CN107974418A - 一株海洋蛭弧菌及在氨苄青霉素下促进蛭质体形成的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一株海洋蛭弧菌及在氨苄青霉素下促进蛭质体形成的应用，属于蛭弧菌技术领域。该菌株为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDN‑1，于2017年11月27日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO：60291。本发明利用促蛭弧菌蛭质体形成因子—氨苄青霉素或氨苄青霉素与钙镁离子，促进了蛭弧菌BDN‑1蛭质体的形成；确认了其具有明显延长蛭弧菌微生物制剂保质期的效果；且可在长时间内有效保持蛭弧菌微生物制剂中菌体的活力。本发明提供的促蛭质体培养方法简单可行，适用于推广使用，有望为水产养殖业防治病害作出贡献。

Description

一株海洋蛭弧菌及在氨苄青霉素下促进蛭质体形成的应用
技术领域
本发明属于蛭弧菌技术领域，特别涉及一株以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)为寄生宿主的具有广裂解谱的海洋蛭弧菌及在氨苄青霉素或氨苄青霉素与钙镁离子下促进高密度蛭质体形成的应用。
背景技术
弧菌(vibrios)是海洋环境中最为常见的细菌类群之一，广泛存在于海水、海底沉积物及鱼、虾、贝、蟹、海参、海带等等海产品中。《伯杰氏细菌学手册》第8版记载了35种弧菌，它们中相当一部分是水产养殖生物的重要致病菌。在水产业界，由副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌等各种弧菌引发的养殖生物的疾病统称为弧菌病(vibriosis)，它每年给水产业界造成巨大的经济损失。
目前，在水产养殖中，针对病害，仍普遍使用抗生素和化学药物，导致耐药菌株产生及药残超标，引发多宝鱼药残事件等食品安全问题。而蛭弧菌(Bdellovibrio-and-likeorganisms，BALOs)为一类极其好氧的寄生性革兰氏阴性菌，具寄生、进而裂解其它细菌的作用。众多研究表明，蛭弧菌具有裂解水产动物养殖中常见致病菌如溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)等的能力，通过抑制这些有害菌群的滋生和转移，能够保持甚至增加水产动物肠道中本就对致病弧菌有抑制作用的益生菌如乳酸菌和双歧杆菌等的数量，激发水产动物肠道免疫系统运作，增强机体免疫力、抗病力和抗应激能力，从而改善水产动物肠道菌群结构、提高其存活率。
蛭弧菌广泛存在于自然环境如海洋等，也存在于鱼、虾、牛、马、猪、鸭和人等肠道，为它们各自微生物群落固有一员，但不具侵染植物、鱼、虾及人等哺乳动物细胞能力。此外，它在健康人肠道中数量众多，维持着肠道微生态系平衡；在患肠炎等病人中则严重减少乃至消失。它在调控人肠道各微生物类群、维持生态平衡的有益作用。因此，蛭弧菌因可裂解致病性弧菌而在海水养殖中倍受重视，目前已成为养殖中有益菌之一。虽然正在被越来越广泛的使用，但目前市面上的产品几乎不存在有活性的蛭弧菌，或数量极少。
我们通过研究蛭弧菌发现，其生活史包括带鞭毛营运动但不增殖的游泳体阶段(free swimming phase)和在宿主细胞内行生长繁殖的蛭质体阶段(Bdelloplast phase)，且蛭弧菌完成一个生命周期仅需4个小时。在游泳体阶段，蛭弧菌需消耗巨大能量和氧营运动生活，以便遇获宿主。如在一段时间内未遇宿主，则能量和/或氧耗尽而死去。此阶段一般不超过数小时。换句话说，游泳体蛭弧菌极易死亡，极难存活。在蛭质体阶段，蛭弧菌已进入到宿主胞质空间，在宿主细胞壁保护下，脱去了鞭毛，通过分解宿主细胞营养自身，成长杆状。之后，通过多分裂，分成多个小段，每小段长出鞭毛，即成子一代游泳体。
已有研究表明，蛭质体阶段，生长(变长的过程)可被随时打断。待环境条件合适后，蛭质体再行分裂、分化成多个游泳体。因此，相比脆弱且高耗氧的游泳体，低耗氧的蛭质体耐受恶劣环境能力强。且蛭质体和游泳体具同等作用力。因此解决当前蛭弧菌产品所存在的活菌存活率低、保质期短的问题的关键在于在高浓度发酵过程中转变游泳体为蛭质体，同时延缓蛭质体发育。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为寄生宿主的具有广裂解谱的海洋蛭弧菌。
本发明的另一目的在于提供一种氨苄青霉素或氨苄青霉素与钙镁离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用。
通过添加促培养因子—氨苄青霉素或氨苄青霉素与钙镁离子来促进海洋蛭弧菌蛭质体形成，提高其浓度。该方法弥补了实验技术中蛭弧菌微生物制剂保质期较短的缺点。
