MX2007012337A - Separacion de contaminantes de polisacarido de streptococcus pneumoniae por manipulacion de ph. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un proceso para reducir el contenido de proteina y preservar el contenido de polisacarido capsular en un complejo de caldo de lisado celular de Streptococcus pneumoniae antes de la purificacion. Utilizar la reduccion de pH despues de la lisis celular, ha resultado en un polisacarido purificado que consistentemente cubre la especificacion de proteina, y rendimientos de recuperacion superiores de polisacarido durante el proceso de purificacion.

Description

SEPARACIÓN DE CONTAMINANTES DE POLISACARIDO DE STREPTOCOCCUS PHEUMONIAE POR MANIPULACIÓN DE pH CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a métodos para remover el exceso de proteína soluble a partir de lisados celulares de serotipos de Streptococcus pneumoniae ( S . pneumoniae) usados en la producción de polisacáridos neu ococales .

ANTEDECENTES DE LA INVENCIÓN El polisacárido capsular para cada serotipo de S . pneumoniae utilizado para los productos de vacunas, se produce haciendo crecer el organismo en un medio líquido complejo. La población del organismo es a menudo escalada de un vial sembrado a botellas sembradas y pasado a través de uno o más fermentadores de semilla de volumen incrementado hasta que se alcanzan los volúmenes de fermentación a escapa de producción. El final del ciclo de crecimiento puede ser determinado por uno de varios medios, en tal punto, las células son lisadas a través de la adición de un detergente, el cual ayuda en el rompimiento de la pared celular y liberación de autolisis, lo cual causa la lisis celular cuando las células alcanzan la fase estacionaria. El caldo de lisado es entonces cosechado para procesamiento corriente abajo (purificación). Esta purificación incluye varias etapas REF. : 186685 de cromatografía en columna y diafiltración, para recuperar el polisacárido capsular que circunda las células bacterianas. El polisacárido, cuando se conjuga con una proteína de alto peso molecular, tal como CRM197, y se formula en una vacuna que contiene conjugados de serotipos múltiples, ayuda a conferir inmunidad (a S . pneumoniae) cuando se inyecta en la población objetivo, tal como, por ejemplo, infantes y niños jóvenes. Se han establecido especificaciones para el contenido de proteína en el polisacárido purificado de cada serotipo, para reducir el riesgo de eventos adversos a partir de la vacuna. Por ejemplo, en la vacuna de conjugado neumococal 7-valente actualmente comercializado (7vPnc) ( Prevnar®) , la especificación para contenido de proteína en el polisacárido 4 de serotipo conjugado, es más de 3% y para el polisacárido de serotípo purificado 6B no es más de 2% en una base en peso seco. En algunos casos, ha probado difícil remover la proteína residual que todavía está presente después del proceso de purificación completo. Esfuerzos hechos para dirigir esta emisión a través de cambios en el procesamiento de purificación del lisado celular cubre con solamente éxitos moderados . Se decidió por lo tanto, atacar esta emisión en un lado corriente arriba del proceso. Las proteínas contaminantes clave, son determinadas por ser críticas para el crecimiento e integridad celular. Por lo tanto, las opciones restantes disponibles para reducir la proteína total, consisten de alterar las condiciones de crecimiento y/o cosecha. El proceso de fermentación es escasamente directo. Las células (semillas) son expandidas en botellas de medio a base de soya, después pasadas a través de uno o dos fermentadores de semillas, y finalmente pasadas a un fermentador a escala de producción. En cada etapa, la temperatura y pH son estrechamente monitoreados con pH siendo controlado por la adición de un material base (20% de bicarbonato de sodio) . Cuando el crecimiento alcanza un cierto punto, la corrida se termina por la introducción de un detergente, tal como desoxicolato de sodio (DOC), el cual inicia un proceso de lisis celular. Después de un periodo de mantenimiento, el pH del caldo de lisado se ajusta a 6.6 para precipitar el desoxicolato y los complejos de membrana celular. Este material se mantiene hasta que el procesamiento por centrifugación y filtración se pueden llevar a cabo para remover los sólidos. Mucha de la proteína, sin embargo, permanece solubilizada en el lisado clarificado, causando que el contenido de proteína residual en el polisacárido purificado exceda la especificación. De este modo, existe una necesidad para reducir los niveles de proteína soluble en varios serotipos neumococales durante ya sea, el proceso de fermentación o purificación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención cubre completamente esta necesidad, proporcionando un proceso para reducir el contenido de proteína, y preservar el contenido de polisacárido capsular en un complejo de caldo de lisado celular de Streptococcus pneumoniae, antes de la purificación. Este proceso comprende las etapas de: (a) hacer crecer un serotipo seleccionado de S . pneumonia e en un medio a base de soya, el cual incluye: (i) inocular un primer recipiente que contiene el medio a base de soya con solución base sembrada del serotipo seleccionado, e incubar el primer recipiente hasta que se cubren los requerimientos de crecimiento, y (ii) inocular un segundo recipiente que contiene el medio a base de soya con el cultivo de la etapa (i), mientras se mantiene un pH estable y temperatura en el segundo recipiente, y (b) someter a lisis con un detergente, las células bacterianas producidas en la etapa (a), con ello, producir un lisado que contiene proteínas solubles, desechos celulares, ácidos nucleicos y polisacáridos; (c) agitar el lisado celular por un tiempo suficiente para asegurar la lisis completa y liberación de polisacárido; (d) disminuir el pH del lisado celular a menos de 5.5, para precipitar el detergente y la mayoría de las proteínas solubles; (e) mantener la solución y precipitado formado en la etapa (d) , sin agitación por un tiempo suficiente para permitir sedimentar lo precipitado; y (f) procesar la solución y precipitado por centrifugación y/o filtración, con ello, el polisacárido capsular en solución, es preservado y la proteína soluble es efectivamente reducida. Serotipos de S . pneumonia e no limitantes, ejemplares, seleccionados para esta modalidad de la invención son, 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F y 19A. En una modalidad particular de la invención, y dependiendo del serotipo que se hace crecer en la etapa (a), el pH de fermentación en la etapa (a) , es mantenido por una alimentación base de hidróxido de sodio, carbonato de sodio, o una combinación de los mismos. En otra modalidad, el pH en la etapa (d) es disminuido hasta entre 4.5 y menos de 5.5. En aún otra modalidad, el detergente es desoxicolato de sodio. Esta invención también se refiere a un proceso para reducir el contenido de proteína y preservar el contenido de polisacárido capsular en un complejo de caldo de lisado celular de Streptococcus pneumoniae antes de la purificación. El proceso comprende las etapas de: (a) expandir en volúmenes incrementados a partir de un recipiente de partida a un recipiente a escala de producción en un medio a base de soya, un serotipo seleccionado de S . pneumoniae y mantener un pH y temperatura estable durante el crecimiento celular; (b) someter a lisis con un detergente, las células bacterianas producidas en la etapa (a), con ello, producir un lisado que contiene proteínas solubles, desechos celulares, ácidos nucleicos y polisacáridos; (c) agitar el lisado celular por un tiempo suficiente para asegurar la lisis completa y liberación de polisacárido; (d) disminuir el pH del lisado celular a menos de 5.5, para precipitar el detergente y la mayoría de las proteínas solubles; (e) mantener la solución y precipitado formado en la etapa (d) , sin agitación por un tiempo suficiente para permitir sedimentar lo precipitado; y (f) procesar la solución y precipitado por centrifugación y/o filtración, con ello, el polisacárido capsular en solución, es preservado y la proteína soluble es efectivamente reducida. Serotipos de S . pneumonia e no limitantes, ejemplares, seleccionados para esta modalidad de la invención son, 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F y 19A. En una modalidad particular de la invención, y dependiendo del serotipo que se hace crecer en la etapa (a), el pH de fermentación en la etapa (a) , es mantenido por una alimentación base de hidróxido de sodio, carbonato de sodio, o una combinación de los mismos. En otra modalidad, el pH en la etapa (d) es disminuido hasta entre 4.5 y menos de 5.5. En aún otra modalidad, el detergente es desoxicolato de sodio. En aún otra modalidad, en donde el serotipo es 5 ó 19A, el medio a base de soya es suplementado con bicarbonato de sodio. Esta invención permite la remoción de cantidades grandes de exceso de contaminación de proteína a partir del lisado celular, con ello, dejando un producto más limpio (Caldo Libre de Célula o CFB) , para purificación, el cual en general, obtendrá recuperación de polisacárido superior y rendimientos de polisacárido total que fueron posibles usando el método antes de la fermentación y recuperación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un gel SDS-PAGE que muestra la reducción significante en proteína soluble en gramos por litro de lisado conforme el pH se reduce con ácido acético para S. pneumoniae Tipo 4. Los componentes de 39 kDa y 48 kDa, son proteínas de la superficie de la pared celular. El rendimiento del polisacárido también se muestra. La Figura 2 es un diagrama de resultados para S. pneumoniae Tipo 6B de ajuste de pH hacia abajo a pH 5 que muestra la reducción de proteína, como se determina por rendimiento de SDS-PAGE y polisacárido (Ps) determinado por CLAR-SEC con detector de índice refractivo (Rl). La Figura 3 es un diagrama de resultados para S . pneumonia e Tipo 1 de ajuste de pH hacia abajo a pH 5 que muestra la