JP5914512B2 - ヒトワクチンとしての使用に適するジフテリアトキソイドの生成のための動物由来成分を含まない発酵培地 - Google Patents
ヒトワクチンとしての使用に適するジフテリアトキソイドの生成のための動物由来成分を含まない発酵培地 Download PDFInfo
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Description
本発明は、Corynebacterium diphtheriaeを培養するための発酵培地に関する。本発明はまた、培養されているC.diphtheriae細菌からジフテリア毒素を得るためのプロセスにおける上記発酵培地の使用、上記プロセスにおいて得られるジフテリア毒素を使用するワクチンの調製、および上記毒素自体に関する。本発明はさらに、例えば、ワクチンに含めるために、上記毒素からジフテリアトキソイドを調製するための精製および無毒化プロセスに関する。
Corynebacterium diphtheriaeは、ジフテリアを引き起こす。上記細菌は、毒性タンパク質であるジフテリア毒素を生成し、上記毒素は、(例えば、ホルマリンもしくはホルムアルデヒドを使用して)処理されて、注射後に防御的抗毒素抗体を誘導する能力を維持しながら、毒性が除去され得る。この処理は、「無毒化」もしくは「トキソイド化(toxoiding)」といわれ、無毒化された毒素は、「トキソイド」といわれる。ジフテリアトキソイドは、ジフテリアワクチンにおいて使用され、書籍「Vaccines」[1]の第13章およびNew Generation Vaccines[2]の第31章においてより詳細に記載されている。
A.発酵培地
本発明は、Corynebacterium diphtheriaeを培養するための種々の培地を提供する。これら培地は、少なくとも300リットルの生成容積を有する発酵槽において産業スケールでのジフテリア毒素生成を可能にし、収量は、一貫して、200Lf/mL〜250Lf/mL(もしくはこれより高い)の範囲にある。本明細書で開示される培地およびプロセスは、ジフテリア毒素を生成するにあたって動物由来の培地で達成される収量をさらに超え得る。
(i)窒素源として鉄分除去した酵母抽出物;
(ii)炭素源として0.08M〜0.16Mの間の還元ジサッカリド(例えば、セロビオースもしくはマルトース);
(iii)鉄源としてゲル様沈殿物の形態にある10〜14μM 可溶性Fe2+/Fe3+;
(iv)マグネシウム、銅、亜鉛、マンガン、ピメリン酸、ニコチン酸およびβ−アラニンを含む増殖因子の混合物;
(v)水、
を含む。
本発明は、本発明の発酵培地を調製するためのプロセスをさらに提供し、上記プロセスは、水に、(i)窒素源、(ii)炭素源、および(iii)鉄補充物を添加する工程を包含する。
本発明は、Corynebacterium diphtheriaeを増殖させるためのプロセスをさらに提供し、上記プロセスは、Corynebacterium diphtheriaeのある株を、本発明の発酵培地で培養する工程を包含する。
本発明は、ジフテリアトキソイドを生成するための種々のプロセスを提供する。これらのプロセスは、理想的には、無毒化する前に精製を含み、それによって、上記トキソイドへの培地成分の架橋を最小限にするかもしくは回避する。酵母抽出物を、上記培養培地中で使用した場合に、上記プロセスは、適切な無毒化剤(好ましくは、ホルムアルデヒド)で処理する前に、大部分の(理想的には、すべての)残留酵母抽出物成分を上記ジフテリア毒素から除去するべきである。それによって、上記ジフテリアトキソイドへの潜在的にアレルギー性の酵母成分の架橋が回避される。高純度の最終ジフテリアトキソイドはまた、有利である。なぜなら、保存剤の添加が回避され得、このことは、ワクチン接種の間の有害反応の可能性をさらに低下させるからである。
(i)ジフテリア毒素もしくはその誘導体を発現するCorynebacterium diphtheriaeのある株の培養物を、以下:
窒素源;
少なくとも0.08Mの炭素源;
1.5μM〜30μM 可溶性Fe2+/Fe3+;
リン;および
増殖因子、
を含む、動物由来成分を含まない少なくとも100Lの発酵培地中で調製する工程;
(ii)上記培養物を、好気性条件において、上記発酵培地中で少なくとも140Lf/mLの濃度の上記ジフテリア毒素もしくは上記誘導体へと増殖させる工程;
(iii)上記ジフテリア毒素もしくは上記誘導体を、上記発酵培地から分離する工程であって、ここで上記分離工程は、遠心分離工程および濾過工程を包含する工程;
(iv)工程(iii)において得られる上記ジフテリア毒素もしくは上記誘導体を、アニオン交換クロマトグラフィーを使用して精製して、精製されたジフテリア毒素もしくは誘導体を含む溶液を得る工程;
(v)上記溶液中の上記精製されたジフテリア毒素もしくは誘導体の濃度を、少なくとも2000Lf/mLへと調節して、ジフテリア毒素濃縮物を得る工程;
(vi)上記濃縮物に、(a)0.025M以下の終濃度までのアミンおよび(b)0.5〜1%(例えば、0.75〜1%)の範囲の終濃度までの適切な無毒化剤(好ましくは、ホルマリン)を添加する工程;ならびに
(vii)工程(vi)からの上記濃縮物をインキュベートして、上記ジフテリアトキソイドを得る工程、
を包含する。
本発明のプロセスは、現在生成されているものよりヒトワクチンとしての使用により良好に適したジフテリアトキソイドを提供する。上記トキソイドは、公知のトキソイドとは、例えば、それらの架橋によって、架橋された培地成分がないことによって、効力によって、および/もしくは純度によって、分析的に区別される。好ましい実施形態において、本明細書で開示されるプロセスによって得られるジフテリアトキソイドは、ホルムアルデヒドで架橋された動物由来成分を含まず、好ましくは、すべての架橋された動物由来成分を含まない。
(i)低マンナン酵母抽出物を水に溶解して、酵母抽出物溶液を得る工程、上記酵母抽出物溶液から鉄分除去して、鉄分除去した酵母抽出物溶液を得る工程、上記鉄分除去した酵母抽出物溶液を、30kDaより大きい分子量カットオフを有する膜を使用して限外濾過する工程、および50g/Lのマルトース、増殖因子溶液および10〜14μMの間の濃度のFe(III)の塩を、上記鉄分除去した酵母抽出物溶液に添加して、上記発酵培地を調製する工程によって、動物由来成分を含まない発酵培地を調製する工程であって、ここで上記Fe(III)の塩は、ホスフェートおよびカルシウム塩と組み合わせて添加されて、鉄の緩慢放出処方物の形成を促進する工程;
(ii)ジフテリア毒素を発現するCorynebacterium diphtheriaeのある株の培養物を、少なくとも100Lの上記発酵培地で調製する工程;
(iii)上記培養物を、上記発酵培地中で少なくとも140Lf/mLの濃度の上記ジフテリア毒素へと増殖させる工程;
(iv)上記ジフテリア毒素を上記発酵培地から遠心分離によって分離して、ジフテリア毒素溶液を得る工程;
(v)上記ジフテリア毒素溶液を濾過滅菌して、滅菌ジフテリア毒素を得る工程;
(vi)上記滅菌ジフテリア毒素を精製して、精製されたジフテリア毒素を得る工程;
(vii)適切な無毒化剤(好ましくは、ホルムアルデヒド)を上記精製されたジフテリア毒素に添加する工程;ならびに
(viii)工程(ix)からの上記精製されたジフテリア毒素をインキュベートして、上記ジフテリアトキソイドを得る工程。
