KR20150087434A - 인간 백신 용도로 적합한 디프테리아 톡소이드 생산을 위한 동물 유래 성분을 함유하지 않는 발효 배지 - Google Patents
인간 백신 용도로 적합한 디프테리아 톡소이드 생산을 위한 동물 유래 성분을 함유하지 않는 발효 배지 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 코리네박테리움 디프테리아 배양을 위한 발효 배지에 관한 것이다. 또한 본 발명은 배양시킨 코리네박테리움 디프테리아 박테리아로부터 디프테리아 독소를 수득하는 방법에 사용되는 발효 배지와 본 방법에 의해 수득된 디프테리아 독소를 사용한 백신의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 백신 접종을 위한 디프테리아 톡소이드의 제조에 적합한 정제 및 해독 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae)의 배양을 위한 발효 배지에 관한 것이다. 본 발명은 또한 배양되는 박테리아인 코리네박테리움 디프테리아로부터 디프테리아 독소를 수득하기 위한 방법에 사용되는 발효 배지의 용도, 방법을 통해 수득된 디프테리아 독소를 사용한 백신의 제조 및 독소 그 자체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 예를 들면 백신 내의 포접을 위한 독소로부터 디프테리아 톡소이드를 제조하기 위한 정제 및 해독 방법에 관한 것이다.
코리네박테리움 디프테리아는 디프테리아를 유발시킨다. 박테리아는 독소 단백질, 디프테리아 독소를 생성시키고 이들은 예를 들면 포르말린 또는 포름알데하이드를 사용하여 처리함으로써 독성을 제거시키는 반면 주사 후에 보호(protective) 항-독소 항원을 유발시킬 수 있는 능력을 잔존시킨다. 이러한 처리를 해독(detoxification) 또는 톡소이딩(toxoiding)으로 언급하며 해독시킨 독소를 톡소이드라고 칭한다. 디프테리아 톡소이드는 디프테리아 백신에 사용되고 이에 관하여는 Vaccines[1] 서적의 13장에 상세히 설명되어 있고 또한 New Generation Vaccines[2] 31장에 설명되어 있다.
인간에게 투여되고 생물학적 방법을 사용하여 제조되는 치료제는 인체 내에 유해한 물질을 도입하기 위한 잠재성을 지니고 있다. 이와 같은 유해한 물질은 생물학적 방법 중에 사용된 배지의 일부일 수 있다. 예를 들면 우태혈청과 같은 동물유래 배지성분은 프리온과 같은 비정상적으로 폴드(fold)된 단백질을 함유할 위험성을 지닌다. 젖소의 우유로부터 유래된 단백질은 특히 DTP 부스터 백신 투여 후에 젖소 우유 알러지를 소아에게 유발시켜 심한 알러지 증상을 야기하는 것으로 제시되어 있다[3]. 이와 유사한 위험성이 소고기 알러지를 지닌 사람에게도 존재한다[4]. 전통적으로 디프테리아 톡소이드는 예를 들면 소고기 추출물 및/또는 젖소 우유로부터 유래된 카즈아미노산과 같은 성분을 포함하는 Linggoud & Fenton 배지와 같은 동물 유래 성분을 함유하는 성장 배지 내에서 디프테리아균을 증식시켜 얻어진다.
비-동물 유래 단백 물질을 사용함으로써 이와 같은 위험성을 제거할 수 있다. EP-B-1849860에서는 효모 추출물인 비-동물유래 단백 물질을 건조 중량으로 20% 이상 포함하는 디프테리아 균 배양 배지를 개시하고 있다[5]. WO2005/056773에서는 실질적으로 동물유래 성분을 제거시킨 디프테리아 독소 생산을 위한 디프테리아 균 배양 배지와 독소의 생산 방법을 개시하고 있다[6]. WO2006/042542에서는 단백질원으로 비-동물성 및 비-두류(soya)를 이용한 박테리아 독소의 생산을 위한 발효 배지를 개시하고 있다[7]. WO00/50449에서는 탄소원으로 포도당을 사용하여 디프테리아 독소를 생산 가능케 하는 미생물 균주를 발효시키는 단계를 포함하는 디프테리아 독소의 정제 방법을 개시하고 있다. 바람직한 실시태양에서 상기 발명은 오직 1%의 효모 추출물을 포함하는 성장 배지의 용도를 개시한다[8].
비록 상기 배지는 비-동물 유래 단백질원을 기반으로 하고 있으며 오염 위험성을 감소시킬 수 있으나 예를 들면 100-600L 범위의 발효조를 사용하는 산업적 생산 방법에서는 디프테리아 독소의 높은 수율을 나타내지 못하며 또한 이러한 낮은 수율은 상기 방법의 또다른 결점이다. 따라서 상기 방법으로는 인간 백신 용도로 적합한 디프테리아 톡소이드에 필요한 충분한 역가를 지닌 동물 유래 성분이 제거된 가교-결합된 디프테리아 톡소이드를 생산할 수 없었다.
따라서 본 발명의 목적은 산업적 규모로 사용하기에 적합한 더욱 개선된 발효 배지를 제공하는 것으로 인간 투여에 적합한 고역가 백신의 생산을 위한 디프테리아 독소의 고수율 제조 방법을 제공하는 것이다.
디프테리아 톡소이드를 제조하기 위한 전통적 방법에서는 예를 들면 참조문헌 2 내의 31장 도 4에 나타난 바와 같은 배양 배지 성분 존재 하에 포름알데하이드를 독소에 처리시켜 제조한다. 디프테리아 독소를 가교-결합 및 해독시키기 위하여 포름알데하이드는 배지 성분의 공유 가교-결합을 야기시킨다. 상기 가교-결합은 만약 성장 배지 내에 존재한다면 동물 유래 성분이 인간 백신 제품 내에 비가역적으로 결합될 수 있음을 의미한다. 백신에 사용할 수 있는 고순도의 톡소이드는 포름알데하이드 처리 전에 독소를 정제함으로써 수득될 수 있다. GB-969772 특허출원에서는 1차 또는 2차 아미노 그룹을 포함하는 분자량 200 이하의 지방족 디아민의 존재 하에서 포름알데하이드를 수용성 배지 내의 독소에 처리하는 단계를 포함하는 디프테리아 독소로부터 톡소이드를 생산하기 위한 방법을 개시하고 있다[9]. Frech 등[10]에서는 2개의 정제된 디프테리아 톡소이드의 생리화학적 분석을 개시하고 있으며 그 첫 번째는 디프테리아 독소가 포르말린화 시키고 정제시키는 전통적인 방법에 따라 제조된 것이며, 두 번째는 먼저 고순도로 정제시킨 후 해독시킨 것이다. WO2005/056773에서는 적어도 75%의 순수한 디프테리아 독소의 해독 방법을 개시하고 있다. 상기 정제 단계와 해독 단계를 통해 고순도를 성취할 수는 있으나 예를 들면 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 및 아미노산 등과 같은 디프테리아 독소를 제조하기 위해 사용되는 발효 배지의 동물 유래 성분의 잔류물이 해독 단계에서 얻어진 디프테리아 톡소이드와 포름알데하이드에 의해 가교-결합될 수 있다.
따라서 본 발명의 또 다른 목적은 동물 유래 성분의 가교-결합으로부터 자유로운 디프테리아 톡소이드를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 우선 디프테리아 독소를 고순도로 정제시키고 해독시키는 보다 개선된 방법을 제공하는 것이다.
Metz 등[11]에서는 디프테리아 독소의 해독 단계에서 글리신과 포름알데하이드 농도가 수득된 디프테리아 톡소이드의 항원성(antigenic property)에 영향을 미침을 개시하고 있다. 특히 해독 단계에서 사용된 포름알데하이드의 농도는 디프테리아 톡소이드의 면역원성(immunogenicity)에 직접적 영향을 주어 서로 다른 디프테리아 톡소이드 제조방법에 따라 최대 15배의 차이를 야기시킬 수 있는 것이다.
본 발명의 추가적 목적은 고역가를 일관적으로 유지시키는 동물-유래 성분의 가교결합으로부터 완벽하게 자유로운 디프테리아 톡소이드를 제공하는 것이며 이는 인간에 사용하기에 적합한 백신의 제조 방법으로 채택될 수 있다.
