KR20080005414A - ｐＨ 조작에 의한 스트렙토코커스 뉴모니애폴리사카라이드로부터 오염물질의 분리 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 정제 전 복합 세포성 스트렙토코커스 뉴모니애 용해물에서 단백질 함량을 감소시키고 캡슐형 폴리사카라이드 함량을 보존하기 위한 방법에 관한 것이다. 세포 용해 후 pH 감소를 이용하여 정제 공정 동안에 단백질 내역을 일관되게 충족시키는 정제된 폴리사카라이드와 고도의 회수율로 폴리사카라이드를 수득한다.
폐렴 구균, pH 조작, 캡슐형 폴리사카라이드

Description

ｐＨ 조작에 의한 스트렙토코커스 뉴모니애 폴리사카라이드로부터 오염물질의 분리 {Separation of contaminants from Streptococcus pneumoniae polysaccharide by pH manipulation}
본 발명은 폐렴 구균성 폴리사카라이드의 생산에서 이용되는 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) (에스. 뉴모니애 (S. pnemoniae)) 혈청형(serotype)의 세포 용해물로부터 과량의 가용성 단백질을 제거하는 방법에 관한 것이다.
백신 생산을 위해 이용되는 각각의 에스. 뉴모니애 혈청형에 대한 캡슐형 폴리사카라이드는 복합 액체 배지에서 성장하는 개체에 의해 생산된다. 개체군을 흔히 씨드 바이알로부터 씨드 병으로 스케일 업하고 용적이 증가되는 하나 이상의 씨드 발효기를 통해서 생산 규모 발효 용적에 도달할 때까지 계대하였다. 성장 주기의 종결은 몇 가지 수단 중 하나에 의해 세포가 용해되는 지점에서 세포 벽의 붕괴를 도와주는 세제의 첨가 및 세포가 정체기에 도달했을 때 세포를 용해시키는 자가 분해효소 (autolysin)의 방출을 통해 결정될 수 있다. 이 후, 용해물은 하위 (정제) 공정을 위해 수거되었다. 당해 정제는 세균 세포를 둘러싸는 캡슐형 폴리사카라이드를 회수하기 위한 몇 가지 컬럼 크로마토그래피 및 정용여과 단계를 포 함한다. CRM179와 같은 고분자량의 단백질과 접합되고 다중 혈청형의 접합체를 함유하는 백신으로 제형화되었을 때, 폴리사카라이드는 예를 들어 유아 및 소아와 같은 표적군에게 주사하였을 때 면역성 (에스. 뉴모니애에 대한)을 부여하도록 돕는다.
백신으로부터 역효과의 위험을 감소시키도록 각 혈청형의 정제된 폴리사카라이드에서 단백질 함량 내역이 설정되었다. 예를 들어, 현재 시판되는 7-가 폐렴구균 접합체 (7vPnC) 백신 (PrevnarR)에서, 정제된 혈청형 4 폴리사카라이드에서 단백질 함량 내역은 건조 중량을 기준으로 3% 이하이고 정제된 혈청형 6B 폴리사카라이드에 대해서는 2% 이하이다.
몇몇 예에서, 전체 정제 공정 후 여전히 존재하는 잔여 단백질의 제거가 어렵다는 것이 입증되었다. 세포 용해물의 정제 공정에서의 변화를 통해 이 문제를 해결하기 위한 노력은 단지 중간 정도의 성공을 이루었다.
그러므로, 공정의 상위 측면에서 이 문제를 공략하기로 결정했다. 주요 오염 단백질은 세포의 성장 및 무결성에 대해 중요한 것으로 결정되었다. 그러므로, 총 단백질을 감소시키는데 유용한 남은 선택 사항은 성장 및/또는 회수 조건을 변화시키는 것으로 이루어진다.
발효 공정은 상당히 간단하다. 세포 (씨드)가 콩-기반 배지의 병에서 증식된 후, 하나 또는 두 개의 씨드 발효기를 통해 계대하고, 최종적으로 생산 규모 발효기에 계대한다. 각 단계에서 온도 및 pH를 면밀히 모니터하고 pH는 염기성 물질 (20% 탄산나트륨)을 첨가하여 조절한다. 성장이 특정 지점에 이르면, 세포 용해 과정을 개시하는, 데옥시콜레이트 나트륨(DOC)과 같은 세제를 도입하여 실험을 종결했다. 방치 기간 후, 용해물의 pH는 6.6으로 조절하여 데옥시콜레이트 및 세포막 복합체를 침전시킨다. 당해 물질은 원심분리 및 여과에 의한 과정이 고체를 제거하기 위해 수행될 때까지 유지되었다.
