JP7216137B2 - 肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖体およびそれらのコンジュゲート - Google Patents

Description

本発明は、単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体およびそれらを調製するためのプロセスに関する。本発明はまた、担体タンパク質に共有結合的に連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体を含む免疫原性コンジュゲート、それらを調製するためのプロセス、ならびにそれらを含む免疫原性組成物およびワクチンにも関する。

肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、グラム陽性のランセット型球菌であり、これらは、通常対をなして（双球菌として）存在するが、また、短鎖としてまたは単一細胞としても存在する。肺炎連鎖球菌は、血液寒天プレート上で容易に増殖し、ギラギラ光るコロニーをなし、嫌気性に増殖させない限りアルファ溶血性を示し、嫌気性に増殖させるとベータ溶血性を示す。ほとんどの肺炎球菌血清型の細胞は、それぞれの細胞を囲む、多糖体の被覆である莢膜を有する。この莢膜が、ヒトにおける病原性の決定因子であり、これは、莢膜が、抗体の細菌細胞への結合を阻止することによって、貪食作用を妨げるからである。現時点では、同定された肺炎球菌莢膜の血清型が９０種超あることが知られており、全世界で、最も一般的な血清型２３種が、侵襲性疾患のおよそ９０％を引き起こしている。発達したまたは健全な免疫系を有する個体においては、ワクチンとして、肺炎球菌の多糖体被覆物が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対して十分な免疫を付与し得るが、莢膜多糖体を適切な担体タンパク質にコンジュゲートさせれば、肺炎球菌感染のリスクも最も高い乳児および老人における免疫応答が可能になる。

２０００年に７価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ７またはＰｒｅｖｎａｒ）が最初に導入されて以来、それら７種の血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ）からの侵襲性疾患はほぼ消失した。血清型１、３、５、６Ａ、７Ｆおよび１９Ａを追加して得たＰｒｅｖｎａｒ１３により、侵襲性肺炎球菌疾患の数はさらに減少した。

しかし、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃ等の、ワクチンが無効な血清型が引き起こす侵襲性肺炎球菌疾患の発生が最近増加している（例えば、Ｂｅａｌｌ Ｂ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、４４（３）：９９９～１０１７、２００６、またはＪａｃｏｂｓら、Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．（２００８）４７（１１）：１３８８～１３９５を参照されたい）。現時点で市販されている肺炎球菌ワクチンはいずれも、ヒト、特に、２歳未満の小児において、血清型１５Ｂの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対しては適切な防御をもたらさない。したがって、血清型１５Ｂの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する免疫応答を誘発するために使用することができる免疫原性組成物が必要とされている。また、そのような免疫原性組成物を血清型１５Ｃおよび／または１５Ａの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から対象を防御するために使用し得るならば、追加の利益も得られるであろう。

一態様では、本開示は、５ｋＤａ～５００ｋＤａの間の分子量を有する、単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体を提供する。

さらなる態様では、本開示は、単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体であって、前記肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８、好ましくは、少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む多糖体を提供する。

さらなる態様では、本開示は、単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体であって、前記肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８、好ましくは、少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む多糖体を提供する。

さらなる態様では、本開示は、担体タンパク質に共有結合的に連結された本明細書に開示する単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体を含む免疫原性コンジュゲートを提供する。一態様では、前記担体タンパク質が、ＣＲＭ_１９７である。

さらなる態様では、本開示は、本明細書に開示する免疫原性コンジュゲート、および生理的に許容できるビヒクルを含む免疫原性組成物を提供する。一態様では、前記免疫原性組成物は、少なくとも１つの追加の抗原をさらに含む。一態様では、前記免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む。

さらなる態様では、本開示は、本明細書に開示する免疫原性組成物を含むワクチンを提供する。

さらなる態様では、本開示は、本明細書に開示する単離血清型１５Ｂ多糖体を生成するためのプロセスであって、
（ａ）肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ細菌細胞の発酵培養物を調製するステップと、
（ｂ）前記発酵培養物中の細菌細胞を溶解するステップと、
（ｃ）発酵培養物から肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体を精製するステップと、
（ｄ）精製した肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体を高圧ホモジナイゼーションによりサイズ調節するステップと
を含むプロセスを提供する。

さらなる態様では、本開示は、活性型肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体を生成するためのプロセスであって、本明細書に開示する単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体を、酸化剤と反応させるステップを含むプロセスを提供する。一態様では、本開示は、上記のプロセスにより得られるまたは得ることができる活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を提供する。

さらなる態様では、本開示は、担体タンパク質に共有結合的に連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体を含む免疫原性コンジュゲートを調製するためのプロセスであって、
（ａ）本明細書に開示する活性型多糖体を担体タンパク質と混ぜ合わせるステップと、
（ｂ）混ぜ合わせた活性型多糖体および担体タンパク質を還元剤と反応させて、血清型１５Ｂ莢膜多糖体－担体タンパク質のコンジュゲートを形成するステップと
を含むプロセスを提供する。一態様では、本開示は、上記のプロセスにより得られるまたは得ることができる免疫原性コンジュゲートを提供する。

さらなる態様では、本開示は、血清型１５Ｂの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染から対象を防御する方法であって、免疫原性量の本明細書に開示する免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含む方法を提供する。

さらなる態様では、本開示は、対象において、血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／または１５Ｃの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と関連がある肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染、疾患または状態を治療または予防する方法であって、治療有効量または予防有効量の本明細書に開示する免疫原性組成物またはワクチンを投与するステップを含む方法を提供する。

肺炎球菌の莢膜多糖体血清型１５Ｂの反復単位の構造を示す図である。

本発明は、本明細書に含まれる本発明の好ましい実施形態および実施例の以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。別段の定義がない限り、本明細書で使用する全ての科学技術用語は、本発明に関わる当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本発明の実行または試験において、本明細書に記載するものに類似するまたはそれらと同等である任意の方法および材料を使用することができるが、特定の好ましい方法および材料を本明細書に記載する。実施形態の記載および本発明の請求において、特定の用語を下記に記載する定義に従って使用する。

定義
本明細書で使用する場合、多糖体または多糖体－担体タンパク質のコンジュゲートの「分子量」は、多角レーザー光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ）と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により計算する分子量を指す。

本明細書で使用する場合、用語「遊離の多糖体」は、担体タンパク質に共有結合的にコンジュゲートしていないが、にもかかわらず、血清型１５Ｂ莢膜多糖体－担体タンパク質のコンジュゲート組成物中に存在する血清型１５Ｂ莢膜多糖体を意味する。遊離の多糖体は、多糖体－担体タンパク質のコンジュゲートと非共有結合的に関わることができる（すなわち、コンジュゲートに非共有結合的に結合し得、それに吸着し得、またはその中にもしくはそれと共に捕捉され得る）。

遊離の多糖体のパーセントを、血清型１５Ｂ莢膜多糖体－担体タンパク質のコンジュゲートの最終的な精製の後に測定する。好ましくは、遊離の多糖体のパーセントは、最終的な精製から４週間以内に測定する。遊離の多糖体のパーセントは、試料中の全多糖体のパーセントとして表現する。

本明細書で使用する場合、用語「血清型１５Ｂ多糖体」または「血清型１５Ｂ莢膜多糖体」は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体を指す。

本明細書で使用する場合、用語「血清型１５Ｂ糖コンジュゲート」または「血清型１５Ｂコンジュゲート」は、担体タンパク質に共有結合的にコンジュゲートさせた単離血清型１５Ｂ多糖体を指す。

本明細書で使用する場合、用語「酸化の程度」（ＤＯ）は、単離多糖体を酸化剤で活性化する場合に生ずるアルデヒド基１つ当たりの糖反復単位の数を指す。多糖体の酸化の程度は、当業者に公知の日常的な方法を使用して決定することができる。

本明細書で使用する場合、用語「対象」は、ヒトを含めた哺乳動物、または鳥、魚、爬虫類、両生類もしくは任意のその他の動物を指す。用語「対象」はまた、家庭用ペットまたは研究動物も含む。家庭用ペットおよび研究動物の非限定的な例として、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、モルモット、ケナガイタチ、サル、鳥、ヘビ、トカゲ、魚、カメおよびカエルが挙げられる。用語「対象」はまた、家畜動物も含む。家畜動物の非限定的な例として、アルパカ、バイソン、ラクダ、ウシ、シカ、ブタ、ウマ、ラマ、ラバ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、トナカイ、ヤク、ニワトリ、ガチョウおよびシチメンチョウが挙げられる。

単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体
図１に示すように、血清型１５Ｂの多糖体の反復単位は、分枝三糖骨格（１つのＮ－アセチルグルコサミン（Ｇｌｃ_ｐＮＡｃ）、１つのガラクトピラノース（Ｇａｌ_ｐ）および１つのグルコピラノース（Ｇｌｃ_ｐ））と、Ｇｌｃ_ｐＮＡｃのＣ４ヒドロキシル基に連結するαＧａｌ_ｐ－βＧａｌ_ｐの二糖分枝とからなる。ホスホグリセロールは、二糖分枝中のβＧａｌ_ｐ残基のＣ３ヒドロキシル基に連結する。血清型１５Ｂ莢膜多糖体はＯ－アセチル化されており、Ｏ－アセチル化の総量は、多糖体の反復単位１つ当たりおよそ０．８～０．９個のＯ－アセチル基である（例えば、Ｃ．Ｊｏｎｅｓら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３４０（２００５）４０３～４０９を参照されたい）。血清型１５Ｃ血清型の莢膜多糖体は、血清型１５Ｂと同一の骨格構造を有するが、Ｏ－アセチル化を欠く。

本発明の単離血清型１５Ｂ多糖体は、
（ａ）血清型１５Ｂ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細菌細胞の発酵培養物を調製するステップと、
（ｂ）前記発酵培養物中の細菌細胞を溶解するステップと、
（ｃ）発酵培養物から血清型１５Ｂ多糖体を精製するステップと、
（ｄ）精製した血清型１５Ｂ多糖体を高圧ホモジナイゼーションによりサイズ調節するステップと
を含むプロセスにより得ることができる。

血清型１５Ｂ多糖体は、当業者に公知の単離の手順を使用して細菌から直接得ることができる（例えば、米国特許出願公開第２００６０２２８３８０号、第２００６０２２８３８１号、第２００７０１８４０７１号、第２００７０１８４０７２号、第２００７０２３１３４０号および第２００８０１０２４９８号、またはＷＯ２００８１１８７５２号に開示されている方法を参照されたい）。さらに、それらの多糖体は、合成のプロトコールを使用して生成することもできる。

血清型１５Ｂの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の菌株は、樹立された培養収集物（例えば、ＡＴＣＣ寄託菌株番号：ＡＴＣＣ１０３５４もしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡから入手可能な菌株等）または臨床検体から得ることができる。

細菌細胞は、好ましくは、大豆ベースの培地中で増殖させる。肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体を生成する細菌細胞の発酵に続き、細菌細胞を溶解して、細胞可溶化液を生成する。細菌細胞は、任意の溶解剤を使用して溶解することができる。「溶解剤」は、細胞壁の崩壊および自己溶菌酵素の放出を助け、それにより、細胞の溶解を引き起こす任意の薬剤であり、例えば、洗剤が挙げられる。本明細書で使用する場合、用語「洗剤」は、細菌細胞の溶解を誘発することが可能な任意のアニオン性またはカチオン性の洗剤を指す。本発明の方法の範囲内で使用するためのそのような洗剤の代表的な例として、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）、Ｎ－ラウロイルサルコシン、ケノデオキシコール酸ナトリウムおよびサポニンが挙げられる。

本発明の一実施形態では、細菌細胞を溶解するために使用する溶解剤はＤＯＣである。ＤＯＣは、胆汁酸であるデオキシコール酸のナトリウム塩であり、デオキシコール酸は通常、ウシまたは雄ウシ等の生物学的供給源から誘導される。ＤＯＣは、ＬｙｔＡタンパク質を活性化し、このタンパク質は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）中で細胞壁の成長および分裂に関わる自己溶菌酵素である。ＬｙｔＡタンパク質は、Ｃ末端部分にコリン結合ドメインを有し、ｌｙｔＡ遺伝子の突然変異により、ＤＯＣを用いる溶解に対して抵抗性を示すＬｙｔＡ突然変異体が生成することが公知である。

本発明の一実施形態では、細菌細胞を溶解するために使用する溶解剤は、動物から誘導されない溶解剤である。本発明の方法の範囲内で使用するための、動物から誘導されない溶解剤には、ＤＯＣの作用様式に類似する作用様式（すなわち、ＬｙｔＡの機能に影響を及ぼし、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細胞の溶解をもたらす作用様式）を有する、動物以外の供給源から得られる薬剤が含まれる。そのような動物から誘導されない溶解剤として、これらに限定されないが、ＤＯＣ類似体、界面活性剤、洗剤、およびコリンの構造的類似体が挙げられる。一実施形態では、動物から誘導されない溶解剤は、デカンスルホン酸、ｔｅｒｔ－オクチルフェノキシポリ（オキシエチレン）エタノール（例えば、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ－６３０、ＣＡＳ番号：９００２－９３－１、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能）、オクチルフェノールエチレンオキシド縮合物（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能）、Ｎ－ラウロイルサルコシン、Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム、ラウリルイミノジプロピオン酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸塩、ヒオデオキシコール酸塩、グリコデオキシコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、タウロケノデオキシコール酸塩およびコール酸塩からなる群から選択される。別の実施形態では、動物から誘導されない溶解剤は、Ｎ－ラウロイルサルコシンである。別の実施形態では、溶解剤は、Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウムである。