A. 발효 배지
본 발명은 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae)를 배양하기 위한 다양한 배지를 제공한다. 이 배지는 200 Lf/mL 내지 250 Lf/mL 또는 그 이상의 지속적인 수율로 적어도 300리터 생산용량을 지닌 발효조 내에서 산업적 규모로 디프테리아 독소를 생산가능케 한다. 본 명세서 내에서 개시된 배지와 방법은 디프테리아 독소를 생산하는 데 동물 유래 배지보다도 향상된 수율을 나타낼 수 있다.
일반적으로 본 발명은 코리네박테리움 디프테리아의 균주를 배양시켜 디프테리아 독소 또는 그 유도체를 생산하기에 적합한 발효 배지를 제공하는 것으로 이 때 배지는 동물 유래 성분을 함유하지 않고 질소원, 탄소원, 철 보충물, 황 및 성장 인자를 포함하는 것이다. 이 배지는 인간에게 사용하는 백신을 제조하기 위한 디프테리아 독소의 생산을 고수율, 산업적 규모로 특히 유용하게 사용할 수 있다.
하나의 측면에서 본 발명은 코리네박테리움 디프테리아의 균주를 배양시켜 디프테리아 독소 또는 그 유도체를 생산하기에 적합한 발효 배지를 제공하는 것으로 이 때 배지는 동물 유래 성분을 함유하지 않고 물, 철제거(deferrated) 효모 추출물 및 탄소원으로써 적어도 0.08M의 이당류를 포함하는 것이다. 또 하나의 실시태양에서 발효 배지는 0.08M 내지 0.16M의 이당류를 포함한다. 특정 실시태양에서 발효 배지는 0.15M의 이당류를 포함한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 코리네박테리움 디프테리아의 균주를 배양시켜 디프테리아 독소 또는 그 유도체를 생산하기에 적합한 발효 배지를 제공하는 것으로 이 때 배지는 동물 유래 성분을 함유하지 않고 물, 철제거 효모 추출물 및 Fe(Ⅲ) 염을 포함한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 코리네박테리움 디프테리아의 균주를 배양시켜 디프테리아 독소 또는 그 유도체를 생산하기에 적합한 발효 배지를 제공하는 것으로 이 때 배지는 동물 유래 성분을 함유하지 않고 물, 저-만난 효모 추출물을 포함한다. 이 때 저-만난 효모 추출물은 철이 제거되어 있다.
또 다른 측면에서 본 발명은 코리네박테리움 디프테리아의 균주를 배양시켜 디프테리아 독소 또는 그 유도체를 생산하기에 적합한 발효 배지를 제공하는 것으로 이 때 배지는 동물 유래 성분을 함유하지 않고 물, 30 kDa 이상의 분자량을 지니는 성분이 제거된 효모 추출물과 1.5μM 내지 30μM의 농도를 지닌 Fe(Ⅱ) 또는 Fe(Ⅲ)의 염을 포함한다.
측정한 실시태양에서 발효 배지는 동물 유래 성분을 함유하지 않고
(ⅰ) 질소원으로써 철제거 효모 추출물;
(ⅱ) 탄소원으로써 예를 들면 셀로비오즈 또는 말토즈와 같은 환원 이당류 0.08M 내지 0.16M;
(ⅲ) 철 성분으로써 겔-유사 침전물 형태의 10~14μM의 용해성 Fe2 +/Fe3 +;
(ⅳ) 마그네슘, 동, 구리, 아연, 망간, 피멜산(pimelic acid), 니코틴산 및 β-알라닌을 포함하는 성장 인자 혼합물;
(ⅴ) 물
을 포함하는 것이다.
제조 과정중에 추가적 배지 성분을 첨가하기 전에 물에 용해된 효모 추출물로부터 30 kDa 이상의 분자량을 지닌 모든 성분을 제거하기 위해 한외여과가 통상 사용된다.
B. 발효 배지의 제조방법
본 발명은 또한 물에 (ⅰ) 질소원, (ⅱ) 탄소원 및 (ⅲ) 철 보충물을 첨가하는 단계로 이루어진 발효 배지의 제조방법을 제공한다.
하나의 측면에서 본 발명은 효모 추출물 용액을 제조하기 위해 효모 추출물을 물에 용해시키는 단계; 철이 제거된 효모 추출물 용액을 수득하기 위해 효모 추출 용액으로부터 철을 제거시키는 단계; 및 발효 배지를 제조하기 위해 철이 제거된 효모 추출 용액에 적어도 0.08M의 이당류를 첨가시키는 단계를 포함하는 발효 배지의 제조방법을 제공하는 것이다. 이 때 하나의 실시태양에서 0.08M 내지 0.16M의 이당류를 철이 제거된 효모 추출 용액에 첨가한다. 특정 실시태양에서 0.15M의 이당류를 철이 제거된 효모 추출 용액에 첨가한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 효모 추출물 용액을 제조하기 위해 효모 추출물을 물에 용해시키는 단계; 철이 제거된 효모 추출 용액을 수득하기 위해 효모 추출 용액에서 철을 제거시키는 단계; 발효 배지를 제조하기 위해서 철이 제거된 효모 추출 용액에 Fe(Ⅲ)의 염을 첨가하는 단계로 이루어진 발효 배지의 제조방법을 제공하는 것이다. 하나의 실시태양에서 철제거 효모 추출 용액에 첨가되는 Fe(Ⅲ)의 염은 인산염 및 칼슘염과 결합하여 철 서방출 제형으로 형성을 증진시킨다.
또 다른 측면에서 본 발명은 발효 배지의 제조방법을 제공하는 것으로 이 때 제조방법은 저-만난 효모 추출물을 제조하는 단계와 발효 배지를 제조하기 위해 저-만난 효모 추출물을 물에 용해시키는 단계를 포함한다. 하나의 실시태양에서 상기 방법은 저-만난 효모 추출물에서 철을 제거시키는 단계를 더욱 포함하는 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 발효 배지의 제조방법을 제공하는 것으로, 이 때 제조방법은 효모 추출물 용액을 제조하기 위해 효모 추출물을 물에 용해시키는 단계; 분자량 30kDa 이상의 모든 성분을 제거하기 위해 멤브레인을 이용하여 30kDa 이상의 분자량 물질을 컷-오프 시켜 효모 추출 용액을 한외여과시키는 단계; 철 성분이 제거된 효모 추출 용액을 수득하기 위해 효모 추출 용액에서 철을 제거시키는 단계; 및 발효 배지를 제조하기 위해 철이 제거된 효모 추출 용액에 최종 농도가 1.5μM 내지 30μM이 되도록 Fe(Ⅱ) 또는 Fe(Ⅲ)의 염을 첨가시키는 단계를 포함하는 방법이다.
C. 디프테리아 독소 또는 그 유도체를 생산하기 위한 방법
본 발명은 또한 본 발명의 발효 배지 내에서 코리네박테리움 디프테리아 균주를 배양하는 단계를 포함하는 코리네박테리움 디프테리아를 성장시키기 위한 방법을 제공하는 것이다.
하나의 측면에서 본 발명의 발효 배지 내에서 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 발현시키기 위해 코리네박테리움 디프테리아균주를 성장시키는 단계 및 발효 배지로부터 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 분리시키는 단계로 이루어진 디프테리아 독소 또는 그의 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 동물 유래 성분이 제거된 적어도 100L 이상의 발효 배지 내에서 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 발현하기 위한 코리네박테리움 디프테리아 균주 배양물을 제조하는 단계; 발효 배지 내에서 디프테리아 독소 또는 그의 유도체가 적어도 140 Lf/mL 농도 이상으로 배양 성장시키는 단계; 및 발효 배지로부터 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 분리시키는 단계로 이루어진 디프테리아 독소 또는 그의 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.