(i)ジフテリア毒素を発現するCorynebacterium diphtheriaeのある株の培養物を、動物由来成分および30kDaより大きい分子量を有する成分を含まない、少なくとも100Lの発酵培地で調製する工程であって、ここで上記発酵培地は、(a)水、(b)鉄分除去した低マンナン酵母抽出物、(c)50g/Lのマルトース、(d)マグネシウム、銅、亜鉛、マンガン、ピメリン酸、ニコチン酸およびβ−アラニンを含む増殖因子溶液、(e)10〜14μMの間の出発濃度のクエン酸鉄(III)アンモニウム、ならびに(f)ホスフェートを含む工程;
(ii)上記培養物を、好気性条件下、上記発酵培地中で少なくとも200Lf/mLの濃度の上記ジフテリア毒素へと増殖させる工程;
(iii)上記ジフテリア毒素を上記発酵培地から遠心分離によって分離して、ジフテリア毒素溶液を得る工程;
(iv)上記ジフテリア毒素溶液を濾過滅菌して、滅菌ジフテリア毒素を得る工程;
(v)上記滅菌ジフテリア毒素を精製して、精製されたジフテリア毒素を得る工程;
(vi)上記精製されたジフテリア毒素を、上記発酵培地中の上記ジフテリア毒素の濃度に対して少なくとも20倍濃縮して、ジフテリア毒素濃縮物を得る工程;
(vii)ホルムアルデヒドおよびリジンを上記ジフテリア毒素濃縮物に添加する工程;ならびに
(viii)上記ジフテリア毒素濃縮物を、ホルムアルデヒドおよびリジンの存在下でインキュベートして、上記ジフテリアトキソイドを得る工程。
(i)ジフテリア毒素を発現するCorynebacterium diphtheriaeのある株の培養物を発酵培地で増殖させる工程;
(ii)上記ジフテリア毒素を、上記発酵培地からアニオン交換クロマトグラフィーを使用して精製して、少なくとも2000Lf/mg窒素を有する精製されたジフテリア毒素を含む溶液を得る工程;
(iii)上記溶液中の上記精製されたジフテリア毒素の濃度を、5000Lf/mLへとダイアフィルトレーションを使用して調節して、ジフテリア毒素濃縮物を得る工程;
(iv)上記濃縮物に、(a)0.025Mの終濃度までのリジンおよび(b)1%の終濃度までのホルマリンを添加する工程;
(v)上記工程からの濃縮物をインキュベートして、ジフテリアトキソイド濃縮物を得る工程;
(vi)上記ジフテリアトキソイド濃縮物を滅菌濾過して、滅菌溶液を得る工程;
(vii)上記滅菌溶液中の上記ジフテリアトキソイドの濃度を、10000Lf/mLへとダイアフィルトレーションを使用して調節して、濃縮溶液を得る工程;ならびに
(viii)上記濃縮溶液のpHをpH7.5へと調節して、ヒトでのワクチン接種における使用に適したジフテリアトキソイドを得る工程。
本発明は、ホルムアルデヒドで架橋された動物由来成分を含まず(および好ましくは、すべての架橋された動物由来成分を含まず)かつ少なくとも60 IU/mlの効力を有するジフテリアトキソイドを含むヒトでのワクチン接種に適した組成物を提供する。同様に、本発明は、ヒトでのワクチン接種に適した組成物を提供し、上記組成物は、動物由来成分を含まない培養培地で増殖し、かつ少なくとも60 IU/mlの効力を有する、Corynebacterium diphtheriaeから精製されたジフテリアトキソイドを含む。一実施形態において、上記組成物は、3:1〜10:1の範囲の、好ましくは、3:1〜6:1(もしくは4:1〜9:1)の範囲の上記ジフテリアトキソイドのモノマー:ダイマー比を有し、上記ジフテリアトキソイドは、4.0〜5.0の範囲の等電点を有し得る。別の実施形態において、上記トキソイドのうちの少なくとも70%は、モノマー形態にある。さらなる実施形態において、上記組成物は、Corynebacterium diphtheriae以外の少なくとも1種の病原体に由来する防御抗原を含む。例えば、上記防御抗原は、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)、破傷風抗原、百日咳抗原、H.influenzae B型莢膜サッカリド、N.meningitidis莢膜サッカリド、S.pneumoniae莢膜サッカリド、およびIPVから選択され得る。
%モノマー=面積モノマー/(面積ダイマー+面積モノマー)×100
1つの具体的実施形態において、本発明は、ヒトでのワクチン接種に適した組成物を提供し、上記組成物は、ホルムアルデヒドで架橋された動物由来成分を含まない(および好ましくは、すべての架橋された動物由来成分を含まない)ジフテリアトキソイドおよびCorynebacterium diphtheriae以外の病原体に由来する少なくとも1種の防御抗原を含む。別の具体的実施形態において、本発明は、ヒトでのワクチン接種に適した組成物を提供し、上記組成物は、ホルムアルデヒドで架橋された動物由来成分を含まず(および好ましくは、すべての架橋された動物由来成分を含まず)かつ3:1〜8:1の範囲の、より好ましくは、3:1〜6:1の範囲のモノマー:ダイマー比を有するジフテリアトキソイドを含み、ここで上記ジフテリアトキソイドは、5.0〜4.0の範囲の等電点を有する。さらなる具体的実施形態において、本発明は、ヒトでのワクチン接種に適した組成物を提供し、上記組成物は、ホルムアルデヒドで架橋された動物由来成分を含まない(および好ましくは、すべての架橋された動物由来成分を含まない)ジフテリアトキソイドを含み、ここで上記ジフテリアトキソイドのうちの少なくとも70%は、モノマー形態にある。
さらなる局面において、本発明は、ヒトでのワクチン接種に適した組成物を調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、(i)ホルムアルデヒドで架橋された動物由来成分を含まない(および好ましくは、すべての架橋された動物由来成分を含まない)ジフテリアトキソイド;(ii)動物由来成分を含まないHBsAg;(iii)動物由来成分を含まないH.influenzae B型莢膜サッカリド;および(iv)動物由来成分を含まないN.meningitidis莢膜サッカリド、を合わせる工程を包含する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
ヒトでのワクチン接種に適した組成物であって、該組成物は、少なくとも1500Lf/mg ジフテリアトキソイドタンパク質窒素の比純度を有し、そして/または少なくとも60 IU/mlの効力を有する、動物由来成分を含まない架橋されたジフテリアトキソイドを含む、組成物。
(項目2)
前記ジフテリアトキソイドは、4.0〜5.0の範囲の等電点を有し、該ジフテリアトキソイドのうちの少なくとも70%は、モノマー形態にある、項目1に記載の組成物。
(項目3)
前記ジフテリアトキソイドのモノマー:ダイマー比は、3:1〜8:1の範囲にある、項目1に記載の組成物。
(項目4)
Corynebacterium diphtheriae以外の少なくとも1種の病原体に由来する防御抗原をさらに含む、項目1〜3に記載の組成物。
(項目5)
前記非ジフテリア防御抗原は、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)、破傷風トキソイド、百日咳抗原、結合体化H.influenzae B型莢膜サッカリド、結合体化N.meningitidis莢膜サッカリド、結合体化S.pneumoniae莢膜サッカリド、および/または不活性化ポリオウイルスから選択される、項目4に記載の組成物。
(項目6)
前記HBsAgは、動物由来成分を含まない、項目5に記載の組成物。
(項目7)
前記H.influenzae B型莢膜サッカリドは、動物由来成分を含まない、項目5または6に記載の組成物。
(項目8)
