BR112016016580B1

BR112016016580B1 - Processo para a preparação de um conjugado imunogênico, conjugado imunogênico, composição imunogênica, e vacina

Info

Publication number: BR112016016580B1
Application number: BR112016016580-2A
Authority: BR
Inventors: Mingming Han; Avvari Krishna Prasad; David Cooper; Wendy Jo Watson
Original assignee: Pfizer Inc
Priority date: 2014-01-21
Filing date: 2015-01-15
Publication date: 2024-01-09
Also published as: FI3583947T3; MX2020001138A; AU2023201579A1; RU2743793C1; CN112336854A; KR20210032013A; IL246738B1; MX2016009469A; US20190070283A1; RU2016127123A; AU2020204508B2; KR20190133066A; ES2883571T3; KR102049825B1; EP3096786A2; JP7216137B2; EP3583947B1; PT3583947T; BR112016016580A2; SI3583947T1

Abstract

polissacarídeos capsulares de streptococcus pneumoniae e conjugados dos mesmos. a invenção refere-se a um polissacarídeo capsular sorotipo 15b de streptococcus pneumoniae isolado e a processos para sua preparação. a invenção também se refere a conjugados imunogênicos compreendendo polissacarídeo capsular sorotipo 15b de streptococcus pneumoniae covalentemente ligado a uma proteína carreadora, a processos para sua preparação e a composições imunogênicas compreendendo os mesmos.

Description

Campo da Invenção

[001] A invenção refere-se a um polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae isolado e processos para sua preparação. A invenção também se refere a conjugados imunogênicos compreendendo polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae covalentemente ligado a uma proteína carreadora, processos para sua preparação e composições imunogênicas compreendendo os mesmos.

Antecedentes

[002] Streptococcus pneumoniae são cocos Gram positivos em forma de lanceta que são usualmente vistos aos pares (diplococos), mas também em cadeias curtas ou como células simples. Eles crescem facilmente em placas de ágar-sangue com colônias cintilantes e exibem alfa-hemólise a menos que cultivados anaerobicamente onde eles mostram beta-hemólise. As células da maioria dos sorotipos pneumocócicos possuem uma cápsula que é um revestimento polissa- carídico envolvendo cada célula. Esta cápsula é um determinante de virulência em seres humanos, uma vez que interfere na fagocitose impedindo que anticorpos se prendam às células bacterianas. Existem atualmente mais de 90 sorotipos capsulares pneumocócicos identificados, com os 23 sorotipos mais comuns sendo responsáveis por apro-ximadamente 90% das doenças invasivas ao redor do mundo. Como uma vacina, o revestimento de polissacarídeo pneumocócico pode conferir um grau razoável de imunidade contra Streptococcus pneumoniae em indivíduos com sistemas imunológicos desenvolvidos ou intactos, mas o polissacarídeo capsular conjugado a uma proteína car- readora adequada possibilita uma resposta imunológica em crianças e idosos que também correm o risco de contrair infecções pneumocóci- cas.

[003] Desde a introdução da primeira vacina conjugada pneumo- cócica septavalente (PCV7 ou Prevnar) em 2000, as doenças invasi- vas decorrentes desses sete sorotipo (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, e 23F) praticamente desapareceram. A adição dos sorotipos 1, 3, 5, 6A, 7F e 19A na Prevnar 13 reduziu ainda o número de doenças pneumocóci- cas invasivas.

[004] No entanto, a incidência de doenças pneumocócicas inva- sivas causadas por sorotipos sem vacina tais como Streptococcus pneumoniae sorotipos 15A, 15B e 15C aumentou recentemente (vide, por exemplo, Beall B. et al., Journal of Clinical Microbiology. 44(3):999- 1017, 2006, ou Jacobs et al., Clin Infect Dis. (2008) 47 (11): 13881395). Nenhuma das de vacinas pneumocócicas comercializadas atualmente oferece proteção apropriada contra Streptococcus pneumoniae sorotipo 15B em seres humanos e em particular em crianças com menos de 2 anos de idade. Por conseguinte, são necessárias composições imunogênicas que possam ser usadas para produzir uma resposta imunológica contra Streptococcus pneumoniae sorotipo 15B. Também seria uma vantagem adicional se tal composição imunogêni- ca pudesse ser usada para proteger indivíduos contra Streptococcus pneumoniae sorotipo 15C e/ou 15A.

Sumário da Invenção

[005] Em um aspecto, a presente invenção oferece um polissaca- rídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae isolado tendo um peso molecular entre 5kDa e 500kDa.

[006] Em um outro aspecto, a presente invenção oferece um po- lissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae isolado compreendendo pelo menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ou 0,8, preferivelmente pelo menos 0,6 mM, de acetato por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae

[007] Em um outro aspecto, a presente invenção oferece um po- lissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae isolado compreendendo pelo menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ou 0,8, preferivelmente pelo menos 0,6 mM de glicerol por mM do referido po- lissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae.

[008] Em um outro aspecto, a presente invenção oferece um con jugado imunogênico compreendendo um polissacarídeo capsular soro- tipo 15B de Streptococcus pneumoniae isolado divulgado nesta invenção covalentemente ligado a uma proteína carreadora. Em um aspecto, a referida proteína carreadora é CRM197.

[009] Em um outro aspecto, a presente invenção oferece uma composição imunogênica compreendendo um conjugado imunogênico divulgado nesta invenção e um veículo fisiologicamente aceitável. Em um aspecto, a referida composição imunogênica compreende ainda pelo menos um antígeno adicional. Em um aspecto, a referida composição imunogênica compreende ainda um adjuvante.

[0010] Em um outro aspecto, a presente invenção oferece uma vacina compreendendo uma composição imunogênica divulgada nesta invenção.

[0011] Em um outro aspecto, a presente invenção oferece um pro cesso para produzir um polissacarídeo sorotipo 15B isolado divulgado nesta invenção, o processo compreendendo as etapas de: (a) preparar uma cultura de fermentação de células bacteri- anas de Streptococcus pneumoniae sorotipo 15B; (b) lisar as células bacterianas na referida cultura de fermentação; (c) purificar o polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae a partir da cultura de fermentação; e, (d) dimensionar o polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae purificado por homogeneização à alta pressão.

[0012] Em um outro aspecto, a presente invenção oferece um pro cesso para produzir um polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae ativado, o referido processo compreendendo a etapa de reagir um polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae isolado divulgado nesta invenção com um agente oxidante. Em um aspecto, a presente invenção oferece um polissaca- rídeo capsular sorotipo 15B ativado obtido ou obtenível pelo processo acima.

[0013] Em um outro aspecto, a presente invenção oferece um pro cesso para a preparação de um conjugado imunogênico compreendendo polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae covalentemente ligado a uma proteína carreadora, o processo compreendendo as etapas de: (a) combinar um polissacarídeo ativado divulgadas nesta invenção com uma proteína carreadora; (b) reagir o polissacarídeo ativado e a proteína carreadora combinados com um agente redutor para formar um conjugado polis- sacarídeo capsular sorotipo 15B-proteína carreadora. Em um aspecto, a presente invenção oferece um conjugado imunogênico obtido ou obtenível pelo processo acima.

[0014] Em um outro aspecto, a presente invenção oferece um mé todo para proteger um indivíduo contra uma infecção pelo sorotipo 15B Streptococcus pneumoniae, o método compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade imunogênica da composição imunogêni- ca ou da vacina divulgada nesta invenção.

[0015] Em um outro aspecto, a presente invenção oferece um mé todo para tratar ou prevenir uma infecção, doença ou condição causa- da por Streptococcus pneumoniae associada ao sorotipo 15A, 15B e/ou 15C de Streptococcus pneumoniae em um indivíduo, o método compreendendo a etapa de administrar uma quantidade terapeutica- mente ou profilaticamente eficaz de uma composição imunogênica ou de uma vacina divulgada nesta invenção.

Breve Descrição dos Desenhos

[0016] Figura 1 - Estrutura da unidade repetitiva do polissacarídeo capsular pneumocócico sorotipo 15B.

Descrição Detalhada da Invenção

[0017] A presente invenção pode ser mais facilmente compreendi da com referência à descrição detalhada que se segue das modalidades preferidas da invenção e dos exemplos incluídos neste relatório. A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste relatório têm o mesmo significado que aquele co- mumente conhecido pelo versado na técnica à qual a invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos nesta invenção possam ser usados na prática ou para testar a presente invenção, certos métodos e materiais preferidos estão descritos nesta invenção. Para descrever as modalidades e reivindicar a invenção, certa terminologia será usada de acordo com as definições apresentadas abaixo.

Definições

[0018] Conforme usado neste relatório, o "peso molecular" de um polissacarídeo ou de um conjugado polissacarídeo-proteína carreado- ra refere-se ao peso molecular calculado por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) combinada com um detector de espalhamento de luz laser multiângulos (MALLS).

[0019] Conforme usado neste relatório, o termo "polissacarídeo livre" significa um polissacarídeo capsular sorotipo 15B que não é co- valentemente conjugado à proteína carreadora, mas ainda assim está presente na composição de conjugado polissacarídeo capsular soroti- po 15B-proteína carreadora. O polissacarídeo livre pode ser não cova- lentemente associado (isto é, não covalentemente ligado, adsorvido, ou aprisionado no ou com) ao conjugado polissacarídeo-proteína car- readora.

[0020] A percentagem de polissacarídeo livre é medida depois da purificação final do conjugado polissacarídeo capsular sorotipo 15B- proteína carreadora. Preferivelmente ela é medida dentro de 4 semanas depois da purificação final. Ela é expressa como uma percentagem do polissacarídeo total na amostra.

[0021] Conforme usado neste relatório, o termo "polissacarídeo sorotipo 15B" ou "polissacarídeo capsular sorotipo 15B" refere-se a um polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae.

[0022] Conforme usado neste relatório, o termo "glicoconjugado sorotipo 15B" ou "conjugado sorotipo 15B" refere-se a um polissacarí- deo sorotipo 15B isolado covalentemente conjugado a uma proteína carreadora.

[0023] Conforme usado neste relatório, o termo "grau de oxidação" (DO) refere-se ao número de unidades repetitivas de açúcar por grupo aldeído geradas quando o polissacarídeo isolado é ativado com um agente oxidante. O grau de oxidação de um polissacarídeo pode ser determinado usando-se métodos de rotina conhecidos pelo versado na técnica.

[0024] Conforme usado neste relatório, o termo "indivíduo" refere- se a um mamífero, incluindo um ser humano, ou a um pássaro, peixe, réptil, anfíbio ou qualquer outro animal. O termo "indivíduo" inclui animais domésticos ou animais de pesquisa. Exemplos não limitativos de animais domésticos e animais de pesquisa incluem: cachorros, gatos, porcos, coelhos, ratos, camundongos, gerbos, hamsters, porquinhos- da-índia, doninhas, macacos, pássaros, cobras, lagartos, peixes, tarta- rugas, e sapos. O termo "indivíduo" também animais de criação. Exemplos não limitativos de animais de criação incluem: alpacas, bisões, camelos, bovinos, cervos, porcos, cavalos, lhamas, mulas, burros, carneiros, cabras, coelhos, renas, iaques, galinhas, gansos, e perus.

Polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado

[0025] Como mostrado na figura 1, a unidade repetitiva de polissa- carídeo sorotipo 15B consiste em uma cadeia principal trissacarídica ramificada (uma N-acetilglucosamina (GlcpNAc), uma galactopiranose (Galp) e uma glucopiranose (Glcp)) com uma ramificação dissacarídica αGalp-βGalp ligado ao grupo hidroxil C4 de GlcpNAc. O fosfoglicerol é ligado ao grupo hidroxil C3 do resíduo βGalp na ramificação dissacarí- dica. O polissacarídeo capsular sorotipo 15B é O-acetilado e a quantidade total de O-acetilação é de aproximadamente 0,8 a 0,9 grupos O- acetila por unidade repetitiva de polissacarídeo (vide, por exemplo, C. Jones et al., Carbohydrate Research, 340 (2005) 403-409). O polissa- carídeo capsular de sorotipo 15C tem a estrutura da cadeia principal idêntica à do sorotipo 15B, porém sem a O-acetilação.

[0026] O polissacarídeo sorotipo 15B isolado da invenção pode ser obtido por um processo compreendendo as etapas de: (a) preparar uma cultura de fermentação de células bacteri- anas de Streptococcus pneumoniae sorotipo 15B; (b) lisar as células bacterianas na referida cultura de fermentação; (c) purificar o polissacarídeo sorotipo 15B a partir da cultura de fermentação; e, (d) dimensionar o polissacarídeo sorotipo 15B purificado por homogeneização à alta pressão.

[0027] Polissacarídeos sorotipo 15B podem ser obtidos diretamen te de bactérias usando-se procedimentos de isolamento conhecidos pelo produto título (vide, por exemplo, os métodos divulgados nas Publicações de Pedido de Patente US Nos 20060228380, 20060228381, 20070184071, 20070184072, 20070231340, e 20080102498 ou WO2008118752). Além disso, eles podem ser produzidos usando-se protocolos de síntese.

[0028] Cepas de Streptococcus pneumoniae sorotipo 15B podem ser obtidas a partir das coleções de culturas estabelecidas (tais como, por exemplo, a cepa depósito ATCC No ATCC10354 ou a cepa disponível no Streptococcal Reference Laboratory of the Center for disease control and prevention, Atlanta, GA)) ou espécimes clínicos.

[0029] As células bacterianas são preferivelmente cultivadas em meio à base de soja. Subsequente à fermentação de células bacteria- nas que produzem polissacarídeos capsulares sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae, as células bacterianas são lisadas para produzir um lisado celular. As células bacterianas podem ser lisadas usando-se qualquer agente lítico. Um "agente lítico" é qualquer agente que ajuda na ruptura da parede celular e na liberação de autolisina que causa lise celular incluindo, por exemplo, detergentes. Conforme usado neste relatório, o termo "detergente" refere-se a qualquer detergente aniônico ou catiônico capaz de induzir a lise de células bacterianas. Exemplos representativos de tais detergentes para uso nos métodos da presente invenção incluem desoxicolato sódio (DOC), N-lauroil sar- cosina, ácido chenodesoxicólico sódio, e saponinas.

[0030] Em uma modalidade da presente invenção, o agente lítico usado para lisar células bacterianas é DOC. DOC é o sal sódico do ácido desoxicólico de ácidos biliares, que é comumente derivado de fontes biológicos tais como vacas ou bois. O DOC ativa a proteína LytA, que é uma autolisina que está envolvida no crescimento e divisão da parede celular em Streptococcus pneumoniae. A proteína LytA tem domínios de ligação de colina em sua porção C-terminal, e sabe- se que mutações do gene lytA produzem mutantes de LytA que são resistentes à lise com DOC.

[0031] Em uma modalidade da presente invenção, o agente lítico usado para lisar células bacterianas é um agente lítico não derivado de animal. Agentes líticos não derivados de animais para uso nos métodos da presente invenção incluem agentes oriundos de fontes não animais com modos de ação similares àquele de DOC (isto é, que afetam a função de LytA e resultam na lise de células de Streptococcus pneumoniae). Tais agentes líticos não derivados de animais incluem, porém sem limitação, análogos de DOC, tensoativos, detergentes, e análogos estruturais de colina. Em uma modalidade, o agente lítico não derivado de animal é selecionado do grupo que consiste em ácido decanossulfônico, ter-octilfenóxi poli(oxietileno)etanóis (por exemplo Igepal® CA-630, CAS #: 9002-93-1, disponível na Sigma Aldrich, St. Louis, MO), condensados de óxido de octilfenol etileno (por exemplo Triton® X-100, disponível na Sigma Aldrich, St. Louis, MO), N-lauroil sarcosina, N-lauroil sarcosina sódio, lauril iminodipropionato, dodecil sulfato de sódio, chenodesoxicolato, hiodesoxicolato, glicodesoxicola- to, taurodeoxicolato, taurocenodeoxicolato, e colato. Em uma outra modalidade, o agente lítico não derivado de animal é N-lauroil sarcosi- na. Em uma outra modalidade, o agente lítico é N-lauroil sarcosina sódio.

