido aislado utilizado en la etapa (a).
En una realización preferida, el polisacárido del serotipo 33F activado obtenido en la etapa (b) tiene un peso molecular de al menos 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ,99 % del peso molecular del polisacárido aislado utilizado en la etapa (a).
En una realización preferida, el grado de oxidación del polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F está entre 2 y 30, 2 y 25, 2 y 20, 2 y 15, 2 y 10, 2 y 5, 5 y 30, 5 y 25, 5 y 20, 5 y 15, 5 y 10, 10 y 30, 10 y 25, 10 y 20, 10 y 15, 5 y 25, 10 y 30, 15 y 30, 15 y 25, 15 y 25, 20 y 25. En una realización preferida, el grado de oxidación del polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F está entre 2 y 10, 4 y 8, 4 y 6, 6 y 8, 6 y 12, 8 y 14, 9 y 11, 10 y 16, 12 y 16, 14 y 18, 16 y 20, 16 y 18, 18 y 22, 18 y 20.
En una realización preferida, el polisacárido del serotipo 10A activado tiene un peso molecular entre 50 y 400, 50 y 350, 50 y 300, 50 y 250, 50 y 200, 100 y 300, 100 y 250 o 100 y 200 kDa. En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 10A tiene un peso molecular entre 50 y 300 kDa. En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 10A tiene un peso molecular entre 100 y 200 kDa. En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 10A tiene un peso molecular entre 100 y 200 kDa y un grado de oxidación entre 5 y 20, 5 y 15, 8 y 14, 8 y 12 o 9 y 11. En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 10A tiene un peso molecular entre 100 y 200 kDa y un grado de oxidación entre 9 y 11.
En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 22F tiene un peso molecular entre 25 y 1000, 100 y 1000, 300 y 800, 300 y 700, 300 y 600, 400 y 1000, 400 y 800, 400 y 700 o 400 y 600 kDa. En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 22F tiene un peso molecular entre 300 y 800 kDa. En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 22F tiene un peso molecular entre 400 y 800 kDa. En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 22F tiene un peso molecular entre 400 y 600 kDa. En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 22F tiene un peso molecular entre 400 y 800 kDa y un grado de oxidación entre 10 y 25, 10 y 20, 12 y 20 o 14 y 18. En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 22F tiene un peso molecular entre 400 y 800 kDa y un grado de oxidación entre 10 y 20.
En una realización preferida, el polisacárido del serotipo 22F activado comprende al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 o 0,7 o aproximadamente 0,8 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F. En una realización preferida, el polisacárido del serotipo 22F activado comprende al menos 0,5, 0,6 o 0,7 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F. En una realización preferida, el polisacárido del serotipo 22F activado comprende al menos 0,6 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F. En una realización preferida, el polisacárido del serotipo 22F activado comprende al menos 0,7 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F.
En una realización preferida, el polisacárido del serotipo 22F activado tiene un peso molecular entre 400 y 800 kDa y comprende al menos 0,6 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22f .
En una realización preferida, el polisacárido del serotipo 22F activado tiene un peso molecular entre 400 y 800 kDa, un grado de oxidación entre 12 y 20 y comprende al menos 0,6 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F.
En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 33F tiene un peso molecular entre 50 y 1250, 200 y 1200, 500 y 1200, 500 y 1000, 700 y 1200, 800 y 1200, 800 y 1100, 900 y 1200, 800 y 1000Da. En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 33F tiene un peso molecular entre 500 y 1000 kDa. En otra realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 33F tiene un peso molecular entre 50 y 600, 50 y 500 o 50 y 400 kDa.
En una realización preferida, el polisacárido del serotipo 33F activado comprende al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 o 0,8 o aproximadamente 0,9 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F. En una realización preferida, el polisacárido del serotipo 33F activado comprende al menos 0,6, 0,7 o 0,8 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F. En una realización preferida, el polisacárido del serotipo 33F activado comprende al menos 0,6 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F. En una realización preferida, el polisacárido del serotipo 33F activado comprende al menos 0,7 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F.
En una realización preferida, el polisacárido del serotipo 33F activado tiene un peso molecular entre 800 y 1200 kDa y comprende al menos 0,7 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F. En una realización preferida, el polisacárido del serotipo 33F activado tiene un peso molecular entre 800 y 1200 kDa, comprende al menos 0,7 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F y tiene un grado de oxidación entre 10 y 20.
En una realización preferida, el polisacárido del serotipo 33F activado tiene un peso molecular entre 50 y 200 kDa y comprende al menos 0,7 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F.
En una realización preferida, el polisacárido del serotipo 33F activado tiene un peso molecular entre 50 y 200 kDa, comprende al menos 0,7 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F y tiene un grado de oxidación entre 10 y 20.
En una realización, el polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F se liofiliza, opcionalmente en presencia de un crioprotector/lioprotector. En una realización preferida, el crioprotector/lioprotector se selecciona entre la sacarosa, la trehalosa, la rafinosa, la estaquiosa, la melezitosa, el dextrano, el manitol, el lactitol y el palatinit. En una realización preferida, el crioprotector/lioprotector es sacarosa. El polisacárido activado liofilizado puede entonces componerse con una solución que comprenda la proteína portadora.
En otra realización, el polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F se compone con la proteína portadora y se liofiliza, opcionalmente, en presencia de un crioprotector/lioprotector. En una realización preferida, el crioprotector/lioprotector se selecciona entre la sacarosa, la trehalosa, la rafinosa, la estaquiosa, la melezitosa, el dextrano, el manitol, el lactitol y el palatinit. En una realización preferida, el crioprotector/lioprotector es sacarosa. A continuación, el polisacárido co-liofilizado y la proteína portadora pueden resuspenderse en una solución y reaccionar con un agente reductor.
En una realización, la invención se refiere a un polisacárido liofilizado activado del serotipo 10A. En una realización, la invención se refiere a un polisacárido liofilizado activado del serotipo 22F. En una realización, la invención se refiere a un polisacárido liofilizado activado del serotipo 33F.
En una realización, la invención se relaciona con el polisacárido del serotipo 10A activado y el portador de proteínas. En una realización preferida, el portador de proteínas es CRM197. En una realización, la invención se refiere al polisacárido del serotipo 22F activado conjuntamente con el portador de proteínas. En una realización preferida, el portador de proteínas es CRM197. En una realización, la invención se refiere al polisacárido del serotipo 33F activado conjuntamente con el portador de proteínas. En una realización preferida, el portador de proteínas es CRM197.
Conjugación del polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F con una proteína portadora
El polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F activado que se divulga en el presente documento puede conjugarse con una proteína portadora mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
a) componer el polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F con una proteína portadora; y
b) hacer reaccionar el polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F activado y la proteína portadora compuestos con un agente reductor para formar un conjugado de polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F: proteína portadora.
La conjugación del polisacárido activado del serotipo 22F o 33F con un portador de proteínas mediante aminación reductora en dimetilsulfóxido (DMSO) es adecuada para preservar el contenido de O-acetilo del polisacárido en comparación, por ejemplo, con la aminación reductora en fase acuosa, donde el nivel de O-acetilación del polisacárido se reduce significativamente. En una realización preferida, la etapa (a) y la etapa (b) se llevan a cabo en DMSO.
En una realización preferida, el paso (a) comprende disolver el polisacárido liofilizado del serotipo 10A, 22F o 33F en una solución acuosa que comprende una proteína portadora o en una solución que comprende una proteína portadora y DMSO. En una realización preferida, el paso (a) comprende la disolución del polisacárido del serotipo 10a , 22F o 33F co-liofilizado y la proteína portadora en una solución acuosa o en DMSO.
Cuando las etapas (a) y (b) se realizan en una solución acuosa, dicha solución comprende un tampón, preferentemente seleccionado entre PBS, MES, HEPES, Bis-tris, ADA, PIPES. MOPSO, BES, MOPS, DIPSO, MOBS, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, Bicina o HEPB, a un pH entre 6,0 y 8,5, 7 y 8 o 7 y 7,5. En una realización preferida, el tampón es PBS. En una realización preferida, el pH es de aproximadamente 7,3.
En una realización preferida, la concentración de polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F en la etapa (a) está entre 0,1 y 10 mg/ml, 0,5 y 5 mg/ml, 0,5 y 2 mg/ml. En una realización preferida, la concentración de polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F en la etapa (a) es de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 o 3 mg/ml.
En una realización preferida, la relación inicial (peso por peso) de polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F con respecto a la proteína portadora está entre 5:1 y 0,1:1, 2:1 y 0,1:1, 2:1 y 1:1, 1,5:1 y 1:1, 0,1:1 y 1:1, 0,3:1 y 1:1, 0,6:1 y 1:1,2, En una realización preferida, la relación inicial de polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F con respecto a la proteína portadora es de aproximadamente 0,6:1 y 1:1,2. En una realización preferida, la relación inicial de polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F con respecto a la proteína portadora es de aproximadamente 0,4:1, 0,5:1, 0,6:1, 0,7:1, 0,8:1, 0,9:1, 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1,9:1, 2:1.
En una realización preferida, en la etapa (b), el polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F se hace reaccionar con entre 0,1 y 10 equivalentes molares, 0,5 y 5 equivalentes molares 0,5 y 2,5 equivalentes molares de agente reductor. En una realización preferida, en la etapa (b), el serotipo activado 10a , 22F o 33F se hace reaccionar con aproximadamente 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1,2,2, 2,3, 2,4 o 2,5 equivalentes molares de agente reductor.
En una realización, el agente reductor es cianoborohidruro de sodio, triacetoxiborhidruro de sodio, borohidruro de sodio o de zinc en presencia de ácidos de Bronsted o de Lewis, boranos de amina, tales como el borano de piridina, el borano de 2-picolina, 2,6-diborano-metanol, el borano de dimetilamina, t-BuMeiPrN-BH3, BH3 de bencilamina o el borano de 5-etil-2-metilpiridina (PEMB). En una realización preferida, el agente reductores cianoborohidruro de sodio.
En una realización preferida, la duración de la etapa (b) está entre 1 y 50, 5 y 30, 10 y 30, 15 y 30, 20 y 30, 5 y 25, 10 y 25, 15 y 25 horas. En una realización preferida, la duración de la etapa (b) es de aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 horas.
En una realización preferida, la temperatura de la reacción en la etapa (b) se mantiene entre 10 y 40 °C, 15 y 30 °C, 20 y 26 °C, 21 y 25 °C. En una realización preferida, la temperatura de la reacción en la etapa (b) se mantiene en aproximadamente 21, 22, 23, 24 o 25 °C.
En una realización preferida, el procedimiento para la preparación de un conjugado inmunogénico que comprende el polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F unido covalentemente a una proteína portadora comprende además una etapa (etapa c) de cubrimiento del aldehído no reaccionado (quenching) mediante la adición de NaBH4.
En una realización preferida, en la etapa (c), los aldehídos que no han reaccionado se cubren mediante la adición de 0,1 a 10 equivalentes molares, 0,5 a 5 equivalentes molares o 1 a 3 equivalentes molares de NaBH4. En una realización preferida, en la etapa (c), los aldehídos que no han reaccionado se cubren mediante la adición de aproximadamente 2 equivalentes molares de NaBH4.
En una realización preferida, la duración de la etapa (c) está entre 0,1 y 10, 0,5 y 5 o 2 y 4 horas. En una realización preferida, la duración de la etapa (c) es de unas 3 horas.
En una realización preferida, la temperatura de la reacción en la etapa (c) se mantiene entre 10 a 40 °C, 15 a 30 °C o 20 a 26 °C. En una realización preferida, la temperatura de la reacción en la etapa (c) se mantiene a aproximadamente 23 °C.
Después de la conjugación del polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F con la proteína portadora, el conjugado polisacárido-proteína puede ser purificado (enriquecido con respecto a la cantidad de conjugado polisacárido-proteína) por una variedad de técnicas conocidas por el experto. Estas técnicas incluyen la diálisis, las operaciones de concentración/diafiltración, la precipitación/elución por filtración de flujo tangencial, la cromatografía en columna (DEAE o cromatografía de interacción hidrófoba) y la filtración en profundidad.