그러나, 많은 단백질이 정화된 용해물에서 가용화되어 남아있어 정제된 폴리사카라이드에서 잔여 단백질 함량이 요구되는 내역을 초과하게 된다. 그러므로, 발효 또는 정제 과정 동안에 여러 폐렴 구균성 혈청형에서 가용성 단백질 수준을 감소시킬 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 정제 전에 복합 세포성 스트렙토코커스 뉴모니애 용해물에서 단백질 함량을 감소시키고 캡슐형 폴리사카라이드 함량을 보존하기 위한 방법을 제공함으로서 당해 요구를 만족시킨다. 당해 방법은,
(a) (i) 콩-기반 배지를 함유한 제 1 용기에 선택된 혈청형의 씨드 스톡을 접종하고 성장 요구량이 충족될 때까지 제 1 용기를 배양하는 단계 및
(ii) pH 및 온도가 안정하게 유지되는, 콩-기반 배지를 함유한 제 2 용기에 단계 (i)의 배양물을 접종하는 단계를 포함하는, 콩-기반 배지에서 선택된 에스. 뉴모니애 혈청형을 증식시키는 단계;
(b) 단계 (a)에서 생성된 세균 세포를 세제로 용해시켜, 가용성 단백질, 세 포 잔해, 핵산 및 폴리사카라이드를 함유한 용해물을 생성하는 단계;
(c) 완전 용해 및 폴리사카라이드 방출을 확신하기에 충분한 시간 동안 세포 용해물을 진탕하는 단계;
(d) 세포 용해물의 pH를 5.5 미만으로 저하시켜 세제 및 대부분의 가용성 단백질을 침전시키는 단계;
(e) 단계 (d)에서 형성된 용액 및 침전물을 진탕없이 침전물이 침강하기에 충분한 시간 동안 방치하는 단계; 및
(f) 원심분리 및/또는 여과에 의해 용액 및 침전물을 처리하여 용액 내의 캡슐형 폴리사카라이드를 보존하고 가용성 단백질을 효과적으로 감소시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 당해 양태를 위해 선택된 비-제한적인 에스. 뉴모니애 혈청형의 예는 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F 및 19A이다. 본 발명의 특정 양태에서, 단계 (a)에서 증식된 혈청형에 따라, 단계 (a)에서 발효 pH는 수산화나트륨, 탄산나트륨 또는 이의 배합물의 염기 공급물질에 의해 유지된다. 다른 양태에서, 단계 (d)에서의 pH는 4.5 및 5.5 미만 사이로 저하시킨다. 또 다른 양태에서, 세제는 데옥시콜레이트 나트륨이다.
본 발명은 또한 정제 전에 복합 세포성 스트렙토코커스 뉴모니애 용해물에서 단백질 함량을 감소시키고 캡슐형 폴리사카라이드 함량을 보존하기 위한 방법에 관한 것이다. 당해 방법은,
(a) 개시 용기에서 생산 규모 용기로 용적을 증가시키면서, 콩-기반 배지에 서, 선택된 에스. 뉴모니애 혈청형을 증식시키고 세포의 증식 동안에 안정한 pH 및 온도를 유지하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 생성된 세균 세포를 세제로 용해시켜, 가용성 단백질, 세포 잔해, 핵산 및 폴리사카라이드를 함유한 용해물을 생성하는 단계;
(c) 완전 용해 및 폴리사카라이드 방출을 확신하기에 충분한 시간 동안 세포 용해물을 진탕하는 단계;
(d) 세포 용해물의 pH를 5.5 미만으로 저하시켜 세제 및 대부분의 가용성 단백질을 침전시키는 단계;
(e) 단계 (d)에서 형성된 용액 및 침전물을 침전이 침강되기에 충분한 시간 동안 방치하는 단계 및
(f) 용액 및 침전물을 원심분리 및/또는 여과에 의해 처리하여 용액 내의 캡슐형 폴리사카라이드를 보존시키고 가용성 단백질을 효과적으로 감소시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 당해 양태를 위해 선택된, 제한되지 않는 에스. 뉴모니애 혈청형의 예는 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F 및 19A이다. 본 발명의 특정 양태에서, 단계 (a)에서 증식된 혈청형에 따라, 단계 (a)에서 발효 pH는 수산화나트륨, 탄산나트륨 또는 이의 배합물의 염기 공급물질에 의해 유지된다. 다른 양태에서, 단계 (d)에서 pH는 4.5 및 5.5 미만 사이로 저하시킨다. 또 다른 양태에서, 세제는 나트륨 데옥시콜레이트이다.
혈청형이 혈청형 5 또는 19A인 또 다른 양태에서, 콩-기반 배지에 중탄산나 트륨을 보충한다.
본 발명은 세포 용해물로부터 과량의 단백질 오염을 대량으로 제거하게 하여, 정제를 위한 보다 오염 제거된 생성물 (세포 부재 브로쓰, CFB)을 제공하여 일반적으로 이전의 발효 및 회수 방법에서 가능한 것보다 더 높은 폴리사카라이드 수율 및 총 폴리사카라이드 수율을 수득할 수 있게 된다.
도 1은 에스. 뉴모니애 4형에 대해 pH가 아세트산으로 감소됨으로서 용해물 리터 당 가용성 단백질 그램이 현저하게 감소함을 나타내는 SDS-PAGE 겔을 도시한 것이다. 39kDa 및 48kDa 성분은 세포 벽 표면 단백질이다. 폴리사카라이드 수율을 또한 나타내었다.
도 2는 SDS-PAGE에 의해 결정된 단백질 감소 및 굴절지수(RI) 검출기를 가진 HPLC-SEC에 의해 결정된 폴리사카라이드(Ps) 수율을 나타낸, pH 5로의 pH 하향 조절에 따른 에스. 뉴모니애 6B형에 대한 결과 차트이다.
