CN105007935A - 用于保护免于白喉和/或破伤风的缀合物 - Google Patents

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Abstract

使用白喉类毒素或破伤风类毒素作为载体蛋白的糖缀合物疫苗可以赋予针对白喉毒素或破伤风毒素的致死攻击的保护。因此，除了保护免受其糖类已经连接至载体的细菌影响以外，此类缀合物疫苗也可以用于保护免于白喉和破伤风，所以当前复杂组合疫苗的白喉类毒素和破伤风类毒素组分可以是多余的。因此，可以降低这些疫苗的抗原复杂性，而不降低其保护宽度，并且去除这些多余组分在疫苗中产生空间用于添加免疫原用于保护免受进一步病原体的影响。用CRM197载体看不到相同的效果，但该观察使得该载体对于与含有Dt和Tt的婴儿组合疫苗伴随给予的缀合物疫苗更有吸引力。

Description

用于保护免于白喉和/或破伤风的缀合物
本申请要求美国临时申请61/738,958(2012年12月18日提交)的权益，其完整内容出于所有目的由此通过引用并入本文。
技术领域
本发明是在免疫领域中，特别是使用缀合物疫苗。
背景技术
在单一剂量中含有来自多于一种病原生物体的抗原的疫苗被称为“组合”疫苗。已经证明各种组合疫苗（包括用于保护免于白喉、破伤风和百日咳的早期三价疫苗(“DTP”疫苗)）。当前可用的最复杂的多病原体疫苗是6价的，并且包括白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、乙型肝炎和Hib的抗原(D-T-aP-IPV-HBV-Hib)。这些疫苗已经是非常复杂的，并且获得具有进一步抗原的疫苗的批准不是简单的。
6价疫苗包括缀合至破伤风类毒素载体蛋白的Hib糖。针对其他病原体的已知缀合物疫苗包括分别针对脑膜炎球菌和肺炎球菌的MENVEO™和PREVNAR™产品。接受缀合物疫苗后，已知不仅针对糖、而且针对载体蛋白产生抗体。典型的载体蛋白包括白喉和破伤风类毒素。这些本身是保护性抗原，但参考文献1报道，这些类毒素的缀合物“不足以诱导关于载体的完全免疫”。为什么缀合去除类毒素的保护效力的可能解释可以是糖的共价偶联破坏或掩盖保护性表位(线性或构象的)，或者缀合降低载体蛋白的柔性。
尽管缀合引起保护效力的这种总体损失，但参考文献1报道，破伤风或白喉类毒素甚至在肺炎链球菌糖的缀合之后可以保留其保护作用。作者没有将该发现外推至任何其他糖类，但的确预期，可以用CRM197看到相同结果(参见参考文献1中的[0041])，所述CRM197是白喉毒素的无毒突变体。CRM197是疫苗糖缀合物中的另一种众所周知的载体蛋白，并且它与白喉毒素的不同在于单个氨基酸突变。
参考文献2报道了使用破伤风类毒素的4价脑膜炎球菌缀合物疫苗(现批准为NIMENRIX™产品)的研究。作者报道，100％的疫苗受体产生抗破伤风抗体，但这些患者已经接受包括破伤风类毒素的常规儿科疫苗，并且在接受4价脑膜炎球菌疫苗之前具有抗破伤风抗体的患者的比率已经大于90％。因此，参考文献2没有给出任何关于缀合物疫苗是否可以在未引发的幼稚的婴儿(un-primed naïve infants)中诱导显著的抗破伤风免疫应答的信息。此外，参考文献2使用无法揭示那些抗体是否具有保护作用的ELISA测试检测抗破伤风抗体。用于测量此类抗体的其他测试(例如，用于测定MENACTRA™产品引发的抗白喉抗体的中和作用的CHO中和测定)也没有揭示抗体是否在体内具有保护作用。
也已经以这种方式研究CRM197。参考文献3显示CRM197在人中是免疫原性的，但，再次，在先前已经接受白喉类毒素疫苗，而不是在幼稚的(naïve)患者中，测量到免疫应答，并且所述免疫应答通过体外测定(ELISA)、而不是功能测定测定到。
尽管白喉和破伤风类毒素在缀合至细菌糖类后保留至少一些免疫原性，但因此不清楚它们是否保留它们的保护效力。因此，疫苗诸如NIMENRIX™或MENACTRA™是否可以在免疫幼稚受试者中引发保护性抗破伤风或抗白喉免疫是未知的。类似地，缀合的CRM197，如MENVEO™和PREVNAR™产品中所使用，是否可以在这些受试者中引发保护性抗白喉免疫是不清楚的。
发明概述
本发明人已经显示使用白喉类毒素或破伤风类毒素作为载体蛋白(诸如MENACTRA™和MENITORIX™产品)、但不含有类毒素作为单独抗原的现有糖缀合物疫苗可以赋予针对白喉毒素或破伤风毒素的致死攻击的保护。因此，除了保护免受其糖类已经连接至载体的细菌影响以外，此类缀合物疫苗也可以用于保护免于白喉和破伤风。这意味着，当前复杂组合疫苗的白喉和破伤风类毒素组分可以是多余的。因此，可以降低这些疫苗的抗原复杂性，而不降低其保护宽度。此外，去除这些多余组分在疫苗中产生空间用于添加免疫原用于保护免受进一步病原体的影响。例如，现有的六价疫苗D-T-P-HBV-IPV-Hib可以(a)通过去除未缀合的T组分和依赖于Hib缀合物中的T载体而简化，(b)通过用具有T载体的MenC缀合物替代未缀合的T组分而扩展，而不增加抗原复杂性，和/或(c)通过用MenACWY-D缀合物替代未缀合的D组分和在Hib缀合物中的T载体代替未缀合的T而大大扩展，而不相应增加抗原复杂性。
因此，本发明的第一个方面提供了用于针对多种病原体免疫婴儿的方法，其包括用(a)含有未缀合的白喉类毒素、但不含有未缀合的破伤风类毒素的疫苗；和(b)含有缀合至破伤风类毒素载体的糖的疫苗共同免疫婴儿的步骤。
本发明的第二个方面提供了用于针对多种病原体免疫婴儿的方法，其包括用(a)含有未缀合的破伤风类毒素、但不含有未缀合的白喉类毒素的疫苗；和(b)含有缀合至白喉类毒素载体的糖的疫苗共同免疫婴儿的步骤。
本发明的第三个方面提供了用于针对多种病原体免疫婴儿的方法，其包括用(a)不含未缀合的破伤风类毒素且不含未缀合的白喉类毒素的疫苗；(b)含有缀合至白喉类毒素载体的糖的疫苗；和(c)含有缀合至白喉类毒素载体的糖的疫苗共同免疫婴儿的步骤。
本发明的第四个方面提供了包含未缀合的白喉类毒素和缀合至破伤风类毒素载体的糖、但不含未缀合的破伤风类毒素的组合疫苗。
本发明的第五个方面提供了包含未缀合的破伤风类毒素和缀合至白喉类毒素载体的糖、但不含未缀合的白喉类毒素的组合疫苗。
本发明的第六个方面提供了包含缀合至破伤风类毒素载体的糖和缀合至白喉类毒素载体的糖、但不含未缀合的破伤风类毒素且不含未缀合的白喉类毒素的组合疫苗。
本发明的第七个方面提供了包含至少两种试剂盒组分的试剂盒，所述试剂盒组分，当混合时，导致第三至第六个方面的组合疫苗。
本发明的第八个方面提供了用于针对脑膜炎球菌疾病和破伤风免疫婴儿的方法，其包括施用含有缀合至破伤风类毒素载体的脑膜炎球菌荚膜糖的疫苗而不施用未缀合的破伤风类毒素的步骤。
本发明的第九个方面提供了用于针对脑膜炎球菌疾病和白喉免疫婴儿的方法，其包括施用含有缀合至白喉类毒素载体的脑膜炎球菌荚膜糖的疫苗而不施用未缀合的白喉类毒素的步骤。
尽管白喉和破伤风缀合物可以赋予针对白喉毒素或破伤风毒素的致死攻击的保护，但本发明人已经显示，用CRM197载体(其与白喉毒素的不同在于单个氨基酸突变)没有看到相同的效果。因此，基于CRM197的缀合物不能以上面讨论的方式使用，但本发明人的发现具有不同的影响。由于在缀合物疫苗的背景下CRM197是比Dt更弱的白喉免疫原，所以当缀合物疫苗与当前婴儿组合疫苗(其含有Dt和Tt)同时给予时，它作为载体是更有吸引力的，因为对于载体蛋白诱导的负面干扰，它们可以提供更低的潜能。因此，本发明的第十个方面提供了用于针对多种病原体免疫婴儿的方法，其包括用(a)含有白喉类毒素和破伤风类毒素的疫苗；和(b1)含有缀合至CRM197载体的脑膜炎球菌荚膜糖的疫苗；(b2)含有缀合至CRM197载体的肺炎球菌荚膜糖的疫苗；(b3)含有缀合至CRM197载体的脑膜炎球菌荚膜糖的第一疫苗和含有缀合至CRM197载体的肺炎球菌荚膜糖的第二疫苗；或(b4)含有各自缀合至CRM197载体的肺炎球菌和脑膜炎球菌荚膜糖的疫苗中的一种共同免疫婴儿的步骤。
婴儿
本发明用于免疫婴儿，即从出生直至12个月龄，例如0-9个月或0-6个月的人。因此，例如，婴儿可以是2个月龄、3个月龄、4个月龄、5个月龄或6个月龄。
本发明联合婴儿的针对白喉和破伤风的初次免疫(这通常发生在2个月龄)是特别有用的。因此，婴儿在免疫时对于破伤风类毒素(Tt)和/或白喉类毒素(Dt)是理想地免疫上幼稚的(immunologically naïve)。
共同免疫
当本发明是指共同免疫时，枚举列表中的不同疫苗可以单独或作为组合施用。
其中单独施用疫苗时，它们通常将在不同部位施用，例如一次疫苗施用于左上臂，且第二次疫苗施用于右上臂。因此，两次疫苗可以对侧(例如双臂或双腿或对侧臂和腿)或同侧(例如身体的同侧的臂和腿)施用。虽然分开施用疫苗，但它们在基本上同时(例如，相同的医疗咨询或访问健康护理专业人员或接种中心过程中)，诸如在彼此的1小时内施用。
不是分开共同免疫，然而，优选作为组合施用。因此，优选的共同免疫使用组合疫苗，即，其中混合不同的免疫原的单一组合物。组合疫苗为患者提供接受减少注射次数的优点，从而可以导致顺应性提高(例如参见参考文献4的第29章)的临床优点，特别是在儿科患者中。在本发明的第一个方面，例如，婴儿优选接受单一组合物，其包括未缀合的Dt和缀合至Tt载体的糖。
缀合和未缀合的类毒素载体
当类毒素是缀合的类毒素时，其共价连接(直接或经由接头)至另一部分，其通常将是糖抗原(例如，细菌荚膜糖)。
本发明的第一至第九个方面是指包括或施用(或不包括/施用)“未缀合的”Dt和/或Tt的疫苗。该术语意指类毒素没有缀合至另一个抗原，例如缀合至糖抗原。因此，例如，“未缀合的”Tt将排除缀合的PRP-T或NIMENRIX™产品中存在的Tt，并且“未缀合的”Dt将排除缀合的PRP-D或MENACTRA™产品中存在的Dt。
当疫苗被定义为含有特定未缀合的类毒素时，它也可以(除非明确指明)包括缀合形式的相同类毒素，例如包括未缀合的Tt的疫苗可以包括Tt和PRP-T两者。相反，当疫苗被定义为不含(或被定义为不含有)特定未缀合的类毒素时，它可以(并且通常将)包括缀合形式的类毒素，例如不含未缀合的Tt的疫苗可以仍然包括Hib-T。
关于类毒素的术语“未缀合的”不是指用于制备缀合物、但无论什么原因已经保持作为未反应的残余类毒素或已经变得去缀合的类毒素。因此，例如，是涉及类毒素的缀合反应，并且糖是不完全的，然后可以保留小残余量的未反应的类毒素(甚至纯化之后)，并且如果缀合物然后与其他组分混合，这将被完成为组合物。类似地，如果缀合物被储存长时间段或储存在恶劣条件下，可以发生分解，使得发生去缀合。当组合物据称不含未缀合的类毒素时，它仍然可以包括缀合后残余类毒素或去缀合类毒素(如果这存在于当制备组合物时使用的缀合的类毒素组分中)。技术人员可以认识到有目的存在的未缀合的类毒素和相反作为残余污染物或作为分解产物存在的类毒素之间的差异，当组合物确实不含未缀合的毒素时，这将是容易理解的。例如，本发明涉及人疫苗，其是通过良好定义的方法制备的紧密调节的产品，并且制备含有缀合的类毒素、但不含未缀合形式的该类毒素的组合物的技术人员将不使用其中该类毒素从未经受缀合反应的组分；相反​​，制备含有未缀合的类毒素的组合物的技术人员将不使用先前经历缀合反应的类毒素。因此，当疫苗被定义为不含有未缀合的类毒素时，该类毒素的任何缀合后残余形式或去缀合形式将占疫苗中该类毒素的总量的<10重量%(例如，<5%、<2%或<1%)。
当疫苗意欲保护免于破伤风时，它将包括足够的免疫原性破伤风类毒素以满足欧洲药典对于破伤风接种的要求(保护小鼠免于破伤风毒素的致死攻击)。类似地，当疫苗意欲保护免于白喉时，它将包括足够的免疫原性白喉类毒素以满足欧洲药典对于白喉接种的要求(保护豚鼠免于白喉毒素的致死攻击)。
具有未缀合的白喉类毒素、但没有未缀合的破伤风类毒素的疫苗
本发明的第一个方面用(a)含有未缀合的Dt、但不含有未缀合的Tt的疫苗；和(b)含有缀合至Tt载体的糖的疫苗共同免疫。当用(a)和(b)的共同免疫作为组合疫苗发生时，这得到本发明的第四个方面。
