ES2965616T3 - Polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae y conjugados de los mismos - Google Patents

Polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae y conjugados de los mismos Download PDF

Info

Publication number
ES2965616T3
ES2965616T3 ES19179577T ES19179577T ES2965616T3 ES 2965616 T3 ES2965616 T3 ES 2965616T3 ES 19179577 T ES19179577 T ES 19179577T ES 19179577 T ES19179577 T ES 19179577T ES 2965616 T3 ES2965616 T3 ES 2965616T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
serotype
capsular polysaccharide
polysaccharide
immunogenic
conjugate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES19179577T
Other languages
English (en)
Inventor
Mingming Han
Avvari Krishna Prasad
David Cooper
Wendy Jo Watson
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Inc
Original Assignee
Pfizer Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52630421&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2965616(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Pfizer Inc filed Critical Pfizer Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2965616T3 publication Critical patent/ES2965616T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

La invención se refiere a polisacárido capsular aislado de Streptococcus pneumoniae serotipo 15B y a procesos para su preparación. La invención también se refiere a conjugados inmunogénicos que comprenden polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 15B unido covalentemente a una proteína portadora, procesos para su preparación y composiciones inmunogénicas que los comprenden. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Polisacáridos capsulares deStreptococcus pneumoniaey conjugados de los mismos
Campo de la invención
La invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende conjugados inmunogénicos que comprenden polisacárido capsular deStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B unido covalentemente a una proteína transportadora para su uso en un procedimiento para prevenir la infección conStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15C.
Antecedentes
LosStreptococcus pneumoniaeson cocos Gram positivos con forma de lanceta que suelen verse en parejas (diplococos), pero también en cadenas cortas o como células individuales. Crecen fácilmente en placas de agar sangre con colonias brillantes y muestran hemólisis alfa a menos que se cultiven anaeróbicamente, donde muestran hemólisis beta. Las células de la mayoría de los serotipos de neumococo tienen una cápsula que es un revestimiento de polisacáridos que rodea a cada célula. Esta cápsula es un factor determinante de la virulencia en los seres humanos, ya que interfiere con la fagocitosis al impedir que los anticuerpos se adhieran a las células bacterianas. Actualmente se conocen más de 90 serotipos capsulares de neumococo, y los 23 serotipos más comunes son responsables de aproximadamente el 90 % de la enfermedad invasiva en todo el mundo. Como vacuna, la capa de polisacárido neumocócico puede conferir un grado razonable de inmunidad frenteal Streptococcus pneumoniaeen individuos con sistemas inmunitarios desarrollados o no deteriorados, pero el polisacárido capsular conjugado con una proteína portadora adecuada permite obtener una respuesta inmunitaria en los lactantes y los ancianos, que también son los que corren más riesgo de contraer infecciones neumocócicas.
Desde la introducción de la primera vacuna neumocócica conjugada de 7 valencias (PCV7 o Prevnar) en el año 2000, la enfermedad invasiva de esos siete serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F) casi ha desaparecido. La adición de los serotipos 1, 3, 5, 6A, 7F y 19A en Prevnar 13 disminuyó aún más el número de enfermedades neumocócicas invasivas.
Sin embargo, la incidencia de enfermedades neumocócicas invasivas causadas por serotipos no vacunales tales comoStreptococcus pneumoniaedel serotipos 15A, 15B y 15C ha aumentado recientemente (véase, por ejemplo, Beall B. et al, Journal of Clinical Microbiology. 44 (3): 999-1017, 2006, o Jacobs et al, Clin Infect Dis. (2008) 47 (11): 1388 1395). Ninguna de las vacunas neumocócicas comercializadas actualmente proporciona una protección adecuada contra el serotipo 15Bdel Streptococcus pneumoniaeen humanos y, en particular, en niños menores de 2 años.
G. Rajam et al. (Clinical and Vaccine Immunology, 2007, vol. 14, no. 9, páginas 1223-1227) divulgan que los anticuerpos funcionales contra el serotipo 15B son específicos del polisacárido 15B O-acetilado y que tienen baja reactividad cruzada con el serotipo 15C.
E. Saeland et al. (The Journal of Infectious Diseases, 2001, vol. 183, páginas 253-260) divulgan que la inmunización pasiva con muestras de suero obtenidas de lactantes vacunados con una vacuna conjugada de proteína polisacárido octavalente (que comprende un conjugado 6B), PncT, protegió a los ratones contra la bacteriemia y /o infección pulmonar causada por provocación intranasal con los serotipos 6B y 6A.
Por lo tanto, se necesitan composiciones inmunogénicas que puedan utilizarse para inducir una respuesta inmunitaria contra el serotipo 15B deStreptococcus pneumoniae.También sería un beneficio adicional si tal composición inmunogénica pudiera usarse para proteger a los sujetos contraStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15C y/ o 15A.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende un conjugado inmunogénico que comprende un polisacárido capsular deStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B aislado unido covalentemente a una proteína transportadora en donde dicho conjugado comprende al menos 0,6 mM de acetato por mM de dicho polisacárido capsular de serotipo 15B, para uso en un procedimiento de prevenir la infección conStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15C, comprendiendo el procedimiento administrar a un sujeto una cantidad inmunogénica de dicha composición inmunogénica.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1 - Estructura de la unidad repetitiva del polisacárido capsular neumocócico del serotipo 15B
Descripción detallada de la invención
La presente invención puede entenderse más fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención y los Ejemplos incluidos en el presente documento. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por una persona con conocimientos normales en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque en la práctica o prueba de la presente invención se puede utilizar cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, en el presente documento se describen ciertos procedimientos y materiales preferidos. Al describir las realizaciones y la reivindicación de la invención, se utilizará cierta terminología de acuerdo con las definiciones que se exponen a continuación.
Definiciones
Tal como se utiliza en el presente documento, el "peso molecular" de un polisacárido o de un conjugado polisacáridoproteína portadora se refiere al peso molecular calculado por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) combinada con un detector de dispersión de luz láser multiángulo (MALLS).
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "polisacárido libre" significa un polisacárido capsular del serotipo 15B que no está conjugado covalentemente con la proteína portadora, pero que sin embargo está presente en la composición de conjugado de polisacárido capsular del serotipo 15B-proteína portadora. El polisacárido libre puede estar asociado de forma no covalente (es decir, unido de forma no covalente a, adsorbido a, o atrapado en o con) el conjugado de polisacárido-proteína portadora.
El porcentaje de polisacárido libre se mide después de la purificación final del conjugado de polisacárido capsular del serotipo 15B-poteína portadora. Preferentemente se mide en las 4 semanas siguientes a la purificación final. Se expresa en porcentaje del total de polisacáridos de la muestra.
Como se usa en este documento, el término "polisacárido de serotipo 15B" o "polisacárido capsular de serotipo 15B" se refiere a un polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae del serotipo 15B.
Como se usa en el presente documento, el término "glicoconjugado de serotipo 15B" o "conjugado de serotipo 15B" se refiere a un polisacárido de serotipo 15B aislado conjugado covalentemente a una proteína transportadora.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "grado de oxidación" (DO) se refiere al número de unidades repetitivas de azúcar por grupo aldehído generadas cuando el polisacárido aislado se activa con un agente oxidante. El grado de oxidación de un polisacárido puede determinarse mediante procedimientos rutinarios conocidos por el experto en la técnica.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un mamífero, incluido el ser humano, o a un ave, pez, reptil, anfibio o cualquier otro animal. El término "sujeto" también incluye a los animales domésticos o de investigación. Ejemplos no limitativos de animales domésticos y de investigación son: perros, gatos, cerdos, conejos, ratas, ratones, jerbos, hámsters, cobayas, hurones, monos, pájaros, serpientes, lagartos, peces, tortugas y ranas. El término "sujeto" también incluye a los animales de ganado. Ejemplos no limitativos de animales de ganado incluyen: alpaca, bisonte, camello, ganado, ciervos, cerdos, caballos, llamas, mulas, burros, ovejas, cabras, conejos, renos, yaks, pollos, gansos y pavos.
Polisacárido capsular aislado del serotipo 15B
Como se muestra en la figura 1, la unidad repetitiva de polisacárido del serotipo 15B consiste en unacolumna vertebral de trisacárido ramificado (una N-acetilglucosamina (GlcpNAc), una galactopiranosa (Galp) y una glucopiranosa (Glcp)) con una rama de disacárido aGalp-pGalp enlzada al grupo hidroxilo C4 de GlcpNAc. El fosfoglicerol está enlazado al grupo hidroxilo C3 del residuo pGalp en la rama del disacárido. El polisacárido capsular del serotipo 15B está O-acetilado y la cantidad total de O-acetilación es aproximadamente de 0,8 a 0,9 grupos O-acetilo por unidad repetitiva de polisacárido (véase, por ejemplo, C. Jones et al, Carbohydrate Research, 340 (2005) 403-409). El polisacárido capsular del serotipo 15C tiene la estructura de la columna vertebral idéntica a la del serotipo 15B pero carece de O-acetilación.
El polisacárido del serotipo 15B aislado se puede obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
(a) preparar un cultivo de fermentación de células bacterianas deStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B;
(b) lisar las células bacterianas en dicho cultivo de fermentación;
(c) purificar el polisacárido del serotipo 15B del cultivo de fermentación; y,
(d) dimensionar el polisacárido purificado del serotipo 15B mediante homogeneización a alta presión.
Los polisacáridos del serotipo 15B pueden obtenerse directamente a partir de bacterias utilizando procedimientos de aislamiento conocidos por un experto en la técnica (véanse, por ejemplo, los procedimientos divulgados en las solicitudes de patente U.S. Pub. Nos. 20060228380, 20060228381, 20070184071, 20070184072, 20070231340 y 20080102498 o WO2008118752). Además, pueden producirse utilizando protocolos sintéticos.
Las cepas deStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B pueden obtenerse de colecciones de cultivos establecidas (tales como, por ejemplo, la cepa de depósito ATCC No ATCC10354 o la cepa disponible en el Laboratorio de referencia de estreptococos del Centro para el control y la prevención de enfermedades, Atlanta, GA)) o muestras clínicas.
Las células bacterianas se cultivan preferentemente en un medio a base de soja. Tras la fermentación de las células bacterianas que producen polisacáridos capsulares deStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B, las células bacterianas se lisan para producir un lisado celular. Las células bacterianas pueden ser lisadas utilizando cualquier agente lítico. Un "agente lítico" es cualquier agente que ayuda a la ruptura de la pared celular y a la liberación de autolisina que provoca la lisis celular, incluyendo, por ejemplo, los detergentes. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "detergente" se refiere a cualquier detergente aniónico o catiónico capaz de inducir la lisis de las células bacterianas. Ejemplos representativos de tales detergentes para su uso dentro de los procedimientos de la presente invención incluyen el desoxicolato de sodio (DOC), la N-lauroil sarcosina, el ácido quenodesoxicólico de sodio y las saponinas.
En una instancia, el agente lítico utilizado para lisar las células bacterianas es DOC. El DOC es la sal sódica del ácido biliar desoxicólico, que suele proceder de fuentes biológicas tales como las vacas o los bueyes. El DOC activa la proteína LytA, que es una autolisina que participa en el crecimiento y la división de la pared celular enStreptococcus pneumoniae.La proteína LytA tiene dominios de unión a colina en su porción C-terminal, y se sabe que las mutaciones del gen lytA producen mutantes LytA que son resistentes a la lisis con DOC.
En una instancia, el agente lítico utilizado para lisar las células bacterianas es un agente lítico no derivado de animales. Los agentes líticos no derivados de animales para su uso dentro de los procedimientos de la divulgación incluyen agentes de fuentes no animales con modos de acción similares a los del d Oc (es decir, que afectan a la función LytA y dan lugar a la lisis de las células deStreptococcus pneumoniae).Tales agentes líticos no derivados de animales incluyen, pero no se limitan a, análogos de DOC, surfactantes, detergentes y análogos estructurales de la colina. En una instancia, el agente lítico no derivado de animales se selecciona del grupo que consiste en ácido decanosulfónico, tert-octilfenoxi poli(oxietileno)etanoles (por ejemplo, Igepal® CA-630, CAS #: 9002-93-1Louis, MO), condensados de óxido de etileno de octilfenol (por ejemplo, Triton® X-100, disponible en Sigma Aldrich, St. Louis, MO), N-lauroil sarcosina, N-lauroil sarcosina sódica, iminodipropionato de laurilo, dodecil sulfato de sodio, quenodesoxicolato, hiodesoxicolato, glicodesoxicolato, taurodesoxicolato, tauroquenodesoxicolato y colato. En otra realización, el agente lítico no derivado de animales es la N-lauroil sarcosina. En otra realización, el agente lítico es N-lauroil sarcosina sódica.
El polisacárido del serotipo 15B puede entonces aislarse del lisado celular utilizando técnicas de purificación conocidas en el arte, incluyendo el uso de centrifugación, filtración en profundidad, precipitación, ultrafiltración, tratamiento con carbón activo, diafiltración y/o cromatografía en columna (Véase, por ejemplo, la solicitud de Patente U.S. Pub. Nos 20060228380, 20060228381, 20070184071, 20070184072, 20070231340 y 20080102498 o WO2008118752). El polisacárido capsular del serotipo 15B, pueden utilizarse entonces para la preparación de conjugados inmunogénicos.
Preferentemente, con el fin de generar conjugados con características de filtrabilidad y/o rendimientos ventajosos, el dimensionamiento del polisacárido a un intervalo de peso molecular (MW) más bajo se realiza antes de la conjugación con una proteína portadora. Ventajosamente, el tamaño del polisacárido purificado del serotipo 15B se reduce al tiempo que se conservan las características críticas de la estructura del polisacárido, como por ejemplo la presencia de grupos O-acetilo. Preferentemente, el tamaño del polisacárido purificado del serotipo 15B se reduce mediante homogeneización mecánica.
En una instancia preferida, el tamaño del polisacárido purificado del serotipo 15B se reduce mediante homogeneización a alta presión. La homogeneización a alta presión logra altas tasas de cizallamiento bombeando la corriente del procedimiento a través de un camino de flujo con dimensiones suficientemente pequeñas. La tasa de cizallamiento se incrementa utilizando una mayor presión de homogeneización aplicada y el tiempo de exposición puede aumentarse recirculando la corriente de alimentación a través del homogeneizador.
El procedimiento de homogeneización a alta presión es particularmente apropiado para reducir el tamaño del polisacárido purificado del serotipo 15B, preservando al mismo tiempo las características estructurales del polisacárido, como la presencia de grupos O-acetilo.
El polisacárido capsular aislado del serotipo 15B obtenido mediante la purificación del polisacárido del serotipo 15B a partir del lisado deStreptococcus pneumoniaey, opcionalmente, el dimensionamiento del polisacárido purificado, puede caracterizarse por diferentes parámetros que incluyen, por ejemplo, el peso molecular, el mM de glicerol por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B o el mM de acetato por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B.
El grado de O-acetilación del polisacárido puede determinarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, por RMN de protones (véase por ejemplo Lemercinier y Jones (1996) Carbohydrate Research 296; 83-96, Jones and Lemercinier (2002) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30; 1233-1247, WO 05/033148 o WO00/56357. Otro procedimiento comúnmente utilizado se describe en Hestrin (1949) J. Biol. Chem. 180; 249-261. Preferentemente, la presencia de grupos O-acetilo se determina mediante un análisis de HPLC iónico.
La presencia de O-acetilo en un polisacárido capsular purificado del serotipo 15B, aislado o activado o en un conjugado de polisacárido del serotipo 15B -proteína portadora se expresa como el número de mM de acetato por mM de dicho polisacárido o como el número de grupo O-acetilo por unidad repetitiva de polisacárido.
La presencia de cadenas laterales de glicerolfosfato se puede determinar midiendo el glicerol usando cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) después de su liberación por tratamiento del polisacárido con ácido fluorhídrico (HF). La presencia de glicerol en un polisacárido purificado del serotipo 15B, aislado o activado o en un conjugado de polisacárido del serotipo 15B-proteína portadora se expresa como el número de mM de glicerol por mM de polisacárido del serotipo 15B.
El polisacárido capsular aislado del serotipo 15B también se puede producir sintéticamente usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.