도 3은 SDS-PAGE에 의해 결정된 단백질 감소 및 RI 검출기를 가진 HPLC-SEC에 의해 결정된 폴리사카라이드 수율로서 나타낸, pH 5로의 pH 하향 조절에 따른 에스. 뉴모니애 1형에 대한 결과 차트이다.
도 4는 SDS-PAGE에 의해 결정된 단백질 감소 및 RI 검출기를 가진 HPLC-SEC에 의해 결정된 폴리사카라이드 수율을 나타낸, pH 4.1로의 pH 하향 조절에 따른 에스. 뉴모니애 5형에 대한 결과 차트이다.
도 5는 SDS-PAGE에 의해 결정된 단백질 감소 및 RI 검출기를 가진 HPLC-SEC에 의해 결정된 폴리사카라이드 수율을 나타낸, 두 가지 상이한 발효 과정에서 pH 4.5로의 pH 하향 조절에 따른 에스. 뉴모니애 6A형에 대한 결과 차트이다.
도 6은 SDS-PAGE에 의해 결정된 단백질 감소 및 RI 검출기를 가진 HPLC-SEC에 의해 결정된 폴리사카라이드 수율을 나타낸, pH 4.8로의 pH 하향 조절에 따른 에스. 뉴모니애 7F형에 대한 결과 차트이다.
스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)는 그람-양성, 란셋(lancet) 형태의 구균으로 일반적으로 여러 쌍(쌍구균)으로 나타나지만, 단쇄 또는 단일 세포로서 나타나기도 한다. 이들은 혈액 한천 플레이트에서 광택성 콜로니로서 쉽게 증식하고, 베타 용혈을 보이는 혐기상태에서 증식되지 알파 용혈을 나타낸다. 이들은 세포 자체의 효소인, 자가 분해 효소(autolysin)의 존재 때문에 세포 벽을 파괴할 수 있는 담즙산염에 민감하다. 당해 유기체는 산소내성 혐기성 생물이고 복합 영양 요구량을 갖는다는 점에서 까다롭다.
대부분의 폐렴 구균 혈청형의 세포는 각 세포 주위를 피복하는 폴리사카라이드인 캡슐을 가진다. 당해 캡슐은 항체가 세균 세포에 부착하는 것을 억제함으로써 식세포 작용을 방해하기 때문에 사람에게 독성 결정 인자이다. 현재 90개의 캡슐형 혈청형이 확인되었고, 이 중 23개의 혈청형이 약 90%의 침습성 질환의 원인이다. 백신으로서 당해 폴리사카라이드 피복물은 발달된 또는 손상되지 않은 면역계를 가진 개인에서 합당한 수준의 면역성(에스. 뉴모니애에 대한)을 부여할 수 있지만, 폴리사카라이드와 접합된 단백질은 폐렴구균성 감염의 위험이 가장 많은 유아 및 노인에서 면역 반응을 일으킨다. 용해된 (사멸된) 세균으로부터 당해 캡슐형 폴리사카라이드를 분리하고 가능한 많은 세포 잔해를 제거할 수 있는 것이 중요하다. 본원에서 기술한 바와 같이, 당해 제거는 연속적인 발효 공정의 변화에 의해 이루어진다.
하위 공정을 크게 개선시킨 세 가지 주요 변화는 다음과 같다: (1) 가능하다면 발효 염기 공급물질을 탄산나트륨으로부터 수산화나트륨으로 변화시키는 것; (2) 데옥시콜레이트 정지 기간 동안에 발효기에서 진탕을 유지하는 것 및 (3) pH를 데옥시콜레이트 용해물 정지 후 5.5 미만으로 저하시키는 것.
초기 발견은 pH를 5.5 미만으로 저하시킴으로써, 50 내지 90%의 바람직하지 않은 가용성 단백질을 하위 공정 (정제)전에 세포 용해물로부터 제거할 수 있다는 것이었다. 이는 매우 중요한 공정 강화였지만, 발효 공정 동안에 설정값 pH를 유지하기 위한 대용량의 탄산나트륨의 사용이, pH를 아세트산을 이용하여 5.0으로 조정했을 때 심각한 발포 문제를 일으켰다. 또한 용액 중에 존재하는 다중 형태의 카보네이트때문에 pH가 조정 후에 안정하게 유지되기 어려운 것으로 밝혀졌다. 이는 발효 브로쓰에서 카보네이트 축적을 일으키지 않는 대안적인 염기 공급물질을 모색하도록 하였다. 수산화나트륨은 이미 접종 전 배지 및 씨드 병의 pH 조정에 이용되었기 때문에 선택되었다. 100L 이하의 발효 연구는 광학 밀도(OD)를 기초로 약간의 증식 감소가 있는 대신 실행가능하다는 것을 지적냈다. 이 염기는 또한 발포 문제를 해결하였다. 수산화나트륨 이외의 다른 염기가 이용될 수 있고, 중탄산나트륨은 예를 들어, 혈청형 5 및 19A와 같은 유기체가 증식을 유지하기 위해 어떤 형태의 카보네이트가 필요한 것으로 결정된 경우 첨가물로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 혈청형 19A에 대해 탄산나트륨이 주요 염기 공급물질로 이용되면, 용해 후 pH 조정 (5.5 미만의 pH까지)은, 발포를 피하기 위해 느린 다중-시간 (multi-hour) 조절되는 산 첨가가 요구된다.