reducción de proteína, como se determina por rendimiento de SDS-PAGE y polisacárido, determinado por CLAR-SEC con detector Rl . La Figura 4 es un diagrama de resultados para S . pneumoniae Tipo 5 de ajuste de pH hacia abajo a pH 4.1 que muestra la reducción de proteína, como se determina por rendimiento de SDS-PAGE y polisacárido, determinado por CLAR-SEC con detector Rl . La Figura 5 es un diagrama de resultados para S . pneumoniae Tipo 6A de ajuste de pH hacia abajo a pH 4.5 de dos diferentes corridas de fermentación que muestran la reducción de proteína, como se determina por rendimiento de SDS-PAGE y polisacárido, determinado por CLAR-SEC con detector Rl . La Figura 6 es un diagrama de resultados para S . pneumoniae Tipo 7F de ajuste de pH hacia abajo a pH 4.8 que muestra la reducción de proteína, como se determina por rendimiento de SDS-PAGE y polisacárido, determinado por CLAR-SEC con detector Rl .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las Streptococcus pneumoniae son estafilococos en forma de lanza, Gram positivos, que son usualmente vistos en pares (diplococos ) , pero también en cadenas cortas o como células únicas. Crecen fácilmente en placas de agar de sangre con colonias brillantes y exhibe hemolisis alfa a menos que el crecimiento anaeróbicamente estuviera mostrando beta-hemólisis. Son sensibles a sales biliares que pueden romper la pared celular con la presencia de las enzimas, autolisis, propia de las células. El organismo en un anaerobio aerotolerante y es molesto en que tiene requerimientos nutricionales complejos. Las células de la mayoría de los serotipos neumococales tienen una cápsula, la cual es una cubierta de polisacárido que circunda cada célula. Esta cápsula es una determinante de la virulencia en humanos, debido a que interfiere con la fagocitosis previniendo a los anticuerpos de unirse a las células bacterianas. Son actualmente 90 serotipos capsulares identificados, con 23 serotipos responsables por aproximadamente 90% de la muerte invasiva. El revestimiento del polisacárido como una vacuna, puede conferir un grado razonable de inmunidad (a S . pneumoniae) , en individuos con sistemas inmune desarrollados o deteriorados, pero una proteína conjugada con polisacárido, permitirá una respuesta inmune en infantes y adultos de edad avanzada, quienes están más en riesgo de infecciones neumococales. Es importante ser capaz de separar este polisacárido capsular a partir de la bacteria lisada (eliminada) y re mover tanto desecho celular como sea posible. Como se describe en este documento, la remoción se realiza en una serie de cambios de procesos de fermentación. Los tres cambios principales que mayormente mejoran el procesamiento corriente abajo son como sigue: (1) cambiar la alimentación base de fermentación de carbonato de sodio a hidróxido de sodio en donde sea posible; (2) mantener la agitación en el fermentador durante el intervalo de mantenimiento de desoxicolato; y (3) disminuir el pH después que el lisado de desoxicolato se mantiene a menos de 5.5. El descubrimiento inicial fue que, disminuyendo el pH a menos de 5.5, de 50-90% de la proteína soluble indeseada puede ser removido del lisado celular antes del procesamiento corriente abajo (purificación). Mientras este es un mejoramiento importante del proceso, el uso de volúmenes grandes de carbonato de sodio para mantener el pH de punto fijo durante las corridas de fermentación, causa un serio problema de espumación cuando el pH se ajusta a 5.0 con ácido acético. También se descubrió que un pH estable es difícil de mantener después del ajuste, debido a las formas múltiples de carbonato que existen en solución. Esto conduce a observar una alimentación de base alterna que no podría crear una acumulación de carbonato en el caldo de fermentación. El hidróxido de sodio se seleccionó debido a que ya ha sido usado para ajustar el pH del medio y botellas sembradas antes de la inoculación. Estudios hasta de fermentaciones de 100 1, indican que esta fue una alternativa viable con solamente una reducción menor en crecimiento, basados en la densidad óptica (OD) . Esta base también resuelve el problema de espumación. Otras bases además de hidróxido de sodio, pueden ser usadas, y se puede usar bicarbonato de sodio como un suplemento, en donde se determina que el organismo requiere alguna forma de carbonato para mantener el crecimiento, tal como, por ejemplo, con serotipos 5 y 19A. Si el carbonato de sodio se usa como la alimentación de base primaria, tal como para el serotipo 19A, entonces el ajuste de pH post-lisado (a pH de menos de 5.5), requiere una adición de ácido controlada lenta de horas múltiples, para evitar la espumación. Finalmente, basados en la observación de laboratorio, se determinó que si el mantenimiento de desoxicolato procede sin agitación (como en un protocolo previo) , podría establecerse un precipitado similar a gel en las paredes del fermentador y la sonda de pH . Esto crea lecturas de pH in si tu no confiables, cuando el pH se ajusta.