En una realización preferida, la proteína portadora no es tóxica ni reactogénica y se puede obtener en cantidad y pureza suficientes. Las proteínas portadoras deben ser susceptibles de procedimientos de conjugación estándar.
En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F se conjuga con una proteína portadora que se selecciona en el grupo que consiste en: DT (toxina diftérica), TT (toxina tetánica) o fragmento C de TT, CRM197 (una variante no tóxica pero antigénicamente idéntica de la toxina diftérica) otros mutantes puntuales de DT, tales como CRM176, CRM228, CRM 45 (Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM102, CRM 103 y CRM107 y otras mutaciones descritas por Nicholls y Youle en Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; supresión o mutación de Glu-148 por Asp, Gln o Ser y/o Ala 158 por Gly y otras mutaciones divulgadas en US 4709017 o US 4950740; mutación de al menos uno o más residuos Lys 516, Lys 526, Phe 530 y/o Lys 534 y otras mutaciones divulgadas en US 5917017 o US 6455673; o fragmento divulgado en el documento US 5843711, neumolisina neumocócica (Kuo et al (1995) Infect Immun 63; 2706-13), incluida la ply detoxificada de alguna manera, por ejemplo, dPLY-GMBS (WO 04081515, PCT/EP2005/010258) o dPLY-formol, PhtX, incluyendo PhtA, PhtB, PhtD, PhtE (las secuencias de PhtA, PhtB, PhtD o PhtE se divulgan en WO 00/37105 o WO 00/39299) y fusiones de proteínas Pht, por ejemplo, fusiones PhtDE, fusiones PhtBE, Pht A-E (WO 01/98334, WO 03/54007, WO2009/000826), OMPC (proteína de membrana externa meningocócica - usualmente extraída de N.meningitidis serogrupo B -) EP0372501), PorB (de N. meningitidis), PD (proteína D de Haemophilus influenza - véase, por ejemplo EP 0594 610 B), o sus equivalentes inmunológicamente funcionales, péptidos sintéticos (EP0378881 , EP0427347), proteínas de choque térmico (WO 93/17712, WO 94/03208), las proteínas de la tos ferina (WO 98/58668, EP0471 177), citoquinas, linfocinas, factores de crecimiento u hormonas (WO10 91/01146), proteínas artificiales que comprenden múltiples epítopos de células T CD4+ humanas de diversos antígenos derivados de patógenos (Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31 ; 3816-3824) tales como la proteína N19 (Baraldoi et al (2004) Infect Immun 72; 4884-7) la proteína de superficie neumocócica PspA (WO 02/091998), las proteínas de captación de hierro (WO 01/72337), la toxina A o B de C. difficile (WO 00/61761). En una realización, el polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F se conjuga con DT (toxoide diftérico). En otra realización, el polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F está conjugado con TT (toxina tetánica). En otra realización, el polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F se conjuga con el fragmento C del TT. En otra realización, el polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F se conjuga con PD (proteína D de Haemophilus influenza - véase, por ejemplo, EP 0594610 B).
En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F se conjuga con la proteína CRM197. La proteína CRM197 es una forma no tóxica de la toxina diftérica pero es inmunológicamente indistinguible de la toxina diftérica. El CRM197 es producido por C. diphtheriae infectado por el fago no toxigénico p197tox- creado por mutagénesis con nitrosoguanidina del corinefago beta toxigénico (Uchida, T. et al. 1971, Nature New Biology 233:8-11). El CRM197 se purifica mediante ultrafiltración, precipitación con sulfato de amonio y cromatografía de intercambio iónico. La proteína CRM197 tiene el mismo peso molecular que la toxina diftérica, pero difiere de ella por un único cambio de base (guanina a adenina) en el gen estructural. Este único cambio de base provoca una sustitución de aminoácidos (ácido glutámico por glicina) en la proteína madura y elimina las propiedades tóxicas de la toxina diftérica. La proteína CRM197 es un portador seguro y eficaz de sacáridos dependiente de las células T. Se pueden encontrar más detalles sobre el CMR197 y su producción, por ejemplo, en US 5.614.382.
En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F divulgado en el presente documento se conjuga con CRM197 mediante un procedimiento que comprende la etapa de:
(a) componer el polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F con CRM197;
b) hacer reaccionar el polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F activado compuesto y el CRM197
con cianoborohidruro de sodio para formar un conjugado polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F:CRM197.
En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F divulgado en el presente documento se conjuga con CRM197 mediante un procedimiento que comprende la etapa de:
(a) componer el polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F con un CRM197;
b) hacer reaccionar el polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F activado compuesto y el CRM197
con cianoborohidruro de sodio para formar un conjugado polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F:CRM^; en el que las etapas (a) y (b) se llevan a cabo en DMSO.
En una realización preferida, el polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F divulgado en el presente documento se conjuga con CRM197 mediante un procedimiento que comprende la etapa de:
(a) componer el polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F con un CRM197;
b) hacer reaccionar el polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F activado compuesto y el CRM197
con cianoborohidruro de sodio equivalente a 0,5 a 2 molares para formar un conjugado polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F:CRM197; en el que las etapas (a) y (b) se llevan a cabo en DMSO.
En una realización, la invención se refiere a un conjugado inmunogénico obtenido o que se puede obtener mediante un procedimiento divulgado en el presente documento. En una realización preferida, la invención se refiere a un conjugado inmunogénico obtenido o que se puede obtener mediante la conjugación de un polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F, como se divulga en el presente documento, con una proteína portadora mediante aminación reductora. En una realización preferida, la invención se refiere a un conjugado inmunogénico obtenido u obtenible mediante la conjugación de un polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F como se divulga en el presente documento a una proteína portadora mediante aminación reductora en DMSO. En una realización preferida, la proteína portadora es CRM197.
Conjugado inmunogénico del serotipo 10A
En una realización preferida, el conjugado inmunogénico del serotipo 10A tiene un peso molecular entre 500 y 15000; 500 y 10000; 2000 y 10000; o 3000 y 8000 kDa. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico del serotipo 10A tiene un peso molecular entre 3000 y 8000 kDa. El peso molecular del conjugado inmunogénico se mide por SEC-MALLS.
En una realización preferida, el conjugado inmunogénico del serotipo 10A comprende menos de aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 o 15 % de polisacárido libre del serotipo 10A en comparación con la cantidad total de polisacárido del serotipo 10A. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico del serotipo 10A comprende menos de aproximadamente un 25 % de polisacárido libre del serotipo 10A en comparación con la cantidad total de polisacárido del serotipo 10A. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico del serotipo 10A comprende menos de un 20 % de polisacárido libre del serotipo 10A en comparación con la cantidad total de polisacárido del serotipo 10A. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico del serotipo 10A comprende menos de aproximadamente un 15 % de polisacárido libre del serotipo 10A en comparación con la cantidad total de polisacárido del serotipo 10A.
En una realización preferida, la relación (peso por peso) del polisacárido del serotipo 10A con respecto a la proteína portadora en el conjugado está entre 0,5 y 3. En una realización preferida, la relación entre el polisacárido del serotipo 10A y la proteína portadora en el conjugado está entre 0,5 y 2, 0,5 y 1,5, 0,5 y 1, 1 y 1,5, 1 y 2. En una realización preferida, la relación entre el polisacárido del serotipo 10A y la proteína portadora en el conjugado está entre 0,8 y 1,4. En una realización preferida, la relación entre el polisacárido capsular del serotipo 10A y la proteína portadora en el conjugado está entre 0,8 y 1,2.
El medio de cromatografía de exclusión por tamaño (CL-4B) puede utilizarse para determinar la distribución del tamaño molecular relativo del conjugado. La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se utiliza en columnas alimentadas por gravedad para perfilar la distribución del tamaño molecular de los conjugados. Las moléculas grandes excluidas de los poros del medio eluyen más rápidamente que las moléculas pequeñas. Los colectores de fracciones se utilizan para recoger el eluido de la columna. Las fracciones se analizan colorimétricamente mediante un ensayo de sacáridos. Para la determinación de Kd, las columnas se calibran para establecer la fracción en la que las moléculas están totalmente excluidas (V0), (Kd=0), y la fracción que representa la máxima retención (Vi), (Kd=1). La fracción a la que se alcanza un determinado atributo de la muestra (Ve), se relaciona con Kd mediante la expresión, Kd = (Ve - Vo)/(Vi -Vo).
En una realización preferida, al menos el 30 % del conjugado inmunogénico del serotipo 10A tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, al menos el 40 % del conjugado inmunogénico tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, al menos el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 % o el 85 % del conjugado inmunogénico del serotipo 10A tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, al menos el 60 % del conjugado inmunogénico del serotipo 10A tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, entre el 50 % y el 80 % del conjugado inmunogénico del serotipo 10A tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B.
El grado de conjugación es el número de residuos de lisina en la proteína portadora que se conjugan con el polisacárido de interés. La evidencia de la modificación de la lisina de la proteína portadora, debido a los enlaces covalentes con los polisacáridos, se obtiene mediante el análisis de aminoácidos utilizando procedimientos rutinarios conocidos por los expertos en la técnica. La conjugación da como resultado una reducción del número de residuos de lisina recuperados, en comparación con el material de partida de la proteína CRM197 utilizado para generar los materiales conjugados.
En una realización preferida, el grado de conjugación del conjugado inmunogénico está entre 2 y 15, 2 y 13, 2 y 10, 2 y 8, 2 y 6, 2 y 5, 2 y 4, 3 y 15, 3 y 13, 3 y 10, 3 y 8, 3 y 6, 3 y 5, 3 y 4, 5 y 15, 5 y 10, 8 y 15, 8 y 12, 10 y 15 o 10 y 12. En una realización preferida, el grado de conjugación del conjugado inmunogénico está entre 6 y 8.
Conjugado inmunogénico del serotipo 22F
En una realización preferida, el conjugado inmunogénico comprende al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 o 0,7 o aproximadamente 0,8 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico comprende al menos 0,5, 0,6 o 0,7 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico comprende al menos 0,6 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico comprende al menos 0,7 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F.
En una realización preferida, la relación de mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F en el conjugado inmunogénico con mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F en el polisacárido aislado es de al menos 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9 o 0,95. En una realización preferida, la relación de mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F en el conjugado inmunogénico con mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F en el polisacárido aislado es de al menos 0,7. En una realización preferida, la relación de mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F en el conjugado inmunogénico con mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F en el polisacárido aislado es de al menos 0,9.
En una realización preferida, la relación de mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F en el conjugado inmunogénico a mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F en el polisacárido activado es de al menos 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9 o 0,95. En una realización preferida, la relación de mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F en el conjugado inmunogénico con mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F en el polisacárido activado es de al menos 0,7. En una realización preferida, la relación de mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F en el conjugado inmunogénico con mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 22F en el polisacárido activado es de al menos 0,9.
En una realización preferida, el conjugado inmunogénico del serotipo 22F tiene un peso molecular entre 400 y 15000; 500 y 10000; 2000 y 10000 kDa; 3000 y 8000 kDa; o 3000 y 5000 kDa. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico del serotipo 22F tiene un peso molecular entre 3000 y 5000 kDa. El peso molecular del conjugado inmunogénico se mide por SEC-MALLS.
En una realización preferida, el conjugado inmunogénico del serotipo 22F comprende menos de aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 o 15 % de polisacárido libre del serotipo 22F en comparación con la cantidad total de polisacárido del serotipo 22F. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico del serotipo 22F comprende menos de aproximadamente un 40 % de polisacárido libre del serotipo 22F en comparación con la cantidad total de polisacárido del serotipo 22F. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico del serotipo 22F comprende menos de aproximadamente un 25 % de polisacárido libre del serotipo 22F en comparación con la cantidad total de polisacárido del serotipo 22F. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico del serotipo 22F comprende menos de aproximadamente un 20 % de polisacárido libre del serotipo 22F en comparación con la cantidad total de polisacárido del serotipo 22F. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico del serotipo 22F comprende menos de aproximadamente un 15 % de polisacárido libre del serotipo 22F en comparación con la cantidad total de polisacárido del serotipo 22F.