마지막으로, 실험적 관찰에 근거하여, 데옥시콜레이트 정지가 진탕없이 진행된다면 (상기한 프로토콜에서와 같이), 겔-유사 침전물이 발효기 벽 및 pH 탐침기 상에 침강할 것이다. 이는 pH를 조정할 때, 신뢰할 수 없는 원위치 pH 판독을 일으킨다. 진탕 단계는 이 침전물이 형성되는 것을 억제하고 pH 탐침기의 무결성이 유지되게 한다.
그러므로, 현재 청구된 발명에서, 선택된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형은 예를 들어, 효소 분해된 콩-기반 생성물, 염화 나트륨, 일 염기성 인산 칼륨, 염화칼슘 및 선택된 아미노산으로 이루어진 멸균 배지 중에서 개시 씨드 바이알로부터 용적을 증가시키면서 증식시켰다. 황산 마그네슘과 함께 덱스트로스가 액체 배지에서 증식을 유지시키기 위한 탄소 공급원으로서 이용된다. 배지에는 또한 특정 혈청형 또는 공정에 의해 요구되는 다른 첨가제가 보충될 수 있다. 배양은 씨드 병과 같은 제 1 용기에서 개시하여 환류-기반 배양기에서 일정 기간 증식시킨 이 후에 이의 배양물을 사용하여 씨드 발효기와 같은 제 2 용기에 접종하고 이어서, 이의 배양물을 사용하여 경우에 따라 생산 규모에 도달할 때까지 하나 이상의 점진적으로 더 큰 용기(생산 발효기와 같은)에 접종시킬 수 있다. 한 양태에서, 선택된 에스. 뉴모니애 혈청형을 개시 씨드 바이알에서 씨드 병으로, 20L 발효기로, 200L 발효기로, 2000L 발효기로 용적을 증가시키면서 증식시켰다. 증식 매개 변수는 언제 배양물을 다음 발효로 이동시킬지 또한 언제 배치(batch) 가동을 정지시킬지 결정하기 위해 광학 밀도, 온도 및 pH에 대해 면밀히 모니터되었다.
세균이 정지기에 진입하면, 생산 발효기에서의 세포는 음이온 또는 양이온 세제와 같은 세제의 첨가에 의해 용해된다. 이들 세제의 대표적인 예는 데옥시콜레이트 나트륨, N-라우릴 사르코신, 케노데옥시콜린산 나트륨 및 사포닌을 포함한다. 완전한 세포 사멸을 확신할 정도의 시간(예, 8 내지 24시간 사이의 시간 및 7℃ 내지 13℃사이의 온도)동안 세포 용해물을 진탕 한 후에, 공정의 제 2기는 세포 용해물의 pH를 50% 아세트산과 같은 아세트산 용액을 이용하여 pH 5.5 미만으로 저하시킨다. 실제적인 pH 감소는 강력한 생산 공정에 필요한 일관된 기초상에서 최종 정제된 단백질 내역 미만이 되도록 하는 목적과 혈청형에 따라 다양하다. 본 발명의 구체적인 양태에서, pH는 4.5 및 5.5 미만 사이로 저하시킨다.
pH 감소 단계는 이전의 가용성 단백질의 "염석"(침전)을 일으킨다. 이는 단백질에 대해 이들이 등전점에 도달했을 때 공지된 화학적 효과이다. 본 발명에서 이 단계를 독특하게 만드는 것은 고도로 복잡한 세포 용해물에서 정제 단계로서 이용되는 것이다. 이 브로쓰는 배지 성분, DNA, 단백질, 폴리사카라이드, RNA 및 기타 세포 잔해를 함유하기 때문에 "복합"으로 정의된다.
아세트산의 첨가뿐만 아니라, 청구된 방법은 또한 황산 또는 인산과 함께 작용하는 것으로 나타나고, 이들 산이 일부인 호프메이스터 (Hofmeister) 시리즈에 따라 다양한 효능으로 작용해야만 한다. 호프메이스터 시리즈는 다양한 음이온 및 양이온 및 단백질 혼합물을 침전시킬 수 있는 능력의 순위이다. 용액 중의 이들 화합물의 최종 농도 (호프메이스터 시리즈에서)는 다양한 단백질의 최종 가용성을 결정한다.
침전물을 침강시키는데 충분하여 계속적인 원심 분리 과정을 도와주기에 충분한 진탕없는 방치 시간, 예를 들어 15℃ 및 25℃사이의 온도에서 12 및 24시간 사이 이후에, 이전의 가용성 단백질 (및 몇몇 기타 이전의 가용성 오염 물질 성분)의 상당 부분이, 용액 중에 남아있는 폴리사카라이드 생성물의 소실 또는 분해가 거의 없이, 고체 침전물로서 용액에서 적출되었다.