En una instancia preferida, el polisacárido capsular aislado del serotipo 15B tiene un peso molecular entre 5 y 500 kDa, 50 y 500 kDa, 50 y 450 kDa, 100 y 400 kDa, 100 y 350 kDa. En una instancia preferida, el polisacárido capsular aislado del serotipo 15B tiene un peso molecular entre 100 y 350 kDa. En una instancia, el polisacárido capsular aislado del serotipo 15B tiene un peso molecular entre 100 y 300 kDa. En una instancia, el polisacárido capsular aislado del serotipo 15B tiene un peso molecular entre 150 y 300 kDa.
En un caso preferido, el polisacárido capsular de serotipo 15B aislado comprende al menos 0,6 mM de acetato por mM de dicho polisacárido capsular de serotipo 15B. En un caso preferido, el polisacárido capsular de serotipo 15B aislado comprende al menos 0,7 mM de acetato por mM de dicho polisacárido capsular de serotipo 15B. En un caso preferido, la presencia de grupos O-acetilo se determina mediante análisis por HPLC de iones.
En un caso preferido, el polisacárido capsular aislado del serotipo 15B comprende al menos glicerol 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 o 0,8 mM por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B. En un caso preferido, de la divulgación, el polisacárido capsular aislado del serotipo 15B comprende al menos 0,5, 0,6 o 0,7 mM de glicerol por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B. En un caso, el polisacárido capsular aislado del serotipo 15<b>comprende al menos acetato 0,6 mM por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B. En un caso preferido, el polisacárido capsular aislado del serotipo 15B comprende glicerol al menos 0,7 mM por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B.
En un caso preferido, el polisacárido capsular aislado del serotipo 15B tiene un peso molecular entre 100 y 350 kDa, preferentemente 150 y 350 kDa, y comprende al menos acetato 0,6 mM por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B.
En un caso preferido, de la divulgación, el polisacárido capsular aislado del serotipo 15B tiene un peso molecular entre 100 y 350 kDa, preferentemente 150 y 350 kDa, y comprende al menos glicerol 0,6 mM por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B.
En un caso preferido, el polisacárido capsular aislado del serotipo 15B comprende al menos acetato 0,6 mM por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B y al menos glicerol 0,6 mM por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B.
En un caso preferido, el polisacárido capsular de serotipo 15B aislado tiene un peso molecular entre 100 y 350 kDa, preferentemente 150 y 350 kDa, y comprende al menos 0,6 mM de acetato por mM de dicho polisacárido capsular de serotipo 15B y al menos 0,6 mM de glicerol por mM de dicho polisacárido capsular de serotipo 15B.
Conjugado de polisacárido capsular del serotipo 15B -proteína portadora
El polisacárido capsular aislado del serotipo 15B puede conjugarse con una proteína portadora para obtener un conjugado inmunogénico. El polisacárido aislado se puede conjugar con la proteína portadora mediante procedimientos conocidos por los expertos (véanse, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente U.S. Nos.
20060228380, 20070184071, 20070184072, 20070231340, o WO2011/100151).
En una realización, el polisacárido puede activarse con tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridinio (CDAP) para formar un éster de cianato. El polisacárido activado puede acoplarse directamente o mediante un grupo espaciador (enlazador) a un grupo amino en la proteína portadora. Por ejemplo, el espaciador podría ser cistamina o cisteamina para dar un polisacárido tiolado que podría acoplarse al portador a través de un enlace tioéter obtenido después de la reacción con una proteína portadora activada por maleimida (por ejemplo, usando GMBS) o una proteína portadora haloacetilada (por ejemplo usando yodoacetimida o bromoacetato de N-succinimidilo o SIAB, o SIA o SBAP). Preferentemente, el éster de cianato (fabricado opcionalmente mediante química de CDAP) se acopla con hexano diamina o dihidrazida de ácido adípico (ADH) y el sacárido derivado con amino se conjuga con la proteína portadora usando la química de carbodiimida (por ejemplo, EDAC o EDC) a través de un grupo carboxilo en el portador de proteína. Tales conjugados se describen, por ejemplo, en los documentos WO93/15760, WO 95/08348 y WO 96129094.
Otras técnicas adecuadas utilizan carbodiimidas, hidrazidas, ésteres activos, norborano, ácido p-nitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU. Muchos se describen en la publicación de solicitud de patente internacional No. WO 98/42721. La conjugación puede implicar un enlazador de carbonilo que puede formarse por reacción de un grupo hidroxilo libre del sacárido con CDI (véase Bethell et al., 1979,1. Biol. Chern. 254: 2572-4; Hearn et al., 1981, pág. J. Chromatogr.218: 509-18) seguido de reacción con una proteína para formar un enlace carbamato. Esto puede implicar la reducción del terminal anomérico a un grupo hidroxilo primario, protección/desprotección opcional, de la reacción del grupo hidroxilo primario del grupo hidroxilo primario con CDI para formar un intermedio de carbamato de CDI y acoplar el intermedio de carbamato de CDI con un grupo amino en una proteína.
En una realización preferida, el polisacárido capsular aislado del serotipo 15B se conjuga con la proteína portadora mediante aminación reductora. La aminación reductora implica la activación del polisacárido por oxidación y la conjugación del polisacárido activado a una proteína portadora por reducción.
Activación del polisacárido capsular del serotipo 15B
Un polisacárido capsular activado del serotipo 15B se obtiene haciendo reaccionar un polisacárido capsular aislado del serotipo 15B con un agente oxidante. Por ejemplo, dicho polisacárido capsular activado del serotipo 15B se puede obtener mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:
(a) preparar un cultivo de fermentación de células bacterianas del serotipo 15Bde Streptococcus pneumoniae;
(b) lisar las células bacterianas en dicho cultivo de fermentación;
(c) purificar el polisacárido del serotipo 15B a partir del cultivo de fermentación.
(d) dimensionar el polisacárido purificado del serotipo 15B mediante homogeneización a alta presión.
(e) hacer reaccionar el polisacárido dimensionado del serotipo 15B con un agente oxidante.
En un caso preferido, la concentración de polisacárido capsular aislado del serotipo 15B que se hace reaccionar con un agente oxidante está entre 0,1 y 10 mg/ml, 0,5 y 5 mg/ml, 1 y 3 mg/ml o aproximadamente 2 mg/ml.
En un caso preferido, el agente oxidante es peryodato. El peryodato oxida los grupos hidroxilos vecinos para formar grupos carbonilo o aldehído y provoca la escición de un enlace C-C. El término "peryodato" incluye tanto el peryodato como el ácido peryódico. Este término también incluye el metaperyodato (IO4') y el ortoperyodato (IO65-). El término "peryodato" también incluye las diversas sales de peryodato, incluyendo el peryodato de sodio y el peryodato de potasio. En un caso preferido, el agente oxidante es peryodato de sodio. En un caso preferido, el peryodato utilizado para la oxidación del polisacárido capsular del serotipo 15B es el metaperyodato. En un caso preferido, el peryodato utilizado para la oxidación del polisacárido capsular del serotipo 15B es metaperyodato de sodio.
En un caso preferido, el polisacárido se hace reaccionar con 0,01 a 10, 0,05 a 5, 0,1 a 1, 0,5 a 1, 0,7 a 0,8, 0,05 a 0,5, 0,1 a 0,3 equivalentes molares de agente oxidante. En un caso preferido, el polisacárido se hace reaccionar con aproximadamente 0,1,0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 equivalente molar de agente oxidante. En un caso preferido, el polisacárido se hace reaccionar con un equivalente molar de aproximadamente 0,15 de agente oxidante. En un caso preferido, el polisacárido se hace reaccionar con un equivalente molar de aproximadamente 0,25 de agente oxidante. En un caso preferido, el polisacárido se hace reaccionar con un equivalente molar de aproximadamente 0,5 de agente oxidante. En un caso preferido, el polisacárido se hace reaccionar con un equivalente molar de aproximadamente 0,6 de agente oxidante. En un caso preferido, el polisacárido se hace reaccionar con un equivalente molar de aproximadamente 0,7 de agente oxidante.
En un caso preferido, la duración de la reacción es de entre 1 y 50, 10 y 30, 15 y 20, 15 y 17 horas o aproximadamente 16 horas.
En un caso preferido, la temperatura de la reacción se mantiene entre 15 y 45 °C, 15 y 30 °C, 20 y 25 °C. En un caso preferido, la temperatura de la reacción se mantiene a aproximadamente 23 °C.
En un caso preferido, la reacción de oxidación se lleva a cabo en un tampón seleccionado entre fosfato de sodio, fosfato de potasio, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) o Bis-Tris. En un caso preferido, el tampón es fosfato de potasio.
En un caso preferido el tampón tiene una concentración de entre 1 y 500 mM, 1 y 300 mM, 50 y 200 mM. En un caso preferido, el tampón tiene una concentración de aproximadamente 100 mM.
En un caso preferido, la reacción de oxidación se lleva a cabo a un pH en la etapa (a) está entre 4 y 8, 5 y 7, 5,5 y 6,5. En un caso preferido, el pH) es de aproximadamente 6.
En un caso preferido, el polisacárido capsular activado del serotipo 15B se obtiene haciendo reaccionar de 0,5 a 5 mg/ml de polisacárido capsular aislado del serotipo 15B con 0,2 a 0,3 equivalentes molares de peryodato a una temperatura entre 20 y 25 °C.
En un caso preferido, se purifica el polisacárido capsular activado del serotipo 15B. El polisacárido capsular activado del serotipo 15B se purifica de acuerdo con procedimientos conocidos por el experto en la técnica, tales como la cromatografía de permeación en gel (GPC), la diálisis o la ultrafiltración/diafiltración. Por ejemplo, el polisacárido capsular activado se purifica por concentración y diafiltración utilizando un dispositivo de ultrafiltración.
En un caso preferido, el grado de oxidación del polisacárido capsular activado del serotipo 15B está entre 2 y 20, 2 y 15, 2 y 10, 2 y 5, 5 y 20, 5 y 15, 5 y 10, 10 y 20, 10 y 15, 15 y 20. En un caso preferido, el grado de oxidación del polisacárido capsular activado del serotipo 15B está entre 2 y 10, 4 y 8, 4 y 6, 6 y 8, 6 y 12, 8 y 12, 9 y 11, 10 y 16, 12 y 16, 14 y 18, 16 y 20, 16 y 18, o 18 y 20.
En un caso preferido, el polisacárido capsular de serotipo 15B activado tiene un peso molecular entre 5 y 500 kDa, 50 y 500 kDa, 50 y 450 kDa, 100 y 400 kDa, 100 y 350 kDa. En un caso preferido, el polisacárido capsular de serotipo 15B activado tiene un peso molecular entre 100 y 350 kDa. En un caso preferido, el polisacárido capsular de serotipo 15B activado tiene un peso molecular entre 100 y 300 kDa. En un caso preferido, el polisacárido capsular de serotipo 15B activado tiene un peso molecular entre 150 y 300 kDa. En un caso preferido, el polisacárido capsular de serotipo 15B activado tiene un peso molecular entre 100 y 250 kDa.
En un caso preferido, el polisacárido capsular activado del serotipo 15B comprende al menos acetato 0,6 mM por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B. En un caso preferido, el polisacárido capsular activado del serotipo 15B comprende al menos acetato 0,7 mM por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B. En un caso preferido, la presencia de grupos O-acetilo se determina mediante análisis de HPLC de iones.
En un caso preferido, el polisacárido capsular activado del serotipo 15B comprende al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 o 0,8 mM de glicerol por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B. En un caso preferido, el polisacárido capsular activado del serotipo 15B comprende al menos 0,5, 0,6 o 0,7 mM de glicerol por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B. En un caso preferido, el polisacárido capsular activado del serotipo 15B comprende al menos glicerol 0,6 mM por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B. En un caso preferido, el polisacárido capsular activado del serotipo 15B comprende al menos glicerol 0,7 mM por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B.
En un caso preferido, el polisacárido capsular activado del serotipo 15B tiene un peso molecular entre 100 y 250 kDa y comprende al menos acetato 0,6 mM por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B.
En un caso preferido, el polisacárido capsular activado del serotipo 15B tiene un peso molecular entre 100 y 250 kDa y comprende al menos glicerol 0,6 mM por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B.
En un caso preferido, el polisacárido capsular activado del serotipo 15B comprende al menos acetato 0,6 mM por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B y al menos glicerol 0,6 mM por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B.
En un caso preferido, el polisacárido capsular activado del serotipo 15B tiene un peso molecular entre 100 y 250 kDa y comprende al menos acetato 0,6 mM por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B y al menos glicerol 0,6 mM por mM de dicho polisacárido capsular del serotipo 15B.
En una realización, el polisacárido capsular activado del serotipo 15B se liofiliza, opcionalmente en presencia de crioprotector/lioprotector. En una realización, dicho crioprotector/lioprotector es un sacárido. En un caso preferido el sacaárido se selecciona entre la sacarosa, latrehalosa, la rafinosa, la estaquiosa, la melezitosa, el dextrano, el manitol, el lactitol y el palatinit. En un caso preferido, el sacárido es sacarosa. El polisacárido capsular activado liofilizado puede entonces componerse con una solución que comprenda la proteína portadora.
En otra realización, el polisacárido capsular activado del serotipo 15B se compone con la proteína portadora y se liofiliza, opcionalmente, en presencia del crioprotector/lioprotector. En una realización, dicho crioprotector/lioprotector es un sacárido. En un caso preferido, el sacárido se selecciona entre la sacarosa, la trehalosa, la rafinosa, la estaquiosa, la melezitosa, el dextrano, el manitol, el lactitol y el palatinit. En un caso preferido, el el sacárido es sacarosa. A continuación, el polisacárido co-liofilizado y la proteína portadora pueden resuspenderse en una solución y reaccionar con un agente reductor.
Conjugación del polisacárido capsular activado del serotipo 15B con una proteína portadora
El polisacárido capsular activado del serotipo 15B puede conjugarse con una proteína portadora mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
a) componer el polisacárido capsular activado del serotipo 15B con una proteína portadora; y
b) hacer reaccionar el polisacárido capsular activado del serotipo 15B y la proteína portadora compuestos con un agente reductor para formar un conjugado de polisacárido capsular del serotipo 15B: proteína portadora.
La conjugación del polisacárido capsular activado del serotipo 15B con un portador de proteínas mediante aminación reductora en dimetilsulfóxido (DMSO) es adecuada para preservar el contenido de O-acetilo del polisacárido en comparación, por ejemplo, con la aminación reductora en solución acuosa, donde el nivel de O-acetilación del polisacárido se reduce significativamente. En una realización preferida, la etapa (a) y la etapa (b) se llevan a cabo en DMSO.
En un caso preferido, la etapa (a) comprende disolver el polisacárido capsular liofilizado del serotipo 15B en una solución que comprende una proteína portadora y DMSO. En un caso preferido, la etapa (a) comprende la disolución del polisacárido capsular co-liofilizado del serotipo 15B y la proteína portadora en DMSO.
Cuando las etapas (a) y (b) se llevan a cabo en solución acuosa, las etapas (a) y (b) se llevan a cabo en un tampón,<preferiblemente seleccionado entre PBS, MES, HEPES, Bis-tris, ADA, PIPES.>MoPSo,<BES, MOPS, DIPSO,>mObS, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, Bicine o HEPB, a un pH entre 6,0 y 8,5, 7 y 8 o 7 y 7,5. En un caso preferido, el tampón es PBS. En un caso preferido, el pH es aproximadamente 7,3.
En un caso preferido, la concentración de polisacárido capsular activado del serotipo 15B en la etapa (b) está entre 0,1 y 10 mg/ml, 0,5 y 5 mg/ml, 0,5 y 2 mg/ml. En un caso preferido, la concentración de polisacárido capsular activado del serotipo 15B en la etapa (b) es de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 o 3 mg/ml.
En un caso preferido, la relación de entrada inicial (peso por peso) de polisacárido capsular activado del serotipo 15B con respecto a la proteína portadora está entre 5:1 y 0,1:1, 2:1 y 0,1:1, 2:1 y 1:1, 1,5:1 y 1:1, 0,1:1 y 1:1, 0,3:1 y 1:1, 0,6:1 y 1 :1.
En un caso preferido, la relación de entrada inicial de polisacárido capsular activado del serotipo 15B con respecto a la proteína portadora es de aproximadamente 0,6:1 a y 1,5:1, preferentemente 0,6: 1 a 1 : 1. Tal relación de entrada inicial es particularmente adecuada para obtener niveles bajos de polisacárido libre en el conjugado inmunogénico.