D. 디프테리아 톡소이드의 생산방법
본 발명은 디프테리아 톡소이드의 다양한 생산방법을 제공한다. 이 방법은 이상적으로는 해독 단계 이전에 정제 단계를 포함하는 것이다. 따라서 톡소이드에 대한 배지 성분이 가교-결합을 최소화하거나 회피할 수 있다. 효모 추출물을 배양 배지 내에 사용하는 경우에는 이 방법은 바람직하게는 포름알데하이드와 같은 적합한 해독제의 처리 전에 디프테리아 독소로부터 잔류된 모든 효모 추출물 성분을 제거하여야 하는 것이다. 이에 따라 디프테리아 톡소이드의 잠재적 알러지 유발 효모 성분의 가교-결합을 회피할 수 있는 것이다. 최종 디프테리아톡소이드의 고순도는 보존제 첨가를 회피할 수 있어 유리할 뿐만 아니라 백신 접종시 잠재적 부작용을 더욱 감소시킬 수 있게 한다.
또한 만약 해독 이전에 정제된 물질을 농축할 수 있다면 더 적은 용량의 물질을 사용하여 예를 들면 포름알데하이드 처리와 같은 해독 단계를 진행시킬 수 있다. 이 최초 농도는 예를 들면 더 농축된 디프테리아 독소 용액을 제공할 수 있는 정용 여과(diafiltration) 단계를 통해 성취될 수 있다. 해독 과정 내에서 더 작은 용량의 사용은 저장 능력뿐만 아니라 시간을 절약할 수 있는 이점을 지닌다.
따라서 또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명의 발효 배지 내에서 디프테리아독소를 발현시키는 코리네박테리움 디프테리아 균주의 배양 성장 단계, 정제된 디프테리아 독소를 수득하기 위한 발효 배지로부터 디프테리아 독소의 정제 단계, 바람직하게는 포름 알데하이드와 같은 적합한 해독제를 정제 디프테리아 독소에 첨가시키는 단계 및 디프테리아 톡소이드를 수득하기 위해 이전 단계에서 얻어진 정제된 디프테리아 독소를 인큐베이팅 시키는 단계로 이루어진 디프테리아 톡소이드의 제조방법을 제공하는 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 (ⅰ) 바람직하게는 적어도 100L 이상의 볼륨을 지니고/지니거나 적어도 140 Lf/mL 이상의 독소/유도체 수율을 제공할 수 있는 발효 배지 내에서 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 발현시키는 코리네박테리움 디프테리아균주를 성장시키는 단계; (ⅱ) 디프테리아 독소 용액을 수득하기 위해 발효 배지로부터 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 분리시키는 단계; (ⅲ) 디프테리아 독소 용액으로부터 디프테리아독소 농축물을 제조하는 단계; (ⅳ) 농축물에 바람직하게는 포름 알데하이드와 같은 적합한 해독제와 아민을 첨가시키는 단계; (ⅴ) 디프테리아 톡소이드를 수득하기 위해 단계 (ⅳ)로부터 농축물을 인큐베이션 시키는 단계로 이루어진 디프테리아 톡소이드의 제조방법을 제공하는 것이다. 이 때 농축물 내의 디프테리아독소 또는 그의 유도체의 농도는 단계 (ⅰ) 이후에 얻어진 발효 배지 내의 디프테리아 독소 또는 그의 유도체의 농도, 또는 단계 (ⅱ)의 이후에 얻어진 독소 용액 내의 디프테리아 독소 또는 그의 유도체의 농도에 비해 적어도 20배 이상 농축된 것이다. 하나의 실시태양에서 단계 (ⅲ)의 농축물 내에 디프테리아 독소 또는 그의 유도체의 농도는 발효 배지 내의 디프테리아 독소 또는 그 유도체의 농도에 비해 20~36배 증가된 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 (ⅰ) 모든 필수 아미노산의 유일한 공급원으로써 효모 추출물을 포함하는 발효 배지 내에서 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 발현시키는 코리네박테리움 디프테리아균주를 성장시키는 단계; (ⅱ) 정제 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 수득하기 위해 발효 배지로부터 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 정제시키는 단계; (ⅲ) 정제된 디프테리아 독소 또는 그의 유도체에 바람직하게는 포름알데하이드와 같은 적합한 해독제를 첨가시키는 단계; (ⅳ) 디프테리아 톡소이드를 수득하기 위해 단계 (ⅲ)로부터 정제된 디프테리아 독소 또는 그 유도체를 인큐베이션 시키는 단계로 이루어진 디프테리아 톡소이드의 제조방법을 제공하는 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 (ⅰ) 선택적으로 효모 추출물을 포함하는 발효 배지 내의 동물 유래 요소가 제거된 발효 배지 내에서 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 발현시키는 코리네박테리움 디프테리아균주를 성장시키는 단계; (ⅱ) 적어도 1,500 Lf/mg 이상의 질소 순도를 가진 정제 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 수득하기 위해 발효 배지로부터 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 정제시키는 단계; (ⅲ) 정제된 디프테리아 독소 또는 그의 유도체에 바람직하게는 포름알데하이드와 같은 적합한 해독제를 첨가시키는 단계; (ⅳ) 디프테리아 톡소이드를 수득하기 위해 단계 (ⅲ)로부터 정제된 디프테리아 독소 또는 그 유도체를 인큐베이션 시키는 단계로 이루어진 인간 용도의 백신의 제조를 위한 디프테리아 톡소이드의 제조방법을 제공하는 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 (ⅰ) 선택적으로 효모 추출물을 포함하는 발효 배지 내의 동물 유래 요소가 제거된 발효 배지 내에서 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 발현시키는 코리네박테리움 디프테리아균주를 성장시키는 단계; (ⅱ) 적어도 85% 이상의 순도를 지닌 정제 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 수득하기 위해 발효 배지로부터 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 정제시키는 단계; (ⅲ) 정제된 디프테리아 독소 또는 그의 유도체에 바람직하게는 포름알데하이드와 같은 적합한 해독제를 첨가시키는 단계; (ⅳ) 디프테리아 톡소이드를 수득하기 위해 단계 (ⅲ)로부터 정제된 디프테리아 독소 또는 그 유도체를 인큐베이션 시키는 단계로 이루어진 디프테리아 톡소이드의 제조방법을 제공하는 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 (ⅰ) 선택적으로 효모 추출물을 포함하는 발효 배지 내의 동물 유래 요소가 제거된 발효 배지 내에서 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 발현시키는 코리네박테리움 디프테리아균주를 성장시키는 단계; (ⅱ) 정제 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 수득하기 위해 음이온 교환 크로마토그라피를 이용하여 발효 배지로부터 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 정제시키는 단계; (ⅲ) 정제된 디프테리아 독소 또는 그의 유도체에 바람직하게는 포름알데하이드와 같은 적합한 해독제를 첨가시키는 단계; (ⅳ) 디프테리아 톡소이드를 수득하기 위해 단계 (ⅲ)로부터 정제된 디프테리아 독소 또는 그 유도체를 인큐베이션 시키는 단계로 이루어진 디프테리아 톡소이드의 제조방법을 제공하는 것이다.
하나의 측면에서 본 발명은 (ⅰ) 적어도 2,000 Lf/mL 농도 이상의 디프테리아 독소 또는 그의 유도체의 용액을 제조하는 단계; (ⅱ) 상기 용액에 (a) 최종 농도가 0.025M 이내가 되는 아민과 (b) 최종 농도가 0.5~1%(바람직하게는 0.75~1%) 범위가 되는 바람직하게는 포르말린과 같은 적합한 해독제를 첨가시키는 단계; (ⅲ) 디프테리아 톡소이드를 수득하기 위해 단계 (ⅱ)로부터의 용액을 인큐베이션 시키는 단계로 이루어진 디프테리아 톡소이드의 생산 방법을 제공하는 것이다. 통상 디프테리아 독소 또는 그의 유도체의 용액 내 농도는 2,000Lf/mL 내지 5,000Lf/mL 범위이다. 특정 실시태양에서 단계 (ⅰ)에서 제조된 용액의 독소 농도는 약 5,000Lf/mL이다. 예를 들면 본 발명은 (ⅰ) 적어도 2,000 Lf/mL 농도 이상의 디프테리아 독소 또는 그의 유도체의 용액을 제조하는 단계; (ⅱ) 상기 용액에 (a) 디프테리아 독소 1Lf 당 5nmol 이내의 아민과 (b) 디프테리아 독소 1Lf 당 12~55nmol 바람직하게는 18~25nmol의 포름알데하이드를 첨가시키는 단계; (ⅲ) 디프테리아 톡소이드를 수득하기 위해 단계 (ⅱ)로부터의 용액을 인큐베이션 시키는 단계로 이루어진 디프테리아 톡소이드의 생산 방법을 제공하는 것이다. 특정 실시태양에서 단계 (ⅰ)에서 제조된 용액의 독소 농도는 약 5,000Lf/mL이다. 아민은 라이신이 바람직하다.