La etapa de agitación previene a este precipitado de formarse y permitir que la integridad de la sonda de pH sea mantenida. De este modo, en la invención actualmente reivindicada, los serotipos seleccionados de Streptococcus pneumoniae son expandidos en volúmenes incrementados de viales sembrados de partida en un medio estéril compuesto de, por ejemplo, un producto a base de soya digerido por la enzima, cloruro de sodio, fosfato de sodio monobásico, cloruro de calcio y un aminoácido seleccionado. La dextrosa con sulfato de magnesio, se usa como la fuente de carbono para sostener el crecimiento en el medio líquido. El medio puede también ser suplementado con otros aditivos como se requiere por el serotipo o procesos específicos. El cultivo inicia en un primer recipiente, tal como botellas sembradas, las cuales, después de un intervalo de crecimiento en una incubadora a base de convección, son usadas para inocular un segundo recipiente, tal como un fermentador de semilla, el cual en cambio, puede ser usado para inocular, si se desea, al menos un recipiente progresivamente grande, tal como un fermentador de producción, hasta que se alcanza la escala de producción. En una modalidad, un serotipo seleccionado de S . pneumonia e es expandido en volúmenes incrementados a partir de viales sembrados a botellas sembradas en un fermentador de 20 1 a un fermentador de 2001 a un fermentador de producción de 2000 1. Los parámetros de crecimiento son estrechamente monitoreados por densidad óptica, temperatura y pH para determinar cuando transferir el cultivo a la siguiente escala de fermentación y también cuando terminar la corrida del lote. Cuando la bacteria entra a la fase estacionaria, las células en el fermentador de producción son forzadas a entras en lisis por la adición de un detergente, tal como un detergente aniónico o catiónico. Ejemplos representativos de tales detergentes incluyen desoxicolato de sodio, N-lauril sarcosina, ácido quenodexoxicólico sódico y saponinas. Después de agitar el lisado celular por un tiempo suficiente para asegurar la completa muerte celular, por ejemplo, por un tiempo entre 8 y 24 horas y una temperatura entre 7°C y 13°C, la segunda fase del proceso es reducir el pH del lisado celular a menos de pH 5.5 con una solución acida, tal como ácido acético al 50%. La reducción de pH actual varía por el serotipo con el propósito de ser capaz de bajar la especificación de proteína purificada final a una base consistente requerida por un proceso de producción robusto. En una modalidad particular de la invención, el pH se disminuye a entre 4.5 y menos de 5.5. La etapa de reducción de pH causa una "salación" (precipitación) de proteínas escasamente solubles. Este es un efecto químico bien conocido en las proteínas, conforme alcanzan sus puntos isoeléctricos. Lo que hace a esta etapa única en la presente invención, es que está siendo usada como una etapa de purificación en un caldo de lisado celular altamente complejo. El caldo es definido como "complejo", debido a que contiene componentes medios, ADN, proteínas, polisacáridos, ARN y otros desechos celulares. Además del ácido acético, el proceso reivindicado también ha sido mostrado por funcionar con ácidos sulfúrico y fosfórico, y debe funcionar con eficiencias variantes después de la serie Hofmeister de los cuales estos ácidos son una parte. Las series Hofmeister son la clasificación de varios aniones y cationes y su capacidad para precipitar mezclas de proteínas. La concentración final de estos compuestos (en la serie Hofmeister) en solución, determina la solubilidad última de las varias proteínas.