En un caso preferido, la relación de entrada inicial de polisacárido capsular activado del serotipo 15B con respecto a la proteína portadora es de aproximadamente 0,4:1,0,5:1, 0,6:1,0,7:1,0,8:1, 0,9:1, 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1,9:1 o 2:1.
En una realización, el agente reductor es cianoborohidruro de sodio, triacetoxiborhidruro de sodio, borohidruro de sodio o de zinc en presencia de ácidos de Bronsted o de Lewis, boranos de amina, tales como el borano de piridina, el borano de 2-picolina, 2,6-diborano-metanol, el borano de dimetilamina, t-BuMeiPrN-BH3, BH3 de bencilamina o el borano de 5-etil-2-metilpiridina (PEMB). En un caso preferido, el agente reductor es cianoborohidruro de sodio. En un caso preferido, el agente reductor es 2-picolina borano de sodio.
En un caso preferido, la cantidad de agente reductor usada en la etapa (b) está entre aproximadamente 0,1 y 10 equivalentes molares, 0,5 y 5 equivalentes molares, 1 y 2 equivalentes molares. En un caso preferido, la cantidad de agente reductor usada en la etapa (b) es aproximadamente 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 o 2 equivalentes molares.
En un caso preferido, la duración de la etapa (b) está entre 1 y 60 horas, 10 y 50 horas, 40 y 50 horas; 42 y 46 horas. En un caso preferido, la duración de la etapa (b) es de aproximadamente 44 horas.
En un caso preferido, la temperatura de la reacción en la etapa (b) se mantiene entre 10 y 40 °C, 15 y 30 °C, o 20 y 26 °C. En un caso preferido, la temperatura de la reacción en la etapa (b) se mantiene en aproximadamente 23 °C.
En un caso preferido, el procedimiento para la preparación de un conjugado inmunogénico que comprende el polisacárido capsular deStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B enlazado covalentemente a una proteína portadora comprende además una etapa (etapa (c)) de cubrimiento del aldehído no reaccionado (inactivación) mediante la adición de NaBH4.
En un caso preferido, la cantidad de NaBH4 usada en la etapa (c) está entre 0,1 y 10 equivalentes molares, 0,5 y 5 equivalentes molares 1 y 3 equivalentes molares. En un caso preferido, la cantidad de NaBH4 usada en la etapa (c) es aproximadamente 2 equivalentes molares.
En un caso preferido, la duración de la etapa (c) está entre 0,1 y 10 horas, 0,5 y 5 horas, 2 y 4 horas. En un caso preferido, la duración de la etapa (c) es de unas 3 horas.
En un caso preferido, la temperatura de la reacción en la etapa (c) se mantiene entre 15 y 45 °C, 15 y 30 °C o 20 y 26 °C. En un caso preferido, la temperatura de la reacción en la etapa (c) se mantiene a aproximadamente 23 °C.
En un caso preferido, el rendimiento de la etapa de conjugación (etapa b) es superior al 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %. En un caso preferido, el rendimiento de la etapa de conjugación (etapa b) es superior al 60 %. En un caso preferido, el rendimiento de la etapa de conjugación (etapa b) es superior al 70 %. El rendimiento es la cantidad de polisacárido del serotipo 15B en el conjugado x100/cantidad de polisacárido activado usado en la etapa de conjugación.
En un caso preferido, el procedimiento para la preparación de un conjugado inmunogénico que comprende polisacárido capsular deStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B enlazado covalentemente a una proteína portadora comprende las etapas de:
(a) preparar un cultivo de fermentación de células bacterianas deStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B;
(b) lisar las células bacterianas en dicho cultivo de fermentación;
(c) purificar el polisacárido del serotipo 15B del cultivo de fermentación;
(d) dimensionar el polisacárido purificado del serotipo 15B mediante homogeneización a alta presión;
(e) hacer reaccionar el polisacárido dimensionado del serotipo 15B con un agente oxidante;
(f) componer el polisacárido activado del serotipo 15B con una proteína portadora, y
(g) hacer reaccionar el polisacárido activado del serotipo 15B compuesto y la proteína portadora con un agente reductor para formar un conjugado de polisacárido del serotipo 15B -proteína portadora; y,
(h) cubrir el aldehído sin reaccionar (inactivación) mediante la adición de NaBH4
En un caso preferido, el rendimiento de la etapa de conjugación (etapa g) del procedimiento anterior es superior al 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %. En un caso preferido, el rendimiento de la etapa de conjugación (etapa g) es superior al 60 %. En un caso preferido, el rendimiento de la etapa de conjugación (etapa g) es superior al 70 %. El rendimiento es la cantidad de polisacárido del serotipo 15B en el conjugado x100)/cantidad de polisacárido activado usado en la etapa de conjugación.
Después de la conjugación del polisacárido capsular del serotipo 15B con la proteína portadora, el conjugado polisacárido-proteína puede ser purificado (enriquecido con respecto a la cantidad de conjugado polisacárido-proteína) por una variedad de técnicas conocidas por el experto. Estas técnicas incluyen la diálisis, las operaciones de concentración/diafiltración, la precipitación/elución por filtración de flujo tangencial, la cromatografía en columna (DEAE o cromatografía de interacción hidrófoba) y la filtración en profundidad.
En un caso preferido, la proteína portadora no es tóxica ni reactogénica y se puede obtener en cantidad y pureza suficientes. Las proteínas portadoras deben ser susceptibles de procedimientos de conjugación estándar.
En un caso preferido, el polisacárido capsular activado del serotipo 15B se conjuga con una proteína portadora que se selecciona en el grupo que consiste en: DT (toxina diftérica), TT (toxina tetánica) o fragmento C de TT, CRM197 (una variante no tóxica pero antigénicamente idéntica de la toxina diftérica) otros mutantes puntuales de DT, tales como CRM176, CRM228, CRM 45 (Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM102, CRM 103 y CRM107 y otras mutaciones descritas por Nicholls y Youle en Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; supresión o mutación de Glu-148 por Asp, Gln o Ser y/o Ala 158 por Gly y otras mutaciones divulgadas en US 4709017 o US 4950740; mutación de al menos uno o más residuos Lys 516, Lys 526, Phe 530 y/o Lys 534 y otras mutaciones divulgadas en US 5917017 o US 6455673; o fragmento divulgado en el documento US 5843711, neumolisina neumocócica (Kuo et al (1995) Infect Immun 63; 2706-13), incluida la ply detoxificada de alguna manera, por ejemplo, dPLY-GMBS (WO 04081515, PCT/EP2005/010258) o dPLY-formol, PhtX, incluyendo PhtA, PhtB, PhtD, PhtE (las secuencias de PhtA, PhtB, PhtD o PhtE se divulgan en WO 00/37105 o WO 00/39299) y fusiones de proteínas Pht, por ejemplo, fusiones PhtDE, fusiones PhtBE, Pht A-E (WO 01/98334, WO 03/54007, W02009/000826), OMPC (proteína de membrana externa meningocócica - usualmente extraída de N.meningitidis serogrupo B -) EP0372501), PorB (de N. meningitidis), PD (proteína D de Haemophilus influenza - véase, por ejemplo EP 0594610 B), o sus equivalentes inmunológicamente funcionales, péptidos sintéticos (EP0378881 , EP0427347), proteínas de choque térmico (WO 93/17712, WO 94/03208), las proteínas de la tos ferina (WO 98/58668, EP0471 177), citoquinas, linfocinas, factores de crecimiento u hormonas (WO10 91/01146), proteínas artificiales que comprenden múltiples epítopos de células T CD4+ humanas de diversos antígenos derivados de patógenos (Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824) tales como la proteína N19 (Baraldoi et al (2004) Infect Immun 72; 4884-7) la proteína de superficie neumocócica PspA (WO 02/091998), las proteínas de captación de hierro (WO 01/72337), la toxina A o B de C. difficile (WO 00/61761). En un caso, el polisacárido capsular activado del serotipo 15B se conjuga con DT (toxoide diftérico). En otro caso, el polisacárido capsular activado del serotipo 15B está conjugado con TT (toxina tetánica). En otro caso, el polisacárido capsular activado del serotipo 15B se conjuga con el fragmento C del TT. En otro caso, el polisacárido capsular activado del serotipo 15B se conjuga con PD (proteína D de Haemophilus influenza - véase, por ejemplo, EP 0594610 B).
En un caso preferidoa, el polisacárido capsular activado del serotipo 15B de la invención se conjuga con la proteína CRM 197. La proteína CRM197 es una forma no tóxica de la toxina diftérica pero es inmunológicamente indistinguible de la toxina diftérica. El CRM197 es producido por C. diphtheriae infectado por el fago no toxigénico p197tox- creado por mutagénesis con nitrosoguanidina del corinefago beta toxigénico (Uchida, T. et al. 1971, Nature New Biology 233:8-11). El CRM197 se purifica mediante ultrafiltración, precipitación con sulfato de amonio y cromatografía de intercambio iónico. La proteína CRM197 tiene el mismo peso molecular que la toxina diftérica, pero difiere de ella por un único cambio de base (guanina a adenina) en el gen estructural. Este único cambio de base provoca una sustitución de aminoácidos (ácido glutámico por glicina) en la proteína madura y elimina las propiedades tóxicas de la toxina diftérica. La proteína CRM197 es un portador seguro y eficaz de sacáridos dependiente de las células T. Se pueden encontrar más detalles sobre el CMR197 y su producción, por ejemplo, en US 5.614.382.
En un caso, la divulgación se refiere a un conjugado inmunogénico que comprende polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 15B unido covalentemente a una proteína transportadora. En un caso, la divulgación se refiere a un conjugado inmunogénico que comprende polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 15B unido covalentemente a una proteína transportadora mediante aminación reductora. En un caso, la divulgación se refiere a un conjugado inmunogénico que comprende polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 15B unido covalentemente a una proteína transportadora mediante aminación reductora en DMSO. En una realización preferida, la proteína portadora es CRM197. En una realización preferida, el polisacárido es un polisacárido capsular de serotipo 15B aislado como se define en el presente documento. En una realización preferida, el polisacárido es un polisacárido capsular de serotipo 15B aislado como se define en el presente documento que ha sido dimensionado mediante homogeneización a alta presión.
En una realización preferida, el conjugado inmunogénico comprende menos de aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 o 15 % de polisacárido capsular del serotipo 15B libre en comparación con la cantidad total de polisacárido capsular del serotipo 15B. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico comprende menos de aproximadamente el 25 % de polisacárido capsular del serotipo 15B libre en comparación con la cantidad total de polisacárido capsular del serotipo 15B. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico comprende menos de aproximadamente el 20 % de polisacárido capsular del serotipo 15B libre en comparación con la cantidad total de polisacárido capsular del serotipo 15B. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico comprende menos de aproximadamente el 15 % de polisacárido capsular del serotipo 15B libre en comparación con la cantidad total de polisacárido capsular del serotipo 15B.
En una realización preferida, el conjugado inmunogénico tiene un peso molecular entre 3000 y 20000 kDa; 5000 y 10000 kDa; 5000 y 20000 kDa; 8000 y 20000 kDa; 8000 y 16000 KDa; o 10000 y 16000 KDa. El peso molecular del conjugado inmunogénico se mide mediante SEC-MALLS.
En una realización preferida, la relación (peso por peso) del polisacárido capsular del serotipo 15B con respecto a la proteína portadora en el conjugado está entre 0,5 y 3. En una realización preferida, la relación entre el polisacárido capsular del serotipo 15B y la proteína portadora en el conjugado está entre 0,4 y 2, 0,5 y 2, 0,5 y 1,5, 0,5 y 1, 1 y 1,5, 1 y 2. En una realización preferida, la relación entre el polisacárido capsular del serotipo 15B a la proteína portadora en el conjugado está entre 0,7 y 0,9.
El medio de cromatografía de exclusión por tamaño (CL-4B) puede utilizarse para determinar la distribución del tamaño molecular relativo del conjugado. La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se utiliza en columnas alimentadas por gravedad para perfilar la distribución del tamaño molecular de los conjugados. Las moléculas grandes excluidas de los poros del medio eluyen más rápidamente que las moléculas pequeñas. Los colectores de fracciones se utilizan para recoger el eluido de la columna. Las fracciones se analizan colorimétricamente mediante un ensayo de sacáridos. Para la determinación de Kd, las columnas se calibran para establecer la fracción en la que las moléculas están totalmente excluidas (V0), (Kd=0), y la fracción que representa la máxima retención (Vi), (Kd=1). La fracción a la que se alcanza un determinado atributo de la muestra (Ve), se relaciona con Kd mediante la expresión, Kd = (Ve - Vü)/(Vi -V0).
En una realización preferida, al menos el 20 % del conjugado inmunogénico tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, al menos el 30 % del conjugado inmunogénico tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, al menos el 40 % del conjugado inmunogénico tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, al menos el 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % u 85 % del conjugado inmunogénico tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, al menos el 60 % del conjugado inmunogénico tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, al menos el 70 % del conjugado inmunogénico tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B.
En una realización preferida, entre el 40 % y el 90 % del conjugado inmunogénico del serotipo 15B tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, entre el 50 % y el 90 % del conjugado inmunogénico del serotipo 15B tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B. En una realización preferida, entre el 65 % y el 80 % del conjugado inmunogénico del serotipo 15B tiene una Kd inferior o igual a 0,3 en una columna CL-4B.
El conjugado inmunogénico comprende al menos acetato 0,6 mM por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico comprende al menos acetato 0,7 mM por polisacárido capsular mM del serotipo 15B. En una realización preferida, la presencia de grupos O-acetilo se determina mediante análisis de HPLC de iones.
En una realización preferida, la relación de mM de acetato por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B en el conjugado inmunogénico con mM de acetato por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B en el polisacárido aislado es de al menos 0,7. En una realización preferida, la relación de mM de acetato por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B en el conjugado inmunogénico con mM de acetato por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B en el polisacárido aislado es de al menos 0,9. En una realización preferida, la presencia de grupos O-acetilo se determina mediante análisis de HPLC de iones.
En una realización preferida, la relación de mM de acetato por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B en el conjugado inmunogénico a mM de acetato por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B en el polisacárido activado es de al menos 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9 o 0,95. En una realización preferida, la relación de mM de acetato por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B en el conjugado inmunogénico con mM de acetato por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B en el polisacárido activado es de al menos 0,7. En una realización preferida, la relación de mM de acetato por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B en el conjugado inmunogénico con mM de acetato por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B en el polisacárido activado es de al menos 0,9. En una realización preferida, la presencia de grupos O-acetilo se determina mediante análisis de HPLC de iones.
En una realización preferida, el conjugado inmunogénico comprende al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 o 0,8 mM de glicerol pormM de polisacárido capsular del serotipo 15B. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico comprende al menos 0,5, 0,6 o 0,7 mM de glicerol por mM de polisacárido capsular de serotipo 15B. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico comprende al menos 0,6 mM de glicerol por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B. En una realización preferida, el conjugado inmunogénico comprende al menos glicerol 0,7 mM de glicerol por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B.
El grado de conjugación es el número de residuos de lisina en la proteína portadora que se conjugan con el polisacárido capsular del serotipo 15B. La evidencia de la modificación con lisina de la proteína portadora, debido a enlaces covalentes con los polisacáridos, se obtiene mediante análisis de aminoácidos usando procedimientos rutinarios conocidos por los expertos en la técnica. La conjugación da como resultado una reducción en el número de residuos de lisina recuperados, en comparación con el material de partida de la proteína CRM197 utilizado para generar los materiales conjugados.
En una realización preferida, el grado de conjugación del conjugado inmunogénico está entre 2 y 15, 2 y 13, 2 y 10, 2 y 8, 2 y 6, 2 y 5, 2 y 4, 3 y 15, 3 y 13, 3 y 10, 3 y 8, 3 y 6, 3 y 5, 3 y 4, 5 y 15, 5 y 10, 8 y 15, 8 y 12, 10 y 15 o 10 y 12. En una realización preferida, el grado de conjugación del conjugado inmunogénico está entre 2 y 5.
Composición inmunogénica
El término "composición inmunogénica" se refiere a cualquier composición farmacéutica que contenga un antígeno, por ejemplo, un microorganismo o un componente del mismo, cuya composición puede utilizarse para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto.