因此，这些疫苗不使用未缀合的Tt制备，并且为了保护免于破伤风，它们反而包括缀合至Tt载体的糖。此类与Tt载体缀合的糖包括但不限于：脑膜炎球菌糖，诸如NEISVAC-C™、MENHIBRIX™、MENITORIX™或NIMENRIX™产品中任一种中存在的缀合物；肺炎球菌糖，诸如SYNFLORIX™产品中存在的血清型18C缀合物；流感嗜血杆菌B型糖，诸如HIBTITER™、MENHIBRIX™、MENITORIX™或HIBERIX™产品中任一种中存在的缀合物。
因此，本发明可以使用以下糖类中的一种或多种，其缀合至Tt载体：脑膜炎球菌血清群A荚膜糖；脑膜炎球菌血清群C荚膜糖；脑膜炎球菌血清群W135荚膜糖；脑膜炎球菌血清群X荚膜糖；脑膜炎球菌血清群Y荚膜糖；肺炎球菌血清型18C荚膜糖；肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)血清变型Typhi (S.Typhi)毒力荚膜多糖(‘Vi’)；和/或流感嗜血杆菌B型荚膜糖。
此外，疫苗可包括进一步的糖，其缀合至非Tt载体，例如SYNFLORIX™产品中存在的其他10种缀合物中的任一种。如果疫苗不包括来自脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y的Tt-缀合的荚膜糖，它可包括这些作为如MENVEO™产品中的CRM197-缀合的糖类，或作为如MENACTRA™产品中的Dt-缀合的糖类。如果疫苗不包括来自肺炎球菌的Tt-缀合的荚膜糖类，它可包括这些作为来自PREVNAR™或PREVNAR13™产品中的CRM197-缀合的糖类。如果疫苗不包括来自S.Typhi的Tt-缀合的Vi荚膜糖类，它可包括这作为Dt-缀合的或CRM197-缀合的糖[5, 6]。
可用于在本发明的第一个方面内共同免疫婴儿和本发明的第四个方面的组合疫苗的疫苗(a)和(b)的具体实例包括但不限于：
。
第四个方面的六种特别优选的组合疫苗是：(a) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt；(b) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenC-Tt；(c) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenC-CRM197；(d) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenACWY-CRM197；(e) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenACWY-Dt；(f) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenACWY-Tt；(g) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenX-Tt；和(h) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenX-CRM197。
本发明的第八个方面提供了用于针对脑膜炎球菌疾病和破伤风免疫婴儿的方法，其包括施用含有缀合至破伤风类毒素载体的脑膜炎球菌荚膜糖的疫苗而不施用未缀合形式的破伤风类毒素的步骤。因此，所述缀合物用于针对脑膜炎球菌和破伤风两者的免疫，而无需分别需要类毒素作为未缀合的免疫原。除了缀合物以外，与第八个方面使用的疫苗可包括如此处详述的进一步抗原用于本发明的第一个方面。因此，疫苗可以保护免于不仅仅脑膜炎球菌和破伤风。
具有未缀合的破伤风类毒素、但没有未缀合的白喉类毒素的疫苗
本发明的第二个方面用(a)含有未缀合的Tt、但不含有未缀合的Dt的疫苗；和(b)含有缀合至Dt载体的糖的疫苗共同免疫。当用(a)和(b)的共同免疫作为组合疫苗发生时，这得到本发明的第五个方面。
因此，这些疫苗不使用未缀合的Dt制备，并且为了保护免于白喉，它们反而包括缀合至Dt载体的糖。此类与Dt载体缀合的糖包括但不限于：脑膜炎球菌糖，诸如MENACTRA™产品中存在的缀合物；肺炎球菌糖，诸如SYNFLORIX™产品中存在的血清型19F缀合物；流感嗜血杆菌B型糖，诸如PROHIBIT™产品中存在的缀合物。
因此，本发明可以使用以下糖类中的一种或多种，其缀合至Dt载体：脑膜炎球菌血清群A荚膜糖；脑膜炎球菌血清群C荚膜糖；脑膜炎球菌血清群W135荚膜糖；脑膜炎球菌血清群X荚膜糖；脑膜炎球菌血清群Y荚膜糖；肺炎球菌血清型19F荚膜糖；Vi糖；和/或流感嗜血杆菌B型荚膜糖。
此外，疫苗可包括进一步的糖，其缀合至非Dt载体，例如SYNFLORIX™产品中存在的其他10种缀合物中的任一种。如果疫苗不包括来自脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y的Dt-缀合的荚膜糖，它可包括这些作为如MENVEO™产品中的CRM197-缀合的糖类，或作为如NIMENRIX™产品中的Tt-缀合的糖类。如果疫苗不包括来自肺炎球菌的Dt-缀合的荚膜糖类，它可包括这些作为来自PREVNAR™或PREVNAR13™产品中的CRM197-缀合的糖类。如果疫苗不包括来自S.Typhi的Dt-缀合的Vi荚膜糖类，它可包括这作为Tt-缀合的或CRM197-缀合的糖。
可用于在本发明的第二个方面内共同免疫婴儿和本发明的第五个方面的组合疫苗的疫苗(a)和(b)的具体实例包括但不限于：
。
第五个方面的三种特别优选的组合疫苗是：(a) Tt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Dt、MenC-CRM197；(b) Tt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenACWY-Dt；(c) Tt、aP、HBsAg、IPV、Hib-CRM197、MenACWY-Dt。
本发明的第九个方面提供了用于针对脑膜炎球菌疾病和白喉免疫婴儿的方法，其包括施用含有缀合至白喉类毒素载体的脑膜炎球菌荚膜糖的疫苗而不施用未缀合形式的白喉类毒素的步骤。因此，所述缀合物用于针对脑膜炎球菌和白喉两者的免疫，而无需分别需要类毒素作为未缀合的免疫原。除了缀合物以外，与第九个方面使用的疫苗可包括如此处详述的进一步抗原用于本发明的第二个方面。因此，疫苗可以保护免于不仅仅脑膜炎球菌和白喉。
不具有未缀合的破伤风类毒素或白喉类毒素的疫苗
本发明的第三个方面用(a)不含未缀合的Tt和不含未缀合的Dt的疫苗；(b)含有缀合至Tt载体的糖的疫苗；和(c)含有缀合至Dt载体的糖的疫苗共同免疫。当用(a)、(b)和(c)的共同免疫作为组合疫苗发生时，这得到本发明的第六个方面。
因此，这些疫苗不使用未缀合的Tt或Dt制备，并且为了保护免于破伤风和白喉，它们反而包括缀合至Dt载体的糖和缀合至Dt载体的糖和。上面讨论含有此类糖缀合物的产品的实例。
因此，本发明可以使用以下糖类中的一种或多种，其缀合至Tt或Dt载体：脑膜炎球菌血清群A荚膜糖；脑膜炎球菌血清群C荚膜糖；脑膜炎球菌血清群W135荚膜糖；脑膜炎球菌血清群Y荚膜糖；肺炎球菌血清型18C荚膜糖；肺炎球菌血清型19F荚膜糖；和/或流感嗜血杆菌B型荚膜糖。
此外，疫苗可包括进一步的糖，其缀合至非Tt和非Dt载体，例如SYNFLORIX™产品内的其他8种肺炎球菌糖中的任一种（其缀合至蛋白D），PREVNAR™或PREVNAR13™产品内的CRM197-缀合的肺炎球菌糖中的任一种，和/或MENVEO™产品内的CRM197-缀合的脑膜炎球菌糖中的任一种。
可用于在本发明的第三个方面内共同免疫婴儿和本发明的第六个方面的组合疫苗的疫苗(a)至(c)的具体实例包括但不限于：
。
进一步的抗原
如上定义的本发明的组合物包括：(i)未缀合的白喉类毒素和缀合的破伤风类毒素；(ii)未缀合的破伤风类毒素和缀合的白喉类毒素；或(iii)缀合的白喉类毒素和缀合的破伤风类毒素。这些类毒素保护免于白喉和破伤风，并且还免受衍生任何缀合的糖类的病原体(例如，Hib、脑膜炎球菌血清群A/C/W135/Y、各种肺炎球菌血清型)的影响。除了这些白喉和破伤风类毒素(和缀合糖类)以外，所述疫苗将包括进一步免疫原用于保护免受进一步病原体的影响。因此，例如，所述疫苗可包括以下中的一种或多种：无细胞百日咳(aP)组分；乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)；灭活的脊髓灰质炎病毒(IPV)；狂犬病毒免疫原(例如，如参考文献7的第27章中描述)，这将通常是灭活的狂犬病毒病毒体；伤寒热组分，诸如Vi糖；和/或黄热病毒免疫原，诸如从细胞培养物，例如，从17D毒株制备的灭活病毒[8]。
本发明的优选组合疫苗可以保护免于：
● 白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎和Hib引起的疾病。
● 白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、乙型肝炎病毒和Hib引起的疾病。
● 白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、Hib引起的疾病、脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)血清群C引起的疾病。
● 白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、乙型肝炎病毒、Hib引起的疾病、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C引起的疾病。
● 白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、Hib引起的疾病、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y引起的疾病。
● 白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、乙型肝炎病毒、Hib引起的疾病、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y引起的疾病。
● 白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、乙型肝炎病毒和Hib引起的疾病、肺炎链球菌(S.pneumoniae)(至少血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F；还优选1、5和7F；并且还更优选3、6A和19A)引起的疾病。
● 白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、Hib引起的疾病、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C引起的疾病、肺炎链球菌(至少血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F；还优选1、5和7F；并且还更优选3、6A和19A)引起的疾病。
● 白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、乙型肝炎病毒、Hib引起的疾病、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C引起的疾病、肺炎链球菌(至少血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F；还优选1、5和7F；并且还更优选3、6A和19A)引起的疾病。
● 白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、Hib引起的疾病、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y引起的疾病、肺炎链球菌(至少血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F；还优选1、5和7F；并且还更优选3、6A和19A)引起的疾病。