[0032] O polissacarídeo sorotipo 15B pode ser então isolado do lisado celular usando-se técnicas de purificação conhecidas na literatura, incluindo o uso de centrifugação, filtração profunda, precipitação, ultrafiltração, tratamento com carvão ativo, diafiltração e/ou cromato- grafia de coluna (vide, por exemplo, Publicações de Pedido de Patente US Nos 20060228380, 20060228381, 20070184071, 20070184072, 20070231340, e 20080102498 ou WO2008118752). O polissacarídeo capsular sorotipo 15B purificado pode ser então usado para a prepara- ção de conjugados imunogênicos.

[0033] Preferivelmente, para gerar conjugados com características e/ou rendimentos de filtrabilidade vantajosos, dimensionamento do po- lissacarídeo até atingir uma faixa de peso molecular (MW) mais baixo é efetuado antes da conjugação a uma proteína carreadora. Vantajosamente, o tamanho do polissacarídeo sorotipo 15B purificado é reduzido preservando ao mesmo tempo características críticas da estrutura do polissacarídeo tal como, por exemplo, a presença de grupos O- acetil. Preferivelmente, o tamanho do polissacarídeo sorotipo 15B purificado é reduzido por homogeneização mecânica.

[0034] Em uma modalidade preferida, o tamanho do polissacarí- deo sorotipo 15B purificado é reduzido por homogeneização à alta pressão. A homogeneização à alta pressão atinge taxas de cisalha- mento elevadas bombeando a corrente do processo através de um percurso de fluxo com dimensões suficientemente pequenas. A taxa de cisalhamento é aumentada usando-se uma pressão de homogeneização aplicada mais alta e o tempo de exposição pode ser aumentado por recirculação da corrente de alimentação através do homogeneiza- dor.

[0035] O processo de homogeneização à alta pressão é particu larmente apropriado para reduzir o tamanho do polissacarídeo sorotipo 15B purificado preservando ao mesmo tempo as características estruturais do polissacarídeo tais como a presença de grupos O-acetil.

[0036] O polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado obtido por purificação do polissacarídeo sorotipo 15B a partir do lisasdo de Streptococcus pneumoniae e opcionalmente o dimensionado do polissaca- rídeo purificado pode ser caracterizado por diferentes parâmetros que incluem, por exemplo, o peso molecular, o número de mM de glicerol por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B ou o número de mM de acetato por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B.

[0037] O grau de O-acetilação do polissacarídeo pode ser deter minado por qualquer método conhecido na literatura, por exemplo, por RMN de prótons (vide, por exemplo, Lemercinier e Jones (1996) Carbohydrate Research 296; 83-96, Jones e Lemercinier (2002) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30; 1233-1247, WO 05/033148 ou WO00/56357). Um outro método comumente usado está descrito em Hestrin (1949) J. Biol. Chem. 180; 249-261. Preferivelmente, a presença de grupos O-acetila é determinada por análise por HPLC iônica.

[0038] A presença de O-acetila em um polissacarídeo capsular sorotipo 15B purificado, isolado ou ativado em um conjugado polissa- carídeo sorotipo 15B-proteína carreadora é expressa como o número de mM de acetato por mM do referido polissacarídeo ou como o número de grupos O-acetila por unidade repetitiva de polissacarídeo.

[0039] A presença de cadeias laterais de glicerolfosfato pode ser determinada por medição do glicerol usando cromatografia de troca aniônica de alta eficiência com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) depois de sua liberação por tratamento do polissacarí- deo com ácido fluorídrico (HF). A presença de glicerol em um polissa- carídeo sorotipo 15B purificado, isolado ou ativado ou em um conjugado polissacarídeo sorotipo 15B-proteína carreadora é expressa como o número de mM de glicerol por mM de polissacarídeo sorotipo 15B.

[0040] O polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado também pode ser produzido sinteticamente usando-se métodos conhecidos pelo versado na técnica.

[0041] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado tem um peso molecular entre 5 e 500kDa, 50 e 500 kDa, 50 e 450kDa, 100 e 400kDa, 100 e 350 kDa. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado tem um peso molecular entre 100 e 350kDa. Em uma modalidade preferi- da, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado tem um peso molecular entre 100 e 300kDa. Em uma modalidade preferida, o polissaca- rídeo capsular sorotipo 15B isolado tem um peso molecular entre 150 e 300kDa.

[0042] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado compreende pelo menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ou 0,8 mM de acetato por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado compreende pelo menos 0,5, 0,6 ou 0,7 mM de acetato por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado compreende pelo menos 0,6 mM de acetato por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado compreende pelo menos 0,7 mM de acetato por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida, a presença de grupos O-acetila é determinada por análise por HPLC iônica.

[0043] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado compreende pelo menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ou 0,8 mM de glicerol por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado compreende pelo menos 0,5, 0,6 ou 0,7 mM de glicerol por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado compreende pelo menos 0,6 mM de glicerol por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado compreende pelo menos 0,7 mM de glicerol por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B.

[0044] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado tem um peso molecular entre 100 e 350 kDa, preferivelmente 150 e 350kDa, e compreende pelo menos 0,6 mM de acetato por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B.

[0045] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado tem um peso molecular entre 100 e 350 kDa, pre-ferivelmente 150 e 350kDa, e compreende pelo menos 0,6 mM de gli- cerol por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B.

[0046] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado compreende pelo menos 0,6 mM de acetato por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B e pelo menos 0,6 mM de glicerol por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B.

[0047] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado tem um peso molecular entre 100 e 350 kDa, pre-ferivelmente 150 e 350kDa, e compreende pelo menos 0,6 mM de acetato por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B e pelo menos 0,6 mM de glicerol por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B.

Conjugado polissacarídeo capsular sorotipo 15B-proteína carrea- dora

[0048] O polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado pode ser conjugado a uma proteína carreadora para obter um conjugado imu- nogênico. O polissacarídeo isolado pode ser conjugado à proteína car- readora por métodos conhecidos pelo versado na técnica (vide, por exemplo, as Publicações de Pedido de Patente US Nos 20060228380, 20070184071, 20070184072, 20070231340 ou WO2011/100151).

[0049] Em uma modalidade, o polissacarídeo pode ser ativado com tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino piridínio (CDAP) para formar um éster de cianato. O polissacarídeo ativado pode ser acoplado diretamente ou via um grupo espaçador (ligador) a um grupo amino na proteína carreadora. Por exemplo, o espaçador poderia ser cistamina ou cisteamina para dar um polissacarídeo tiolado que poderia ser acoplado ao carreador via uma ligação tioéter obtida depois da reação com uma proteína carreadora ativada por maleimida (por exemplo, usando GMBS) ou uma proteína carreadora haloacetilada (por exemplo, usando iodoacetimida ou N-succinimidil bromoacetato ou SlAB, ou SIA, ou SBAP). Preferivelmente, o éster de cianato (opcionalmente feito pela química de CDAP) é acoplado a hexano diamina ou di- hidrazida de ácido adípico (ADH) e o sacarídeo amino-derivatizado é conjugado à proteína carreadora usando química de carbodi-imida (por exemplo, EDAC ou EDC) via um grupo carboxil na proteína carreado- ra. Tais conjugados estão descritos, por exemplo, nos documentos WO93/15760, WO 95/08348 e WO 96129094.

[0050] Outras técnicas adequadas utilizam carbodi-imidas, hidrazi- das, ésteres ativos, norborano, ácido p-nitrobenzoico, N- hidroxissuccinimida, S--NHS, EDC, TSTU. Muitos estão descritos na Publicação de Pedido de Patente Internacional N° WO 98/42721. A conjugação pode envolver uma ligador carbonílico que pode ser formado por reação de um grupo hidroxil livre do sacarídeo com CDI (vide Bethell et al., 1979,1. Biol. Chern. 254:2572-4; Hearn et al., 1981, J. Chromatogr.218:509-18) seguida por reação com uma proteína para formar uma ligação carbamato. Isto pode envolver redução do terminal anomérico a um grupo hidroxil primário, proteção/desproteção opcional do grupo hidroxil primário, reação do grupo hidroxil primário com CDI para formar um carbamato de CDI intermediário e acoplamento do carbamato de CDI intermediário com um grupo amino em uma proteína.

[0051] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado é conjugado à proteína carreadora por aminação redutora. Aminação redutora envolve a ativação do polissacarídeo por oxidação e conjugação do polissacarídeo ativado a uma proteína car- readora por redução.

Ativação de polissacarídeo capsular sorotipo 15B

[0052] Um polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado é obtido por reação de um polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado com um agente oxidante. Por exemplo, o referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado pode ser obtido por um processo compreendendo as seguintes etapas: (a) preparar uma cultura de fermentação de células bacteri- anas de Streptococcus pneumoniae sorotipo 15B; (b) lisar as células bacterianas na referida cultura de fermentação; (c) purificar o polissacarídeo sorotipo 15B a partir da cultura de fermentação; (d) dimensionar o polissacarídeo sorotipo 15B purificado por homogeneização à alta pressão. (e) reagir o polissacarídeo sorotipo 15B dimensionado com um agente oxidante.

[0053] Em uma modalidade preferida, a concentração de polissa- carídeo capsular sorotipo 15B isolado which is reacted com um agente oxidante varia entre 0,1 e 10 mg/mL, 0,5 e 5 mg/mL, 1 e 3 mg/mL, ou cerca de 2 mg/mL.

[0054] Em uma modalidade preferida, o agente oxidante é perioda- to. O periodato oxida os grupos hidroxil vizinhos para formar grupos carbonila ou aldeído e causa clivagem de uma ligação C-C. O termo 'periodato' inclui tanto periodato quanto ácido periódico. Este termo também inclui tanto metaperiodato (IO4-) quanto ortoperiodato (IO65-). O termo 'periodato' também inclui os vários sais de periodato incluindo periodato de sódio e periodato de potássio. Em uma modalidade preferida, o agente oxidante é periodato de sódio. Em uma modalidade pre- ferida, o periodato usado para a oxidação de polissacarídeo capsular sorotipo 15B é metaperiodato. Em uma modalidade preferida, o perio- dato usado para a oxidação de polissacarídeo capsular sorotipo 15B é metaperiodato de sódio.

[0055] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo é reagido com 0,01 a 10, 0,05 a 5, 0,1 a 1, 0,5 a 1, 0,7 a 0,8, 0,05 a 0,5, 0,1 a 0,3 equivalente molar de agente oxidante. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo é reagido com cerca de 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 equivalente molar de agente oxidante. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo é reagido com cerca de 0,15 equivalente molar de agente oxidante. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo é reagido com cerca de 0,25 equivalente molar de agente oxidante. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo é reagido com cerca de 0,5 equivalente molar de agente oxidante. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo é reagido com cerca de 0,6 equivalente molar de agente oxidante. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo é reagido com cerca de 0,7 equivalente molar de agente oxidante.

[0056] Em uma modalidade preferida, a duração da reação varia entre 1 e 50, 10 e 30, 15 e 20, 15 e 17 horas ou cerca de 16 horas.

[0057] Em uma modalidade preferida, a temperatura da reação é mantida entre 15 e 45°C, 15 e 30°C, 20 e 25°C. Em uma modalidade preferida, a temperatura da reação é mantida em cerca de 23°C.

[0058] Em uma modalidade preferida, a reação de oxidação é rea lizada em um tampão selecionado dentre fosfato de sódio, fosfato de potássio, ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES) ou Bis-Tris. Em uma modalidade preferida, o tampão é fosfato de potássio.

[0059] Em uma modalidade preferida, o tampão tem uma concen tração de entre 1 e 500 mM, 1 e 300mM, 50 e 200mM. Em uma modalidade preferida o tampão tem uma concentração de cerca de 100mM.

[0060] Em uma modalidade preferida, a reação de oxidação é rea lizada a um pH entre 4 e 8, 5 e 7, 5,5 e 6,5. Em uma modalidade preferida, o pH é de cerca de 6.

[0061] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado é obtido por reação de 0,5 a 5 mg/mL de polissa- carídeo capsular sorotipo 15B isolado com 0,2 a 0,3 equivalente molar de periodato a uma temperatura entre 20 e 25°C.

[0062] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado é purificado. O polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado é purificado de acordo com métodos conhecidos pelo versado na técnica tais como cromatografia de permeação em gel (GPC), diálise ou ultrafiltração/diafiltração. Por exemplo, o polissacarídeo capsular ativado é purificado por concentração e diafiltração usando um dispositivo de ultrafiltração.

[0063] Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a um polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado obtido ou obtenível pelo processo divulgado acima.

[0064] Em uma modalidade preferida, o grau de oxidação do polis- sacarídeo capsular sorotipo 15B ativado varia entre 2 e 20, 2 e 15, 2 e 10, 2 e 5, 5 e 20, 5 e 15, 5 e 10, 10 e 20, 10 e 15, 15 e 20. Em uma modalidade preferida o grau de oxidação do polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado varia entre 2 e 10, 4 e 8, 4 e 6, 6 e 8, 6 e 12, 8 e 12, 9 e 11, 10 e 16, 12 e 16, 14 e 18, 16 e 20, 16 e 18, ou 18 e 20.

[0065] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado tem um peso molecular entre 5 e 500kDa, 50 e 500 kDa, 50 e 450kDa, 100 e 400kDa, 100 e 350 kDa. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado tem um peso molecular entre 100 e 350kDa. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado tem um peso molecular entre 100 e 300kDa. Em uma modalidade preferida, o polissaca- rídeo capsular sorotipo 15B ativado tem um peso molecular entre 150 e 300kDa. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado tem um peso molecular entre 100 e 250kDa.

[0066] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado compreende pelo menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ou 0,8 mM de acetato por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado compreende pelo menos 0,5, 0,6 ou 0,7 mM de acetato por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado compreende pelo menos 0,6 mM de acetato por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado compreende pelo menos 0,7 mM de acetato por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida, a presença de grupos O-acetila é determinada por análise por HPLC iônica.

[0067] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado compreende pelo menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ou 0,8 mM de glicerol por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado compreende pelo menos 0,5, 0,6 ou 0,7 mM de glicerol por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado compreende pelo menos 0,6 mM de glicerol por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado compreende pelo menos 0,7 mM de glicerol por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B.

[0068] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado tem um peso molecular entre 100 e 250 kDa e compreende pelo menos 0,6 mM de acetato por mM do referido polis- sacarídeo capsular sorotipo 15B.

[0069] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado tem um peso molecular entre 100 e 250 kDa e compreende pelo menos 0,6 mM de glicerol por mM do referido polis- sacarídeo capsular sorotipo 15B.

[0070] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado compreende pelo menos 0,6 mM de acetato por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B e pelo menos 0,6 mM de glicerol por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B.

[0071] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado tem um peso molecular entre 100 e 250 kDa e compreende pelo menos 0,6 mM de acetato por mM do referido polis- sacarídeo capsular sorotipo 15B e pelo menos 0,6 mM de glicerol por mM do referido polissacarídeo capsular sorotipo 15B.