En una realización preferida, la relación (peso por peso) del polisacárido del serotipo 22F con respecto a la proteína portadora en el conjugado está entre 0,5 y 3. En una realización preferida, la relación entre el polisacárido del serotipo 22F y la proteína portadora en el conjugado está entre 0,5 y 2, 0,5 y 1,5, 0,8 y 1,2, 0,5 y 1, 1 y 1,5, o 1 y 2. En una realización preferida, la relación entre el polisacárido del serotipo 22F y la proteína portadora en el conjugado está entre 0,8 y 1,2. En una realización preferida, la relación entre el polisacárido capsular del serotipo 22F y la proteína portadora en el conjugado está entre 0,9 y 1,1.
En una realización preferida, al menos el 30 % del conjugado inmunogénico del serotipo 22F tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, al menos el 40 % del conjugado inmunogénico tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, al menos el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 % o el 85 % del conjugado inmunógeno del serotipo 22F tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, al menos el 60 % del conjugado inmunogénico del serotipo 22F tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, entre el 50 % y el 80 % del conjugado inmunogénico del serotipo 22F tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, entre el 65 % y el 80 % del conjugado inmunogénico del serotipo 22F tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B.
En una realización preferida, el grado de conjugación del conjugado inmunogénico está entre 2 y 15, 2 y 13, 2 y 10, 2 y 8, 2 y 6, 2 y 5, 2 y 4, 3 y 15, 3 y 13, 3 y 10, 3 y 8, 3 y 6, 3 y 5, 3 y 4, 4 y 7, 5 y 15, 5 y 10, 8 y 15, 8 y 12, 10 y 15 o 10 y 12. En una realización preferida, el grado de conjugación del conjugado inmunogénico está entre 4 y 7.
Conjugado inmunogénico del serotipo 33F
En una realización preferida, el conjugado inmunogénico comprende al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 o 0,7 o aproximadamente 0,8 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico comprende al menos 0,5, 0,6 o 0,7 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico comprende al menos 0,6 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico comprende al menos 0,7 mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F.
En una realización preferida, la relación de mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F en el conjugado inmunogénico a mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F en el polisacárido aislado es de al menos 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9 o 0,95. En una realización preferida, la relación de mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F en el conjugado inmunogénico con mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F en el polisacárido aislado es de al menos 0,7. En una realización preferida, la relación de mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F en el conjugado inmunogénico con mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F en el polisacárido aislado es de al menos 0,9.
En una realización preferida, la relación de mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F en el conjugado inmunogénico a mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F en el polisacárido activado es de al menos 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9 o 0,95. En una realización preferida, la relación de mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F en el conjugado inmunogénico con mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F en el polisacárido activado es de al menos 0,7. En una realización preferida, la relación de mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F en el conjugado inmunogénico con mM de acetato por mM de polisacárido del serotipo 33F en el polisacárido activado es de al menos 0,9.
En una realización preferida, el conjugado inmunogénico del serotipo 33F tiene un peso molecular entre 500 y 30000; 500 y 25000; 500 y 20000; 500 y 15000; 500 y 10000; 1000 y 10000; 1000 y 8000; 1000 y 5000; 2000 y 10000 kDa; 2000 y 8000; o 2000 y 5000 kDa. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico del serotipo 33F tiene un peso molecular entre 1000 y 5000 kDa. El peso molecular del conjugado inmunogénico se mide por SEC-MALLS.
En una realización preferida, el conjugado inmunogénico del serotipo 33F comprende menos de aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 o 15 % de polisacárido libre del serotipo 33F en comparación con la cantidad total de polisacárido del serotipo 33F. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico del serotipo 33F comprende menos de aproximadamente un 25 % de polisacárido libre del serotipo 33F en comparación con la cantidad total de polisacárido del serotipo 33F. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico del serotipo 33F comprende menos de un 20 % de polisacárido libre del serotipo 33F en comparación con la cantidad total de polisacárido del serotipo 33F. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico del serotipo 33F comprende menos de aproximadamente un 15 % de polisacárido libre del serotipo 33F en comparación con la cantidad total de polisacárido del serotipo 33F.
En una realización preferida, la relación (peso por peso) del polisacárido del serotipo 33F con respecto a la proteína portadora en el conjugado está entre 0,4 y 3. En una realización preferida, la relación entre el polisacárido del serotipo 33F y la proteína portadora en el conjugado está entre 0,5 y 2, 0,5 y 1,5, 0,5 y 1, 1 y 1,5, 1 y 2. En una realización preferida, la relación entre el polisacárido del serotipo 33F y la proteína portadora en el conjugado está entre 0,5 y 1,5. En una realización preferida, la relación entre el polisacárido capsular del serotipo 33F y la proteína portadora en el conjugado está entre 0,5 y 1,2.
En una realización preferida, al menos el 30 % del conjugado inmunogénico del serotipo 33F tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, al menos el 40 % del conjugado inmunogénico tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, al menos el 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 % del conjugado inmunogénico del serotipo 33F tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, al menos el 60 % del conjugado inmunogénico del serotipo 33F tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, entre el 40 % y el 80 % del conjugado inmunogénico del serotipo 33F tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, entre el 45 % y el 65 % del conjugado inmunogénico del serotipo 33F tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B.
En una realización preferida, el grado de conjugación del conjugado inmunogénico está entre 1 y 15, 2 y 13, 2 y 10, 2 y 8, 2 y 6, 2 y 5, 2 y 4, 3 y 15, 3 y 13, 3 y 10, 3 y 8, 3 y 6, 3 y 5, 3 y 4, 5 y 15, 5 y 10, 8 y 15, 8 y 12, 10 y 15 o 10 y 12. En una realización preferida, el grado de conjugación del conjugado inmunogénico está entre 3 y 6.
Composición inmunogénica
El término "composición inmunogénica" se refiere a cualquier composición farmacéutica que contenga un antígeno, por ejemplo, un microorganismo o un componente del mismo, cuya composición puede utilizarse para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto.
Tal como se utiliza en el presente documento, "inmunogénico" significa la capacidad de un antígeno (o un epítopo del antígeno), tal como un polisacárido capsular bacteriano, o un glicoconjugado o composición inmunogénica que comprende un antígeno, para provocar una respuesta inmunitaria en un huésped como un mamífero, ya sea mediada por vía humoral o celular, o ambas.
En una realización preferida, la composición inmunogénica comprende un conjugado del serotipo 10A, 22F o 33F obtenido por un procedimiento divulgado en el presente documento. En una realización preferida de la divulgación, la composición inmunogénica que comprende un conjugado del serotipo 10A, 22F o 33F se puede obtener mediante un procedimiento divulgado en el presente documento.
En una realización, la composición inmunogénica divulgada en el presente documento, cuando se administra a un sujeto, induce la formación de anticuerpos capaces de unirse al serotipo 10A del Streptococcus pneumonía. En una realización, la composición inmunogénica divulgada en el presente documento, cuando se administra a un sujeto, induce la formación de anticuerpos capaces de unirse al serotipo 10A de Streptococcus pneumonía , medido mediante un ensayo ELISA estándar.
En una realización, la composición inmunogénica divulgada en el presente documento, cuando se administra a un sujeto, induce la formación de anticuerpos capaces de matar el Streptococcus pneumonia del serotipo 10A en un ensayo de opsonofagocitosis como se divulga en el presente documento.
En una realización, la composición inmunogénica divulgada en el presente documento, cuando se administra a un sujeto, induce la formación de anticuerpos capaces de unirse al serotipo 22F del Streptococcus pneumonía. En una realización, la composición inmunogénica divulgada en el presente documento, cuando se administra a un sujeto, induce la formación de anticuerpos capaces de unirse al serotipo 22F de Streptococcus pneumonía, medido mediante un ensayo ELISA estándar.
En una realización, la composición inmunogénica divulgada en el presente documento, cuando se administra a un sujeto, induce la formación de anticuerpos capaces de matar Streptococcus pneumonia del serotipo 22F en un ensayo de opsonofagocitosis como se divulga en el presente documento.
En una realización, la composición inmunogénica divulgada en el presente documento, cuando se administra a un sujeto, induce la formación de anticuerpos capaces de unirse al serotipo 33F del Streptococcus pneumonía. En una realización, la composición inmunogénica divulgada en el presente documento, cuando se administra a un sujeto, induce la formación de anticuerpos capaces de unirse al serotipo 33F de Streptococcus pneumonía, medido mediante un ensayo ELISA estándar.
En una realización, la composición inmunogénica divulgada en el presente documento, cuando se administra a un sujeto, induce la formación de anticuerpos capaces de matar al Streptococcus pneumonia del serotipo 33F en un ensayo de opsonofagocitosis como se divulga en el presente documento.
La formulación de la composición inmunogénica del presente de la divulgación puede llevarse a cabo utilizando procedimientos reconocidos en la técnica. Por ejemplo, los conjugados del serotipo 10A, 22F o 33F pueden formularse con un vehículo fisiológicamente aceptable para preparar la composición. Ejemplos de tales vehículos incluyen, pero no se limitan a, agua, solución salina tamponada, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y soluciones de dextrosa.
En una realización preferida, la composición inmunogénica puede comprender al menos un antígeno adicional. En una realización preferida, la composición inmunogénica puede comprender al menos un polisacárido capsular adicional de Streptococcus pneumoniae .
En una realización preferida, la composición inmunogénica puede comprender al menos un polisacárido capsular adícíonal de Streptococcus pneumoníae conjugado con una proteína portadora. En una realización preferida, dicha proteína portadora es CRM197.
En ciertas realizaciones, la composición inmunogénica comprende uno o más adyuvantes. Tal como se define en el presente documento, un "adyuvante" es una sustancia que sirve para mejorar la inmunogenicidad de una composición inmunogénica de esta invención. Así, los adyuvantes se administran a menudo para potenciar la respuesta inmunitaria y son bien conocidos por la persona experimentada. Los adyuvantes adecuados para mejorar la eficacia de la composición incluyen, pero no se limitan a:
(1) sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc;
(2) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos, como péptidos de muramilo (definidos más adelante) o componentes de la pared celular bacteriana), tales como, por ejemplo
(a) MF59 (PCT Pub. N°WO 90/14837), que contiene un 5 % de escualeno, un 0,5 %5 de Tween 80 y un 0,5 % de Span 85 (opcionalmente con diversas cantidades de MTP-PE (véase más adelante, aunque no es necesario)) formulado en partículas submicrónicas utilizando un microfluidizador como el modelo 11OY (Microfluidics, Newton, Ma ),
b) SAF, que contiene un 10 % de escualeno, un 0,4 % de Tween 80, un 5 % de polímero plurónico bloqueado L121 y thr-MDP (véase más adelante), microfluidizado en una emulsión submicrónica o sometida a vórtex para generar una emulsión de mayor tamaño de partícula, y
c) Sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Corixa, Hamilton, MT) que contiene un 2 % de escualeno, un 0,2 % de Tween 80 y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo formado por el monofosforilípido A (MPL™) 3-O-deilado descrito en el documentoo de Patente U.S. No. 4.912.094 (Corixa), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferentemente MPL CWS (Detox™);
(3) adyuvantes de saponina, como Quil A o STIMULON™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (Patente U.S. No. 5.057.540) pueden utilizarse o partículas generadas a partir de ellos, como los ISCOM (complejos inmunoestimulantes);
(4) los bacteriallipopolisacáridos, los análogos sintéticos del lípido A, tales como los compuestos de aminoalquilglucosamina-fosfato (AGP), o sus derivados o análogos, disponibles en Corixa, y que se describen en Patente U.S. No. 6, 113.918; uno de estos AGP es el 2-[(R)-3-Tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etil 2-Desoxi-4-Ofosfono-3-O-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3tetradecanoiloxitetradecanoilamino]-b-D-glucopiranósido que también se conoce como 529 (antes conocido como RC529), que se formula como una forma acuosa o como una emulsión estable, polinucleótidos sintéticos tlaes como oligonucleótidos que contienen motivo(s) CpG (Patente U.S. No. 6.207.646);
(5) citoquinas, tales como interleuquinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, etc.), interferones (por ejemplo, interferón gamma), factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), moléculas coestimuladoras 87-1 y 87-2, etc;
(6) mutantes detoxificados de una toxina bacteriana ADP-ribosiladora, tal como la toxina del cólera (CT), ya sea en forma salvaje o mutante, por ejemplo, en la que el ácido glutámico en la posición del aminoácido 29 se sustituye por otro aminoácido, preferentemente una histidina, de acuerdo con la solicitud internacional de patente publicada número WO 00/18434 (véase también WO 02/098368 y WO 02/098369), una toxina pertussis (PT) o una toxina termolábil de E. coli (LT), en particular LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129 (véase, porejemploWO 93/13302 y WO 92/19265); y
(7) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para aumentar la eficacia de la composición.