前記N.meningitidis莢膜サッカリドは、動物由来成分を含まない、項目5〜7のいずれか1項に記載の組成物。
(項目9)
前記組成物は、以下:
からなる、項目5〜8のいずれかに記載の組成物。
(項目10)
ヒトワクチンの製造に適した組成物であって、ここで該組成物は少なくとも5Lの容積を有し、動物由来成分を含まない架橋されたジフテリアトキソイドを含み、少なくとも1500Lf/mg タンパク質窒素の比純度を有し、ここで該ジフテリアトキソイドは、少なくとも500Lf/mLの濃度で存在し、そして/または少なくとも2000 IU/mlの効力を有する、組成物。
(項目11)
項目4〜9のいずれか1項に記載の組成物を作製するためのプロセスであって、ここで該プロセスは、少なくとも1500Lf/mg タンパク質窒素の比純度を有する動物由来成分を含まない架橋されたジフテリアトキソイドと、Corynebacterium
diphtheriae以外の少なくとも1種の病原体に由来する防御抗原とを混合する工程を包含する、プロセス。
(項目12)
少なくとも1000単回単位用量の混合ワクチンを調製するためのプロセスであって、該プロセスは、
(i)動物由来成分を含まずかつ少なくとも1500Lf/mg タンパク質窒素の比純度を有する架橋されたジフテリアトキソイドと、Corynebacterium diphtheriae以外の少なくとも1種の病原体に由来する防御抗原とを混合して、該混合ワクチンを得る工程;
(ii)該混合ワクチンを少なくとも1000単回単位用量に分ける工程;
を包含し、ここで各単回単位用量は、ヒトでの注射に適しており、かつ少なくとも20 IUの該ジフテリアトキソイドを含む、プロセス。
(項目13)
単位用量形態において混合ワクチンを調製するためのプロセスであって、該プロセスは、
(i)ジフテリアトキソイドバルクと、1種以上の非ジフテリア抗原のバルクとを、および必要に応じて、水性希釈剤とを混合して、バルク混合ワクチンを得る工程;ならびに
(ii)少なくとも1000単位用量の該混合ワクチンを、該バルク混合ワクチンから調製する工程、
を包含し、ここで
(a)各単位用量は、ヒトでの注射に適しており、かつ少なくとも20 IUの該ジフテリアトキソイドを含み、
(b)該ジフテリアトキソイドバルクは、架橋されたジフテリアトキソイドを含み、該架橋されたジフテリアトキソイドは、動物由来成分を含まず、少なくとも1500Lf/mg タンパク質窒素の比純度を有し、少なくとも2000 IU/mlの効力を有する、プロセス。
(項目14)
ヒトでの使用のためのワクチンを調製するためにジフテリアトキソイドを生成するためのプロセスであって、該プロセスは、
(i)ジフテリア毒素を発現するCorynebacterium diphtheriaeのある株の培養物を、以下:
鉄分除去した酵母抽出物;
少なくとも0.08Mのサッカリド;
1.5μM〜30μM 可溶性Fe 2+ /Fe 3+ ;
リン;および
増殖因子、
を含むが、動物由来成分を含まない、少なくとも100Lの発酵培地中で調製する工程;
(ii)好気性条件において、該培養物を、該発酵培地中で少なくとも140Lf/mLの該ジフテリア毒素の濃度まで増殖させる工程;
(iii)該ジフテリア毒素を該発酵培地から分離する工程;
(iv)無毒化剤を該工程(iii)において得られたジフテリア毒素に添加する工程;ならびに
(v)得られた溶液をインキュベートして、該ジフテリアトキソイドを得る工程;
を包含し、ここで該プロセスは、精製工程をさらに包含し、ここで該精製工程は、該無毒化剤を添加する前に、該工程(iii)において得られたジフテリアトキソイドに適用されるか、または該ジフテリアトキソイドに適用されるかのいずれかである、プロセス。
(項目15)
前記濃度は、少なくとも200Lf/mLの前記ジフテリア毒素もしくはその誘導体である、項目14に記載のプロセス。
(項目16)
前記濃度は、少なくとも250Lf/mLの前記ジフテリア毒素もしくはその誘導体である、項目14に記載のプロセス。
(項目17)
前記酵母抽出物は、対応する野生型株より少なくとも30%少ないマンナンを含む酵母株を使用して調製される、項目14〜16のいずれか1項に記載のプロセス。
(項目18)
前記酵母抽出物は、前記発酵培地を調製する前に、限外濾過されて、マンナンおよび他のポリサッカリドが既に除去されている、項目14〜16のいずれか1項に記載のプロセス。
(項目19)
前記サッカリドは、ジサッカリドである、項目14〜18のいずれか1項のプロセス。
(項目20)
前記ジサッカリドは、0.08M〜0.16Mの間の濃度で存在する、項目18に記載のプロセス。
(項目21)
前記鉄補充物は、Fe(III)の塩である、項目14〜20のいずれか1項に記載のプロセス。
(項目22)
前記発酵培地は、前記Fe(III)の塩を、ホスフェートおよびカルシウム塩と組み合わせて添加して、鉄の緩慢放出処方物の形成を促進することによって調製される、項目21に記載のプロセス。
(項目23)
前記工程(iii)において得られたジフテリア毒素は、少なくとも85%の純度まで精製される、項目14〜22のいずれか1項に記載のプロセス。
(項目24)
前記工程(iii)において得られたジフテリア毒素もしくは前記ジフテリアトキソイドは、少なくとも1500Lf/mg タンパク質窒素まで精製される、項目14〜22のいずれか1項に記載のプロセス。
(項目25)
前記無毒化剤を添加する前の前記ジフテリア毒素の濃度は、少なくとも2000Lf/mLに調節される、項目14〜24のいずれか1項に記載のプロセス。
(項目26)
前記無毒化剤は、0.75〜1%の範囲の終濃度のホルマリンであり、インキュベーションは、0.025M以下の終濃度のアミノ酸の存在下で行う、項目14〜25のいずれか1項に記載のプロセス。
(項目27)
前記アミノ酸は、グリシンもしくはリジンである、項目26に記載のプロセス。
(項目28)
アジュバント、キャリアおよび/もしくは賦形剤を、前記ジフテリアトキソイドに添加する工程をさらに包含する、項目14〜27のいずれか1項に記載のプロセス。
(項目29)
Corynebacterium diphtheriae以外の少なくとも1種の病原体に由来する防御抗原を、前記ジフテリアトキソイドに添加する工程をさらに包含する、項目14〜28のいずれか1項に記載のプロセス。
(項目30)
項目14〜27のいずれか1項に記載のプロセスによって得られるヒトでのワクチン接種における使用のためのジフテリアトキソイドであって、ここで該ジフテリアトキソイドは、無毒化剤によって、発酵培地のうちの少なくとも1つの成分に架橋されている、ジフテリアトキソイド。
(項目31)
項目14〜27のいずれか1項に記載のプロセスによって得られる、ジフテリアトキソイド。
(項目32)
項目30または31に記載のジフテリアトキソイドを含む、ヒトでのワクチン接種に適した組成物。
(項目33)
ヒトでの使用のためのワクチンを調製するためのジフテリアトキソイドを生成するためのプロセスであって、該プロセスは、
(i)ジフテリア毒素を発現するCorynebacterium diphtheriaeのある株の培養物を、発酵培地で増殖させる工程;
(ii)該ジフテリア毒素を該発酵培地から精製して、ジフテリア毒素溶液を得る工程;
(iii)該ジフテリア毒素溶液中のジフテリア毒素の濃度を、少なくとも2000Lf/mLに調節して、濃縮溶液を得る工程;
(iv)該濃縮溶液に無毒化剤を添加する工程;および
(v)得られた溶液をインキュベートして、該ジフテリアトキソイドを得る工程、