특정 실시태양에서 본 발명은 (ⅰ) 효모 추출물을 포함하는 발효 배지 내에서 디프테리아 독소를 발현시키는 코리네박테리움 디프테리아균주를 배양 성장시키는 단계; (ⅱ) 디프테리아독소 용액을 수득하기 위해 발효 배지로부터 디프테리아 독소를 정제시키는 단계; (ⅲ) 디프테리아 독소 농축물을 수득하기 위해 디프테리아 독소 용액의 디프테리아 독소 농도를 적어도 2,000 Lf/mL 이상으로 조정하는 단계; (ⅳ) 상기 농축물에 (a) 최종 농도가 0.025M 이내가 되는 아민과 (b) 최종 농도가 0.5~1%(바람직하게는 0.75~1%) 범위가 되도록 바람직하게는 포르말린과 같은 적합한 해독제를 첨가시키는 단계; (ⅴ) 디프테리아 톡소이드를 수득하기 위해 단계 (ⅳ)로부터의 농축물을 인큐베이션 시키는 단계로 이루어진 디프테리아 톡소이드의 제조방법을 제공하는 것이다. 전형적으로 용액 내의 디프테리아 독소 또는 그의 유도체의 농도는 2,000Lf/mL 내지 5,000Lf/mL 범위이다. 통상 특정 실시태양에서 단계 (ⅲ) 내의 독소 농도는 5,000Lf/mL으로 조정된다. 바람직한 실시태양에서 아민은 라이신이고 해독제는 포르말린이다.
더욱 상세한 특정 실시태양에서 본 발명은 (ⅰ) 효모 추출물을 포함하는 발효 배지 내에서 디프테리아 독소를 발현시키는 코리네박테리움 디프테리아균주를 배양 성장시키는 단계; (ⅱ) 디프테리아독소 용액을 수득하기 위해 발효 배지로부터 디프테리아 독소를 정제시키는 단계; (ⅲ) 디프테리아 독소 농축물을 수득하기 위해 디프테리아 독소 용액의 디프테리아 독소 농도를 적어도 2,000 Lf/mL 이상으로 조정하는 단계; (ⅳ) 상기 농축물에 (a) 디프테리아 독소 1 Lf 당 5nmol 이내의 아민과 (b) 디프테리아 독소 1 Lf 당 12~55nmol 바람직하게는 18~25nmol의 포름알데하이드를 첨가시키는 단계; (ⅴ) 디프테리아 톡소이드를 수득하기 위해 단계 (ⅳ)로부터의 농축물을 인큐베이션 시키는 단계로 이루어진 디프테리아 톡소이드의 제조방법을 제공하는 것이다. 전형적으로 용액 내의 디프테리아 독소 또는 그의 유도체의 농도는 2,000Lf/mL 내지 5,000Lf/mL 범위이다. 통상 특정 실시태양에서 단계 (ⅲ) 내의 독소 농도는 5,000Lf/mL으로 조정된다. 바람직한 실시태양에서 아민은 라이신이다.
하나의 실시태양에서 본 발명은 (ⅰ) 질소원; 탄소원으로 적어도 0.08M; 1.5μM~30μM의 용해성 Fe2+/Fe3+; 인; 및 성장인자를 포함하는 동물-유래 성분을 함유하지 않는 발효 배지 적어도 100L 내에서 디프테리아 독소 또는 그 유도체를 발현시키는 코리네박테리움 디프테리아의 균주를 배양 제조하는 단계; (ⅱ) 발효 배지 내에서 디프테리아 독소 또는 그 유도체의 농도가 적어도 140 Lf/mL이 되도록 호기성 조건 하에서 배양 성장시키는 단계; (ⅲ) 발효 배지로부터 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 분리시키는 단계로써 농축 단계와 여과 단계를 포함하는 분리 단계; (ⅳ) 정제된 디프테리아독소 또는 그의 유도체를 포함하는 용액을 수득하기 위해 음이온 교환 크로마토그라피를 사용하여 단계 (ⅲ)에서 수득된 디프테리아 독소 또는 그 유도체를 정제시키는 단계; (ⅴ) 디프테리아 독소 농축물을 수득하기 위해 용액 내의 정제된 디프테리아 독소 또는 그 유도체의 농도를 적어도 2,000 Lf/mL로 조정시키는 단계; (ⅵ) 상기 농축물에 (a) 최종 농도가 0.025M 이내가 되도록 아민과 (b) 0.5~1% 바람직하게는 0.75~1% 범위의 최종 농도가 되도록 바람직하게는 포르말린과 같은 적합한 해독제를 첨가시키는 단계; (ⅶ) 디프테리아톡소이드를 수득하기 위하여 단계 (ⅵ)으로부터 농축물을 인큐베이션 시키는 단계를 포함하는 방법으로 수득되는 인간 백신에 사용하기 위한 디프테리아 톡소이드를 제공하는 것이다.
E. 디프테리아 톡소이드
본 발명의 방법은 현재 생산되고 있는 인간 백신에 사용되기에 적합한 것보다 향상된 디프테리아 톡소이드의 제조방법을 제공한다. 톡소이드는 가교-결합이 없는 배지성분에 의해, 역가 및/또는 순도에 의해 예를 들면 가교-결합에 의해 알려진 톡소이드와는 분석학적으로 구별되는 것이다. 바람직한 실시태양에서 본 명세서 내에 개시된 방법으로 수득되는 디프테리아 톡소이드는 포름알데하이드-가교결합된 동물 유래 성분, 더욱 바람직하게는 모든 가교결합 동물 유래 성분이 제거된 것이다.
하나의 측면에서 본 발명은 동물 유래 성분이 제거된 발효 배지에서 디프테리아 독소를 발현시키는 코리네박테리움 디프테리아균주를 성장시키는 단계, 발효 배지로부터 디프테리아 독소를 분리시키는 단계, 디프테리아 톡소이드를 생산하기 위해 바람직하게는 포름알데하이드와 같은 적합한 해독제의 존재 하에서 디프테리아 독소를 인큐베이션 시키는 단계로 이루어진 인간 백신에 사용하기 위한 디프테리아 톡소이드를 제공하는 것이다. 특정 한 실시태양에서 이 방법으로 수득된 디프테리아 톡소이드는 발효 배지의 적어도 하나의 성분에 바람직하게는 포름알데하이드와 같은 해독제에 가교-결합되어있다. 하나 또는 그 이상의 성분은 발효 배지의 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 아미노산을 포함한다. 특정 실시태양에서 이 성분은 30kDa 이하의 분자량을 지닌다. 특정 실시태양에서 이 성분은 효모-유래의 것이다.
본 발명은 디프테리아 독소를 발현하는 코리네박테리움 디프테리아박테리아에 의해 생성된 디프테리아 독소로부터 제조된 톡소이드를 제공하는 것이다. 이 때 박테리아는 동물 유래 성분이 제거된 발효 배지에서 성장하고 톡소이드는 발효 배지의 적어도 하나의 성분과 가교-결합된 것이다. 하나 또는 그 이상의 성분은 발효 배지의 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 아미노산을 포함한다. 특정 실시태양에서 이 성분은 30kDa 이하의 분자량을 지닌다. 특정 실시태양에서 이 성분은 효모-유래의 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 (ⅰ) 선택적으로 효모 추출물을 포함하는 발효 배지 내의 동물 유래 요소가 제거된 적어도 100L의 발효 배지 내에서 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 발현시키는 코리네박테리움 디프테리아균주를 성장시키는 단계, (ⅱ) 적어도 85% 이상 및/또는 적어도 1,500Lf/mg 질소 순도를 지닌 정제된 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 수득하기 위해 발효 배지로부터 디프테리아 독소 또는 그의 유도체를 정제시키는 단계, (ⅲ) 정제된 디프테리아 독소 또는 그의 유도체에 바람직하게는 포름알데하이드와 같은 적합한 해독제를 첨가시키는 단계, (ⅳ) 디프테리아 톡소이드를 수득하기 위해 단계 (ⅲ)로부터 정제된 디프테리아 독소 또는 그 유도체를 인큐베이션 시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 인간 백신 사용을 위한 디프테리아톡소이드를 제공하는 것이다.