次いで、血清型１５Ｂ多糖体を、細胞可溶化液から、遠心分離、深ろ過、沈殿、限外ろ過、活性炭を用いる処理、透析ろ過および／またはカラムクロマトグラフィーの使用を含めた、当技術分野で公知の精製の技法を使用して単離することができる（例えば、米国特許出願公開第２００６０２２８３８０号、第２００６０２２８３８１号、第２００７０１８４０７１号、第２００７０１８４０７２号、第２００７０２３１３４０号および第２００８０１０２４９８号、またはＷＯ２００８１１８７５２を参照されたい）。次いで、精製した血清型１５Ｂ莢膜多糖体を、免疫原性コンジュゲートを調製するために使用することができる。

好ましくは、ろ過特性および／または収率が有利なコンジュゲートを作製するために、多糖体をサイズ調節して、より低い分子量（ＭＷ）の範囲を得てから、担体タンパク質へのコンジュゲーションを行う。好都合なことに、精製した血清型１５Ｂ多糖体のサイズは、多糖体の構造の決定的に重要な特徴、例えば、Ｏ－アセチル基の存在等を維持しながら低下する。好ましくは、精製した血清型１５Ｂ多糖体のサイズは、機械的ホモジナイゼーションにより低下させる。

好ましい実施形態では、精製した血清型１５Ｂ多糖体のサイズは、高圧ホモジナイゼーションにより低下させる。プロセスストリームを十分に小さな寸法の流路にポンプで送ることによって、高圧ホモジナイゼーションはより高いせん断率を達成する。より大きなホモジナイゼーションの圧力を適用することによって、せん断率は増加し、ホモジナイザー中にフィードストリームを再循環させることによって、暴露時間を増加させることができる。

高圧ホモジナイゼーションのプロセスは、Ｏ－アセチル基の存在等の多糖体の構造的な特徴を維持しながら、精製した血清型１５Ｂ多糖体のサイズを低下させるのに特に適切である。

肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の可溶化液から血清型１５Ｂ多糖体を精製し、精製した多糖体を任意選択によりサイズ調節することによって得た単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体を、例えば、分子量、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たりのグリセロールのｍＭの値、または前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たりのアセテートのｍＭの値を含めた、異なるパラメータにより特徴付けることができる。

多糖体のＯ－アセチル化の程度を、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、プロトンＮＭＲにより決定することができる（例えば、ＬｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒおよびＪｏｎｅｓ（１９９６）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９６；８３～９６、ＪｏｎｅｓおよびＬｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒ（２００２）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ、３０；１２３３～１２４７、ＷＯ０５／０３３１４８またはＷＯ００／５６３５７を参照されたい）。別の一般に使用されている方法が、Ｈｅｓｔｒｉｎ（１９４９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１８０；２４９～２６１に記載されている。好ましくは、Ｏ－アセチル基の存在は、イオン－ＨＰＬＣ分析により決定する。

精製した、単離した、もしくは活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体中または血清型１５Ｂ多糖体－担体タンパク質のコンジュゲート中のＯ－アセチルの存在を、前記多糖体１ｍＭ当たりのアセテートのｍＭ数または多糖体の反復単位１つ当たりのＯ－アセチル基の数として表現する。

グリセロールリン酸側鎖の存在は、フッ化水素酸（ＨＦ）を用いて多糖体を処理することによってグリセロールを放出させた後に、パルスアンペロメトリー検出（ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ）を行う高速陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してグリセロールを測定することによって決定することができる。精製した、単離した、もしくは活性型の血清型１５Ｂ多糖体中または血清型１５Ｂ多糖体－担体タンパク質のコンジュゲート中のグリセロールの存在を、血清型１５Ｂ多糖体１ｍＭ当たりのグリセロールのｍＭ数として表現する。

また、単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、当業者に公知の方法を使用して合成により生成することもできる。

好ましい実施形態では、単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、５～５００ｋＤａ、５０～５００ｋＤａ、５０～４５０ｋＤａ、１００～４００ｋＤａ、１００～３５０ｋＤａの間の分子量を有する。好ましい実施形態では、単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、１００～３５０ｋＤａの間の分子量を有する。好ましい実施形態では、単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、１００～３００ｋＤａの間の分子量を有する。好ましい実施形態では、単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、１５０～３００ｋＤａの間の分子量を有する。

好ましい実施形態では、単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．５、０．６または０．７ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、Ｏ－アセチル基の存在は、イオン－ＨＰＬＣ分析により決定する。

好ましい実施形態では、単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８ｍＭのグリセロールを含む。好ましい実施形態では、単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．５、０．６または０．７ｍＭのグリセロールを含む。好ましい実施形態では、単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。好ましい実施形態では、単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．７ｍＭのグリセロールを含む。

好ましい実施形態では、単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、１００～３５０ｋＤａの間、好ましくは、１５０～３５０ｋＤａの間の分子量を有し、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。

好ましい実施形態では、単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、１００～３５０ｋＤａの間、好ましくは、１５０～３５０ｋＤａの間の分子量を有し、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。

好ましい実施形態では、単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのアセテートおよび前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。

好ましい実施形態では、単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、１００～３５０ｋＤａ、好ましくは、１５０～３５０ｋＤａの間の分子量を有し、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのアセテートおよび前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。

血清型１５Ｂ莢膜多糖体－担体タンパク質のコンジュゲート
単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体を担体タンパク質にコンジュゲートさせて、免疫原性コンジュゲートを得ることができる。単離多糖体を、当業者に公知の方法により担体タンパク質にコンジュゲートさせることができる（例えば、米国特許出願公開第２００６０２２８３８０号、第２００７０１８４０７１号、第２００７０１８４０７２号、第２００７０２３１３４０号、またはＷＯ２０１１／１００１５１を参照されたい）。

ある実施形態では、多糖体を、１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）を用いて活性化させて、シアン酸エステルを形成させることができる。活性型多糖体を、担体タンパク質上のアミノ基に、直接またはスペーサー（リンカー）基を介してカップリングさせることができる。例えば、スペーサーがシスタミンまたはシステアミンであれば、チオール化多糖体を得ることができ、これを、マレイミド活性化担体タンパク質（例えば、ＧＭＢＳを使用）またはハロアセチル化担体タンパク質（例えば、ヨードアセトアミドもしくはＮ－スクシンイミジルブロモアセテートもしくはＳＩＡＢもしくはＳＩＡもしくはＳＢＡＰを使用）と反応させて得られるチオエーテル連結を介して、担体にカップリングさせることができるであろう。好ましくは、（ＣＤＡＰの化学反応によって生じたものであってもよい）シアン酸エステルを、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングさせ、アミノ誘導体化糖を、カルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）の化学反応を使用して、タンパク質担体上のカルボキシル基を介して担体タンパク質にコンジュゲートさせる。そのようなコンジュゲートが、例えば、ＷＯ９３／１５７６０、ＷＯ９５／０８３４８およびＷＯ９６１２９０９４に記載されている。

その他の適切な技法は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ－ニトロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ－－ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する。多くが、国際特許出願公開第ＷＯ９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲーションに、糖の遊離ヒドロキシル基をＣＤＩと反応させることによって形成することができるカルボニルリンカー（Ｂｅｔｈｅｌｌら、１９７９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４：２５７２～４；Ｈｅａｒｎら、１９８１、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、２１８：５０９～１８を参照されたい）を関与させ、続いて、このリンカーをタンパク質と反応させて、カルバミン酸エステル連結を形成する場合がある。この場合、アノマー末端を還元して第一級ヒドロキシル基を得、第一級ヒドロキシル基の保護／脱保護を行ってもよく、第一級ヒドロキシル基をＣＤＩと反応させて、ＣＤＩカルバミン酸エステル中間体を形成し、ＣＤＩカルバミン酸エステル中間体をタンパク質上のアミノ基とカップリングさせることができる。

好ましい実施形態では、単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体を、還元的アミノ化により担体タンパク質にコンジュゲートさせる。還元的アミノ化では、酸化による多糖体の活性化、および還元による、活性型多糖体のタンパク質担体へのコンジュゲーションが関与する。

血清型１５Ｂ莢膜多糖体の活性化
活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を、単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体を酸化剤と反応させることによって得る。例えば、前記活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を、
（ａ）血清型１５Ｂ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細菌細胞の発酵培養物を調製するステップと、
（ｂ）前記発酵培養物中の細菌細胞を溶解するステップと、
（ｃ）発酵培養物から血清型１５Ｂ多糖体を精製するステップと、
（ｄ）精製した血清型１５Ｂ多糖体を高圧ホモジナイゼーションによりサイズ調節するステップと、
（ｅ）サイズ調節した血清型１５Ｂ多糖体を酸化剤と反応させるステップと
を含むプロセスにより得ることができる。

好ましい実施形態では、酸化剤と反応させる単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体の濃度は、０．１～１０ｍｇ／ｍＬ、０．５～５ｍｇ／ｍＬ、１～３ｍｇ／ｍＬの間、または約２ｍｇ／ｍＬである。

好ましい実施形態では、酸化剤は過ヨウ素酸である。過ヨウ素酸は、近接するヒドロキシル基を酸化して、カルボニル基またはアルデヒド基を形成し、Ｃ－Ｃ結合の切断を引き起こす。用語「過ヨウ素酸」は、過ヨウ素酸塩および過ヨウ素酸の両方を含む。この用語はまた、メタ過ヨウ素酸（ＩＯ_４ ^－）およびオルト過ヨウ素酸（ＩＯ_６ ^５－）の両方も含む。用語「過ヨウ素酸」はまた、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウムを含めた、過ヨウ素酸の種々の塩も含む。好ましい実施形態では、酸化剤は過ヨウ素酸ナトリウムである。好ましい実施形態では、血清型１５Ｂ莢膜多糖体を酸化するために使用する過ヨウ素酸は、メタ過ヨウ素酸である。好ましい実施形態では、血清型１５Ｂ莢膜多糖体を酸化するために使用する過ヨウ素酸は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムである。

好ましい実施形態では、多糖体を、０．０１～１０、０．０５～５、０．１～１、０．５～１、０．７～０．８、０．０５～０．５、０．１～０．３モル当量の酸化剤と反応させる。好ましい実施形態では、多糖体を、約０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５モル当量の酸化剤と反応させる。好ましい実施形態では、多糖体を、約０．１５モル当量の酸化剤と反応させる。好ましい実施形態では、多糖体を、約０．２５モル当量の酸化剤と反応させる。好ましい実施形態では、多糖体を、約０．５モル当量の酸化剤と反応させる。好ましい実施形態では、多糖体を、約０．６モル当量の酸化剤と反応させる。好ましい実施形態では、多糖体を、約０．７モル当量の酸化剤と反応させる。

好ましい実施形態では、反応の持続時間は、１～５０、１０～３０、１５～２０、１５～１７時間の間、または約１６時間である。

好ましい実施形態では、反応温度を、１５～４５℃、１５～３０℃、２０～２５℃の間に保つ。好ましい実施形態では、反応温度を約２３℃に保つ。

好ましい実施形態では、酸化反応を、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、またはＢｉｓ－Ｔｒｉｓから選択される緩衝液中で実施する。好ましい実施形態では、緩衝液はリン酸カリウムである。

好ましい実施形態では、緩衝液は、１～５００ｍＭ、１～３００ｍＭ、５０～２００ｍＭの間の濃度を有する。好ましい実施形態では、緩衝液は約１００ｍＭの濃度を有する。

好ましい実施形態では、酸化反応を、４～８、５～７、５．５～６．５の間のｐＨで実施する。好ましい実施形態では、ｐＨは約６である。

好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を、０．５～５ｍｇ／ｍＬの単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体を０．２～０．３モル当量の過ヨウ素酸と２０～２５℃の間の温度で反応させることによって得る。

好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を精製する。活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、透析または限外ろ過／透析ろ過等の当業者に公知の方法に従って精製する。例えば、活性型莢膜多糖体を、限外ろ過デバイスを使用する濃縮および透析ろ過により精製する。

好ましい実施形態では、本発明は、上記に開示したプロセスにより得られるまたは得ることができる活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体に関する。

好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体の酸化の程度は、２～２０、２～１５、２～１０、２～５、５～２０、５～１５、５～１０、１０～２０、１０～１５、１５～２０の間である。好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体の酸化の程度は、２～１０、４～８、４～６、６～８、６～１２、８～１２、９～１１、１０～１６、１２～１６、１４～１８、１６～２０、１６～１８または１８～２０の間である。

好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、５～５００ｋＤａ、５０～５００ｋＤａ、５０～４５０ｋＤａ、１００～４００ｋＤａ、１００～３５０ｋＤａの間の分子量を有する。好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、１００～３５０ｋＤａの間の分子量を有する。好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、１００～３００ｋＤａの間の分子量を有する。好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、１５０～３００ｋＤａの間の分子量を有する。好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、１００～２５０ｋＤａの間の分子量を有する。

好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．５、０．６または０．７ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、Ｏ－アセチル基の存在は、イオン－ＨＰＬＣ分析により決定する。

好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８ｍＭのグリセロールを含む。好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．５、０．６または０．７ｍＭのグリセロールを含む。好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．７ｍＭのグリセロールを含む。

好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、１００～２５０ｋＤａの間の分子量を有し、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。

好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、１００～２５０ｋＤａの間の分子量を有し、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。

好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのアセテート、および前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。

好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、１００～２５０ｋＤａの間の分子量を有し、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのアセテートおよび前記血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。