を包含する、プロセス。
(項目34)
前記工程(ii)において得られたジフテリア毒素は、少なくとも1500Lf/mg タンパク質窒素の比純度を有する、項目33に記載のプロセス。
(項目35)
前記発酵培地は、動物由来成分を含まない、項目33または34に記載のプロセス。
(項目36)
前記発酵培地は、動物由来成分を含む、項目33または34に記載のプロセス。
(項目37)
前記無毒化剤は、0.75〜1%の範囲の終濃度のホルマリンであり、インキュベーションは、0.025M以下の終濃度のアミノ酸の存在下で行う、項目33〜36のいずれか1項に記載のプロセス。
(項目38)
前記アミノ酸は、グリシンもしくはリジンである、項目37に記載のプロセス。
(項目39)
項目33〜38のいずれか1項に記載のプロセスによって得られる、ジフテリアトキソイド。
(発酵培地)
一局面において、本発明は、ジフテリア毒素もしくはその誘導体を生成するためのC.diphtheriaeのある株を培養するのに適した発酵培地に関する。細菌増殖を支援するために、上記培地は、窒素源、炭素源、リン源、および増殖因子を含むべきである。上記細菌による毒素生成を支援するために、上記培地は、適切な鉄源を含むべきである。
本発明の発酵培地の窒素源は、好ましくは、酵母抽出物である。酵母抽出物は、一般に、一次酵母の無塩自己消化およびその後の徹底的な精製によって得られる。このことは、上記酵母抽出物を所望でない成分(例えば、胞子およびDNA)を含まないようにする。
種々の炭素源が、C.diphtheriaeを増殖させるために使用されてきた(グルコースおよびグリセロールが挙げられる)。別個の炭素源の添加は、炭素含有窒素源が使用される場合には絶対的に必要なわけではない(C.diphtheriaeは、アミノ酸から炭素を同化し得る)が、さらなる炭素源が存在する場合には、増殖速度は、発酵の間に遙かに大きい。
ホスフェートの形態にあるリンは、多くの生体分子の必須成分である。例えば、DNA、RNAおよび細胞膜を形成するリン脂質は、ホスフェートを含む。従って、リンは、本発明の発酵培地の必須成分である。酵母抽出物が窒素源として使用されるのであれば、上記発酵培地へのリンの添加は、代表的には、不要である。なぜなら、酵母抽出物は、例えば、ヌクレオチドおよびリン脂質の形態でホスフェートの十分な供給源を含むからである。
発酵槽におけるC.diphtheriaeの迅速な増殖の間に、上記発酵の特定の成分は、律速になり得る。これらの成分を発酵培地に補充することによって、ジフテリア毒素の収量は、さらに改善され得る。従って、これらの成分は、一般には「増殖因子」といわれる。
培養培地における高い鉄濃度は、C.diphtheriaeの増殖の間に上記ジフテリア毒素の発現を阻害する。従って、上記培地から過剰な鉄を除去することは、C.diphtheriaeの発酵の間に高収量の毒素生成を与えるために必要である。培養培地から鉄分除去するための方法は、例えば、StainerおよびScholte[14]によって記載されるように、一般に当業者に公知である。例えば、鉄は、酵母抽出物溶液から、上記溶液中に存在する鉄を沈殿させ、その沈殿物を遠心分離および/もしくは限外濾過によって除去することによって、除去され得る。
発酵培地は、液体培地としてもしくは固体培地として調製され得る。あるいは、上記発酵培地は、乾燥粉末として調製され得る。一実施形態において、固体培地は、アガーを液体培地に添加することによって調製され得る。本発明に従って調製される固体培地は、C.diphtheriaeのマスターシードバンクを調製するために特に有用である。上記マスターシードは、ワーキングシードを調製するために使用されうる。次に、上記ワーキングシードを使用して、多量のC.diphtheriaeを増殖させて、ワクチンに使用するためのジフテリア毒素の調製するために、本発明の発酵培地に接種する。
一局面において、本発明は、本発明の発酵培地を調製するためのプロセスに関する。一実施形態において、本発明の発酵培地を調製するためのプロセスは、水に(もしくは別の水性液体に)窒素源および炭素源を添加する工程を包含する。窒素源として使用される材料の鉄レベルに依存して、上記プロセスはまた、鉄補充物を添加する工程を包含する。さらに、上記プロセスは、増殖因子およびリンを添加する工程を包含し得る。
発酵培地は、C.diphtheriaeを増殖させるためのプロセスにおいて使用され得、上記プロセスは、本発明の発酵培地でC.diphtheriaeのある株を培養する工程を包含する。種々のジフテリア毒素生成C.diphtheriae株は、本発明を実施するにあたって使用され得る。C.diphtheriae株 Park−Williamns no.8(PW8)は、多量のジフテリア毒素を例外的に生成し、代表的には、ワクチン生成において、ジフテリア毒素を得るために使用される[15]。この株は、本発明の発酵培地を使用する場合に、高収量のジフテリア毒素を達成するのに特に適している。
本発明の特定の局面において、ジフテリアトキソイドを調製するために使用される上記ジフテリア毒素は、無毒化工程の前に精製される。トキソイド化する前に上記ジフテリア毒素を精製することは、無毒化の間に、上記ジフテリア毒素への上記発酵培地由来の成分(例えば、タンパク質および/もしくはペプチド)の架橋を低下させる。培地成分の架橋は不利である。なぜなら、このことから、均一性の低い(less homogenous)生成物がもたらされ(これは、品質管理の間に問題をもたらし得る)、上記トキソイド中にアレルゲンを捕捉する可能性を有するからである。無毒化の前に上記ジフテリア毒素を精製することは、これら欠点を低減もしくは回避する。無毒化前の精製(pre−detoxification purification)と組み合わせて、培養培地において動物由来成分を避けることは、非常に高純度の強力なトキソイドを与える。無毒化前の精製が使用された場合[10]ですら、C.diphtheriae培養培地からの残留動物由来成分はなお、このような架橋された材料が慣用的な分析アッセイによって容易に検出可能であるとは限らないとしても、トキソイド化の間に上記毒素へ共有結合的に架橋される。
本発明は、「ジフテリア毒素もしくはその誘導体」への言及によって、本明細書で定義される。このような誘導体は、ジフテリア毒素と免疫学的に交差反応性であるものであり、すなわち、モルモットに投与される場合、上記誘導体は、ジフテリア毒素と交叉反応する抗体を誘発する。多くのこのような誘導体は、当該分野で公知であり、しばしば、番号づけられた「CRM」タンパク質(交叉反応材料)(例えば、CRM9、CRM45、CRM102、CRM103、CRM107)といわれる[8]。代表的には、このような誘導体は、野生型毒素とはわずか数個(例えば、1個、2個、3個、4個もしくは5個)のアミノ酸変異(単一アミノ酸挿入、置換もしくは欠失)によって異なるジフテリア毒素変異体であるが、短縮変異体(例えば、CRM45)もまた、公知である。これら変異は、成熟毒素のAおよび/もしくはBサブユニット中に存在し得る(上記Aサブユニットは、上記毒素の酵素活性を担うのに対して、上記Bサブユニットは、標的宿主細胞への結合を担う)。