本发明的另一目的在于提供一种海洋蛭弧菌蛭质体微生物制剂。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一株具有广裂解谱的海洋蛭弧菌，名称为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDN-1，是来源于福建某水产养殖的海水中，经人工富集培养、分离纯化得到，是一株以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为寄生宿主的蛭弧菌。
所述的蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDN-1的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2017年11月27日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC NO：60291。
所述的蛭弧菌BDN-1的培养温度优选为25～35℃(更优选为30℃)，pH优选为6.5～8.0(更优选为7.2)，盐度优选为10～25‰(更优选为15‰)；
培养所述的蛭弧菌BDN-1的培养基优选为DNB培养基；
所述的蛭弧菌BDN-1，具有2如下形态特征和生理生化特性：
a、所筛选的蛭弧菌BDN-1革兰氏染色为阴性，椭圆形，无芽孢，端生单根鞭毛；
b、噬菌斑的形态特征为：所述的蛭弧菌BDN-1在DNB双层固体培养基平板30℃培养3天后，噬菌斑呈圆形，透明，湿润，边缘整齐，直径2～3mm；
本发明还提供一种所述的蛭弧菌BDN-1在抑制会引发水产养殖生物病害的致病菌中的应用，具有广裂解谱性质。
所述的致病菌包括溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)、气味沙雷菌(Serratiaficaria)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、雷氏普罗威登斯菌(Providenciarettgeri)等；
本发明还提供一种氨苄青霉素或氨苄青霉素与钙镁离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用，尤其是氨苄青霉素或氨苄青霉素与钙镁离子在延长海洋蛭弧菌蛭质体的保质期中的应用。
优选的，所述的氨苄青霉素的使用终浓度为50～150μg/mL；更优选为100～150μg/mL，最优选为150μg/mL。
优选的，所述的钙镁离子的摩尔比为2：1。
优选的，所述的氨苄青霉素与钙镁离子的使用终浓度分别为50～150μg/mL、(4～40)/(2～20)mM；更优选为100～150μg/mL、(4～20)/(2～10)mM；最优选为150μg/mL、20/10mM。
一种海洋蛭弧菌蛭质体微生物制剂，通过以下方法制备得到：在含有宿主菌的DNB液体培养基中接入蛭弧菌，于25～35℃、150～300rpm培养36～48h，再次添加宿主菌，并加入氨苄青霉素或氨苄青霉素与钙镁离子，继续培养20～28h，培养液经4℃、6000～8000rpm离心10～15min后，去除含蛭弧菌游泳体的上清液，沉淀使用质量体积比(g/mL)10～25‰(优选为15‰)盐度的灭菌蒸馏水吸打悬浮，调整其浓度至1011PFU/mL，即是海洋蛭弧菌蛭质体微生物制剂。
优选的，所述的蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDN-1。
本发明的机理是：
本发明就现有研究，发明一种通过在高浓度发酵过程中添加促培养因子氨苄青霉素或氨苄青霉素与钙镁离子来促进蛭质体的转变，并延缓其发育，再将其浓缩后冷冻干燥或直接保藏，来延长蛭弧菌蛭质体试剂的保质期，保证其存活率的同时，投入市场应用，有望为水产养殖业防治病害作出贡献。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供了一株以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为寄生宿主且具有广裂解谱性质的蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDN-1；
(2)本发明利用促蛭弧菌蛭质体形成因子——氨苄青霉素或氨苄青霉素与钙镁离子，促进了蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDN-1蛭质体的形成；确认了其具有明显延长蛭弧菌微生物制剂保质期的效果；且可在长时间内有效保持蛭弧菌微生物制剂中菌体的活力。本发明提供的促蛭质体培养方法简单可行，适用于推广使用。
(3)本发明提供的高密度蛭质体可抑制会引发水产养殖生物病害的弧菌，具有广裂解谱性质，且其裂解能力同蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDN-1混合体(既含有蛭质体又含有游泳体)相比有所提高；
(4)本发明提供的蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDN-1高密度蛭质体组同对照组相比保质期得到了延长。