Tal como se utiliza en el presente documento, "inmunogénico" significa la capacidad de un antígeno (o un epítopo del antígeno), tal como un polisacárido capsular bacteriano, o un onjugado inmunogénico o composición inmunogénica que comprende un antígeno, para provocar una respuesta inmunitaria en un huésped como un mamífero, ya sea mediada por vía humoral o celular, o ambas.
En una realización, la divulgación se refiere a una composición inmunogénica que comprende un conjugado de proteína portadora de polisacárido capsular inmunogénico del serotipo 15B divulgado en el presente documento.
En una realización, la composición inmunogénica divulgada en el presente documento, cuando se administra a un sujeto, induce la formación de anticuerpos capaces de unirse al serotipo 15B delStreptococcus pneumonía.En una realización, la composición inmunogénica divulgada en el presente documento, cuando se administra a un sujeto, induce la formación de anticuerpos capaces de unirse al serotipo 15B deStreptococcus pneumoníae,medido mediante un ensayo ELISA estándar.
En una realización, la composición inmunogénica divulgada en el presente documento, cuando se administra a un sujeto, induce la formación de anticuerpos capaces de unirse al serotipo 15B y 15A y/o 15C delStreptococcus pneumonía.En una realización, la composición inmunogénica divulgada en el presente documento, cuando se administra a un sujeto, induce la formación de anticuerpos capaces de unirse al serotipo 15B y 15A y/o 15C deStreptococcus pneumoníae,medido mediante un ensayo ELISA estándar.
En una realización, la composición inmunogénica divulgada en el presente documento, cuando se administra a un sujeto, induce la formación de anticuerpos capaces de unirse al serotipo 15B y 15C delStreptococcus pneumonía.En una realización, la composición inmunogénica divulgada en el presente documento, cuando se administra a un sujeto, induce la formación de anticuerpos capaces de unirse al serotipo 15B y 15C deStreptococcus pneumoníae,medido mediante un ensayo ELISA estándar.
En el procedimiento ELISA (Ensayo de inmunosorbente enlazado a enzima), los anticuerpos de los sueros de los sujetos vacunados se incuban con polisacáridos que han sido adsorbidos en un soporte sólido. Los anticuerpos unidos se detectan usando anticuerpos de detección secundaria conjugados con enzima.
En una realización, dicho ensayo ELISA es el ensayo ELISA estandarizado (OMS) como lo define la OMS en el 'Training manual for Enzyme linked immunosorbent assay for the quantitation ofStreptococcus pneumoniaeserotype specific IgG (Pn PS ELISA).' (accesible en http://www.vaccine.uab.edu/ELISA %20protocol.pdf; consultado el 31 de marzo de 2014).
El ELISA mide anticuerpos de polisacárido capsular (PS) de tipo IgG específicoanti-Streptococcus pneumoniaepresentes en suero humano. Cuando se añaden diluciones de sueros humanos a placas de microtitulación recubiertas con PS capsulares de tipo específico, los anticuerpos específicos para ese PS capsular se unen a las placas de microtitulación. Los anticuerpos unidos a las placas se detectan usando un anticuerpo de cabra anti-IgG humana marcado con fosfatasa alcalina seguido de un sustrato de p-nitrofenil fosfato. La densidad óptica del producto final coloreado es proporcional a la cantidad de anticuerpo PS anticapsular presente en el suero.
En una realización, la composición inmunogénica para uso de la invención es capaz de provocar anticuerpos IgG en humanos que son capaces de unirse al polisacárido de los serotipos 15B de S.pneumoniaea una concentración de al menos 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,35, 0,4 o 0,5 pg/ml según se determina mediante ensayo ELISA.
En una realización, la composición inmunogénica para uso de la invención es capaz de provocar anticuerpos IgG en humanos que son capaces de unirse al polisacárido de S.pneumoniaede serotipos 15C a una concentración de al menos 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,35, 0,4 o 0,5 pg/ml según se determina mediante ensayo ELISA.
En una realización, la composición inmunogénica para uso de la invención es capaz de provocar anticuerpos IgG en humanos que son capaces de unirse al polisacárido de S.pneumoniaede los serotipos 15B y 15C a una concentración de al menos 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,35, 0,4 o 0,5 pg/ml según se determina mediante ensayo ELISA.
En una realización, la composición inmunogénica para uso de la invención, cuando se administra a un sujeto, induce la formación de anticuerpos capaces de matar la Streptococcuspneumoniaedel serotipo 15B en un ensayo de opsonofagocitosis (OPA) como se divulga en el presente documento. En una realización, la composición inmunogénica para uso de la invención, cuando se prueba en un ensayo de OPA como se divulga en este documento, tiene un título de OPA mayor que el título de OPA obtenida con un polisacárido capsular deStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B nativo no conjugado.
En una realización, la composición inmunogénica para uso de la invención, cuando se administra a un sujeto, induce la formación de anticuerpos capaces de matar la Streptococcuspneumoniaedel serotipo 15C en un ensayo de opsonofagocitosis como se divulga en el presente documento. En una realización, la composición inmunogénica para uso de la invención, cuando se prueba en un ensayo de OPA como se describe en este documento, tiene un título de OPA mayor que el título de OPA obtenido con un polisacárido capsular deStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15C nativo no conjugado.
En una realización, la composición inmunogénica para uso de la invención, cuando se administra a un sujeto, induce la formación de anticuerpos capaces de matar la Streptococcuspneumoniaedel serotipo 15B y 15C y/o 15A en un ensayo de opsonofagocitosis como se divulga en este documento.
En una realización, la composición inmunogénica para uso de la invención, cuando se administra a un sujeto, induce la formación de anticuerpos capaces de matar los serotipos 15B y 15C.
El ensayo opsonofagocítico neumocócico (OPA), que mide la muerte de células de S.pneumoniaepor células efectoras fagocíticas en presencia de anticuerpo funcional y complemento, se considera un sustituto importante para evaluar la eficacia de las vacunas neumocócicas.
El ensayo opsonofagocítico (OPA) se puede realizar incubando en conjunto una mezcla de células deStreptococcus pneumoniae,un suero humano inactivado por calor que se va a probar, células HL-60 diferenciadas (fagocitos) y una fuente de complemento exógeno (por ejemplo, complemento de conejo bebé). La opsonofagocitosis procede durante la incubación y las células bacterianas que están cubiertas con el anticuerpo y el complemento mueren tras la opsonofagocitosis. Las unidades formadoras de colonias (ufc) de bacterias supervivientes que escapan de la opsonofagocitosis se determinan sembrando la mezcla de ensayo. El título de OPA se define como la dilución recíproca que da como resultado una reducción del 50 % en el recuento bacteriano con respecto a los pocillos de control sin suero de prueba. El título de OPA se interpola a partir de las dos diluciones que abarcan este límite de muerte del 50 %.
Un título de punto final de 1: 8 o mayor se considera un resultado positivo en estos OPA de tipo inductor de muerte.
En una realización, la composición inmunogénica para uso de la invención es capaz de provocar un título de al menos 1:8 contra S.pneumoniaedel serotipo 15B en al menos el 50 % de los sujetos según se determina mediante el ensayo de inducción de muerte opsonofagocítica (OPA). En una realización, la composición inmunogénica para uso de la invención es capaz de provocar un título de al menos 1:8 contra S.pneumoniaedel serotipo 15B en al menos 60 %; 70 %, 80 %, 90 % o al menos 93 % de los sujetos según lo determinado por el ensayo de inducción de muerte opsonofagocítica (OPA).
En una realización, la composición inmunogénica para uso de la invención es capaz de provocar un título de al menos 1: 8 contra S.pneumoniaedel serotipo 15C en al menos el 50% de los sujetos según se determina mediante el ensayo de inducción de muerte opsonofagocítica (OPA). En una realización, la composición inmunogénica para uso de la invención es capaz de provocar un título de al menos 1: 8 contra S.pneumoniaedel serotipo 15C en al menos 60 %; 70 %, 80 %, 90 % o al menos 95 % de los sujetos según lo determinado por el ensayo de inducción de muerte opsonofagocítica (OPA).
La formulación de la composición inmunogénica para uso de la presente invención puede llevarse a cabo utilizando procedimientos reconocidos en la técnica. Por ejemplo, los conjugados inmunogénicos divulgados pueden formularse con un vehículo fisiológicamente aceptable para preparar la composición. Ejemplos de tales vehículos incluyen, pero no se limitan a, agua, solución salina tamponada, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y soluciones de dextrosa.
En una realización preferida, la composición inmunogénica para uso de la invención puede comprender al menos un antígeno adicional. En realizaciones preferidas, la composición inmunogénica para uso de la invención puede comprender al menos un polisacárido capsular adicionalde Streptococcus pneumoniae.
En una realización preferida, la composición inmunogénica para uso de la invención puede comprender al menos un polisacárido capsularadicional de Streptococcus pneumoniaeconjugado con una proteína portadora. En una realización preferida, dicha proteína portadora es CRM197.
En ciertas realizaciones, la composición inmunogénica para uso de la invención comprende uno o más adyuvantes. Tal como se define en el presente documento, un "adyuvante" es una sustancia que sirve para mejorar la inmunogenicidad de una composición inmunogénica para uso de esta invención. Así, los adyuvantes se administran a menudo para potenciar la respuesta inmunitaria y son bien conocidos por la persona experimentada. Los adyuvantes adecuados para mejorar la eficacia de la composición incluyen, pero no se limitan a:
(1) sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc;
(2) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos, como péptidos de muramilo (definidos más adelante) o componentes de la pared celular bacteriana), tales como, por ejemplo
(a) MF59 (PCT Pub. N°WO 90/14837), que contiene un 5 % de escualeno, un 0,5 %5 de Tween 80 y un 0,5 % de Span 85 (opcionalmente con diversas cantidades de MTP-PE (véase más adelante, aunque no es necesario)) formulado en partículas submicrónicas utilizando un microfluidizador como el modelo<11OY (Microfluidics, Newton,>Ma),
b) SAF, que contiene un 10 % de escualeno, un 0,4 % de Tween 80, un 5 % de polímero plurónico bloqueado L121 y thr-MDP (véase más adelante), microfluidizado en una emulsión submicrónica o sometida a vórtex para generar una emulsión de mayor tamaño de partícula, y
c) Sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Corixa, Hamilton, MT) que contiene un 2 % de escualeno, un 0,2 % de Tween 80 y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo formado por el monofosforilípido A (MPL™) 3-O-deilado descrito en el documentoo de Patente U.S. No. 4.912.094 (Corixa), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferentemente MPL CWS (Detox™);
(3) adyuvantes de saponina, como Quil A o STIMULON™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (Patente U.S. No. 5.057.540) pueden utilizarse o partículas generadas a partir de ellos, como los ISCOM (complejos inmunoestimulantes);
(4) los bacteriallipopolisacáridos, los análogos sintéticos del lípido A, tales como los compuestos de aminoalquilglucosamina-fosfato (AGP), o sus derivados o análogos, disponibles en Corixa, y que se describen en Patente U.S. No. 6, 113.918; uno de estos AGP es el 2-[(R)-3-Tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etil 2-Desoxi-4-Ofosfono-3-O-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3tetradecanoiloxitetradecanoilamino]-b-D-glucopiranósido que también se conoce como 529 (antes conocido como RC529), que se formula como una forma acuosa o como una emulsión estable, polinucleótidos sintéticos tales como oligonucleótidos que contienen motivo(s) CpG (Patente U.S. No. 6.207.646);
(5) citoquinas, tales como interleuquinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, etc.), interferones (por ejemplo, interferón gamma), factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), moléculas coestimuladoras 87-1 y 87-2, etc;
(6) mutantes detoxificados de una toxina bacteriana ADP-ribosiladora, tal como la toxina del cólera (CT), ya sea en forma salvaje o mutante, por ejemplo, en la que el ácido glutámico en la posición del aminoácido 29 se sustituye por otro aminoácido, preferentemente una histidina, de acuerdo con la solicitud internacional de patente publicada número WO 00/18434 (véase también WO 02/098368 y WO 02/098369), una toxina pertussis (PT) o una toxina termolábil de E. coli (LT), en particular LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129 (véase, por ejemploWO 93/13302 y WO 92/19265); y
(7) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para aumentar la eficacia de la composición.
Los péptidos de muramilo incluyen, pero no se limitan a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetilnormuramil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.
En una realización de la presente invención, las composiciones inmunogénicas para uso de la invención comprenden un oligonucleótido CpG como adyuvante. Un oligonucleótido CpG, tal y como se utiliza en este documento, se refiere a un oligodeoxinucleótido CpG inmunoestimulador (ODN CpG), por lo que estos términos se utilizan indistintamente a menos que se indique otra cosa. Los oligodeoxinucleótidos CpG inmunoestimuladores contienen uno o más motivos CpG inmunoestimuladores que son dinucleótidos de citosina-guanina no metilados, opcionalmente dentro de ciertos contextos de bases preferidos. El estado de metilación del motivo inmunoestimulador CpG se refiere generalmente al residuo de citosina en el dinucleótido. Un oligonucleótido inmunoestimulador que contiene al menos un dinucleótido CpG no metilado es un oligonucleótido que contiene una citosina 5' no metilada unida por un enlace fosfato a una guanina 3', y que activa el sistema inmunitario mediante la unión al receptor tipo Toll 9 (TLR-9). En otra realización, el oligonucleótido inmunoestimulador puede contener uno o más dinucleótidos CpG metilados, que activarán el sistema inmunitario a través de TLR9 pero no con tanta fuerza como si el motivo o motivos CpG no estuvieran metilados. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores CpG pueden comprender uno o más palíndromos que a su vez pueden englobar el dinucleótido CpG. Los oligonucleótidos CpG se han descrito en una serie de patentes emitidas, solicitudes de patentes publicadas y otras publicaciones, incluyendo Patentes U.S. Nos. 6.194.388 6,207,646 6,214,806 6,218,371 6,239,116y 6,339,068.
En una realización de la presente invención, las composiciones inmunogénicas para uso de la invención comprenden cualquiera de los oligonucleótidos CpG descritos en las páginas 3 líneas 22 a la página 12 línea 36 del documento WO2010/125480.
Se han identificado diferentes clases de oligonucleótidos inmunoestimuladores CpG. Se denominan clase A, B, C y P, y se describen con más detalle en las páginas 3 líneas 22 a la página 12 línea 36 del documento WO2010/125480.
En una realización de la presente invención, las composiciones inmunogénicas para uso de la invención comprenden un oligonucleótido CpG de clase A. Preferentemente, el oligonucleótido CpG "clase A" para uso en la presente invención tiene la siguiente secuencia de ácido nucleico: 5' GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3' (SEQ ID NO: 1). Algunos ejemplos no limitantes de oligonucleótidos de la Clase A incluyen: 5' G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G 3' (SEQ ID NO: 2); en la que * se refiere a un enlace fosforotioato y _ se refiere a un enlace fosfodiéster.
En una realización de la presente invención, las composiciones inmunogénicas para uso de la invención comprenden un oligonucleótido CpG de clase B. En una realización, el oligonucleótido CpG para su uso en la presente invención es un oligonucleótido CpG de clase B representado por al menos la fórmula:
5' X1X2CGX3X43', en la que X1, X2, X3 y X4 son nucleótidos. En una realización, X2 es adenina, guanina o timina. En otra realización, X3 es citosina, adenina o timina. Las secuencias de oligonucleótidos CpG de clase B para uso en la presente invención son las descritas ampliamente en las Patentes U.S. Ps 6.194.388, 6,207,646, 6,214,806, 6,218,371, 6,239,116 y 6,339,068. Las secuencias ejemplares incluyen, pero no se limitan a las divulgadas en estas últimas solicitudes y patentes.
En una realización, el oligonucleótido CpG "clase B" para uso en la presente invención tiene la siguiente secuencia de ácido nucleico:
5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3' (SEQ ID NO: 3), o
5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3' (SEQ ID NO: 4), o
5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 5), o
5' TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 6), o
5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3' (SEQ ID NO: 7).
En cualquiera de estas secuencias, todos los enlaces pueden ser uniones de fosforotioato. En otra realización, en cualquiera de estas secuencias, uno o más de los enlaces puede ser fosfodiéster, preferentemente entre la "C" y la "G" del motivo CpG haciendo un oligonucleótido CpG semiblando. En cualquiera de estas secuencias, una etil-uridina o un halógeno pueden sustituir a la 5' T; los ejemplos de sustituciones halógenas incluyen, pero no se limitan a, sustituciones de bromo-uridina o yodo-uridina.