ある実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を、凍結保護剤／凍結乾燥保護剤の存在下で、凍結乾燥してもよい。ある実施形態では、前記凍結保護剤／凍結乾燥保護剤は、糖である。好ましい実施形態では、糖は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットから選択される。好ましい実施形態では、糖はスクロースである。次いで、凍結乾燥した活性型莢膜多糖体を、担体タンパク質を含む溶液と混ぜ合わせることができる。

別の実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を、担体タンパク質と混ぜ合わせ、凍結保護剤／凍結乾燥保護剤の存在下で、凍結乾燥してもよい。ある実施形態では、前記凍結保護剤／凍結乾燥保護剤は、糖である。好ましい実施形態では、糖は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットから選択される。好ましい実施形態では、糖はスクロースである。次いで、同時凍結乾燥した多糖体および担体タンパク質を、溶液中に再懸濁させ、還元剤と反応させることができる。

ある実施形態では、本発明は、凍結乾燥した活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体に関する。

ある実施形態では、本発明は、同時凍結乾燥した活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体とタンパク質担体に関する。好ましい実施形態では、タンパク質担体はＣＲＭ_１９７である。

活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体の担体タンパク質とのコンジュゲーション
活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を、
（ａ）活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を担体タンパク質と混ぜ合わせるステップと、
（ｂ）混ぜ合わせた活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体および担体タンパク質を還元剤と反応させて、血清型１５Ｂ莢膜多糖体－担体タンパク質のコンジュゲートを形成するステップと
を含むプロセスにより、担体タンパク質にコンジュゲートさせることができる。

ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中における還元的アミノ化による活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体のタンパク質担体とのコンジュゲーションは、例えば、水溶液中における還元的アミノ化と比較して、多糖体のＯ－アセチル含有量を維持するのに適切であり、後者は、多糖体のＯ－アセチル化レベルを顕著に低下させる。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）が、ＤＭＳＯ中で実施される。

好ましい実施形態では、ステップ（ａ）は、凍結乾燥した血清型１５Ｂ莢膜多糖体を担体タンパク質およびＤＭＳＯを含む溶液中に溶かすことを含む。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）は、同時凍結乾燥した血清型１５Ｂ莢膜多糖体および担体タンパク質をＤＭＳＯ中に溶かすことを含む。

ステップ（ａ）および（ｂ）を水溶液中で実施する場合、ステップ（ａ）および（ｂ）は、緩衝液、好ましくは、ＰＢＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ、ビシンまたはＨＥＰＢから選択される緩衝液中、６．０～８．５、７～８または７～７．５の間のｐＨで実施する。好ましい実施形態では、緩衝液はＰＢＳである。好ましい実施形態では、ｐＨは約７．３である。

好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）の活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体の濃度は、０．１～１０ｍｇ／ｍＬ、０．５～５ｍｇ／ｍＬ、０．５～２ｍｇ／ｍＬの間である。好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）の活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体の濃度は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９または３ｍｇ／ｍＬである。

好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体対担体タンパク質の初期投入量の比（重量比）が、５：１～０．１：１、２：１～０．１：１、２：１～１：１、１．５：１～１：１、０．１：１～１：１、０．３：１～１：１、０．６：１～１：１の間である。

好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体対担体タンパク質の初期投入量の比が、約０．６：１～１．５：１、好ましくは、０．６：１～１：１である。そのような初期投入量の比は、遊離の多糖体の低いレベルを免疫原性コンジュゲート中で得るのに特に適切である。

好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体対担体タンパク質の初期投入量の比は、約０．４：１、約０．５：１、約０．６：１、約０．７：１、約０．８：１、約０．９：１、約１：１、約１．１：１、約１．２：１、約１．３：１、約１．４：１、約１．５：１、約１．６：１、約１．７：１、約１．８：１、約１．９：１または約２：１である。

ある実施形態では、還元剤は、ブレンステッド酸またはルイス酸の存在下のシアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素亜鉛；ピリジンボラン、２－ピコリンボラン、２，６－ジボラン－メタノール、ジメチルアミン－ボラン、ｔ－ＢｕＭｅ^ｉＰｒＮ－ＢＨ_３、ベンジルアミン－ＢＨ_３または５－エチル－２－メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）等のアミンボランである。好ましい実施形態では、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである。好ましい実施形態では、還元剤は、ナトリウム２－ピコリンボランである。

好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）で使用する還元剤の分量は、約０．１～１０モル当量、０．５～５モル当量、１～２モル当量である。好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）で使用する還元剤の分量は、約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２モル当量である。

好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）の持続時間は、１～６０時間、１０～５０時間、４０～５０時間；４２～４６時間の間である。好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）の持続時間は、約４４時間である。

好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）における反応温度を、１０～４０℃、１５～３０℃または２０～２６℃の間に保つ。好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）における反応温度を、約２３℃に保つ。

好ましい実施形態では、担体タンパク質に共有結合的に連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体を含む免疫原性コンジュゲートを調製するためのプロセスは、未反応のアルデヒドをＮａＢＨ_４の添加によりキャップ（クエンチング）するステップ（ステップ（ｃ））をさらに含む。

好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）において使用するＮａＢＨ_４の分量は、０．１～１０モル当量、０．５～５モル当量、１～３モル当量の間である。好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）において使用するＮａＢＨ_４の分量は、約２モル当量である。

好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）の持続時間は、０．１～１０時間、０．５～５時間、２～４時間の間である。好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）の持続時間は、約３時間である。

好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）における反応温度を、１５～４５℃、１５～３０℃または２０～２６℃の間に保つ。好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）における反応温度を、約２３℃に保つ。

好ましい実施形態では、コンジュゲーションのステップ（ステップｂ）の収率は、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超または９０％超である。好ましい実施形態では、コンジュゲーションのステップ（ステップｂ）の収率は、６０％超である。好ましい実施形態では、コンジュゲーションのステップ（ステップｂ）の収率は、７０％超である。収率は、コンジュゲート中の血清型１５Ｂ多糖体の量×１００／コンジュゲーションのステップにおいて使用した活性型多糖体の量である。

好ましい実施形態では、担体タンパク質に共有結合的に連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体を含む免疫原性コンジュゲートを調製するためのプロセスは、
（ａ）血清型１５Ｂ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細菌細胞の発酵培養物を調製するステップと、
（ｂ）前記発酵培養物中の細菌細胞を溶解するステップと、
（ｃ）発酵培養物から血清型１５Ｂ多糖体を精製するステップと、
（ｄ）精製した血清型１５Ｂ多糖体を高圧ホモジナイゼーションによりサイズ調節するステップと、
（ｅ）サイズ調節した血清型１５Ｂ多糖体を酸化剤と反応させるステップと、
（ｆ）活性型の血清型１５Ｂ多糖体を担体タンパク質と混ぜ合わせるステップと、
（ｇ）混ぜ合わせた活性型の血清型１５Ｂ多糖体および担体タンパク質を還元剤と反応させて、血清型１５Ｂ多糖体－担体タンパク質のコンジュゲートを形成するステップと、
（ｈ）未反応のアルデヒドをＮａＢＨ_４の添加によりキャップ（クエンチング）するステップと
を含む。

好ましい実施形態では、上記のプロセスのコンジュゲーションのステップ（ステップｇ）の収率は、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超または９０％超である。好ましい実施形態では、コンジュゲーションのステップ（ステップｇ）の収率は、６０％超である。好ましい実施形態では、コンジュゲーションのステップ（ステップｇ）の収率は、７０％超である。収率は、コンジュゲート中の血清型１５Ｂ多糖体の量×１００／コンジュゲーションのステップにおいて使用した活性型多糖体の量である。

血清型１５Ｂ莢膜多糖体の担体タンパク質へのコンジュゲーションの後、多糖体－タンパク質のコンジュゲートを、当業者に公知の多様な技法により精製する（多糖体－タンパク質のコンジュゲートの量に関して濃縮する）ことができる。これらの技法として、透析、濃縮／透析ろ過の操作、タンジェンシャルフローろ過、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー）、および深ろ過が挙げられる。

好ましい実施形態では、担体タンパク質は、無毒性かつ非反応源性であり、十分な量および純度で得ることができる。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーションの手順に適していなければならない。

好ましい実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風トキソイド）またはＴＴの断片Ｃ、ＣＲＭ_１９７（無毒性であるが、ジフテリア毒素の、抗原性が同一のバリアント）、その他のＤＴの点突然変異体、例として、ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２１８；３８３８～３８４４、１９７３）；Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔｏｘｉｎｓ、Ｆｒａｎｋｅｌ編、Ｍａｅｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ、１９９２中、ＮｉｃｈｏｌｌｓおよびＹｏｕｌｅにより記載されている、ＣＲＭ９、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３およびＣＲＭ１０７ならびにその他の突然変異；ＵＳ４７０９０１７やＵＳ４９５０７４０に開示されている、欠失や、Ｇｌｕ－１４８のＡｓｐ、ＧｌｎもしくはＳｅｒへの突然変異および／またはＡｌａ１５８のＧｌｙへの突然変異ならびにその他の突然変異；ＵＳ５９１７０１７またはＵＳ６４５５６７３に開示されている、少なくとも１つまたは複数の残基Ｌｙｓ５１６、Ｌｙｓ５２６、Ｐｈｅ５３０および／またはＬｙｓ５３４の突然変異ならびにその他の突然変異；それとも、ＵＳ５８４３７１１に開示されている断片；肺炎球菌のニューモリシン（Ｋｕｏら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、６３；２７０６～１３）、例として、何らかの様式で解毒したｐｌｙ、例えば、ｄＰＬＹ－ＧＭＢＳ（ＷＯ０４０８１５１５、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１０２５８）またはｄＰＬＹ－ｆｏｒｍｏｌ、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥを含めたＰｈｔＸ（ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤもしくはＰｈｔＥの配列は、ＷＯ００／３７１０５またはＷＯ００／３９２９９に開示されている）、およびＰｈｔタンパク質の融合体、例えば、ＰｈｔＤＥ融合体、ＰｈｔＢＥ融合体、ＰｈｔＡ－Ｅ（ＷＯ０１／９８３３４、ＷＯ０３／５４００７、Ｗ０２００９／０００８２６）；ＯＭＰＣ（髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｂから通常抽出される髄膜炎菌外膜タンパク質、ＥＰ０３７２５０１）、ＰｏｒＢ（髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来）、ＰＤ（インフルエンザ桿菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）プロテインＤ、例えば、ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照されたい）またはそれらの免疫学的機能性均等物；合成ペプチド（ＥＰ０３７８８８１、ＥＰ０４２７３４７）；熱ショックタンパク質（ＷＯ９３／１７７１２、ＷＯ９４／０３２０８）；百日咳タンパク質（ＷＯ９８／５８６６８、ＥＰ０４７１１７７）、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子またはホルモン（ＷＯ１０ ９１／０１１４６）；Ｎ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉら（２００４）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、７２；４８８４～７）、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ（ＷＯ０２／０９１９９８）、鉄取込みタンパク質（ＷＯ０１／７２３３７）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ（ＷＯ００／６１７６１）等の種々の病原体に由来する抗原から得られた複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇｉら（２００１）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、３１；３８１６～３８２４）からなる群中から選択される担体タンパク質にコンジュゲートさせる。ある実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）にコンジュゲートさせる。別の実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を、ＴＴ（破傷風トキソイド）にコンジュゲートさせる。別の実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を、ＴＴの断片Ｃにコンジュゲートさせる。別の実施形態では、活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を、ＰＤ（インフルエンザ桿菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）プロテインＤ、例えば、ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照されたい）にコンジュゲートさせる。

好ましい実施形態では、本発明の活性型の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を、ＣＲＭ_１９７タンパク質にコンジュゲートさせる。ＣＲＭ_１９７タンパク質は、ジフテリア毒素の無毒性の形態であるが、ジフテリア毒素と免疫学的に区別できない。ＣＲＭ_１９７は、毒素産生性コリネファージベータのニトロソグアニジン突然変異誘発により作り出された非毒素産生性ファージβ１９７^ｔｏｘ－に感染させたジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）により生成される（Ｕｃｈｉｄａ，Ｔ．ら、１９７１、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２３３：８～１１）。ＣＲＭ_１９７は、限外ろ過、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーにより精製される。ＣＲＭ_１９７タンパク質は、ジフテリア毒素と同じ分子量を有するが、ジフテリア毒素とは、構造遺伝子中に（グアニンからアデニンへの）単一塩基の変化がある点で異なる。この単一塩基の変化により、成熟タンパク質中のグリシンからグルタミン酸へのアミノ酸の置換が引き起こされ、ジフテリア毒素の毒性が排除される。ＣＲＭ_１９７タンパク質は、糖のための安全かつ有効なＴ細胞依存性担体である。ＣＲＭ_１９７およびその生成についてのさらなる詳細を、例えば、ＵＳ５，６１４，３８２に見出すことができる。

ある実施形態では、本発明は、担体タンパク質に共有結合的に連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体を含む免疫原性コンジュゲートに関する。ある実施形態では、本発明は、還元的アミノ化により担体タンパク質に共有結合的に連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体を含む免疫原性コンジュゲートに関する。ある実施形態では、本発明は、ＤＭＳＯ中で還元的アミノ化により担体タンパク質に共有結合的に連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体を含む免疫原性コンジュゲートに関する。好ましい実施形態では、担体タンパク質はＣＲＭ_１９７である。好ましい実施形態では、多糖体は、本明細書の定義に従う単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体である。好ましい実施形態では、多糖体は、本明細書の定義に従う単離血清型１５Ｂ莢膜多糖体であり、高圧ホモジナイゼーションによりサイズ調節されている。