Después de un tiempo de mantenimiento sin agitación, que es suficiente para permitir la sedimentación del precipitado y con ello, ayudar en el proceso de centrifugación continua tal como, por ejemplo, entre 12 y 24 horas a una temperatura entre 15°C y 25°C, una porción significante de las proteínas previamente solubles (y probablemente algunos de los otros componentes contaminantes previamente solubles), que caen de la solución como un precipitado sólido con casi pérdida o degradación del producto de polisacárido el cual permanece en la solución. Esta solución con el precipitado, es entonces procesada a través de una centrifuga continua o alternativamente, por centrifugación estándar de botella. El sobrenadante que contiene el polisacárido, es colectado y corrido a través de filtración de micrón y particulados antes de ser transferido para concentración y purificación corriente abajo. Los resultados de usar el proceso de esta invención, son representados en las Figuras. La Figura 1 muestra un gel SDS-PAGE representativo de la reducción de proteína observada usando ácido acético, para reducir el pH de 6.8 a 5.0 en el caldo de lisado celular para el serotipo 4 de S . pneumonia e . La línea izquierda lejana, es un marcador de peso molecular usado como una referencia para el peso de la proteína. La línea de muestra ("C"), es un control que el pH no fue ajustado. Los números muestran el valor aproximado (g/1 del caldo lisado) de las dos bandas de contaminantes de proteína principales (48kDa y 39kDa), y también la proteína total en la línea completa. También se muestra el rendimiento de polisacárido contenido en una alícuota de muestra proporcionada por análisis de CLAR-SEC. Las líneas 2-8 muestran la misma formación a partir de las muestras ajustadas de pH . Las líneas 9-11 son estándares de BSA usados para determinar los rendimientos de proteína por análisis de regresión lineal básicos. Los análisis de Ps no se hacen en la muestra de pH 6.8. En este serotipo particular, hubo alguna pérdida moderada de polisacárido (Ps) pero a una proporción mucho menor que la pérdida de proteína a través de la reducción de pH. La Figura 2 es una gráfica trazada que ilustra la reducción de proteína en el lisado celular del serotipo 6B de S . pneumoniae, junto con la estabilidad de rendimiento de polisacárido, en donde el pH del lisado celular se disminuye a 5.0. No se observó pérdida de polisacárido con este serotipo. Por el contrario, la proteína total se reduce por más de la mitad. La Figura 3 es una gráfica trazada que ilustra la reducción de proteína en el lisado celular del serotipo 1 de S . pneumoniae , junto con la estabilidad de rendimiento de polisacárido cuando el pH del lisado celular se disminuye a .0. Casi no se observó cambio en la concentración del polisacárido. Por el contrario, la proteína total se redujo por más de 90%. La Figura 4 es una gráfica trazada que ilustra la reducción de proteína en el lisado celular del serotipo 5 de S. pneumoniae , junto con la estabilidad de rendimiento de polisacárido cuando el pH del lisado celular se disminuye a 4.1. Casi no se observó cambio en la concentración del polisacárido, hasta pH muy bajo, lo cual se atribuye a un efecto de dilución debido a la cantidad de ácido agregado.

Por el contrario, la proteína total se redujo por más de 75% a pH 4.5. La Figura 5 es una gráfica trazada de dos diferentes corridas de ilustración que ilustra la reducción de proteína en el lisado celular del serotipo 6A de S . pneumoniae , junto con la estabilidad de rendimiento de polisacárido cuando el pH del lisado celular se disminuye a 4.5. Casi no se observó cambio en la concentración del polisacárido. Esta gráfica también muestra que las concentraciones del polisacárido se mantuvieron mientras las concentraciones de proteína se redujeron cuando se usó NaOH en lugar de Na2C03. La Figura 6 es una gráfica trazada que ilustra la reducción de proteína en el lisado celular del serotipo 7F de S . pneumoniae , junto con la estabilidad de rendimiento de polisacárido cuando el pH del lisado celular se disminuye a 4.8. Casi no se observó cambio en la concentración del polisacárido. Por el contrario, la proteína total se redujo por más de 80% a pH 4.8. La Tabla 1 abajo, es representativa de algunas de las ganancias de polisacárido y reducción de proteína, a partir de los polisacáridos purificados después que se utilizó el proceso de esta invención.

Tabla 1. Concentración de Proteína y Rendimiento de Polisacárido de Varios Serotipos de S. pneumoniae *E1 proceso de fermentación mostró una reducción de 80% de proteína del material de lisado DOC, pero la remoción de proteína adicional no fue eficiente durante el proceso de purificación .

Los cambios del proceso de fermentación resumidos anteriormente, sirven para reducir mayormente el contenido de proteína del caldo de lisado previo al procesamiento de purificación. Esto ha permitido al producto purificado, cubrir la especificación de proteína sin modificación significante del proceso de purificación actual para recuperación del polisacárido. Un beneficio inesperado de estos cambios es un mejoramiento del rendimiento total del polisacárido de purificación de 25-100%, debido al crecimiento ligeramente inferior, como se determina por OD. Este es un mejoramiento robusto del proceso de fermentación/recuperación que puede mayormente, mejorar la producción de polisacáridos neumococales. La descripción anterior en general, describe la presente invención. Se puede obtener un entendimiento más completo por referencia los siguientes ejemplos específicos. Estos ejemplos son descritos solamente para propósitos de ilustración y no están propuestos para limitar el alcance de la invención .