Algunos ejemplos no limitantes de oligonucleótidos de la Clase B incluyen:
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO: 8), o
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO: 9), o
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3' (SEQ ID NO: 10) , o
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3' (SEQ ID NO: 11) , o
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A 3' (SEQ ID NO: 12) .
donde * se refiere a un enlace fosforotioato.
En una realización de la presente invención, las composiciones inmunogénicas para uso de la invención comprenden un oligonucleótido CpG de clase C. En una realización, los oligonucleótidos CpG "clase C" para uso en la presente invención tienen la siguiente secuencia de ácido nucleico:
5' TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 13), o
5' TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 14), o
5' TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 15), o
5' TCGGACGTTCGGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 16), o
5' TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 17), o
5' TCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 18), o
5' TCGACGTTCGGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 19), o
5' TCGCGTCGTTCGGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 20), o
5' TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 21), o
5' TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 22), o
5' TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG 3' (SEQ ID NO: 23), o
5' TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG 3' (SEQ ID NO: 24), o
5' TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGT 3' (SEQ ID NO: 25).
En cualquiera de estas secuencias, todos los enlaces pueden ser uniones de fosforotioato. En otra realización, en cualquiera de estas secuencias, uno o más de los enlaces puede ser fosfodiéster, preferentemente entre la "C" y la "G" del motivo CpG haciendo un oligonucleótido CpG semiblando.
Algunos ejemplos no limitantes de oligonucleótidos de la Clase C incluyen:
5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 26), o
5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 27), o
5' T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 28), o
5' T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 29), o
5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 30), o
5' T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 31), o
5' T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 32), o
5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 33), o
5' T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 34), o
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 35), o
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 36), o
5' T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*A*C_G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 37), o
5' T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3' (SEQ ID NO: 38)
donde * se refiere a un enlace fosforotioato y _ se refiere a un enlace fosfodiéster.
En cualquiera de estas secuencias, una etil-uridina o un halógeno pueden sustituir a la 5' T; ejemplos de sustituciones halógenas incluyen, pero no se limitan a, sustituciones de bromo-uridina o yodo-uridina.
En una realización de la presente invención, las composiciones inmunogénicas para uso de la invención comprenden un oligonucleótido CpG de clase P. En una realización, el oligonucleótido CpG para su uso en la presente invención es un oligonucleótido CpG de clase P que contiene un dominio de activación TLR 5' y al menos dos regiones palindrómicas, siendo una de las regiones palindrómicas una región palindrómica 5' de al menos 6 nucleótidos de longitud y conectada a una región palindrómica 3' de al menos 8 nucleótidos de longitud, ya sea directamente o a través de un espaciador, en el que el oligonucleótido incluye al menos un dinucleótido YpR. En una realización, dicho oligoonucleótido no es T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 27). En una realización, el oligonucleótido CpG de clase P incluye al menos un dinucleótido CpG no metilado. En otra realización, el dominio de activación de TLR es TCG, TTCG, TTTCG, TYpR, TTYpR, TTTYpR, UCG, UUCG, UUUCG, TTT o TTTT. En otra realización, el dominio de activación de TLR está dentro de la región palindrómica 5'. En otra realización, el dominio de activación de TLR está inmediatamente 5' a la región palindrómica 5'.
En una realización, los oligonucleótidos CpG "clase P" para uso en la presente invención tienen la siguiente secuencia de ácido nucleico: 5' TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 39).
En dichas secuencias, todos los enlaces pueden ser enlaces de fosforotioato. En otra realización, uno o más de los enlaces puede ser fosfodiéster, preferentemente entre la "C" y la "G" del motivo CpG haciendo un oligonucleótido CpG semiblando. En cualquiera de estas secuencias, una etil-uridina o un halógeno pueden sustituir a la 5' T; ejemplos de sustituciones halógenas incluyen, pero no se limitan a, sustituciones de bromo-uridina o yodo-uridina.
Un ejemplo no limitativo de oligonucleótidos de la Clase P incluye:
5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 40)
donde * se refiere a un enlace fosforotioato y _ se refiere a un enlace fosfodiéster.
En una realización, el oligonucleótido incluye al menos un enlace fosforotioato. En otra realización, todos los enlaces internucleótidos del oligonucleótido son enlaces de fosforotioato. En otra realización, el oligonucleótido incluye al menos un enlace tipo fosfodiéster. En otra realización, el enlace fosfodiéster es un enlace fosfodiéster. En otra realización se conjuga un grupo lipofílico con el oligonucleótido. En una realización el grupo lipofílico es el colesterol.
En una realización, todos los enlaces internucleotídicos de los oligonucleótidos CpG aquí divulgados son enlaces fosfodiéster (oligonucleótidos "blandos", como se describe en la Solicitud PCT WO2007/026190). En otra realización, los oligonucleótidos CpG para uso en la presente invención se hacen resistentes a la degradación (por ejemplo, se estabilizan). Un "oligonucleótido estabilizado" se refiere a un oligonucleótido que es relativamente resistente a la degradaciónin vivo(por ejemplo, a través de una exo o endo nucleasa). La estabilización del ácido nucleico puede lograrse mediante modificaciones de la columna vertebral. Los oligonucleótidos con enlaces de fosforotioato proporcionan una actividad máxima y protegen al oligonucleótido de la degradación por las exo- y endo-nucleasas intracelulares.
Los oligonucleótidos inmunoestimuladores pueden tener una columna vertebral quimérica, que tiene combinaciones de enlaces fosfodiéster y fosforotioato. Para los propósitos de la presente invención, una columna vertebral quimérica se refiere a una columna vertebral parcialmente estabilizada, en la que al menos un enlace internucleotídico es fosfodiéster o similar al fosfodiéster, y en la que al menos otro enlace internucleotídico es un enlace internucleotídico estabilizado, en el que el al menos un enlace fosfodiéster o similar al fosfodiéster y el al menos un enlace estabilizado son diferentes. Cuando el enlace fosfodiéster se localiza preferentemente dentro del motivo CpG, tales moléculas se denominan "semiblandas", como se describe en la Solicitud PCT WO2007/026190.
El tamaño del oligonucleótido CpG (es decir, el número de residuos de nucleótidos a lo largo del oligonucleótido) también puede contribuir a la actividad estimulante del oligonucleótido. Para facilitar la captación en las células, el oligonucleótido CpG de la invención tiene preferentemente una longitud mínima de 6 residuos de nucleótidos. Los oligonucleótidos de cualquier tamaño superior a 6 nucleótidos (incluso de muchas kb de longitud) son capaces de inducir una respuesta inmunitaria si hay suficientes motivos inmunoestimuladores, porque los oligonucleótidos más grandes se degradan dentro de las células. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos CpG tienen una longitud de 6 a 100 nucleótidos, preferentemente de 8 a 30 nucleótidos. En realizaciones importantes, los ácidos nucleicos y oligonucleótidos de la invención no son plásmidos o vectores de expresión.
En una realización, los oligonucleótidos CpG aquí divulgados comprenden sustituciones o modificaciones, como en las bases y/o los azúcares, tal como se describe en los párrafos 134 a 147 del documento WO2007/026190.
En una realización, el oligonucleótido CpG para uso en la presente invención está modificado químicamente. Ejemplos de modificaciones químicas son conocidos por el experto y se describen, por ejemplo, en Uhlmann E. et al. (1990), Chem. Rev. 90:543, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke, S.T. et al. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:107-129 y Hunziker J. et al., (1995), Mod. Sintetizador. Methods 7:331-417. Un oligonucleótido para uso en la presente invención puede tener una o más modificaciones, en las que cada modificación se localiza en un puente internucleósido fosfodiéster particular y/o en una unidad de p-D-ribosa particular y/o en una posición de base nucleósida natural particular en comparación con un oligonucleótido de la misma secuencia que está compuesto de ADN o ARN natural.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos que contienen CpG pueden mezclarse simplemente con portadores inmunogénicos de acuerdo con los procedimientos conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo WO03/024480).
En una realización particular de la presente invención, las composiciones inmunogénicas para uso de la invención comprende de 2|jg a 100mg de oligonucleótido CpG, preferentemente de 0,1mg a 50 mg de oligonucleótido CpG, preferentemente de 0,2 mg a 10 mg de oligonucleótido CpG, preferentemente de 0,3 mg a 5 mg de oligonucleótido CpG, incluso Preferentemente de 0,5 a 2 mg de oligonucleótido CpG, incluso Preferentemente de 0,75 a 1,5 mg de oligonucleótido CpG. En una realización preferida, la composición inmunogénica para uso de la invención comprende aproximadamente 1mg de oligonucleótido CpG.
En una realización preferida, el adyuvante es un adyuvante a base de aluminio seleccionado del grupo que consiste en fosfato de aluminio, sulfato de aluminio e hidróxido de aluminio. En una realización, las composiciones inmunogénicas descritas aquí comprenden el adyuvante fosfato de aluminio.
En una realización preferida, las composiciones inmunogénicas para uso de la invención comprenden además al menos uno de un tampón, un crioprotector, una sal, un catión divalente, un detergente no iónico, un inhibidor de la oxidación de radicales libres, un diluyente o un portador.
La composición inmunogénica para uso de la invención puede comprender opcionalmente uno o más tampones fisiológicamente aceptables seleccionados de, pero no limitados a, Tris (trimetamina), fosfato, acetato, borato, citrato, glicina, histidina y succinato. En ciertas realizaciones, la formulación está tamponada dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0, preferentemente de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5.
La composición inmunogénica para uso de la invención puede comprender opcionalmente uno o más tensioactivos no iónicos, incluidos pero no limitados a los ésteres de ácidos grasos de sorbitán de polioxietileno, el polisorbato-80 (Tween 80), el polisorbato-60 (Tween 60), el polisorbato-40 (Tween 40) y el polisorbato-20 (Tween 20), los éteres alquílicos de polioxietileno, incluidos pero no limitados a Brij 58, Brij 35, así como otros como Triton X-100; Triton X-114, NP40, Span 85 y la serie Pluronic de tensioactivos no iónicos (por ejemplo, Pluronic 121). p. ej., Pluronic 121). En una realización preferida, la composición inmunogénica comprende Polisorbato-80 o Polisorbato-40, preferentemente Polisorbato-80. En una realización preferida, la composición inmunogénica comprende Polisorbato-80 en una concentración de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 2 % (siendo preferible hasta aproximadamente 0,25 %) o Polisorbato-40 en una concentración de aproximadamente 0,001 % a 1 % (siendo preferible hasta aproximadamente 0,5 %).
Procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria y proteger contra la infección
Las referencias a procedimientos de tratamiento en los párrafos siguientes de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para el diagnóstico).
La presente divulgación también incluye procedimientos de uso para las composiciones inmunogénicas aquí descritas. Por ejemplo, una realización de la divulgación proporciona un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contraStreptococcus pneumoniae,que comprende la administración a un sujeto de una cantidad inmunogénica de cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento.
Una realización de la divulgación proporciona un procedimiento para proteger a un sujeto contra una infección porStreptococcus pneumoniae,o un procedimiento para prevenir la infección porStreptococcus pneumoniae,o un procedimiento para reducir la gravedad o retrasar la aparición de al menos un síntoma asociado con una infección causada porStreptococcus pneumoniae,los procedimientos comprenden administrar a un sujeto una cantidad inmunogénica de cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento.
Una realización de la divulgación proporciona un procedimiento para proteger a un sujeto contra una infección porStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B, o un procedimiento para prevenir la infección porStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B, o un procedimiento para reducir la gravedad o retrasar la aparición de al menos un síntoma asociado con una infección causada porStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B, los procedimientos comprenden administrar a un sujeto una cantidad inmunogénica de cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento.
Una realización de la divulgación proporciona un procedimiento para proteger a un sujeto contra una infección porStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15C, o un procedimiento para prevenir la infección porStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15C, o un procedimiento para reducir la gravedad o retrasar la aparición de al menos un síntoma asociado con una infección causada porStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15C, los procedimientos comprenden administrar a un sujeto una cantidad inmunogénica de cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento.
Una realización de la divulgación proporciona un procedimiento para proteger a un sujeto contra una infección porStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15A, o un procedimiento para prevenir la infección porStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15A, o un procedimiento para reducir la gravedad o retrasar la aparición de al menos un síntoma asociado con una infección causada porStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15A, comprendiendo los procedimientos administrar a un sujeto una cantidad inmunogénica de cualquiera de las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento.
Una realización de la divulgación proporciona un procedimiento para tratar o prevenir una infecciónpor Streptococcus pneumoniae,una enfermedad o una afección asociada al serotipo 15A, 15B y/o 15C (preferentemente 15B y/o 15C, más preferentemente 15B)de Streptococcus pneumoniaeen un sujeto, comprendiendo el procedimiento la etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una composición inmunogénica descrita en el presente documento. Otra realización proporciona un procedimiento para tratar o prevenir una infección, enfermedad o afecciónpor Streptococcus pneumoniaeasociada a unStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15A, 15B y/o 15C (preferentemente 15<b>y/o 15C, más preferentemente 15B) en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la generación de una preparación de anticuerpos policlonales o monoclonales a partir de la composición inmunogénica descrita en el presente documento, y utilizando dicha preparación de anticuerpos para conferir inmunidad pasiva al sujeto.
En una realización, la divulgación se refiere al uso del conjugado inmunogénico o composición inmunogénica descrita en el presente documento para la fabricación de un medicamento para proteger a un sujeto contra una infección porStreptococcus pneumoniaey/o prevenir la infección porStreptococcus pneumoniaey/o reducir la gravedad o retrasar la aparición de al menos un síntoma asociado con una infección causada porStreptococcus pneumoniae,y/o proteger a un sujeto contra una infección porStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15A, 15B y/o 15C (preferentemente 15B y/o 15C, más preferentemente 15b ) y/o prevenir la infección porStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15A, 15B y/o 15C (preferentemente 15B y/o 15C, más preferentemente 15B), y/o reducir la gravedad o retrasar la aparición de al menos un síntoma asociado con una infección causada porStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15A, 15B y/o 15C (preferentemente 15B y/o 15C, más preferentemente 15B).
En una realización, la divulgación se refiere al uso del conjugado inmunogénico o la composición inmunogénica divulgados en el presente documento para proteger a un sujeto contra una infección porStreptococcus pneumoniae,y/o prevenir la infección por Streptococcuspneumoniae, y/o reducir la gravedad o retrasar la aparición de al menos un síntoma asociado con una infección causada porStreptococcus pneumoniae,y/o proteger a un sujeto contra una infección por Streptococcuspneumoniaedel serotipo 15A, 15B y/o 15C (preferentemente 15B y/o 15C, más preferentemente 15B) y/o prevenir la infección porStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15A, 15B y/o 15C (preferentemente 15B y/o 15C, más preferentemente 15B), y/o reducir la gravedad o retrasar la aparición de al menos un síntoma asociado a una infección causada porStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15A, 15B y/o 15C (preferentemente 15B y/o 15C, más preferentemente 15B).
Una "respuesta inmunitaria" a una composición inmunogénica es el desarrollo en un sujeto de una respuesta inmunitaria humoral y/o mediada por células a las moléculas presentes en la composición inmunogénica o la composición de vacuna de interés. A efectos de la presente divulgación, una "respuesta inmunitaria humoral" es una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos e implica la inducción y generación de anticuerpos que reconocen y se unen con cierta afinidad al antígeno de la composición inmunogénica o la vacuna de la divulgación, mientras que una "respuesta inmunitaria mediada por células" es la mediada por las células T y/o otros glóbulos blancos. La "respuesta inmunitaria mediada por células" es provocada por la presentación de epítopos antigénicos en asociación con moléculas de clase I o clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (M<h>C), CD1 u otras moléculas no clásicas similares al MHC. Esto activa las células T auxiliares CD4+ específicas del antígeno o las células de linfocitos T citotóxicos CD8+ ("CTL"). Los CTL tienen especificidad para los antígenos peptídicos que se presentan en asociación con las proteínas codificadas por los MHC clásicos o no clásicos y que se expresan en la superficie de las células. Los CTL ayudan a inducir y promover la destrucción intracelular de los microbios intracelulares, o la lisis de las células infectadas con dichos microbios. Otro aspecto de la inmunidad celular implica una respuesta específica al antígeno por parte de las células T auxiliares. Las células T auxiliares actúan para ayudar a estimular la función y concentrar la actividad de las células efectoras no específicas contra las células que presentan péptidos u otros antígenos en asociación con moléculas MHC clásicas o no clásicas en su superficie. Una "respuesta inmunitaria mediada por células" también se refiere a la producción de citoqunas, quimioquinas y otras moléculas de este tipo producidas por las células T activadas y/u otros glóbulos blancos, incluidos los derivados de las células T CD4+ y CD8+. La capacidad de un antígeno o composición particular para estimular una respuesta inmunológica mediada por células puede determinarse mediante una serie de ensayos, como por ejemplo, ensayos de linfoproliferación (activación de linfocitos), ensayos de células citotóxicas CTL, mediante ensayos de linfocitos T específicos para el antígeno en un sujeto sensibilizado, o mediante la medición de la producción de citoquinas por las células T en respuesta a la reestimulación con el antígeno. Estos ensayos son bien conocidos en la técnica.Véase, por ejemploErickson et al. (1993) J. Immunol. 151:4189-4199 y Doe et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:2369-2376.