침전물을 가진 당해 용액은 그 후 계속적인 원심분리 또는 대안적으로 표준 병 원심분리에 의해 처리된다. 폴리사카라이드를 함유한 상청액은 수집되고 입자 및 미크론 여과를 거친 하위 농축 및 정제를 위해 옮겨진다.
본 발명의 방법을 이용하는 결과는 도면에 도시했다. 도 1은 에스. 뉴모니애 혈청형 4에 대한 세포 용해물 상의 pH를 아세트산으로 6.8로부터 5.0으로 감소시켜 단백질 감소가 관찰되는 대표적인 SDS-PAGE 겔을 도시한 것이다. 가장 왼쪽 레인은 단백질 중량의 참조로서 이용된 분자량 마커이다. 샘플 레인 1 ("C")은 pH가 조정되지 않은 대조군이다. 숫자는 두 가지 주요 단백질 오염 물질 밴드 (48kDa 및 39kDa)의 대략적인 값 (용해물 중의 g/L) 및 또한 전체 레인에서 전체 단백질의 값을 도시한 것이다. 또한 도시한 것은 HPLC-SEC 분석을 위해 제시한 샘플 분취량 중에 함유된 총 폴리사카라이드 회수율이다. 레인 2 내지 8은 pH 조정된 샘플로부터 동일한 정보를 도시한 것이다. 레인 9 내지 11은 기초 선형 회귀 분석에 의해 단백질 회수율을 결정하기 위해 이용되는 BSA 표준이다. Ps분석은 pH 6.9 샘플에 대해서 수행하지 않았다. 이 특정 혈청형에서, 약간의 폴리사카라이드(Ps)의 손실이 있었지만 pH의 감소를 통한 단백질의 손실보다 훨씬 낮은 비율이었다.
도 2는 세포 용해물의 pH를 5.0으로 낮추었을 때, 폴리사카라이드 회수율 안정성과 함께 에스. 뉴모니애 혈청형 6B의 세포 용해물에서 단백질 감소를 나타낸 플롯 그래프이다. 이 혈청형에서 폴리사카라이드의 손실은 나타나지 않았다. 대조적으로, 총 단백질은 반 이상 감소하였다.
도 3은 세포 용해물의 pH를 5.0으로 낮추었을 때, 폴리사카라이드 회수율 안정성과 함께 에스. 뉴모니애 혈청형 1형의 세포 용해물에서 단백질 감소를 나타낸 플롯 그래프이다. 폴리사카라이드 농도는 거의 변화가 없음이 관찰되었다. 대조적으로, 총 단백질은 90% 이상 감소했다.
도 4는 세포 용해물의 pH를 4.1로 낮추었을 때, 폴리사카라이드 회수율 안정성과 함께 에스. 뉴모니애 혈청형 5의 세포 용해물에서 단백질 감소를 나타낸 플롯 그래프를 도시한 것이다. 폴리사카라이드 농도는 다량의 첨가된 산으로 인한 희석 효과에 기인하는 매우 낮은 pH에서까지 거의 변화가 없음이 관찰되었다. 대조적으로, 총 단백질은 pH 4.5에서 75% 이상 감소했다.
도 5는 세포 용해물의 pH를 4.5로 낮추었을 때, 폴리사카라이드 회수율 안정성과 함께 에스. 뉴모니애 혈청형 6A의 세포 용해물에서 단백질 감소를 나타내는 두 가지 상이한 발효의 플롯 그래프이다. 폴리사카라이드 농도의 변화는 거의 관찰되지 않았다. 당해 그래프는 Na2CO3 대신 NaOH를 이용하였을 때 단백질 농도가 감소한 반면 폴리사카라이드 농도는 유지됨을 보여준다.
도 6은 세포 용해물의 pH를 4.8로 낮추었을 때, 폴리사카라이드 회수율 안정성과 함께 에스. 뉴모니애 혈청형 7F형의 세포 용해물에서 단백질 감소를 나타낸 플롯 그래프이다. 폴리사카라이드 농도에서 거의 변화가 관찰되지 않았다. 대조적으로, 총 단백질은 pH 4.8에서 80% 이상 감소하였다.
하기 표 1은 본 발병의 방법이 이용된 이후에 최종 정제된 폴리사카라이드로부터의 몇몇 단백질 감소 및 폴리사카라이드 수득을 기술한 것이다.
Figure 112007080254314-PCT00001
상기한 발효 공정 변화는 정제 공정 전 용해물의 단백질 함량을 크게 감소시키는 역할을 한다. 이는 정제된 생성물이 폴리사카라이드 회수를 위한 현재의 정제 공정의 상당한 변화 없이 단백질 내역을 이루도록 한다. 이들 변화의 예상치 못한 이득은 OD에 의해 결정되는 바와 같이 성장이 약간 낮아지지만, 25 내지 100%의 총 정제 폴리사카라이드 회수율 개선이다. 이는 폐렴 구균성 폴리사카라이드의 생산을 크게 강화할 수 있는 발효/회수 공정의 강력한 개선이다.