附图说明
图1是蛭弧菌BDN-1的DNB双层固体培养基平板法分离结果图。
图2是蛭弧菌BDN-1的透射电镜观察结果图。
图3是实施例2中的不同浓度氨苄青霉素组的蛭弧菌BDN-1蛭质体密度结果图。
图4是实施例3中的不同浓度钙离子组的蛭弧菌BDN-1蛭质体密度结果图。
图5是实施例4中的不同浓度镁离子组的蛭弧菌BDN-1蛭质体密度结果图。
图6是实施例5中的不同浓度钙镁离子组合组的蛭弧菌BDN-1蛭质体密度结果图。
图7是实施例7中优选的氨苄青霉素组蛭弧菌蛭质体制剂浓度降低到原始浓度的1％的保质期效果对比图。
图8是实施例7中优选的氨苄青霉素与钙镁离子组蛭弧菌蛭质体制剂浓度降低到原始浓度的1％的保质期效果对比图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中涉及到的培养基：
DNB液体培养基的配方(g/L)：营养肉体0.8，酸水解酪蛋白0.5，酵母提取粉0.1，氯化钠15；最终pH 7.2；
DNB上层培养基配方：15‰盐度的无菌水中加入质量比为0.8％的琼脂粉，最终pH7.2；
DNB下层培养基配方：DNB液体培养基中加入质量比为1.5％的琼脂粉，最终pH7.2；
营养肉汤(NB)液体培养基配方(g/L)：蛋白胨10；牛肉膏粉3；氯化钠5，最终pH7.2；
营养肉汤(NB)固体培养基配方：营养肉汤液体培养基中加入质量比为1.5％的琼脂粉，最终pH 7.2；
氨苄青霉素母液的配方：称取0.25g氨苄青霉素粉末溶于50mL的无菌蒸馏水中；
氯化钙母液的配方：称取0.55g氯化钙粉末溶于50mL的蒸馏水，灭菌处理；
硫酸镁母液的配方：称取12.32g七水合硫酸镁粉末溶于50mL的蒸馏水，灭菌处理。
本实施例中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis GIM 1.136)购买于广东省微生物研究所。
本实施例中26株指示菌中，溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)1、溶藻弧菌(V.alginolyticus)2、溶藻弧菌(V.alginolyticus)3、溶藻弧菌(V.alginolyticus)4、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)8、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)9、溶藻弧菌(V.alginolyticus)10、溶藻弧菌(V.alginolyticus)11、腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)12、气味沙雷菌(Serratia ficaria)15、溶藻弧菌(V.alginolyticus)16、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)17、溶藻弧菌(V.alginolyticus)19、气味沙雷菌(Serratia ficaria)20、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)22、腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)24、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)25、腐败希瓦氏菌(Sh.putrefaciens)27、腐败希瓦氏菌(Sh.putrefaciens)28、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)29、成团泛菌(Pantoea agglomerans)30、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)31、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)33、腐败希瓦氏菌(Sh.putrefaciens)34、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)35由华南理工大学轻工与食品学院提供(biological characterization of two marine bdellovibrio-and-likeorganisms isolated from Daya bay of Shenzhen,China and their application inthe elimination of Vibrio parahaemolyticus in oyster[J].Li H,Liu C,Chen L etal.International Journal of Food Microbiology,2011,151:36–43.)；
雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)32由华南理工大学轻工与食品学院提供(The protective effect of bdellovibrio-and-like organisms(BALO)on tilapiafish fillets against Salmonella enterica ssp.enterica serovar Typhimurium[J].Lu F,Cai J.Letters in Applied Microbiology,2010,51:625–631.)；
同时，本实施例中26株指示菌均在专利“ZL201410752144.2、一株具有广谱抑菌活性的乳酸菌及其应用”中公开。
实施例1 蛭弧菌BDN-1的分离和纯化
从福建某水产养殖的海水水体区域取回样品，取样品液体10mL在20000rpm下离心20min富集后，用灭菌后的DNB液体培养基悬浮，加入无菌处理的50mL瓶装DNB液体营养基中，200r/min 30℃培养48h，将菌液先在6000rpm下离心10min，取上清液经0.8μm醋酸纤维素滤膜过滤，滤液于20000rpm下离心20min后，用无菌水悬浮沉淀物，将悬浮液稀释成10-1、10-2、10-3、10-4，各稀释梯度倒DNB双层固体培养基平板检测出斑情况，30℃培养3～4天，接种环挑取大小一致，圆形，透明且边缘整齐的的单个噬菌斑到50mL DNB液体培养基中继续培养，重复倒DNB双层固体培养基平板，直至双层平板上的噬菌斑大小基本一致，呈圆形透明且边缘整齐，即可初步确认为蛭弧菌，并进行透射电镜观察及菌种鉴定；
将纯化得到的蛭弧菌进行鉴定，鉴定结果如下：
a、所筛选的蛭弧菌大小为0.82×0.43μm，杆状，端生鞭毛，鞭毛长度约为2.1μm；
b、噬菌斑的形态特征为：在DNB双层固体培养基平板30℃培养4天后，噬菌斑呈圆形，透明，凹陷，表面湿润，边缘整齐，直径2～3mm；
DNB双层固体培养基平板法分离结果图，如图1所示。
透射电镜观察结果图，如图2所示。
分子生物学鉴定结果：
接种平板噬菌斑摇床培养一瓶蛭弧菌菌液，先在6000rpm下离心10min，再将上清液在20000rpm下离心20min，用500μL的TE缓冲液富集沉淀，送于测序公司(上海生工生物工程有限公司)进行测序；其中，PCR扩增所用引物为：
63F：5'-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3'；
842R：5'-CGWCACTGAAGGGGTCAA-3'，其中，简并碱基W表示A/T；
PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃，变性1min；56℃，退火45s；72℃，延伸1min；35个循环；72℃，终延伸10min；本发明采用单克隆鉴定方法，经正向引物63F和反向引物842R扩增得到两条片段，DNAStar拼接两条序列，得到约800bp目的片段。
将16S rDNA基因测序结果序列通过NCBI BLAST在GenBank数据库中进行同源比对分析鉴定，RDP classifier搜索分类为蛭弧菌，进一步NCBI BLAST分析发现，该蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)和它们与最近的亲缘关系-Bdellovibrio sp.BDH12和Bdellovibrionales bacterium BDHSH06有99％的相似度，因此，菌株BDN-1鉴定为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)。
综上所述，本发明分离纯化得到的蛭弧菌命名为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDN-1，其保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2017年11月27日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCCNO：60291。
所述的蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDN-1的16S rDNA的序列如SEQ ID NO：3所示(758bp)。
实施例2 氨苄青霉素对蛭弧菌BDN-1蛭质体的促培养作用
(1)宿主培养：取新培养的宿主菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis GIM1.136)，在无菌操作台中酒精灯外焰下烧好瓶口，吸取3mL宿主菌种子液转入250mL瓶装NB液体培养基中，将接种好的宿主菌放在31℃左右的恒温摇床中培养约15h后，放入冷冻离心机中在6000rpm转速、4℃下离心10min，然后弃上清液，每管加入1mL 15‰盐度的无菌蒸馏水，打散混合均匀后移入一个离心管中，得到宿主菌浓缩液，套袋，放入4℃冰箱保存备用；