Los péptidos de muramilo incluyen, pero no se limitan a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetilnormuramil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.
En una realización de la presente divulgación, las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento comprenden un oligonucleótido CpG como adyuvante. Un oligonucleótido CpG, tal y como se utiliza en este documento, se refiere a un oligodeoxinucleótido CpG inmunoestimulador (ODN CpG), por lo que estos términos se utilizan indistintamente a menos que se indique otra cosa. Los oligodeoxinucleótidos CpG inmunoestimuladores contienen uno o más motivos CpG inmunoestimuladores que son dinucleótidos de citosina-guanina no metilados, opcionalmente dentro de ciertos contextos de bases preferidos. El estado de metilación del motivo inmunoestimulador CpG se refiere generalmente al residuo de citosina en el dinucleótido. Un oligonucleótido inmunoestimulador que contiene al menos un dinucleótido CpG no metilado es un oligonucleótido que contiene una citosina 5' no metilada unida por un enlace fosfato a una guanina 3', y que activa el sistema inmunitario mediante la unión al receptortipo Toll 9 (TLR-9). En otra realización, el oligonucleótido inmunoestimulador puede contener uno o más dinucleótidos CpG metilados, que activarán el sistema inmunitario a través de TLR9 pero no con tanta fuerza como si el motivo o motivos CpG no estuvieran metilados. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores CpG pueden comprender uno o más palíndromos que a su vez pueden englobar el dinucleótido CpG. Los oligonucleótidos CpG se han descrito en una serie de patentes emitidas, solicitudes de patentes publicadas y otras publicaciones, incluyendo Patentes U.S. Nos.
6.194.388 6,207,646 6,214,806 6,218,371 6,239,116y 6,339,068.
En una realización de la presente divulgación, las composiciones inmunogénicas divulgada en el presente documentos comprenden cualquiera de los oligonucleótidos CpG descritos en las páginas 3 líneas 22 a la página 12 línea 36 del documento WO2010/125480.
Se han identificado diferentes clases de oligonucleótidos inmunoestimuladores CpG. Se denominan clase A, B, C y P, y se describen con más detalle en las páginas 3 líneas 22 a la página 12 línea 36 del documento WO2010/125480. Los procedimientos de la invención abarcan el uso de estas diferentes clases de oligonucleótidos inmunoestimuladores CpG.
En una realización de la presente divulgación, las composiciones inmunogénicas como se divulgan en el presente documento comprenden un oligonucleótido CpG de clase A. Preferentemente, el oligonucleótido CpG "clase A" de la invención tiene la siguiente secuencia de ácido nucleico: 5' GGGGACGACGTCGGGGGG 3' (SEQ ID NO: 1). Algunos ejemplos no limitantes de oligonucleótidos de la Clase A incluyen: 5' G*G*G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G_G*G*G 3' (s Eq ID NO: 2 ); en la que * se refiere a un enlace fosforotioato y _ se refiere a un enlace fosfodiéster.
En una realización de la presente divulgación, las composiciones inmunogénicas como se divulgan en el presente documento comprenden un oligonucleótido CpG de clase B. En una realización, el oligonucleótido CpG para su uso en la presente divulgación es un oligonucleótido CpG de clase B representado por al menos la fórmula:
5' X1X2CGX3X4 3', en la que X1, X2, X3 y X4 son nucleótidos. En una realización, X2 es adenina, guanina o timina. En otra realización, X3 es citosina, adenina o timina.
Las secuencias de oligonucleótidos CpG de clase B de la invención son las descritas ampliamente en las Patentes U.S. Ps 6.194.388, 6,207,646, 6,214,806, 6,218,371,6,239,116 y 6,339,068. Las secuencias ejemplares incluyen, pero no se limitan a las divulgadas en estas últimas solicitudes y patentes.
En una realización, el oligonucleótido CpG "clase B" de la divulgación tiene la siguiente secuencia de ácido nucleico:
5' TCGTCGTTTCGGTGCTTTT 3' (SEQ ID NO: 3), o
5' TCGTCGTTTCGGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 4), o
5' TCGTCGTTGTCGTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 5), o
5' TCGTCGTTTCGTCTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 6), o
5' TCGTCGTTGTCGTTTTTCGA 3' (SEQ ID NO: 7).
En cualquiera de estas secuencias, todos los enlaces pueden ser uniones de fosforotioato. En otra realización, en cualquiera de estas secuencias, uno o más de los enlaces puede ser fosfodiéster, preferentemente entre la "C" y la "G" del motivo CpG haciendo un oligonucleótido CpG semiblando. En cualquiera de estas secuencias, una etil-uridina o un halógeno pueden sustituir a la 5' T; los ejemplos de sustituciones halógenas incluyen, pero no se limitan a, sustituciones de bromo-uridina o yodo-uridina.
Algunos ejemplos no limitantes de oligonucleótidos de la Clase B incluyen:
5' t *C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T 3' (SEQ ID NO: 8), o
5' t *C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T 3' (SEQ ID NO: 9), o
5' t *C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO: 10), o
5' t *C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*T 3' (SEQ ID NO: 11), o
5' t *C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*C*G*T*T*T*T*T*C*G*A 3' (SEQ ID NO: 12).
donde * se refiere a un enlace fosforotioato.
En una realización de la presente divulgación, las composiciones inmunogénicas como se divulgan en el presente documento comprenden un oligonucleótido CpG de clase C. En una realización, los oligonucleótidos CpG "clase C" de la invención tienen la siguiente secuencia de ácido nucleico:
5' TCGCGTCGTTCGGCGCG 3' (SEQ ID NO: 13), o
5' TCGTCGACGTTCGGCGCG 3' (SEQ ID NO: 14), o
5' TCGGACGTTCGGCGCG 3' (SEQ ID NO: 15), o
5' TCGGACGTTCGGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 16), o
5' TCGCGTCGTTCGGCG 3' (SEQ ID NO: 17), o
5' TCGACGTTCGGCGCG 3' (SEQ ID NO: 18), o
5' TCGACGTTCGGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 19), o
5' TCGCGTCGTTCGGCG 3' (SEQ ID NO: 20), o
5' TCGCGACGTTCGGCGGCG 3' (SEQ ID NO: 21), o
5' TCGTCGTTCGGCGGCG 3' (SEQ ID NO: 22), o
5' TCGTCGTTCGGCGGCCG 3' (SEQ ID NO: 23), o
5' TCGTCGTTTTACGGCGGTGCCG 3' (SEQ ID NO: 24), o
5' TCGTCGTTCGGCGCGGGT 3' (SEQ ID NO: 25).
En cualquiera de estas secuencias, todos los enlaces pueden ser uniones de fosforotioato. En otra realización, en cualquiera de estas secuencias, uno o más de los enlaces puede ser fosfodiéster, preferentemente entre la "C" y la "G" del motivo CpG haciendo un oligonucleótido CpG semiblando.
Algunos ejemplos no limitantes de oligonucleótidos de la Clase C incluyen:
5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*C_G*G*C*G*G*C*G*C*G 3' (SEQ ID NO: 26), o
5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G 3' (SEQ ID NO: 27), o
5' T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 28), o
5' T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 29), o
5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*C_G*G*C*G*G*C*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 30), o
5' T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 31), o
5' T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 32), o
5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*C_G*G*C*G*G 3' (SEQ ID NO: 33), o
5' T*C_G*C_G*A*C_G*T*C_G*G*C*G*G*C*G*C*G 3' (SEQ ID NO: 34), o
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 35), o
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 36), o
5' t *C*G*T*C_G*T*T*T*A*C_G*G*C*G*C_G*T*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 37), o
5' T*C_G*T*C*G*T*T*T*C*G*C*C*G*G*C*C*G*T 3' (SEQ ID NO: 38)
donde * se refiere a un enlace fosforotioato y _ se refiere a un enlace fosfodiéster.
En cualquiera de estas secuencias, una etil-uridina o un halógeno pueden sustituir a la 5' T; ejemplos de sustituciones halógenas incluyen, pero no se limitan a, sustituciones de bromo-uridina o yodo-uridina.
En una realización de la presente divulgación, las composiciones inmunogénicas como se divulgan en el presente documento comprenden un oligonucleótido CpG de clase P. En una realización, el oligonucleótido CpG para su uso en la presente invención es un oligonucleótido CpG de clase P que contiene un dominio de activación TLR 5' y al menos dos regiones palindrómicas, siendo una de las regiones palindrómicas una región palindrómica 5' de al menos 6 nucleótidos de longitud y conectada a una región palindrómica 3' de al menos 8 nucleótidos de longitud, ya sea directamente o a través de un espaciador, en el que el oligonucleótido incluye al menos un dinucleótido YpR. En una realización, dicho oligoonucleótido no es T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*G*C*C*G*C*G (SEQ ID NO: 27). En una realización, el oligonucleótido CpG de clase P incluye al menos un dinucleótido CpG no metilado. En otra realización, el dominio de activación de TLR es TCG, TTCG, TTTCG, TYpR, TTYpR, TTTYpR, UCG, UUCG, UUUCG, TTT o TTTT. En otra realización, el dominio de activación de TLR está dentro de la región palindrómica 5'. En otra realización, el dominio de activación de TLR está inmediatamente 5' a la región palindrómica 5'.
En una realización, los oligonucleótidos CpG "clase P" de la divulgación tienen la siguiente secuencia de ácido nucleico: 5' TCGTCGACGATCGGCGGCG 3' (SEQ ID NO: 39).
En dichas secuencias, todos los enlaces pueden ser enlaces de fosforotioato. En otra realización, uno o más de los enlaces puede ser fosfodiéster, preferentemente entre la "C" y la "G" del motivo CpG haciendo un oligonucleótido CpG semiblando. En cualquiera de estas secuencias, una etil-uridina o un halógeno pueden sustituir a la 5' T; ejemplos de sustituciones halógenas incluyen, pero no se limitan a, sustituciones de bromo-uridina o yodo-uridina.
Un ejemplo no limitativo de oligonucleótidos de la Clase P incluye:
5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 40) donde * se refiere a un enlace fosforotioato y_ se refiere a un enlace fosfodiéster.
En una realización, el oligonucleótido incluye al menos un enlace fosforotioato. En otra realización, todos los enlaces internucleótidos del oligonucleótido son enlaces de fosforotioato. En otra realización, el oligonucleótido incluye al menos un enlace tipo fosfodiéster. En otra realización, el enlace fosfodiéster es un enlace fosfodiéster. En otra realización se conjuga un grupo lipofílico con el oligonucleótido. En una realización el grupo lipofílico es el colesterol.
En una realización, todos los enlaces internucleotídicos de los oligonucleótidos CpG aquí divulgados son enlaces fosfodiéster (oligonucleótidos "blandos", como se describe en la Solicitud PCT WO2007/026190). En otra realización, los oligonucleótidos CpG de la invención se hacen resistentes a la degradación (por ejemplo, se estabilizan). Un "oligonucleótido estabilizado" se refiere a un oligonucleótido que es relativamente resistente a la degradación in vivo (por ejemplo, a través de una exo o endo nucleasa). La estabilización del ácido nucleico puede lograrse mediante modificaciones de la columna vertebral. Los oligonucleótidos con enlaces de fosforotioato proporcionan una actividad máxima y protegen al oligonucleótido de la degradación por las exo- y endo-nucleasas intracelulares.