EJEMPLOS Ejemplo 1 Reducción de Proteina en el Lisado Celular de S. pnemnonlae Serotipos 1 , 6A y 7F Preparación de Bancos Celulares Principales y de Trabajo Se obtuvo S. pneumoniae serotipo 1 a partir de la Colección de Cultivos Tipo Americanos, ATCC, cepa 6301. Se obtuvieron los serotipos 6A y 7F de S . pneumoniae a partir de Dr. Gerald Shiffman de la Universidad Estatal de Nueva York. Varias generaciones de soluciones base sembradas se crearon para expandir la cepa y remover los componentes de origen animal (generaciones Fl, F2 y F3) . Se produjeron dos generaciones adicionales de soluciones base sembradas. La primera generación adicional se hizo de un vial F3, y la generación subsecuente se hizo a partir de un vial de la primera generación adicional. Viales sembrados se congelaron almacenados (<-70°C) , con glicerol sintético como un criopreservativo . Además de los viales congelados, se prepararon viales liofilizados para la generación F . Para preparación del banco celular, todos los cultivos se hicieron crecer en un medio a base de soya. Antes del congelamiento, las células se concentraron por centrifugación, el medio de centrifugación se removió, y las pelotillas celulares fueron re-suspendidas en medio libre que contiene un criopreservativo, tal como glicerol sintético.

Fermentación y Recuperación Los cultivos del banco celular de trabajo, se usaron para inocular botellas sembradas que contienen un medio a base de soya (Tabla 2) . Las botellas se incubaron a 36°C + 2°C sin agitación, hasta que se cubrieron los requerimientos de crecimiento. Se usó una botella sembrada para inocular un fermentador de siembra que contiene el medio a base de soya. Un pH de aproximadamente 7, se mantiene con NaOH 3N . Después que se alcanzó la densidad óptica objetivo, el fermentador de semilla se usó para inocular el termentador de producción que contiene el medio a base de soya. El pH se mantiene con NaOH 3N. La fermentación se terminó después de la cesación del crecimiento o cuando se alcanzó el volumen de trabajo del fermentador. Se agregó una cantidad apropiada de desoxicolato de sodio estéril al 12% al cultivo, para obtener una concentración de 0.12%-0.13% en el caldo, para lisar las células bacterianas y liberar el polisacárido asociado con la célula. Después del lisado, los contenidos del fermentador se agitaron por un intervalo entre 8 y 24 horas a una temperatura entre 7°C y 13°C, para asegurar que ha ocurrido la lisis celular completa y liberación del polisacárido. La agitación durante este periodo de mantenimiento, previene el sedimento del lisado a partir de la sedimentación en las paredes del fermentador y sonda de pH, con ello, permitiendo mantener la integridad de la sonda de pH . Después, el pH del caldo de cultivo de lisado, se ajustó a aproximadamente pH 5.0 con ácido acético al 50%. Después de un tiempo de mantenimiento sin agitación, por un intervalo de tiempo entre 12 y 24 horas a una temperatura entre 15°C y 25°C, una porción significante de las proteínas previamente solubles, caen de la solución conforme un sólido precipita con poca pérdida o degradación del polisacárido, el cual permanece en la solución. La solución con el precipitado entonces es clarificada por centrifugación de flujo continuo, seguida por filtración profunda y microfiltración de 0.45 µm . A una escala inferior, el proceso descrito anteriormente, también resulta en una reducción significante de la proteína total para serotipos 4 y 6B (Figuras 1 y 2) , lo cual indica que el proceso funcionará para estos dos serotipos a una escala más grande. (Los serotipos 4 y 6b DE S . pn e um on i a e , también se obtuvieron de Dr . Gerald Shiffman de la Universidad Estatal de Nueva York) .

Tabla 2. Compuesto de Medio a base de Soya Ejemplo 2 Reducción de Proteina en el Lisado Celular de S. pnevsmonlae Serotipo 5 El S . pneumonia e serotipo 5, se obtuvo de Dr. Gerald Schiffman de la Universidad Estatal de New York. Para la preparación del sistema de banco celular, véase Ejemplo 1.