一局面において、本発明は、ジフテリア毒素を無毒化して、ジフテリアトキソイドを調製するためのプロセスに関する。一実施形態において、本発明は、ジフテリアトキソイドを調製するためのプロセスに関し、ここで上記プロセスは、(i)ジフテリア毒素を発現するC.diphtheriaeのある株の培養物を、動物由来成分を含まない発酵培地で増殖させる工程、(ii)上記ジフテリア毒素を上記発酵培地から精製して、精製されたジフテリア毒素を得る工程、(iii)適切な無毒化剤(好ましくは、ホルムアルデヒド)を上記精製されたジフテリア毒素に添加する工程、ならびに(iv)上記精製されたジフテリア毒素を、上記無毒化剤(好ましくは、ホルムアルデヒド)の存在下でインキュベートして、上記ジフテリアトキソイドを得る工程を包含する。
無毒化の間の上記ジフテリア毒素もしくは誘導体の濃度は、ワクチン生成のための多量のジフテリアトキソイドを提供する合理化されかつ効率的な産業プロセスを提供するにあたって、特に重要である。安全性が理由で、無毒化は、一般に、6週間の期間にわたって行われる。従って、無毒化工程の間に容積が大きいと、さらなる貯蔵空間を必要とする。さらに、無毒化は、インキュベーター中で36±2℃で行われる。従って、小容積を使用することは、上記無毒化プロセスの間に使用されるエネルギーを徹底的に低下させる。上記無毒化工程の間の上記ジフテリア毒素もしくは上記誘導体の濃度が高くなるほど、無毒化に使用され得る容積が小さくなる。濃度に起因して容積が20倍低下することは、300L インキュベーターからの上記ジフテリア毒素もしくは誘導体が、20Lボトルにおいて容易に処理され得るということを意味する。従って、精製後に得られた上記精製されたジフテリア毒素バルクは、好ましくは、無毒化前に濃縮される。
適切な無毒化剤(例えば、ホルムアルデヒド)での無毒化の間にアミンを含めることは、ジフテリア毒素が架橋してマルチマー複合体を与えることを防ぎ得る。しかし、高濃度のアミンは、一般に、上記無毒化剤のより高い濃度を必要とする。従って、無毒化剤(例えば、ホルムアルデヒド)の毒性に起因して、トキソイド化の間のアミンの濃度を低くすることは好ましい。なぜならこのことは、より少ない無毒化剤の使用、および、よって、ワクチン生成の間に毒性廃棄物のより少量の生成を生じるからである。
ジフテリア毒素の毒性に起因するワクチン接種の間の有害反応を防止するために、毒性は、例えば、適切な無毒化剤の存在下で上記ジフテリア毒素濃縮物をインキュベートすることによって破壊される。高すぎる濃度の無毒化剤が使用される場合、上記ジフテリアトキソイドバルクで調製される最終ワクチンは、ヒトでの使用には受け入れられない上記無毒化剤のレベルを含み得る。従って、ヒトワクチンを製造することにおける使用に適したジフテリアトキソイドバルクを調製するためには、上記無毒化剤の特定の濃度範囲のみが受け入れられ得る。
本発明に従ってジフテリアトキソイドを調製するためのプロセスは、1回以上の濾過滅菌工程をさらに包含し得る。一実施形態において、無毒化のために使用される上記ジフテリア毒素濃縮物は、適切な無毒化剤(好ましくは、ホルムアルデヒド)の添加の前に、濾過滅菌される。別の実施形態において、本発明の無毒化プロセスから生じる上記ジフテリアトキソイドは、濾過滅菌される。さらなる実施形態において、上記ジフテリア毒素濃縮物および上記ジフテリアトキソイドの両方が、濾過滅菌される。上記ジフテリアトキソイドの調製の間に1回以上の濾過滅菌工程を適用することは、汚染する細菌増殖を防止するための保存剤の使用を回避し得るという利点を有する。保存剤の回避は、本発明のジフテリアトキソイドを含むワクチンがヒトに投与される場合に、上記保存剤によって引き起こされる有害反応を防ぎ得る。保存剤が、貯蔵のために上記ジフテリアトキソイドに添加される場合、フェノール以外の保存剤が好ましい。好ましい実施形態において、上記ジフテリアトキソイドには、保存剤は添加されない。
本明細書で開示されるジフテリア毒素もしくは誘導体を無毒化するためのプロセスを使用することは、先行技術において調製されたトキソイドより高い純度であるジフテリアトキソイドの提供を生じる。特に、本発明の方法によって生成されるジフテリアトキソイドは、架橋された動物由来成分を含まない。上記発酵培地および上記無毒化手順における動物由来成分の回避は、上記最終材料が、動物由来成分を完全に含まないので、このような成分が、トキソイド化の間に上記毒素へと共有結合的に架橋され得ないことを意味するのに対して、動物由来成分を含む培地での増殖後に生成された先行技術のトキソイドは、架橋された動物由来成分が慣用的な分析アッセイによって容易に検出され得ないとしても、これら架橋された動物由来成分を必然的に含む。従って、本発明のこれらトキソイドは、それらがプリオンなどのような材料を含まない均質な組成を有するので、有利である。
本発明はまた、本発明のジフテリアトキソイドを含むか、または本発明のジフテリアトキソイドを使用するプロセスによって作製されるワクチン組成物を包含する。これら組成物において、上記ジフテリアトキソイドの効力は、単回単位用量あたり、少なくとも20 IUであるべきである。代表的な組成物において、上記ジフテリアトキソイドの効力は、少なくとも25IU/用量(例えば、少なくとも50IU/ml)である。本発明のワクチン組成物は、動物由来成分を含む培地から調製されるジフテリアトキソイドを含むワクチン組成物に対して以前に有害反応を示した患者に投与するために特に適している。本発明のワクチン組成物はまた、有害なアレルギー反応を発症するリスクがある患者への投与に適している。これは、動物由来成分にアレルギーを有すると診断された患者(例えば、牛肉アレルギーもしくは牛乳アレルギーを有する患者)を含む。
Clostridium tetaniは、破傷風を引き起こす。破傷風毒素は、防御トキソイドを与えるために処理され得る。上記トキソイドは、破傷風ワクチンにおいて使用され、参考文献1の第27章においてより詳細に開示される。従って、本発明の混合ワクチンは、破傷風トキソイドを含み得る。好ましい破傷風トキソイドは、ホルムアルデヒド処理によって調製されるものである。上記破傷風トキソイドは、増殖培地(例えば、ウシカゼインから得られるLatham培地)でC.tetaniを増殖させ、続いてホルムアルデヒド処理、限外濾過および沈殿によって得ることができる。次いで、上記材料は、滅菌濾過および/もしくは透析を含むプロセスによって処理され得る。
Bordetella pertussisは、百日咳を引き起こす。ワクチン中の百日咳抗原は、細胞性(全細胞(不活性化B.pertussis細胞の形態にある):「wP」)もしくは無細胞性(「aP」)のいずれかである。従って、本発明の混合ワクチンは、細胞性百日咳抗原もしくは無細胞性百日咳抗原を含み得る。
Haemophilus inflienzae b型(「Hib」)は、細菌性髄膜炎を引き起こす。Hibワクチンは、代表的には、莢膜サッカリド抗原に基づいており(例えば、参考文献1の第14章)、その調製は、十分に記録されている(例えば、参考文献25〜34)。上記H.influenzae細菌は、動物由来成分の非存在下で培養され得る。上記Hibサッカリドは、特に小児において、その免疫原性を増強するために、キャリアタンパク質に結合体化される。これらの結合体における代表的なキャリアタンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ジフテリア毒素のCRM197誘導体、もしくは血清群B髄膜炎菌由来の外膜タンパク質複合体である。従って、本発明の混合ワクチンは、キャリアタンパク質に結合体化されたHib莢膜サッカリドを含み得る。