Tal y como se utiliza en el presente documento, "tratamiento" (incluyendo sus variaciones, por ejemplo, "tratar" o "tratado") significa uno o más de los siguientes: (i) la prevención de la infección o la reinfección, como en una vacuna tradicional, (ii) la reducción de la gravedad o la eliminación de los síntomas, y (iii) la eliminación sustancial o completa del patógeno o del trastorno en cuestión. Por lo tanto, el tratamiento puede ser efectuado de manera profiláctica (antes de la infección) o de manera terapéutica (después de la infección). En la presente divulgación, el tratamiento profiláctico es el modo preferido. De acuerdo con una realización particular de la presente divulgación, se proporcionan composiciones y procedimientos que tratan, incluyendo la inmunización profiláctica y/o terapéutica, a un animal huésped contra una infección porStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15A, 15B y/o 15C (preferentemente 15B y/o 15C, más preferentemente 15<b>). Los procedimientos de la presente divulgación son útiles para conferir inmunidad profiláctica y/o terapéutica a un sujeto. Los procedimientos de la presente divulgación también se pueden practicar en sujetos para aplicaciones de investigación biomédica.
Una "cantidad inmunogénica" y una "cantidad inmunológicamente eficaz", ambas utilizadas indistintamente en el presente documento, se refieren a la cantidad de antígeno o composición inmunogénica suficiente para provocar una respuesta inmunitaria, ya sea una respuesta celular (células T) o humoral (células B o anticuerpos), o ambas, según las mediciones realizadas mediante ensayos estándar conocidos por un experto en la técnica.
En una realización preferida, dicho sujeto es un humano. En una realización más preferida, dicho sujeto es un recién nacido (es decir, menos de tres meses de edad), un bebé (de 3 meses a un año de edad) o un niño pequeño (es decir, de un año a cuatro años de edad).
En una realización, las composiciones inmunogénicas divulgada en el presente documentos son para su uso como vacuna.
En tal realización, el sujeto que va a ser vacunado puede ser menor de 1 año de edad. Por ejemplo, el sujeto que va a ser vacunado puede tener aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses de edad. En una realización, el sujeto que va a ser vacunado tiene aproximadamente 2, 4 o 6 meses de edad. En otra realización, el sujeto que va a ser vacunado es menor de 2 años de edad. Por ejemplo, el sujeto que va a ser vacunado puede tener aproximadamente 12-15 meses de edad. En algunos casos, sólo se necesita una dosis de la composición inmunogénica de acuerdo con la invención, pero en algunas circunstancias, se puede administrar una segunda, tercera o cuarta dosis (véase la sección de régimen).
En una realización de la presente invención, el sujeto que va a ser vacunado es un adulto humano de 50 años o más, más Preferentemente un adulto humano de 55 años o más. En una realización, el sujeto que va a ser vacunado es un adulto humano de 65 años o más, de 70 años o más, de 75 años o más o de 80 años o más.
En una realización el sujeto que va a ser vacunado es un individuo inmunocomprometido, en particular un humano. Un individuo inmunocomprometido se define generalmente como una persona que muestra una capacidad atenuada o reducida para montar una defensa humoral o celular normal ante el desafío de agentes infecciosos.
En una realización de la presente invención, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado sufre de una enfermedad o afección que deteriora el sistema inmunológico y resulta en una respuesta de anticuerpos que es insuficiente para proteger contra o tratar la enfermedad neumocócica.
En una realización, dicha enfermedad es un trastorno de inmunodeficiencia primaria. Preferentemente, dicho trastorno de inmunodeficiencia primaria se selecciona del grupo que consiste en: inmunodeficiencias combinadas de células T y B, deficiencias de anticuerpos, síndromes bien definidos, enfermedades de desregulación inmunitaria, trastornos de fagocitos, deficiencias de inmunidad innata, trastornos autoinflamatorios y deficiencias del complemento. En una realización, dicho trastorno de inmunodeficiencia primaria se selecciona de lo divulgado en la página 24 línea 11 a la página 25 línea 19 de la Solicitud PCT WO2010/125480.
En una realización particular de la presente invención, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado padece una enfermedad seleccionada entre los grupos que consisten en: Infección por VIH, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), cáncer, trastornos cardíacos o pulmonares crónicos, insuficiencia cardíaca congestiva, diabetes mellitus, enfermedad hepática crónica, alcoholismo, cirrosis, fugas de líquido cefalorraquídeo, cardiomiopatía, bronquitis crónica, enfisema, Enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), disfunción del bazo (tal como la enfermedad de células falciformes), falta de función del bazo (asplenia), neoplasia sanguínea, leucemia, mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin, linfoma, insuficiencia renal, síndrome nefrótico y asma.
En una realización de la presente invención, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado sufre de desnutrición.
En una realización particular de la presente invención, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado está tomando un fármaco o tratamiento que disminuye la resistencia del cuerpo a la infección. En una realización, dicho fármaco se selecciona entre el divulgado en la página 26 línea 33 a la página 26 línea 40 de la Solicitud PCT WO2010/125480.
En una realización particular de la presente invención, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado es un fumador.
En una realización particular de la presente invención, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado tiene un recuento de glóbulos blancos (recuento de leucocitos) inferior a 5 x109 células por litro, o inferior a 4 x109 células por litro, o inferior a 3 x109 células por litro, o inferior a 2 x109 células por litro, o inferior a 1 x109 células por litro, o inferior a 0,5 x109 células por litro, o inferior a 0,3 x109 células por litro, o inferior a 0,1 x109 células por litro.
Recuento de glóbulos blancos (recuento de leucocitos): El número de glóbulos blancos (WBC) en la sangre. Los glóbulos blancos usualmente se miden como parte del CBC (recuento sanguíneo completo). Los glóbulos blancos son las células de la sangre que luchan contra las infecciones y se diferencian de los glóbulos rojos (que transportan oxígeno) conocidos como eritrocitos. Existen diferentes tipos de glóbulos blancos, incluidos los neutrófilos (leucocitos polimorfonucleares; PMN), las células en banda (neutrófilos ligeramente inmaduros), los linfocitos de tipo T (células T), los linfocitos de tipo B (células B), los monocitos, los eosinófilos y los basófilos. Todos los tipos de glóbulos blancos se reflejan en el recuento de glóbulos blancos. El intervalo normal del recuento de glóbulos blancos usualmente está entre 4.300 y 10.800 células por milímetro cúbico de sangre. También puede denominarse recuento de leucocitos y puede expresarse en unidades internacionales como 4,3 -10,8 x109 células por litro.
En una realización particular de la presente invención, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado sufre de neutropenia. En una realización particular de la presente invención, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado tiene un recuento de neutrófilos inferior a 2 x109 células por litro, o inferior a 1 x109 células por litro, o inferior a 0,5 x109 células por litro, o inferior a 0,1 x109 células por litro, o inferior a 0,05 x109 células por litro.
Un recuento bajo de glóbulos blancos o "neutropenia" es una condición caracterizada por niveles anormalmente bajos de neutrófilos en la sangre circulante. Los neutrófilos son un tipo específico de glóbulos blancos que ayudan a prevenir y combatir las infecciones. La razón más común por la que los pacientes con cáncer experimentan neutropenia es como efecto secundario de la quimioterapia. La neutropenia inducida por la quimioterapia aumenta el riesgo de infección del paciente e interrumpe el tratamiento del cáncer.
En una realización particular de la presente invención, el sujeto inmunocomprometido que va a ser vacunado tiene un recuento de células CD4+ inferior a 500/mm3, o un recuento de células<c>D4+ inferior a 300/mm3, o un recuento de células CD4+ inferior a 200/mm3, un recuento de células CD4+ inferior a 100/mm3, un recuento de células CD4+ inferior a 75/mm3, o un recuento de células CD4+ inferior a 50/mm3.
Las pruebas de células CD4 se informan normalmente como el número de células en mm3. Los recuentos normales de CD4 están entre 500 y 1600, y los recuentos de CD8 están entre 375 y 1100. Los recuentos de CD4 disminuyen drásticamente en las personas con VIH.
En una realización de la invención, cualquiera de los sujetos inmunocomprometidos divulgados en el presente documento es un macho humano o una hembra humana.
La cantidad de un conjugado en una composición se calcula generalmente en base al total de polisacáridos, conjugados y no conjugados para ese conjugado. Por ejemplo, un conjugado con un 20 % de polisacárido libre tendrá aproximadamente 80 |jg de polisacárido conjugado y aproximadamente 20 |jg de polisacárido no conjugado en una dosis de 100 jg de polisacárido. La contribución de las proteínas al conjugado no suele tenerse en cuenta a la hora de calcular la dosis de un conjugado. Generalmente, cada dosis comprenderá de 0,1 a 100 jg de polisacárido, particularmente de 0,1 a 10 jg , y más particularmente de 1 a 10 jg y más particularmente de 1 a 5 jg . Preferentemente, cada dosis comprenderá aproximadamente 1,1, 2, 2,2, 3, 3,3, 4, 4,4 jg de polisacárido.
Las cantidades óptimas de componentes para una composición o vacuna inmunogénica particular pueden determinarse mediante estudios estándar que involucren la observación de las respuestas inmunitarias adecuadas en los sujetos. Tras la vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias vacunas de refuerzo adecuadamente espaciadas.
La efectividad de un antígeno como inmunógeno puede medirse mediante ensayos de proliferación, mediante ensayos citolíticos, tales como los ensayos de liberación de cromo para medir la capacidad de una célula T de lisar su célula diana específica, o midiendo los niveles de actividad de las células B mediante la medición de los niveles de anticuerpos circulantes específicos para el antígeno en el suero. También puede detectarse una respuesta inmunitaria midiendo los niveles séricos de anticuerpos específicos contra el antígeno inducidos tras la administración del mismo y, más concretamente, midiendo la capacidad de los anticuerpos así inducidos para aumentar la capacidad opsonofagocítica de determinados glóbulos blancos, como se describe en el presente documento. El nivel de protección de la respuesta inmunitaria puede medirse desafiando al huésped inmunizado con el antígeno que se le ha administrado. Por ejemplo, si el antígeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria es una bacteria, el nivel de protección inducido por la cantidad inmunogénica del antígeno se mide detectando el porcentaje de supervivencia o el porcentaje de mortalidad después de la provocación de los animales con las células bacterianas. En una realización, la cantidad de protección puede medirse midiendo al menos un síntoma asociado a la infección bacteriana, por ejemplo, una fiebre asociada a la infección. La cantidad de cada uno de los antígenos en las vacunas o composiciones inmunogénicas multiantígeno o multicomponente variará con respecto a cada uno de los otros componentes y puede determinarse por procedimientos conocidos por el artesano experto. Estos procedimientos incluirían procedimientos para medir la inmunogenicidad y/o la eficaciain vivo.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación del polisacárido capsular aislado de Streptococcus pneumoniae del serotipo 15B
1.1 Fermentación y Purificación
Los polisacáridos capsulares del serotipo 15B pueden obtenerse directamente de las bacterias utilizando procedimientos de aislamiento conocidos por un experto en la técnica. (véase, por ejemplo, los procedimientos divulgados en las publicaciones de solicitudes de Patente U.S. Pub. Nos. 20060228380, 20060228381,20070184071, 20070184072, 20070231340 y 20080102498 o WO2008118752). LosStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B se cultivaron en un frasco de semillas y luego se transfirieron a un fermentador de semillas. Una vez alcanzada la densidad óptica deseada, las células se transfirieron a un fermentador de producción. El caldo de fermentación se inactivó mediante la adición de N-lauroil sarcosina y se purificó por ultrafiltración y diafiltración.
El polisacárido purificado deStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B fue luego clasificado por homogeneización a alta presión utilizando un homogeneizador PANDA 2K® (GEA Niro Soavi) para producir el polisacárido aislado deStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B.
Preferentemente, el polisacárido capsular aislado deStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B obtenido por el procedimiento anterior comprende al menos acetato 0,6 mM por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B y tiene un peso molecular entre 50 kDa y 500 kDa, preferentemente 150 a 350 kDa
1.2. Oxidación del polisacárido capsular deStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B aislado
La oxidación del polisacárido se llevó a cabo en un tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 6,0 ± 0,2) mediante la adición secuencial de una cantidad calculada de tampón de fosfato de potasio 500 mM (pH 6,0) y WFI para dar una concentración final de polisacárido de 2,0 g/l. En caso necesario, el pH de la reacción se ajustó a 6,0, aproximadamente. Después del ajuste del pH, la temperatura de reacción se ajustó a 23 ± 2 °C. La oxidación se inició con la adición de aproximadamente 0,25 equivalentes molares de peryodato de sodio. La reacción de oxidación se realizó a 23 ± 2 °C durante 16 horas aproximadamente.
La concentración y la diafiltración del polisacárido activado se llevaron a cabo utilizando casetes de ultrafiltración de 100K MWCO. La diafiltración se realizó frente a diavolúmenes de 20 veces de WFI. El polisacárido activado purificado se almacenó luego a 5 ± 3 °C. El sacárido activado purificado se caracterizó, entre otras cosas, por (i) concentración de sacárido por ensayo colorimétrico; (ii) concentración de aldehído por ensayo colorimétrico; (iii) Grado de oxidación (iv) Peso molecular por SEC-MALLS y (v) la presencia de O-acetilo.
El SEC-MALLS se utiliza para la determinación del peso molecular de los polisacáridos y de los conjugados polisacárido-proteína. La SEC se utiliza para separar los polisacáridos por volumen hidrodinámico. Para la determinación del peso molecular se utilizan detectores de índice de refracción (RI) y de dispersión de luz láser multiángulo (MALLS). Cuando la luz interactúa con la materia, se dispersa y la cantidad de luz dispersada está relacionada con la concentración, el cuadrado del dn/dc (los incrementos del índice de refracción específico) y la masa molar de la materia. La medición del peso molecular se calcula a partir de las lecturas de la señal de luz dispersa del detector MALLS y de la señal de concentración del detector RI.
El grado de oxidación (DO = moles de unidad repetitiva de azúcar/moles de aldehído) del polisacárido activado se determinó como sigue:
Los moles de la unidad repetitiva de azúcar se determinan por diversos procedimientos colorimétricos, por ejemplo utilizando el procedimiento de Anthrone. Mediante el procedimiento de Anthrone, el polisacárido se descompone primero en monosacáridos por la acción del ácido sulfúrico y el calor. El reactivo de Antrona reacciona con las hexosas para formar un complejo de color amarillo-verde cuya absorbancia se lee espectrofotométricamente a 625 nm. Dentro del intervalo del ensayo, la absorbancia es directamente proporcional a la cantidad de hexosa presente.
Los moles de aldehído también se determinan simultáneamente, utilizando el procedimiento colorimétrico MBTH. El ensayo MBTH implica la formación de un compuesto de azina mediante la reacción de grupos aldehídos (de una muestra determinada) con una hidrazona de 3-metil-2-benzotiazolona (reactivo del ensayo MBTH). El exceso de 3-metil-2-benzotiazolona hidrazona se oxida para formar un catión reactivo. El catión reactivo y la azina reaccionan para formar un cromóforo azul. El cromóforo formado se lee entonces espectroscópicamente a 650 nm.