특정 한 실시태양에서 이 방법으로 수득된 디프테리아 톡소이드는 발효 배지의 적어도 하나의 성분에 바람직하게는 포름알데하이드와 같은 해독제에 가교-결합되어있다. 하나 또는 그 이상의 성분은 발효 배지의 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 아미노산을 포함한다. 특정 실시태양에서 이 성분은 30kDa 이하의 분자량을 지닌다. 특정 실시태양에서 이 성분은 효모-유래의 것으로, 예를 들면 본 발명의 방법에 의해 수득된 디프테리아 톡소이드는 예를 들면 효모 단백질, 효모 유래 폴리펩타이드 등과 같은 효모 유래 성분에 해독제를 가교-결합시킨 것이다.
특정 실시 태양에서 본 발명은
(ⅰ) 효모 추출물 용액을 제조하기 위해 저-만난 효모 추출물을 물에 용해시키는 단계; 철 성분이 제거된 효모 추출 용액을 수득하기 위해 효모 추출 용액에서 철을 제거시키는 단계; 멤브레인을 이용하여 30kDa 이상의 분자량 물질을 컷-오프 시켜 효모 추출 용액을 한외여과시키는 단계; 발효 배지를 제조하기 위해 철이 제거된 효모 추출 용액에 50g/L의 말토즈, 성장 인자 용액 및 농도가 10μM 내지 14μM이 되도록 Fe(Ⅱ) 또는 Fe(Ⅲ)의 염을 첨가시키는 단계에 의해 동물 유래 성분이 제거된 발효 배지의 제조 단계로써, 상기 Fe(Ⅲ)의 염은 철의 서방출 제형의 형성을 증진시키기 위해 인산과 칼슘염으로 겸합시켜 첨가시키는 단계;
(ⅱ) 적어도 100L 이상의 발효 배지에서 디프테리아 독소를 발현시키는 코리네박테리움 디프테리아 균주 배양물을 제조하는 단계;
(ⅲ) 발효 배지 내에서 적어도 140 Lf/mL 이상의 디프테리아 독소 농도로 배양물을 증식시키는 단계;
(ⅳ) 디프테리아 독소 용액을 생성하기 위해 원심분리 방법으로 발효 배지로부터 디프테리아 독소를 분리시키는 단계;
(ⅴ) 멸균된 디프테리아 독소를 생성하기 위해 디프테리아 독소 용액을 여과-멸균시키는 단계;
(ⅵ) 정제된 디프테리아 독소를 수득하기 위해 멸균된 디프테리아 독소를 정제시키는 단계;
(ⅶ) 정제된 디프테리아 독소에 바람직하게는 포름알데하이드와 같은 적합한 해독제를 첨가시키는 단계; 및
(ⅷ) 디프테리아 톡소이드를 수득하기 위해 단계 (ⅵ)으로부터 정제된 디프테리아 독소를 인큐베이션 시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된 인간 백신으로 사용되는 디프테리아 톡소이드를 제공하는 것이다.
특정 실시 태양에서 본 발명은
(ⅰ) 적어도 100L 이상의 동물 유래 성분 및 분자량 30kDa 이상의 성분이 제거된 발효 배지에서 디프테리아 독소를 발현시키는 코리네박테리움 디프테리아 균주 배양물을 제조하는 단계로써 이 때 상기 발효 배지는 (a) 물, (b) 철이 제거된 저-만난 효모 추출물, (c) 50g/L의 말토즈, (d) 마그네슘, 동, 아연, 망간, 피멜린산, 니코틴산 및 β-알라닌을 포함하는 성장 인자 용액, (e) 최초 농도 10~14μM의 시트르산 철 암모니움, (f)인산을 포함하는 배양물의 제조 단계;
(ⅱ) 발효 배지 내에서 적어도 200 Lf/mL 이상의 디프테리아 독소 농도로 호기성 조건 하에서 배양물을 증식시키는 단계;
(ⅲ) 디프테리아 독소 용액을 생성하기 위해 원심분리 방법으로 발효 배지로부터 디프테리아 독소를 분리시키는 단계;
(ⅳ) 멸균된 디프테리아 독소를 생성하기 위해 디프테리아 독소 용액을 여과-멸균시키는 단계;
(ⅴ) 정제된 디프테리아 독소를 수득하기 위해 멸균된 디프테리아 독소를 정제시키는 단계;
(ⅵ) 디프테리아 독소 농축물을 수득하기 위해 발효 배지 내에 디프테리아 독소 농도를 적어도 20배 이상 농축시키기 위해 정제된 디프테리아 독소를 농축시키는 단계;
(ⅶ) 농축된 디프테리아 독소에 포름알데하이드와 라이신을 첨가시키는 단계; 및
(ⅷ) 디프테리아 톡소이드를 수득하기 위해 포름알데하이드와 라이신 존재 하에서 디프테리아 독소 농축물을 인큐베이션 시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된 인간 백신으로 사용되는 디프테리아 톡소이드를 제공하는 것이다.
특정 실시 태양에서 본 발명은
(ⅰ) 발효 배지 내에서 디프테리아 독소를 발현시키는 코리네박테리움 디프테리아균주 배양물을 증식시키는 단계;
(ⅱ) 적어도 2,000Lf/mg 이상의 질소를 지니는 정제된 디프테리아 독소를 포함하는 용액을 수득하기 위해 음이온 교환 크로마토그라피를 이용하여 발효 배지로부터 디프테리아 독소를 정제시키는 단계;
(ⅲ) 디프테리아 독소 농축물을 수득하기 위해 정용 여과(diafiltration)를 사용하여 5,000Lf/mL로 용액 내의 정제된 디프테리아 독소 농도를 조정하는 단계;
(ⅳ) 농축물에 (a) 최종 농도 0.025M이 되도록 라이신, (b) 최종 농도 1%가 되도록 포르말린을 첨가하는 단계;
(ⅴ) 디프테리아 톡소이드 농축물을 수득하기 위하여 상기 단계로부터 농축물을 인큐베이션 시키는 단계;
(ⅵ) 멸균 용액을 수득하기 위하여 디프테리아 톡소이드 농축물을 멸균-여과시키는 단계;
(ⅶ) 농축 용액을 수득하기 위하여 정용 여과를 사용하여 멸균 용액 내의 디프테리아 톡소이드 농도를 10,000Lf/mL가 되도록 조정하는 단계; 및
(ⅷ) 인간 백신에 사용하기 적합한 디프테리아 톡소이드를 수득하기 위하여 농축 용액의 pH를 pH 7.5로 조정하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된 인간 백신으로 사용되는 디프테리아 톡소이드를 제공하는 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 적어도 2,000 Lf/mL 이상의 농도를 지닌 예를 들면 포름알데하이드 처리를 통한 디프테리아 독소의 해독 방법에 의해 수득된 디프테리아 톡소이드를 제공하는 것이다. 해독은 본 명세서 그밖의 부분에서 개시한 바와 같이 독소 용액에 (a) 최종 농도 0.025M 이내의 아민, (b) 최종 농도 0.5~1%, 바람직하게는 0.75~1% 범위의 바람직하게는 포르말린과 같은 적합한 해독제를 첨가시키는 단계를 포함한다. 예를 들면 해독은 본 명세서 그밖의 부분에서 개시한 바와 같이 독소 용액에 (a) 디프테리아 독소 1 Lf 당 5nmol 이내의 아민, (b) 디프테리아 독소 1 Lf 당 12~55nmol 바람직하게는 18~25nmol의 포름알데하이드를 첨가시키는 단계를 포함한다. 아민은 바람직하게는 라이신이다. 포름알데하이드, 선택적으로는 라이신과 같은 아민의 첨가량은 알려져 있으나 본 발명과 같이 높은 농도를 지닌 독소의 처리를 위한 것은 아니다. 변경된 비율은 종래의 톡소이드와 분자적으로 구별되는 톡소이드를 제공한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 발명에 의해 수득되는 디프테리아 톡소이드를 제공한다. 특히 본 발명은 예를 들면 표 3의 배지 내에서 코리네박테리움 디프테리아를 성장시켜 수득되고 독소를 정제시키고 독소를 해독시키는 방법과 같은 실시예 내에 개시된 방법에 의해 수득된 디프테리아 톡소이드를 제공하는 것이다.