● 白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、乙型肝炎病毒、Hib引起的疾病、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y引起的疾病、肺炎链球菌(至少血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F；还优选1、5和7F；并且还更优选3、6A和19A)引起的疾病。
这些疫苗的免疫原性组分可以限于用于保护免受上面列出的病原体的那些，或者所述疫苗可以包括针对进一步病原体的进一步免疫原。
这些疫苗还可以结合轮状病毒疫苗、流感病毒疫苗、蜱传脑炎疫苗、狂犬病疫苗、黄热病疫苗、伤寒热疫苗、MenX疫苗等给予。
对于疫苗中以缀合形式存在的任何给定的糖，优选包括仅连接至一种载体的糖，例如，如果包括MenA(即，脑膜炎奈瑟氏球菌的血清群A)糖，则这将作为MenA-CRM197、MenA-Dt或MenA-Tt中的仅一种存在。总体而言，然而，如果疫苗包括多种不同的糖类作为缀合物，则这些可以连接至一种类型的载体(例如，Dt或Tt)，或多种一种类型(例如，Dt和/或Tt；和任选地CRM)。
试剂盒
本发明的第七个方面提供了试剂盒，其包含的试剂盒组分可以混合，以得到本发明的组合疫苗。
因此，尽管疫苗可以作为组合施用于患者，它不需要作为组合分布或储存。例如，尽管全液体疫苗是已知的(即，其中所有抗原组分是在水溶液或悬浮液中)，还已知分开免疫原，使得它们可以在用于施用的时间/点临时混合。此类实施方案包括液体/液体混合和液体/固体混合，例如通过混合含水材料与冻干物质。例如，在一个实施方案中，疫苗可以通过混合以下制备：(a)包含含水抗原的第一组分；和(b)包含冻干抗原的第二组分。当使用冻干试剂盒组分时，这经常含有缀合的抗原。例如，试剂盒可具有(a)包括Dt + aP + HBsAg + IPV的液体组分；和(b)包括Hib-Tt + MenC-Tt + MenY-Tt的冻干组分。
两种组分优选在分开容器(例如，小瓶和/或注射器)中，并且本发明提供了包含这些组分(a)和(b)的试剂盒。
含有未缀合的白喉和破伤风类毒素两者的疫苗
与本发明的前九个方面相反，本发明的第十个方面使用含有未缀合的白喉类毒素和未缀合的破伤风类毒素的疫苗。婴儿用缀合至CRM197载体的脑膜炎球菌和/或肺炎球菌荚膜糖共同免疫。
当婴儿接受CRM197-缀合的脑膜炎球菌荚膜糖时，优选他们还不接受Dt-缀合的脑膜炎球菌荚膜糖或Tt-缀合的脑膜炎球菌荚膜糖。
当婴儿接受CRM197-缀合的肺炎球菌荚膜糖时，优选他们还不接受Dt-缀合的肺炎球菌荚膜糖或Tt-缀合的肺炎球菌荚膜糖。
当婴儿接受CRM197-缀合的脑膜炎球菌荚膜糖和CRM197-缀合的肺炎球菌荚膜糖两者时，优选他们还不接受以下中的任一种：Dt-缀合的脑膜炎球菌荚膜糖；Tt-缀合的脑膜炎球菌荚膜糖；Dt-缀合的肺炎球菌荚膜糖；和Tt-缀合的肺炎球菌荚膜糖。
含有Dt/Tt的疫苗可以，例如，市售儿科疫苗中任一种(例如，PEDIACEL™、PENTACEL™、INFANRIX™、PEDIARIX™、DAPTACEL™等)，或包括来自这些疫苗的免疫原的疫苗。因此，婴儿可以接受以下中的一种：(a) 包含Dt、Tt、百日咳类毒素、FHA、百日咳杆菌粘附素、百日咳菌毛类型2和3、IPV和Hib-Tt与磷酸铝佐剂的疫苗；(b) 包含Dt、Tt、百日咳类毒素、FHA和百日咳杆菌粘附素与氢氧化铝佐剂的疫苗；(c) 包含Dt、Tt、百日咳类毒素、FHA、百日咳杆菌粘附素、HBsAg和IPV与氢氧化铝和磷酸铝佐剂的疫苗；或(d) 包含Dt、Tt、百日咳类毒素、FHA、百日咳杆菌粘附素、百日咳菌毛类型2和3的疫苗。
疫苗应当包括相对于Tt过量的Dt(如以Lf单位测量)。过量理想地为至少1.5倍，例如2倍或2.5倍，但过量将通常不超过5倍。2.5:1比率是有用的，例如每2 Lf的Tt，5 Lf的Dt。
缀合的脑膜炎球菌/肺炎球菌疫苗可以是使用CRM197载体的任何市售疫苗，例如，MENVEO™、PREVNAR™、PREVNAR13™等。因此，婴儿可以接受(a) 包含CRM197-缀合的来自脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y中每种的寡糖的未佐剂化的疫苗；和/或(b1)包含CRM197-缀合的来自肺炎球菌血清型18C的寡糖和CRM197-缀合的来自肺炎球菌血清型4、6B、9V、14、19F和23F中每种的多糖与磷酸铝佐剂的疫苗或(b2)包含CRM197-缀合的来自肺炎球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F中每种的多糖与磷酸铝佐剂的疫苗中的一种。
制造方法
本发明还提供了用于制造本发明的疫苗的方法。这些方法涉及以期望比率组合相关组分(免疫原、佐剂、载体等)。在一些实施方案中，将单独添加免疫原，但在其他实施方案中，免疫原使用它们时可能已经呈混合形式(例如，方法可能使用已经包括混合的Dt和aP抗原的组分)。类似地，在一些实施方案中，免疫原可以在用于本发明的方法中之前预先吸附，但在其他实施方案中，它们可以以未吸附形式添加，并且可以随后吸附至混合物中的佐剂。
本发明的疫苗以整批制备，且然后细分(例如)为单位剂量。
通过该方法制备的疫苗可在患者中直接用作疫苗，或者可用作其他组合疫苗的组分。
佐剂
本发明的疫苗将通常包括佐剂。佐剂被包括在当前含有Dt-和Tt-的疫苗中，和肺炎球菌缀合物疫苗中，还有单价MenC缀合物疫苗中，但不包括在当前4价MenACWY缀合物疫苗中。
当包括佐剂时，这将通常包含(i)至少一种铝盐或(ii)油包水乳液。当疫苗包括铝盐佐剂时，则其优选还不包括水包油乳液佐剂。相反，当疫苗包括水包油乳液佐剂时，则其优选还不包括铝盐佐剂。
当疫苗包括铝盐佐剂时，疫苗中的一种至所有免疫原可以吸附至盐。
铝盐佐剂
本发明的疫苗可包括铝盐佐剂。目前使用的铝盐佐剂通常被称为“氢氧化铝”或“磷酸铝”佐剂。然而，这些是方便的名称，因为无一是存在的实际化合物的精确描述(例如，参见参考文献9的第9章，和参考文献10的第4章)。本发明可使用可用作佐剂的“氢氧化物”或“磷酸盐”中的任一者。
已知为“氢氧化铝”的佐剂通常是羟基氧化铝盐，其通常是至少部分结晶的。可通过式AlO(OH)代表的羟基氧化铝(Aluminium oxyhydroxide)可通过红外(IR)光谱学，特别是通过在1070cm– 1的吸附带和在3090–3100cm– 1的强肩部存在与其他铝化合物诸如氢氧化铝Al(OH)3进行区分(参考文献9的第9章)。氢氧化铝佐剂的结晶度通过在半高的衍射带的宽度(WHH)来反映，其中差结晶颗粒显示由于较小晶粒尺寸导致的较大线增宽。表面积随着WHH增加而增加，且具有较高WHH值的佐剂已被视为具有对于抗原吸附的较大能力。纤维状形态(例如，如透射电子显微照片所见)对于氢氧化铝佐剂是典型的，例如，具有直径约2nm的针样颗粒。氢氧化铝佐剂的PZC通常为约11，即佐剂本身在生理pH具有正表面电荷。对于氢氧化铝佐剂已经报道在pH7.4 1.8-2.6 mg蛋白/mg Al+++的吸附能力。
已知为“磷酸铝”的佐剂通常是羟基磷酸铝，经常还含有少量硫酸盐。它们可通过沉淀获得，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中的羟基的程度。羟基磷酸盐通常具有0.3至0.99的PO4/Al 摩尔比。羟基磷酸盐可通过羟基的存在与严格(strict)AlPO4区分开来。例如，在3164cm– 1(例如，当加热至200℃时)的IR谱带表明结构性羟基的存在(参考文献9的第9章)。
磷酸铝佐剂的PO4/Al3+摩尔比将通常为0.3至1.2，优选0.8至1.2，并且更优选0.95+0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其对于羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO4/Al摩尔比为0.84至0.92的无定形的羟基磷酸铝，其以0.6mg Al3+/ml包括。磷酸铝将通常是颗粒。在任何抗原吸附后，颗粒的典型直径是范围0.5-20μm(例如约5-10μm)。对于磷酸铝佐剂已经报道在pH7.4 0.7-1.5 mg蛋白/mg Al+++的吸附能力。
磷酸铝的PZC与磷酸根对羟基的取代程度逆相关，这种取代程度可取决于用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度而不同。也通过改变溶液中游离磷酸根离子(phosphate ion)的浓度(更多磷酸根＝更酸性PZC)或通过添加缓冲剂诸如组氨酸缓冲剂(使PZC碱性更强)改变PZC。根据本发明使用的磷酸铝将通常具有4.0至7.0，更优选5.0至6.5，例如约5.7的PZC。
在溶液中，磷酸铝和氢氧化物佐剂两者趋于形成直径为1-10μm的稳定的多孔聚集体[11]。
疫苗可包括氢氧化铝和磷酸铝两者的混合物，且组分可以被吸附到这些盐中的一种或两种。
用于制备本发明的组合物的磷酸铝溶液可含有缓冲剂(例如，磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲剂)，但这不总是必要的。磷酸铝溶液优选是无菌且无热原的。磷酸铝溶液可包括游离的含水磷酸根离子，例如以1.0至20mM、优选5至15 mM、更优选约10 mM的浓度存在。磷酸铝溶液还可以包含氯化钠。氯化钠的浓度优选在0.1至100 mg/ml的范围内(例如，0.5-50 mg/ml，1-20 mg/ml，2-10 mg/ml)，并且更优选约3+1 mg/ml。NaCl的存在有利于在吸附抗原之前正确测量pH。
本发明的组合物理想地包括小于0.85mg Al+++/单位剂量。在本发明的一些实施方案中，组合物包括小于0.5mg Al+++/单位剂量。Al+++的量可以小于该值，例如<250µg、<200µg、<150μg、<100μg、<75μg、<50μg、<25μg、<10μg等。
当疫苗包括基于铝的佐剂，组分的沉降可在储存过程中发生。所述组合物因此应当在向患者施用之前摇动。经摇动的组合物将是混浊的白色悬浮液。
水包油乳液佐剂
在一些实施方案中，疫苗用水包油乳液佐剂化。各种此类乳液是已知的，例如MF59和AS03都在欧洲被批准。
有用的乳液佐剂，通常包括至少一种油和至少一种表面活性剂，其中所述油和表面活性剂是可生物降解的(可代谢的)和生物相容的。乳液中的油滴通常具有亚微米直径，且这些小尺寸可以容易地使用提供稳定乳液的微流化床(microfluidiser)或通过替代方法(例如，相反转)来实现。其中至少80％(以数目计)的液滴具有小于220nm的直径的乳液是优选的，因为它们可进行过滤除菌。
所述乳液可以包括来自动物(诸如鱼)和/或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种子和谷物。最普遍可得的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油例举坚果油。可以使用(例如获得自霍霍巴豆的)霍霍巴油。种子油包括红花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物组中，玉米油是最容易获得的，但也可以使用其他谷物(诸如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等)的油。可从坚果和种子油开始，通过水解、分离和酯化适当材料制备不是种子油中天然存在的甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以与本发明使用。从动物来源获得纯油所必需的分离、纯化、皂化和其他方式的程序是本领域众所周知的。