好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖体の総量と比較して、遊離の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を約５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０または１５％未満を含む。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖体の総量と比較して、遊離の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を約２５％未満含む。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖体の総量と比較して、遊離の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を約２０％未満含む。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖体の総量と比較して、遊離の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を約１５％未満含む。

好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、３０００～２００００ｋＤａ；５０００～１００００ｋＤａ；５０００～２００００ｋＤａ；８０００～２００００ｋＤａ；８０００～１６０００ｋＤａ；または１００００～１６０００ｋＤａの分子量を有する。免疫原性コンジュゲートの分子量は、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳにより測定する。

好ましい実施形態では、コンジュゲート中の担体タンパク質に対する血清型１５Ｂ莢膜多糖体対の比（重量比）は、０．５～３の間である。好ましい実施形態では、コンジュゲート中の担体タンパク質に対する血清型１５Ｂ莢膜多糖体の比は、０．４～２、０．５～２、０．５～１．５、０．５～１、１～１．５、１～２の間である。好ましい実施形態では、コンジュゲート中の担体タンパク質に対する血清型１５Ｂ莢膜多糖体の比は、０．７～０．９の間である。

サイズ排除クロマトグラフィー媒体（ＣＬ－４Ｂ）を使用して、コンジュゲートの相対的な分子のサイズ分布を決定することができる。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を自然落下式カラム中で使用して、コンジュゲートの分子のサイズ分布のプロファイルを得る。媒体中のポアから除外される大きな分子は、小さな分子よりも迅速に溶出する。自動分取装置を使用して、カラムの溶出液を収集する。画分を、糖アッセイによる比色分析により試験する。Ｋｄを決定するために、カラムを較正して、分子が完全に除外される（Ｖ_０）画分（Ｋｄ＝０）および最大の保持を示す（Ｖ_ｉ）画分（Ｋｄ＝１）を確立する。試料の特定の属性に到達する画分（Ｖ_ｅ）とＫｄの関係は、式Ｋｄ＝（Ｖ_ｅ－Ｖ_０）／（Ｖ_ｉ－Ｖ_０）で示される。

好ましい実施形態では、少なくとも２０％の免疫原性コンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、少なくとも３０％の免疫原性コンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、少なくとも４０％の免疫原性コンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも８５％の免疫原性コンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、少なくとも６０％の免疫原性コンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、少なくとも７０％の免疫原性コンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３以下のＫｄを有する。

好ましい実施形態では、４０％～９０％の間の血清型１５Ｂ免疫原性コンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、５０％～９０％の間の血清型１５Ｂ免疫原性コンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３以下のＫｄを有する。好ましい実施形態では、６５％～８０％の間の血清型１５Ｂ免疫原性コンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３以下のＫｄを有する。

好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．５、０．６または０．７ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態では、Ｏ－アセチル基の存在は、イオン－ＨＰＬＣ分析により決定する。

好ましい実施形態では、単離多糖体中の血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たりのアセテートのｍＭ値に対する、免疫原性コンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たりのアセテートのｍＭ値の比が、少なくとも０．６、少なくとも０．６５、少なくとも０．７、少なくとも０．７５、少なくとも０．８、少なくとも０．８５、少なくとも０．９または少なくとも０．９５である。好ましい実施形態では、単離多糖体中の血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たりのアセテートのｍＭ値に対する、免疫原性コンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たりのアセテートのｍＭ値の比は、少なくとも０．７である。好ましい実施形態では、単離多糖体中の血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たりのアセテートのｍＭ値に対する、免疫原性コンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たりのアセテートのｍＭ値の比は、少なくとも０．９である。好ましい実施形態では、Ｏ－アセチル基の存在は、イオン－ＨＰＬＣ分析により決定する。

好ましい実施形態では、活性型多糖体中の血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たりのアセテートのｍＭ値に対する、免疫原性コンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たりのアセテートのｍＭ値の比が、少なくとも０．６、少なくとも０．６５、少なくとも０．７、少なくとも０．７５、少なくとも０．８、少なくとも０．８５、少なくとも０．９または少なくとも０．９５である。好ましい実施形態では、活性型多糖体中の血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たりのアセテートのｍＭ値に対する、免疫原性コンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たりのアセテートのｍＭ値の比は、少なくとも０．７である。好ましい実施形態では、活性型多糖体中の血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たりのアセテートのｍＭ値に対する、免疫原性コンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たりのアセテートのｍＭ値の比は、少なくとも０．９である。好ましい実施形態では、Ｏ－アセチル基の存在は、イオン－ＨＰＬＣ分析により決定する。

好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８ｍＭのグリセロールを含む。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．５、０．６または０．７ｍＭのグリセロールを含む。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．７ｍＭのグリセロールを含む。

コンジュゲーションの程度は、血清型１５Ｂ莢膜多糖体にコンジュゲートしている担体タンパク質中のリジン残基の数である。多糖体への共有結合的連結に起因する担体タンパク質のリジン修飾についての証拠は、当業者に公知の日常的な方法を使用するアミノ酸分析により得られる。コンジュゲーションの結果、コンジュゲートされた材料を作製するために使用したＣＲＭ_１９７タンパク質出発材料と比較して、回収されるリジン残基の数の低下が生じる。

好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートのコンジュゲーションの程度は、２～１５、２～１３、２～１０、２～８、２～６、２～５、２～４、３～１５、３～１３、３～１０、３～８、３～６、３～５、３～４、５～１５、５～１０、８～１５、８～１２、１０～１５または１０～１２の間である。好ましい実施形態では、免疫原性コンジュゲートのコンジュゲーションの程度は、２～５の間である。

免疫原性組成物
用語「免疫原性組成物」は、抗原、例えば、微生物またはその構成成分を含有する任意の医薬組成物に関し、この組成物を使用して、対象の免疫応答を惹起することができる。

本明細書で使用する場合、「免疫原性」は、細菌の莢膜多糖体等の抗原（もしくは抗原のエピトープ）、または抗原を含む免疫原性コンジュゲートもしくは免疫原性組成物の、宿主、例として、哺乳動物中で、免疫応答を液性媒介型または細胞性媒介型のいずれかまたは両方で惹起する能力を意味する。

ある実施形態では、本開示は、本明細書に開示する血清型１５Ｂ莢膜多糖体－担体タンパク質の免疫原性コンジュゲートを含む免疫原性組成物に関する。

ある実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物は、対象に投与した場合、血清型１５Ｂの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に結合することが可能な抗体の形成を誘発する。ある実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物は、標準的なＥＬＩＳＡアッセイによる測定に従うと、対象に投与した場合、血清型１５Ｂの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に結合することが可能な抗体の形成を誘発する。

ある実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物は、対象に投与した場合、血清型１５Ｂならびに１５Ａおよび／または１５Ｃの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に結合することが可能な抗体の形成を誘発する。ある実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物は、標準的なＥＬＩＳＡアッセイによる測定に従うと、対象に投与した場合、血清型１５Ｂならびに１５Ａおよび／または１５Ｃの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に結合することが可能な抗体の形成を誘発する。

ある実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物は、対象に投与した場合、血清型１５Ｂおよび１５Ｃの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に結合することが可能な抗体の形成を誘発する。ある実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物は、標準的なＥＬＩＳＡアッセイによる測定に従うと、対象に投与した場合、血清型１５Ｂおよび１５Ｃの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に結合することが可能な抗体の形成を誘発する。

ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）の方法では、ワクチンを接種した対象の血清から得られた抗体を、固体の支持体に吸着させてある多糖体と共にインキュベートする。結合した抗体を、酵素をコンジュゲートさせた二次検出抗体を使用して検出する。

ある実施形態では、前記ＥＬＩＳＡアッセイは、ＷＨＯにより「Ｔｒａｉｎｉｎｇ ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ（Ｐｎ ＰＳ ＥＬＩＳＡ）」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖａｃｃｉｎｅ．ｕａｂ．ｅｄｕ／ＥＬＩＳＡ％２０ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｐｄｆにおいて取得可能；取得日：２０１４年３月３１日）において定義されている標準化された（ＷＨＯ）ＥＬＩＳＡアッセイである。

ＥＬＩＳＡにより、ヒト血清中に存在する型特異的なＩｇＧ抗肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖体（ＰＳ）抗体について測定する。ヒト血清の希釈物を、型に特異的な莢膜ＰＳで被覆したマイクロタイタープレートに添加すると、その莢膜ＰＳに特異的な抗体が、マイクロタイタープレートに結合する。プレートに結合した抗体を、ヤギ抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼ標識抗体、続いて、リン酸ｐ－ニトロフェニル基質を使用して検出する。有色最終産物の光学密度が、血清中に存在する抗莢膜ＰＳ抗体の量に比例する。

ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定する場合、少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．３、０．３５、０．４または０．５μｇ／ｍｌの濃度で、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂの多糖体に結合することが可能であるヒト中のＩｇＧ抗体を惹起することができる。

ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定する場合、少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．３、０．３５、０．４または０．５μｇ／ｍｌの濃度で、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｃの多糖体に結合することが可能であるヒト中のＩｇＧ抗体を惹起することができる。

ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定する場合、少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．３、０．３５、０．４または０．５μｇ／ｍｌの濃度で、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂおよび１５Ｃの多糖体に結合することが可能であるヒト中のＩｇＧ抗体を惹起することができる。

ある実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物は、対象に投与した場合、本明細書に開示するオプソニン化貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）において血清型１５Ｂの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を死滅させることが可能な抗体の形成を誘発する。ある実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物は、本明細書に開示するＯＰＡアッセイにおいて試験すると、コンジュゲートされていないネイティブ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体を用いて得たＯＰＡタイターよりも高いＯＰＡタイターを有する。

ある実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物は、対象に投与した場合、本明細書に開示するオプソニン化貪食作用アッセイにおいて血清型１５Ｃ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を死滅させることが可能な抗体の形成を誘発する。ある実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物は、本明細書に開示するＯＰＡアッセイにおいて試験すると、コンジュゲートされていないネイティブ肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｃ莢膜多糖体を用いて得たＯＰＡタイターよりも高いＯＰＡタイターを有する。

ある実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物は、対象に投与した場合、本明細書に開示するオプソニン化貪食作用アッセイにおいて血清型１５Ｂならびに１５Ｃおよび／または１５Ａの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を死滅させることが可能な抗体の形成を誘発する。

ある実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物は、対象に投与した場合、血清型１５Ｂおよび１５Ｃを死滅させることが可能な抗体の形成を誘発する。

肺炎球菌のオプソニン化貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）では、貪食性のエフェクター細胞が、機能性の抗体および補体の存在下で、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細胞を死滅させるのを測定し、このアッセイは、肺炎球菌ワクチンの有効性を評価するための重要な代替アッセイとなるとみなされる。

オプソニン化貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細胞、試験しようとする熱不活性化ヒト血清、分化ＨＬ－６０細胞（貪食細胞）および外因性補体供給源（例えば、仔ウサギの補体）の混合物を一緒にインキュベートすることによって実施することができる。オプソニン化貪食作用が、インキュベーションの間に進行し、抗体および補体で被覆されている細菌細胞は、オプソニン化貪食作用を受けて死滅する。オプソニン化貪食作用を逃れた生存細菌のコロニー形成単位（ｃｆｕ）を、アッセイ混合物を平板培養することによって決定する。ＯＰＡタイターを、試験血清を有さない対照のウエルと比して細菌のカウント数の５０％の低下をもたらす希釈度の逆数と定義する。ＯＰＡタイターを、この５０％死滅のカットオフを包含する２つの希釈度から内挿する。

これらの死滅型ＯＰＡでは、１：８以上の終点タイターを陽性の結果とみなす。

ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、オプソニン化貪食作用死滅アッセイ（ＯＰＡ）により決定する場合、対象の少なくとも５０％において、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに対して少なくとも１：８のタイターを惹起することが可能である。ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、オプソニン化貪食作用死滅アッセイ（ＯＰＡ）により決定する場合、対象の少なくとも６０％；７０％、８０％、９０％、または少なくとも９３％において、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに対して少なくとも１：８のタイターを惹起することが可能である。

ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、オプソニン化貪食作用死滅アッセイ（ＯＰＡ）により決定する場合、対象の少なくとも５０％において、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｃに対して少なくとも１：８のタイターを惹起することが可能である。ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、オプソニン化貪食作用死滅アッセイ（ＯＰＡ）により決定する場合、対象の少なくとも６０％；７０％、８０％、９０％、または少なくとも９５％において、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｃに対して少なくとも１：８のタイターを惹起することが可能である。

本発明の免疫原性組成物の製剤化を、当技術分野において認識されている方法を使用して行うことができる。例えば、本発明の免疫原性コンジュゲートを生理的に許容できるビヒクルと共に製剤化して、組成物を調製することができる。そのようなビヒクルの例として、これらに限定されないが、水、緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、およびデキストロース溶液が挙げられる。

好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、少なくとも１つの追加の抗原を含むことができる。好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、少なくとも１つの追加の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖体を含むことができる。

好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、少なくとも１つの追加の、担体タンパク質にコンジュゲートさせた肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖体を含むことができる。好ましい実施形態では、前記担体タンパク質はＣＲＭ_１９７である。