Neisseria menigitidisは、細菌性髄膜炎を引き起こす。その生物の莢膜ポリサッカリドに基づいて、N.meningitidisの種々の血清群が、同定されてきた(A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、YおよびZが挙げられる)。上記N.meningitidis細菌は、動物由来成分の非存在下で培養され得る。疾患と最も関連する血清群は、A、B、C、W135およびYである。血清群A、C、W135およびYに対する現在のワクチンは、莢膜サッカリド抗原に基づいているが、このアプローチは、血清群Bに関しては適切でないので、タンパク質抗原および外膜小胞が代わりに使用される[36]。上記莢膜サッカリドは、免疫原性を増強するために、キャリアタンパク質に結合体化される。代表的なキャリアタンパク質は、破傷風トキソイド(NIMENRIXTM製品におけるように)、ジフテリアトキソイド(MENACTRATM製品におけるように)、およびジフテリア毒素のCRM197誘導体(MENVEOTM製品におけるように)である。従って、本発明の混合ワクチンは、以下から選択される、キャリアタンパク質に結合体化された1種以上の(例えば、2種、3種、もしくは4種)莢膜サッカリドを含み得る:(1)血清群A N.meningitidis;(2)血清群C N.meningitidis;(3)血清群W135 N.meningitidis;および/もしくは(4)血清群Y N.meningitidis。
Streotococcus pneumoniaeは、細菌性髄膜炎を引き起こす。Hibおよび髄膜炎菌のように、現存のワクチンは、莢膜サッカリドに基づく。上記S.pneumoniae細菌は、動物由来成分の非存在下で培養され得る。従って、本発明の混合ワクチンは、キャリアタンパク質に結合体化された肺炎球菌莢膜サッカリドを含み得る。
B型肝炎ウイルス(HBV)は、ウイルス性肝炎の原因である。HBVビリオンは、外側タンパク質コートもしくはカプシドによって囲まれた内側のコアからなり、上記ウイルスコアは、ウイルスDNAゲノムを含む。上記カプシドの主要成分は、HBV表面抗原もしくはより一般には、「HBsAg」として公知のタンパク質であり、これは、代表的には、分子量約24kDaを有する226アミノ酸のポリペプチドである。全ての現存のB型肝炎ワクチンは、HBsAgを含み、この抗原が、正常な、ワクチン接種を受けたヒト(vaccinee)に投与される場合には、これは、HBV感染を防御する抗HBsAg抗体の生成を刺激する。従って、本発明の混合ワクチンは、HBsAgを含み得る。
ポリオウイルスは、灰白髄炎を引き起こす。不活性化ポリオウイルスワクチン(IPV)は、参考文献1の第24章においてより詳細に開示されるように、何年もの間にわたって公知であった。従って、本発明の混合ワクチンは、不活性化ポリオウイルス抗原を含み得る。
ワクチンにおける使用のためのこれら病原体に由来する抗原性成分は、一般には、略称で言及される:ジフテリアトキソイドに関しては「D」;破傷風トキソイドに関しては「T」;百日咳抗原に関しては「P」であり、「Pa」は、無細胞性(例えば、少なくともPT、FHAおよびペルタクチンを含む)であり、「Pw」は、細胞性である;結合体化H.influenzae b莢膜サッカリドに関しては「Hib」;それぞれの髄膜炎菌血清群に関しては、「MenA」、「MenB」、「MenC」、「MenW」および「MenY」(別個にキャリアタンパク質に結合体化される):三価不活性化ポリオウイルスに関しては「IPV」;ならびに肺炎球菌に関しては「Spn」。
−D,T,HBsAg
−D,T,Pw,HBsAg
−D,T,Pw,HBsAg,Hib
−D,T,Pw,HBsAg,Hib,MenA,MenC
−D,T,Pw,HBsAg,Hib,MenA,MenC、MenW135
−D,T,Pw,HBsAg,Hib,MenA,MenC,MenY
−D,T,Pw,HBsAg,Hib,MenA,MenC、MenW135,MenY
−D,T,Pa,HBsAg
−D,T,Pa,Hib
−D,T,Pa,HBsAg,Hib
−D,T,Pa,HBsAg,IPV
−D,T,Pa,HBsAg,IPV,Hib
−D,T,Pa,HBsAg,IPV,Hib,Spn
−D,T,Pa,HBsAg,IPV,Hib,MenC
−D,T,Pa,HBsAg,IPV,Hib,MenC,MenA
−D,T,Pa,HBsAg,IPV,Hib,MenC,MenY
−D,T,Pa,HBsAg,IPV,Hib,MenC,MenW135
−D,T,Pa,HBsAg,IPV,Hib,MenC,MenA、MenW135,MenY。
結合体化サッカリド抗原は、キャリアタンパク質を含み、上記キャリアタンパク質に、上記サッカリドは、直接にもしくはリンカーを介してかのいずれかで共有結合される。結合体化技術に関する一般的情報は、参考文献34に見いだされ得る。
本発明のワクチンは、一般に、アジュバントを含む。含めるために最も通常のアジュバントは、アルミニウム塩(例えば、水酸化アルミニウムおよび/もしくはリン酸アルミニウム)である。混合ワクチンにおける抗原は、アルミニウム塩に(部分的にもしくは全体的に)吸着され得る。
本発明のワクチン組成物は、キャリア、賦形剤、バッファなどを含み得る。
本発明は、個々の用量へとパッケージするために適したバルク材料を提供し得る。次いで、これは、患者への投与のために配布され得る。上記で言及した濃度は、代表的には、最終のパッケージされた用量における濃度であるので、バルクワクチンにおける濃度は、より高くてもよい(例えば、希釈によって最終濃度へと低下させられるために)。濃縮されたジフテリアトキソイドバルク組成物は、代表的には、他の材料(例えば、他の抗原、アジュバントなど)と合わせられる前に、水性成分(例えば、水もしくは緩衝液)中で希釈される。
−上記のとおりであるが、上記1種以上の抗原が、結合体化莢膜サッカリド抗原を含まない水性混合ワクチンを調製する工程;
−上記水性混合ワクチンを第1の容器(例えば、シリンジ)にパッケージする工程;
−結合体化莢膜サッカリド抗原を凍結乾燥形態に調製する工程;
−上記凍結乾燥した抗原を第2の容器(例えば、バイアル)にパッケージする工程;ならびに
−上記第1の容器および第2の容器を、キットの中に一緒にパッケージする工程。
本発明の組成物は、ヒト患者への投与に適しており、本発明は、患者における免疫応答を惹起するための方法を提供し、上記方法は、本発明の組成物を上記患者に投与する工程を包含する。本発明の組成物は、好ましくは、0.5ml用量(上記で考察されるとおり)において患者に投与される。
組成物中のジフテリア毒素および/もしくはトキソイドの量は、一般に、毒素/トキソイドの量として定義される、「Lf」単位(「凝集単位」、もしくは「限界凝集用量(limes flocculating dose)」、もしくは「凝集限界」)において測定され、これは、抗毒素の1国際単位と混合された場合に、最適に凝集する混合物を生じる[74,75]。例えば、NIBSCは、300Lf/アンプルを含む「Diphtheria Toxoid, Plain’[76]を供給し、また、900Lf/アンプルを含む「The 1st International Reference Reagent For Diphthelia Toxoid For Flocculation Test」[77]を供給する。組成物中のジフテリア毒素もしくはトキソイドの濃度は、このような参照試薬に対して較正された参照物質との比較によって、凝集アッセイを使用して容易に決定され得る。
用語「含む、包含する(comprising)」は、「含む、包含する(including)」および「〜からなる(consisting)」を包含し、例えば、Xを「含む」組成物は、もっぱらXからなってもよいし、何かさらなるもの(例えば、X+Y)を含んでいてもよい。