상기 내용은 일반적으로 본 발명을 기술한다. 더 완벽한 이해는 다음의 구체적인 실시예를 참조로 납득될 수 있다. 이들 실시예는 단지 설명을 위한 목적으로 기술되며 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
에스 . 뉴모니애 혈청형 1, 6A 및 7F의 세포 용해물에서 단백질 감소
마스터 및 운영 세포 은행의 제조
에스. 뉴모니애 혈청형 1을 수탁기관 [American Type Culture Collection, ATCC, 균주 6301]으로부터 수득했다. 에스. 뉴모니애 혈청형 6A 및 7F을 뉴욕 주립 대학의 쉬프만 게랄드 (Gerald Shiffman) 박사로부터 수득했다. 몇 세대의 씨드 스톡 (세대 F1, F2, F3)을, 균주를 증식시키고 동물 기원의 성분을 제거하기 위해 제조했다. 두 가지 추가적인 세대의 씨드 스톡을 제조했다. 첫 번째 추가적인 세대는 F3 바이알로부터 만들었고, 후속 세대는 첫 번째 추가적인 세대의 바이알로부터 만들었다. 씨드 바이알은 동결 보존제로서 합성 글리세롤과 함께 동결(-70℃ 미만) 저장했다. 동결 바이알에 추가로, 동결 건조한 바이알을 F4 세대를 위해 제조했다. 세포 은행 제조를 위해, 모든 배양물은 콩-기반 배지에서 증식시켰다. 동결 전에, 세포를 원심분리에 의해 농축하고, 사용된 배지를 제거하고, 세포 펠렛을 합성 글리세롤과 같은 동결 보존제를 함유한 신선한 배지에서 재-현탁하였다.
발효 및 회수
운영 세포 뱅크로부터의 배양물을 콩-기반 배지(표 2)를 함유한 씨드 병에 접종하기 위해 이용했다. 병은 진탕하지 않고 성장 요구 조건이 맞을 때까지 36℃±2℃에서 배양했다. 씨드 병을 콩-기반 배지를 함유한 씨드 발효기를 접종하는데 이용했다. 약 7의 pH를 3N NaOH로 유지했다. 표적 광학 밀도에 이른 후, 씨드 발효기를 콩-기반 배지를 함유한 생산 발효기를 접종하는데 이용했다. pH는 3N NaOH로 유지되었다. 발효는 성장의 정지 후 또는 발효기의 운영 용적에 도달했을 때 종결되었다. 적당한 양의 멸균 12% 데옥시콜레이트 나트륨을 배양물에 첨가하여 브로쓰에서 0.12% 내지 0.13%의 농도를 수득하고 세균 세포를 용해시키고 세포-결합된 폴리사카라이드를 방출시켰다. 용해 후, 발효기 내용물을 완전 세포 용해 및 폴리사카라이드의 방출이 일어나는 것이 확실하도록 온도 7℃ 및 13℃사이에서 8 및 24 시간 간격 동안 진탕했다. 당해 정지 기간 동안 진탕은 용해물의 침강물이 발효기 벽 및 pH 탐침기 상에 침강되는 것을 막으므로, pH 탐침기의 무결성이 유지된다. 다음에, 용해된 배양물의 pH를 50% 아세트산으로 약 pH 5.0으로 조정했다. 15℃ 및 25℃ 사이의 온도에서 12 및 24시간 사이의 시간 간격동안의 진탕 없는 방치 시간 이후, 용액 중에 남은 폴리사카라이드는 손실 또는 분해 없이, 이전의 가 용성 단백질의 상당 부분이 고체 침전물로서 용액으로부터 적출되었다. 침전물을 함유한 당해 용액은 계속적인 유동 원심분리 이후 다층 여과 및 0.45㎛ 미세 여과에 의해 정화되었다.
더 작은 규모에서, 상기한 공정은 또한 혈청형 4 및 6B (도 1 및 도 2)에 대한 총 단백질의 상당한 감소를 보였고, 이는 당해 공정이 이들 두 가지 혈청형에 대해 더 큰 규모로 효과적일 것임을 나타낸다 (에스. 뉴모니애 혈청형 4 및 6B를 뉴욕 주립 대학의 쉬프만 게랄드 박사로부터 또한 수득했다).
Figure 112007080254314-PCT00002
실시예 2
에스 . 뉴모니애 혈청형 5의 세포 용해물에서 단백질 감소
에스. 뉴모니애 혈청형 5는 뉴욕 주립 대학의 쉬프만 게랄드 박사로부터 수득했다. 세포 은행 시스템의 제조를 위해 실시예 1을 참조한다.