(2)BDN-1种子液培养：挑取分离的平板上较圆的噬菌斑若干个，接入50mL DNB液体培养基中，再加入250μL浓度为1mol/L的MSG(谷氨酸钠)，再加入1mL的宿主菌浓缩液，之后在31℃下摇床培养至第三天后作为BDN-1种子液。
(3)氨苄青霉素组接种及培养：取步骤(2)中的BDN-1种子液，接种1mL BDN-1种子液到四瓶50mL DNB液体培养基中，再加入250μL浓度为1mol/L的MSG，再加入1mL的宿主菌浓缩液，之后在31℃下摇床培养至48h，补加500μL宿主菌浓缩液，培养至72h后再次补加1mL宿主菌浓缩液，并接入用0.22μm滤膜过滤除菌的氨苄青霉素，使其终浓度分别为50μg/mL、100μg/mL和150μg/mL，剩余一组为对照组，不加入氨苄青霉素；接好后，继续摇床培养24h，便于蛭质体形成。
(4)蛭质体的分离及倒双层：所有的培养液先6000rpm离心，使蛭质体沉淀，弃上清液，用1mL 15‰盐度的无菌蒸馏水悬浮蛭质体沉淀，然后分别取500μL稀释为10-1、10-2和10-3梯度的蛭质体悬浮液倒DNB双层固体培养基平板，置于30℃培养箱中静置培养；
(5)结果观察：每隔12h观察一次平板，看所有平板的蛭弧菌的出斑情况，待出斑后，计噬菌斑个数并计算出各相应浓度(见图3)。
结果与对照组相比，氨苄青霉素浓度为50μg/mL组、100μg/mL组和150μg/mL组分别增加了65％、77％和81％。随着氨苄青霉素浓度的增加，蛭弧菌蛭质体密度越高。
实施例3 钙离子对蛭弧菌BDN-1蛭质体的促培养作用
(1)接种宿主并培养：同实施例2步骤(1)；
(2)BDN-1种子液培养：同实施例2步骤(2)；
(3)钙离子组接种及培养：同实施例2步骤(3)，将因素变量换为终浓度为4mM、20mM和40mM的氯化钙；
(4)蛭质体的分离及倒双层：同实施例2步骤(4)；
(5)结果观察：同实施例2步骤(5)(见图4)。
结果与对照组相比，钙离子浓度为4mM、20mM和40mM分别减少了91％、93％和99％。随着钙离子的增加，蛭弧菌蛭质体密度越低。
实施例4 镁离子对蛭弧菌BDN-1蛭质体的促培养作用
(1)接种宿主并培养：同实施例2步骤(1)；
(2)BDN-1种子液培养：同实施例2步骤(2)；
(3)镁离子组接种及培养：同实施例2步骤(3)，将因素变量换为终浓度为2mM、10mM和20mM的硫酸镁；
(4)蛭质体的分离及倒双层：同实施例2步骤(4)；
(5)结果观察：同实施例2步骤(5)(见图5)。
结果与对照组相比，镁离子浓度为2mM组、10mM组和20mM组分别减少了13％、51％和95％。随着镁离子浓度的增加，蛭弧菌蛭质体密度越低。
实施例5 钙镁离子组合对蛭弧菌BDN-1蛭质体的促培养作用
(1)接种宿主并培养：同实施例2步骤(1)；
(2)BDN-1种子液培养：同实施例2步骤(2)；
(3)钙镁离子组合组接种及培养：同实施例2步骤(3)，将因素变量换为终浓度为4/2mM、20/10mM和40/20mM的钙/镁组合；
(4)蛭质体的分离及倒双层：同实施例2步骤(4)；
(5)结果观察：同实施例2步骤(5)(见图6)。
结果与对照组相比，钙/镁离子浓度为4/2mM组、20/10mM组和40/20mM组分别增加了89％、92％和54％。随着钙镁离子组合浓度的增加，蛭弧菌蛭质体密度先增后减。
通过上述实施例发现，钙镁离子组合作用效果最佳，且前期有研究发现氨苄青霉素的促培养效果也很好，因此将钙镁离子与氨苄青霉素结合来讨论高密度蛭质体的裂解能力和保质期。
实施例6 蛭弧菌BDN-1蛭质体的广裂解谱性质的应用
(1)26株指示菌的制备：26株指示菌(表1)单菌落接种营养肉汤液体培养基中，37℃，200r/min培养8h，调节其浓度至1×106CFU/mL，4℃保存，备用；
表1 26株不同的实验指示菌株
(2)蛭弧菌蛭质体的制备：按照蛭弧菌BDN-1：宿主菌浓缩液：DNB液体培养基的体积比1:1:50的比例进行混合，加入250μL浓度为1mol/L的MSG使MSG终浓度为5mmol/L)，恒温培养，每48h添加一次宿主浓缩液，培养72h后，加入最佳浓度的促培养因子氨苄青霉素、氨苄青霉素与钙镁离子，并再添加一次宿主菌浓缩液，继续培养24h，得到培养液；将培养液6000rpm、4℃离心10min，弃上清液，取沉淀，使用质量体积比(g/mL)15‰盐度的灭菌蒸馏水吸打悬浮，调整其浓度，最终蛭弧菌蛭质体的终浓度分别为2.5×1011PFU/mL、9.6×1011PFU/mL，4℃保存。此浓缩后的蛭弧菌蛭质体即为后续进行加速试验所用。
(3)(蛭质体)裂解实验：取步骤(1)制备得到的指示菌和蛭质体各500μL一同与3mLDNB上层培养基混合振荡均匀，平铺于DNB下层培养基上，待DNB上层培养基凝结后，在30℃静置培养3天。
实验采用该株蛭弧菌混合体(既含有蛭质体又含有游泳体)菌液作为对照，以便检验蛭质体相对于混合体的裂解能力是否会出现减弱的可能性。蛭质体裂解实验结果如表2所示，26株不同来源的致病菌作为本实验的指示菌。