Preferentemente, el polisacárido capsular activado deStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B obtenido mediante el procedimiento anterior comprende al menos acetato 0,6 mM por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B y tiene un peso molecular entre 50 kDa y 500 kDa, preferentemente 100 a 250 kDa.
1.3. Conjugación de un polisacárido capsular activado deStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B con CRM197 El procedimiento de conjugación consiste en las siguientes etapas:
a) Compuesto con excipiente de sacarosa, y liofilización.
b) Reconstitución del polisacárido activado liofilizado y del CRM197.
c) Conjugación del polisacárido activado con el CRM197 y el cubrimiento
d) Purificación del conjugado
a) Composición con excipiente de sacarosa y liofilización
El polisacárido activado fue compuesto con sacarosa en una relación de 25 gramos de sacarosa por gramo de polisacárido activado. El frasco de la mezcla compuesta se liofilizó a continuación. Tras la liofilización, los frascos que contenían el polisacárido activado liofilizado se almacenaron a -20 ± 5 °C. La cantidad calculada de proteína CRM197 se congeló externamente y se liofilizó por separado. El CRM197 liofilizado se almacenó a -20 ± 5 °C.
b) Reconstitución del polisacárido activado liofilizado y de la proteína CRM197
El polisacárido activado liofilizado se reconstituyó en dimetilsulfóxido (DMSO) anhidro. Tras la disolución completa del polisacárido, se añadió una cantidad igual de DMSO anhidro al CRM197 liofilizado para su reconstitución.
c) Conjugación y cubrimiento
El polisacárido activado reconstituido se combinó con CRM197 reconstituido en el recipiente de reacción (relación de entrada: 0,8:1), seguido de una mezcla completa hasta obtener una solución transparente antes de iniciar la conjugación con cianoborohidruro de sodio. La concentración final de polisacárido en la solución de reacción es de aproximadamente 1 g/l. La conjugación se inició añadiendo 1,0 - 1,5 MEq de cianoborohidruro de sodio a la mezcla de reacción y se incubó a 23 ± 2 °C durante 40-48 h. La reacción de conjugación se terminó añadiendo 2 MEq de borohidruro de sodio (NaBH4) para cubrir los aldehidos sin reaccionar. Esta reacción de cubrimiento continuó a 23 ± 2 °C durante 3 ± 1 h.
d) Purificación del conjugado
La solución de conjugado se diluyó 1:10 con succinato 5 mM-0,9 % salino (pH 6,0) refrigerado en preparación para la purificación por filtración de flujo tangencial utilizando membranas de 100-300 K MWCO. La solución de conjugado diluido se pasó a través de un filtro de 5 pm y la diafiltración se realizó utilizando succinato 5 mM-0,9 % de solución salina (pH 6,0) como medio. Una vez completada la diafiltración, el retentado del conjugado se transfirió a través de un filtro de 0,22pm.
El conjugado se diluyó adicionalmente con succinato 5 mM/solución salina al 0,9% (pH 6), hasta una concentración de sacárido objetivo de aproximadamente 0,5 mg/ml. Se completó la etapa final de filtración de 0,22 pm para obtener el conjugado inmunogénico.
Preferentemente, el conjugado obtenido mediante el procedimiento anterior comprende al menos acetato 0,6 mM por mM de polisacárido capsular del serotipo 15B, tiene un peso molecular entre 3000 y 20000 kDa y tiene un grado de conjugación entre 2 y 6.
Ejemplo 2: Caracterización de un conjugado inmunogénico que comprende el polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae del serotipo 15B enlazado covalentemente a un CRM197
El conjugado 1 se preparó mediante el procedimiento divulgado en el ejemplo 1. Los conjugados 2 y 3 se prepararon mediante un procedimiento similar usando diferentes cantidades de agente oxidante. El conjugado 4 se preparó mediante un procedimiento similar excepto que el polisacárido capsular purificado del serotipo 15B no se dimensionó y se activó a un DO más bajo (nivel de oxidación más alto) y la conjugación se realizó en medio acuoso. El conjugado 5 se preparó mediante un procedimiento similar excepto que el polisacárido capsular purificado del serotipo 15B se dimensionó mediante hidrólisis química y la conjugación se realizó en medio acuoso. Los conjugados 6 y 7 se prepararon mediante un procedimiento similar excepto que el polisacárido capsular purificado del serotipo 15B no fue dimensionado. Los conjugados obtenidos se caracterizaron y los resultados se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1:Conjugados de polisacárido capsular deStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B-CRMi97
El porcentaje de polisacárido libre se mide mediante un procedimiento que utiliza gel de hidróxido de aluminio para unir proteínas y sacáridos unidos covalentemente para su eliminación por centrifugación. Las muestras se mezclan con gel de hidróxido de aluminio tamponado con fosfato y se centrifugan. El sacárido unido se sedimenta con el gel y el sacárido libre permanece en el sobrenadante. El sobrenadante resultante y las muestras de control se cuantifican mediante ensayos colorimétricos apropiados para determinar el porcentaje de sacárido libre y confirmar la eliminación suficiente de proteína y la recuperación de sacárido.
Para el análisis de aminoácidos, la muestra de polisacárido-proteína se hidroliza primero en sus componentes individuales como aminoácidos libres, usando hidrólisis de ácido clorhídrico (HCl) 6N bajo vacío y calor (160 °C durante 15 minutos). Después de la hidrólisis, las muestras se analizan utilizando el analizador de aminoácidos. Los aminoácidos individuales se separan mediante cromatografía de intercambio iónico usando un gradiente escalonado de tampón de citrato de sodio con cambios de temperatura y caudal. Después de la separación, la cantidad de cada aminoácido residual se determina cuantitativamente usando un sistema de detección de acoplamiento de ninhidrina poscolumna. En este sistema, la ninhidrina se mezcla con el eluido de la columna en el sistema de reactor poscolumna y la mezcla se pasa al fotómetro. La reacción de la ninhidrina con los aminoácidos eluidos produce un compuesto de color púrpura que se absorbe al máximo a 570 nm. Esta absorbancia es una respuesta lineal (función) de la cantidad de grupos a-amino presentes y esta reacción proporciona un ensayo colorimétrico cuantitativo para todos los compuestos orgánicos con grupos a-amino. En la reacción con iminoácidos tales como prolina e hidroxilprolina, que no tienen grupo amino libre, se genera un compuesto de color amarillo brillante y se monitoriza a 440 nm. Las áreas de los picos para cada aminoácido se calculan usando salidas de longitud de onda de 570 y 440 nm.
El rendimiento se calcula como sigue: (cantidad de polisacárido en el conjugado x100)/cantidad de polisacárido activado.
Los conjugados (4 y 5) generados usando en medio acuoso demostraron una pérdida significativa en los niveles de O-acetilo. Los conjugados generados en disolvente DMSO, usando polisacárido nativo sin dimensionar el MW (6 y 7) no demostraron pérdida en los niveles de O-acetilo. Sin embargo, los rendimientos del conjugado fueron muy pobres además de las malas características de filtrabilidad. Los conjugados generados en DMSO usando polisacáridos que fueron dimensionados por homogeneización a alta presión (1, 2 y 3) tuvieron un alto rendimiento y mejores características de filtrabilidad con una preservación significativa de los niveles de O-acetilo. Estos conjugados también tenían niveles muy bajos de polisacáridos libres.
Ejemplo 3: Ensayo de actividad opsonofagocítica (OPA)
La inmunogenicidad de los conjugados de la invención puede evaluarse utilizando el ensayo opsonofagocítico (OPA) descrito a continuación.
Grupos de 30 ratones Swiss Webster hembra de 6-7 semanas de edad fueron inmunizados con 0,001 |jg, 0,01 |jg o 0,1 jg de conjugados de prueba por vía subcutánea en la semana 0. Los ratones fueron reforzados con la misma dosis de conjugado en la semana 3 y luego sangraron en la semana 4. Se realizaron OPAs específicos del serotipo en muestras de suero de la semana 4.
Se utilizan ensayos OPA para medir anticuerpos funcionales en sueros murinos específicos para S.pneumoniaedel serotipo 15B. El suero de la prueba se prepara en reacciones de ensayo que miden la capacidad de la inmunoglobulina específica del polisacárido capsular para opsonizar las bacterias, desencadenar la deposición del complemento, facilitando así la fagocitosis y la eliminación de las bacterias por los fagocitos. El título OPA se define como la dilución recíproca que da como resultado una reducción del 50 % del recuento bacteriano con respecto a los pocillos de control sin suero de prueba. El título de OPA se interpola a partir de las dos diluciones que abarcan este límite de muerte del 50 %.
Los procedimientos de OPA se basaron en los procedimientos descritos en Hu et al., Clin Diagn Lab Immunol 2005;12(febrero (2)):287-95 con las siguientes modificaciones. El suero de prueba se diluyó en serie 2,5 veces y se añadió a las placas de ensayo de microtitulación. Se añadieron bacterias diana vivas del serotipo 15B a los pocillos y las placas se agitaron a 37 °C durante 30 minutos. Se añadieron a los pocillos células HL-60 diferenciadas (fagocitos) y suero de conejo bebé (de 3 a 4 semanas de edad, Pel-Freez®, 6,25 % de concentración final), y las placas se agitaron a 37 °C durante 45 minutos. Para terminar la reacción, se añadieron 80 j l de NaCl al 0,9 % a todos los pocillos, se mezclaron y se transfirió una alícuota de 10 j l a los pocillos de las placas de filtro MultiScreen HTS HV (Millipore®) que contenían 200 j l de agua. El líquido se filtró a través de las placas al vacío, y se añadieron 150 j l de medio HySoy a cada pocillo y se filtraron. A continuación, las placas de filtro se incubaron a 37 °C, 5 % de CO2 durante la noche y se fijaron con Destain Solution (Bio-Rad). A continuación, las placas se tiñeron con azul de Coomassie y se destiñeron una vez. Las colonias se visualizaron y enumeraron en un Cellular Technology Limited (CTL) ImmunoSpot Analyzer®. Los recuentos crudos de colonias se utilizaron para trazar las curvas de mortalidad y calcular los títulos de OPA.
La inmunogenicidad de los conjugados 1 y 2 se ha probado de acuerdo con el ensayo mencionado anteriormente. También se probaron en el mismo ensayo un conjugado adicional y un polisacárido capsular de S.pneumoniaenativo no conjugado del serotipo 15B (PS no conjugado):
El conjugado 9 se preparó mediante conjugación de polisacárido capsular nativo del serotipo 15B (es decir, no dimensionado) a CRM197 mediante aminación reductora en solución acuosa.
Los resultados se muestran en la tabla 2.
Tabla 2: Títulos de OPA de pruebas con animales
Como se muestra en la tabla anterior, los conjugados 1 y 2, cuando se administran a ratones, generan anticuerpos capaces de opsonizar el serotipo 15B de S.pneumoniae,desencadenando la deposición del complemento, lo que facilita la fagocitosis y la muerte de bacterias por fagocitos. Además, a pesar de su menor peso molecular, también exhibieron un nivel similar de inmunogenicidad en comparación con el conjugado 9 que no ha sido dimensionado.
Ejemplo 4: Respuestas de OPA multifuncionales entre el serotipo 15B y el serotipo 15C
El serogrupo 15 de neumococos incluye cuatro serotipos relacionados estructuralmente: 15A, 15B, 15C y 15F. Los serotipos 15B y 15C no se pueden distinguir mediante técnicas de tipificación genética y tienen una composición similar de polisacárido capsular (PS), excepto que el 15B-PS es la variante O-acetilada de 15C-PS. Para comprender si los anticuerpos PS anti- capsulares para el serotipo 15B tienen una reacción cruzada funcional con el serotipo 15C, se inmunizaron 10 conejos con vacunas PCV16v y PCV20v, ambas conteniendo un conjugado inmunogénico que comprende el polisacárido capsular deStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B enlazado covalentemente a CRM197 como se divulga en este documento como parte de su formulación. Los sueros de antes y después de la vacunación se probaron en ensayos de OPA contra cepas neumocócicas diana de los serotipos 15B y 15C.
De los 10 conejos de cada grupo, el 100 % tuvo respuesta de OPA al serotipo 15B después de la inmunización con un conjugado del serotipo 15B. De estas mismas muestras, el 100 % también tuvo respuesta de OPA al serotipo 15C (Tabla 1 y Tabla 2). Se observaron títulos bajos de OPA en sueros previos a la vacunación en 15C OPA. Sin embargo, un aumento de más de 10 veces el título de GMT OPA con sueros posvacunación en comparación con la prevacunación demostró que los conjugados inmunogénicos de la invención inducen la formación de anticuerpos capaces de matar laStreptococcus pneumoniaedel serotipo 15B y 15C en un OPA.
PCV16v es una composición de conjugados 16 valencias que comprende glicoconjugados de S.pneumoniaede serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F (16vPnC) todos individualmente conjugados con CRM197.
PCV20v es una composición de conjugados de 20 valencia que comprende glicoconjugados deS. pneumoniaede serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F (20vPnC) todos ellos conjugados individualmente con CRM197.
Tabla 1. Títulos de OPA contra cepas de los serotipos 15B y 15C en sueros de conejo antes y después de la vacunación con PCV16v
Tabla 2. Títulos de OPA contra cepas de los serotipos 15B y 15C en sueros de conejo antes y después de la vacunación con PCV20v

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una composición inmunogénica que comprende un conjugado inmunogénico que comprende un polisacárido capsular deStreptococcus pneumoniaede serotipo 15B aislado unido covalentemente a una proteína portadora en la que dicho conjugado comprende al menos 0,6 mM de acetato por mM de dicho polisacárido capsular de serotipo 15B, para su uso en un procedimiento para prevenir la infección conStreptococcus pneumoniaede serotipo 15C, comprendiendo el procedimiento administrar a un sujeto una cantidad inmunogénica de dicha composición inmunogénica.
2. La composición inmunogénica para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho polisacárido capsular de serotipo 15B tiene un peso molecular entre 100 kDa y 350 kDa.
3. La composición inmunogénica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que dicho conjugado comprende al menos 0,6 mM de glicerol por mM de dicho polisacárido capsular de serotipo 15B.
4. La composición inmunogénica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicha proteína transportadora es CRM197.
5. La composición inmunogénica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el conjugado inmunogénico comprende menos del 40, 35, 30, 25, 20 o 15% de polisacárido capsular de serotipo 15B libre en comparación con la cantidad total de polisacárido capsular de serotipo 15B.
6. La composición inmunogénica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la que el conjugado inmunogénico tiene un peso molecular entre 10000 y 16000 KDa.
7. La composición inmunogénica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la relación (peso en peso) de polisacárido capsular de serotipo 15B a proteína portadora en el conjugado está entre 0,7 y 0,9.
8. La composición inmunogénica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el grado de conjugación está entre: 2 y 15; 2 y 13; 2 y 10; 2 y 8; 2 y 6; 2 y 5; 2 y 4; 3 y 15; 3 y 13; 3 y 10; 3 y 8; 3 y 6; 3 y 5; 3 y 4; 5 y 15; 5 y 10; 8 y 15; 8 y 12; 10 y 15; o 10 y 12.
9. La composición inmunogénica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 que comprende además al menos un antígeno adicional.
10. La composición inmunogénica para uso de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende además un adyuvante.