발효 및 회수
운영 세포 은행으로부터의 배양물을 10mM의 농도에서 멸균 NaHCO3가 보충된 배지인 상기한 콩-기반 배지 (표 2)를 함유한 씨드 병을 접종하는데 이용했다. 병을 36℃±2℃에서 진탕없이 성장 요구 조건이 충족될 때까지 배양했다. 씨드 병을 배지 중에 10mM NaHCO3 농도를 함유한 콩-기반 배지를 함유한 씨드 발효기를 접종하는데 이용했다. 약 7.0의 pH는 3N NaOH로 유지되었다. 표적 광학 밀도에 도달한 이후에, 씨드 발효기를 배지 중에 10mM NaHCO3 농도를 함유한 콩-기반 배지를 함유한 씨드 발효기를 접종하는데 이용했다. pH를 3N NaOH로 유지했다. 발효를 성장의 종료 또는 발효기의 운영 용적에 도달했을 때 종결했다. 적당한 양의 멸균 12% 데옥시콜레이트 나트륨을 배양물에 첨가하여 브로쓰 중의 0.12% 내지 0.13% 농도로 수득하여, 세균 세포를 용해시키고 세포-결합된 폴리사카라이드를 방출시켰다. 용해 후, 발효기의 내용물을 완전 세포 용해 및 폴리사카라이드 방출이 일어나는 것이 확실시되는 7℃ 및 13℃ 사이의 온도에서 8 및 24시간 사이의 시간 간격 동안 진탕했다. 이 정지 기간 동안의 진탕은 발효기 벽 및 pH 탐침기 상에 용해물 침강이 발생하지 않도록하여, pH 탐침기의 무결성을 유지했다. 다음에, 용해된 배양물의 pH를 약 4.8로 50% 아세트산을 이용하여 조정하였다. 15℃ 및 25℃ 사이의 온도에서 12 및 24시간 사이의 시간 간격 동안의 진탕 없는 정지 시간 이후, 용액 중에 남은 폴리사카라이드는 손실 또는 분해 없이, 이전의 가용성 단백질의 상당 부분이 고체 침전물로서 용액에서 적출되었다. 침전물을 함유한 당해 용액은 계속적인 유동 원심분리 이후 다층 여과 및 0.45㎛ 미세 여과에 의해 정화되었다.
앞선 논의 및 실시예는 단순히 특정 양태의 상세한 설명을 제공하고자 한 것임을 이해해야만 한다. 그러므로 다양한 변형 및 등가물이 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않고 수행될 수 있음은 당업자에게 명백하다.

Claims (19)

  1. (a) (i) 콩-기반 배지를 함유한 제 1 용기에 선택된 에스. 뉴모니애 혈청형의 씨드 스톡을 접종하고 제 1 용기를 증식 요구량이 충족될 때까지 배양하고,
    (ii) 안정한 pH 및 온도를 유지하면서 콩-기반 배지를 함유한 제 2 용기에 단계 (i)로부터의 배양물을 접종하는 것을 포함하는, 콩-기반 배지에서 선택된 에스. 뉴모니애 혈청형을 증식시키는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 생성된 세균 세포를 세제로 용해시켜, 가용성 단백질, 세포 잔해, 핵산 및 폴리사카라이드를 함유한 용해물을 생성하는 단계;
    (c) 완전 용해 및 폴리사카라이드 방출을 보장하기에 충분한 시간 동안 세포 용해물을 진탕하는 단계;
    (d) 세포 용해물의 pH를 5.5 미만으로 저하시켜 세제 및 대부분의 가용성 단백질을 침전시키는 단계;
    (e) 단계 (d)에서 형성된 용액 및 침전물을 침전물이 침강하기에 충분한 시간 동안 진탕없이 방치하는 단계 및
    (f) 원심분리 및/또는 여과에 의해 용액 및 침전물을 처리하여 용액 중의 캡슐형 폴리사카라이드를 보존하고 가용성 단백질을 효과적으로 감소시키는 단계
    를 포함하는, 정제 전 복합 세포성 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 용해물에서 단백질 함량을 감소시키고 캡슐형 폴리사카라이드 함량을 보존하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 선택된 에스. 뉴모니애 혈청형이 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F 또는 19A인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 세제가 데옥시콜레이트 나트륨인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단계 (d)에서 pH가 4.5 및 5.5 미만 사이로 저하되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 단계 (a)에서 pH가 수산화나트륨, 탄산나트륨 또는 이의 배합물의 염기 공급물질에 의해 유지되는 방법.
  6. (a) 개시 용기에서 생산 규모 용기로 용적을 증가시키면서, 콩-기반 배지에서, 선택된 에스. 뉴모니애 혈청형을 증식시키고 세포의 증식 동안에 안정한 pH 및 온도를 유지하는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 생산된 세균 세포를 세제로 용해시켜, 가용성 단백질, 세포 잔해, 핵산 및 폴리사카라이드를 함유하는 용해물을 생산하는 단계;
    (c) 완전 용해 및 폴리사카라이드 방출을 보장하기에 충분한 시간 동안 세포 용해물을 진탕하는 단계;
    (d) 세포 용해물의 pH를 5.5 미만으로 저하시켜 세제 및 대부분의 가용성 단백질을 침전시키는 단계;
    (e) 단계 (d)에서 형성된 용액 및 침전물을 침전물이 침강하기에 충분한 시간 동안 진탕없이 방치하는 단계 및
    (f) 원심분리 및/또는 여과에 의해 용액 및 침전물을 처리하여 용액 중의 캡슐형 폴리사카라이드를 보존하고 가용성 단백질을 효과적으로 감소시키는 단계
    를 포함하는, 정제 전 복합 세포성 스트렙토코커스 뉴모니애 용해물에서 단백질 함량을 감소시키고 캡슐형 폴리사카라이드 함량을 보존하기 위한 방법.