特定の実施形態では、免疫原性組成物は、１つまたは複数のアジュバントを含む。本明細書の定義に従うと、「アジュバント」は、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を増強するのに役立つ物質である。したがって、アジュバントは、しばしば免疫応答をブーストするために加えられ、当業者に周知である。組成物の有効性を増強するのに適切なアジュバントとして、これらに限定されないが、
（１）アルミニウム塩（ミョウバン）、例として、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等；
（２）水中油型乳剤の製剤（ムラミルペプチド（下記に定義）または細菌細胞壁の構成成分等のその他の特異的な免疫賦活剤がある場合またはない場合の）、例えば、
（ａ）５％スクアレン、０．５％５Ｔｗｅｅｎ８０および０．５％Ｓｐａｎ８５を含有し（（必ずしも必要ではないが）種々の量のＭＴＰ－ＰＥ（下記を参照されたい）を含有していてもよい）、顕微溶液化装置、例として、モデル１１ＯＹ顕微溶液化装置（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）を使用してサブミクロン粒子に製剤化されたＭＦ５９（ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１４８３７号）
（ｂ）１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ－ＭＤＰ（下記を参照されたい）を含有し、顕微溶液化したサブミクロン乳剤またはボルテックスして作製したより大きな粒子サイズの乳剤のいずれかのＳＡＦ、さらに、
（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびに米国特許第４，９１２，０９４号（Ｃｏｒｉｘａ）に記載されている３－Ｏ－デスアシルモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（商標））、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群から得られる１つまたは複数の細菌細胞壁構成成分、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）
等；
（３）サポニンのアジュバント、例として、Ｑｕｉｌ ＡもしくはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ－２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）（米国特許第５，０５７，５４０号）を使用することができ、またはそれらから作製した粒子、例として、ＩＳＣＯＭ（免疫賦活複合体）；
（４）細菌のリポ多糖；合成リピドＡ類似体、例として、Ｃｏｒｉｘａから入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されているアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）またはそれらの誘導体もしくは類似体；１つのそのようなＡＧＰが、水性形態または安定な乳剤として製剤化された２－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２－デオキシ－４－Ｏ－ホスホノ－３－Ｏ－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］－２－［（Ｒ）－３－テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］－ｂ－Ｄ－グルコピラノシドであり、これは、５２９としてもまた公知である（以前は、ＲＣ５２９として公知であった）；合成ポリヌクレオチド、例として、ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）；
（５）サイトカイン、例として、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８等）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共刺激分子８７－１および８７－２等；
（６）細菌のＡＤＰリボシル化毒素の解毒突然変異体、例として、コレラ毒素（ＣＴ）の野生型もしくは突然変異体形態のいずれか、例えば、公開されている国際特許出願公開第ＷＯ００／１８４３４号（また、ＷＯ０２／０９８３６８およびＷＯ０２／０９８３６９も参照されたい）に従う２９位のアミノ酸のグルタミン酸が別のアミノ酸、好ましくは、ヒスチジンで置き換えられているもの、百日咳毒素（ＰＴ）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の熱不安定性毒素（ＬＴ）、特に、ＬＴ－Ｋ６３、ＬＴ－Ｒ７２、ＣＴ－Ｓ１０９、ＰＴ－Ｋ９／Ｇ１２９（例えば、ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照されたい）；さらに、
（７）免疫賦活剤として作用して組成物の有効性を増強する、その他の物質
が挙げられる。

ムラミルペプチドとして、これらに限定されないが、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－スレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）等が挙げられる。

本発明のある実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドをアジュバントとして含む。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、本明細書で使用する場合、免疫賦活性ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）を指し、したがって、別段の記載がない限り、これらの用語を交換可能に使用する。免疫賦活性ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、１つまたは複数の免疫賦活性ＣｐＧモチーフを含有し、これらのモチーフは、シトシン－グアニンの非メチル化ジヌクレオチドであり、特定の好ましい塩基構成内に存在していてもよい。ＣｐＧ免疫賦活性モチーフのメチル化状況は一般に、ジヌクレオチド中のシトシン残基について言及する。少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、リン酸結合により３’グアニンに連結する５’非メチル化シトシンを含有し、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ－９）に結合することによって、免疫系を活性化するオリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有することができ、この場合、免疫系を、ＴＬＲ９を介して活性化するが、活性化は、ＣｐＧモチーフがメチル化されていない場合ほどには強くない。ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドもまた包含し得る１つまたは複数の回文構造を含むことができる。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２１４，８０６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；および第６，３３９，０６８号を含めた、いくつかの発行されている特許、公開されている特許出願、およびその他の刊行物に記載されている。

本発明のある実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物は、ＷＯ２０１０／１２５４８０、３頁２２行～１２頁３６行に記載されているＣｐＧオリゴヌクレオチドのいずれかを含む。

異なるクラスのＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドが同定されている。これらは、Ａクラス、Ｂクラス、ＣクラスおよびＰクラスと呼ばれ、ＷＯ２０１０／１２５４８０、３頁２２行～１２頁３６行により詳細に記載されている。本発明の方法は、これらの異なるクラスのＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドの使用を包含する。

本発明のある実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物は、ＡクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、本発明の「Ａクラス」のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、核酸配列：５’ＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧ３’（配列番号：１）を有する。Ａクラスのオリゴヌクレオチドのいくつかの非限定的な例は、５’Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＿Ｇ＿Ａ＿Ｃ＿Ｇ＿Ａ＿Ｃ＿Ｇ＿Ｔ＿Ｃ＿Ｇ＿Ｔ＿Ｇ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ３’（配列番号：２）を含み、ここで、＊は、ホスホロチオエート結合を指し、＿は、リン酸ジエステル結合を指す。

本発明のある実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物は、ＢクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、本発明において使用するためのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、少なくとも式：５’Ｘ_１Ｘ_２ＣＧＸ_３Ｘ_４３’により示されるＢクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドであり、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、ヌクレオチドである。一実施形態では、Ｘ_２は、アデニン、グアニンまたはチミンである。別の実施形態では、Ｘ_３は、シトシン、アデニンまたはチミンである。

本発明のＢクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドの配列は、上記の米国特許第６，１９４，３８８号、第６，２０７，６４６号、第６，２１４，８０６号、第６，２１８，３７１号、第６，２３９，１１６号および第６，３３９，０６８号に広く記載されている配列である。例示的な配列として、これらに限定されないが、こうした最近の出願および特許に開示されている配列が挙げられる。

ある実施形態では、本発明の「Ｂクラス」のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、核酸配列：
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ３’（配列番号３）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣＧＴＴＴＴ３’（配列番号４）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ３’（配列番号５）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ３’（配列番号６）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＴＴＴＣＧＡ３’（配列番号７）
を有する。

これらの配列のいずれにおいても、全ての連結はいずれも、ホスホロチオエート結合であり得る。別の実施形態では、これらの配列のいずれにおいても、１つまたは複数の連結が、リン酸ジエステルであり得、好ましくは、ＣｐＧモチーフの「Ｃ」と「Ｇ」との間でセミソフトなＣｐＧオリゴヌクレオチドをなす。これらの配列のいずれにおいても、エチル－ウリジンまたはハロゲンで、５’Ｔを置換することができ；ハロゲン置換の例として、これらに限定されないが、ブロモ－ウリジン置換またはヨード－ウリジン置換が挙げられる。

Ｂクラスのオリゴヌクレオチドのいくつかの非限定的な例として、
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ３’（配列番号８）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ３’（配列番号９）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ３’（配列番号１０）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ３’（配列番号１１）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ３’（配列番号１２）
が挙げられ、
ここで、＊は、ホスホロチオエート結合を指す。

本発明のある実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物は、ＣクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。ある実施形態では、本発明の「Ｃクラス」のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、核酸配列：
５’ＴＣＧＣＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１３）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１４）、または
５’ＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１５）、または
５’ＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１６）、または
５’ＴＣＧＣＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１７）、または
５’ＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１８）、または
５’ＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１９）、または
５’ＴＣＧＣＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号２０）、または
５’ＴＣＧＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号２１）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号２２）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧ３’（配列番号２３）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧ３’（配列番号２４）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＴ３’（配列番号２５）
を有する。

これらの配列のいずれにおいても、全ての連結はいずれも、ホスホロチオエート結合であり得る。別の実施形態では、これらの配列のいずれにおいても、１つまたは複数の連結が、リン酸ジエステルであり得、好ましくは、ＣｐＧモチーフの「Ｃ」と「Ｇ」との間でセミソフトなＣｐＧオリゴヌクレオチドをなす。

Ｃクラスのオリゴヌクレオチドのいくつかの非限定的な例として、
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号２６）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号２７）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号２８）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号２９）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３０）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３１）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３２）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３３）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３４）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３５）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３６）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３７）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ３’（配列番号３８）
が挙げられ、
ここで、＊は、ホスホロチオエート結合を指し、＿は、リン酸ジエステル結合を指す。

これらの配列のいずれにおいても、エチル－ウリジンまたはハロゲンで、５’Ｔを置換することができ；ハロゲン置換の例として、これらに限定されないが、ブロモ－ウリジン置換またはヨード－ウリジン置換が挙げられる。

本発明のある実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物は、ＰクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。ある実施形態では、本発明において使用するためのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’ＴＬＲ活性化ドメインおよび少なくとも２つの回文構造領域を含有するＰクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドであり、１つの回文構造領域は、少なくとも６ヌクレオチド長の５’回文構造領域であり、少なくとも８ヌクレオチド長の３’回文構造領域に直接またはスペーサーを介して接続し、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＹｐＲジヌクレオチドを含む。ある実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ（配列番号：２７）ではない。一実施形態では、ＰクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ＴＬＲ活性化ドメインは、ＴＣＧ、ＴＴＣＧ、ＴＴＴＣＧ、ＴＹｐＲ、ＴＴＹｐＲ、ＴＴＴＹｐＲ、ＵＣＧ、ＵＵＣＧ、ＵＵＵＣＧ、ＴＴＴまたはＴＴＴＴである。さらに別の実施形態では、ＴＬＲ活性化ドメインは、５’回文構造領域内にある。別の実施形態では、ＴＬＲ活性化ドメインは、５’回文構造領域に対して直接５’側にある。

ある実施形態では、本発明の「Ｐクラス」のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、核酸配列：５’ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号：３９）を有する。

前記配列において、全ての連結はいずれも、ホスホロチオエート結合であり得る。別の実施形態では、１つまたは複数の連結が、リン酸ジエステルであり得、好ましくは、ＣｐＧモチーフの「Ｃ」と「Ｇ」との間でセミソフトなＣｐＧオリゴヌクレオチドをなす。これらの配列のいずれにおいても、エチル－ウリジンまたはハロゲンで、５’Ｔを置換することができ；ハロゲン置換の例として、これらに限定されないが、ブロモ－ウリジン置換またはヨード－ウリジン置換が挙げられる。

Ｐクラスのオリゴヌクレオチドの非限定的な例として、
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号：４０）
が挙げられ、
ここで、＊は、ホスホロチオエート結合を指し、＿は、リン酸ジエステル結合を指す。

一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのリン酸ジエステル様連結を含む。別の実施形態では、リン酸ジエステル様連結は、リン酸ジエステル連結である。別の実施形態では、親油性基が、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている。一実施形態では、親油性基はコレステロールである。

ある実施形態では、本明細書に開示するＣｐＧオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド間連結が、リン酸ジエステル結合（ＰＣＴ出願ＷＯ２００７／０２６１９０の記載に従う「ソフトな」オリゴヌクレオチド）である。別の実施形態では、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドを、分解に対して抵抗性となす（例えば、安定化させる）。「安定化されたオリゴヌクレオチド」は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる）分解に対して比較的抵抗性であるオリゴヌクレオチドを指す。核酸の安定化は、骨格の改変を介して達成することができる。ホスホロチオエート連結を有するオリゴヌクレオチドは、最大の活性をもたらし、オリゴヌクレオチドを細胞内のエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼによる分解から保護する。

免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、キメラ骨格を有し得、この骨格は、リン酸ジエステル連結とホスホロチオエート連結との組合せを有する。本発明の目的では、キメラ骨格は、部分的に安定化された骨格を指し、ここで、少なくとも１つのヌクレオチド間連結が、リン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様であり、少なくとも１つのその他のヌクレオチド間連結が安定化されたヌクレオチド間連結であり、上記少なくとも１つのリン酸ジエステル連結またはリン酸ジエステル様連結と、上記少なくとも１つの安定化された連結とが異なる。リン酸ジエステル連結を、ＣｐＧモチーフ内に選択的に位置させる場合、そのような分子を、ＰＣＴ出願ＷＯ２００７／０２６１９０の記載に従って「セミソフトな」分子と呼ぶ。

また、ＣｐＧオリゴヌクレオチドのサイズ（すなわち、オリゴヌクレオチドの長さに沿うヌクレオチド残基の数）も、オリゴヌクレオチドの賦活活性に寄与し得る。細胞内への取込みを促進するために、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、好ましくは、６ヌクレオチド残基の最小長を有する。６ヌクレオチド超の任意のサイズのオリゴヌクレオチドも（数ｋｂ長のオリゴヌクレオチドであっても）、十分な免疫賦活性モチーフが存在するならば、免疫応答を誘発することが可能であり、これは、より大きなオリゴヌクレオチドは、細胞内部で分解されるからである。特定の実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、６～１００ヌクレオチド長、優先的に、８～３０ヌクレオチド長である。重要な実施形態では、本発明の核酸およびオリゴヌクレオチドは、プラスミドおよび発現ベクターではない。

ある実施形態では、本明細書に開示するＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＷＯ２００７／０２６１９０、段落１３４～１４７の記載に従い、塩基および／糖中等に置換または修飾を含む。