Los oligonucleótidos inmunoestimuladores pueden tener una columna vertebral quimérica, que tiene combinaciones de enlaces fosfodiéster y fosforotioato. Para los propósitos de la presente invención, una columna vertebral quimérica se refiere a una columna vertebral parcialmente estabilizada, en la que al menos un enlace internucleotídico es fosfodiéster o similar al fosfodiéster, y en la que al menos otro enlace internucleotídico es un enlace internucleotídico estabilizado, en el que el al menos un enlace fosfodiéster o similar al fosfodiéster y el al menos un enlace estabilizado son diferentes. Cuando el enlace fosfodiéster se localiza preferentemente dentro del motivo CpG, tales moléculas se denominan "semiblandas", como se describe en la Solicitud PCT WO2007/026190.
El tamaño del oligonucleótido CpG (es decir, el número de residuos de nucleótidos a lo largo del oligonucleótido) también puede contribuir a la actividad estimulante del oligonucleótido. Para facilitar la captación en las células, el oligonucleótido CpG de la invención tiene preferentemente una longitud mínima de 6 residuos de nucleótidos. Los oligonucleótidos de cualquier tamaño superior a 6 nucleótidos (incluso de muchas kb de longitud) son capaces de inducir una respuesta inmunitaria si hay suficientes motivos inmunoestimuladores, porque los oligonucleótidos más grandes se degradan dentro de las células. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos CpG tienen una longitud de 6 a 100 nucleótidos, preferentemente de 8 a 30 nucleótidos. En realizaciones importantes, los ácidos nucleicos y oligonucleótidos de la invención no son plásmidos o vectores de expresión.
En una realización, los oligonucleótidos CpG aquí divulgados comprenden sustituciones o modificaciones, como en las bases y/o los azúcares, tal como se describe en los párrafos 134 a 147 del documento WO2007/026190.
En una realización, el oligonucleótido CpG de la presente divulgación está modificado químicamente. Ejemplos de modificaciones químicas son conocidos por el experto y se describen, por ejemplo, en Uhlmann E. et al. (1990), Chem. Rev. 90:543, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke, S.T. et al. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:107-129y Hunziker J. etal., (1995), Mod. Sintetizador. Methods 7:331-417. Un oligonucleótido de acuerdo con la divulgación puede tener una o más modificaciones, en las que cada modificación se localiza en un puente internucleósido fosfodiéster particular y/o en una unidad de p-D-ribosa particular y/o en una posición de base nucleósida natural particular en comparación con un oligonucleótido de la misma secuencia que está compuesto de ADN o ARN natural.
En algunas realizaciones de la divulgación, los ácidos nucleicos que contienen CpG pueden mezclarse simplemente con portadores inmunogénicos de acuerdo con los procedimientos conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo WO03/024480).
En una realización particular de la presente divulgación, cualquiera de las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento comprende de 2|jg a 100mg de oligonucleótido CpG, preferentemente de 0,1mg a 50 mg de oligonucleótido CpG, preferentemente de 0,2 mg a 10 mg de oligonucleótido CpG, preferentemente de 0,3 mg a 5 mg de oligonucleótido CpG, incluso Preferentemente de 0,5 a 2 mg de oligonucleótido CpG, incluso Preferentemente de 0,75 a 1,5 mg de oligonucleótido CpG. En una realización preferida, la composición inmunogénica divulgada en el presente documento comprende aproximadamente 1mg de oligonucleótido CpG.
En una realización preferida, el adyuvante es un adyuvante a base de aluminio seleccionado del grupo que consiste en fosfato de aluminio, sulfato de aluminio e hidróxido de aluminio. En una realización, las composiciones inmunogénicas descritas aquí comprenden el adyuvante fosfato de aluminio.
En una realización preferida, las composiciones inmunogénicas de la divulgación comprenden además al menos uno de un tampón, un crioprotector, una sal, un catión divalente, un detergente no iónico, un inhibidor de la oxidación de radicales libres, un diluyente o un portador.
La composición inmunogénica puede comprender opcionalmente un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen portadores aprobados por una agencia reguladora de un gobierno federal, estatal u otra agencia reguladora, o listados en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, incluidos los humanos y los mamíferos no humanos. El término portador puede utilizarse para referirse a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra la composición farmacéutica. El agua, las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol pueden emplearse como soportes líquidos, especialmente para las soluciones inyectables. En "Remington's Pharmaceutical Sciences", de E. W. Martin, se describen ejemplos de soportes farmacéuticos adecuados. La formulación debe adaptarse al modo de administración.
La composición inmunogénica puede comprender opcionalmente uno o más tampones fisiológicamente aceptables seleccionados de, pero no limitados a, Tris (trimetamina), fosfato, acetato, borato, citrato, glicina, histidina y succinato. En ciertas realizaciones, la formulación está tamponada dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0, preferentemente de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5.
La composición inmunogénica puede comprender opcionalmente uno o más tensioactivos no iónicos, incluidos pero no limitados a los ésteres de ácidos grasos de sorbitán de polioxietileno, el polisorbato-80 (Tween 80), el polisorbato-60 (Tween 60), el polisorbato-40 (Tween 40) y el polisorbato-20 (Tween 20), los éteres alquílicos de polioxietileno, incluidos pero no limitados a Brij 58, Brij 35, así como otros como Triton X-100; Triton X - 114, NP40, Span 85 y la serie Pluronic de tensioactivos no iónicos (por ejemplo, Pluronic 121). p. ej., Pluronic 121), con componentes preferidos Polisorbato-80 en una concentración de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 2 % (siendo preferible hasta aproximadamente 0,25 %) o Polisorbato-40 en una concentración de aproximadamente 0,001 % a 1 % (siendo preferible hasta aproximadamente 0,5 %).
La divulgación se refiere además a vacunas que comprenden la composición inmunogénica de la divulgación.
Procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria y proteger contra la infección
La presente divulgación también incluye procedimientos de uso para las composiciones inmunogénicas aquí descritas. Por ejemplo, una realización de la divulgación proporciona un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra Streptococcus pneumoniae, que comprende la administración a un sujeto de una cantidad inmunogénica de cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento.
Una realización de la divulgación proporciona un procedimiento para proteger a un sujeto contra una infección por Streptococcus pneumoniae , o un procedimiento para prevenir la infección por Streptococcus pneumoniae, o un procedimiento para reducir la gravedad o retrasar la aparición de al menos un síntoma asociado con una infección causada por Streptococcus pneumoniae, los procedimientos comprenden administrar a un sujeto una cantidad inmunogénica de cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento.
Una realización de la divulgación proporciona un procedimiento para proteger a un sujeto contra una infección por Streptococcus pneumoniae del serotipo 10A , o un procedimiento para prevenir la infección por Streptococcus pneumoniae del serotipo 10A, o un procedimiento para reducir la gravedad o retrasar la aparición de al menos un síntoma asociado con una infección causada por Streptococcus pneumoniae del serotipo 10A , los procedimientos comprenden administrar a un sujeto una cantidad inmunogénica de cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento.
Una realización de la divulgación proporciona un procedimiento para tratar o prevenir una infección por Streptococcus pneumoniae , una enfermedad o una afección asociada al serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una composición inmunogénica descrita en el presente documento. Otra realización proporciona un procedimiento para tratar o prevenir una infección, enfermedad o afección por Streptococcus pneumoniae asociada a un Streptococcus pneumoniae del serotipo 10A en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la generación de una preparación de anticuerpos policlonales o monoclonales a partir de la composición inmunogénica descrita en el presente documento, y utilizando dicha preparación de anticuerpos para conferir inmunidad pasiva al sujeto.
En una realización, la divulgación se refiere al uso del conjugado inmunogénico o de la composición inmunogénica divulgados en el presente documento para la fabricación de un medicamento para proteger a un sujeto contra una infección por Streptococcus pneumoniae , y/o prevenir la infección por Streptococcus pneumoniae , y/o reducir la gravedad o retrasar la aparición de al menos un síntoma asociado a una infección causada por Streptococcus pneumoniae, y/o proteger aun sujeto contra una infección por Streptococcus pneumoniae del serotipo 10A y/o prevenir la infección por Streptococcus pneumoniae del serotipo 10A, y/o reducir la gravedad o retrasar la aparición de al menos un síntoma asociado a una infección causada por Streptococcus pneumoniaedel serotipo 10A.
Una realización de la divulgación proporciona un procedimiento para proteger a un sujeto contra una infección por Streptococcus pneumoniae del serotipo 22F , o un procedimiento para prevenir la infección por Streptococcus pneumoniae del serotipo 22F, o un procedimiento para reducir la gravedad o retrasar la aparición de al menos un síntoma asociado con una infección causada por Streptococcus pneumoniae del serotipo 22F , los procedimientos comprenden administrar a un sujeto una cantidad inmunogénica de cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento.
Una realización de la divulgación proporciona un procedimiento para tratar o prevenir una infección por Streptococcus pneumoniae , una enfermedad o una afección asociada al serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una composición inmunogénica descrita en el presente documento. Otra realización proporciona un procedimiento para tratar o prevenir una infección, enfermedad o afección por Streptococcus pne umoniae asociada a un Streptococcus pneumoniae del serotipo 22F en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la generación de una preparación de anticuerpos policlonales o monoclonales a partir de la composición inmunogénica descrita en el presente documento, y utilizando dicha preparación de anticuerpos para conferir inmunidad pasiva al sujeto.
En una realización, la divulgación se refiere al uso del conjugado inmunogénico o la composición inmunogénica divulgados en el presente documento para la fabricación de un medicamento para proteger a un sujeto contra una infección por Streptococcus pneumoniae , y/o prevenir la infección por Streptococcus pneumoniae , y/o reducir la gravedad o retrasar la aparición de al menos un síntoma asociado con una infección causada por Streptococcus pneumoniae, y/o proteger a un sujeto contra una infección por Streptococcus pneumoniae del serotipo 22F y/o prevenir la infección por Streptococcus pneumoniae del serotipo 22F, y/o reducir la gravedad o retrasar la aparición de al menos un síntoma asociado a una infección causada por Streptococcus pneumoniaedel serotipo 22F .
Una realización de la divulgación proporciona un procedimiento para proteger a un sujeto contra una infección por Streptococcus pne umoniae del serotipo 33F , o un procedimiento para prevenir la infección por Streptococcus pneumoniae del serotipo 33F, o un procedimiento para reducir la gravedad o retrasar la aparición de al menos un síntoma asociado con una infección causada por Streptococcus pneumoniae del serotipo 33F , comprendiendo los procedimientos la administración a un sujeto de una cantidad inmunogénica de cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento.
Una realización de la divulgación proporciona un procedimiento para tratar o prevenir una infección por Streptococcus pneumoniae , una enfermedad o una afección asociada al serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una composición inmunogénica descrita en el presente documento. Otra realización proporciona un procedimiento para tratar o prevenir una infección, enfermedad o afección por Streptococcus pne umoniae asociada a un Streptococcus pneumoniae del serotipo 33F en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la generación de una preparación de anticuerpos policlonales o monoclonales a partir de la composición inmunogénica descrita en el presente documento, y utilizando dicha preparación de anticuerpos para conferir inmunidad pasiva al sujeto.
En una realización, la divulgación se refiere al uso del conjugado inmunogénico o la composición inmunogénica divulgados en el presente documento para la fabricación de un medicamento para proteger a un sujeto contra una infección por Streptococcus pneumoniae , y/o prevenir la infección por Streptococcus pneumoniae , y/o reducir la gravedad o retrasar la aparición de al menos un síntoma asociado con una infección causada por Streptococcus pneumoniae, y/o proteger aun sujeto contra una infección por Streptococcus pneumoniae del serotipo 33F y/o prevenir la infección por Streptococcus pneumoniae del serotipo 33F, y/o reducir la gravedad o retrasar la aparición de al menos un síntoma asociado a una infección causada por Streptococcus pneumoniae del serotipo 33F .