PTK酵母抽出物を、Ohly GmbH(Germany)から購入し、以下の段落においてまとめられるように、参考文献14から改変したプロセスによって鉄分除去した。
上記発酵培地を調製するために、水に溶解したマルトース一水和物、乳酸ナトリウム溶液、増殖因子溶液、水およびL−システイン溶液を、上記鉄分除去した酵母抽出物に、列挙したとおりの順序で添加した。さらなる工程において、クエン酸鉄(III)アンモニウム溶液およびホスフェート溶液(同様に、列挙した通りの順序で)添加した。塩化カルシウム溶液のさらなる添加は、鉄の沈殿物および鉄含有ゲルの形成をもたらした。上記鉄含有ゲルは、毒素生成を阻害することなく、細菌増殖の間に、上記発酵培地に鉄をゆっくり放出する。最後の工程において、上記発酵培地のpHを、必要であれば、20% 酢酸溶液もしくは10% アンモニウム溶液を添加することによって、7.3に調節した。上記増殖因子溶液の組成を、表2に提供する。
上記発酵培地に、前培養物を調製するためにワーキングシードからCorynebacterium diphtheriaeを接種した。上記ワーキングシードおよび上記マスターシードはともに、上記で記載される発酵培地を使用して調製した。
先の実施例に記載される発酵プロセスにおいて生成された上記粗製ジフテリア毒素をさらに精製するために、アニオン交換クロマトグラフィーを適用した。50L発酵槽回収物は、以下に記載される方法を使用して再現性をもって精製できた。
本実施例は、37℃での6週間の貯蔵後に、再毒性化を全く示さない不可逆的に無毒化したジフテリア毒素(いわゆる、トキソイド)を生じる無毒化条件を決定するための実験を記載する。
各pHに関して、ジフテリア毒素(500Lf/mLに対応する)を、規定された量の1M リジン(pH調節し、滅菌濾過した)と混合して、0M、0.025M、0.05Mおよび0.1Mのリジンを有する5mlサンプルを得た。無毒化を、12.5μL(0.25%)ホルムアルデヒド(FA) 40%を、それぞれ2日間、3日間もしくは4日間にわたって添加することによって行った。合計で30のホルミル化条件を、二連で試験した(表5を参照のこと)。従って、本明細書で使用される場合、終濃度0.5% ホルムアルデヒドは、40%(v/v)ホルムアルデヒドを含む飽和溶液の1:200希釈をいい、本明細書で記載される場合、終濃度1% ホルムアルデヒドは、40%(v/v)ホルムアルデヒドを含む飽和溶液の1:100希釈をいう。
ジフテリア濁度アッセイの結果に基づいて、各サンプルを、NaCl溶液(8.5g/L NaCl)で、それぞれ、50Lf/mL(小児用ワクチン)および3Lf/mL(成人用ワクチン)へと希釈し、37℃においてさらに6週間にわたって貯蔵した。3週間および6週間後、Vero細胞試験を行って、上記ジフテリア毒素調製物の毒性を決定した。
無毒化後および再毒性化期間後の残留するジフテリア毒素の存在を決定するために、Vero細胞試験を開発した。Vero細胞を、72時間にわたって種々のサンプル希釈物とともにインキュベートした。その後、細胞生存性を顕微鏡で調べ、3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイを使用して定量した。MTTは、生きている細胞では、紫色のホルマザンに還元される。あるいは、クリスタルバイオレットを上記Vero細胞培養物に添加して、死細胞を検出した。両方の試験は、ジフテリア毒素に対して非常に感度が高いことを示した。Vero細胞の代謝は、0.001mLf/mL毒素未満で阻害された。
加水分解しなかったサンプル番号3、5、7、9、13、15、19および47においては、リジンは見いだされなかった。このことは、上記透析が非常に有効であったことを示す。加水分解後のリジン含有量は、決定しなかった。
TSK 3000 SWXLカラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を確立して、上記トキソイドの分子量分布をアッセイした。そのクロマトグラムは、全てのサンプルに関してかなり類似して見え、約19分後に溶出する主要なモノマーピーク(83〜95%)および17分でのより小さなダイマーピーク(5〜17%)を有した。
等電点電気泳動(IEF)は、FA処理の程度を評価するために使用した。FAは正に荷電したアミノ基と反応するので、酸性基は、より顕著になる。結果として、pIが低下する。
調べた範囲では、全てのジフテリア毒素サンプルを無毒化したところ、37℃において6週間の貯蔵後に再毒性化は示されなかった。HPLCおよびIEF研究の両方は、1% FA 40%および0.025M リジンで最も良好にホルミル化が機能することに一致した。
より高い毒素濃度(500〜5000Lf)での無毒化および無毒化時間(14日間、28日間および42日間)の両方を調査した。精製したジフテリア毒素濃縮物(12,500Lf/mL、20mmol/L)を、0.1mol/L リン酸緩衝液中に希釈し、濾過によって滅菌した。最終毒素濃度およびサンプル組成を、表9に示す。
効力研究を、欧州局方(1997, third edition, Council of Europe, Strasbourg, France, Assay of diphtheria vaccine (adsorbed), pp. 113−115)の要件に従って行った。
図12に概説されるプロセスに従って調製されたジフテリアトキソイドを含む組成物を、+2〜8℃において、0ヶ月、6ヶ月および12ヶ月にわたって貯蔵した。上記製造プロセス全体の間に、上記組成物に保存剤は全く添加しなかった。各時点の後、上記サンプルのアリコートを、効力試験、純度分析、凝集アッセイ、HPLC分析、pH測定、毒性および滅菌性試験、ならびに遊離リジン、ホルムアルデヒド、塩化ナトリウム、スルフェートおよびホスフェート含有量の化学分析のために使用した。効力および毒性を、モルモットにおいて試験した。結果を、表15にまとめる。
Claims (30)
- ヒトでのワクチン接種に適した組成物であって、該組成物は、
(i)ホルムアルデヒドで結合された動物由来成分を含まない、ホルムアルデヒドで結合されたジフテリアトキソイド、および
(ii)コリネバクテリウム・ジフテリエ(Corynebacterium diphtheriae)以外の少なくとも1種の病原体に由来する防御抗原
を含み、ここで、該ジフテリアトキソイドは、少なくとも60 IU/mlの効力を有し、アジュバントに吸着され、そして、該ジフテリアトキソイドは、少なくとも90%純粋であり、かつ/または少なくとも1500Lf/mg窒素の純度を有し、ここで、該ジフテリアトキソイドは、アレルギー反応を引き起こすには不十分な酵母成分を含む、組成物。 - 前記非ジフテリア防御抗原は、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)、破傷風トキソイド、百日咳抗原、結合体化インフルエンザ菌(H.influenzae)B型莢膜サッカリド、結合体化髄膜炎菌(N.meningitidis)莢膜サッカリド、結合体化ストレプトコッカス・ニューモニエ(S.pneumoniae)莢膜サッカリド、および/または不活性化ポリオウイルスから選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記HBsAgは、動物由来成分を含まない、請求項2に記載の組成物。
- 前記インフルエンザ菌(H.influenzae)B型莢膜サッカリドは、動物由来成分を含まない、請求項2または3に記載の組成物。