ある実施形態では、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドを、化学的に修飾する。化学的修飾の例は、当業者に公知であり、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ Ｅ．ら（１９９０）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、９０：５４３、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＵＳＡ、１９９３；Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ら（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、３６：１０７～１２９；およびＨｕｎｚｉｋｅｒ Ｊ．ら、（１９９５）Ｍｏｄ．Ｓｙｎｔｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、７：３３１～４１７に記載されている。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾を有し得、それぞれの修飾が、天然のＤＮＡまたはＲＮＡで構成される同じ配列のオリゴヌクレオチドと比較して、特定のリン酸ジエステルヌクレオシド間架橋に、および／または特定のβ－Ｄ－リボース単位に、および／または特定の天然のヌクレオシド塩基の位置に存在する。

当業者に公知の方法に従って、本発明のいくつかの実施形態では、ＣｐＧ含有核酸を、免疫原性の担体と単に混合してもよいであろう（例えば、ＷＯ０３／０２４４８０を参照されたい）。

本発明の特定の実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物はいずれも、２μｇ～１００ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、好ましくは、０．１ｍｇ～５０ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、好ましくは、０．２ｍｇ～１０ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、好ましくは、０．３ｍｇ～５ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは、０．５～２ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは、０．７５～１．５ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物は、およそ１ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。

好ましい実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択されるアルミニウムに基づくアジュバントである。一実施形態では、本明細書に記載する免疫原性組成物は、アジュバントのリン酸アルミニウムを含む。

好ましい実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、緩衝液、凍結保護剤、塩、二価カチオン、非イオン性洗剤、フリーラジカル酸化阻害剤、希釈剤または担体のうちの少なくとも１つをさらに含む。

免疫原性組成物は、これらに限定されないが、トリス（トロメタミン）、リン酸、酢酸、ホウ酸、クエン酸、グリシン、ヒスチジンおよびコハク酸から選択される１つまたは複数の生理的に許容できる緩衝液を含んでいてもよい。特定の実施形態では、製剤を、約５．０～約７．０、好ましくは、約５．５～約６．５のｐＨ範囲内に緩衝する。

免疫原性組成物は、１つまたは複数の非イオン性界面活性剤を任意選択により含むことができ、これらに限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート－８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリソルベート－６０（Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリソルベート－４０（Ｔｗｅｅｎ４０）およびポリソルベート－２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、これらに限定されないが、Ｂｒｉｊ５８、Ｂｒｉｊ３５、およびその他、例として、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００；Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、ＮＰ４０を含めた、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｓｐａｎ８５、ならびにＰｌｕｒｏｎｉｃ系の非イオン性界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ１２１）が挙げられる。好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、ポリソルベート－８０またはポリソルベート－４０、好ましくは、ポリソルベート－８０を含む。好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、ポリソルベート－８０を約０．００１％～約２％（約０．２５％までが好ましい）の濃度で、またはポリソルベート－４０を約０．００１％～１％（約０．５％までが好ましい）の濃度で含む。

本発明はさらに、本発明の免疫原性組成物を含むワクチンにも関する。

免疫応答を誘発し、感染から防御するための方法
本開示はまた、本明細書に記載する免疫原性組成物についての使用方法も含む。例えば、本開示の一実施形態は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する免疫応答を誘発する方法であって、免疫原性量の、本明細書に記載する免疫原性組成物のいずれかを対象に投与するステップを含む方法を提供する。

本開示の一実施形態は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染から対象を防御する方法、または肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染を予防する方法、または肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が引き起こす感染と関連がある少なくとも１つの症状の重症度を低下させるもしくはそうした症状の発生を遅延させる方法であって、免疫原性量の、本明細書に記載する免疫原性組成物のいずれかを対象に投与するステップを含む方法を提供する。

本開示の一実施形態は、血清型１５Ｂの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染から対象を防御する方法、または血清型１５Ｂの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染を予防する方法、または血清型１５Ｂの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が引き起こす感染と関連がある少なくとも１つの症状の重症度を低下させるもしくはそうした症状の発生を遅延させる方法であって、免疫原性量の、本明細書に記載する免疫原性組成物のいずれかを対象に投与するステップを含む方法を提供する。

本開示の一実施形態は、血清型１５Ｃの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染から対象を防御する方法、または血清型１５Ｃの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染を予防する方法、または血清型１５Ｃの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が引き起こす感染と関連がある少なくとも１つの症状の重症度を低下させるもしくはそうした症状の発生を遅延させる方法であって、免疫原性量の、本明細書に記載する免疫原性組成物のいずれかを対象に投与するステップを含む方法を提供する。

本開示の一実施形態は、血清型１５Ａの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染から対象を防御する方法、または血清型１５Ａの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染を予防する方法、または血清型１５Ａの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が引き起こす感染と関連がある少なくとも１つの症状の重症度を低下させるもしくはそうした症状の発生を遅延させる方法であって、免疫原性量の、本明細書に記載する免疫原性組成物のいずれかを対象に投与するステップを含む方法を提供する。

本開示の一実施形態は、対象において、血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／または１５Ｃ（好ましくは、１５Ｂおよび／または１５Ｃ、より好ましくは、１５Ｂ）の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と関連がある肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染、疾患または状態を治療または予防する方法であって、治療有効量または予防有効量の本明細書に記載する免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。別の実施形態は、対象において、血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／または１５Ｃ（好ましくは、１５Ｂおよび／または１５Ｃ、より好ましくは、１５Ｂ）の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と関連がある肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染、疾患または状態を治療または予防する方法であって、本明細書に記載する免疫原性組成物からポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の調製物を作製するステップと、前記抗体調製物を使用して、受動免疫を対象に付与するステップとを含む方法を提供する。

一実施形態では、本開示は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染から対象を防御するため、ならびに／または肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染を予防するため、ならびに／または肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が引き起こす感染と関連がある少なくとも１つの症状の重症度を低下させるもしくはそうした症状の発生を遅延させるため、ならびに／または血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ（好ましくは、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ、より好ましくは、１５Ｂ）の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染から対象を防御するため、ならびに／または血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ（好ましくは、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ、より好ましくは、１５Ｂ）の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染を予防するため、ならびに／または血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ（好ましくは、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ、より好ましくは、１５Ｂ）の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が引き起こす感染と関連がある少なくとも１つの症状の重症度を低下させるもしくはそうした症状の発生を遅延させるための医薬品を製造するために、本明細書に開示する免疫原性コンジュゲートまたは免疫原性組成物を使用することに関する。

一実施形態では、本開示は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染から対象を防御するため、ならびに／または肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染を予防するため、ならびに／または肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が引き起こす感染と関連がある少なくとも１つの症状の重症度を低下させるもしくはそうした症状の発生を遅延させるため、ならびに／または血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ（好ましくは、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ、より好ましくは、１５Ｂ）の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染から対象を防御するため、ならびに／または血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ（好ましくは、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ、より好ましくは、１５Ｂ）の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染を予防するため、ならびに／または血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ（好ましくは、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ、より好ましくは、１５Ｂ）の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が引き起こす感染と関連がある少なくとも１つの症状の重症度を低下させるもしくはそうした症状の発生を遅延させるために、本明細書に開示する免疫原性コンジュゲートまたは免疫原性組成物を使用することに関する。

免疫原性組成物に対する「免疫応答」とは、対象中で、目的の免疫原性組成物またはワクチン組成物中に存在する分子に対して、液性および／または細胞媒介型の免疫応答が発生することである。本開示の目的では、「液性の免疫応答」は、抗体が媒介する免疫応答であり、本開示の免疫原性組成物またはワクチン中の抗原を認識し、何らかの親和性でそれに結合する抗体を誘発および生成し、一方、「細胞媒介型の免疫応答」は、Ｔ細胞および／またはその他の白血球細胞が媒介する免疫応答である。「細胞媒介型の免疫応答」は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のクラスＩもしくはクラスＩＩの分子、ＣＤ１またはその他の非古典的なＭＨＣ様分子と会合したかたちで抗原性エピトープを提示することにより惹起される。これにより、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞、またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞（「ＣＴＬ」）が活性化される。古典的または非古典的なＭＨＣがコードし、細胞表面上に発現するタンパク質と会合したかたちで提示されるペプチド抗原に対して、ＣＴＬは特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内の微生物の細胞内での破壊、またはそのような微生物に感染した細胞の溶解を誘発および促進するのに役立つ。細胞性免疫の別の態様では、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答が関与する。ヘルパーＴ細胞の作用は、細胞表面上に古典的または非古典的なＭＨＣ分子を伴ってペプチドまたはその他の抗原を呈する細胞に対して、非特異的エフェクター細胞の機能を賦活し、その活性を集中させるのに役立つ。「細胞媒介型の免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイン、さらに、活性化したＴ細胞ならびに／またはＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来する細胞を含めた、その他の白血球細胞が生成するその他のそのような分子が生成されることも指す。特定の抗原または組成物の、細胞媒介型の免疫学的応答を賦活する能力を、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイ等のいくつかのアッセイ、感作された対象における、その抗原に特異的なＴリンパ球をアッセイすること、または抗原での再刺激に応答したＴ細胞によるサイトカイン生成を測定することによって決定することができる。そのようなアッセイは、当技術分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：４１８９～４１９９；およびＤｏｅら（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２３６９～２３７６を参照されたい。

本明細書で使用する場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（その変化形、例えば、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療した（ｔｒｅａｔｅｄ）」を含む）は、以下の１つまたは複数のいずれかを意味する：（ｉ）従来のワクチンにおいて行われている感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の重症度の低下または症状の排除、および（ｉｉｉ）問題の病原体または障害の実質的または完全な排除。したがって、治療は、（感染に先立って）予防的に行う、または（感染後に）治療的に行うことができる。本開示では、予防的治療が、好ましい様式である。本開示の特定の実施形態によれば、血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／または１５Ｃ（好ましくは、１５Ｂおよび／または１５Ｃ、より好ましくは、１５Ｂ）の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染に対して、宿主動物を、予防的および／または治療的に免疫することを含め、治療する組成物および方法を提供する。本開示の方法は、予防的および／または治療的な免疫を対象に付与するのに有用である。また、本開示の方法は、生物医学的研究に応用するために、対象に対して実行することもできる。

「免疫原性量」および「免疫学的有効量」の両方を、本明細書では交換可能に使用し、これらは、当業者に公知の標準的なアッセイにより測定する場合に、（Ｔ細胞による）細胞性応答または（Ｂ細胞もしくは抗体による）液性応答のいずれかまたは両方の免疫応答を惹起するのに十分な抗原または免疫原性組成物の量を指す。

好ましい実施形態では、前記対象はヒトである。最も好ましい実施形態では、前記対象は、新生児（すなわち、年齢：３カ月未満）、乳児（年齢：３カ月～１歳）、または幼児（すなわち、年齢：１～４歳）である。

ある実施形態では、本明細書に開示する免疫原性組成物は、ワクチンとして使用するためのものである。

そのような実施形態では、ワクチンを接種すべき対象は、１歳未満である。例えば、ワクチンを接種すべき対象は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２カ月であり得る。ある実施形態では、ワクチンを接種すべき対象は、約２、４または６カ月である。別の実施形態では、ワクチンを接種すべき対象は、２歳未満である。例えば、ワクチンを接種すべき対象は、約１２～１５カ月であり得る。場合によっては、わずか１回の用量の本発明に従う免疫原性組成物を必要とするに過ぎないが、状況によっては、第２、第３または第４の用量を投与する場合もある（レジメンのセクションを参照されたい）。

本発明のある実施形態では、ワクチンを接種すべき対象は、年齢５０歳以上のヒト成人、より好ましくは、年齢５５歳以上のヒト成人である。ある実施形態では、ワクチンを接種すべき対象は、年齢６５歳以上、年齢７０歳以上、年齢７５歳以上、または年齢８０歳以上のヒト成人である。

ある実施形態では、ワクチンを接種すべき対象は、免疫が低下した個体、特に、ヒトである。一般に、免疫が低下した個体を、感染性病原体による攻撃に対し、正常な液性または細胞性の防御を開始する能力の減弱または低下を示す人と定義する。

本発明のある実施形態では、ワクチンを接種すべき、免疫が低下した対象は、免疫系を損傷し、その結果、抗体応答が肺炎球菌疾患を防御するまたはそれに対処するのに不十分である疾患または状態に罹患している。

ある実施形態では、前記疾患は、原発性免疫不全障害である。好ましくは、前記原発性免疫不全障害は、Ｔ細胞およびＢ細胞の複合型免疫不全、抗体の欠乏、明確に定義された症候群、免疫調節不全疾患、貪食細胞障害、自然免疫の欠乏、自己炎症性の障害、ならびに補体の欠乏からなる群から選択される。ある実施形態では、前記原発性免疫不全障害は、ＰＣＴ出願ＷＯ２０１０／１２５４８０、２４頁１１行～２５頁１９行に開示されているものから選択される。

本発明の特定の実施形態では、ワクチンを接種すべき、免疫が低下した対象は、ＨＩＶ感染、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、癌、慢性の心臓または肺の障害、うっ血性心不全、糖尿病、慢性肝臓疾患、アルコール依存、硬変、脊髄液漏出、心筋症、慢性気管支炎、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、脾臓機能不全（例として、鎌状赤血球症）、脾臓機能の欠如（無脾症）、血液の悪性病変、白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病、リンパ腫、腎臓不全、ネフローゼ症候群および喘息からなる群から選択される疾患に罹患している。

本発明のある実施形態では、ワクチンを接種すべき、免疫が低下した対象は、栄養不良に陥っている。

本発明の特定の実施形態では、ワクチンを接種すべき、免疫が低下した対象は、感染に対する身体の抵抗性を低下させる薬物または治療を施されている。ある実施形態では、前記薬物は、ＰＣＴ出願ＷＯ２０１０／１２５４８０、２６頁３３行～２６頁４０行に開示されているものから選択される。