[0072] Em uma modalidade, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado é liofilizado, opcionalmente na presença de um crioprote- tor/lioprotetor. Em uma modalidade, o referido crioprotetor/lioprotetor é um sacarídeo. Em uma modalidade preferida, o sacarídeo é selecionado dentre sacarose, trealose, rafinose, estaquiose, melezitose, dex- trana, manitol, lactitol e palatinit. Em uma modalidade preferida, o sa- carídeo é sacarose. O polissacarídeo capsular ativado liofilizado pode ser então combinado com uma solução compreendendo a proteína carreadora.

[0073] Em uma outra modalidade, o polissacarídeo capsular soro- tipo 15B ativado é combinado com a proteína carreadora e liofilizado opcionalmente na presença de um crioprotetor/lioprotetor. Em uma modalidade, o referido crioprotetor/lioprotetor é um sacarídeo. Em uma modalidade preferida, o sacarídeo é selecionado dentre sacarose, trealose, rafinose, estaquiose, melezitose, dextrana, manitol, lactitol e palatinit. Em uma modalidade preferida, o sacarídeo é sacarose. O po- lissacarídeo coliofilizado e a proteína carreadora podem ser então res- suspendidos em solução e reagidos com um agente redutor.

[0074] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polissaca- rídeo capsular sorotipo 15B ativado liofilizado.

[0075] Em uma modalidade a invenção refere-se ao polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado liofilizado e à proteína carreadora. Em uma modalidade preferida, a proteína carreadora é CRM197.

Conjugação de polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado com uma proteína carreadora

[0076] O polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado pode ser conjugado a uma proteína carreadora por um processo compreendendo a etapa de: (a) combinar o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado com uma proteína carreadora, e, (b) reagir o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado e a e proteína carreadora combinados com um agente redutor para formar um conjugado polissacarídeo capsular sorotipo 15B-proteína car- readora.

[0077] A conjugação de polissacarídeo capsular sorotipo 15B ati vado com uma proteína carreadora por aminação redutora em dime- tilsulfóxido (DMSO) é adequada para preservar o teor de O-acetila do polissacarídeo em comparação, por exemplo, com a aminação redutora em solução aquosa onde o nível de O-acetilação do polissacarídeo é significativamente reduzido. Em uma modalidade preferida, a etapa (a) e a etapa (b) são realizadas em DMSO.

[0078] Em uma modalidade preferida, a etapa (a) compreende dis solver o polissacarídeo capsular sorotipo 15B liofilizado em uma solução compreendendo uma proteína carreadora e DMSO. Em uma mo- dalidade preferida, a etapa (a) compreende dissolver o polissacarídeo capsular sorotipo 15B coliofilizado e a proteína carreadora em DMSO.

[0079] Quando as etapas (a) e (b) são realizadas em solução aquosa, as etapas (a) e (b) são realizadas em um tampão, preferivelmente selecionado dentre PBS, MES, HEPES, Bis-tris, ADA, PIPES. MOPSO, BES, MOPS, DIPSO, MOBS, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, Bicina ou HEPB, a um pH entre 6,0 e 8,5, 7 e 8 ou 7 e 7,5. Em uma modalidade preferida o tampão é PBS. Em uma modalidade preferida o pH é de cerca de 7,3.

[0080] Em uma modalidade preferida, a concentração de polissa- carídeo capsular sorotipo 15B ativado na etapa (b) varia entre 0,1 e 10 mg/mL, 0,5 e 5 mg/mL, 0,5 e 2 mg/mL. Em uma modalidade preferida, a concentração de polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado na etapa (b) é de cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 ou 3 mg/mL.

[0081] Em uma modalidade preferida, a proporção de entrada ini cial (peso por peso) de polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado para proteína carreadora varia entre 5:1 e 0,1:1, 2:1 e 0,1:1, 2:1 e 1:1, 1.5:1 e 1:1, 0,1:1 e 1:1, 0,3:1 e 1:1, 0,6:1 e 1:1.

[0082] Em uma modalidade preferida, a proporção de entrada ini cial de polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado para proteína car- readora varia de cerca de 0,6:1 a 1,5:1, preferivelmente 0,6:1 a 1:1. Tal proporção de entrada inicial é particularmente adequada para obter níveis baixos de polissacarídeo livre no conjugado imunogênico.

[0083] Em uma modalidade preferida a proporção de entrada inici al de polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado para proteína car- readora é de cerca de 0,4:1, 0,5:1, 0,6:1, 0,7:1, 0,8:1, 0,9:1, 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1,9:1 ou 2:1.

[0084] Em uma modalidade, o agente redutor é cianoboroidreto de sódio, triacetoxiboroidreto de sódio, boroidreto de sódio ou zinco na presença de ácidos Bronsted ou Lewis, amina boranos tais como piri- dina borano, 2-picolina borano, 2,6-diborano-metanol, dimetilamina- borano, t-BuMeiPrN-BH3, benzilamina-BH3 ou 5-etil-2-metilpiridina borano (PEMB). Em uma modalidade preferida, o agente redutor é cia- noboroidreto de sódio. Em uma modalidade preferida, o agente redutor é 2-picolina borano de sódio.

[0085] Em uma modalidade preferida, a quantidade de agente re dutor usada na etapa (b) varia entre cerca de 0,1 e 10 equivalentes molares, 0,5 e 5 equivalentes molares, 1 e 2 equivalentes molares. Em uma modalidade preferida, a quantidade de agente redutor usada na etapa (b) é de cerca de 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 ou 2 equivalentes molares.

[0086] Em uma modalidade preferida, a duração da etapa (b) varia entre 1 e 60 horas, 10 e 50 horas, 40 e 50 horas; 42 e 46 horas. Em uma modalidade preferida, a duração da etapa (b) é de cerca de 44 horas.

[0087] Em uma modalidade preferida, a temperatura da reação na etapa (b) é mantida entre 10 e 40°C, 15 e 30°C ou 20 e 26°C. Em uma modalidade preferida, a temperatura da reação na etapa (b) é mantida em cerca de 23°C.

[0088] Em uma modalidade preferida, o processo para a prepara ção de um conjugado imunogênico compreendendo polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae covalentemente ligado a uma proteína carreadora compreende ainda uma etapa (etapa (c)) de capear o aldeído não reagido (resfriar bruscamente) por adição de NaBH4.

[0089] Em uma modalidade preferida, a quantidade de NaBH4 usada na etapa (c) varia entre 0,1 e 10 equivalentes molares, 0,5 e 5 equivalentes molares 1 e 3 equivalentes molares. Em uma modalidade preferida, a quantidade de NaBH4 usada na etapa (c) é de cerca de 2 equivalentes molares.

[0090] Em uma modalidade preferida, a duração da etapa (c) varia entre 0,1 e 10 horas, 0,5 e 5 horas, 2 e 4 horas. Em uma modalidade preferida, a duração da etapa (c) é de cerca de 3 horas.

[0091] Em uma modalidade preferida, a temperatura da reação na etapa (c) é mantida entre 15 e 45°C, 15 e 30°C ou 20 e 26°C. Em uma modalidade preferida, a temperatura da reação na etapa (c) é mantida em cerca de 23°C.

[0092] Em uma modalidade preferida o rendimento da etapa de conjugação (etapa b) é maior que 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou 90%. Em uma modalidade preferida o rendimento da etapa de conjugação (etapa b) é maior que 60%. Em uma modalidade preferida o rendimento da etapa de conjugação (etapa b) é maior que 70%. O rendimento é a quantidade de polissacarídeo sorotipo 15B no conjugado x100 / quantidade de polissacarídeo ativado usada na etapa de conjugação.

[0093] Em uma modalidade preferida, o processo para a prepara ção de um conjugado imunogênico compreendendo polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae covalentemente ligado a uma proteína carreadora compreende as etapas de: (a) preparar uma cultura de fermentação de células bacteri- anas de Streptococcus pneumoniae sorotipo 15B; (b) lisar as células bacterianas na referida cultura de fermentação; (c) purificar o polissacarídeo sorotipo 15B a partir da cultura de fermentação; (d) dimensionar o polissacarídeo sorotipo 15B purificado por homogeneização à alta pressão; (e) reagir o polissacarídeo sorotipo 15B dimensionado com um agente oxidante; (f) combinar o polissacarídeo sorotipo 15B ativado com uma proteína carreadora, e, (g) reagir o polissacarídeo sorotipo 15B ativado e proteína carreadora combinados com um agente redutor para formar um conjugado polissacarídeo sorotipo 15B-proteína carreadora; e, (h) capear o aldeído não reagido (resfriar bruscamente) por adição de NaBH4.

[0094] Em uma modalidade preferida o rendimento da etapa de conjugação (etapa g) do processo acima é maior que 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou 90%. Em uma modalidade preferida o rendimento da etapa de conjugação (etapa g) é maior que 60%. Em uma modalidade preferida o rendimento da etapa de conjugação (etapa g) é maior que 70%. O rendimento é a quantidade de polissacarí- deo sorotipo 15B no conjugado x100) / quantidade de polissacarídeo ativado usado na etapa de conjugação.

[0095] Depois da conjugação do polissacarídeo capsular sorotipo 15B com a proteína carreadora, o conjugado polissacarídeo-proteína pode ser purificado (enriquecido em relação à quantidade de conjugado polissacarídeo-proteína) por uma variedade de técnicas conhecidas pelos versados na técnica. Estas técnicas incluem diálise, operações de concentração/diafiltração, filtração de fluxo tangencial, precipita- ção/eluição, cromatografia de coluna (DEAE ou cromatografia de interação hidrofóbica), e filtração profunda.

[0096] Em uma modalidade preferida, a proteína carreadora é ató- xica e não reatogênica e obtenível em quantidade e pureza suficientes. As proteínas carreadoras devem ser passíveis a procedimentos de conjugação tradicionais.

[0097] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado é conjugado a uma proteína carreadora que é selecionada do grupo que consiste em: DT (toxina diftérica), TT (toxoi- de tetânico) ou fragmento C de TT, CRM197 (uma variante atóxica, porém antigenicamente idêntica da toxina diftérica) outros mutantes pontuais de DT, tais como CRM176, CRM228, CRM 45 (Uchida et al., J. BioI. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM102, CRM 103 e CRM107 e outras mutações descritas por Nicholls e Youle em Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; dele- ção ou mutação de Glu-148 para Asp, Gln ou Ser e/ou Ala 158 para Gly e outras mutações divulgadas nos documentos US 4709017 ou US 4950740; mutação de pelo menos um ou mais resíduos Lys 516, Lys 526, Phe 530 e/ou Lys 534 e outras mutações divulgadas nos docu-mentos US 5917017 ou US 6455673; ou o fragmento divulgado no documento US 5843711, pneumolisina pneumocócica (Kuo et al. (1995) Infect Immun 63; 2706-13) incluindo ply detoxificada de alguma maneira, por exemplo, dPLY-GMBS (WO 04081515, PCT/EP2005/010258) ou dPLY-formol, PhtX, incluindo PhtA, PhtB, PhtD, PhtE (sequências de PhtA, PhtB, PhtD ou PhtE estão divulgadas nos documentos WO 00/37105 ou WO 00/39299) e fusões de proteínas Pht, por exemplo, fusões PhtDE, fusões PhtBE, Pht A-E (WO 01/98334, WO 03/54007, W02009/000826), OMPC (proteína membranar externa meningocóc- cica - usualmente extraída de N.meningitidis sorogrupo B - EP0372501 ), PorB (de N. meningitidis), PD (proteína D da Haemophilus influenza - vide, por exemplo, EP 0 594 610 B), ou equivalentes imunologica- mente funcionais das mesmas, peptídio sintéticos (EP0378881 , EP0427347), proteínas do choque térmico (WO 93/17712, WO 94/03208), proteínas da coqueluche (WO 98/58668, EP0471 177), ci- tocinas, Iinfocinas, fatores de crescimento ou hormônios (WO10 91/01146), proteínas artificiais compreendendo múltipos epítopos de células T CD4+ humanas de vários antígenos derivados de patógenos (Falugi et al. (2001 ) Eur J Immunol 31 ; 3816-3824) tais como a prote- ína N19 (Baraldoi et al. (2004) Infect Immun 72; 4884-7) proteína superficial pneumocócica PspA (WO 02/091998), proteínas de absorção de ferro (WO 01/72337), toxina A ou B de C. difficile (WO 00/61761 ). Em uma modalidade, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado é conjugado ao DT (toxoide diftérico). Em uma outra modalidade, o po- lissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado é conjugado ao TT (toxoide tetânico). Em uma outra modalidade, o polissacarídeo capsular soroti- po 15B ativado é conjugado ao fragmento C de TT. Em uma outra modalidade, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado é conjugado ao PD (proteína D da Haemophilus influenza - vide, por exemplo, o documento EP 0 594 610 B).

[0098] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado da invenção é conjugado à proteína CRM197. A proteína CRM197 é uma forma atóxica da toxina diftérica, mas é imuno- logicamente indistinguível da toxina diftérica. A CRM197 é produzida por C. diphtheriae infectado pelo fago não toxigênico □197tox- criado por mutagênese com nitrosoguanidina do corinefago beta toxigênico (Uchida, T. et al. 1971, Nature New Biology 233:8-11). A CRM197 é purificada por ultrafiltração, precipitação em sulfato de amônio, e croma- tografia de troca iônica. A proteína CRM197 tem o mesmo peso molecular que a toxina diftérica mas difere da mesma pela troca de uma única base (guanina por adenina) no gene estrutural. Esta troca de uma única base provoca uma substituição aminoacídica de ácido glutâmico por glicina) na proteína madura e elimina as propriedades tóxicas da toxina diftérica. A proteína CRM197 é um carreador dependente de células T seguro e eficaz para sacarídeos. Maiores detalhes acerca da CRM197 e sua produção podem ser encontrados, por exemplo, no documento US 5,614,382.

[0099] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um conjugado imunogênico compreendendo polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae covalentemente ligado a uma proteína car- readora. Em uma modalidade, a invenção refere-se a um conjugado imunogênico compreendendo polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae covalentemente ligado a uma proteína car- readora por aminação redutora. Em uma modalidade, a invenção refere-se a um conjugado imunogênico compreendendo polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae covalentemente ligado a uma proteína carreadora por aminação redutora em DMSO. Em uma modalidade preferida, a proteína carreadora é CRM197. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo é um polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado definido neste relatório. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo é um polissacarídeo capsular sorotipo 15B isolado definido neste relatório que fora dimensionado por homo-geneização à alta pressão.

[00100] Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico compreende menos de cerca de 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 ou 15% de polissacarídeo capsular sorotipo 15B livre em comparação com a quantidade total de polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida o conjugado imunogênico compreende menos de cerca de 25% de polissacarídeo capsular sorotipo 15B livre em comparação com a quantidade total de polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida o conjugado imunogênico compreende menos de cerca de 20% de polissacarídeo capsular sorotipo 15B livre em comparação com a quantidade total de polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida o conjugado imunogênico compreende menos de cerca de 15% de polissacarídeo capsular soro- tipo 15B livre em comparação com a quantidade total de polissacarí- deo capsular sorotipo 15B.

[00101] Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico tem um peso molecular entre 3000 e 20000kDa; 5000 e 10000kDa; 5000 e 20000kDa; 8000 e 20000kDa; 8000 e 16000 KDa; ou 10000 e 16000 KDa. O peso molecular do conjugado imunogênico é medido por SEC-MALLS.

[00102] Em uma modalidade preferida, a relação (peso por peso) de polissacarídeo capsular sorotipo 15B para proteína carreadora no conjugado varia entre 0,5 e 3. Em uma modalidade preferida, a relação de polissacarídeo capsular sorotipo 15B para proteína carreadora no conjugado varia entre 0,4 e 2, 0,5 e 2, 0,5 e 1.5, 0,5 e 1, 1 e 1,5, 1 e 2. Em uma modalidade preferida, a relação de polissacarídeo capsular sorotipo 15B para proteína carreadora no conjugado varia entre 0,7 e 0,9.