对照组：蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDN-1混合体对26株指示菌的裂解率达73％。且对26株受试菌株中，该株BDN-1对溶藻弧菌(V.alginolyticus)的裂解率为75％，对副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的裂解率为67％。
氨苄青霉素组：蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDN-1蛭质体相较于混合体裂解能力有所提高，对26株指示菌的裂解率达85％，并未影响其裂解能力。且对26株受试菌株中，该株BDN-1对溶藻弧菌(V.alginolyticus)的裂解率为87％，对副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的裂解率为100％。
氨苄青霉素与钙镁离子组：蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDN-1蛭质体与氨苄青霉素组裂解能力保持一致，对26株指示菌的裂解率达85％。对26株受试菌株中，该株BDN-1对溶藻弧菌(V.alginolyticus)的裂解率为87％，对副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的裂解率为100％。
表2 蛭质体BDN-1蛭质体对26株不同来源致病指示菌裂解情况
注：+表示该蛭弧菌蛭质体能够裂解对应菌株
实施例7 蛭弧菌BDN-1蛭质体保存的保质期研究
(1)蛭弧菌蛭质体的制备：见实施例6中步骤(2)；对照组不添加任何促培养因子。
(2)将制备好的蛭弧菌蛭质体置于梯度温度下进行加速试验；
(3)定期取样，检测对照组和添加氨苄青霉素组、氨苄青霉素与钙镁离子组的蛭弧菌蛭质体的浓度；
(4)运用阿伦尼乌斯方程及步骤(3)记录的数据计算出该微生物制剂保质期，通过比对保质期来确定添加促培养因子氨苄青霉素、氨苄青霉素与钙镁离子后，保质期是否变长。
步骤(2)中所述的梯度温度优选为25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃、95℃；
步骤(2)中所述的加速试验是加速时间的长短随温度的升高而递减；
步骤(2)中所述的定期取样的检测间隔时间优选如表3所示。
表3 不同的温度下取样检测间隔时间及取样次数
温度 持续时间/取样间隔时间 总共取样次数
25℃ 0～72h/12h 6
37℃ 0～48h/8h 6
45℃ 0～24h/4h 6
55℃ 0～8h/40min 12
65℃ 0～2h/20min 6
75℃ 0～1h/10min 6
85℃ 0～30min/5min 6
95℃ 0～10min/1min 10
步骤(3)中所述的对照组和氨苄青霉素组、氨苄青霉素与钙镁离子组中蛭弧菌的浓度优选通过DNB双层固体培养基平板检测法进行检测；
步骤(4)中所述的阿伦尼乌斯方程为：阿伦尼乌斯方程(Arrhenius formula)的指数定律k＝Ae-E/RT，其对数形式为：lgk＝-E/2.303RT+lgA；
其中k为失活速度常数，E为表观活化能，R为摩尔气体常数，T为热力学温度，A为频率因子；以混合液中蛭弧菌的初始浓度为C0，所测的蛭弧菌浓度为C，求出各温度下保存不同时间后的相对活性(Cr＝C/C0)；以lgCr对时间(t)进行回归分析，得出各温度下蛭弧菌的失活速度常数(k)，将lgk对1/T×103进行回归分析，得阿伦尼乌斯方程；此后，求出该种蛭弧菌混合液和蛭质体在不同温度(4℃和10℃)下浓度降为原始浓度的1％时的保质期(见表4及图7、8)。
表4 不同温度下普通组和高密度蛭质体组的保质期
不同处理方式的蛭弧菌 4℃下保质期/d 10℃下保质期/d
对照组 49.537 21.682
氨苄青霉素组 62.758 29.786
氨苄青霉素与钙镁离子组 66.327 31.985
所述的蛭弧菌优选为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDN-1，通过使用研究保质期的经典恒温加速试验，对蛭弧菌BDN-1的高密度蛭质体组和对照组进行保质期研究，以确定该菌株蛭质体相较于对照组保质期有所延长，实现了通过该方法达到提高蛭弧菌BDN-1保质期的目的。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一株海洋蛭弧菌及在氨苄青霉素下促进蛭质体形成的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 63F
<400> 1
caggcctaac acatgcaagt c 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 842R
<400> 2
cgwcactgaa ggggtcaa 18
<210> 3