本発明の特定の実施形態では、ワクチンを接種すべき、免疫が低下した対象は、喫煙者である。

本発明の特定の実施形態では、ワクチンを接種すべき、免疫が低下した対象は、１リットル当たり５×１０^９個未満の細胞、または１リットル当たり４×１０^９個未満の細胞、または１リットル当たり３×１０^９個未満の細胞、または１リットル当たり２×１０^９個未満の細胞、または１リットル当たり１×１０^９個未満の細胞、または１リットル当たり０．５×１０^９個未満の細胞、または１リットル当たり０．３×１０^９個未満の細胞、または１リットル当たり０．１×１０^９個未満の細胞の白血球細胞のカウント数（白血球のカウント数）を有する。

白血球細胞のカウント数（白血球のカウント数）：血中の白血球細胞（ＷＢＣ）の数。ＷＢＣは通常、ＣＢＣ（全血球数）の一部として測定される。白血球細胞は、血中の、感染と戦う細胞であり、赤血球として公知の、赤色の（酸素を運搬する）血液細胞とは明確に異なる。異なる型の白血球細胞があり、それらには、好中球（多型核白血球；ＰＭＮ）、帯状核細胞（やや未熟な好中球）、Ｔ型リンパ球（Ｔ細胞）、Ｂ型リンパ球（Ｂ細胞）、単核球、好酸球および好塩基球がある。全ての型の白血球細胞が、白血球細胞のカウント数として反映される。白血球細胞のカウント数についての正常範囲は通常、血液１立方ミリメートル当たり４，３００～１０，８００個の細胞である。これはまた、白血球のカウント数と呼ぶ場合もあり、国際単位として、１リットル当たり４．３～１０．８×１０^９個の細胞と表わすことができる。

本発明の特定の実施形態では、ワクチンを接種すべき、免疫が低下した対象は、好中球減少症に罹患している。本発明の特定の実施形態では、ワクチンを接種すべき、免疫が低下した対象は、１リットル当たり２×１０^９個未満の細胞、または１リットル当たり１×１０^９個未満の細胞、または１リットル当たり０．５×１０^９個未満の細胞、または１リットル当たり０．１×１０^９個未満の細胞、または１リットル当たり０．０５×１０^９個未満の細胞の好中球のカウント数を有する。

低い白血球のカウント数または「好中球減少症」は、循環血液中の好中球の異常に低いレベルにより特徴付けられる状態である。好中球は、感染を予防したり、感染と戦ったりするのに役立つ特定の種類の白血球細胞である。癌患者が好中球減少症を経験する最も一般的な理由は、化学療法の副作用である。化学療法誘発性の好中球減少症により、患者の感染リスクが増加し、癌治療に混乱が生じる。

本発明の特定の実施形態では、ワクチンを接種すべき、免疫が低下した対象は、５００個／ｍｍ^３未満のＣＤ４＋細胞のカウント数、または３００個／ｍｍ^３未満のＣＤ４＋細胞のカウント数、または２００個／ｍｍ^３未満のＣＤ４＋細胞のカウント数、または１００個／ｍｍ^３未満のＣＤ４＋細胞のカウント数、または７５個／ｍｍ^３未満のＣＤ４＋細胞のカウント数、または５０個／ｍｍ^３未満のＣＤ４＋細胞のカウント数を有する。

ＣＤ４細胞試験は通例、１ｍｍ^３中の細胞の数として報告される。正常なＣＤ４のカウント数は、５００～１６００個の間であり、ＣＤ８のカウント数は、３７５～１１００個の間である。ＣＤ４のカウント数は、ＨＩＶを有する人々において劇的に低下する。

本発明ある実施形態では、任意の本明細書に開示する免疫が低下した対象は、ヒト男性またはヒト女性である。

組成物中のコンジュゲートの量は一般に、そのコンジュゲートについての、多糖体、すなわち、コンジュゲートされている多糖体とコンジュゲートされていない多糖体の総量に関して計算する。例えば、２０％の遊離の多糖体を有するコンジュゲートは、１００μｇの多糖体の用量中に、約８０μｇのコンジュゲートされている多糖体および約２０μｇのコンジュゲートされていない多糖体を有する。コンジュゲートの用量を計算する場合、コンジュゲートへのタンパク質の寄与は通常考慮されない。一般に各用量が多糖体を、０．１～１００μｇ、特定すると０．１～１０μｇ、より特定すると１～１０μｇ、より特定すると１～５μｇ含む。好ましくは、各用量は多糖体を、約１．１、２、２．２、３、３．３、４、４．４ｍｇ含む。

特定の免疫原性組成物またはワクチンのための構成成分の最適な量を、対象における適切な免疫応答を観察する標準的な研究により確かめることができる。対象に、最初のワクチン接種の後、１回または数回のブースター免疫を、適切に間隔を開けて行うことができる。

増殖アッセイ；細胞溶解アッセイ、例として、Ｔ細胞の、その特異的標的細胞を溶解させる能力を測定するためのクロム放出アッセイ；または血清中の抗原に特異的な循環抗体のレベルを測定することによって、Ｂ細胞の活性のレベルを測定することのいずれかにより、抗原の、免疫原としての有効性を測定することができる。また、免疫応答は、抗原の投与後に誘発される抗原特異的抗体の血清レベルを測定することによって、より具体的には、本明細書の記載に従って、そのようにして誘発される抗体の、特定の白血球細胞のオプソニン化貪食能力を増強する能力を測定することによって検出することもできる。免疫した宿主を、投与されている抗原でチャレンジすることによって、免疫応答の防御レベルを測定することができる。例えば、免疫応答が所望される抗原が細菌である場合には、動物を細菌細胞でチャレンジした後で、抗原の免疫原性量により誘発される防御レベルを、パーセント生存率またはパーセント死亡率を検出することによって測定する。一実施形態では、細菌感染と関連がある少なくとも１つの症状、例えば、感染と関連がある発熱を測定することによって、防御の量を測定することができる。多抗原型または複数構成成分のワクチンまたは免疫原性組成物中の各抗原の量は、その他の構成成分のそれぞれに関して変化させ、そうした量は、当業者に公知の方法により決定することができる。そのような方法は、免疫原性および／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける効能を測定するための手順を含むであろう。

本開示は、本開示の莢膜多糖体または免疫原性コンジュゲートに特異的かつ選択的に結合する抗体および抗体組成物をさらに提供する。いくつかの実施形態では、本開示の莢膜多糖体または免疫原性コンジュゲートを対象に投与すると、抗体が生じる。いくつかの実施形態では、本開示は、１つまたは複数の本開示の莢膜多糖体または免疫原性コンジュゲートに対して作られ、精製または単離した抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、動物効能モデル中でまたはオプソニン化貪食作用死滅アッセイにより細菌を死滅させることによって測定する場合に機能を示す。いくつかの実施形態では、本開示の抗体により、受動免疫が対象に付与される。本開示は、当業者に周知の技法を使用して、本開示の抗体もしくは抗体断片をコードするポリヌクレオチド分子、および細胞、細胞株（例として、ハイブリドーマ細胞、もしくは抗体を組換えにより生成するための、その他の工学的に作製された細胞株）、または本開示の抗体を生成するトランスジェニック動物、または抗体組成物をさら提供する。

（実施例１）
単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体の調製
１．１ 発酵および精製
血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、当業者に公知の単離の手順を使用して細菌から直接得ることができる（例えば、米国特許出願公開第２００６０２２８３８０号、第２００６０２２８３８１号、第２００７０１８４０７１号、第２００７０１８４０７２号、第２００７０２３１３４０号および第２００８０１０２４９８号、またはＷＯ２００８１１８７５２に開示されている方法を参照されたい）。血清型１５Ｂの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、培養ボトル中で増殖し、次いで、培養発酵槽に移した。細胞が標的とする光学密度に達したら、細胞を生産用発酵槽に移した。発酵ブロスを、Ｎ－ラウロイルサルコシンを添加することによって不活性化し、限外ろ過および透析ろ過により精製した。

次いで、精製した肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ多糖体を、ＰＡＮＤＡ２Ｋ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（登録商標）（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ）を使用する高圧ホモジナイゼーションによりサイズ調節して、単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ多糖体を生成した。

好ましくは、上記のプロセスにより得られる単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含み、５０ｋＤａ～５００ｋＤａ、好ましくは、１５０～３５０ｋＤａの間の分子量を有する。

１．２ 単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体の酸化
多糖体の酸化を、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０±０．２）中で、２．０ｇ／Ｌの多糖体の最終濃度を得るように計算された量の５００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）およびＷＦＩを逐次添加することによって実施した。必要であれば、反応ｐＨを、およそｐＨ６．０に調整した。ｐＨ調整の後に、反応温度を、２３±２℃に調整した。酸化を、およそ０．２５モル当量の過ヨウ素酸ナトリウムを添加することによって開始した。酸化反応を、２３±２℃でおよそ１６時間の間実施した。

活性型多糖体の濃縮および透析ろ過を、１０ＫのＭＷＣＯ限外ろ過カセットを使用して実施した。透析ろ過を、２０倍のダイア容量のＷＦＩに対して実施した。次いで、精製した活性型多糖体を、５±３℃で保存した。精製した活性型の糖をとりわけ、（ｉ）比色分析アッセイによる糖の濃度；（ｉｉ）比色分析アッセイによるアルデヒドの濃度；（ｉｉｉ）酸化の程度、（ｉｖ）ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳによる分子量、ならびに（ｖ）Ｏ－アセチルおよびグリセロールの存在により特徴付けた。

ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳを使用して、多糖体および多糖体－タンパク質のコンジュゲートの分子量を決定した。ＳＥＣを使用して、多糖体を流体力学的容積により分離した。屈折率（ＲＩ）検出器および多角レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器を使用して、分子量を決定した。光が物質と相互作用すると、光は散乱し、散乱光の量は、濃度、ｄｎ／ｄｃ（比屈折率の増加量）の二乗、および物質のモル質量と関係がある。分子量の測定値を、ＭＡＬＬＳ検出器から得られる散乱光のシグナルおよびＲＩ検出器から得られる濃度のシグナルに由来する読取りに基づいて計算する。

活性型多糖体の酸化の程度（ＤＯ＝糖反復単位のモル数／アルデヒドのモル数）を、以下に従って決定した。糖反復単位のモル数を、種々の比色分析法により、例えば、アンスロン法を使用して決定する。アンスロン法により、多糖体は最初に、硫酸および熱の作用により単糖に分解される。アンスロン試薬がヘキソースと反応して、黄緑色の複合体を形成し、この吸光度を６２５ｎｍで分光光学的に読み取る。アッセイの範囲内では、吸光度は、存在するヘキソースの量に直接比例する。

また、アルデヒドのモル数も、ＭＢＴＨ比色分析法を使用して同時に決定する。ＭＢＴＨアッセイでは、（所与の試料に由来する）アルデヒド基を３－メチル－２－ベンゾチアゾロンヒドラゾン（ＭＢＴＨアッセイ試薬）と反応させることによって、アジン化合物を形成する。過剰量の３－メチル－２－ベンゾチアゾロンヒドラゾンは酸化して、反応性カチオンを形成する。反応性カチオンとアジンが反応して、青色の発色団を形成する。次いで、形成した発色団を、６５０ｎｍで分光学的に読み取る。

好ましくは、上記のプロセスにより得られる活性型肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含み、５０ｋＤａ～５００ｋＤａ、好ましくは、１００～２５０ｋＤａの間の分子量を有する。

１．３ 活性型肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体のＣＲＭ_１９７とのコンジュゲーション
コンジュゲーションのプロセスは、
ａ）スクロース賦形剤と混ぜ合わせ、凍結乾燥を行うステップと、
ｂ）凍結乾燥した活性型多糖体およびＣＲＭ_１９７を復元するステップと、
ｃ）活性型多糖体をＣＲＭ_１９７にコンジュゲートさせ、キャップするステップと、
ｄ）コンジュゲートを精製するステップと
からなる。

ａ）スクロース賦形剤と混ぜ合わせ、凍結乾燥を行うステップ
活性型多糖体をスクロースと混ぜ合わせて、活性型多糖体１グラム当たり２５グラムのスクロースの比とした。次いで、混ぜ合わせた混合物のボトルを凍結乾燥した。凍結乾燥に続き、凍結乾燥した活性型多糖体を含有するボトルを、－２０±５℃で保存した。計算量のＣＲＭ_１９７タンパク質を別途、シェルフリーズおよび凍結乾燥した。凍結乾燥したＣＲＭ_１９７を、－２０±５℃で保存した。

ｂ）凍結乾燥した活性型多糖体およびＣＲＭ_１９７タンパク質を復元するステップ
凍結乾燥した活性型多糖体を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元した。多糖体が完全に溶解したら、等しい量の無水ＤＭＳＯを凍結乾燥したＣＲＭ_１９７に添加して、復元を行った。

ｃ）コンジュゲートさせ、キャップするステップ
反応槽中で、復元した活性型多糖体を復元したＣＲＭ_１９７と組み合わせ（投入量の比：０．８：１）、続いて、徹底的に混合して、透明溶液を得てから、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いてコンジュゲーションを開始した。反応溶液中の多糖体の最終濃度は、およそ１ｇ／Ｌである。コンジュゲーションを、反応混合物に１．０～１．５ＭＥｑのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加することによって開始し、インキュベーションを２３±２℃で４０～４８時間行った。２ＭＥｑの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_４）を添加して、未反応のアルデヒドをキャップすることによって、コンジュゲーション反応を止めた。このキャッピング反応を、２３±２℃で３±１時間継続した。