Fermentación y Recuperación Los cultivos del banco celular de trabajo, se usaron para inocular botellas sembradas que contienen un medio a base de soya descrito anteriormente (Tabla 2), en el cual, el medio se suplemento con una solución estéril de NaHC0 a una concentración de 10 mM. Las botellas se incubaron a 36°C + 2°C sin agitación, hasta que se cubrieron los requerimientos de crecimiento. Se usó una botella sembrada para inocular un fermentador de siembra que contiene el medio a base de soya con una concentración de NaHC03 10 mM en el medio. Un pH de aproximadamente 7.0, se mantiene con NaOH 3N . Después que se alcanzó la densidad óptica objetivo, el fermentador de semilla se usó para inocular el fermentador de producción que contiene el medio a base de soya con una concentración de NaHC03 10 mM en el medio. El pH se mantiene con NaOH 3N. La fermentación se terminó después de la cesación del crecimiento o cuando se alcanzó el volumen de trabajo del fermentador. Se agregó una cantidad apropiada de desoxicolato de sodio estéril al 12% al cultivo, para obtener una concentración de 0.12%-0.13% en el caldo, para lisar las células bacterianas y liberar el polisacárido asociado con la célula. Después del lisado, los contenidos del fermentador se agitaron por un intervalo entre 8 y 24 horas a una temperatura entre 7°C y 13°C, para asegurar que ha ocurrido la lisis celular completa y liberación del polisacárido. La agitación durante este periodo de mantenimiento, previene el sedimento del lisado a partir de la sedimentación en las paredes del fermentador y sonda de pH, con ello, permitiendo mantener la integridad de la sonda de pH . Después, el pH del caldo de cultivo de lisado, se ajustó a aproximadamente pH 4.8 con ácido acético al 50%. Después de un tiempo de mantenimiento sin agitación, por un intervalo de tiempo entre 12 y 24 horas a una temperatura entre 15°C y 25°C, una porción significante de las proteínas previamente solubles, caen de la solución conforme un sólido precipita con poca pérdida o degradación del polisacárido, el cual permanece en la solución. La solución con el precipitado entonces es clarificada por centrifugación de flujo continuo, seguida por filtración profunda y microfiltración de 0.45 µm. Se debe entender que la discusión y ejemplos mencionados anteriormente, presentan solamente una descripción detallada de ciertas modalidades. Sebe ser por lo tanto, aparente para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica, que varias modificaciones y equivalentes pueden hacerse sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Proceso para reducir el contenido de proteína y preservar el contenido de polisacárido capsular en un complejo de caldo de lisado celular de Streptococcus pneumoniae antes de la purificación, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) hacer crecer un serotipo seleccionado de S . pneumoniae en un medio a base de soya, el cual incluye : (i) inocular un primer recipiente que contiene el medio a base de soya con solución base sembrada del serotipo seleccionado, e incubar el primer recipiente hasta que se cubren los requerimientos de crecimiento, y (ii) inocular un segundo recipiente que contiene el medio a base de soya con el cultivo de la etapa (i), mientras se mantiene un pH estable y temperatura en el segundo recipiente, y (b) someter a lisis con un detergente, las células bacterianas producidas en la etapa (a) , con ello, producir un lisado que contiene proteínas solubles, desechos celulares, ácidos nucleicos y polisacáridos; (c) agitar el lisado celular por un tiempo suficiente para asegurar la lisis completa y liberación de polisacárido; (d) disminuir el pH del lisado celular a menos de 5.5, para precipitar el detergente y la mayoría de las proteínas solubles; (e) mantener la solución y precipitado formado en la etapa (d) , sin agitación por un tiempo suficiente para permitir sedimentar lo precipitado; y (f) procesar la solución y precipitado por centrifugación y/o filtración conservando así el polisacárido capsular en solución y se reduce efectivamente la proteína soluble.
2. 2. Proceso para reducir el contenido de proteína y preservar el contenido de polisacárido capsular en un complejo de caldo de lisado celular de Streptococcus pneumoniae, antes de la purificación, caracterizado porgue comprende las etapas de: (a) expandir en volúmenes incrementados a partir de un recipiente de partida a un recipiente a escala de producción en un medio a base de soya, un serotipo seleccionado de S . pneumoniae y mantener un pH y temperatura estable durante el crecimiento celular; (b) someter a lisis con un detergente, las células bacterianas producidas en la etapa (a), con ello, producir un lisado que contiene proteínas solubles, desechos celulares, ácidos nucleicos y polisacáridos; (c) agitar el lisado celular por un tiempo suficiente para asegurar la lisis completa y liberación de polisacárido; (d) disminuir el pH del lisado celular a menos de 5.5, para precipitar el detergente y la mayoría de las proteínas solubles; (e) mantener la solución y precipitado formado en la etapa (d) , sin agitación por un tiempo suficiente para permitir sedimentar lo precipitado; y (f) procesar la solución y precipitado por centrifugación y/o filtración, con ello, el polisacárido capsular en solución, es preservado y la proteína soluble es efectivamente reducida.