Una "respuesta inmunitaria" a una composición inmunogénica es el desarrollo en un sujeto de una respuesta inmunitaria humoral y/o mediada por células a las moléculas presentes en la composición inmunogénica o la composición de vacuna de interés. A efectos de la presente divulgación, una "respuesta inmunitaria humoral" es una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos e implica la inducción y generación de anticuerpos que reconocen y se unen con cierta afinidad al antígeno de la composición inmunogénica o la vacuna de la divulgación, mientras que una "respuesta inmunitaria mediada por células" es la mediada por las células T y/o otros glóbulos blancos. La "respuesta inmunitaria mediada por células" es provocada por la presentación de epítopos antigénicos en asociación con moléculas de clase I o clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), CD1 u otras moléculas no clásicas similares al MHC. Esto activa las células T auxiliares CD4+ específicas del antígeno o las células de linfocitos T citotóxicos CD8+ ("CTL"). Los CTL tienen especificidad para los antígenos peptídicos que se presentan en asociación con las proteínas codificadas por los m Hc clásicos o no clásicos y que se expresan en la superficie de las células. Los CTL ayudan a inducir y promover la destrucción intracelular de los microbios intracelulares, o la lisis de las células infectadas con dichos microbios. Otro aspecto de la inmunidad celular implica una respuesta específica al antígeno por parte de las células T auxiliares. Las células T auxiliares actúan para ayudar a estimular la función y concentrar la actividad de las células efectoras no específicas contra las células que presentan péptidos u otros antígenos en asociación con moléculas MHC clásicas o no clásicas en su superficie. Una "respuesta inmunitaria mediada por células" también se refiere a la producción de citoqunas, quimioquinas y otras moléculas de este tipo producidas por las células T activadas y/u otros glóbulos blancos, incluidos los derivados de las células T CD4+ y CD8+. La capacidad de un antígeno o composición particular para estimular una respuesta inmunológica mediada por células puede determinarse mediante una serie de ensayos, como por ejemplo, ensayos de linfoproliferación (activación de linfocitos), ensayos de células citotóxicas CTL, mediante ensayos de linfocitos T específicos para el antígeno en un sujeto sensibilizado, o mediante la medición de la producción de citoquinas por las células T en respuesta a la reestimulación con el antígeno. Estos ensayos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo Erickson et al. (1993) J. Immunol. 151:4189-4199y Doe et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:2369-2376.
Tal y como se utiliza en el presente documento, "tratamiento" (incluyendo sus variaciones, por ejemplo, "tratar" o "tratado") significa uno o más de los siguientes: (i) la prevención de la infección o la reinfección, como en una vacuna tradicional, (ii) la reducción de la gravedad o la eliminación de los síntomas, y (iii) la eliminación sustancial o completa del patógeno o del trastorno en cuestión. Por lo tanto, el tratamiento puede ser efectuado de manera profiláctica (antes de la infección) o de manera terapéutica (después de la infección). En la presente divulgación, el tratamiento profiláctico es el modo preferido. De acuerdo con una realización particular de la presente divulgación, se proporcionan composiciones y procedimientos que tratan, incluyendo la inmunización profiláctica y/o terapéutica, a un animal huésped contra una infección por Streptococcus pneumoniae del serotipo 10A. De acuerdo con una realización particular de la presente divulgación, se proporcionan composiciones y procedimientos que tratan, incluyendo la inmunización profiláctica y/o terapéutica, a un animal huésped contra una infección por Streptococcus pneumoniae del serotipo 22F. De acuerdo con una realización particular de la presente divulgación, se proporcionan composiciones y procedimientos que tratan, incluyendo la inmunización profiláctica y/o terapéutica, a un animal huésped contra una infección por Streptococcus pneumoniae del serotipo 33F. Los procedimientos de la presente divulgación son útiles para conferir inmunidad profiláctica y/o terapéutica a un sujeto. Los procedimientos de la presente divulgación también pueden practicarse en sujetos para aplicaciones de investigación biomédica.
Una "cantidad inmunogénica" y una "cantidad inmunológicamente eficaz", ambas utilizadas indistintamente en el presente documento, se refieren a la cantidad de antígeno o composición inmunogénica suficiente para provocar una respuesta inmunitaria, ya sea una respuesta celular (células T) o humoral (células B o anticuerpos), o ambas, según las mediciones realizadas mediante ensayos estándar conocidos por un experto en la técnica.
En una realización preferida, dicho sujeto es un humano. En una realización más preferida, dicho sujeto es un recién nacido (es decir, menos de tres meses de edad), un bebé (de 3 meses a un año de edad) o un niño pequeño (es decir, de un año a cuatro años de edad).
En una realización, las composiciones inmunogénicas divulgada en el presente documentos son para su uso como vacuna.
En tal realización, el sujeto que va a ser vacunado puede ser menor de 1 año de edad. Por ejemplo, el sujeto que va a ser vacunado puede tener aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses de edad. En una realización, el sujeto que va a ser vacunado tiene aproximadamente 2, 4 o 6 meses de edad. En otra realización, el sujeto que va a ser vacunado es menor de 2 años de edad. Por ejemplo, el sujeto que va a ser vacunado puede tener aproximadamente 12-15 meses de edad. En algunos casos, sólo se necesita una dosis de la composición inmunogénica de acuerdo con la invención, pero en algunas circunstancias, se puede administrar una segunda, tercera o cuarta dosis (véase la sección de régimen).
En una realización de la presente divulgación, el sujeto que va a ser vacunado es un adulto humano de 50 años o más, más Preferentemente un adulto humano de 55 años o más. En una realización, el sujeto que va a ser vacunado es un adulto humano de 65 años o más, de 70 años o más, de 75 años o más o de 80 años o más.
En una realización el sujeto que va a ser vacunado es un individuo inmunocomprometido, en particular un humano. Un individuo inmunocomprometido se define generalmente como una persona que muestra una capacidad atenuada o reducida para montar una defensa humoral o celular normal ante el desafío de agentes infecciosos.
En una realización de la presente divulgación, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado sufre de una enfermedad o afección que deteriora el sistema inmunológico y resulta en una respuesta de anticuerpos que es insuficiente para proteger contra o tratar la enfermedad neumocócica.
En una realización, dicha enfermedad es un trastorno de inmunodeficiencia primaria. Preferentemente, dicho trastorno de inmunodeficiencia primaria se selecciona del grupo que consiste en: inmunodeficiencias combinadas de células T y B, deficiencias de anticuerpos, síndromes bien definidos, enfermedades de desregulación inmunitaria, trastornos de fagocitos, deficiencias de inmunidad innata, trastornos autoinflamatorios y deficiencias del complemento. En una realización, dicho trastorno de inmunodeficiencia primaria se selecciona de lo divulgado en la página 24 línea 11 a la página 25 línea 19 de la Solicitud PCT WO2010/125480.
En una realización particular de la presente divulgación, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado padece una enfermedad seleccionada entre los grupos que consisten en: Infección por VIH, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), cáncer, trastornos cardíacos o pulmonares crónicos, insuficiencia cardíaca congestiva, diabetes mellitus, enfermedad hepática crónica, alcoholismo, cirrosis, fugas de líquido cefalorraquídeo, cardiomiopatía, bronquitis crónica, enfisema, Enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), disfunción del bazo (tal como la enfermedad de células falciformes), falta de función del bazo (asplenia), neoplasia sanguínea, leucemia, mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin, linfoma, insuficiencia renal, síndrome nefrótico y asma.
En una realización de la presente divulgación, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado sufre de desnutrición.
En una realización particular de la presente divulgación, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado está tomando un fármaco o tratamiento que disminuye la resistencia del cuerpo a la infección. En una realización, dicho fármaco se selecciona entre el divulgado en la página 26 línea 33 a la página 26 línea 40 de la Solicitud PCT WO2010/125480.
En una realización particular de la presente divulgación, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado es un fumador.
En una realización particular de la presente divulgación, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado tiene un recuento de glóbulos blancos (recuento de leucocitos) inferior a 5 x109 células por litro, o inferior a 4 x109 células por litro, o inferior a 3 x109 células por litro, o inferior a 2 x109 células por litro, o inferior a 1 x109 células por litro, o inferior a 0,5 x109 células por litro, o inferior a 0,3 x109 células por litro, o inferior a 0,1 x109 células por litro.
Recuento de glóbulos blancos (recuento de leucocitos): El número de glóbulos blancos (WBC) en la sangre. Los glóbulos blancos usualmente se miden como parte del CBC (recuento sanguíneo completo). Los glóbulos blancos son las células de la sangre que luchan contra las infecciones y se diferencian de los glóbulos rojos (que transportan oxígeno) conocidos como eritrocitos. Existen diferentes tipos de glóbulos blancos, incluidos los neutrófilos (leucocitos polimorfonucleares; PMN), las células en banda (neutrófilos ligeramente inmaduros), los linfocitos de tipo T (células T), los linfocitos de tipo B (células B), los monocitos, los eosinófilos y los basófilos. Todos los tipos de glóbulos blancos se reflejan en el recuento de glóbulos blancos. El intervalo normal del recuento de glóbulos blancos usualmente está entre 4.300 y 10.800 células por milímetro cúbico de sangre. También puede denominarse recuento de leucocitos y puede expresarse en unidades internacionales como 4,3 -10,8 x109 células por litro.
En una realización particular de la presente divulgación, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado sufre de neutropenia. En una realización particular de la presente divulgación, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado tiene un recuento de neutrófilos inferior a 2 x109 células por litro, o inferior a 1 x109 células por litro, o inferior a 0,5 x109 células por litro, o inferior a 0,1 x109 células por litro, o inferior a 0,05 x109 células por litro.
Un recuento bajo de glóbulos blancos o "neutropenia" es una condición caracterizada por niveles anormalmente bajos de neutrófilos en la sangre circulante. Los neutrófilos son un tipo específico de glóbulos blancos que ayudan a prevenir y combatir las infecciones. La razón más común por la que los pacientes con cáncer experimentan neutropenia es como efecto secundario de la quimioterapia. La neutropenia inducida por la quimioterapia aumenta el riesgo de infección del paciente e interrumpe el tratamiento del cáncer.
En una realización particular de la presente divulgación, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado tiene un recuento de células CD4+ inferior a 500/mm3, o un recuento de células CD4+ inferior a 300/mm3, o un recuento de células CD4+ inferior a 200/mm3, un recuento de células CD4+ inferior a 100/mm3, un recuento de células CD4+ inferior a 75/mm3, o un recuento de células CD4+ inferior a 50/mm3.
Las pruebas de células CD4 se informan normalmente como el número de células en mm3. Los recuentos normales de CD4 están entre 500 y 1600, y los recuentos de CD8 están entre 375 y 1100. Los recuentos de CD4 disminuyen drásticamente en las personas con VIH.
En una realización de la divulgación, cualquiera de los sujetos inmunocomprometidos divulgados en el presente documento es un macho humano o una hembra humana.
La cantidad de un conjugado en una composición se calcula generalmente en base al total de polisacáridos, conjugados y no conjugados para ese conjugado. Por ejemplo, un conjugado con un 20 % de polisacárido libre tendrá aproximadamente 80 mcg de polisacárido conjugado y aproximadamente 20 mcg de polisacárido no conjugado en una dosis de 100 mcg de polisacárido. La contribución de las proteínas al conjugado no suele tenerse en cuenta a la hora de calcular la dosis de un conjugado. Generalmente, cada dosis comprenderá de 0,1 a 100 mcg de polisacárido, particularmente de 0,1 a 10 mcg, y más particularmente de 1 a 10 mcg y más particularmente de 1 a 5 |jg. Preferentemente, cada dosis comprenderá aproximadamente 1,1, 2, 2,2, 3, 3,3, 4, 4,4 jg de polisacárido.
Las cantidades óptimas de componentes para una composición o vacuna inmunogénica particular pueden determinarse mediante estudios estándar que involucren la observación de las respuestas inmunitarias adecuadas en los sujetos. Tras la vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias vacunas de refuerzo adecuadamente espaciadas.