[00103] Meios de cromatografia de exclusão por tamanho (CL-4B) podem ser usados para determinar a distribuição de tamanho molecular relativa do conjugado. Cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) é usada em colunas alimentadas por gravidade para traçar o perfil da distribuição de tamanho molecular dos conjugados. As moléculas grandes excluídas dos poros no meio eluem mais rápido que as moléculas pequenas. Coletores de fração são usados para coletar o eluato da coluna. As frações são testadas colorimetricamente por um ensaio usando sacarídeo. Para a determinação de Kd, as colunas são calibradas para estabelecer a fração à qual as moléculas são totalmente excluídas (V0), (Kd=0), e a fração que representa a retenção máxima (Vi), (Kd=1). A fração à qual um atributo específico da amostra é atingido (Ve), é relacionada com a Kd pela expressão, Kd = (Ve - V0)/ (Vi - V0).

[00104] Em uma modalidade preferida, pelo menos 20% do conjugado imunogênico têm uma Kd menor ou igual a 0,3 em uma coluna CL-4B. Em uma modalidade preferida, pelo menos 30% do conjugado imunogênico têm uma Kd menor ou igual a 0,3 em uma coluna CL-4B. Em uma modalidade preferida, pelo menos 40% do conjugado imuno- gênico têm uma Kd menor ou igual a 0,3 em uma coluna CL-4B. Em uma modalidade preferida, pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, ou 85% do conjugado imunogênico têm uma Kd menor ou igual a 0,3 em uma coluna CL-4B. Em uma modalidade preferida, pelo menos 60% do conjugado imunogênico têm uma Kd menor ou igual a 0,3 em uma coluna CL-4B. Em uma modalidade preferida, pelo menos 70% do conjugado imunogênico têm uma Kd menor ou igual a 0,3 em uma coluna CL-4B.

[00105] Em uma modalidade preferida, entre 40% e 90% do conjugado imunogênico sorotipo 15B têm uma Kd menor ou igual a 0,3 em uma coluna CL-4B. Em uma modalidade preferida, entre 50% e 90% do conjugado imunogênico sorotipo 15B têm uma Kd menor ou igual a 0,3 em uma coluna CL-4B. Em uma modalidade preferida, entre 65% e 80% do conjugado imunogênico sorotipo 15B têm uma Kd menor ou igual a 0,3 em uma coluna CL-4B.

[00106] Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico compreende pelo menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ou 0,8 mM de acetato por mM de polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico compreende pelo menos 0,5, 0,6 ou 0,7 mM de acetato por mM de polissacarídeo capsular so- rotipo 15B. Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico compreende pelo menos 0,6 mM de acetato por mM de polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico compreende pelo menos 0,7 mM de acetato por mM de polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida, a presença de grupos O-acetila é determinada por análise por HPLC iô- nica.

[00107] Em uma modalidade preferida, a relação de mM de acetato por mM de polissacarídeo capsular sorotipo 15B no conjugado imuno- gênico para mM de acetato por mM de polissacarídeo capsular soroti- po 15B no polissacarídeo isolado é de pelo menos 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, ou 0,95. Em uma modalidade preferida, a relação de mM de acetato por mM de polissacarídeo capsular sorotipo 15B no conjugado imunogênico para mM de acetato por mM de polissacarídeo capsular sorotipo 15B no polissacarídeo isolado é de pelo menos 0,7. Em uma modalidade preferida, a relação de mM de acetato por mM de polissacarídeo capsular sorotipo 15B no conjugado imunogênico para mM de acetato por mM de polissacarídeo capsular sorotipo 15B no polissacarídeo isolado é de pelo menos 0,9. Em uma modalidade preferida, a presença de grupos O-acetila é determinada por análise por HPLC iônica.

[00108] Em uma modalidade preferida, a relação de mM de acetato por mM de polissacarídeo capsular sorotipo 15B no conjugado imuno- gênico para mM de acetato por mM de polissacarídeo capsular soroti- po 15B no polissacarídeo ativado é de pelo menos 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, ou 0,95. Em uma modalidade preferida, a relação de mM de acetato por mM de polissacarídeo capsular sorotipo 15B no conjugado imunogênico para mM de acetato por mM de polissacarídeo capsular sorotipo 15B no polissacarídeo ativado é de pelo menos 0,7. Em uma modalidade preferida, a relação de mM de acetato por mM de polissacarídeo capsular sorotipo 15B no conjugado imunogênico para mM de acetato por mM de polissacarídeo capsular sorotipo 15B no polissacarídeo ativado é de pelo menos 0,9. Em uma modalidade preferida, a presença de grupos O-acetila é determinada por análise por HPLC iônica.

[00109] Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico compreende pelo menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ou 0,8 mM de glicerol por mM de polissacarídeo capsular sorotipo 15B. Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico compreende pelo menos 0,5, 0,6 ou 0,7 mM de glicerol por mM de polissacarídeo capsular soro- tipo 15B. Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico compreende pelo menos 0,6 mM de glicerol por mM de polissacarídeo capsular sorotipo 15B.

[00110] Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico compreende pelo menos 0,7 mM de glicerol por mM de polissacarídeo capsular sorotipo 15B.

[00111] O grau de conjugação é o número de resíduos lisina na proteína carreadora que são conjugados ao polissacarídeo capsular soro- tipo 15B. A evidência para modificação de lisina da proteína carreado- ra, devido a ligações covalentes aos polissacarídeos, é obtida por análise de aminoácidos usando métodos de rotina conhecidos pelos versados na técnica. A conjugação resulta em uma redução no número de resíduos lisina recuperados, em comparação o material de partida proteína CRM197 usado para gerar os materiais conjugados.

[00112] Em uma modalidade preferida, o grau de conjugação do conjugado imunogênico varia entre 2 e 15, 2 e 13, 2 e 10, 2 e 8, 2 e 6, 2 e 5, 2 e 4, 3 e 15, 3 e 13, 3 e 10, 3 e 8, 3 e 6, 3 e 5, 3 e 4, 5 e 15, 5 e 10, 8 e 15, 8 e 12, 10 e 15 ou 10 e 12. Em uma modalidade preferida, o grau de conjugação do conjugado imunogênico varia entre 2 e 5.

Composição imunogênica

[00113] O termo "composição imunogênica" refere-se a qualquer composição farmacêutica contendo um antígeno, por exemplo, um micro-organismo ou um componente do mesmo, composição esta que pode ser usada para produzir uma resposta imunológica em um indivíduo.

[00114] Conforme usado neste relatório, "imunogênico" significa a capacidade de um antígeno (ou um epítopo do antígeno), tal como um polissacarídeo capsular bacteriano, ou um conjugado imunogênico ou composição imunogênica compreendendo um antígeno, para produzir uma resposta imunológica em um hospedeiro tal como um mamífero, seja mediada humoralmente ou celularmente, ou ambos.

[00115] Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma composição imunogênica compreendendo um conjugado polissacarídeo capsular sorotipo 15B imunogênico-proteína carreadora divulgado nesta invenção.

[00116] Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada nesta invenção, quando administrada a um indivíduo, induz a formação de anticorpos capazes de se ligar ao Streptococcus pneumoniae sorotipo 15B. Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada nesta invenção, quando administrada a um indivíduo, induz a formação de anticorpos capazes de se ligar ao Streptococcus pneumoniae sorotipo 15B segundo medido por um ensaio ELISA padrão.

[00117] Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada nesta invenção, quando administrada a um indivíduo, induz a formação de anticorpos capazes de se ligar ao Streptococcus pneumoniae sorotipo 15B e 15A e/ou 15C. Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada nesta invenção, quando administrada a um indivíduo, induz a formação de anticorpos capazes de se ligar ao Streptococcus pneumoniae sorotipo 15B e 15A e/ou 15C segundo medido por um ensaio ELISA padrão.

[00118] Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada nesta invenção, quando administrada a um indivíduo, induz a formação de anticorpos capazes de se ligar ao Streptococcus pneumoniae sorotipo 15B e 15C. Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada nesta invenção, quando administrada a um indivíduo, induz a formação de anticorpos capazes de se ligar ao Streptococcus pneumoniae sorotipo 15B e 15C segundo medido por um ensaio ELISA padrão.

[00119] No método ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado à enzima), anticorpos provenientes do soro de indivíduos vacinados são in- cubados com polissacarídeo que foram adsorvidos a um suporte sólido. Os anticorpos ligados são detectados usando anticorpos de detecção secundários conjugados à enzima.

[00120] Em uma modalidade, o referido ensaio ELISA é o ensaio ELISA (WHO) padronizado definido pela WHO em ‘Training manual for Enzyme linked immunosorbent assay for the quantitation of Streptococcus pneumoniae serotype specific IgG (Pn PS ELISA).’ (que pode ser visto em http://www.vaccine.uab.edu/ELISA%20protocol.pdf ; acessado em 31 de março de 2014).

[00121] O ELISA mede os anticorpos IgG tipo-específicos anti- polissacarídeo capsular (PS) de S. pneumoniae presentes no soro humano. Quando diluições de soro humano são adicionadas a placas de microtitulação revestidas com PS capsular tipo-específico, os anticorpos específicos para aquele PS capsular ligam-se às placas de mi- crotitulação. Os anticorpos ligados às placas são detectados usando- se um anticorpo IgG marcado com fosfatase alcalina anti-humano de cabra seguido pelo substrato p-nitrofenil fosfato . A densidade ótica do produto final colorido é proporcional à quantidade de anticorpo anti-PS capsular presente no soro.

[00122] Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção é capaz de produzir anticorpos IgG em um ser humano que são capazes de ligar o polissacarídeo sorotipo 15B de S. pneumoniae a uma concentração de pelo menos 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,35, 0,4 ou 0,5 μg/ml segundo determinado pelo ensaio ELISA.

[00123] Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção é capaz de produzir anticorpos IgG em um ser humano que são capazes de ligar o polissacarídeo sorotipo 15C de S. pneumoniae a uma concentração de pelo menos 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,35, 0,4 ou 0,5 μg/ml segundo determinado pelo ensaio ELISA.

[00124] Em uma modalidade, a composição imunogênica da inven ção é capaz de produzir anticorpos IgG em um ser humano que são capazes de ligar o polissacarídeo sorotipo 15B e 15C de S. pneumoniae a uma concentração de pelo menos 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,35, 0,4 ou 0,5 μg/ml segundo determinado pelo ensaio ELISA.

[00125] Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada nesta invenção, quando administrada a um indivíduo, induz a formação de anticorpos capazes de destruir o Streptococcus pneumoniae sorotipo 15B em um ensaio de opsonofagocitose (OPA) divulgado nesta invenção. Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada nesta invenção, quando testada em um ensaio de OPA divulgado nesta invenção, tem um título OPA maior que o título OPA obtido com um polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae nativo não conjugado.

[00126] Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada nesta invenção, quando administrada a um indivíduo, induz a formação de anticorpos capazes de destruir o Streptococcus pneumoniae sorotipo 15C em um ensaio de opsonofagocitose divulgadas nesta invenção. Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada nesta invenção, quando testada em um ensaio de OPA divulgado nesta invenção, tem um título OPA maior que o título OPA obtido com um polissacarídeo capsular sorotipo 15C de Streptococcus pneumoniae nativo não conjugado.

[00127] Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada nesta invenção, quando administrada a um indivíduo, induz a formação de anticorpos capazes de destruir o Streptococcus pneumoniae sorotipo 15B e 15C e/ou 15A em um ensaio de opsonofagocitose divulgado nesta invenção.

[00128] Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada nesta invenção, quando administrada a um indivíduo, induz a formação de anticorpos capazes de destruir o sorotipo 15B e 15C.

[00129] O ensaio opsonofagocítico pneumocócico (OPA), que mede a destruição de células de S. pneumoniae por células efetoras na presença de anticorpo funcional e complemento, é considerado um substituto importante para avaliar a eficácia de vacinas pneumocócicas.

[00130] O ensaio opsonofagocítico (OPA) pode ser conduzido por incubação de uma mistura de células de Streptococcus pneumoniae, um soro humano inativado por calor a ser testado, células HL-60 diferenciadas (fagócitos) e uma fonte de complemento exógena (por exemplo, complemento de filhote de coelho). A opsonofagocitose prossegue durante a incubação e as células bacterianas que são revestidas com anticorpo e complemento são eliminadas com a opsono- fagocitose. As unidades formadoras de colônia (cfu) de bactérias sobreviventes que escapam da opsonofagocitose são determinadas por plaqueamento da mistura de ensaio. O título OPA é definido como a diluição recíproca que resulta em uma redução de 50% na contagem bacteriana em relação aos poços de controle sem soro de teste. O título OPA é interpolado a partir das duas diluições que envolvem este corte de destruição de 50%.

[00131] Um título terminal de 1:8 ou mais é considerado um resultado positivo nesse OPA do tipo destruição.

[00132] Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção é capaz de produzir um título de pelo menos 1:8 contra S. pneumoniae sorotipo 15B em pelo menos 50% dos indivíduos segundo determinado pelo ensaio opsonofagocítico de destruição (OPA). Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção é capaz de produzir um título de pelo menos 1:8 contra S. pneumoniae sorotipo 15B em pelo menos 60%; 70%, 80%, 90%, ou pelo menos 93% dos indivíduos segundo determinado pelo ensaio opsonofagocítico de destruição (OPA).

[00133] Em uma modalidade, a composição imunogênica da inven- ção é capaz de produzir um título de pelo menos 1:8 contra S. pneumoniae sorotipo 15C em pelo menos 50% dos indivíduos segundo determinado pelo ensaio opsonofagocítico de destruição (OPA). Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção é capaz de produzir um título de pelo menos 1:8 contra S. pneumoniae sorotipo 15C em pelo menos 60%; 70%, 80%, 90%, ou pelo menos 95% dos indivíduos segundo determinado pelo ensaio opsonofagocítico de destruição (OPA).

[00134] A formulação da composição imunogênica da presente invenção pode ser feita usando métodos reconhecidos na literatura. Por exemplo, os conjugados imunogênicos da invenção podem ser formulados com um veículo fisiologicamente aceitável para preparar a composição. Exemplos de tais veículos incluem, porém sem limitação, água, solução salina tamponada, polióis (por exemplo, glicerol, propi- leno glicol, polietileno glicol líquido) e soluções de dextrose.

[00135] Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica pode compreender pelo menos um antígeno adicional. Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica pode compreender pelo menos um polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae adicional.

[00136] Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica pode compreender pelo menos um polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae adicional conjugado a uma proteína carreadora. Em uma modalidade preferida, a referida proteína carreadora é CRM197.