大多数鱼含有可容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油(诸如鲸蜡)例举本文中可使用的几种鱼油。以5-碳异戊二烯单元生化合成许多支链油，其统称为萜类化合物。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯的支链不饱和萜类化合物，2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，其为特别优选用于与本发明使用(参见下文)。角鲨烯的饱和类似物角鲨烷也是有用的油。鱼油，包括角鲨烯和角鲨烷，易于从商业来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。其他优选油是生育酚(参见下文)。可以使用油的混合物。
佐剂乳液中总油(体积％)的优选量是1至20％，例如2-10%。5体积％的角鲨烯含量是特别有用的。
表面活性剂可以通过其‘HLB’(亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选的表面活性剂具有至少10，例如约15的HLB。可以与本发明使用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；以DOWFAX™商品名销售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，诸如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧基-1,2-乙二基(ethanediyl))基团数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇-9(曲通(Triton) X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，诸如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬基苯酚乙氧基化物，诸如Tergitol™ NP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(已知为苄泽(Brij)表面活性剂)，诸如三甘醇单月桂基醚(苄泽30)；和脱水山梨糖醇酯(通常已知为司盘(SPAN))，诸如脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
本发明使用的乳液优选包括非离子表面活性剂。用于乳液中包括的优选表面活性剂是聚山梨醇酯80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯；吐温80)、司盘85(脱水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂或曲通X-100。可以使用表面活性剂的混合物，例如聚山梨醇酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯的混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(诸如聚山梨醇酯80 (吐温80))和辛苯聚醇(诸如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100))的组合也是有用的。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚9加上聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。当使用表面活性剂的混合物时，则混合物的HLB根据它们的相对权重(以体积计)计算，例如，聚山梨醇酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯的优选1:1混合物具有8.4的HLB。
佐剂乳液中总表面活性剂(体积％)的优选量是0.1至2％，例如0.25-2%。1体积％的总含量是特别有用的，例如0.5体积％的聚山梨醇酯80和0.5体积％的脱水山梨糖醇三油酸酯。
有用的乳液可使用已知的技术制备，例如参见参考文献10和12-1318。
可与本发明使用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：
● 角鲨烯、聚山梨醇酯80和脱水山梨糖醇三油酸酯的亚微米(submicron)乳液。所述乳液的体积组成可以是约5％角鲨烯、约0.5％聚山梨醇酯80和约0.5％脱水山梨糖醇三油酸酯。在重量方面，这些比率变为4.3％角鲨烯、0.5％聚山梨醇酯80和0.48％脱水山梨糖醇三油酸酯。这种佐剂已知为‘MF59’ [19-21]，如参考文献9的第10章和参考文献10的第12章中更详细描述。MF59乳液有利地包括柠檬酸根离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲液。
● 角鲨烯、生育酚和聚山梨醇酯80的乳液。所述乳液可包括磷酸盐缓冲盐水。这些乳液可具有2-10％角鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％聚山梨醇酯80，且角鲨烯：生育酚的重量比优选≤1 (例如0.90)，因为这可以提供更稳定的乳液。角鲨烯和聚山梨醇酯80可以约5:2的体积比或以约11:5的重量比存在。因此，三种组分(角鲨烯、生育酚、聚山梨醇酯80)可以1068:1186:485或约55:61:25的重量比存在。该佐剂已知为‘AS03’。另一种这种类型的有用乳液每个人剂量可包含0.5-10 mg角鲨烯、0.5-11 mg生育酚和0.1-4 mg聚山梨酸酯80 [22]，例如以上述讨论的比率。
● 其中皂苷(例如QuilA或QS21)和固醇(例如胆固醇)结合为螺旋胶束的乳液[23]。
● 具有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献24中所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。亚微米液滴尺寸是有利的。
● 包含角鲨烯、含水溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(例如聚氧乙烯(12)十六十八烷基醚)和疏水性非离子型表面活性剂(例如脱水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，诸如脱水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或具有至少90％油滴(以体积计)具有小于200nm的尺寸[25]。该乳液也可包括以下中的一种或多种：醛糖醇(alditol)；冷冻保护剂(例如，糖，诸如十二烷基麦芽糖苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside)。它也可以包括TLR4激动剂，诸如其化学结构不包括糖环的TLR4激动剂[26]。此类乳液可以冻干。‘AF03’产品是一种此类乳液。
本发明使用的优选的水包油乳液包含角鲨烯和聚山梨醇酯80。
所述乳液在疫苗制造过程中可以与抗原混合，或者它们可以在递送时临时混合。因此，在一些实施方案中，所述佐剂和抗原可单独地保存在包装或分销(distributed)的疫苗中，其备用于在使用时的最终配制。在混合时(在批量制造过程中，或在使用点)，抗原将通常是含水形式，使得通过混合两种液体制备最终疫苗。所述两种液体的混合体积比可变(例如5∶1-1∶5)，但通常约为1∶1。如果乳液和抗原在试剂盒中分开储存，则该产品可作为含有乳液的小瓶和含有含水抗原的小瓶呈现，用于混合以得到佐剂化的液体疫苗(单剂量或多剂量)。
本发明的优选乳液包括角鲨烯油。这通常从鲨鱼油制备，但替代来源也是已知的，例如参见参考文献27(酵母)和28(橄榄油)。含有少于661皮克PCB/克角鲨烯(TEQ)的角鲨烯对于与本发明使用是优选的，如参考文献29所公开。所述乳液优选从高纯度的角鲨烯制备，例如，如参考文献30中公开通过双蒸馏制备。
当组合物包括生育酚时，可使用α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚中的任何一种，但优选α-生育酚。生育酚可采用几种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，诸如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。可使用D-α-生育酚和DL-α-生育酚两者。生育酚具有抗氧化特性，其可以有助于稳定该乳液[31]。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚，该生育酚的优选盐是琥珀酸盐。
疫苗组合物
除了上述讨论的抗原和佐剂组分以外，本发明的疫苗可包含其他非抗原性组分。这些可包括载体、赋形剂、缓冲剂等。这些非抗原性组分可具有各种来源。例如，它们可存在于制造过程中使用的抗原或佐剂材料之一中或者可与那些组分分开单独添加。
本发明的优选疫苗包括一种或多种药物载体和/或赋形剂。
为了控制涨度，优选包括生理盐，诸如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其可以以1至20mg/ml存在。
疫苗将通常具有200 mOsm/kg至400 mOsm/kg，优选240-360 mOsm/kg的摩尔渗透压浓度(osmolality)，且将更优选落在280-320 mOsm/kg的范围内。先前已报道摩尔渗透压浓度对于接种引起的疼痛没有影响[32]，但尽管如此优选将摩尔渗透压浓度保持在该范围内。
本发明的疫苗可包括一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris 缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸盐缓冲剂。缓冲剂通常将包括在5-20mM范围内。
本发明疫苗的pH通常将为6.0至7.5。因此，制备方法可包括在包装前调整组合物的pH的步骤。施用于患者的含水组合物可具有5.0-7.5的pH，且更通常针对最佳稳定性为5.0-6.0；当存在白喉类毒素和/或破伤风类毒素时，pH理想地为6.0至7.0。
本发明的疫苗优选为无菌的。
本发明的疫苗优选是无热原的，例如含有<1EU(内毒素单位，标准量度；1EU等于0.2ng FDA参考标准内毒素EC-2‘RSE’)/ 剂量，优选<0.1EU/剂量。
本发明的疫苗优选不含谷蛋白。
如果抗原包括吸附组分，则疫苗可以是具有混浊外观的悬浮液。这种外观意味着不容易看见微生物污染，所以疫苗优选含有抗微生物剂。当将疫苗包装在多剂量容器中时，这特别重要。优选用于包括的抗微生物剂是2-苯氧乙醇和硫柳汞。然而优选在本发明的方法过程中不使用汞防腐剂(例如硫柳汞)。因此，方法中混合的1种至所有组分可以基本上不含汞防腐剂。然而，如果组分在用于本发明之前用此类防腐剂处理，则微量的存在可能是不可避免的。然而，出于安全性，优选最终组合物含有小于约25 ng/ml汞。更优选地，最终疫苗产品不含有可检测的硫柳汞。这通常通过在本发明方法中添加抗原制剂之前从抗原制剂去除汞防腐剂，或在制备用于制备该组合物的组分过程中避免使用硫柳汞而实现。不含汞的疫苗是优选的。
本发明的疫苗将通常呈含水形式。
在制造过程中，通常用WFI(注射用水)或用缓冲液进行组分的稀释以得到期望的最终浓度。
本发明可提供适合包装到单独剂量中的整批材料，其随后可分配用于施用于患者。上面讨论的浓度通常是最终包装剂量中的浓度，所以整批疫苗中的浓度可更高(例如通过稀释降低至最终浓度)。
本发明的疫苗以单位剂量施用于患者，所述单位剂量即在单次施用中给予单个患者的疫苗的量(例如，单次注射是单位剂量)。当疫苗作为液体施用时，则单位剂量通常具有0.5ml的体积。应理解，该体积包括正常差异，例如0.5ml±0.05ml。对于多剂量情况，将提取多个剂量的量，并且一起包装在单个容器中，例如对于10剂量多剂量容器的5ml(或5.5ml，10％过度填充)。