F. 인간 백신에 적합한 조성물
본 발명은 포름알데하이드-가교 결합된 동물-유래 성분이 제거된 더욱 바람직하게는 모든 가교 결합된 동물-유래 성분이 제거된 디프테리아톡소이드로 이루어진 적어도 60 IU/ml의 역가를 지닌 인간 백신에 적합한 조성물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 동물-유래 성분이 제거된 배양 배지에서 성장된 코리네박테리움디프테리아로부터 정제된 적어도 60 IU/ml의 역가를 지닌 디프테리아톡소이드로 이루어진 인간 백신에 적합한 조성물을 제공하는 것이다. 하나의 실시태양에서 조성물은 디프테리아 톡소이드의 단량체:이량체 비율이 3:1 내지 10:1의 범위를 지닌 바람직하게는 3:1 내지 6:1 또는 4:1 내지 9:1의 범위인 것이고, 디프테리아 톡소이드의 등전점은 4.0에서 5.0의 범위인 것이다. 또 다른 실시태양에서 적어도 70%의 톡소이드는 단량체 형태이다. 또 다른 실시태양에서 조성물은 코리네박테리움 디프테리아 이외의 적어도 하나의 다른 병원체로부터의 보호 항원을 포함한다. 예를 들면 보호 항원은 B형간염바이러스 표면항원(HBsAg), 파상풍 항원, 헤모필루스 인플루엔자 B형 협막 다당체, 수막염균(N.meningitidis) 협막 다당체, 폐렴연쇄구균 협막 다당체 및 소아마비 바이러스로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 등전점이 4.0에서 5.0의 범위이고 적어도 70% 이상의 톡소이드가 단량체 형태인 가교 결합된 동물-유래 성분이 제거된 가교 결합된 디프테리아톡소이드로 이루어진 인간 백신에 적합한 조성물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 가교 결합된 동물-유래 성분이 제거되고 적어도 70% 이상의 톡소이드가 단량체 형태인 가교 결합된 디프테리아톡소이드로 이루어진 인간 백신에 적합한 조성물을 제공하는 것이다. 예를 들면 조성물은 포름알데하이드-결합된 동물-유래 성분이 제거된 적어도 70% 이상의 톡소이드가 단량체 형태인 포름알데하이드-결합된 디프테리아 톡소이드를 포함하는 것이다. 바람직하게는 인간 백신에 적합한 조성물은 등전점이 4.0에서 5.0의 범위이고 포름알데하이드-결합된 동물-유래 성분이 제거된 적어도 70% 이상의 톡소이드가 단량체 형태인 포름알데하이드-결합된 디프테리아 톡소이드를 포함한다. 상기한 바와 같이 본 조성물은 코리네박테리움 디프테리아 이외의 적어도 하나의 병원체로부터의 보호 항원을 포함할 수 있다.
단량체 형태의 톡소이드의 퍼센트는 크기-배제 크로마토그라피에 의해 결정될 수 있다. 곡선 이하의 면적은 다음의 공식을 사용하여 단량체 형태의 톡소이드의 퍼센트를 계산하기 위해 사용된다.
% 단량체 = 면적단량체/(면적이량체+면적단량체) × 100
하나의 특정 실시태양에서 본 발명은 포름알데하이드-가교 결합된 동물-유래 성분이 제거된 더욱 바람직하게는 모든 가교 결합된 동물-유래 성분이 제거된 코리네박테리움 디프테리아 이외의 병원체로부터의 적어도 하나 이상의 보호 항원을 지닌 디프테리아톡소이드로 이루어진 인간 백신에 적합한 조성물을 제공하는 것이다. 또 다른 특정 실시태양에서 본 발명은 포름알데하이드-가교 결합된 동물-유래 성분이 제거된 더욱 바람직하게는 모든 가교결합된 동물-유래 성분이 제거된 디프테리아 톡소이드 내에서 단량체:이량체 비율이 3:1 내지 8:1의 범위, 바람직하게는 3:1 내지 6:1의 범위를 지니고 4.0에서 5.0의 범위인 등전점을 지닌 디프테리아톡소이드로 이루어진 인간 백신에 적합한 조성물을 제공하는 것이다. 또 다른 특정 실시태양에서 본 발명은 포름알데하이드-가교 결합된 동물-유래 성분이 제거된 더욱 바람직하게는 모든 가교 결합된 동물-유래 성분이 제거된 적어도 70% 이상의 톡소이드가 단량체 형태인 디프테리아톡소이드로 이루어진 인간 백신에 적합한 조성물을 제공하는 것이다.
또 하나의 실시태양에서 본 발명은 (ⅰ) 포름알데하이드-가교 결합된 동물-유래 성분이 제거된 더욱 바람직하게는 모든 가교 결합된 동물-유래 성분이 제거된 100~250 Lf/mL의 디프테리아 톡소이드; 및 (ⅱ) 조성물 내에서 디프테리아 톡소이드와 파상풍 톡소이드의 비율이 2:1 및 3:1 범위인 40~100 Lf/mL의 디프테리아 톡소이드;로 이루어진 인간 백신 제조에 사용될 조성물을 제공하는 것이다. 특정 실시태양에서 조성물은 디프테리아 톡소이드와 파상풍 톡소이드를 제외한 어떤 다른 항원들로는 포함하지 않는다.
다른 하나의 실시태양에서 본 발명은 예를 들면 수산화알루미늄과 같은 불용성 알루미늄 염 애쥬번트에 흡착되어 있는 본 발명의 디프테리아 톡소이드를 포함하는 인간 백신에 적합한 조성물을 제공하는 것이다. 예를 들면 본 발명은 포름알데하이드-가교 결합된 동물-유래 성분이 제거된 더욱 바람직하게는 모든 가교 결합된 동물-유래 성분이 제거된 예를 들면 수산화알루미늄과 같은 불용성 알루미늄 염 애쥬번트에 흡착되어 있는 디프테리아 톡소이드를 포함하는 인간 백신에 적합한 조성물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 동물-유래 성분이 제거된 배양 배지 내에서 성장된 코리네박테리움 디프테리아로부터 정제된 디프테리아 톡소이드로써 적어도 60 IU/ml의 역가를 지니고 예를 들면 수산화알루미늄과 같은 불용성 알루미늄 염 애쥬번트에 흡착되어 있는 인간 백신에 적합한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 디프테리아 톡소이드는 다당체 콘쥬게이트 내에서 단백질 전달체로써 사용될 수 있다. 그러므로 또 다른 측면에서 본 발명은 박테리아 다당체와 디프테리아톡소이드 단백질 전달체와의 콘쥬게이트(conjugate)를 제공하는 것으로 이 때 디프테리아톡소이드는 상기에서 다양하게 정의된 것과 같은 예를 들면 포름알데하이드-가교 결합된 동물-유래 성분이 제거된 또는 바람직하게는 모든 가교 결합된 동물-유래 성분이 제거된 디프테리아 톡소이드이다.
또 다른 측면에서 본 발명의 디프테리아톡소이드와 이와 동일한 성분을 포함하는 조성물로 이루어진 백신 제형을 제공하는 것이다.