[00137] Em certas modalidades, a composição imunogênica compreende um ou mais adjuvantes. Conforme definido neste relatório, um "adjuvante" é uma substância que serve para aumentar a imunogenici- dade de uma composição imunogênica desta invenção. Portanto, os adjuvantes são frequentemente dados para reforçar a resposta imuno- lógica e são bastante conhecidos pelo versado na técnica. Adjuvantes adequados para aumentar a eficácia da composição incluem, porém sem limitação: (1) sais de alumínio (alum), tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc.; (2) formulações do tipo emulsão de óleo em água (com ou sem outros agentes imunoestimuladores específicos tais como mura- mil peptídios (definidos abaixo) ou componentes da parede celular de bactérias), tais como, por exemplo, (a) MF59 (Publicação PCT N° WO 90/14837), contendo 5% de esqualeno, 0,5%5 de Tween 80, e 0,5% de Span 85 (opcionalmente contendo quantidades variáveis de MTP-PE (vide abaixo, embora não necessário)) formulado como partículas submicrônicas usando um microfluidificador tal como o microfluidificador Modelo 11OY (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, contendo 10% de esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero L121 bloqueado com pluronic, e thr-MDP (vide abaixo) ou microfluidificado em uma emulsão submicrônica ou centrifugado para gerar uma emulsão de tamanho de partícula maior, e (c) sistema adjuvante Ribi™ (RAS), (Corixa, Hamilton, MT) contendo 2% de esqualeno, 0,2% de Tween 80, e um ou mais componentes da parede celular de bactérias do grupo que consiste em mo- nofosforil lipídio A 3-O-desacilado (MPLTM) descrito na Patente US N° 4,912,094 (Corixa), trealose dimicolato (TDM), e esqueleto de parede celular (CWS), preferivelmente MPL + CWS (Detox™); (3) adjuvantes do tipo saponina, tal como Quil A ou STIMULONTM QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (Patente US N° 5,057,540) podem ser usados ou partículas geradas a partir dos mesmos tais como ISCOMs (complexos imunoestimuladores); (4) lipopolissacarídeos bacterianos, análogos sintéticos do lipídio A tais como compostos do tipo aminoalquil glucosamina fosfato (AGP), ou derivados ou análogos dos mesmos, que se encontram disponíveis na Corixa, e que estão descritos na Patente US N° 6, 113,918; um destes AGP é 2-[(R)-3- tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etil 2-desoxi-4-Ofosfono-3-O-[(R)-3- tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)- 3tetradecanoiloxitetradecanoilamino]-b-D-glucopiranosídeo, que também é conhecido como 529 (antes conhecido como RC529), que é formulado como uma forma aquosa ou como uma emulsão estável, polinucleotídeos sintéticos tais como oligonucleotídeos contendo motivos CpG (Patente US N° 6,207,646); (5) citocinas, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL- 2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, etc.), interferons (por exemplo, interferon gama), fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF), fator de necrose tumoral (TNF), moléculas coestimuladoras 87-1 e 87-2, etc.; (6) mutantes destoxificados de uma toxina ADP-ribosilante bacteriana tal como uma toxina colérica (CT) seja na forma de um tipo selvagem ou em uma forma mutante, por exemplo, onde o ácido glu- tâmico na posição aminoacídica 29 é substituído por um outro aminoá- cido, preferivelmente uma histidina, de acordo com o pedido de patente internacional publicado WO 00/18434 (vide também os documentos WO 02/098368 e WO 02/098369), uma toxina pertússica (PT), ou uma toxina lábil ao calor de E. coli (LT), particularmente LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129 (vide, por exemplo, os documentos WO 93/13302 e WO 92/19265); e (7) outras substâncias que agem como agentes imunoesti- muladoras para aumentar a eficácia da composição.

[00138] Muramil peptídios incluem, porém sem limitação, N-acetil- muramil-L-treonil-D-isoglutamina (tr-MDP), N-acetil-normuramil-L- alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

[00139] Em uma modalidade da presente invenção, as composições imunogênicas divulgadas nesta invenção compreendem um oli- gonucleotídeo contendo CpG como adjuvante. Um oligonucleotídeo contendo CpG conforme usado neste relatório refere-se a um oligode- soxinucleotídeo contendo CpG imunoestimulador (CpG ODN), e por conseguinte esses termos são usasdos intercambiavelmente, a menos que indicado em contrário. Os oligodesoxinucleotídeos contendo CpG imunoestimuladores contêm um ou mais motivos CpG imunoestimula- dores que são dinucleotídeos citosina-guanina não metilados, opcionalmente dentro de certos contextos básicos preferidos. O estado de metilação do motivo CpG imunoestimulador geralmente refere-se ao resíduo citosina no dinucleotídeo. Um oligonucleotídeo imunoestimula- dor contendo pelo menos um dinucleotídeo CpG não metilado é um oligonucleotídeo que contém uma citosina não metilada 5' ligada por ligação fosfato a uma guanina 3', e que ativa o sistema imunológico através de ligação ao receptor Toll-like 9 (TLR-9). Em uma outra modalidade, o oligonucleotídeo imunoestimulador pode conter um ou mais dinucleotídeos CpG metilados, que vai ativar o sistema imunoló- gica através do TLR9 mas não tão forte quanto o faria se os motivos CpG fossem não metilados. Os oligonucleotídeos contendo CpG imu- noestimuladores podem compreender um ou mais palíndromos que por sua vez podem conter o dinucleotídeo CpG. Oligonucleotídeos contendo CpG já foram descritos em inúmeras patentes emitidas, pedidos de patente publicados, e outros publicações, incluindo as Patentes US Nos 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116; e 6,339,068.

[00140] Em uma modalidade da presente invenção, as composi- ções imunogênicas divulgadas nesta invenção compreendem qualquer um dos oligonucleotídeos contendo CpG descrito na página 3 linha 22 à página 12 linha 36 do documento WO2010/125480.

[00141] Diferentes classes de oligonucleotídeos imunoestimulado- res contendo CpG já foram identificadas. Estas são denominadas classe A, B, C e P, e estão descritas mais detalhadamente na página 3 linha 22 à página 12 linha 36 do documento WO2010/125480. Os métodos da invenção abrangem o uso dessas classes diferentes de oli- gonucleotídeos imunoestimuladores contendo CpG.

[00142] Em uma modalidade da presente invenção, as composições imunogênicas divulgadas nesta invenção compreendem um oli- gonucleotídeo contendo CpG classe A. Preferivelmente, o oligonucleo- tídeo contendo CpG "classe A" da invenção tem a seguinte sequência de ácidos nucleicos: 5’ GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3’ (SEQ ID N°: 1). Alguns exemplos não limitativos de oligonucleotídeos classe A incluem: 5’ G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G 3’ (SEQ ID N°: 2) ; onde * refere-se a uma ligação fosforotioato e _ refere-se a uma ligação fosfodiéster.

[00143] Em uma modalidade da presente invenção, as composições imunogênicas divulgadas nesta invenção compreendem um oli- gonucleotídeo contendo CpG classe B. Em uma modalidade, o oligo- nucleotídeo contendo CpG para uso na presente invenção é um oligo- nucleotídeo contendo CpG classe B representado pelo menos pela fórmula:

[00144] 5' X1X2CGX3X4 3’, onde X1, X2, X3, e X4 são nucleotídeos. Em uma modalidade, X2 é adenina, guanina, ou timina. Em uma outra modalidade, X3 é citosina, adenina, ou timina.

[00145] As sequências do oligonucleotídeo contendo CpG classe B da invenção são aquelas amplamente descritas acima nas patentes US Ps 6.194.388, 6.207.646, 6.214.806, 6.218.371, 6.239.116 e 6.339.068. Sequências exemplificativas incluem, porém sem limitação, aquelas divulgadas nestes últimos pedidos e patentes.

[00146] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo contendo CpG "classe B" da invenção tem a seguinte sequência de ácidos nucleicos: 5’ TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3’ (SEQ ID N°: 3), ou 5’ TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3’ (SEQ ID N°: 4), ou 5’ TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3’ (SEQ ID N°: 5), ou 5’ TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3’ (SEQ ID N°: 6), ou 5’ TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3’ (SEQ ID N°: 7).

[00147] Em qualquer uma dessas sequências, todas as ligações podem ser todas ligações fosforotioato. Em uma outra modalidade, em qualquer uma dessas sequências, uma ou mais das ligações podem ser fosfodiéster, preferivelmente entre o "C" e o "G" do motivo CpG fazendo um oligonucleotídeo contendo CpG semimole. Em qualquer uma dessas sequências, uma etil-uridina ou um halogênio pode substituir o 5' T; exemplos de substituições por halogênio incluem, porém sem limitação, substituições do tipo bromo-uridina ou iodo-uridina.

[00148] Alguns exemplos não limitativos de oligonucleotídeos classe B incluem: 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3’ (SEQ ID N°: 8), ou 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3’ (SEQ ID N°: 9), ou 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’ (SEQ ID N°: 10), ou 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’ (SEQ ID N°: 11), ou 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A 3’ (SEQ ID N°: 12)

[00149] onde * refere-se a uma ligação fosforotioato.

[00150] Em uma modalidade da presente invenção, as composições imunogênicas divulgadas nesta invenção compreendem um oli- gonucleotídeo contendo CpG classe C. Em uma modalidade, os oligo- nucleotídeos contendo CpG "classe C" da invenção têm a seguinte se-quência de ácidos nucleicos: 5’ TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID N°: 13), ou 5’ TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID N°: 14), ou 5’ TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID N°: 15), ou 5’ TCGGACGTTCGGCGCGCCG 3’ (SEQ ID N°: 16), ou 5’ TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG 3’ (SEQ ID N°: 17), ou 5’ TCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID N°: 18), ou 5’ TCGACGTTCGGCGCGCCG 3’ (SEQ ID N°: 19), ou 5’ TCGCGTCGTTCGGCGCCG 3’ (SEQ ID N°: 20), ou 5’ TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID N°: 21), ou 5’ TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID N°: 22), ou 5’ TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG 3’ (SEQ ID N°: 23), ou 5’ TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG 3’ (SEQ ID N°: 24), ou 5’ TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGT 3’ (SEQ ID N°: 25).

[00151] Em qualquer uma dessas sequências, todas as ligações podem ser todas ligações fosforotioato. Em uma outra modalidade, em qualquer uma dessas sequências, uma ou mais das ligações podem ser fosfodiéster, preferivelmente entre o "C" e o "G" do motivo CpG fazendo um oligonucleotídeo contendo CpG semimole.

[00152] Alguns exemplos não limitativos de oligonucleotídeos classe C incluem: 5’ T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID N°: 26), ou 5’ T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID N°: 27), ou 5’ T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID N°: 28), ou 5’ T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID N°: 29), ou 5’ T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID N°: 30), ou 5’ T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID N°: 31), ou 5’ T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID N°: 32), ou 5’ T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID N°: 33), ou 5’ T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID N°: 34), ou 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID N°: 35), ou 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID N°: 36), ou 5’ T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*A*C_G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G 3’ (SEQ ID N°: 37), ou 5’ T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3’ (SEQ ID N°: 38)

[00152] onde * refere-se a uma ligação fosforotioato e _ refere-se a uma ligação fosfodiéster.

[00153] Em qualquer uma dessas sequências, uma etil-uridina ou um halogênio pode substituir o 5' T; exemplos de substituições por ha- logênio incluem, porém sem limitação, substituições do tipo bromo- uridina ou iodo-uridina.

[00154] Em uma modalidade da presente invenção, as composições imunogênicas divulgadas nesta invenção compreendem um oli- gonucleotídeo contendo CpG classe P. Em uma modalidade, o oligo- nucleotídeo contendo CpG para uso na presente invenção é um oligo- nucleotídeo contendo CpG classe P contendo um domínio de ativação 5' TLR e pelo menos duas regiões palindrômicas, uma região palin- drômica sendo uma região palindrômica 5' de pelo menos 6 nucleotí- deos de comprimento e conectada a uma região palindrômica 3' de pelo menos 8 nucleotídeos de comprimento seja diretamente ou através de um espaçador, onde o oligonucleotídeo inclui pelo menos um dinucleotídeo contendo YpR. Em uma modalidade, o referido oligonu- cleotídeo não é T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G (SEQ ID N°: 27). Em uma modalidade o oligonucleotídeo contendo CpG classe P inclui pelo menos um dinucleotídeo contendo CpG não metilado. Em uma outra modalidade, o domínio de ativação TLR é TCG, TTCG, TTTCG, TYpR, TTYpR, TTTYpR, UCG, UUCG, UUUCG, TTT, ou TTTT. Em ainda uma outra modalidade, o domínio de ativação TLR está dentro da região palindrômica 5'. Em uma outra modalidade, o domínio de ativação TLR está imediatamente 5' em relação à região palindrômica 5'.

[00155] Em uma modalidade, os oligonucleotídeos contendo CpG "classe P" da invenção têm a seguinte sequência de ácidos nucleicos: 5’ TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID N°: 39).

[00156] Nas referidas sequências, todas as ligações podem ser todas ligações fosforotioato. Em uma outra modalidade, uma ou mais das ligações podem ser fosfodiéster, preferivelmente entre o "C" e o "G" do motivo CpG fazendo um oligonucleotídeo contendo CpG semimole. Em qualquer uma dessas sequências, uma etil-uridina ou um halogênio pode substituir o 5' T; exemplos de substituições por halo- gênio incluem, porém sem limitação, substituições do tipo bromo- uridina ou iodo-uridina.

[00157] Um exemplo não limitativo de oligonucleotídeos classe P inclui: 5’ T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID N°: 40)

[00157] onde * refere-se a uma ligação fosforotioato e _ refere-se a uma ligação fosfodiéster.

[00158] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo inclui pelo menos uma ligação fosforotioato. Em uma outra modalidade todas as ligações internucleotídicas do oligonucleotídeo são ligações fosforotioato. Em uma outra modalidade o oligonucleotídeo inclui pelo menos uma ligação do tipo fosfodiéster. Em uma outra modalidade ligação do tipo fos- fodiéster é uma ligação fosfodiéster. Em uma outra modalidade um grupo lipofílico é conjugado ao oligonucleotídeo. Em uma modalidade o grupo lipofílico é colesterol.

[00159] Em uma modalidade, todas as ligações internucleotídicas dos oligonucleotídeos contendo CpG divulgado nesta invenção são ligações fosfodiéster (oligonucleotídeos "moles", como descrito no pedido PCT WO2007/026190). Em uma outra modalidade, os oligonucle- otídeos contendo CpG da invenção são deixados resistentes à degradação (por exemplo, são estabilizados). Um "oligonucleotídeo estabilizado" refere-se a um oligonucleotídeo que é relativamente resistente à degradação in vivo (por exemplo, via uma exo- ou endo-nuclease). A estabilização de ácidos nucleicos pode ser efetuada via modificações na cadeia principal. Oligonucleotídeos tendo ligações fosforotioato proporcional atividade máxima e protegem o oligonucleotídeo contra degradação por exo- e endo-nucleases intracelulares.

[00160] Os oligonucleotídeos imunoestimuladores podem ter uma cadeia principal quimérica, que possui combinações de ligações fosfo- diéster e fosforotioato. Para os efeitos da presente invenção, uma cadeia principal quimérica refere-se a uma cadeia principal parcialmente estabilizada, onde pelo menos uma ligação internucleotídíca é do tipo fosfodiéster ou fosfodiéster, e onde pelo menos uma outra ligação in- ternucleotídica é uma ligação internucleotídica estabilizada, onde a pelo menos uma ligação do tipo fosfodiéster ou fosfodiéster e a pelo menos uma ligação estabilizada são diferentes. Quando a ligação fos- fodiéster está preferivelmente localizada no motivo CpG, tais moléculas são denominadas "semimoles" como descrito no pedido PCRF WO2007/026190.

[00161] O tamanho do oligonucleotídeo contendo CpG (isto é, o número dos resíduos nucleotídicos ao longo do comprimento do oligo- nucleotídeo) também pode contribuir para a atividade estimuladora do oligonucleotídeo. Para facilitar a absorção nas células, os oligonucleo- tídeos contendo CpG da invenção preferivelmente tem um comprimento mínimo de 6 resíduos nucleotídicos. Oligonucleotídeos de qualquer tamanho maior que 6 nucleotídeos (até mesmo muitos kb de compri-mento) são capazes de induzir uma resposta imunológica se motivos imunoestimuladores suficientes estiverem presentes, porque oligonu- cleotídeos maiores são degradados dentro das células. Em certas mo-dalidades, os oligonucleotídeos contendo CpG têm 6 a 100 nucleotí- deos de comprimento, preferivelmente 8 a 30 nucleotídeos de comprimento. Em modalidades importantes, os ácidos nucleicos e oligonu- cleotídeos da invenção não são plasmídios ou vetores de expressão.