在最终疫苗中还可以痕量存在来自单独抗原性组分的残余物质。例如，如果使用甲醛来制备白喉、破伤风和百日咳的类毒素，则最终疫苗产品可保留痕量的甲醛(例如少于10μg/ml，优选＜5μg/ml)。在制备脊髓灰质炎病毒过程中可能已经使用培养基或稳定剂(例如培养基199)，并且这些物质可能保留(carry through)到最终疫苗。类似地，游离氨基酸(例如丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和/或胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸和/或羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和/或缬氨酸)、维生素(例如胆碱、抗坏血酸等)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、钙、葡萄糖、硫酸腺嘌呤、酚红、乙酸钠、氯化钾等可以各自≤100μg/ml，优选＜10μg/ml保留在最终疫苗中。来自抗原制剂的其他组分，诸如新霉素(例如硫酸新霉素，尤其来自脊髓灰质炎病毒组分)、多粘菌素B(例如硫酸多粘菌素B、尤其来自脊髓灰质炎病毒组分)等也可以亚纳克量/剂量存在。最终疫苗的源自抗原制剂的其他可能组分源自抗原的不完全(less-than-total)纯化。因此可存在小量百日咳博德特氏菌(B.pertussis)、白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)、破伤风梭状芽孢杆菌(C.tetani)和酿酒酵母(S.cerevisiae)蛋白和/或基因组DNA。为了尽可能减少这些残留组分的量，在与本发明使用抗原之前，优选处理抗原制剂以去除所述残留组分。
当使用脊髓灰质炎病毒组分时，通常使其在Vero细胞上生长。最终疫苗优选含有少于10ng/ml，优选<1ng/ml(例如<500pg/ml或 <50 pg/ml) Vero细胞DNA，例如少于10ng/ml Vero细胞DNA，所述DNA为>50个碱基对长。
本发明的疫苗被呈现用于在容器中使用。合适的容器包括小瓶和一次性注射器(优选无菌注射器)。本发明方法可包括将疫苗包装到容器中用于使用的步骤。合适的容器包括小瓶和一次性注射器(优选无菌注射器)。
本发明还提供含有本发明的疫苗(例如，含有单位剂量)的递送装置(例如注射器、雾化器、喷雾器、吸入器、皮肤贴片等)。该装置可用于向婴儿施用所述疫苗。
本发明还提供含有本发明的疫苗(例如，含有单位剂量)的无菌容器(例如，小瓶)。
本发明还提供本发明的疫苗的单位剂量。
本发明还提供含有本发明的疫苗的气密封容器。合适的容器包括例如小瓶。
当本发明的疫苗在小瓶中呈现时，其优选由玻璃或塑料材料制成。优选在将组合物添加至小瓶之前将小瓶进行无菌处理。为了避免乳胶敏感的患者的问题，可以用无乳胶塞密封所述小瓶。小瓶可包括单个剂量的疫苗，或者其可包括多于一个剂量(‘多剂量’小瓶)，例如10个剂量。当使用多剂量小瓶时，应当在严格的无菌条件下用无菌针头和注射器取出各剂量，小心避免污染小瓶内容物。优选的小瓶由无色玻璃制成。
小瓶可以具有帽(例如Luer锁)，所述帽经调整使得可以将预填充的注射器插入帽中，可以将注射器内容物排入小瓶(例如以重构其中的冻干材料)，并且可以将小瓶内容物移回注射器中。从小瓶移取注射器后，然后可以连接针头，并且可以将该组合物施用于患者。帽优选位于密封物或覆盖物内，使得在可以进入该帽之前，必须去除该密封物或覆盖物。
当将疫苗包装到注射器中时，注射器通常不具有与之连接的针头，尽管也可提供单独的针头与注射器，用于组装和使用。优选安全针头。1-英寸23-号(gauge)、1-英寸25-号和5/8-英寸25-号针头是典型的。可提供具有剥离型标记的注射器，所述标记上可以打印内容物的批号和过期日期，以帮助记录保存。注射器中的活塞优选具有塞子，以防止柱塞在抽吸过程中意外移除。该注射器可具有乳胶橡胶帽和/或柱塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。注射器将通常具有尖端帽，以便在连接针头之前密封尖端，尖端帽优选由丁基橡胶制成。如果分开包装注射器和针头，则该针头优选装有丁基橡胶护罩。优选灰色丁基橡胶。优选的注射器是商品名为“Tip-Lok”™市售的注射器。
当使用玻璃容器(例如注射器或小瓶)时，则优选使用由硼硅玻璃而非钠钙玻璃制成的容器。
将疫苗包装到容器中之后，然后将该容器封装到用于分销的箱中，例如纸板箱内，并且该箱将用疫苗的详情标记，所述疫苗的详情例如其商品名、疫苗中抗原的列表(例如‘乙型肝炎重组物’等)、呈现容器(例如‘一次性预填充Tip-Lok注射器’或‘10×0.5ml单剂量小瓶’)、其剂量(例如‘各自含有一个0.5ml剂量’)、警告(例如‘仅用于成人使用’或‘仅用于儿童使用’)、过期日期、适应症、专利号等。各箱可含有多于一个的包装疫苗，例如五个或十个包装疫苗(特别是小瓶)。
疫苗可与小页一起包装(例如在同一个箱中)，所述小页包括疫苗详情，例如施用说明书、疫苗内的抗原详情等。说明书还可含有警告，例如，在接种后的过敏反应的情况下保持肾上腺素溶液容易可用，等。
包装疫苗优选储存于2℃-8℃。其不应冷冻。
当冻干组分时，它通常包括在冷冻干燥之前例如作为稳定剂添加的非活性组分。用于包括的优选稳定剂是乳糖、蔗糖和甘露醇，以及其混合物，例如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。通过冻干物质的含水重构获得的最终疫苗因此可以含有乳糖和/或蔗糖。优选当制备冻干疫苗时使用无定形的赋形剂和/或无定形的缓冲剂[33]。
治疗方法和疫苗的施用
本发明疫苗适合施用于人婴儿，并且本发明提供了在婴儿中产生免疫应答的方法，所述方法包括将本发明组合物施用于患者的步骤。
本发明还提供了本发明的疫苗，其用于药物。可以如本文不同地所述施用组合物。因此，提供疫苗，其用于本文中公开的任何免疫方法中，例如，用于针对多种病原体免疫婴儿的方法中。
本发明还提供了本文提到的抗原(和任选的佐剂)在制备用于在婴儿中产生免疫应答的药物中的用途。所述药物理想地是如本文别处不同地所述的组合物，并且它可以如本文各处所述施用。制备中使用的抗原决定婴儿产生的免疫应答的效果。
本发明的疫苗用于主动免疫。由这些方法、用途和组合物产生的免疫应答是理想地保护性的，并且本发明的疫苗可用于预防各种疾病。当疫苗包括白喉类毒素(无论缀合或非缀合)时，它可以保护免于白喉。当疫苗包括破伤风类毒素(无论缀合或非缀合)时，它可以保护免于破伤风。当疫苗包括无细胞百日咳抗原，它可以保护免于百日咳(百日咳)。当疫苗包括HBsAg时，它可以保护免于乙型肝炎。当疫苗包括IPV时，它可以保护免于脊髓灰质炎。当疫苗包括Hib荚膜糖时，它可以保护免于流感嗜血杆菌b型引起的疾病。当疫苗包括来自特定血清群的脑膜炎球菌荚膜糖时，它可以保护免于该血清群的脑膜炎奈瑟氏球菌引起的脑膜炎球菌疾病(具体而言，侵袭性脑膜炎球菌疾病)。当疫苗包括来自特定血清型的肺炎球菌荚膜糖时，它可以保护免于该血清型的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)引起的疾病(具体而言，侵袭性疾病)，并且它也可以保护免于那些血清型引起的中耳炎。
本发明的疫苗可用于婴儿的初始免疫。为了具有完全效力，典型的初始免疫时间表(特别对于婴儿)可涉及施用多于一个剂量。例如，剂量可以在：0和6个月(时间0是第一剂量)；在0、1、2和6个月；在第0天、第21天，然后在6至12个月的第三剂量；在2、4和6个月；在3、4和5个月；在6、10和14周；在2、3和4个月；或在0、1、2、6和12个月。
本发明的疫苗也可以在生命中随后用作加强剂量，例如，用于生命第二年的儿童，用于青少年，或用于成人。
本发明疫苗可通过肌内注射来施用，例如胳膊或腿注射。注射到大腿的前外侧或上臂的三角肌是典型的。
白喉类毒素
白喉由白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)(一种革兰氏阳性无孢子好氧菌)引起。该生物体表达原噬菌体编码的ADP-核糖基化外毒素(“白喉毒素”)，其可以进行处理(例如使用甲醛)以得到类毒素，所述类毒素不再有毒性但保留抗原性，且能够在注射后刺激特异性抗毒素抗体的产生。参考文献4的第13章中更详细地公开了白喉类毒素。优选的白喉类毒素是通过甲醛处理制备的那些。通过使白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)在可补充牛提取物的生长培养基(例如Fenton培养基，或Linggoud & Fenton培养基)中培养，随后进行甲醛处理、超滤和沉淀，可获得白喉类毒素。然后可通过包括无菌过滤和/或透析的方法来处理所述类毒素化的物质。
组合物应当包括足以引发至少0.01 IU/ml的循环白喉抗毒素水平的白喉类毒素。白喉类毒素的量通常以‘Lf’单位(“絮凝单位”或“边界絮凝剂量”或“絮凝限值”)测量，其被定义为当与一个国际单位的抗毒素混合时，产生最优絮凝混合物的毒素/类毒素量[34,35]。例如，NIBSC提供了‘Diphtheria Toxoid, Plain (白喉类毒素，普通) ’[36]， 其包含300 LF/安瓿，并且还应用‘The 1st International Reference Reagent For Diphtheria Toxoid For Flocculation Test’ [37]，其含有900 Lf/安瓿。可以容易地使用絮凝测定通过与针对此类参考试剂校准的参考材料进行比较而测定组合物中的白喉类毒素的浓度。
组合物中白喉类毒素的免疫功效通常以国际单位(IU)表示。可以通过将实验室动物(通常豚鼠)中的组合物提供的保护与已经以IU校准的参考疫苗提供的保护进行比较而评估功效。NIBSC提供‘白喉类毒素吸附的第三国际标准1999(Diphtheria Toxoid Adsorbed Third International Standard 1999)’[38, 39]，其含有每安瓿160 IU，并且适合于校准此类测定。
IU与Lf系统之间的转换取决于特定的类毒素制剂。
本发明的疫苗每单位剂量通常包括，10-35 Lf白喉类毒素/单位剂量，例如15-30 Lf，诸如15、25或30 Lf。通过IU测量，本发明的疫苗将通常包括>25 IU白喉类毒素/单位剂量。
当疫苗包括白喉类毒素时，它应当包括足以满足欧洲药典对于白喉接种的要求(保护豚鼠免于白喉毒素的致死攻击)。当白喉类毒素是糖缀合物中的载体蛋白时，缀合物中的糖:类毒素的比率将变化，使得所述缀合物可以提供足够的白喉类毒素以满足对于白喉保护的最低功效要求，和足够的糖以提供所需剂量(例如，5-15µg Hib糖/剂量)。
如果组合物包括铝盐佐剂，则所述组合物中的白喉类毒素优选吸附(更优选完全吸附)至铝盐上，优选吸附至氢氧化铝佐剂上。
破伤风类毒素
破伤风由破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)(一种革兰氏阳性芽孢形成杆菌)引起。该生物体表达内肽酶(“破伤风毒素”)，其可以进行处理以得到类毒素，所述类毒素不再具有毒性但保留抗原性，并且能够在注射后刺激特异性抗毒素抗体的产生。参考文献4的第 27章中更详细地公开了破伤风类毒素。优选的破伤风类毒素是通过甲醛处理制备的那些。通过使破伤风梭状芽孢杆菌(C.tetani)在生长培养基(例如衍生自牛酪蛋白的Latham培养基)中生长，然后进行甲醛处理、超滤和沉淀，可以获得破伤风类毒素。然后可通过包括无菌过滤和/或透析的方法处理该物质。
组合物应当包括足够的破伤风类毒素以引发至少0.01 IU/ml的循环破伤风抗毒素水平。破伤风类毒素的量通常以‘Lf’单位(参见上文)表示，其被定义为类毒素的量，当与一个国际单位的抗毒素混合时，其产生最佳絮凝混合物[34]。NIBSC提供‘The 1st International Reference Reagent for Tetanus Toxoid For Flocculation Test’[40]，其含有1000 LF/安瓿，通过其可以校准测量。