11. La composición inmunogénica para uso de acuerdo con la reivindicación 10, donde el adyuvante es fosfato de aluminio.
ES19179577T 2014-01-21 2015-01-15 Polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae y conjugados de los mismos Active ES2965616T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461929561P 2014-01-21 2014-01-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2965616T3 true ES2965616T3 (es) 2024-04-16

Family

ID=52630421

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15708581T Active ES2883571T3 (es) 2014-01-21 2015-01-15 Polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae y conjugados de los mismos
ES19179577T Active ES2965616T3 (es) 2014-01-21 2015-01-15 Polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae y conjugados de los mismos

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15708581T Active ES2883571T3 (es) 2014-01-21 2015-01-15 Polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae y conjugados de los mismos

Country Status (22)

Country Link
US (3) US20160324949A1 (es)
EP (3) EP3096786B1 (es)
JP (3) JP6585624B2 (es)
KR (4) KR20210032013A (es)
CN (2) CN106413747A (es)
AU (3) AU2015208822B2 (es)
BR (2) BR112016016580B1 (es)
CA (1) CA2937190A1 (es)
DK (2) DK3096786T3 (es)
ES (2) ES2883571T3 (es)
FI (1) FI3583947T3 (es)
FR (1) FR22C1041I2 (es)
HK (1) HK1232133A1 (es)
HR (2) HRP20231504T1 (es)
HU (2) HUE064837T2 (es)
IL (2) IL311385A (es)
MX (2) MX2020001138A (es)
PL (2) PL3583947T3 (es)
PT (2) PT3583947T (es)
RU (2) RU2743793C1 (es)
SI (2) SI3096786T1 (es)
WO (1) WO2015110942A2 (es)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
RU2710393C2 (ru) * 2014-01-21 2019-12-26 Пфайзер Инк. Способ получения иммуногенного конъюгата капсульный полисахарид Streptococcus pneumoniae-белок-носитель
IL297740A (en) 2015-05-04 2022-12-01 Pfizer Protein-polysaccharide conjugates of group b streptococcus, methods for preparing the conjugates, immunogenic preparations containing conjugates and their uses
MY192183A (en) 2015-07-21 2022-08-05 Pfizer Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
AU2017306708B2 (en) 2016-08-05 2021-08-26 Sk Bioscience Co., Ltd. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
SG11201900794PA (en) 2016-08-05 2019-02-27 Sanofi Pasteur Inc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EP3562838A2 (en) 2016-12-28 2019-11-06 Henriques Normark, Birgitta Microparticles from streptococcus pneumoniae as vaccine antigens
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
WO2018126229A2 (en) 2016-12-30 2018-07-05 Sutrovax, Inc. Polypeptide-antigen conjugates with non-natural amino acids
CN110198735A (zh) * 2017-01-20 2019-09-03 辉瑞公司 用于肺炎球菌疫苗中的免疫原性组合物
CN116870144A (zh) 2017-01-31 2023-10-13 默沙东有限责任公司 制备多糖-蛋白缀合物的方法
US11246918B2 (en) 2017-02-03 2022-02-15 Eva Barbara Schadeck Haemophilus influenzae saccharide-carrier conjugate compositions and uses thereof
BR112019017560A2 (pt) 2017-02-24 2020-04-07 Merck Sharp & Dohme intensificação da imunogenicidade dos conjugados de polissacarídeo-proteína de streptococcus pneumoniae
WO2018222741A1 (en) * 2017-05-31 2018-12-06 Oklahoma Medical Research Foundation Bispecific antibodies for the treatment of streptococcus pneumonia
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
BR112019026192B1 (pt) 2017-06-10 2022-05-10 Inventprise, Llc Vacinas de conjugado multivalente com polissacarídeos de conjugado bivalente ou multivalente que fornecem imunogenicidade e avidez melhoradas
WO2019043245A1 (en) * 2017-09-04 2019-03-07 London School Of Hygiene And Tropical Medicine MICROBIAL CELLS EXPRESSING STREPTOCOCCAL SERROTYPES
MX2020002557A (es) 2017-09-07 2020-07-13 Merck Sharp & Dohme Polisacaridos neumococicos y su uso en conjugados de polisacarido inmunogenico con proteina.
CN111065387B (zh) 2017-09-07 2023-08-25 默沙东有限责任公司 肺炎球菌多糖及其在免疫原性多糖-载体蛋白缀合物中的用途
GEP20227420B (en) * 2017-12-06 2022-10-10 Merck Sharp & Dohme Llc Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
AU2019215216A1 (en) 2018-02-05 2020-07-23 Sk Bioscience Co., Ltd. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
MX2020007939A (es) 2018-02-05 2020-09-03 Sanofi Pasteur Inc Composicion del conjugado proteina-polisacarido multivalente nuemococica.
BR112020021296A2 (pt) 2018-04-18 2021-01-26 Sk Bioscience Co., Ltd. polissacarídeo capsular de streptococcus pneumoniae e conjugado imunogênico do mesmo
EP3787673A4 (en) * 2018-04-30 2022-04-27 Merck Sharp & Dohme Corp. METHODS FOR PRODUCING CAPSULAR CARRIER PROTEIN-POLYSACCHARIDE CONJUGATES OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
US11896656B2 (en) 2018-04-30 2024-02-13 Merck Sharp & Dohme Llc Methods for providing a homogenous solution of lyophilized mutant diptheria toxin in dimethylsulfoxide
AU2019299836A1 (en) * 2018-07-04 2021-02-25 Vaxcyte, Inc. Improvements in immunogenic conjugates
MX2021003358A (es) * 2018-09-23 2021-05-27 Biological E Ltd Polisacaridos capsulares purificados de streptococcus pneumoniae.
JOP20210148A1 (ar) 2018-12-19 2023-01-30 Merck Sharp & Dohme تركيبات تشتمل على متقارنات بولي سكاريد-بروتين للمكورات العقدية الرئوية وطرق استخدامها
JP7239509B6 (ja) * 2019-02-22 2023-03-28 ファイザー・インク 細菌多糖類を精製するための方法
AU2020315673A1 (en) * 2019-07-18 2022-02-10 Celltrion, Inc. Immunogenic composition comprising multivalent Streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates
KR20220042378A (ko) * 2019-07-31 2022-04-05 사노피 파스퇴르 인코포레이티드 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물 및 그 사용 방법
EP4150104A1 (en) * 2020-05-14 2023-03-22 Serum Institute Of India Private Limited Methods for simultaneous fragmentation and purification of bacterial polysaccharides
KR20230097160A (ko) * 2020-11-04 2023-06-30 화이자 인코포레이티드 폐렴구균 백신에 사용하기 위한 면역원성 조성물

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4686102A (en) * 1984-04-12 1987-08-11 American Cyanamid Company Multivalent pneumococcal vaccine and preparation thereof
US4709017A (en) 1985-06-07 1987-11-24 President And Fellows Of Harvard College Modified toxic vaccines
US4950740A (en) 1987-03-17 1990-08-21 Cetus Corporation Recombinant diphtheria vaccines
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
DE3841091A1 (de) 1988-12-07 1990-06-13 Behringwerke Ag Synthetische antigene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
EP0378881B1 (en) 1989-01-17 1993-06-09 ENIRICERCHE S.p.A. Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
CA2017507C (en) 1989-05-25 1996-11-12 Gary Van Nest Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
AU651949B2 (en) 1989-07-14 1994-08-11 American Cyanamid Company Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
IL98715A0 (en) 1990-08-13 1992-07-15 American Cyanamid Co Filamentous hemaglutinin of bodetella pertussis as a carrier molecule for conjugate vaccines
US5153312A (en) * 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
CA2059693C (en) * 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
CA2059692C (en) * 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
IL101715A (en) 1991-05-02 2005-06-19 Amgen Inc Recombinant dna-derived cholera toxin subunit analogs
JPH07507854A (ja) 1991-12-23 1995-08-31 ツォッヒェ，ミヒャエル 油除去装置を備えたエンジン
CA2129899C (en) 1992-02-11 2011-01-04 James J. Mond Dual carrier immunogenic construct
IT1262896B (it) 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
AU4230493A (en) 1992-05-06 1993-11-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin receptor-binding region
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
ES2231770T3 (es) 1993-03-05 2005-05-16 Wyeth Holdings Corporation Nuevos plasmidos para la produccion de proteina crm y toxina difterica.
JP3828145B2 (ja) 1993-09-22 2006-10-04 ヘンリー エム．ジャクソン ファウンデイション フォー ザ アドバンスメント オブ ミリタリー メディスン 免疫原性構成物の製造のための新規シアン化試薬を使った可溶性炭水化物の活性化方法
US6455673B1 (en) 1994-06-08 2002-09-24 President And Fellows Of Harvard College Multi-mutant diphtheria toxin vaccines
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
ATE420171T1 (de) 1994-07-15 2009-01-15 Univ Iowa Res Found Immunomodulatorische oligonukleotide
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
ATE241384T1 (de) 1995-03-22 2003-06-15 Jackson H M Found Military Med Herstellung von immunogenen konstrukten unter verwendung von löslichen kohlehydraten, die durch organische cyanylierungs-reagenzien aktiviert wurden
US5714354A (en) * 1995-06-06 1998-02-03 American Home Products Corporation Alcohol-free pneumococcal polysaccharide purification process
WO1998037919A1 (en) 1997-02-28 1998-09-03 University Of Iowa Research Foundation USE OF NUCLEIC ACIDS CONTAINING UNMETHYLATED CpG DINUCLEOTIDE IN THE TREATMENT OF LPS-ASSOCIATED DISORDERS
US6299881B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
EP1003531B1 (en) 1997-05-20 2007-08-22 Ottawa Health Research Institute Processes for preparing nucleic acid constructs
GB9713156D0 (en) 1997-06-20 1997-08-27 Microbiological Res Authority Vaccines
AU760549B2 (en) 1998-04-03 2003-05-15 University Of Iowa Research Foundation, The Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines
DK1117435T3 (da) 1998-09-30 2008-03-17 Wyeth Corp Muteret cholera-holotoxin som adjuvans
JP4689044B2 (ja) 1998-12-21 2011-05-25 メディミューン，インコーポレーテッド ワクチン用の肺炎連鎖球菌タンパク質と免疫原断片
KR100802198B1 (ko) 1998-12-23 2008-02-11 샤이어 바이오켐 인코포레이티드 신규한 스트렙토코커스 항원
US6936258B1 (en) 1999-03-19 2005-08-30 Nabi Biopharmaceuticals Staphylococcus antigen and vaccine
WO2000061761A2 (en) 1999-04-09 2000-10-19 Techlab, Inc. Recombinant clostridium toxin a protein carrier for polysaccharide conjugate vaccines
GB0007432D0 (en) 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Proteins for use as carriers in conjugate vaccines
WO2001098334A2 (en) 2000-06-20 2001-12-27 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
US20030035806A1 (en) 2001-05-11 2003-02-20 D'ambra Anello J. Novel meningitis conjugate vaccine
IL159209A0 (en) 2001-06-07 2004-06-01 Wyeth Corp Mutant forms of cholera holotoxin as an adjuvant
CN1977971A (zh) 2001-06-07 2007-06-13 惠氏控股有限公司 作为佐剂的霍乱全毒素的突变体形式
WO2003024480A2 (en) 2001-09-14 2003-03-27 Cytos Biotechnology Ag In vivo activation of antigen presenting cells for enhancement of immune responses induced by virus like particles
AU2002351623A1 (en) 2001-12-20 2003-07-09 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
US8084235B2 (en) 2003-03-13 2011-12-27 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Purification process for bacterial cytolysin
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
EP1781325A2 (en) 2004-07-18 2007-05-09 CSL Limited Immuno stimulating complex and oligonucleotide formulations for inducing enhanced interferon-gamma responses
US20070184072A1 (en) 2005-04-08 2007-08-09 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
CN102716480B (zh) 2005-04-08 2023-03-21 惠氏有限责任公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物
US7955605B2 (en) * 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
JP5049264B2 (ja) 2005-04-08 2012-10-17 ワイス・エルエルシー ｐＨ操作によるストレプトコッカス・ニューモニエ多糖からの混入物の分離
US7709001B2 (en) 2005-04-08 2010-05-04 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
CA2808919C (en) * 2005-12-22 2016-04-19 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Streptococcus pneumoniae capsular saccharide vaccine
CL2007002909A1 (es) 2006-10-10 2008-04-18 Wyeth Corp Metodo para reduccion o extraccion de impurezas de proteinas a partir de lisado celular de streptoccocus pneumoniae que comprende calentar dicho lisado, separar a los precipitantes a partir de dicho lisado produciendo un lisado que contiene polisacar
HUE039169T2 (hu) * 2007-03-23 2018-12-28 Wyeth Llc Rövidített tisztítási eljárás Streptococcus pneumoniae tok-poliszacharidok elõállítására
US20100189740A1 (en) * 2007-06-20 2010-07-29 Francis Michon Modified polysaccharides for conjugate vaccines
EP2687228B1 (en) 2007-06-26 2017-07-19 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates
WO2010125480A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pneumococcal vaccine and uses thereof
JP2012530785A (ja) * 2009-06-22 2012-12-06 ワイス・エルエルシー 組成物および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）血清型５および８莢膜多糖コンジュゲート免疫原性組成物を調製するための方法
TW201136603A (en) 2010-02-09 2011-11-01 Merck Sharp & Amp Dohme Corp 15-valent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine composition
GB201003922D0 (en) * 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
CA2819366A1 (en) * 2010-12-10 2012-06-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel formulations which mitigate agitation-induced aggregation of immunogenic compositions
GB201103836D0 (en) * 2011-03-07 2011-04-20 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
DK2709656T3 (da) * 2011-05-18 2019-06-24 Matrivax Inc Proteinmatrix-vaccinesammensætninger omfattende polykationer
KR102057217B1 (ko) * 2012-06-20 2020-01-22 에스케이바이오사이언스 주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
HUE041381T2 (hu) * 2012-08-16 2019-05-28 Pfizer Glikokonjugációs eljárások és kompozíciók
WO2014097099A2 (en) * 2012-12-20 2014-06-26 Pfizer Inc. Glycoconjugation process
PL3096785T3 (pl) * 2014-01-21 2021-03-08 Pfizer Inc. Kompozycje immunogenne zawierające skoniugowane antygeny sacharydów otoczkowych i ich zastosowania
MY192183A (en) * 2015-07-21 2022-08-05 Pfizer Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
HUE055553T2 (hu) 2021-12-28
AU2020204508A1 (en) 2020-07-23
WO2015110942A2 (en) 2015-07-30
AU2015208822B2 (en) 2020-06-18
IL311385A (en) 2024-05-01
RU2016127123A3 (es) 2018-02-28
HRP20211288T1 (hr) 2021-11-26
MX371453B (es) 2020-01-29
JP2019172701A (ja) 2019-10-10
HRP20231504T1 (hr) 2024-03-01
ES2883571T3 (es) 2021-12-09
AU2020204508B2 (en) 2023-02-02
EP3583947A1 (en) 2019-12-25
MX2020001138A (es) 2021-09-30
US20210121555A1 (en) 2021-04-29
EP3583947B1 (en) 2023-10-11
EP4286000A3 (en) 2024-02-14
SI3583947T1 (sl) 2024-01-31
KR102619514B1 (ko) 2023-12-28
JP6585624B2 (ja) 2019-10-02
BR122023022294A2 (pt) 2023-12-12
CA2937190A1 (en) 2015-07-30
RU2743793C1 (ru) 2021-02-26
JP2017504661A (ja) 2017-02-09
BR112016016580B1 (pt) 2024-01-09
KR102049825B1 (ko) 2019-12-03
KR20190133066A (ko) 2019-11-29
KR102229568B1 (ko) 2021-03-18
CN112336854A (zh) 2021-02-09
CN106413747A (zh) 2017-02-15
SI3096786T1 (sl) 2021-09-30
FI3583947T3 (fi) 2023-10-12
HUE064837T2 (hu) 2024-05-28
WO2015110942A3 (en) 2015-11-26
FR22C1041I2 (fr) 2023-05-26
RU2016127123A (ru) 2018-02-28
AU2023201579A1 (en) 2023-04-13
RU2688831C2 (ru) 2019-05-22
PT3583947T (pt) 2023-12-14
KR20220156982A (ko) 2022-11-28
US20160324949A1 (en) 2016-11-10
EP3096786A2 (en) 2016-11-30
JP2021105036A (ja) 2021-07-26
BR112016016580A2 (pt) 2017-10-03
PL3096786T3 (pl) 2021-11-08
KR20160104076A (ko) 2016-09-02
KR20210032013A (ko) 2021-03-23
DK3583947T3 (da) 2023-11-06
PT3096786T (pt) 2021-08-24
EP4286000A2 (en) 2023-12-06
US20190070283A1 (en) 2019-03-07
DK3096786T3 (da) 2021-08-02
IL246738B1 (en) 2024-04-01
IL246738A0 (en) 2016-08-31
EP3096786B1 (en) 2021-07-07
PL3583947T3 (pl) 2024-04-02
JP7216137B2 (ja) 2023-01-31
AU2015208822A1 (en) 2016-07-21
HK1232133A1 (zh) 2018-01-05
MX2016009469A (es) 2016-10-13
FR22C1041I1 (fr) 2022-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020204508B2 (en) Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and conjugates thereof
US11426456B2 (en) Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and conjugates thereof