[00162] Em uma modalidade, os oligonucleotídeos contendo CpG divulgados nesta invenção compreendem substituições ou modificações, tais como nas bases e/ou açúcares como descrito nos parágrafos 134 a 147 do documento WO2007/026190.

[00163] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo contendo CpG da presente invenção é modificado quimicamente. Exemplos de modifica-ções químicas são conhecidos pelos versados na técnica e estão des-critas, por exemplo, em Uhlmann E. et al. (1990), Chem. Rev. 90:543, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke, S.T. et al. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:107-129; e Hunziker J. et al., (1995), Mod. Synth. Methods 7:331-417. Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção pode ter uma ou mais modificações, onde cada modificação fica localizada em uma ponte internucleosídica fosfodi- éster particular e/ou em uma unidade â-D-ribose particular e/ou em uma posição na base nucleosídica natural particular em comparação com um oligonucleotídeo da mesma sequência que é composto de DNA ou RNA natural.

[00164] Em algumas modalidades da invenção, ácidos nucleicos contendo CpG devem ser simplesmente misturados com carreadores imunogênicos de acordo com métodos conhecidos pelos versados na técnica (vide, por exemplo o documento WO03/024480).

[00165] Em uma modalidade particular da presente invenção, qualquer uma das composições imunogênicas divulgadas nesta invenção compreende de 2 μg a 100 mg de oligonucleotídeo contendo CpG, preferivelmente de 0,1 mg a 50 mg de oligonucleotídeo contendo CpG, preferivelmente de 0,2 mg a 10 mg de oligonucleotídeo contendo CpG, preferivelmente de 0,3 mg a 5 mg de oligonucleotídeo contendo CpG, mais preferivelmente de 0,5 a 2 mg de oligonucleotídeo contendo CpG, mais preferivelmente de 0,75 a 1,5 mg de oligonucleotídeo contendo CpG. Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica divulgada nesta invenção compreende aproximadamente 1 mg de oli- gonucleotídeo contendo CpG.

[00166] Em uma modalidade preferida, o adjuvante é um adjuvante à base de alumínio selecionado do grupo que consiste em fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio. Em uma modalidade, as composições imunogênicas descritas nesta invenção compreendem o adjuvante fosfato de alumínio.

[00167] Em uma modalidade preferida, as composições imunogêni- cas da invenção compreendem ainda pelo menos um dentre um tampão, um crioprotetor, um sal, um cátion divalente, um detergente não iônico, um inibidor da oxidação de radicais livres, um diluente ou um carreador.

[00168] A composição imunogênica pode compreender opcionalmente um ou mais tampões fisiologicamente aceitáveis selecionados dentre, porém sem limitação, Tris (trimetamina), fosfato, acetato, borato, citrato, glicina, histidina e succinato. Em certas modalidades, a formulação é tamponada dentro de uma faixa de pH de cerca de 5,0 a cerca de 7,0, preferivelmente de cerca de 5,5 a cerca de 6,5.

[00169] A composição imunogênica pode compreender opcionalmente um ou mais tensoativos não iônicos, incluindo, porém sem limitação, ésteres de ácidos graxos de polioxietileno sorbitan, Polissorba- to-80 (Tween 80), Polissorbato-60 (Tween 60), Polissorbato-40 (Tween 40) e Polissorbato-20 (Tween 20), polioxietileno alquil éteres, incluindo, porém sem limitação, Brij 58, Brij 35, assim como outros tais como Triton X-100; Triton X- 114, NP40, Span 85 e a série Pluronic de ten- soativos não iônicos (por exemplo, Pluronic 121). Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica compreende Polissorbato-80 ou Polissorbato-40, preferivelmente Polissorbato-80. Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica compreende Polissorbato-80 a uma concentração de cerca de 0,001% a cerca de 2% (com até cerca de 0,25% sendo preferido) ou Polissorbato-40 a uma concentração de cerca de 0,001% a 1% (com até cerca de 0,5% sendo preferido).

[00170] A invenção refere-se ainda a vacinas compreendendo a composição imunogênica da invenção.

Métodos para induzir uma resposta imunológica e proteger contra infecções

[00171] A presente invenção também inclui métodos de uso das composições imunogênicas descritas nesta invenção. Por exemplo, uma modalidade da invenção oferece um método para produzir uma resposta imunológica contra Streptococcus pneumoniae, compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade imunogênica de qualquer uma das composições imunogênicas descritas nesta invenção.

[00172] Uma modalidade da invenção oferece um método para proteger um indivíduo contra uma infecção por Streptococcus pneumoniae, ou um método para prevenir infecção por Streptococcus pneumoniae, ou um método para reduzir a severidade de ou retardar o aparecimento de pelo menos um sintoma associado a uma infecção causada por Streptococcus pneumoniae, os métodos compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade imunogênica de qualquer uma das composições imunogênicas descritas nesta invenção.

[00173] Uma modalidade da invenção oferece um método para proteger um indivíduo contra uma infecção pelo sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae, ou um método para prevenir infecção pelo soroti- po 15B de Streptococcus pneumoniae, ou um método para reduzir a severidade de ou retardar o aparecimento de pelo menos um sintoma associado a uma infecção causada pelo sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae, os métodos compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade imunogênica de qualquer uma das composições imunogênicas descritas nesta invenção.

[00174] Uma modalidade da invenção oferece um método para proteger um indivíduo contra uma infecção pelo sorotipo 15C de Streptococcus pneumoniae, ou um método para prevenir infecção pelo soroti- po 15C de Streptococcus pneumoniae, ou um método para reduzir a severidade de ou retardar o aparecimento de pelo menos um sintoma associado a uma infecção causada pelo sorotipo 15C de Streptococcus pneumoniae, os métodos compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade imunogênica de qualquer uma das composições imunogênicas descritas nesta invenção.

[00175] Uma modalidade da invenção oferece um método para proteger um indivíduo contra uma infecção pelo sorotipo 15A de Strepto coccus pneumoniae, ou um método para prevenir infecção pelo soroti- po 15A de Streptococcus pneumoniae, ou um método para reduzir a severidade de ou retardar o aparecimento de pelo menos um sintoma associado a uma infecção causada pelo sorotipo 15A de Streptococcus pneumoniae, os métodos compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade imunogênica de qualquer uma das composições imunogênicas descritas nesta invenção.

[00176] Uma modalidade da invenção oferece um método para tratar ou prevenir uma infecção, doença ou condição causada por Streptococcus pneumoniae associada ao sorotipo 15A, 15B e/ou 15C (preferivelmente 15B e/ou 15C, mais preferivelmente 15B) de Streptococcus pneumoniae em um indivíduo, o método compreendendo a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de uma composição imunogênica descrita nesta invenção ao indivíduo. Uma outra modalidade oferece um método para tratar ou prevenir uma infecção, doença ou condição causada por Streptococcus pneumoniae associada a um sorotipo 15A, 15B e/ou 15C (preferivelmente 15B e/ou 15C, mais preferivelmente 15B) de Streptococcus pneumoniae em um indivíduo, o método compreendendo gerar uma preparação de anticorpo policlonal ou monoclonal a partir da composição imunogênica descrita nesta invenção, e usar a referida preparação de anticorpo para conferir imunidade passiva ao indivíduo.

[00177] Em uma modalidade, a invenção refere-se ao uso do conjugado imunogênico ou composição imunogênica descrita nesta invenção para a produção de um medicamento para proteger um indivíduo contra uma infecção por Streptococcus pneumoniae, e/ou prevenir infecção por Streptococcus pneumoniae, e/ou reduzir a severidade de ou retardar o aparecimento de pelo menos um sintoma associado a uma infecção causada por Streptococcus pneumoniae, e/ou proteger um indivíduo contra uma infecção pelo sorotipo 15A, 15B e/ou 15C (preferivelmente 15B e/ou 15C, mais preferivelmente 15B) de Strepto-coccus pneumoniae e/ou prevenir infecção pelo sorotipo 15A, 15B e/ou 15C (preferivelmente 15B e/ou 15C, mais preferivelmente 15B) de Streptococcus pneumoniae, e/ou reduzir a severidade de ou retardar o aparecimento de pelo menos um sintoma associado a uma infecção causada pelo sorotipo 15A, 15B e/ou 15C (preferivelmente 15B e/ou 15C, mais preferivelmente 15B) de Streptococcus pneumoniae.

[00178] Em uma modalidade, a invenção refere-se ao uso do conjugado imunogênico ou composição imunogênica descrita nesta invenção para proteger um indivíduo contra uma infecção por Streptococcus pneumoniae, e/ou prevenir infecção por Streptococcus pneumoniae, e/ou reduzir a severidade de ou retardar o aparecimento de pelo menos um sintoma associado a uma infecção causada por Streptococcus pneumoniae, e/ou proteger um indivíduo contra uma infecção pelo so- rotipo 15A, 15B e/ou 15C (preferivelmente 15B e/ou 15C, mais preferi-velmente 15B) de Streptococcus pneumoniae e/ou prevenir infecção pelo sorotipo 15A, 15B e/ou 15C (preferivelmente 15B e/ou 15C, mais preferivelmente 15B) de Streptococcus pneumoniae, e/ou reduzir a severidade de ou retardar o aparecimento de pelo menos um sintoma associado a uma infecção causada pelo sorotipo 15A, 15B e/ou 15C (preferivelmente 15B e/ou 15C, mais preferivelmente 15B) de Strepto-coccus pneumoniae.

[00179] Uma "resposta imunológica" a uma composição imunogêni- ca é o desenvolvimento em um indivíduo de uma resposta imunológica humoral e/ou mediada por células a moléculas presentes na composição imunogênica ou composição de vacina de interesse. Para os efeitos da presente invenção uma "resposta imunológica humoral" é uma resposta imunológica mediada por anticorpos e envolve a indução e produção de anticorpos que reconhecem e se ligam com alguma afinidade para o antígeno na composição imunogênica ou vacina da inven- ção, ao passo que uma "resposta imunológica mediada por células" é uma resposta mediada por células T e/ou outras células sanguíneas brancas. Uma "resposta imunológica mediada por células" é produzida pela apresentação de epítopos antigênicos associados a moléculas classe I ou classe II do complexo de histocompatibilidade maior (MHC), CD1 ou outras moléculas do tipo MHC não clássicas. Isto ativa células T auxiliares CD4+ antígeno-específicas ou linfócitos T citotóxi- cos CD8+ ("CTLs"). Os CTLs têm especificidade para antígenos peptí- dicos que são apresentados associados a proteínas codificadas por MHCs clássicos ou não clássicos e expressos na superfície das células. Os CTLs ajudam a induzir e promover a destruição intracelular de micróbios intracelulares, ou a lise de células infectadas por tais micróbios. Um outro aspecto da imunidade celular envolve uma resposta antígeno-específica pelas células T auxiliares. As células T auxiliares agem para ajudar a estimular a função, e se concentram na atividade de células efetoras inespecíficas contra células que apresentam peptí- dio ou outros antígenos associados a moléculas de MHC clássicas ou não clássicas em sua superfície. Uma "resposta imunológica mediada por células" também se refere à produção de citocinas, quimiocinas e outras moléculas deste tipo produzidas por células T ativadas e/ou outras células sanguíneas brancas, incluindo aquelas derivadas de células T CD4+ e célula T CD8+. A capacidade de um antígeno ou composição particular de estimular uma resposta imunológica mediada por células pode ser determinada por inúmeros ensaios, tal como por ensaios de linfoproliferação (ativação de linfócitos), ensaios de células citotóxicas CTL, buscando por linfócitos T específicos para o antígeno em um indivíduo sensibilizado, ou por medição da produção de citoci- na pelas células T em resposta a reestimulação com o antígeno. Tais ensaios são bastante conhecidos na literatura. Vide, por exemplo, Erickson et al. (1993) J. Immunol. 151:4189-4199; e Doe et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:2369-2376.

[00180] Conforme usado neste relatório, "tratamento" (incluindo variações do mesmo, por exemplo, "tratar" ou "tratado") significa qualquer um ou mais dos seguintes: (i) a prevenção de infecção ou rein- fecção, como em uma vaccina tradicional, (ii) a redução na severidade ou na eliminação de sintomas, e (iii) a eliminação substancial ou completa do patógeno ou distúrbio em questão. Assim sendo, o tratamento pode ser efetuado profilaticamente (antes da infecção) ou terapeuti- camente (depois da infecção). Na presente invenção, tratamento profilático é o modo preferido. De acordo com uma modalidade particular da presente invenção, são oferecidos composições e métodos que tratam, incluindo profilaticamente e/ou terapeuticamente, um animal hospedeiro contra uma infecção por Streptococcus pneumoniae sorotipo 15A, 15B e/ou 15C (preferivelmente 15B e/ou 15C, mais preferivelmente 15B). Os métodos da presente invenção são úteis para conferir imunidade profilática e/ou terap6eutica a um indivíduo. Os métodos da presente invenção também podem ser praticados em indivíduos para aplicações de pesquisa biomédica.

[00181] Uma "quantidade imunogênica" e "quantidade imunologi- camente eficaz", ambas usadas intercambiavelmente neste relatório, referem-se à quantidade de antígeno ou composição imunogênica suficiente para produzir uma resposta imunológica, seja uma resposta celular (células T) ou humoral (células B ou anticorpo), ou ambas, segundo medido por ensaios tradicionais conhecidos pelo versado na técnica.

[00182] Em uma modalidade preferida, o referido indivíduo é um ser humano. Em uma modalidade mais preferida, o referido indivíduo é um recém-nascido (isto é, menos de três meses de idade), um bebê (de 3 meses a um ano de idade) ou uma criança de colo (isto é, de um ano a quatro anos de idade).

[00183] Em uma modalidade, as composições imunogênicas divulgadas nesta invenção são para uso como uma vacina.

[00184] Em tal modalidade, o indivíduo a ser vacinado pode ter menos de 1 ano de idade. Por exemplo, o indivíduo a ser vacinado pode ter cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses de idade. Em uma modalidade, o indivíduo a ser vacinado é de cerca de 2, 4 ou 6 meses de idade. Em uma outra modalidade, o indivíduo a ser vacinado tem menos de 2 anos de idade. Por exemplo, o indivíduo a ser vacinado pode ter cerca de 12-15 meses de idade. Em alguns casos, apenas uma dose da composição imunogênica de acordo com a invenção é necessária, mas em algumas circunstâncias, uma segunda, terceira ou quarta dose pode ser dada (vide a seção de posologia).

[00185] Em uma modalidade da presente invenção, o indivíduo a ser vacinado é um adulto humano de 50 anos de idade ou mais, mais preferivelmente um adulto humano de 55 anos de idade ou mais. Em uma modalidade, o indivíduo a ser vacinado é um adulto humano de 65 anos de idade ou mais, 70 anos de idade ou mais, 75 anos de idade ou mais ou 80 anos de idade ou mais.

[00186] Em uma modalidade o indivíduo a ser vacinado é um indivíduo imunocomprometido, em particular um ser humano. Um indivíduo imunocomprometido é genericamente definido como uma pessoa que apresenta capacidade atenuada ou reduzida de criar uma defesa humoral ou celular normal a um desafio por agentes infecciosos.

[00187] Em uma modalidade da presente invenção, o indivíduo imunocomprometido a ser vacinado sofre de uma doença ou condição que prejudica o sistema imunológico e resulta em uma resposta de an-ticorpos que é insuficiente para protegê-lo contra uma doença pneu- mocócica ou tratar a mesma.