La efectividad de un antígeno como inmunógeno puede medirse mediante ensayos de proliferación, mediante ensayos citolíticos, tales como los ensayos de liberación de cromo para medir la capacidad de una célula T de lisar su célula diana específica, o midiendo los niveles de actividad de las células B mediante la medición de los niveles de anticuerpos circulantes específicos para el antígeno en el suero. También puede detectarse una respuesta inmunitaria midiendo los niveles séricos de anticuerpos específicos contra el antígeno inducidos tras la administración del mismo y, más concretamente, midiendo la capacidad de los anticuerpos así inducidos para aumentar la capacidad opsonofagocítica de determinados glóbulos blancos, como se describe en el presente documento. El nivel de protección de la respuesta inmunitaria puede medirse desafiando al huésped inmunizado con el antígeno que se le ha administrado. Por ejemplo, si el antígeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria es una bacteria, el nivel de protección inducido por la cantidad inmunogénica del antígeno se mide detectando el porcentaje de supervivencia o el porcentaje de mortalidad después de la provocación de los animales con las células bacterianas. En una realización, la cantidad de protección puede medirse midiendo al menos un síntoma asociado a la infección bacteriana, por ejemplo, una fiebre asociada a la infección. La cantidad de cada uno de los antígenos en las vacunas o composiciones inmunogénicas multiantígeno o multicomponente variará con respecto a cada uno de los otros componentes y puede determinarse por procedimientos conocidos por el artesano experto. Estos procedimientos incluirían procedimientos para medir la inmunogenicidad y/o la eficacia in vivo .
La divulgación proporciona además anticuerpos y composiciones de anticuerpos que se unen específica y selectivamente a los polisacáridos capsulares o glicoconjugados de la presente divulgación. En algunas realizaciones, se generan anticuerpos al administrar a un sujeto los polisacáridos capsulares o los glicoconjugados de la presente divulgación. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona anticuerpos purificados o aislados dirigidos contra uno o más de los polisacáridos capsulares o glicoconjugados de la presente divulgación. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente divulgación son funcionales según la medición de la eliminación de bacterias en un modelo de eficacia animal o mediante un ensayo de eliminación opsonofagocítica. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la divulgación confieren inmunidad pasiva a un sujeto. La presente divulgación proporciona además moléculas de polinucleótidos que codifican un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de la divulgación, y una célula, línea celular (tal como células de hibridoma u otras líneas celulares de ingeniería para la producción recombinante de anticuerpos) o un animal transgénico que produce un anticuerpo o una composición de anticuerpos de la divulgación, utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica.
Ejemplos
Ejemplo 1: preparación del conjugado polisacárido del serotipo 22F - CRM197
1.1. Preparación del polisacárido aislado de Streptococcus pneumoniae del serotipo 22F
Los polisacáridos capsulares del serotipo 22F pueden obtenerse directamente de las bacterias utilizando procedimientos de aislamiento conocidos por un experto en la técnica. (véase, por ejemplo, los procedimientos divulgados en las publicaciones de solicitudes de Patente U.S. Pub. Nos. 20060228380, 20060228381,20070184071, 20070184072, 20070231340 y 20080102498 o WO2008118752). Los Streptococcus pneumonia del serotipo 22F se cultivaron en un frasco de semillas y luego se transfirieron a un fermentador de semillas. Una vez alcanzada la densidad óptica deseada, las células se transfirieron a un fermentador de producción. El caldo de fermentación se inactivó mediante la adición de N-lauroil sarcosina y se purificó por ultrafiltración y diafiltración.
El polisacárido purificado de Streptococcus pneumoniae del serotipo 22F fue clasificado por homogeneización a alta presión utilizando un homogeneizador PANDA 2K ® (GEA Niro Soavi) para producir el polisacárido aislado de Streptococcus pneumoniae del serotipo 22F.
1.2. Oxidación del polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae del serotipo 22F aislado
La oxidación del polisacárido se llevó a cabo en un tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 5,8 ± 0,2) obtenido mediante la adición secuencial de una cantidad calculada de tampón de fosfato de potasio 500 mM (pH 5,8) y WFI para dar una concentración final de polisacárido de 2,0 g/l. En caso necesario, el pH de la reacción se ajustó a 5,8, aproximadamente. Después del ajuste del pH, la temperatura de reacción se redujo a 5 ± 3 °C. La oxidación se inició con la adición de 0,10 ± 0,02 equivalentes molares (MEq) de peryodato de sodio. El tiempo de reacción de oxidación objetivo es de 16 ± 1 horas a 5 ± 3 °C.
La reacción de oxidación se ianctivó con 2 MEq de 2,3-butanediol bajo agitación continua a 5 ± 3 °C durante 1-2 horas.
La concentración y la diafiltración del polisacárido activado se llevaron a cabo utilizando casetes de ultrafiltración de 100K MWCO. La diafiltración se realizó con un volumen de 35 veces el WFI. El polisacárido activado purificado se almacenó a 5 ± 3 °C. El sacárido activado purificado se caracteriza, entre otras cosas, por (i) el peso molecular por SEC-MALLS (ii) la presencia de O-acetilo y (iii) el grado de oxidación.
El SEC-MALLS se utiliza para la determinación del peso molecular de los polisacáridos y de los conjugados polisacárido-proteína. La SEC se utiliza para separar los polisacáridos por volumen hidrodinámico. Para la determinación del peso molecular se utilizan detectores de índice de refracción (RI) y de dispersión de luz láser multiángulo (MALLS). Cuando la luz interactúa con la materia, se dispersa y la cantidad de luz dispersada está relacionada con la concentración, el cuadrado del dn/dc (los incrementos del índice de refracción específico) y la masa molar de la materia. La medición del peso molecular se calcula a partir de las lecturas de la señal de luz dispersa del detector MALLS y de la señal de concentración del detector RI.
El grado de oxidación (DO = moles de unidad de repetición de azúcar / moles de aldehído) del polisacárido activado se determinó como sigue:
Los moles de la unidad de repetición de azúcar se determinan por diversos procedimientos colorimétricos, tales como por ejemplo utilizando el procedimiento de Anthrone. El polisacárido se descompone primero en monosacáridos por la acción del ácido sulfúrico y el calor. El reactivo de Antrona reacciona con las hexosas para formar un complejo de color amarillo-verde cuya absorbancia se lee espectrofotométricamente a 625 nm. Dentro del intervalo del ensayo, la absorbancia es directamente proporcional a la cantidad de hexosa presente.
Los moles de aldehído también se determinan simultáneamente, utilizando el procedimiento colorimétrico MBTH. El ensayo MBTH implica la formación de un compuesto de azina mediante la reacción de grupos aldehídos (de una muestra determinada) con una hidrazona de 3-metil-2-benzotiazolona (reactivo del ensayo MBTH). El exceso de 3-metil-2-benzotiazolona hidrazona se oxida para formar un catión reactivo. El catión reactivo y la azina reaccionan para formar un cromóforo azul. El cromóforo formado se lee entonces espectroscópicamente a 650 nm.
1.3. Conjugación de un polisacárido activado de Streptococcus pneumoniae del serotipo 22F con CRM197
El procedimiento de conjugación consiste en las siguientes etapas:
a. Compuesto con excipiente de sacarosa, y liofilización.
b. Reconstitución del polisacárido liofilizado y del CRM197.
c. Conjugación del polisacárido activado con el CRM197 y el cubrimiento
d. Purificación del conjugado
a. Composición con sacarosa y liofilización
El polisacárido activado fue compuesto con sacarosa (50 % p/v en WFI) en una relación de 25 gramos de sacarosa por gramo de polisacárido activado. El frasco de la mezcla compuesta se liofilizó a continuación. Tras la liofilización, los frascos que contenían el polisacárido activado liofilizado se almacenaron a -20 ± 5 °C. La cantidad calculada de proteína CRM197 (relación de S objetivo /P entrada = 1) se congeló externamente y se liofilizó por separado. El CRM197 liofilizado se almacenó a -20 ± 5 °C.
b. Reconstitución del polisacárido activado liofilizado y de la proteína CRM197
El polisacárido activado liofilizado se reconstituyó en dimetilsulfóxido (DMSO) anhidro. Tras la disolución completa del polisacárido, se añadió una cantidad igual de DMSO anhidro al CRM197 liofilizado para su reconstitución.
c. Conjugación del polisacárido activado con el CRM197 y el cubrimiento
El CRM 197 reconstituido (en DMSO) se combinó en el recipiente de reacción de conjugación con el polisacárido activado reconstituido. La concentración final de polisacáridos en la solución de reacción es de 1 g/l. La conjugación se inició añadiendo 1,5 ± 0,1 MEq de cianoborohidruro de sodio a la mezcla de reacción y la reacción se incubó a 23 ± 2 °C durante 20 ± 2 horas. La terminación de la reacción de conjugación se realiza añadiendo 2 MEq de borohidruro de sodio. La reacción de cubrimiento se incubó a 23 ± 2 °C durante 3 ± 1 horas.
d. Purificación del conjugado
La solución de conjugado se diluyó 1:5 con succinato 5 mM-0,9 % salino (pH 6,0) refrigerado en preparación para la purificación por filtración de flujo tangencial utilizando membranas de 100K MWCO y se realizó una diafiltración 20X utilizando succinato 5 mM-0,9 % de solución salina (pH6,0) como medio. Una vez completada la diafiltración, el retentado del conjugado se diluyó de nuevo, se filtró a través de un filtro de 0,22pm y se almacenó a 2-8 °C.
La Tabla 1 comprende los datos de caracterización de los conjugados de polisacáridos del serotipo 2 2 F-CRM197 obtenidos por el procedimiento de la invención. En particular, los conjugados 5 y 6 de la tabla se obtuvieron como se divulga en el ejemplo 1.
Los conjugados de polisacárido del serotipo 22F -CRM197 generados por el procedimiento RAC-DMSO proporcionaron mejores rendimientos y mostraron una mejor consistencia de lote a lote en el MW, junto con niveles de % de sacáridos libres significativamente menores y una mayor modificación de la proteína portadora (lisina) en comparación con los conjugados generados por el procedimiento RAC-acuoso, como se muestra en la Tabla 1.
Figure imgf000028_0001
El % de rendimiento del conjugado se calcula de la siguiente manera: (cantidad de polisacárido en el conjugado x100) / cantidad de polisacárido activado.
Ejemplo 2: preparación del conjugado polisacárido del serotipo 10A - CRM197
2.1. Preparación del polisacárido aislado de Streptococcus pneumoniae del serotipo 10A
Los polisacáridos aislados del serotipo 10A se obtuvieron como se divulga en el ejemplo 1.1, excepto que el polisacárido purificado no se dimensionó.
2.2. Oxidación del polisacárido capsular del serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae aislado
Se añadió un volumen calculado de tampón de fosfato de potasio 0,1M (pH 6,0) y agua para inyección (WFI) a la solución de polisacáridos para lograr una concentración final de polisacáridos de 2,5g/l y una concentración final de tampón de fosfato de potasio 25 mM, Si se requiere el pH se ajustó a 6,0, aproximadamente. A continuación, el polisacárido diluido se enfrió hastga 5 ± 3 °C. La oxidación se inició mediante la adición de 0,25± 0,02 equivalentes molares (MEq) de solución de peryodato de sodio. El tiempo de reacción de oxidación fue de aproximadamente 4 horas a 5 ± 3 °C. La reacción de oxidación se ianctivó con 1 MEq de 2,3-butanediol bajo agitación continua a 5 ± 3 °C durante 1-2 horas.
Después de alcanzar el tiempo de reacción objetivo, el polisacárido activado se concentró utilizando casetes de ultrafiltración Millipore de 30K MWCO. A continuación, se realizó la diafiltración frente a un diavolumen de 20 veces WFI. El polisacárido activado purificado se almacenó a 5 ± 3 °C. El sacárido activado purificado se caracteriza, entre otras cosas, por (i) el peso molecular por SEC-MALLS y (ii) el grado de oxidación.
2.3 Conjugación de un polisacárido activado de Streptococcus pneumoniae del serotipo 10A con CRM197
El procedimiento de conjugación consiste en las siguientes etapas:
a. Compuesto con excipiente de sacarosa, y liofilización.
b. Reconstitución del polisacárido liofilizado y del CRM197.
c. Conjugación del polisacárido activado con el CRM197 y el recubrimiento
d. Purificación del conjugado
a. Compuesto con sacarosa
El polisacárido activado se mezcla con sacarosa en una relación de 25 ± 2,5 gramos de sacarosa por gramo de polisacárido activado. El frasco de la mezcla compuesta se liofilizó a continuación. Después de la liofilización, los frascos que contenían el polisacárido activado liofilizado se almacenaron a -20 ± 5 °C.
b. Reconstitución del polisacárido activado liofilizado y de la proteína CRM197
El polisacárido activado liofilizado se reconstituyó en dimetilsulfóxido (DMSO) anhidro. Tras la disolución completa del polisacárido, se añadió la misma cantidad de DMSO anhidro al CRM197 calculado para su reconstitución.