특정 실시태양에서 본 발명은 (ⅰ) 포름알데하이드-가교 결합된 동물-유래 성분이 제거된 더욱 바람직하게는 모든 가교 결합된 동물-유래 성분이 제거된 적어도 60 IU/ml의 역가를 지닌 디프테리아 톡소이드; 및 (ⅱ) 코리네박테리움 디프테리아 이외의 적어도 하나의 병원체로부터의 보호 항원;으로 이루어진 조합 백신을 제공하는 것이다. 보호 항원은 B형간염바이러스 표면항원(HBsAg), 헤모필루스 인플루엔자 B형 협막 다당체, 수막염균 협막 다당체로부터 선택될 수 있다. HBsAg는 동물-유래 성분이 제거된 것이 바람직하다. 헤모필루스 인플루엔자 B형 협막 다당체는 동물-유래 성분이 제거된 것이 바람직하다. 수막염균 협막 다당체는 동물-유래 성분이 제거된 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 (ⅰ) 상기한 바와 같이 예를 들면 포름알데하이드 처리시킨 적어도 2,000 Lf/mL의 농도를 지닌 디프테리아 독소의 해독으로부터 수득되는 디프테리아 톡소이드; 및 (ⅱ) 상기한 바와 같이 코리네박테리움 디프테리아 이외의 적어도 하나의 병원체로부터의 보호 항원;으로 이루어진 조합 백신을 제공하는 것이다.
일반적으로 본 발명은 또한 본 발명의 디프테리아 톡소이드로 이루어진 인간 백신을 제공하는 것이다. 이 때 상기 백신은 (ⅰ) 불용성 알루미늄 염 애쥬번트에 흡착된 톡소이드; 및/또는 (ⅱ) 코리네박테리움 디프테리아 이외의 적어도 하나의 병원체로부터의 보호 항원을 포함하는 백신;임을 특징으로 하는 것이다.
G. 인간 백신에 적합한 조성물의 제조방법
다른 하나의 측면에서 본 발명은 (ⅰ) 포름알데하이드-가교결합된 동물-유래 성분이 제거된 더욱 바람직하게는 모든 가교결합된 동물-유래 성분이 제거된 디프테리아 톡소이드; (ⅱ) 동물-유래 성분이 제거된 HBsAg; (ⅲ) 동물-유래 성분이 제거된 헤모필루스 인플루엔자 B형 협막 다당체; 및 (ⅳ) 동물-유래 성분이 제거된 수막염균 협막 다당체;를 조합시키는 단계로 이루어진 인간 백신에 적합한 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
하나의 실시태양에서 본 발명은 (ⅰ) 포름알데하이드-가교결합된 동물-유래 성분이 제거된 더욱 바람직하게는 모든 가교결합된 동물-유래 성분이 제거된 100~250 Lf/mL의 디프테리아 톡소이드; 및 (ⅱ) 적어도 하나의 다른 항원을 포함하는 조성물에서 조성물 내의 디프테리아 톡소이드와 파상풍 톡소이드의 비율이 2:1에서 3:1의 범위임을 특징으로 하는 40~100 Lf/mL의 파상풍 톡소이드;로 이루어진 조성물을 혼합시키는 단계로 이루어진 인간 백신 제조방법을 제공하는 것이다. 특정 실시태양에서 본 방법은 20~30 Lf/mL의 디프테리아 톡소이드 및 5~15 Lf/mL 파상풍 톡소이드로 이루어진 인간 백신을 제공한다.
본 발명은 또한 (ⅰ) 동물-유래 성분이 제거된 배양 배지 내에서 성장한 코리네박테리움 디프테리아로부터 정제된 디프테리아톡소이드; (ⅱ) 동물-유래 성분이 제거된 HBsAg; (ⅲ) 동물 유래 성분이 제거된 헤모필루스 인플루엔자 B형 협막 다당체; 및 (ⅳ) 동물-유래 성분이 제거된 수막염균 협막 다당체;의 조합시키는 단계로 이루어진 인간 백신에 적합한 조성물 제조방법을 제공하는 것이다. 조성물은 적어도 60 IU/ml의 역가를 지닌 디프테리아 톡소이드를 포함할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 발효 공정의 플로우차트이다.
도 2는 음이온 교환 크로마토그래피 전후의 디프테리아 독소 용액의 크로마토그램이다.
도 3은 농축/정용여과 전후의 디프테리아 독소 용액의 크로마토그램이다.
도 4는 샘플번호 1, 7, 15, 41, 47 및 55의 전기영동(electric focusing) 겔 사진으로 조-디프테리아 독소가 정제 이전에 해독된 종래의 방법에 의해 제조된 샘플과의 비교를 포함한 것이다.
도 5는 샘플 번호 1, 3, 9, 15, 41, 43, 49 및 55의 전기영동 겔 사진이다.
도 6은 샘플 번호 5, 25, 45, 11, 51, 17, 37 및 57의 전기영동 겔 사진이다.
도 7은 샘플 번호 7, 27, 47, 13, 53, 19, 39 및 59의 전기영동 겔 사진이다.
도 8은 샘플번호 21, 23, 29, 31, 33 및 35의 전기영동(electric focusing) 겔 사진으로 pH 7(레인 2) 또는 pH 8(레인 9)의 해독 완충화 이전의 독소를 비교한 것이다.
도 9는 0.0025M 라이신 존재 또는 라이신 부재하에 1% 포르말린으로 해독 후 시작 농도 500 Lf/mL의 디프테리아 독소 시료의 크로마토그램이다.
도 10은 0.0025M 라이신 존재 또는 라이신 부재하에 1% 포르말린으로 해독 후 시작 농도 2000 Lf/mL의 디프테리아 독소 시료의 크로마토그램이다.
도 11은 0.0025M 라이신 존재 또는 라이신 부재하에 1% 포르말린으로 해독 후 시작 농도 5000 Lf/mL의 디프테리아 독소 시료의 크로마토그램이다.
도 12는 본 발명에 따른 정제 및 해독 공정의 플로우차트이다.
도 2는 음이온 교환 크로마토그래피 전후의 디프테리아 독소 용액의 크로마토그램이다.
도 3은 농축/정용여과 전후의 디프테리아 독소 용액의 크로마토그램이다.
도 4는 샘플번호 1, 7, 15, 41, 47 및 55의 전기영동(electric focusing) 겔 사진으로 조-디프테리아 독소가 정제 이전에 해독된 종래의 방법에 의해 제조된 샘플과의 비교를 포함한 것이다.
도 5는 샘플 번호 1, 3, 9, 15, 41, 43, 49 및 55의 전기영동 겔 사진이다.
도 6은 샘플 번호 5, 25, 45, 11, 51, 17, 37 및 57의 전기영동 겔 사진이다.
도 7은 샘플 번호 7, 27, 47, 13, 53, 19, 39 및 59의 전기영동 겔 사진이다.
도 8은 샘플번호 21, 23, 29, 31, 33 및 35의 전기영동(electric focusing) 겔 사진으로 pH 7(레인 2) 또는 pH 8(레인 9)의 해독 완충화 이전의 독소를 비교한 것이다.
도 9는 0.0025M 라이신 존재 또는 라이신 부재하에 1% 포르말린으로 해독 후 시작 농도 500 Lf/mL의 디프테리아 독소 시료의 크로마토그램이다.
도 10은 0.0025M 라이신 존재 또는 라이신 부재하에 1% 포르말린으로 해독 후 시작 농도 2000 Lf/mL의 디프테리아 독소 시료의 크로마토그램이다.
도 11은 0.0025M 라이신 존재 또는 라이신 부재하에 1% 포르말린으로 해독 후 시작 농도 5000 Lf/mL의 디프테리아 독소 시료의 크로마토그램이다.
도 12는 본 발명에 따른 정제 및 해독 공정의 플로우차트이다.
발효 배지
하나의 측면에서 본 발명은 디프테리아 독소 또는 그 유도체를 생산하는 코리네박테리움 디프테리아의 배양에 적합한 발효 배지에 관한 것이다. 박테리아의 성장을 돕기 위해서 배지는 질소원, 탄소원, 인 성분 및 성장인자를 포함하여야 한다. 박테리아로부터 독소 생성을 지지하기 위해서 배지는 적합한 철분 원료를 함유하여야 한다.