[00188] Em uma modalidade, a referida doença é um distúrbio de imunodeficiência primária. Preferivelmente, o referido distúrbio de imu- nodeficiência primária é selecionado do grupo que consiste em: imu-nodeficiências de células T e B combinadas, deficiências de anticorpos, síndromes bem definidas, doenças de desregulação imune, distúrbios fagocíticos, deficiências da imunidade inata, distúrbios autoin- flamatórios, e deficiências em complemento. Em uma modalidade, o referido distúrbio de imunodeficiência primária é selecionado dentre aqueles divulgados na página 24 linha 11 à página 25 linha 19 do pedido PCT WO2010/125480.

[00189] Em uma modalidade particular da presente invenção, o indivíduo imunocomprometido a ser vacinado sofre de uma doença selecionada do grupo que consiste em: infecção por HIV, síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), câncer, distúrbios cardíacos ou pulmonares crônicos, insuficiência cardíaca congestiva, diabetes meli- to, doença hepática crônica, alcoolismo, cirrose, vazamentos de fluido espinhal, cardiomiopatia, bronquite crônica, enfisema, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), disfunção do baço (doença de células falciformes), falta de função do baço (asplenia), malignidade hematológica, leucemia, mieloma múltiplo, doença de Hodgkin, linfoma, insuficiência renal, síndrome nefrótica e asma.

[00190] Em uma modalidade da presente invenção, o indivíduo imunocomprometido a ser vacinado sofre de desnutrição.

[00191] Em uma modalidade particular da presente invenção, o indivíduo imunocomprometido a ser vacinado está tomando um droga ou tratamento que diminui a resistência do corpo à infecção. Em uma mo-dalidade, a referida droga é selecionada dentre aquelas divulgadas na página 26 linha 33 à página 26 linnha 40 do pedido PCT WO2010/125480.

[00192] Em uma modalidade particular da presente invenção, o indivíduo imunocomprometido a ser vacinado é um fumante.

[00193] Em uma modalidade particular da presente invenção, o in- divíduo imunocomprometido a ser vacinado tem uma contagem de cé-lulas sanguíneas brancas (contagem de leucócitos) inferior a 5 x 109 células por litro, ou inferior a 4 x 109 células por litro, ou inferior a 3 x 109 células por litro, ou inferior a 2 x 109 células por litro, ou inferior a 1 x 109 células por litro, ou inferior a 0,5 x 109 células por litro, ou inferior a 0,3 x 109 células por litro, ou inferior a 0,1 x 109 células por litro.

[00194] Contagem de células sanguíneas brancas (contagem de leucócitos): o número de células sanguíneas brancas (WBCs) no sangue. As WBC são usualmente medidas como parte da CBC (contagem sanguínea completa). Células sanguíneas brancas são as células combatentes de infecções no sangue e são distintas das células san-guíneas vermelhas (que transportam oxigênio) conhecidas como eri- trócitos. Existem diferentes tipos de células sanguíneas brancas, inclu-indo neutrófilos (leucócitos polimorfonucleares; PMNs), células em bastão (neutrófilos levemente imaturos), linfócitos tipo T (células T), linfócitos tipo B (células B), monócitos, eosinófilos, e basófilos. Todos os tipos de células sanguíneas brancas estão refletidos na contagem de células sanguíneas brancas. A faixa normal para a contagem de células sanguíneas brancas geralmente varia entre 4.300 e 10.800 células por milímetro cúbico de sangue. Esta também pode ser chamada de contagem de leucócitos e pode ser expressa em unidades internacionais como 4,3 - 10,8 x 109 células por litro.

[00195] Em uma modalidade particular da presente invenção, o indivíduo imunocomprometido a ser vacinado sofre de neutropenia. Em uma modalidade particular da presente invenção, o indivíduo imu- nocomprometido a ser vacinado tem um contagem de neutrófilos inferior a 2 x 109 células por litro, ou inferior a 1 x 109 células por litro, ou inferior a 0,5 x 109 células por litro, ou inferior a 0,1 x 109 células por litro, ou inferior a 0,05 x 109 células por litro.

[00196] Uma contagem de células sanguíneas brancas baixa ou "neutropenia" é uma condição caracterizada por níveis anormalmente baixos de neutrófilos no sangue circulante. Neutrófilos são um tipo es-pecífico de células sanguíneas brancas que ajudam a prevenir e com-bater infecções. O motivo mais comum pelo qual pacientes com câncer apresentam neutropenia é como um efeito colateral de quimioterapia. A neutropenia induzida por quimioterapia aumenta o risco de infecção do paciente e interrompe o tratamento de câncer.

[00197] Em uma modalidade particular da presente invenção, o indivíduo imunocomprometido a ser vacinado tem uma contagem de células CD4+ inferior a 500/mm3, ou uma contagem de células CD4+ inferior a 300/mm3, ou uma contagem de células CD4+ inferior a 200/mm3, uma contagem de células CD4+ inferior a 100/mm3, uma contagem de células CD4+ inferior a 75/mm3, ou uma contagem de células CD4+ inferior a 50/mm3.

[00198] Os exames de células CD4 normalmente são reportados como o número de células por mm3. As contagens normais de CD4 variam entre 500 e 1600, e as contagens de CD8 variam entre 375 e 1100. As contagens CD4 caem drasticamente em pessoas com HIV.

[00199] Em uma modalidade da invenção, qualquer um dos indivíduos imunocomprometidos descritos neste relatório é um ser humano do sexo masculino ou um ser humano do sexo feminino.

[00200] A quantidade de um conjugado em uma composição geralmente é calculada com base no polissacarídeo total, conjugado e não conjugado para aquele conjugado. Por exemplo, um conjugado com 20% de polissacarídeo livre terá cerca de 80 μg de polissacarídeo conjugado e cerca de 20 μg de polissacarídeo não conjugado em uma dose de polissacarídeo de 100 μg. A contribuição proteica para o conjugado normalmente não é levada em consideração ao se calor a dose de um conjugado. Geralmente, cada dose vai compreender de 0,1 a 100 μg de polissacarídeo, particularmente 0,1 a 10 μg, e mais particu larmente 1 a 10 μg e mais particularmente 1 a 5 Dg. Preferivelmente cada dose vai compreender cerca de 1,1, 2, 2,2, 3, 3,3, 4, 4,4 Dg de polissacarídeo.

[00201] As quantidades ideais de componentes para uma composição imunogênica ou vacina particular pode ser determinada por estudos tradicionais que envolvem a observação de respostas imunológi- cas apropriadas em indivíduos. Subsequente a uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou várias imunizações de reforço adequadamente espaçadas.

[00202] A eficácia de um antígeno como um imunógeno pode ser medida seja por ensaios de proliferação, por ensaios citolíticos, tais como ensaios de liberação de cromo para medir a capacidade de uma célula T de lisar sua célula alvo específica, ou por medição dos níveis de atividade das células B medindo-se os níveis de anticorpos circulantes específicos para o antígeno no soro. Uma resposta imunológica também pode ser detectada medindo-se os níveis séricos de anticorpo antígeno-específico induzidos depois da administração do antígeno, e mais especificamente, medindo-se a capacidade dos anticorpos induzidos dessa maneira de melhorar a capacidade opsonofagocitica de células sanguíneas brancas particulares, como descrito nesta invenção. O nível de proteção da resposta imunológica pode ser medido desafiando-se o hospedeiro imunizado com o antígeno que fora administrado. Por exemplo, se o antígeno para o qual uma resposta imuno- lógica é desejada for uma bactéria, o nível de proteção induzida pela quantidade imunogênica do antígeno é medido detectando-se a percentagem de sobrevivência ou a percentagem de mortalidade depois do desafio dos animais com as células bacterianas. Em uma modalidade, a quantidade de proteção pode ser medida medindo-se pelo menos um sintoma associado à infecção bacteriana, por exemplo, uma febre associada à infecção. A quantidade de cada um dos antígenos na vacina ou composições imunogênicas multiantígenos ou multicom- ponentes vai variar em relação a cada um dos outros componentes e pode ser determinada por métodos conhecidos pelo versado na técnica. Tais métodos incluem procedimentos para medir a imunogenicida- de e/ou a eficácia in vivo.

[00203] A invenção oferece ainda anticorpos e composições de an-ticorpos que se ligam especificamente e seletivamente aos polissaca- rídeos capsulares ou conjugados imunogênicos da presente invenção. Em algumas modalidades, os anticorpos são gerados mediante a ad-ministração a um indivíduo dos polissacarídeos capsulares ou conju-gados imunogênicos da presente invenção. Em algumas modalidades, a invenção oferece anticorpos purificados ou isolados direcionados contra um ou mais dos polissacarídeos capsulares ou conjugados imunogênicos da presente invenção. Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção são funcionais segundo medido pela destruição de bactérias em um modelo de eficácia em animais ou via um ensaio de destruição opsonofagocítico. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção conferem imunidade passiva a um indivíduo. A presente invenção oferece ainda moléculas de polinucleotídeo codificando um anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção, e uma célula, linhagem celular (tal como células de hibridoma ou outras linhagens celulares modificadas geneticamente para produção recom- binante de anticorpos) ou um animal transgênico que produz um anticorpo ou composição de anticorpos da invenção, usando técnicas bastante conhecidas pelo versado na técnica.

Exemplos Exemplo 1: Preparação de polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae isolado 1.1 Fermentação e Purificação

[00204] Polissacarídeos capsulares sorotipo 15B podem ser obtidos diretamente de bactérias usando-se procedimentos de isolamento co-nhecidos pelo versado na técnica (vide, por exemplo, os métodos di-vulgados nas Publicações de Pedido de Patente US Nos 20060228380, 20060228381, 20070184071, 20070184072, 20070231340, e 20080102498 ou WO2008118752). Os Streptococcus pneumoniae so- rotipo 15B foram cultivados em um frasco com sementes e em seguida transferidos para um fermentador de sementes. Depois que a densidade ótica desejada foi atingida, as células foram transferidas para um fermentador de produção. O caldo de fermentação foi inativado pela adição de N-lauroil sarcosina e purificado por ultrafiltração e diafiltra- ção.

[00205] O polissacarídeo sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae purificado foi então dimensionado por homogeneização à alta pressão usando-se um homogeneizador PANDA 2K® (GEA Niro Soavi) para produzir o polissacarídeo sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae isolado.

[00206] Preferivelmente, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae isolado obtido pelo processo acima com-preende pelo menos 0,6 mM de acetato por mM de polissacarídeo capsular sorotipo 15B e tem um peso molecular entre 50kDa e 500kDa, preferivelmente 150 e 350kDa.

1.2 Oxidação de polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Strepto-coccus pneumoniae isolado

[00207] A oxidação do polissacarídeo foi efetuada em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,0 ± 0,2) por adição sequencial de uma quantidade calculada de tampão fosfato de potássio 500 mM (pH 6,0) e WFI para dar uma concentração final de polissacarídeo de 2,0 g/L. Se necessário, o pH da reação pH foi ajustado em pH 6,0, aproximadamente. Depois do ajuste do pH, a temperatura da reação foi ajustada em 23 ± 2 °C. A oxidação foi iniciada pela adição de aproxi- madamente 0,25 equivalente molar de periodato de sódio. A reação de oxidação foi efetuada a 23 ± 2 °C durante 16 horas, aproximadamente.

[00208] A concentração e a diafiltração do polissacarídeo ativado foram efetuadas usando-se cassetes de ultrafiltração MWCO 10K. A diafiltração foi efetuada contra diavolumes 20 vezes maiores de WFI. O polissacarídeo ativado purificado foi então armazenado a 5 ± 3°C. O polissacarídeo ativado purificado foi caracterizado, inter alia, por (i) concentração de sacarídeo pelo ensaio colorimétrico; (ii) concentração de aldeído pelo ensaio colorimétrico; (iii) grau de oxidação (iv) peso molecular por SEC-MALLS e (v) presença de O-acetila e glicerol.

[00209] SEC-MALLS é usado para a determinação do peso molecular de polissacarídeos e conjugados polissacarídeo-proteína. SEC é usado para separar os polissacarídeos por volume hidrodinâmico. Índice de refração (RI) e detectores de espalhamento de luz laser multi- ângulos (MALLS) são usados para a determinação do peso molecular. Quando luz interage com matéria, ela espalha-se e a quantidade de luz espalhada está relacionada com a concentração, o quadrado do dn/dc (os incrementos do índice de refração específico), e a massa molar da matéria. A medida do peso molecular é calculada com base nas leituras do sinal de luz espalhada obtidas pelo detector MALLS e do sinal de concentração obtidas pelo detector de RI.

[00210] O grau de oxidação (DO = moles de unidade repetitiva de açúcar / moles de aldeído) do polissacarídeo ativado foi determinado da seguinte maneira:

[00211] O número de moles de unidade repetitiva de açúcar é de-terminado por vários métodos colorimétricos, por exemplo, usando o método Anthrone. Pelo método Anthrone, o polissacarídeo primeiro é decomposto em monossacarídeos pela ação de ácido sulfúrico e calor. O reagente Anthrone reage com as hexoses para formar um complexo de cor verde amarelado cuja absorvência é lida espectrofotometrica- mente a 625nm. Dentro da faixa do ensaio, a absorvência é diretamente proporcional à quantidade de hexose presente.

[00212] O número de moles de aldeído também é determinado si-multaneamente, usando-se o método colorimétrico MBTH. O ensaio MBTH envolve a formação de um composto azínico por reação de grupos aldeído (de uma dada amostra) com uma 3-metil-2- benzotiazolona hidrazona (reagente do ensaio MBTH). O excesso de 3-metil-2-benzotiazolona hidrazona oxida para formar um cátion reativo. O cátion reativo e a azina reagem para formar um cromóforo azul. O cromóforo formado é então lido espectroscopicamente a 650 nm.

[00213] Preferivelmente, o polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae ativado obtido pelo processo acima com-preende pelo menos 0,6 mM de acetato por mM de polissacarídeo capsular sorotipo 15B e tem um peso molecular entre 50kDa e 500kDa, preferivelmente 100 e 250kDa.

1.3 Conjugação de polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Strep-tococcus pneumoniae ativado com CRM197

[00214] O processo de conjugação consiste nas seguintes etapas: a) combinação com o excipiente sacarose e liofilização b) reconstituição do polissacarídeo ativado liofilizado e CRM197 c) conjugação do polissacarídeo ativado a CRM197 e cape- amento d) purificação do conjugado

a) combinação com o excipiente sacarose, e liofilização

[00215] O polissacarídeo ativado foi combinado com sacarose em uma proporção de 25 gramas de sacarose por grama de polissacarí- deo ativado. O frasco com a mistura combinada foi então liofilizado. Subsequente à liofilização, os frascos contendo polissacarídeo ativado liofilizado foram armazenados a -20 ± 5°C. A quantidade calculada de proteína CRM197 foi congelada em cápsulas e liofilizada separadamente. A CRM197 liofilizada foi armazenada a -20 ± 5°C.

b) Reconstitução do polissacarídeo ativado liofilizado e da proteína CRM197

[00216] O polissacarídeo ativado liofilizado foi reconstituído em di- metil sulfóxido anidro (DMSO). Depois da dissolução completa do po- lissacarídeo, uma quantidade igual de DMSO anidro foi adicionada à CRM197 liofilizada para reconstituição.

c) Conjugação e capeamento

[00217] O polissacarídeo ativado reconstituído foi combinado com a CRM197 reconstituída no vaso de reação (proporção inicial: 0,8:1), se-guido por misturação vigorosa para obter uma solução límpida antes de iniciar a conjugação com cianoboroidreto de sódio. A concentração final de polissacarídeo na solução reacional era de aproximadamente 1 g/L. A conjugação foi iniciada pela adição de 1,0 - 1,5 MEq de cia- noboroidreto de sódio à mistura reacional e foi incubada a 23 ± 2 °C por 40-48 horas. A reação de conjugação foi interrompida pela adição de 2 MEq de boroidreto de sódio (NaBH4) para capear os aldeídos não reagidos. Esta reação de capeamento continuou a 23 ± 2°C por 3 ± 1 hora.

d) Purificação do conjugado

[00218] A solução de conjugado foi diluída 1:10 com succinato a 5 mM-solução salina a 0,9% gelado (pH 6.0) na preparação para purificação por filtração de fluxo tangencial usando membranas MWCO de 100-300K. A solução de conjugado diluída foi passada por um filtro de 5 μm e a diafiltração foi efetuada usando-se succinato a 5 mM-solução salina a 0,9% (pH 6,0) como o meio. Depois de a diafiltração ter terminado, o retentado de conjugado foi transferido através de um filtro de 0,22 μm.