破伤风类毒素的免疫功效以国际单位(IU)测定，其通过将实验室动物(通常豚鼠)中的组合物提供的保护与每安瓿含有469 IU(例如使用NIBSC的‘破伤风类毒素吸附的第三国际标准2000’[41, 42])的参考疫苗提供的保护进行比较而评价。
IU和Lf系统之间的转换取决于特定的类毒素制剂。
本发明的疫苗通常包括4-15 Lf破伤风类毒素/单位剂量，例如5-10 Lf，诸如5或10 Lf。通过IU测量，本发明的疫苗将通常包括>40 IU破伤风类毒素/单位剂量。
当疫苗包括破伤风类毒素时，它应当包括足以满足欧洲药典对于破伤风接种的要求(保护小鼠免于破伤风毒素的致死攻击)。当破伤风类毒素是糖缀合物中的载体蛋白时，缀合物中的糖:类毒素的比率将变化，使得所述缀合物可以提供足够的破伤风类毒素以满足对于破伤风保护的最低功效要求，和足够的糖以提供所需剂量(例如，5-15µg Hib糖/剂量)。
如果组合物包括铝盐佐剂，则组合物中的破伤风类毒素优选吸附(有时完全吸附)至铝盐上，优选吸附至氢氧化铝佐剂上。
无细胞百日咳抗原
百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)引起百日咳。本发明的组合物包括无细胞(“aP”)百日咳抗原，即纯化百日咳抗原的定义混合物，而不是细胞裂解物。疫苗将通常包括百日咳类毒素(‘PT’即百日咳毒素的脱毒形式)、丝状血细胞凝集素(FHA)、和/或百日咳杆菌粘附素(也称为“69千道尔顿外膜蛋白”)中的至少两种。其还可以任选地包括2型 和3型菌毛。这些各种aP抗原的制备是本领域众所周知的。
可以通过用甲醛和/或戊二醛处理而使PT脱毒，并且FHA和百日咳杆菌粘附素也可以以相同的方式处理。作为PT的化学脱毒的替代形式，本发明可以使用其中已经通过诱变而降低野生型酶活性的突变体PT[43]，例如，9K/129G 双突变体[44]。
无细胞百日咳抗原的量通常用微克表示。本发明的疫苗通常包括5-30µg PT/单位剂量(例如，5、7.5、20或25μg)，2.5-25µg FHA/单位剂量(例如，2.5、5、10、20或25μg)，和2.5-10µg百日咳杆菌粘附素/单位剂量(例如，2.5、3、8或10µg)。组合物通常含有<80µg/单位剂量的总无细胞百日咳抗原。各单独抗原将通常以<30µg/单位剂量存在。
通常，PT、FHA和百日咳杆菌粘附素各自存在于本发明的组合物中。这些可以不同比率(以质量计)存在，诸如20:20:3或25:25:8的PT:FHA:p69比率。通常FHA的质量相对于百日咳杆菌粘附素过量，如果两者都存在。
如果组合物包括铝盐佐剂，则组合物中的PT优选吸附(有时完全吸附)至铝盐上，优选吸附至氢氧化铝佐剂上。任何FHA也可被吸附在铝盐上。任何百日咳杆菌粘附素可以吸附至铝盐佐剂，但百日咳杆菌粘附素的存在通常意指所述组合物需要氢氧化铝的存在以确保稳定的吸附[45]。
灭活的脊髓灰质炎病毒抗原(IPV)
脊髓灰质炎可以由三种类型的脊髓灰质炎病毒中的一种引起。这三种类型是相似的并且引起相同的症状，但它们的抗原性非常不同，并且被一种类型感染无法保护免受其他类型的感染。如参考文献4的第24章中所解释，因此本发明优选使用三种脊髓灰质炎病毒抗原—脊髓灰质炎病毒1型(例如Mahoney毒株)、脊髓灰质炎病毒2型(例如MEF-1毒株)和脊髓灰质炎病毒3型(例如Saukett毒株)。作为这些毒株(“Salk”毒株)的替代方案，如参考文献46和47中所讨论，可以使用1至3型的Sabin毒株。这些毒株可比正常Salk毒株更有效。
脊髓灰质炎病毒可以在细胞培养物中生长。优选的培养物是Vero细胞系，它是源自猴肾的连续细胞系。可方便地将Vero细胞进行微载体培养。病毒感染之前和感染过程中的Vero细胞的培养可涉及使用源自牛的材料(诸如小牛血清)，并且使用乳清蛋白水解产物(例如通过乳清蛋白酶促降解获得的)。这些源自牛的材料应从不含BSE或其他TSE的来源获得。
生长后，可使用技术诸如超滤、渗滤和层析纯化病毒体。在施用于患者之前，必须将脊髓灰质炎病毒灭活，这可以通过在病毒用于本发明方法之前用甲醛处理而实现。
优选地对病毒单独地进行生长、纯化和灭活，然后组合以得到用于本发明的大量混合物。
IPV的量通常以“DU”单位(“D-抗原单位”[48]) 表示。当存在1型、2型和3型脊髓灰质炎病毒中的所有三种时，这三种抗原可以分别以5:1:4的DU 比率或其他任何合适比率存在，例如当使用Sabin毒株时，15:32:45的比率 [46]。每单位剂量的Salk IPV毒株的典型量为40DU 1型、8DU 2型和32DU 3型，尽管也可以使用较低剂量。低量的来自Sabin毒株的抗原是特别有用的，具有<15 DU 1型、<5 DU 2型和<25 DU 3型(每单位剂量)。
如果组合物包括铝盐佐剂，则IPV抗原经常在它们用于本发明的方法之前不预先吸附至任何佐剂，但在配制后，它们可以变得吸附至铝盐上。
乙型肝炎病毒表面抗原
乙型肝炎病毒(HBV)是引起病毒性肝炎的已知物质之一。HBV病毒体由外部蛋白外壳或衣壳包围的内部核心组成，且病毒核心含有病毒DNA基因组。衣壳的主要组分是被称为HBV表面抗原的蛋白，或者更常被称为‘HBsAg’的蛋白，其通常是226个氨基酸多肽，分子量为～24 kDa。所有现有的乙型肝炎疫苗均含有HBsAg，当将该抗原施用于正常疫苗接种者时，它刺激产生抗HBsAg抗体，所述抗HBsAg抗体保护免于HBV 感染。
对于疫苗制造，可用两种方式制备HBsAg。第一种方法涉及从慢性乙型肝炎携带者的血浆纯化颗粒形式的抗原，因为在HBV感染过程中在肝脏中合成了大量HBsAg，并释放至血流中。第二种方式涉及通过重组DNA方法表达蛋白。用于本发明的方法中使用的HBsAg是在例如酵母细胞或CHO细胞中重组表达的。合适的酵母包括酵母属(Saccharomyces)(诸如酿酒酵母(S.cerevisiae))或汉逊酵母属(Hanensula)(诸如多形汉逊酵母(H.polymorpha))宿主。
与天然HBsAg(即血浆纯化产物中的 HBsAg)不同，酵母表达的HBsAg通常为非糖基化的，这是用于本发明的 HBsAg的最优选的形式。酵母表达的HBsAg具有高免疫原性，并且可以在没有血液制品污染的风险的情况下制备。
HBsAg通常呈基本球形颗粒的形式(平均直径为约20nm)，包括包含磷脂的脂质基质。酵母表达的HBsAg颗粒可包含磷脂酰肌醇，这在天然HBV病毒体中不存在。该颗粒还可包括无毒量的LPS，以便刺激免疫系统[49]。所述颗粒可以保留非离子表面活性剂(例如聚山梨醇酯20)，如果这是在酵母的破坏过程中使用[50]。
在细胞破坏后，HBsAg纯化的优选方法涉及：超滤；大小排阻层析；阴离子交换层析；超速离心；脱盐；和过滤除菌。细胞破坏(例如，使用聚乙二醇)后，可沉淀裂解物，将HBsAg留在溶液中，准备进行超滤。
纯化后，HBsAg可经受透析(例如用半胱氨酸)，其可用于去除可能在HBsAg制备过程中已经使用的任何汞防腐剂诸如硫柳汞[51]。优选不含硫柳汞的制剂。
HBsAg优选来自HBV亚型adw2。
HBsAg的量通常以微克表示。如果本发明的疫苗包括HBsAg，则每单位剂量的正常量是5-25µg，例如10µg或20µg。
如果组合物包括铝盐佐剂，则HBsAg可吸附至其上(优选吸附至磷酸铝佐剂上)。
Hib缀合物
流感嗜血杆菌b型(‘Hib’)引起细菌性脑膜炎。Hib疫苗通常基于‘PRP’荚膜糖抗原(例如，参考文献4的第14章)，其制备是充分记载的(例如参考文献52-61)。将Hib糖缀合至载体蛋白以增强其免疫原性，特别是在儿童中。典型的载体蛋白是破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉类毒素的CRM197 衍生物、或来自血清群B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物。破伤风类毒素是有用的载体，如通常被称为‘PRP-T’或‘Hib-T’的产品中所使用，即共价结合至破伤风蛋白的纯化的Hib磷酸多核糖基核糖醇荚膜多糖。PRP-T可通过以下制备：使用溴化氰活化Hib荚膜多糖，将活化的糖偶联至己二酸接头(诸如(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)，通常为盐酸盐)，然后使接头-糖实体与破伤风类毒素载体蛋白反应。CRM197是用于本发明的组合物中的Hib缀合物的另一种有用的载体(例如，如‘HbOC’和‘Vaxem-Hib’产品中所见)。
缀合物的糖部分可包含从Hib细菌制备的全长磷酸多核糖基核糖醇(PRP)，和/或全长PRP的片段。可使用具有1∶5(即过量蛋白)至5∶1(即过量糖)的糖∶蛋白比率(w/w)的缀合物，例如，比例在1∶2至5∶1的比率和1∶1.25至1∶2.5 的比率。然而，在优选的疫苗中，糖与载体蛋白的重量比为1∶2.5至1∶3.5。在破伤风类毒素作为抗原和作为载体蛋白两者存在的疫苗中，缀合物中糖与载体蛋白的重量比可为1∶0.3至1∶2[62]。Hib缀合物的施用优选导致>0.15µg/ml、且更优选>1µg/ml的抗PRP抗体浓度，并且这些是标准响应阈值。
Hib抗原的量通常以糖的微克数表示。如果本发明的组合物包括Hib抗原，则每单位剂量的正常量是5-15µg，例如10µg或12µg。
如上所述，缀合物中的荚膜糖与载体蛋白的比率可以变化，使得所述缀合物可以提供足够的类毒素以满足对于保护的最低功效要求，和足够的糖以提供所需剂量。该比率将根据类毒素的特定功效而变化。因此，Hib缀合物中的糖:类毒素质量比可以变化，具有过量糖(以质量计)，等量的两者(例如，10µg Hib糖缀合至10µg类毒素)，或者过量载体(以质量计)。过量载体蛋白是典型的。
如果疫苗包括铝盐佐剂，则Hib抗原可吸附至其上，或可以是未吸附的。
脑膜炎球菌荚膜糖缀合物
当组合物包括脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物时，可以存在一种或多于一种此类缀合物。包括血清群A、C、W135和Y中的2种、3种或4种是典型的，例如A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、A+W135+Y、A+C+W135+Y等。包括来自所有四种血清群A、C、W135和Y的糖的组分是有用的，如在MENVEO™、MENACTRA™和NIMENRIX™产品中。也可能包括血清群X脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的缀合物。
当包括来自多于一种血清群的缀合物时，这些优选分开制备、分开缀合、然后组合。它们可以以基本上相等的质量存在，例如每种血清群的糖的质量在彼此的+10%之内。每种血清群的典型量为1µg至20µg，例如每种血清群2至10 µg，或约4µg或约5μg或约10μg。作为基本上相等比率的替代方案，可以使用双倍质量的血清群A糖(如在MENVEO™产品中)。
缀合物的施用优选导致针对相关血清群的血清杀菌测定(SBA)滴度增加至少4倍，优选至少8倍。SBA滴度可使用幼兔补体或人补体测量[63]。
血清群A脑膜炎球菌的荚膜糖(‘MenA’)是(α1→6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸酯(其在C3和C4位置具有部分O-乙酰化)的均聚物。C-3位置的乙酰化可以是70-95％。用于纯化糖的条件可导致去-O-乙酰化(例如在碱性条件下)，但保留该C-3位置的OAc是有用的。在一些实施方案中，血清群A糖中的至少50％(例如，至少60％、70％、80％、90％、95％或更多)甘露糖胺残基在C-3位置被O-乙酰化。乙酰基可以用封闭基团取代，以防止水解[64]，并且此类修饰的糖仍然是本发明的含义内的血清群A糖。