  7. 제6항에 있어서, 선택된 에스. 뉴모니애 혈청형이 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F 또는 19A인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 세제가 데옥시콜레이트 나트륨인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 단계 (d)에서 pH가 4.5 및 5.5 미만 사이로 저하되는 방법.
  10. 제6항에 있어서, 단계 (a)에서의 pH가 수산화나트륨, 탄산나트륨 또는 이의 배합물의 염기 공급물질에 의해 유지되는 방법.
  11. (a) 개시 용기에서 생산 규모 용기로 용적을 증가시키면서 콩-기반 배지에서, 혈청형 1, 4, 6A, 6B 및 7F로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 에스. 뉴모니애 혈청형을 증식시키고 세포의 증식 동안 수산화나트륨으로 유지되는 안정한 pH 및 온도를 유지하는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 생산된 세균 세포를 세제로 용해시켜, 가용성 단백질, 세포 잔해, 핵산 및 폴리사카라이드를 함유하는 용해물을 생산하는 단계;
    (c) 완전 용해 및 폴리사카라이드의 방출을 보장하기에 충분한 시간 동안 세포 용해물을 진탕하는 단계;
    (d) 세포 용해물의 pH를 5.5 미만으로 저하시켜 세제 및 대부분의 가용성 단백질을 침전시키는 단계;
    (e) 단계 (d)에서 형성된 용액 및 침전물을 침전물이 침강하기에 충분한 시간 동안 진탕없이 방치하는 단계 및
    (f) 원심분리 및/또는 여과에 의해 용액 및 침전물을 처리하여 용액 중의 캡슐형 폴리사카라이드를 보존하고 가용성 단백질을 효과적으로 감소시키는 단계
    를 포함하는, 정제 전 복합 세포성 스트렙토코커스 뉴모니애의 용해물에서 단백질 함량을 감소시키고 캡슐형 폴리사카라이드 함량을 보존하기 위한 방법.
  12. 제11항에 있어서, 세제가 데옥시콜레이트 나트륨인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 단계 (d)에서 pH가 4.5 및 5.5 미만 사이로 저하되는 방법.
  14. (a) 개시 용기에서 생산 규모 용기로 용적을 증가시키면서 중탄산나트륨이 보충된 콩-기반 배지에서, 에스. 뉴모니애 혈청형 5를 증식시키고 세포의 증식 동안에 수산화나트륨으로 유지되는 안정한 pH 및 온도를 유지하는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 생산된 세균 세포를 세제로 용해시켜, 가용성 단백질, 세포 잔해, 핵산 및 폴리사카라이드를 함유하는 용해물을 생산하는 단계;
    (c) 완전 용해 및 폴리사카라이드 방출을 보장하기에 충분한 시간 동안 세포 용해물을 진탕하는 단계;
    (d) 세포 용해물의 pH를 5.5 미만으로 저하시켜 세제 및 대부분의 가용성 단백질을 침전시키는 단계;
    (e) 단계 (d)에서 형성된 용액 및 침전물을 침전물이 침강하기에 충분한 시간 동안 진탕없이 방치하는 단계 및
    (f) 원심분리 및/또는 여과에 의해 용액 및 침전물을 처리하여 용액 중의 캡슐형 폴리사카라이드를 보존하고 가용성 단백질을 효과적으로 감소시키는 단계
    를 포함하는, 정제 전 복합 세포성 스트렙토코커스 뉴모니애 용해물에서 단백질 함량을 감소시키고 캡슐형 폴리사카라이드 함량을 보존하기 위한 방법.
  15. 제14항에서, 세제가 데옥시콜레이트 나트륨인 방법.
  16. 제14항에서, 단계 (d)에서 pH가 4.5 및 5.5 미만 사이로 저하되는 방법.
  17. (a) 개시 용기에서 생산 규모 용기로 용적을 증가시키면서, 중탄산나트륨이 보충된 콩-기반 배지에서, 에스. 뉴모니애 혈청형 19A를 증식시키고 세포의 증식 동안에 탄산나트륨으로 유지되는 안정한 pH 및 온도를 유지하는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 생산된 세균 세포를 세제로 용해시켜, 가용성 단백질, 세포 잔해, 핵산 및 폴리사카라이드를 함유하는 용해물을 생산하는 단계;
    (c) 완전 용해 및 폴리사카라이드 방출을 보장하기에 충분한 시간 동안 세포 용해물을 진탕하는 단계;
    (d) 세포 용해물의 pH를 5.5 미만으로 저하시켜 세제 및 대부분의 가용성 단백질을 침전시키는 단계;
    (e) 단계 (d)에서 형성된 용액 및 침전물을 침전물이 침강하기에 충분한 시간 동안 진탕없이 방치하는 단계 및
    (f) 원심분리 및/또는 여과에 의해 용액 및 침전물을 처리하여 용액 중의 캡슐형 폴리사카라이드를 보존하고 가용성 단백질을 효과적으로 감소시키는 단계
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  18. 제17항에 있어서, 세제가 데옥시콜레이트 나트륨인 방법.
  19. 제17항에 있어서, pH가 4.5 및 5.5 미만 사이로 저하되는 방법.
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