[00219] O conjugado foi diluído ainda com succinato 5 mM / solução salina a 0,9% (pH 6), até atingir uma concentração desejada de saca- rídeo de aproximadamente 0,5 mg/mL. A etapa de filtração final no filtro de 0,22 μm foi terminada para obter o conjugado imunogênico.

[00220] Preferivelmente, o conjugado obtido pelo processo acima compreende pelo menos 0,6 mM de acetato por mM de polissacarídeo capsular sorotipo 15B, tem um peso molecular entre 3000 e 20000kDa e tem um grau de conjugação entre 2 e 6.

Exemplo 2: Caracterização do conjugado imunogênico compre-endendo polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae covalentemente ligado a uma CRM197

[00221] O conjugado 1 foi preparado pelo processo divulgado no exemplo 1. Os conjugados 2 e 3 foram preparados por um processo semelhante usando uma quantidade diferente de agente oxidante. O conjugado 4 foi preparado por um processo semelhante à exceção de que o polissacarídeo capsular sorotipo 15B purificado não foi dimensionado e foi ativado até atingir um DO mais baixo (nível de oxidação mais alto) e a conjugação foi realizada em meio aquoso. O conjugado 5 foi preparado por um processo semelhante à exceção de que o po- lissacarídeo capsular sorotipo 15B purificado foi dimensionado por hidrólise química e a conjugação foi realizada em meio aquoso. Os conjugados 6 e 7 foram preparados por um processo semelhante à exceção de que o polissacarídeo capsular sorotipo 15B purificado não foi dimensionado.

[00222] Os conjugados obtidos foram caracterizados e os resultados estão resumidos na Tabela 1. Tabela 1: Conjugados de polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae-CRM197

[00222] A percentagem de polissacarídeo livre é medida por um procedimento que utiliza hidróxido de alumínio gel para ligar a proteína e o sacarídeo ligado covalentemente para remoção por centrifugação. As amostras são misturadas com hidróxido de alumínio gel tamponado com fosfato e centrifugadas. O sacarídeo ligado é pelotizado com o gel e o sacarídeo livre fica no sobrenadante. O sobrenadante resultante e as amostras de controle são quantificadas por ensaios colorimétricos apropriados para determinar a percentagem de sacarídeo livre e con-firmar remoção suficiente de proteína e recuperação de sacarídeo.

[00223] Para a análise de aminoácidos, a amostra de polissacarí- deo-proteína é primeiro hidrolisada em seus componentes individuais como aminoácidos livres, usando-se hidrólise com ácido clorídrico (HCl) 6 N a vácuo e sob calor (160°C por 15 minutos). Depois da hi-drólise, as amostras são analisadas por um analisador de aminoáci- dos. Os aminoácidos individuais são separados por cromatografia de troca iônica usando um gradiente escalonado de tampão citrato de sódio com variações da temperatura e da taxa de fluxo. Depois da separação, a qualquer de cada aminoácido residual é determinada quantitativamente usando-se um sistema de detecção de acoplamento de ninidrina pós-coluna. Neste sistema, a ninidrina é misturada com o eluato da coluna no sistema de reatores pós-coluna e a mistura é passada para o fotômetro. A reação da ninidrina com os aminoácidos elu- ídos produz um composto púrpura que é absorvido no máximo a 570 nm. Esta absorvência é uma resposta (função) linear da quantidade de grupos α-amino presentes e esta reação proporciona um ensaio colo- rimétrico quantitativo para todos os compostos orgânicos com grupos α-amino. Na reação com iminoácidos tais como prolina e hidroxilproli- na, que não possuem grupos amino livres, um composto amarelo bri- lhoso é gerado e monitorado a 440 nm. As áreas de pico para cada aminoácido são calculadas usando-se as saídas de comprimento de onda de 570 e 440 nm.

[00224] O rendimento é calculado da seguinte maneira: (quantidade de polissacarídeo no conjugado x100) / quantidade de polissacarídeo ativado.

[00225] Os conjugados (4 e 5) gerados usando um meio aquoso demonstraram perdas significativos em níveis de O-acetil. Os conjuga-dos gerados no solvente DMSO, usando polissacarídeo nativo sem dimensionamento do MW (6 e 7) não demonstraram perda em níveis de O-acetil. No entanto, os rendimentos do conjugado foram muito pobres além de ter características de filtrabilidade pobres. Os conjugados gerados em DMSO usando polissacarídeo que foram dimensionados por homogeneização à alta pressão (1, 2 e 3) tiveram rendimento alto e características de filtrabilidade melhores com significativa preservação dos níveis de O-acetil. Estes conjugados também tiveram níveis muito baixos de polissacarídeo livres.

Exemplo 3: Ensaio opsonofagocítico da atividade (OPA)

[00226] A imunogenicidade dos conjugados da invenção pode ser avaliada usando-se o ensaio opsonofagocítico (OPA) descrito abaixo.

[00227] Grupos de 30 camundongos Swiss Webster fêmeas de 6-7 semanas de idade foram imunizados com 0,001 μg, 0,01 μg, ou 0,1 μg dos conjugados de teste por via subcutânea na semana 0. Os camun-dongos receberam um reforço com a mesma dose de conjugado na semana 3 e sangue foi coletado na semana 4. OPAs sorotipo- específicos foram efetuados em amostras de soro da semana 4.

[00228] OPAs são usados para medir anticorpos funcionais em soro murino específico para S. pneumoniae sorotipo 15B. O soro de teste é colocado em reações do ensaio que medem a capacidade da imuno- globulina polissacarídeo capsular-específica de opsonizar bactérias, e induzir deposição do complemento, facilitando assim a fagocitose e a destruição de bactérias por fagócitos. O título OPA é definido como a diluição recíproca que resulta em uma redução de 50% na contagem de bactérias em relação aos poços de controle sem soro de teste. O título OPA é interpolado a partir das duas diluições que envolvem este corte de destruição de 50%.

[00229] Os procedimentos OPA foram baseados em métodos descritos por Hu et al., Clin Diagn Lab Immunol 2005;12(February (2)):287-95 com as seguintes modificações. O soro de teste foi diluído seriadamente 1 para 2,5 e adicionado a placas de ensaio de microtitu- lação. Bactérias alvo sorotipo 15B vivas foram acrescentadas aos poços e as placas foram agitadas a 37°C por 30 minutos. Células HL-60 (fagócitos) diferenciadas e soro de filhote de coelho (3 a 4 semanas de idade, Pel-Freez®, concentração final 6,25%) foram acrescentados aos poços, e as placas foram agitadas a 37°C por 45 minutos. Para terminar a reação, 80 μL de NaCl a 0,9% foram adicionados aos poços, misturados, e uma alíquota de 10 μL foi transferida para os poços de placas-filtro MultiScreen HTS HV (Millipore®) contendo 200 μL de água. O líquido foi filtrado através das placas a vácuo e 150 μL de meio HySoy foram acrescentados a cada poço e filtrados. As placas- filtro foram então incubadas a 37°C, 5% CO2 por uma noite e foram então fixadas em solução Destain (Bio-Rad). As placas foram então coloridas com azul de coomassie e descoradas uma vez. As colônias tiveram imagens feitas e foram enumeradas em um analisador ImmunoSpot Analyzer® da Cellular Technology Limited (CTL). As contagens de colônias brutas foram usadas para traçar curvas de destruição e calcular os títulos OPA.

[00230] A imunogenicidade dos conjugados 1 e 2 foi testada de acordo com o ensaio mencionado acima. Um conjugado adicional e um polissacarídeo capsular sorotipo 15B nativo de S. pneumoniae não conjugado (PS não conjugado) também foram testados no mesmo en-saio:

[00231] O conjugado 9 foi preparado por conjugação de polissaca- rídeo capsular sorotipo 15B nativo (isto é, não dimensionado) à CRM197 por aminação redutora em solução aquosa.

[00232] Os resultados estão mostrados na tabela 2.

[00233] Como mostrado na tabela acima, os conjugados 1 e 2, quando administrados a camundongos, geram anticorpos capazes op- sonizar S. pneumoniae sorotipo 15B, e induzir deposição do complemento, facilitando assim a fagocitose e a destruição de bactérias por fagócitos. Além disso, apesar de seu peso molecular mais baixo, eles também apresentaram um nível similar de imunogenicidade em comparação com o conjugado 9 que não fora dimensionado.

Exemplo 4: Respostas OPA funcionais cruzadas entre o sorotipo 15B e o sorotipo 15C

[00234] O sorogrupo pneumocócico 15 inclui quatro sorotipos rela-cionados estruturalmente: 15A, 15B, 15C, e 15F. Os sorotipos 15B e 15C são indistinguíveis por técnicas de tipagem genética e têm composições de polissacarídeos capsulares (PS) semelhantes, exceto que o 15B-PS é a variante O-acetilada de 15C-PS. Para entender se anticorpos anti-PS capsular para o sorotipo 15B funcionalmente sofrem reação cruzada com o sorotipo 15C, 10 coelhos foram imunizados com as vacinas PCV16v e PCV20v ambas contendo um conjugado imuno- gênico compreendendo polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae covalentemente ligado à CRM197 divulgado nesta invenção como parte de sua formulação. Os soros antes e depois da vaccinação foram testados em ensaios OPA contra cepas pneumo- cócicas alvo sorotipos 15B e 15C.

[00235] Dos 10 coelhos de cada grupo, 100% apresentaram resposta OPA ao sorotipo 15B subequente à imunização com um conjugado sorotipo 15B. Dessas mesmas amostras, 100% também apresentaram resposta OPA ao sorotipo 15C (Tabela 1 e Tabela 2). Títulos OPA baixos foram observados nos soros pré-vaccinação no OPA de 15C. Entretanto, um aumento de mais de 10 vezes no título GMT OPA nos soros pós-vaccinação em comparação com os soros pré- vaccinação demonstrou que os conjugados imunogênicos da invenção induz a formação de anticorpos capazes de destruir Streptococcus pneumoniae sorotipo 15B e 15C em um OPA.

[00236] PCV16v é uma composição de conjugados de valência 16 compreendendo glicoconjugados de S. pneumoniae sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F (16vPnC) todos individualmente conjugados a CRM197.

[00237] PCV20v é uma composição de conjugados de valência 20 compreendendo glicoconjugados de S. pneumoniae sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F (20vPnC) todos individualmente conjugados a CRM197. Tabela 1. Títulos de OPA contra cepas sorotipos 15B e 15C em soro de coelho pré- e pós-vacinação com PCV16v Tabela 2. Títulos de OPA contra cepas sorotipos 15B e 15C em soro de coelho pré- e pós-vacinação com PCV20v * Não é possível determinar o título devido a curvas de destruição ruins

Claims

1. Processo para a preparação de um conjugado imunogê- nico compreendendo polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae covalentemente ligado a uma proteína carreadora, caracterizado por compreender as etapas de: (a) combinar um polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado com CRM197, em que o dito polissacarídeo ativado é obtido por um processo compreendendo as etapas de reagir um polissacarídeo capsular sorotipo 15B de Streptococcus pneumoniae isolado compreendendo pelo menos 0,6 mM de acetato por mM do dito polissacarídeo capsular sorotipo 15B com um agente oxidante, em que o dito polissacarídeo ativado tem um peso molecular entre 100 e 300kDa; e (b) reagir o polissacarídeo ativado e a proteína carreadora combinados com um agente redutor para formar um conjugado de polissacarídeo capsular sorotipo 15B-proteína carreadora; em que a etapa (a) e etapa (b) são realizadas em DMSO.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração de polissacarídeo capsular soroti- po 15B ativado na etapa (b) varia entre 0,1 e 10 mg/mL, 0,5 e 5 mg/mL ou 0,5 e 2 mg/mL.

3. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a proporção de entrada inicial de polissacarídeo capsular sorotipo 15B ativado para proteína car- readora varia entre 5:1 e 0,1:1, 2:1 e 0,1:1, 2:1 e 1:1, 1,5:1 e 1:1, 0,1:1 e 1:1, 0,3:1 e 1:1, 0,6:1 e 1:1, ou 0,6:1 e 1,5:1.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que na etapa (b), o polissacarí- deo ativado é reagido com entre cerca de 1 e 2 equivalentes molares de cianoboroidreto de sódio durante cerca de 40 a 50 horas a uma temperatura entre cerca de 20 e 26°C.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender a seguinte etapa adicional: (c) capear o aldeído não reagido por adição de NaBH4.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido agente oxidante é periodato.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido agente oxidante é o periodato de sódio.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido agente oxidante é o metaperiodato de sódio.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o referido processo compreende ainda a etapa de formulação do conjugado em uma vacina multivalente.

10. Conjugado imunogênico, caracterizado pelo fato de que é obtido pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

11. Conjugado imunogênico, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido conjugado imunogênico compreende menos de cerca de 40% de polissacarídeo capsular soro- tipo 15B livre em comparação com a quantidade total de polissacarí- deo capsular sorotipo 15B.

12. Conjugado imunogênico, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o conjugado imunogênico tem um peso molecular entre: 3000 e 20000kDa; 5000 e 10000kDa; 5000 e 20000kDa; 8000 e 20000kDa; 8000 e 16000 KDa; ou 10000 e 16000 KDa.

13. Conjugado imunogênico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que a proporção de polissacarídeo capsular sorotipo 15B para proteína transportadora no conjugado está entre 0,4 e 2.

14. Conjugado imunogênico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que pelo menos 40% do conjugado imunogênico tem um Kd menor ou igual a 0,3 em uma coluna CL-4B.

15. Conjugado imunogênico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de que o grau de conjugação está entre: 2 e 15; 2 e 13; 2 e 10; 2 e 8; 2 e 6; 2 e 5, 2 e 4; 3 e 15; 3 e 13; 3 e 10; 3 e 8; 3 e 6; 3 e 5; 3 e 4; 5 e 15; 5 a 10; 8 e 15; 8 e 12; 10 e 15; ou 10 e 12.

16. Conjugado imunogênico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizado pelo fato de que a razão de acetato por mM polissacarídeo capsular sorotipo 15B mM no conjugado imunogênico para acetato por mM de polissacarídeo capsular soro- tipo 15B mM no polissacarídeo ativado é de pelo menos 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9 ou 0,95, preferencialmente pelo menos 0,7 ou pelo menos 0,9.

17. Composição imunogênica, caracterizada por compreender um conjugado imunogênico como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 16, e um veículo fisiologicamente aceitável.

18. Vacina, caracterizada por compreender uma composição imunogênica como definida na reivindicação 17.

19. Composição imunogênica para proteger um indivíduo contra uma infecção por Streptococcus pneumoniae sorotipo 15B, a composição caracterizada pelo fato de que compreende um conjugado imunogênico preparado de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16 e um veículo fisiologicamente aceitável.