血清群C (‘MenC’)荚膜糖是(α 2→9)-连接的唾液酸(N-乙酰基神经氨酸，或‘NeuNAc’)的均聚物。该糖结构被写作→9)-Neu p NAc 7/8 OAc-(α2→。大多数血清群C菌株在唾液酸残基的C-7和/或C-8具有O-乙酰基，但约15 ％的临床分离株缺乏这些O-乙酰基[65, 66]。OAc基团的存在或不存在生成独特表位，且抗体结合糖的特异性可影响其针对O-乙酰化(OAc-)和去-O-乙酰化(OAc+)菌株的杀菌活性[67-69]。用于本发明的血清群C糖类可从OAc+或OAc-菌株制备。批准的 MenC缀合物疫苗包括OAc– (NEISVAC-C™)和OAc+ (MENJUGATE™ & MENINGITEC™)糖类两者。在一些实施方案中，用于产生血清群C缀合物的菌株是OAc+菌株，例如血清型16的菌株，血清亚型P1.7a，1等。因此，可以使用C:16:P1.7a,1 OAc+菌株。血清亚型P1.1的OAc+菌株也是有用的，诸如C11菌株。优选的MenC糖取自OAc+菌株，诸如菌株C11。
血清群W135(‘MenW’)荚膜糖是唾液酸-半乳糖二糖单元的聚合物。如血清群C糖，它具有不同的O-乙酰化，但在7和9位置的唾液酸[70]。其结构可写作：→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→ 。
血清群X (‘MenX’)荚膜糖是α1→4-连接的N-乙酰基葡糖胺1-磷酸酯的聚合物。血清群X结构被写作：→4)-α-D-GlcpNAc-(1→OPO3→ 。
血清群Y(‘MenY’)糖类似于血清群W135糖，除了二糖重复单元包含葡萄糖而非半乳糖。如血清群W135，它在7和9位置的唾液酸具有不同的O-乙酰化[70]。血清群Y结构可写作：→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→。
根据本发明使用的糖可以如上所述被O-乙酰化(例如，具有与天然荚膜糖中所见相同的O-乙酰化模式)，或者它们可以在糖环的一个或多个位置被部分或完全去-O-乙酰化，或者它们可以相对于天然荚膜糖被高(hyper)-O-乙酰化。例如，参考文献71报道了使用超过80％被去-O-乙酰化的血清群Y糖。
脑膜炎球菌缀合物中的糖部分可包含制备自脑膜炎球菌的全长糖类，和/或可包含全长糖类的片段，即糖类可短于在细菌中发现的天然荚膜糖。因此，将糖类解聚，其中解聚在糖纯化过程中或之后、但在缀合之前发生。解聚降低了糖类的链长。一种解聚方法涉及使用过氧化氢[72]。将过氧化氢添加至糖(例如得到1％的最终H2O2浓度)，然后孵育(例如在约55℃)混合物，直到已经实现期望的链长降低。另一种解聚方法涉及酸水解[73]，并且其他方法包括微流化或超声处理[74]。其他解聚方法是本领域已知的。用来制备用于本发明的缀合物的糖类可通过这些解聚方法中的任一种获得。可以使用解聚来提供免疫原性的最佳链长和/或针对糖类的物理可操作性降低链长。在一些实施方案中，糖类具有以下范围的平均聚合度(Dp)：A=10-20；C=12-22；W135=15-25；Y=15-25。对于所有血清群，在分子量而非Dp方面，有用范围为：<100kDa；5kDa-75kDa；7kDa-50kDa；8kDa-35kDa；12kDa-25kDa；15kDa-22kDa。在其他实施方案中，来自脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y中每种的糖的平均分子量可以是大于50kDa，例如>75kDa、>100kDa、>110kDa、>120kDa、>130kDa等[74]，甚至至多达1500kDa，特别是通过MALLS测定。例如：MenA糖的范围可以是50-500kDa，例如60-80kDa；MenC糖的范围可以是100-210kDa；MenW135糖的范围可以是60-190kDa，例如120-140kDa；和/或MenY糖的范围可以是60-190kDa，例如150-160kDa。
如果组分或组合物包括Hib和脑膜炎球菌缀合物两者，则在一些实施方案中，Hib糖的质量可以与特定脑膜炎球菌血清群糖的质量基本上相同。在一些实施方案中，Hib糖的质量将大于(例如，至少1.5x)特定脑膜炎球菌血清群糖的质量。在一些实施方案中，Hib糖的质量将小于(例如，小至少1.5x)特定脑膜炎球菌血清群糖的质量。
当组合物包括来自多于一种脑膜炎球菌血清群的糖，存在每种血清群的平均糖质量。如果使用每种血清群的基本上相等的质量，则平均质量与每种单独质量将是相同的；当使用不相等质量，则平均值将是不同的，例如，对于MenACWY混合物具有10:5:5:5 μg量，平均质量是6.25μg/血清群。在一些实施方案中，Hib糖的质量将与脑膜炎球菌糖的平均质量/血清群是基本上相同的。在一些实施方案中，Hib糖的质量将大于(例如，至少1.5x)脑膜炎球菌糖的平均质量/血清群。在一些实施方案中，Hib糖的质量将小于(例如，至少1.5x)脑膜炎球菌糖的平均质量/血清群[75]。
如上所述，缀合物中的荚膜糖与载体蛋白的比率可以变化，使得所述缀合物可以提供足够的类毒素以满足对于保护的最低功效要求，和足够的糖以提供所需剂量。该比率将根据类毒素的特定功效而变化。因此，脑膜炎球菌缀合物中的糖:类毒素质量比可以变化，具有过量糖(以质量计)，等量的两者(例如，10µg 脑膜炎球菌糖缀合至10µg类毒素)，或者过量载体(以质量计)。过量载体蛋白是典型的。例如，MENACTRA™产品具有16μg糖(4μg/血清群)和48μg白喉类毒素，而NIMENRIX™产品具有20μg糖(5μg/血清群)和44μg破伤风类毒素。
当疫苗组合物包括来自多于一种血清群的荚膜糖时，优选的是，每种单独缀合物使用相同的载体蛋白。因此，用于脑膜炎球菌糖的载体蛋白可以是CRM197(如MENVEO™产品中)，Dt(如MENACTRA™产品中)，或Tt(如在NIMENRIX™产品中)。然而，在一些实施方案中，不同的血清群可以使用不同的载体，例如缀合至CRM197的至少一种血清群，且缀合至Tt的至少一种血清群。
肺炎球菌荚膜糖缀合物
肺炎链球菌引起细菌性脑膜炎，并且现有的疫苗基于荚膜糖类。因此，本发明的疫苗组合物可包括至少一种缀合至载体蛋白的肺炎球菌荚膜糖。
本发明可包括来自一种或多种不同肺炎球菌血清型的荚膜糖。当组合物包括来自多于一种血清型的糖抗原时，这些优选地单独制备，单独缀合，然后组合。用于纯化肺炎球菌荚膜多糖的方法是本领域已知的(例如参见参考文献76)，并且多年已知基于来自23种不同血清型的纯化糖的疫苗。已经描述了这些方法的改进，例如，对于血清型3，如参考文献77中所述，或者对于血清型1、4、5、6A、6B、7F和19A，如参考文献78中所述。
肺炎球菌荚膜糖将通常选自以下血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和/或33F。因此，总共，组合物可以包括来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或更多种不同的血清型的荚膜糖。包括至少血清型6B糖的组合物是有用的。
有用的血清型组合是7价组合，例如包括来自4、6B、9V、14、18C、19F 和23F各血清型的荚膜糖。另一种有用组合是9价组合，例如包括来自1、4、5、6B、9V、14、18C、19F和23F各血清型的荚膜糖。另一种有用组合是10价组合， 例如包括来自1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F各血清型的荚膜糖。11价组合可进一步包括来自血清型3的糖。可以将12价组合添加至10价混合物：血清型6A和19A；6A和22F；19A和22F；6A和15B；19A和15B；或22F和15B。可以将13价组合添加至11价混合物：血清型19A和22F；8和12F；8和15B；8和19A；8和22F；12F和15B；12F和19A；12F和22F；15B和19A；15B和22F；6A和19A等。
因此，有用的13价组合包括来自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19 (或19A)、19F和23F的荚膜糖，例如如参考文献79-82中所公开制备。一种此类组合包括约 8μg/ml的血清型6B糖和浓度各约4μg/ml的其他12种糖。另一种此类组合包括各约 8μg/ml的血清型6A和6B糖和各约4μg/ml的其他11种糖。
用于肺炎球菌缀合物疫苗的特别有用的载体蛋白是CRM197、破伤风类毒素、白喉类毒素和流感嗜血杆菌蛋白D。CRM197用于PREVNAR™中。13价混合物可使用 CRM197作为13种缀合物中每种的载体蛋白，并且CRM197可以约55-60μg/ml存在。
当组合物包括来自多于1种肺炎球菌血清型的缀合物时，对于各单独缀合物可使用相同的载体蛋白或使用不同的载体蛋白。尽管在两种情况下，不同缀合物的混合物将通常通过单独制备各血清型缀合物，然后将其混合以形成单独缀合物的混合物而形成。参考文献83描述了当在多价肺炎球菌缀合物疫苗中使用不同载体蛋白时的潜在优势，但从PREVNAR™产品已知相同的载体可用于多种不同的血清型。
肺炎球菌糖可包含制备自肺炎球菌的全长完整糖，和/或可包含全长糖的片段，即所述糖可比细菌中所见的天然荚膜糖更短。因此，多糖可以解聚，其中解聚在糖纯化过程中或者之后、但在缀合之前发生。解聚降低糖的链长。可使用解聚以提供对于免疫原性的最佳链长和/或针对糖的物理可操作性而降低链长。当使用多于一种肺炎球菌血清型时，则可使用各血清型的完整糖、各血清型的片段，或使用一些血清型的完整糖和其他血清型的片段。
当组合物包括来自血清型4、6B、9V、14、19F和23F中任一种的糖时，这些糖优选是完整的。相反，当组合物包含来自血清型18C的糖时，该糖优选是解聚的。
血清型3糖也可以是解聚的，例如，血清型3糖可以经受酸水解(例如，使用乙酸)以解聚[79]。然后使所得片段氧化以活化(例如，高碘酸盐氧化，可在二价阳离子(例如MgCl2)存在的情况下)，在还原性条件下(例如，使用氰基硼氢化钠)缀合至载体(例如CRM197)，然后(任选地)在糖中任何未反应的醛可进行加帽(capped)(例如，使用硼氢化钠)[79]。缀合可以在冻干物质上进行，例如在共冷冻干燥活化的糖和载体之后。
血清型1糖可以至少部分去-O-乙酰化，例如通过碱性pH缓冲液处理(诸如通过使用碳酸氢盐/碳酸盐缓冲液)实现[80]。此类(部分地)去-O-乙酰化的糖可以被氧化以活化(例如高碘酸盐氧化)，在还原条件下(例如，使用氰基硼氢化钠)缀合至载体(例如，CRM197)，然后(任选地)可对糖中任何未反应的醛加帽(capped)(例如，使用硼氢化钠)[80]。缀合可以在冻干物质上进行，例如在共冷冻干燥活化的糖和载体之后。
血清型19A糖可被氧化以活化(例如，高碘酸盐氧化)，在还原性条件下在 DMSO中缀合至载体(例如CRM197)，然后(任选地)糖中任何未反应的醛可被加帽(例如，使用硼氢化钠)[84]。偶联可以在冻干物质上进行，例如在共冷冻干燥活化的糖和载体之后。
肺炎球菌缀合物可以理想地引发结合相关糖的抗荚膜抗体，例如，引发>0.20μg/mL的抗-糖抗体水平[85]。可以通过酶免疫测定(EIA)和/或调理素吞噬活性(OPA)的测量来评估抗体。EIA方法已经广泛验证并且在抗体浓度和疫苗效力之间存在关联。
通用
术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可包括额外物质，例如X+Y。
词语“基本上”不排除“完全地”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，词语“基本上”可以从本发明的定义中省略。
与数值x相关的术语“约”是任选的，并且意指，例如x±10％。
除非特别说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不要求混合的任何特定顺序。因此，组分可以任何顺序混合。当存在三种组分时，则两种组分可以彼此组合，然后该组合可以与第三组分组合，等。
当将抗原描述为“吸附”至佐剂时，优选至少50％(以重量计)的该抗原被吸附，例如50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或更多。优选白喉类毒素和破伤风类毒素都被全部吸附，即在上清液中都不可检测。可以使用HBsAg的全部吸附。