El CRM 197 reconstituido (en DMSO) se añadió al polisacárido activado reconstituido en el reactor de conjugación. La concentración final de polisacáridos es de 1 g/l. La conjugación se realizó añadiendo 1,2 ± 0,1 MEq de cianoborohidruro de sodio a la mezcla de reacción. La reacción se incubó a 23 ± 2 °C durante 24 ± 2 horas. La terminación de la reacción de conjugación se realiza añadiendo 2 MEq de borohidruro de sodio. La reacción de cubrimiento se incubó a 23 ± 2 °C durante 3 ± 1 horas.
La terminación de la reacción de conjugación se realiza añadiendo 2 MEq de borohidruro de sodio. Esta reacción de cubrimiento se llevó a cabo durante 3 ± 1 horas a 23 ± 2 °C.
d. Purificación del conjugado
La solución de conjugado se diluyó entonces en 5x (en volumen) succinato 5 mM enfriado -solución salina al 0,9 % (pH 6,0) y se realizó una diafiltración 20X utilizando succinato 5 mM enfriado -solución salina al 0,9 % (pH6,0). Una vez completada la diafiltración inicial, el retentado del conjugado se transfirió a través de un filtro de 0,22 pm. El conjugado se diluyó adicionalmente con succinato 5 mM / solución salina al 0,9 % (pH 6), y después de la etapa final de filtración de 0,22pm se almacenó a 2-8 °C.
La tabla 2 comprende los datos de caracterización de los conjugados de polisacáridos del serotipo 10 A-CRM197 obtenidos por el procedimiento de la invención. En particular, los conjugados 4 a 6 de la tabla 2 se obtuvieron como se divulga en el ejemplo 2.
Los conjugados de polisacárido del serotipo 10A -CRM197 generados por el procedimiento RAC-DMSO proporcionaron mejores rendimientos y exihibieron una mejor consistencia de lote a lote en el MW, junto con niveles % de sacáridos libres significativamente menores y una mayor modificación de la proteína portadora (lisina) en comparación con los conjugados generados por el procedimiento RAC-acuoso, como se muestra en la Tabla 2.
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Ejemplo 3: preparación del conjugado de polisacárido del serotipo 33F - CRM197
3.1. Preparación del polisacárido aislado de Streptococcus pneumoniae del serotipo 33F
El polisacárido aislado del serotipo 33F se obtuvo como se divulga en el ejemplo 1.1.
3.2. Oxidación del polisacárido capsular del serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae aislado
Se añadió un volumen calculado de tampón de fosfato de sodio 0,1M (pH 6,0) y agua para inyección (WFI) a la solución de polisacáridos para lograr una concentración final de polisacáridos de 2g/l. Si es necesario, el pH se ajustó a 6,0, aproximadamente. A continuación, el polisacárido diluido se enfrió a 5 ± 3 °C. La oxidación se inició mediante la adición de 0,1 equivalente molar (MEq) de solución de peryodato de sodio. El tiempo de reacción de oxidación fue de aproximadamente 20 horas a 5 ± 3 °C. La reacción de oxidación se inactivó con 1 MEq de 2,3-butanediol bajo agitación continua a 5 ± 3 °C durante aproximadamente 1 hora. Tras alcanzar el tiempo de reacción deseado, el polisacárido activado se concentró utilizando casetes de ultrafiltración Millipore de 100K MWCO. La diafiltración se realizó entonces con un volumen de 40 veces de WFI. El polisacárido activado purificado se almacenó a 5 ± 3 °C. El sacárido activado purificado se caracteriza, entre otras cosas, por (i) el peso molecular por SEC-MALLS y (ii) el grado de oxidación.
3.3 Conjugación de un polisacárido activado de Streptococcus pneumoniae del serotipo 33F con CRM197
El conjugado polisacárido del serotipo 33F -CRM197 se obtuvo mediante un procedimiento similar al del ejemplo 1.3, utilizando el polisacárido 33F activado obtenido en el ejemplo 3.2.
c. Conjugación del polisacárido activado con el CRM197 y el cubrimiento
Los conjugados de polisacárido del serotipo 33F -CRM197 generados por el procedimiento RAC-DMSO proporcionaron mejores rendimientos y mostraron una mejor consistencia de lote a lote en términos de preservación de los niveles de O-acetilo, junto con niveles de % de sacáridos libres más bajos y una mayor modificación de la proteína portadora (lisina) en comparación con los conjugados generados por el procedimiento RAC-acuoso, como se muestra en la Tabla 3.
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Ejemplo 4: efecto de la inactivación en el peso molecular de los polisacáridos activados de los serotipos 22F y 33F
La activación de los polisacáridos 22F y 33F se llevó a cabo a 4 °C o a 22 °C. Ambas temperaturas dieron valores de DO similares. Sin embargo, debido al hecho de que la temperatura elevada dio lugar a una descomposición más rápida del polisacárido activado, disminuyendo así el MW del poli activado (como se muestra al comparar, por ejemplo, la figura 4 (22 °C) y la figura 5 (4 °C)), se prefirió generalmente 4 °C para la reacción de activación. Además, los datos de activación mostraron que la inactivación del NalO4 sin reaccionar después de la oxidación es una etapa esencial para la activación, especialmente para la activación utilizando una mayor cantidad de NalO4. El gráfico mostrado en la Figura 6 indica que el MW del polisacárido 33F activado es relativamente estable cuando se utilizan concentraciones crecientes de peryodato para la activación (con inactivación), mientras que dicho MW es muy variable cuando no se utiliza ningún etapa de inactivación. En condiciones específicas establecidas para obtener un grado de oxidación determinado, el peso molecular del polisacárido activado es menos variable cuando se utiliza la etapa de inactivación. La adición de un reactivo de inactivación después de la oxidación ayuda a mantener la integridad estructural del polisacárido activado hasta la finalización de la purificación, por ejemplo, por ultrafiltración y diafiltración.
Ejemplo 5: Ensayo de actividad opsonofagocítica (OPA)
La inmunogenicidad de los conjugados obtenidos por los procedimientos divulgados en el presente documento puede evaluarse utilizando el ensayo opsonofagocítico (OPA) descrito a continuación.
Grupos de treinta ratones Swiss Webster hembra de 6-7 semanas de edad fueron inmunizados con 0,001 pg, 0,01 pg o 0,1 pg de conjugados de prueba por vía subcutánea en la semana 0. Los ratones fueron reforzados con la misma dosis de conjugado en la semana 3 y luego sangraron en la semana 4. Se realizaron OPAs específicos del serotipo en muestras de suero de la semana 4.
Se utilizan ensayos validados de actividad opsonofagocítica (OPA) para medir anticuerpos funcionales en sueros murinos específicos para S. pneumonía serotipo 10A, 22F o 33F. El suero de la prueba se prepara en reacciones de ensayo que miden la capacidad de la inmunoglobulina específica del polisacárido capsular para opsonizar las bacterias, desencadenar la deposición del complemento, facilitando así la fagocitosis y la eliminación de las bacterias por los fagocitos. El título OPA se define como la dilución recíproca que da como resultado una reducción del 50 % del recuento bacteriano con respecto a los pocillos de control sin suero de prueba. El título de OPA se interpola a partir de las dos diluciones que abarcan este límite de muerte del 50 %.
Los procedimientos de OPA se basaron en los procedimientos descritos en Hu et al., Clin Diagn Lab Immunol 2005;12(febrero (2)):287-95 con las siguientes modificaciones. El suero de prueba se diluyó en serie 2,5 veces y se añadió a las placas de ensayo de microtitulación. Se añadieron cepas bacterianas vivas de los serotipos 10A, 22f y 33F a los pocillos y se agitaron las placas a 25 °C (serotipo 22F) o a 37 °C (serotipos 10Ay 33F) durante 30 minutos. Se añadieron a los pocillos células HL-60 diferenciadas (fagocitos) y suero de conejo bebé (de 3 a 4 semanas de edad, Pel-Freez®, 12,5 % de concentración final), y las placas se agitaron a 37 °C durante 45 minutos (serotipo 22F y 33F) o 60 minutos (serotipo 10A). Para terminar la reacción, se añadieron 80 pl de NaCl al 0,9 % a todos los pocillos, se

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para la preparación de un conjugado inmunogénico que comprende el polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteína portadora, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
a) componer un polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F con una proteína portadora, en el que dicho polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33F se obtiene mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
i) hacer reaccionar un polisacárido capsular aislado de los serotipos 10A, 22F o 33F con peryodato; y ii) inactivar la reacción de oxidación mediante la adición de butano-2,3-diol, lo que da como resultado un polisacárido activado de Streptococcus pneumoniae de los serotipos 10A, 22F o 33F;
y,
b) hacer reaccionar el polisacárido del serotipo 10A, 22F o 33F compuesto y activado y la proteína portadora con un agente reductor para formar un conjugado de polisacárido del serotipo 10a , 22F o 33F: proteína portadora.
2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la temperatura de la reacción en las etapas (i) y (ii) se mantiene entre 2 y 8 °C.
3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dicho polisacárido del serotipo 10A activado se obtiene mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
i) hacer reaccionar un polisacárido aislado del serotipo 10A con peryodato equivalente a 0,2 a 0,3 molares a una temperatura entre 2 y 8 °C; y
(ii) inactivar la reacción de oxidación mediante la adición de 0,5 a 2 equivalentes molares de butano-2,3-diol a una temperatura entre 2 y 8 °C, lo que da como resultado un polisacárido del serotipo 10A activado.
4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polisacárido del serotipo 22F activado se obtiene mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
i) hacer reaccionar un polisacárido aislado del serotipo 22F con peryodato equivalente a 0,05 a 0,2 molares a una temperatura entre 2 y 8 °C; y
(ii) inactivar la reacción de oxidación mediante la adición de 2 a 3, preferentemente 2, equivalentes molares de butano-2,3-diol a una temperatura entre 2 y 8 °C, lo que da como resultado un polisacárido del serotipo 22F activado.
5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polisacárido del serotipo 33F activado se obtiene mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
i) hacer reaccionar un polisacárido aislado del serotipo 33F con peryodato equivalente a 0,05 a 0,2 molares a una temperatura entre 2 y 8 °C; y
(ii) inactivar la reacción de oxidación mediante la adición de un equivalente molar de 0,5 a 1,5 de butano-2,3-diol a una temperatura entre 2 y 8 °C, lo que da como resultado un polisacárido del serotipo 33F activado.
6. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo dicho procedimiento además la etapa de:
(c) cubrir los aldehídos que no hayan reaccionado en el conjugado de polisacárido:del serotipo 10A, 22F o 33F: proteína portadora .
7. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las etapas (a) y (b) se llevan a cabo en DMSO o en una solución acuosa.
8. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la concentración de polisacárido activado en la etapa (b) está entre 0,1 y 10 mg/ml, 0,5 y 5 mg/ml, o 0,5 y 2 mg/ml.
9. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la relación inicial de polisacárido activado del serotipo 10A, 22F o 33f con respecto a la proteína portadora está entre 5:1 y 0,1:1, 2:1 y 0,1:1, 2:1 y 1:1, 1,5:1 y 1:1, 0,1:1 y 1:1, 0,3:1 y 1:1, o 0,6:1 y 1,2:1.
10. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que, en la etapa (b), el polisacárido activado se hace reaccionar con entre 0,5 y 2,5 equivalentes molares de cianoborohidruro de sodio.
11. Un procedimiento de acuerdo con unacualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que comprende además una etapa de purificación del conjugado polisacárido:proteína portadora.
12. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en el que la proteína portadora es CRM197.
13. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho procedimiento comprende además la etapa de formular el conjugado en una vacuna multivalente.
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