3. 3. Proceso de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque el serotipo seleccionado de S . pneumonia e es 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F ó 19A. . Proceso de conformidad con la reivindicación 1 ó reivindicación 2, caracterizado porque el pH en la etapa (a) se mantiene por una alimentación base de hidróxido de sodio, carbonato de sodio o una combinación de los mismos. 5. Proceso para reducir el contenido de proteína y preservar el contenido de polisacárido capsular en un complejo de caldo de lisado celular de Streptococcus pneumonia e antes de la purificación, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) expandir en volúmenes incrementados a partir de un recipiente de partida a un recipiente a escala de producción en un medio a base de soya, un serotipo seleccionado de S . pneumoniae del grupo que consiste de serotipos 1, 4, 6a, 6B y 7F, y mantener un pH y temperatura estable durante el crecimiento celular, el pH es mantenido con hidróxido de sodio; (b) someter a lisis con un detergente, las células bacterianas producidas en la etapa (a), con ello, producir un lisado que contiene proteínas solubles, desechos celulares, ácidos nucleicos y polisacáridos ; (c) agitar el lisado celular por un tiempo suficiente para asegurar la lisis completa y liberación de polisacárido; (d) disminuir el pH del lisado celular a menos de 5.5, para precipitar el detergente y la mayoría de las proteínas solubles; (e) mantener la solución y precipitado formado en la etapa (d) , sin agitación por un tiempo suficiente para permitir sedimentar lo precipitado; y (f) procesar la solución y precipitado por centrifugación y/o filtración, con ello, el polisacárido capsular en solución, es preservado y la proteína soluble es efectivamente reducida. 6. Proceso para reducir el contenido de proteína y preservar el contenido de polisacárido capsular en un complejo de caldo de lisado celular de Streptococcus pneumoniae antes de la purificación, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) expandir en volúmenes incrementados de S . pneumoniae serotipo 5, a partir de un recipiente de partida a un recipiente a escala de producción en un medio a base de soya, con bicarbonato de sodio, y mantener un pH estable y temperatura durante el crecimiento celular, el pH es mantenido con hidróxido de sodio; (b) someter a lisis con un detergente, las células bacterianas producidas en la etapa (a), con ello, producir un lisado que contiene proteínas solubles, desechos celulares, ácidos nucleicos y polisacáridos; (c) agitar el lisado celular por un tiempo suficiente para asegurar la lisis completa y liberación de polisacárido; (d) disminuir el pH del lisado celular a menos de 5.5, para precipitar el detergente y la mayoría de las proteínas solubles; (e) mantener la solución y precipitado formado en la etapa (d) , sin agitación por un tiempo suficiente para permitir sedimentar lo precipitado; y (f) procesar la solución y precipitado por centrifugación y/o filtración, con ello, el polisacárido capsular en solución, es preservado y la proteína soluble es efectivamente reducida. 7. Proceso para reducir el contenido de proteína y preservar el contenido de polisacárido capsular en un complejo de caldo de lisado celular de Streptococcus pneumoniae antes de la purificación, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) expandir en volúmenes incrementados de S. pneumonia e serotipo 19A, a partir de un recipiente de partida a un recipiente a escala de producción en un medio a base de soya, con bicarbonato de sodio, y mantener un pH estable y temperatura durante el crecimiento celular, el pH es mantenido con bicarbonato de sodio; (b) someter a lisis con un detergente, las células bacterianas producidas en la etapa (a), con ello, producir un lisado que contiene proteínas solubles, desechos celulares, ácidos nucleicos y polisacáridos; (c) agitar el lisado celular por un tiempo suficiente para asegurar la lisis completa y liberación de polisacárido; (d) disminuir el pH del lisado celular a menos de 5.5, para precipitar el detergente y la mayoría de las proteínas solubles; (e) mantener la solución y precipitado formado en la etapa (d) , sin agitación por un tiempo suficiente para permitir sedimentar lo precipitado; y (f) procesar la solución y precipitado por centrifugación y/o filtración, con ello, el polisacárido capsular en solución, es preservado y la proteína soluble es efectivamente reducida. 8. Proceso de conformidad con cualquiera de la reivindicación 1, reivindicación 2, reivindicación 5, reivindicación 6 ó reivindicación 7, caracterizado porque el detergente de desoxicolato de sodio. 9. Proceso de conformidad con cualquiera de la reivindicación 1, reivindicación 2, reivindicación 5, reivindicación 6 ó reivindicación 7, caracterizado porque el pH en la etapa (d) se disminuye entre
4. 4.5 y menos de 5.
5. 5.