缀合物的量通常以糖的质量给出(即，缀合物(载体+糖)的剂量作为整体将高于所述剂量)以避免由于载体选择导致的变化。
当动物(特别是牛)材料在细胞培养中使用时，它们应当获得自不具有传染性海绵状脑病(TSE)、特别是不具有牛海绵状脑病(BSE)的来源。
实施本发明的方式
用于保护免于破伤风的Tt-缀合物
为了评估缀合物中的Tt是否可以体内保护免于破伤风毒素的致死攻击(根据欧洲药典2.7.8)，未引发的小鼠用MENITORIX™(其中两个多糖组分缀合至Tt的二价MenC/Hib缀合物)免疫。
根据其SmPC，MENITORIX™含有约17.5 µg Tt。两组小鼠(各8只动物)接受一部分MENITORIX™，使得每只小鼠用10.5 µg Tt (第1组)或2.1 µg Tt (第2组)皮下免疫。接种后四周，小鼠用破伤风毒素攻击，并且在第1组中，所有小鼠均存活。在第2组中，八只小鼠中的六只(80％)存活。在使用二价‘Td-pur’疫苗的阳性对照组中，100％的小鼠存活，而在对照组中，所有小鼠都死亡。
用于保护免于白喉的Dt-缀合物
为了评估缀合物中的Dt是否可以保护免于白喉毒素的致死攻击，豚鼠用MENACTRA™(基于Dt的四价脑膜炎球菌缀合物，其中Dt浓度为~48 µg/0.5ml人剂量)免疫。五只动物两次接受人剂量，其中接种间隔为14天。第二次免疫后两周，豚鼠用白喉毒素攻击。五只动物中的四只存活。在阳性对照中，所有动物均存活，且阴性对照组中无一存活。
用于保护免于白喉的CRM197-缀合物
为了评估CRM197缀合物是否可以赋予针对白喉毒素的致死攻击的保护，豚鼠用MENVEO™(四价脑膜炎球菌ACWY缀合物疫苗，具有~40 µg CRM197/剂量)免疫。使用两组，每组10只动物。第1组用20 µg CRM197免疫一次，且组接受约8 µg CRM197。用白喉毒素攻击后，第1组或第2组中都没有动物存活，而在用DTP疫苗的阳性对照组中，100％的动物存活。
为了研究佐剂是否可以改善CRM197的保护，使用MENJUGATE™ (基于CRM197和含有12.5-25μg/剂量、具有氢氧化铝佐剂的单价脑膜炎球菌血清群C疫苗)。一组10只豚鼠用约6 µg CRM197/动物免疫一次。没有动物存活。阳性对照中的所有动物均存活，但阴性对照组中没有动物存活。
为了研究更高剂量是否可以改善CRM197的保护，使用双倍剂量。使用两次免疫，各具有含有~40 µg CRM197的完全人剂量。第一次免疫后14天给予第二次剂量，且在其后14天实施致死攻击。用MENVEO™接种两次的组中的五只豚鼠中，所有动物都死亡，而在阳性对照组中，所有动物都存活。
用SYNFLORIX™中的Dt载体的实验
上述实验研究脑膜炎球菌多糖的缀合物，并且显示，偶联至作为载体的Dt的脑膜炎球菌多糖在豚鼠中针对白喉毒素的致死攻击是保护性的。进一步实验看看Dt载体使用来自另一种细菌(例如肺炎链球菌)的糖是否也可以是保护性的。这些实验使用SYNFLORIX™。这是10价肺炎球菌缀合物疫苗，其中10种血清型中的8种(1、4、5、6B、7F、9V、14和23F)的多糖都偶联至源自非分型的流感嗜血杆菌的蛋白D，并且血清型18C多糖缀合至破伤风类毒素。只有血清型19F的多糖缀合至Dt (3-6 µg Dt/疫苗剂量)。SYNFLORIX™用磷酸铝佐剂化。
五只豚鼠各自用SYNFLORIX™的人疫苗剂量接种一次，并且五只动物的比较组用MENJUGATE™(各自具有一个人疫苗剂量)接种。用SYNFLORIX™接种的五只豚鼠在随后用白喉毒素攻击之后存活，而用MENJUGATE™接种的五只豚鼠死亡(也如上述先前实验中看到)。
该实验证实，用作缀合物疫苗的载体的Dt的保护性免疫独立于多糖来源的性质，并且如果缀合至脑膜炎球菌和肺炎球菌多糖，则其保护效力不受负面影响。
概述
实验结果概述如下：
。
结论
甚至当它们仅作为缀合物疫苗的载体蛋白存在时，Dt和Tt可以赋予针对白喉毒素或破伤风毒素的致死攻击的保护，而CRM197突变体不是保护性的。
参考文献1报道，作为肺炎球菌缀合物疫苗中的载体蛋白的Tt和Dt可以保护免于破伤风毒素或白喉毒素的致死攻击，并且作者在第[0041]段中宣称，用CRM197将看到相同效果。本发明人已经显示，CRM197与作为缀合物疫苗的部分的Dt相比令人惊讶地是较弱的免疫原，尽管基于CRM197的缀合物仍然是保护免于连接的糖指定的细菌疾病的有效疫苗。
因此，当开发超过现有六价疫苗(D+T+Pa+Hib+HBsAg+IPV)的组合疫苗时，可以添加脑膜炎球菌缀合物如MenC-Tt或MenC-Dt和去除现有的Dt或Tt组分，但MenC-CRM197不可以以这种方式使用。因此，有用的组合疫苗将是D+Pa+Hib+HBsAg+IPV+MenC-Tt或T+Pa+Hib+HBV+IPV+MenC-Dt。
如果Tt用作Hib的载体且Dt用于MenC (和任选用于进一步脑膜炎球菌血清群)，可以去除Tt和Dt两者，以得到Pa+Hib-Tt+HBV+IPV+MenC-Dt，从而降低抗原复杂性，而不降低保护的宽度。该组合包括五种组分(如果Pa被认为是单一组分)，但具有与7价疫苗相同的疾病覆盖范围。对于一进一步效价(one further valence)仍然存在空间，而不会变得比当前市售6价疫苗更复杂。
相反，在缀合物疫苗的背景下CRM197是比Dt更弱的免疫原的事实使得当缀合物疫苗与当前婴儿组合疫苗同时给予时该蛋白是有吸引力的载体，因为对于载体蛋白诱导的负面干扰存在较低可能。因此，从可用的MenC缀合物疫苗来看，当与当前儿科疫苗结合使用时，MENJUGATE™和MENINGITEC™将优于NEISVAC-C™(其具有Tt载体)。类似地，从可用的MenACWY缀合物疫苗来看，当与当前儿科疫苗结合使用时，MENVEO™将优于NIMENRIX™ (其具有Tt载体)和MENACTRA™ (Dt载体)。此外，从可用的多价肺炎球菌缀合物疫苗来看，当与当前儿科疫苗结合使用时，PREVNAR™和PREVNAR13™将优于SYNFLORIX™(其包括Dt和Tt载体)。
应当理解，本发明仅通过实例的方式进行描述，并且可进行修改，而仍在本发明的范围和精神之内。
参考文献：
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Claims (28)

1.用于针对多种病原体免疫婴儿的方法，其包括用(a)含有未缀合的白喉类毒素、但不含有未缀合的破伤风类毒素的疫苗；和(b)含有缀合至破伤风类毒素载体的糖的疫苗共同免疫婴儿的步骤。
2.用于针对多种病原体免疫婴儿的方法，其包括用(a)含有未缀合的破伤风类毒素、但不含有未缀合的白喉类毒素的疫苗；和(b)含有缀合至白喉类毒素载体的糖的疫苗共同免疫婴儿的步骤。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述婴儿接受含有(a)的未缀合的类毒素和(b)的缀合的类毒素的单一疫苗。
4.用于针对多种病原体免疫婴儿的方法，其包括用(a)含有至少一种免疫原、但不含未缀合的破伤风类毒素且不含未缀合的白喉类毒素的疫苗；(b)含有缀合至破伤风类毒素载体的糖的疫苗；和(c)含有缀合至白喉类毒素载体的糖的疫苗共同免疫婴儿的步骤。
5.权利要求3的方法，其中所述婴儿接受含有(a)的免疫原和(b)和(c)的缀合的类毒素的单一疫苗。
6.用于针对脑膜炎球菌疾病和破伤风免疫婴儿的方法，其包括施用含有缀合至破伤风类毒素载体的脑膜炎球菌荚膜糖的疫苗而不施用未缀合的破伤风类毒素的步骤。
7.用于针对脑膜炎球菌疾病和白喉免疫婴儿的方法，其包括施用含有缀合至白喉类毒素载体的脑膜炎球菌荚膜糖的疫苗而不施用未缀合的白喉类毒素的步骤。
8.任一前述权利要求的方法，其中所述婴儿在免疫时对于破伤风类毒素(Tt)和/或白喉类毒素(Dt)是免疫上幼稚的。
9.组合疫苗，其包含未缀合的白喉类毒素和缀合至破伤风类毒素载体的糖，但不含未缀合的破伤风类毒素。
10.组合疫苗，其包含未缀合的破伤风类毒素和缀合至白喉类毒素载体的糖，但不含未缀合的白喉类毒素。
11.组合疫苗，其包含缀合至破伤风类毒素载体的糖和缀合至白喉类毒素载体的糖，但不含未缀合的破伤风类毒素且不含未缀合的白喉类毒素。
12.权利要求9的疫苗，其任选用于进行权利要求1或权利要求6的方法，其中所述疫苗包含(i)脑膜炎球菌荚膜糖与破伤风类毒素的缀合物，(ii)Hib荚膜多糖与破伤风类毒素的缀合物，和/或(iii)肺炎球菌荚膜糖与破伤风类毒素的缀合物。
13.权利要求12的疫苗，其中所述疫苗包含缀合至破伤风类毒素的来自脑膜炎球菌血清群C的荚膜糖。
14.权利要求13的疫苗，其中所述疫苗包含来自脑膜炎球菌血清群C和Y的荚膜糖，其各自缀合至破伤风类毒素。
15.权利要求14的疫苗，其中所述疫苗包含来自脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y的荚膜糖，其各自缀合至破伤风类毒素。
16.权利要求12至15中任一项的疫苗，其进一步包含以下中的2种、3种或4种：未缀合的白喉类毒素；一种或多种无细胞百日咳抗原；灭活的脊髓灰质炎病毒；和/或乙型肝炎病毒表面抗原。
17.权利要求10的疫苗，其任选用于进行权利要求2或权利要求7的方法，其中所述疫苗包含(i)脑膜炎球菌荚膜糖与白喉类毒素的缀合物，(ii)Hib荚膜多糖与白喉类毒素的缀合物，和/或(iii)肺炎球菌荚膜糖与白喉类毒素的缀合物。
18.权利要求17的疫苗，其中所述疫苗包含缀合至白喉类毒素的来自脑膜炎球菌血清群C的荚膜糖。
19.权利要求18的疫苗，其中所述疫苗包含来自脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y的荚膜糖，其各自缀合至白喉类毒素。
20.权利要求17至19中任一项的疫苗，其进一步包含以下中的2种、3种或4种：未缀合的破伤风类毒素；一种或多种无细胞百日咳抗原；灭活的脊髓灰质炎病毒；和/或乙型肝炎病毒表面抗原。
21.权利要求11的疫苗，其任选用于进行权利要求4的方法，其中所述疫苗包含(i)脑膜炎球菌荚膜糖与破伤风类毒素的缀合物，(ii)Hib荚膜多糖与破伤风类毒素的缀合物，(iii)肺炎球菌荚膜糖与破伤风类毒素的缀合物，(iv)脑膜炎球菌荚膜糖与白喉类毒素的缀合物，(v)Hib荚膜多糖与白喉类毒素的缀合物，和/或(vi)肺炎球菌荚膜糖与白喉类毒素的缀合物。
22.权利要求21的疫苗，其中所述疫苗包含缀合至破伤风类毒素的Hib荚膜糖，和缀合至白喉类毒素的脑膜炎球菌荚膜糖。
23.权利要求22的疫苗，其中所述疫苗包含：缀合至破伤风类毒素的Hib荚膜糖；和来自脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y的荚膜糖，其各自缀合至白喉类毒素。
24.权利要求22的疫苗，其中所述疫苗包含：缀合至白喉类毒素的Hib荚膜糖；和来自脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y的荚膜糖，其各自缀合至破伤风类毒素。
25.权利要求21至24中任一项的疫苗，其进一步包含以下中的1种、2种或3种：一种或多种无细胞百日咳抗原；灭活的脊髓灰质炎病毒；和/或乙型肝炎病毒表面抗原。
26.权利要求9至25中任一项的疫苗，其包括至少一种铝盐佐剂。
27.试剂盒，其包含至少两种试剂盒组分，所述试剂盒组分当混合时，导致权利要求9至26中任一项的组合疫苗。
28.用于针对多种病原体免疫婴儿的方法，其包括用(a)含有白喉类毒素和破伤风类毒素的疫苗；和(b1)含有缀合至CRM197载体的脑膜炎球菌荚膜糖的疫苗；(b2)含有缀合至CRM197载体的肺炎球菌荚膜糖的疫苗；(b3)含有缀合至CRM197载体的脑膜炎球菌荚膜糖的第一疫苗和含有缀合至CRM197载体的肺炎球菌荚膜糖的第二疫苗；或(b4)含有各自缀合至CRM197载体的肺炎球菌和脑膜炎球菌荚膜糖的疫苗中的一种共同免疫婴儿的步骤。
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