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 蛭弧菌（Bdellovibrio sp.）BDN-1的16S rDNA的序列
<400> 3
gtggcgcacg ggtgagtaac gcgtaggtga cgtgcctttt agtgggggac aacatcgtga 60
aaacggtgct aataccgcat aagttaagcg acattgaaaa agcttaagaa agtgggcttc 120
ggctcacgct gaaagatcgg cctgcgtatc attagcttgt tggtggggta acggcctacc 180
atggctacga tgattaactg gtctgagagg atgatcagtc acactggaac tgagacacgg 240
tccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatattgcgc aatgggggaa accctgacgc 300
agcaatgcca cgtgagtgag gaaggccctt gggttgtaaa gctctgtcct atgggaagaa 360
ctgcattacg gttaataccc gtagtgtttg acggtaccat agaagaaagc accggctaac 420
tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gtgcaagcgt tgttcggatt tactgggcgt 480
aaagcgcgcg caggcggatt ggcaagtcag atgtgaaatc tcggggctca accccgaaac 540
tgcgtctgaa actatcagtc tagagtctca tagggggcag gggaatttca cgtgtagggg 600
taaaatccgt agagatgtga aggaacaccc gtggcgaagg cgcctgcctg gatgagcact 660
gacgctgagg cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattat ataccctggt actccacgcc 720
gtaaacgatg agtactagcc cttggaggta ttgacccc 758

Claims (10)

1.一株具有广裂解谱的海洋蛭弧菌，其特征在于该菌株名称为蛭弧菌(Bdellovibriosp.)BDN-1，于2017年11月27日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO：60291。
2.权利要求1的具有广裂解谱的海洋蛭弧菌在抑制会引发水产养殖生物病害的致病菌中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述的致病菌包括溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)、气味沙雷菌(Serratiaficaria)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、雷氏普罗威登斯菌(Providenciarettgeri)。
4.氨苄青霉素或氨苄青霉素与钙镁离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
氨苄青霉素或氨苄青霉素与钙镁离子在延长海洋蛭弧菌蛭质体的保质期中的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：
所述的氨苄青霉素的使用终浓度为50～150μg/mL。
7.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：
所述的钙镁离子的摩尔比为2：1。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述的氨苄青霉素与钙镁离子的使用终浓度分别为50～150μg/mL、(4～40)/(2～20)mM。
9.一种海洋蛭弧菌蛭质体微生物制剂，其特征在于通过以下方法制备得到：在含有宿主菌的DNB液体培养基中接入蛭弧菌，于25～35℃、150～300rpm培养36～48h，再次添加宿主菌，并加入氨苄青霉素或氨苄青霉素与钙镁离子，继续培养20～28h，培养液经4℃、6000～8000rpm离心10～15min后，去除含蛭弧菌游泳体的上清液，沉淀使用质量体积比10～25‰盐度的灭菌蒸馏水吸打悬浮，调整其浓度至1011PFU/mL，即是海洋蛭弧菌蛭质体微生物制剂。
10.根据权利要求9所述的海洋蛭弧菌蛭质体微生物制剂，其特征在于：
所述的蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDN-1。
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