ｄ）コンジュゲートを精製するステップ
コンジュゲート溶液を、１００～３００ＫのＭＷＣＯメンブランを使用するタンジェンシャルフローろ過による精製に備えて、冷やした５ｍＭコハク酸－０．９％生理食塩水（ｐＨ６．０）を用いて１：１０に希釈した。希釈したコンジュゲート溶液を５μｍのフィルターに通し、透析ろ過を、媒体として５ｍＭコハク酸－０．９％生理食塩水（ｐＨ６．０）を使用して実施した。透析ろ過の完了の後に、コンジュゲート保持液を０．２２μｍのフィルターに通した。

コンジュゲートを、５ｍＭコハク酸／０．９％生理食塩水（ｐＨ６）を用いてさらに希釈して、およそ０．５ｍｇ／ｍＬの糖の標的濃度を得た。最後の０．２２μｍのろ過のステップを完了して、免疫原性コンジュゲートを得た。

好ましくは、上記のプロセスにより得られるコンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ当たり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含み、３０００～２００００ｋＤａの間の分子量を有し、２～６の間のコンジュゲーションの程度を有する。

（実施例２）
ＣＲＭ_１９７に共有結合的に連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体を含む免疫原性コンジュゲートの特徴付け
コンジュゲート１は、実施例１に開示したプロセスにより調製した。コンジュゲート２および３は、異なる量の酸化剤を使用する類似のプロセスにより調製した。コンジュゲート４は、類似のプロセスにより調製したが、ただし、精製した血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、サイズ調節せずに、活性化させて、より低いＤＯ（より高い酸化のレベル）を得、コンジュゲーションは、水性媒体中で実施した。コンジュゲート５は、類似のプロセスにより調製したが、ただし、精製した血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、化学的加水分解によりサイズ調節し、コンジュゲーションは、水性媒体中で実施した。コンジュゲート６および７は、類似のプロセスにより調製したが、ただし、精製した血清型１５Ｂ莢膜多糖体は、サイズ調節しなかった。

得られたコンジュゲートを特徴付け、結果を表１に要約する。

水酸化アルミニウムゲルを利用し、タンパク質および共有結合している糖を結合させて、遠心分離により除去する手順により、遊離の多糖体のパーセントを測定する。試料を、リン酸緩衝水酸化アルミニウムゲルと混合し、遠心分離する。結合している糖は、ゲルと共にペレット化し、遊離の糖は、上清中に留まる。結果として得られた上清および対照試料を適切な比色分析アッセイにより定量して、遊離の糖のパーセントを決定し、タンパク質の除去および糖の回収が十分であることを確認する。

アミノ酸分析のために、最初に、真空かつ加熱（１６０℃、１５分間）下における６Ｎ塩酸（ＨＣｌ）による加水分解を使用して、多糖体－タンパク質の試料を加水分解して、遊離のアミノ酸としてのその個々の構成成分を得る。加水分解の後、アミノ酸分析装置を使用して、試料を分析する。個々のアミノ酸を、クエン酸ナトリウム緩衝液の段階的勾配を使用するイオン交換クロマトグラフィーにより、温度および流速を変化させて分離する。分離の後、各アミノ酸の残留量を、ポストカラムニンヒドリンカップリング検出システムを使用して定量的に決定する。このシステムでは、ニンヒドリンを、ポストカラム反応器システム中でカラムの溶出液と混合し、混合物を光度計内に通す。ニンヒドリンが溶出したアミノ酸と反応すると、５７０ｎｍで最大吸収を示す紫色の化合物が生じる。この吸光度は、存在するα－アミノ基の量に関して、線形の応答（関数）を示し、この反応により、α－アミノ基を有する全ての有機化合物の定量的比色分析アッセイを行う。プロリンおよびヒドロキシルプロリン等の、遊離のアミノ基を有さないイミノ酸との反応では、明るい黄色の化合物が生じ、これを４４０ｎｍでモニターする。各アミノ酸についてのピーク面積を、５７０ｎｍおよび４４０ｎｍの両方の波長のアウトプットを使用して計算する。

収率を、以下に従って計算する：（コンジュゲート中の多糖体の量×１００）／活性型多糖体の量。

水性媒体中で作製したコンジュゲート（４および５）は、Ｏ－アセチルのレベルの顕著な喪失を示した。ネイティブの多糖体を使用し、ＭＷのサイズ調節は実施せず、ＤＭＳＯ溶媒中で作製したコンジュゲート（６および７）は、Ｏ－アセチルのレベルの喪失を示さなかった。しかし、ろ過特性が良好でないことに加えて、コンジュゲートの収率は非常に低かった。高圧ホモジナイゼーションによりサイズ調節した多糖体を使用して、ＤＭＳＯ中で作製したコンジュゲート（１、２および３）は、高い収率およびより良好なろ過特性を示し、Ｏ－アセチルのレベルは顕著に保存された。これらのコンジュゲートはまた、非常に低いレベルの遊離の多糖体も有していた。

（実施例３）
オプソニン化貪食活性（ＯＰＡ）アッセイ
本発明のコンジュゲートの免疫原性は、下記に記載するオプソニン化貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）を使用して評価することができる。

３０匹の６～７週齢、雌のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの群を、第０週に、０．００１μｇ、０．０１μｇまたは０．１μｇの試験用コンジュゲートを用いて、皮下経路を介して免疫した。第３週に、同じ用量のコンジュゲートを用いてマウスにブーストをかけ、次いで、第４週に採血した。血清型に特異的なＯＰＡを、第４週の血清試料に対して実施した。

ＯＰＡを使用して、マウス血清中の、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに特異的な機能性抗体を測定する。試験血清を、莢膜多糖体に特異的な免疫グロブリンの、細菌をオプソニン化し、補体沈着を引き起こし、それにより、貪食細胞による貪食作用および細菌の死滅を促進する能力を測定するアッセイ反応に供する。ＯＰＡタイターを、試験血清を有さない対照のウエルと比して細菌のカウント数の５０％の低下をもたらす希釈度の逆数と定義する。ＯＰＡタイターを、この５０％死滅のカットオフを包含する２つの希釈度から内挿する。

ＯＰＡの手順は、Ｈｕら、Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００５；１２（Ｆｅｂｒｕａｒｙ（２））：２８７～９５に記載されている方法に基づくが、以下の改変を加えた。試験血清を、２．５倍に段階希釈し、マイクロタイターアッセイプレートに添加した。血清型１５Ｂの生存標的細菌を、ウエルに添加し、プレートを、３７℃で３０分間振とうした。分化ＨＬ－６０細胞（貪食細胞）および仔ウサギの血清（３～４週齢、Ｐｅｌ－Ｆｒｅｅｚ（登録商標）、６．２５％の最終濃度）を、ウエルに添加し、プレートを、３７℃で４５分間振とうした。反応を止めるために、８０μＬの０．９％ＮａＣｌを、全てのウエルに添加し、混合し、１０μＬの一定分量を、２００μＬの水を含有する、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＨＴＳ ＨＶフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））のウエルに移した。液体は、真空下でプレートを通ってろ過され、１５０μＬのＨｙＳｏｙ培地を、各ウエルに添加し、フィルターに通した。次いで、フィルタープレートを、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートし、次いで、Ｄｅｓｔａｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて固定した。次いで、プレートを、クマシーブルーを用いて染色し、１回脱染した。コロニーを、撮像し、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＣＴＬ）のＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）上で数え上げた。未加工のコロニーのカウント数を使用して、死滅曲線をプロットし、ＯＰＡタイターを計算した。

コンジュゲート１および２の免疫原性を、上記で言及したアッセイに従って試験するに至った。１つの追加のコンジュゲート、およびコンジュゲートされていないネイティブの肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂの莢膜多糖体（非コンジュゲートＰＳ）もまた、同じアッセイ中で試験した。ネイティブの（すなわち、サイズ調節されていない）血清型１５Ｂ莢膜多糖体をＣＲＭ_１９７に水溶液中における還元的アミノ化によりコンジュゲートすることによって、コンジュゲート９を調製した。

結果を、表２に示す。

上記の表に示すように、コンジュゲート１および２は、マウスに投与すると、血清型１５Ｂの肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）をオプソニン化し、補体沈着を引き起こし、それにより、貪食細胞による貪食作用および細菌の死滅を促進することが可能な抗体を生じた。さらに、より低い分子量にもかかわらず、コンジュゲート１および２はまた、サイズ調節されていないコンジュゲート９と比較して、類似のレベルの免疫原性も示した。

（実施例４）
血清型１５Ｂと血清型１５Ｃとの間の交差機能性ＯＰＡ応答
肺炎球菌血清群１５には、４つの、構造的に関連のある血清型：１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃおよび５Ｆが含まれる。血清型１５Ｂおよび１５Ｃは、遺伝子タイピングの技法によっては区別できず、１５Ｂ－ＰＳは１５Ｃ－ＰＳのＯ－アセチル化バリアントであることを除いて、類似の莢膜多糖体（ＰＳ）組成を有する。血清型１５Ｂについての抗莢膜ＰＳ抗体が血清型１５Ｃに対して機能的な交差反応性を示すかどうかを理解するために、１０匹のウサギを、本明細書に開示するＣＲＭ_１９７に共有結合的に連結された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体を含む免疫原性コンジュゲートをいずれもその製剤の一部として含有するＰＣＶ１６ｖワクチンおよびＰＣＶ２０ｖワクチンを用いて免疫した。ワクチン接種の前および後に得られた血清を、ＯＰＡアッセイ中で、血清型１５Ｂおよび１５Ｃの標的の肺炎球菌の菌株に対して試験した。

各群からの１０匹のウサギのうち、１００％が、血清型１５Ｂコンジュゲートを用いて免疫した後に、血清型１５Ｂに対するＯＰＡ応答を示した。これらの同じ試料のうち、１００％が、血清型１５Ｃに対してもＯＰＡ応答を示した（表１および表２）。１５ＣのＯＰＡにおいて、ワクチン接種前の血清中では、低いＯＰＡタイターを観察した。しかし、ＯＰＡ中において、ワクチン接種後の血清が、ワクチン接種前と比較して１０倍超のＧＭＴ ＯＰＡタイターの増加を示したことから、本発明の免疫原性コンジュゲートが血清型１５Ｂおよび１５Ｃの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を死滅させることが可能な抗体の形成を誘発することが実証された。

ＰＣＶ１６ｖは、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ（１６ｖＰｎＣ）に由来し、いずれもがＣＲＭ_１９７に個々にコンジュゲートしている糖コンジュゲートを含む１６価のコンジュゲート組成物である。

ＰＣＶ２０ｖは、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ（２０ｖＰｎＣ）に由来し、いずれもがＣＲＭ_１９７に個々にコンジュゲートしている糖コンジュゲートを含む２０価のコンジュゲート組成物である。

Claims (10)

1. 担体タンパク質に共有結合的に連結された単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖体を含む免疫原性組成物であって、ヒト対象に投与した場合、オプソニン化貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）において肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂおよび１５Ｃを死滅させることが可能な抗体の形成を誘発し、担体タンパク質がＣＲＭ _１９７ である、免疫原性組成物。
2. オプソニン化貪食作用死滅アッセイ（ＯＰＡ）により決定する場合、対象の少なくとも５０％において、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂおよび１５Ｃに対して少なくとも１：８のタイターを惹起することが可能である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
3. ヒト対象に投与した場合、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定する場合、少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．３、０．３５、０．４または０．５μｇ／ｍｌの濃度で、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂおよび１５Ｃの多糖体に結合することが可能であるＩｇＧ抗体を惹起することができる、請求項２に記載の免疫原性組成物。
4. 活性型多糖体中の血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ（ｍｏｌ／ｍ^３）当たりのアセテートのｍＭ（ｍｏｌ／ｍ^３）値に対する、免疫原性コンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖体１ｍＭ（ｍｏｌ／ｍ^３）当たりのアセテートのｍＭ（ｍｏｌ／ｍ^３）値の比が、少なくとも０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９または０．９５である、請求項１または３に記載の免疫原性組成物。
5. 免疫原性コンジュゲートが、
   免疫原性コンジュゲートが、血清型１５Ｂ莢膜多糖体の総量と比較して、遊離の血清型１５Ｂ莢膜多糖体を４０％未満含む；
   免疫原性コンジュゲートが、３０００～２００００ｋＤａ；５０００～１００００ｋＤａ；５０００～２００００ｋＤａ；８０００～２００００ｋＤａ；８０００～１６０００ｋＤａ；または１００００～１６０００ｋＤａの間の分子量を有する；
   コンジュゲート中の担体タンパク質に対する血清型１５Ｂ莢膜多糖体の比が、０．４～２の間である；
   少なくとも４０％の免疫原性コンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３以下のＫｄを有する；および
   コンジュゲーションの程度が、２～１５；２～１３；２～１０；２～８；２～６；２～５；２～４；３～１５；３～１３；３～１０；３～８；３～６；３～５；３～４；５～１５；５～１０；８～１５；８～１２；１０～１５；または１０～１２の間である、
   の少なくとも１つにより特徴付けられる、請求項４に記載の免疫原性組成物。
6. 免疫原性組成物が少なくとも１つの追加の抗原をさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
7. 免疫原性組成物がアジュバントをさらに含む、請求項１または６に記載の免疫原性組成物。
8. アジュバントがリン酸アルミニウムである、請求項７に記載の免疫原性組成物。
9. ヒト対象において、血清型１５Ｂおよび１５Ｃの肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と関連がある肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染、疾患または状態を治療または予防するための、請求項１から８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
10. 請求項１から８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を含むワクチン。

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