- 前記髄膜炎菌(N.meningitidis)莢膜サッカリドは、動物由来成分を含まない、請求項2〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物は、以下:
- ヒトでの使用のためのワクチンを調製するためのジフテリアトキソイドを作製するためのプロセスであって、
(i)ジフテリア毒素を発現するコリネバクテリウム・ジフテリエ(Corynebacterium diphtheriae)のある株を、動物由来成分を含まない、少なくとも100Lの発酵培地中で増殖させる工程であって、該発酵培地が、以下:
鉄分除去した酵母抽出物;
少なくとも0.08Mのジサッカリド;
1.5μM〜30μM 可溶性Fe2+/Fe3+;
リン;および
増殖因子、
を含む、工程;
(ii)該ジフテリア毒素を、該発酵培地から精製して、精製されたジフテリア毒素を得る工程であって、該精製された毒素は、少なくとも85%純粋である、工程;
(iii)ホルムアルデヒドを該精製されたジフテリア毒素に添加する工程;ならびに
(iv)工程(iii)からの該精製されたジフテリア毒素をインキュベートして、該ジフテリアトキソイドを得る工程
を包含する、プロセス。 - ヒトでの使用のためのワクチンを調製するためのジフテリアトキソイドを作製するためのプロセスであって、
(i)ジフテリア毒素を発現するコリネバクテリウム・ジフテリエ(Corynebacterium diphtheriae)のある株の培養物を、動物由来成分を含まない発酵培地中で増殖させる工程であって、該発酵培地が、以下:
鉄分除去した酵母抽出物;
少なくとも0.08Mのジサッカリド;
1.5μM〜30μM 可溶性Fe2+/Fe3+;
リン;および
増殖因子、
を含む、工程;
(ii)該発酵培地からの該ジフテリア毒素を精製して、少なくとも85%の純度のジフテリア毒素溶液を得る工程;
(iii)該ジフテリア毒素溶液中のジフテリア毒素の濃度を、少なくとも3000Lf/mLに調整して、濃縮された溶液を得る工程;
(iv)該濃縮された溶液に、(a)0.025M以下の終濃度のアミノ酸、および(b)0.75〜1%の範囲の終濃度のホルマリンを加えて、無毒化溶液を得る工程;ならびに
(v)該無毒化溶液をインキュベートして、該ジフテリアトキソイドを得る工程
を包含する、プロセス。 - 前記アミノ酸が、グリシンまたはリジンである、請求項8に記載のプロセス。
- コリネバクテリウム・ジフテリエ(Corynebacterium diphtheriae)のある株を培養して、ジフテリア毒素を作製するために適切な発酵培地であって、該培地は、動物由来成分を含まず、そして:
(i)水;
(ii)鉄分除去した酵母抽出物;
(iii)少なくとも0.08Mの濃度のジサッカリド;
(iv)1.5μM〜30μMの可溶性Fe2+/Fe3+を提供する鉄補充物;
(v)リン;および
(vi)増殖因子、
を含み、ここで、少なくとも100Lの該発酵培地中のコリネバクテリウム・ジフテリエ(Corynebacterium diphtheriae)の培養物は、少なくとも140Lf/mLの該ジフテリア毒素を生成する、発酵培地。 - 前記コリネバクテリウム・ジフテリエ(Corynebacterium diphtheriae)培養物は、少なくとも200Lf/mLの前記ジフテリア毒素を生成する、請求項10に記載の発酵培地。
- 前記コリネバクテリウム・ジフテリエ(Corynebacterium diphtheriae)培養物は、250Lf/mLの前記ジフテリア毒素を生成する、請求項10に記載の発酵培地。
- 前記ジサッカリドの濃度は、0.08M〜0.16Mである、請求項10、11または12に記載の発酵培地。
- 前記鉄補充物は、Fe(III)の塩である、請求項10、11または12に記載の発酵培地。
- 前記酵母抽出物は、低マンナン含有量を有する、請求項10、11または12に記載の発酵培地。
- 前記酵母抽出物は、30kDaより大きい分子量を有する成分を含まず、前記鉄補充物は、1.5μM〜30μMの濃度のFe(II)もしくはFe(III)の塩である、請求項10、11または12に記載の発酵培地。
- 前記酵母抽出物は、低マンナン含有量を有する、請求項10、11、12、14または16に記載の発酵培地。
- 前記酵母抽出物は、30kDaより大きい分子量を有する成分を含まない、請求項10、11、12、14または15に記載の発酵培地。
- 請求項10に記載の発酵培地を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、
酵母抽出物を水に溶解する工程;
該酵母抽出物から鉄分除去する工程;
ジサッカリドを、少なくとも0.08Mの終濃度まで添加する工程;および
1.5μM〜30μMの可溶性Fe2+/Fe3+を提供する鉄補充物を添加する工程を包含する、プロセス。 - 前記酵母抽出物は、低マンナンの酵母抽出物である、請求項19に記載のプロセス。
- 前記酵母抽出物を、30kDaより大きい分子量カットオフを有する膜を使用して限外濾過する工程を包含する、請求項19または20に記載のプロセス。
- 前記ジサッカリドは、0.08M〜0.16Mの濃度で存在する、請求項19〜21のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記鉄補充物が、Fe(III)の塩である、請求項19〜22のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記Fe(III)の塩を、ホスフェートおよびカルシウム塩と組み合わせて添加して、鉄の緩慢放出処方物の形成を促進する工程を包含する、請求項23に記載のプロセス。
- ヒトでの使用のためのワクチンを調製するためのジフテリア毒素を生成するためのプロセスであって、該プロセスは、
(i)ジフテリア毒素を発現するコリネバクテリウム・ジフテリエ(Corynebacterium diphtheriae)のある株の培養物を、以下:
鉄分除去した酵母抽出物;
少なくとも0.08Mのジサッカリド;
1.5μM〜30μM 可溶性Fe2+/Fe3+;
リン;および
増殖因子、
を含むが、動物由来成分を含まない、少なくとも100Lの発酵培地中で調製する工程;
(ii)好気性条件において、該培養物を、該発酵培地中で少なくとも140Lf/mLの該ジフテリア毒素の濃度まで増殖させる工程;ならびに
(iii)該ジフテリア毒素を該発酵培地から分離する工程であって、該分離工程は、遠心分離工程および濾過工程を包含する、工程
を包含する、プロセス。 - 前記濃度は、少なくとも200Lf/mLの前記ジフテリア毒素である、請求項25に記載のプロセス。
- 前記濃度は、250Lf/mLの前記ジフテリア毒素である、請求項25に記載のプロセス。
- 前記増殖因子は、マグネシウム、銅、亜鉛、マンガン、ピメリン酸、ニコチン酸およびβ−アラニンから選択される、請求項25〜27のいずれか一項に記載のプロセス。
- 請求項25〜27のいずれか一項に記載のプロセスによってジフテリア毒素を生産する工程を包含し、さらに、ホルムアルデヒドを、前記ジフテリア毒素に添加し、それをインキュベートして、ジフテリアトキソイドを得る工程をさらに包含する、プロセス。
- アジュバント、キャリアおよび/もしくは賦形剤を、前記ジフテリアトキソイドに添加する工程をさらに包含する、請求項29に記載のプロセス。
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