더 바람직한 실시태양에서 배지는 동물-유래 성분이 제거된다. 따라서 배지 내의 모든 성분은 비-동물원으로부터 제조되어야 한다. 예를 들면 성분은 콩과 같은 식물원 또는 합성 방법으로 제조될 수도 있지만 고기 및 우유 성분은 사용되지 않는다.
질소원
본 발명의 발효 배지의 질소원은 바람직하게는 효모 추출물이다. 효모 추출물은 일반적으로 1차 효모의 염-제거 자가분해에 의해 수득되고 순차적으로 광범위한 정제를 행하며 이는 효모 추출물 내에 포자 또는 DNA와 같은 원하지 않는 성분을 제거시킬 수 있는 것이다.
하나의 실시태양에서 효모 추출물은 저-만난이다. 저-만난 효모 추출물 제조방법은 잘 알려져 있다. 예를 들면 저-만난 효모 추출물은 종래의 한외여과를 통해 제조된 효모 추출물로부터 다당체를 제거함으로써 제조될 수 있다. 다른 방법으로는 저-만난 효모 추출물은 만난의 함량을 감소시켜 발현하는 효모 균주로부터 제조될 수 있다. 만난의 함량을 예를 들면 70% 이하의 야생형 함량 수준으로 감소시켜 발현하는 효모 균주는 세포벽의 완벽성(integrity)이 부분적으로 결핍된 것으로 세포 내 함유물을 쉽게 분비시키며 따라서 배치와 배치간의 편차가 작은 효모 추출물을 제조하기에 특히 적합한 것이다. 이상적으로 저-만난 효모 균주는 산업적 규모의 효모 추출물을 제조하기에 적합한 액체 배지 내에서 성장할 수 있다. 이러한 효모 균주는 만난 발현에 필요한 하나 또는 그 이상의 유전자가 변형된 효모 균주일 수도 있다. 선택적으로 자연적으로 발생되는 저-수준 만난 발현 효모 균주가 효모 추출물을 제조하는데 사용될 수 있다. 저-만난 성분을 지닌 세포벽으로 이루어진 효모 균주 또는 그의 생성방법의 예로는 참조문헌 12 및 13에 개시된 것을 들 수 있다. 특히 자연적으로 발생하는 효모 균주 또는 화학적 또는 물리적으로 변이시킨 효모 균주는 그람-염색법을 이용하여 세포벽 내에서 저-만난 성분으로 스크리닝 될 수 있다. 그람-양성 염색법에 따라 전자 현미경 검사를 통한 세포벽의 외층의 저하된 전자밀도는 만난 함량이 저하된 것과 유사하다. 만난 함량은 화학적 분석에 의해 결정될 수 있다. 또한 효모 세포벽의 저-만난 함량은 콘카나발린 A(concanavalin A)와 같은 만난-특이성 항체 또는 렉틴으로 확인될 수 있다.
또 하나의 실시태양에서 효모 추출물은 한외 여과된 효모 추출물로 예를 들면 조-효모 추출물을 한외 여과시킨 것이다. 예를 들면 한외여과의 단계는 효모 추출액의 제조 단계 내에 포함될 수 있고 또는 효모 추출액 상태에서 본 발명의 발효 배지 제조 단계에서 그의 사용 이전에 한외 여과시킬 수 있다. 특정 실시태양에서 한외여과는 분자량 30kDa 이상을 지닌 모든 성분을 효모 추출액으로부터 제거하는 데 쓰인다. 고-분자량 성분을 효모 추출물로부터 제거함으로써 충분히 가수분해되지 않은 단백질, DNA 및 포자도 제거되며 서로 다른 효모 추출물 간의 배치-배치간 변이를 최소화하고 높은 재생가능성을 지닌 발효 방법을 보장하는 것이다.
또 다른 실시태양에서 효모 추출액은 철 성분이 제거된다. 하기와 같이 높은 철 농도는 코리네박테리움 디프테리아가 성장하는 동안 디프테리아 독소의 발현을 억제한다. 효모 추출액에서 철을 제거하는 방법은 당업자에게 흔히 알려져 있다. 예를 들면 Stainer & Scholte[14]에 의해 기재된 방법은 발효 배지에서 사용하기 이전에 효모 추출물로부터 철을 침전시켜 사용하는 것이다. 철은 물에 효모 추출물을 용해시키는 단계, pH를 9.3으로 조정하는 단계, 효모 추출 용액에 Na2HPO4 및 KH2PO4를 첨가시키는 단계, 용액을 85℃로 가열하는 단계 및 CaCl2를 첨가하는 단계에 의해 침전시킬 수 있다. 침전물은 천천히 용액을 냉각시킴으로써 형성된다. 특히 더 나은 결과는 물에 효모 추출물을 용해시키는 단계, pH를 9.3으로 조정하는 단계, 용액을 60℃로 가열하는 단계, 효모 추출 용액에 Na2HPO4 및 KH2PO4를 첨가시키는 단계, 용액을 79℃로 더 가열하는 단계, CaCl2를 첨가하는 단계, 용액을 85℃로 더 가열하는 단계 및 철 침전물을 형성하기 위해 충분히 3시간 이상 25℃로 용액을 냉각시키는 단계에 의해 철을 침전시킬 수 있다. 침전물은 예를 들면 여과 및 원심분리로 제거시킬 수 있다.
바람직한 실시태양에서 효모추출물의 한외여과와 철 성분 제거는 결합하여 시행한다. 성장인자 및 철 보충물의 첨가 이전에 효모 추출물의 한외여과 및 철 성분 제거의 결합 처치는 코리네박테리움 디프테리아의 성장에 사용 시 약 200 Lf/mL 또는 그 이상의 디프테리아 독소를 생성시키는 발효 배지를 제공할 수 있는 것이다.
또 하나의 바람직한 실시태양에서 효모 추출물은 발효 배지의 모든 필수 아미노산의 유일한 원료이다. β-알라닌 및 L-시스테인과 같은 몇몇 아미노산이 성장인자의 부분으로써 별도로 첨가되는 반면에 효모 추출액은 코리네박테리움 디프테리아의 성장에 필요한 모든 아미노산을 공급하는 것으로 발효 배지의 제조에 필요한 성분의 수를 줄이게 되고 또한 화학적으로 한정된 배지를 제공하는 모든 비용을 부담하게 되는 것이다.
또 다른 실시태양에서 효모 추출물을 사용하는 대신 발효 배지의 질소원은 벼 밀 펩톤, 벼 펩톤, 밀 펩톤, 콩 펩톤, 목화 펩톤, 완두콩 펩톤 및 감자 펩톤에서 선택된 것을 사용할 수 있다. 그러나 몇몇 실시태양에서는 발효 배지가 콩 펩톤을 포함하지 않을 수 있다. 또 다른 실시태양에서 본 발명에 상응하는 발효 배지는 어느 식물 또는 동물-유래 성분도 포함하지 않는다.
본 발명의 발효 배지 내 질소원으로써 효모 추출물의 사용은 특히 바람직하다. 식물 펩톤과 같은 식물-유래 성분은 농산물이며 적절한 절차에 따라 제조되지 않으면 예를 들면 아벤티티오스(adventitious) 바이러스의 제거가 보장되지 않는다. 예를 들면 파르보바이러스(parvovirus)는 소와 같은 그들의 동물 숙주의 대변 내에서 발견될 수 있다. 파르보바이러스-오염된 대변은 비료로써 사용될 수 있으며 따라서 파르보바이러스-오염된 대변의 존재 하에서 성장한 식물로부터 유래된 식물 펩톤은 오염될 수 있다. 파르보바이러스는 조직배양세포를 감염시킬 수 있으며 해독 후 디프테리아 톡소이드 제제의 잔류독성을 측정하기 위해 사용되는 Vero cell 에세이와 같은 품질 조절 에세이를 교란시킬 수 있다. 또한 식물-유래 성분으로 제조된 디프테리아 톡소이드 내 바이러스 성분의 존재는 톡소이드를 포함하는 백신을 투여받은 인간 개체에 역반응을 유발시킬 수 있는 것이다. 따라서 적절한 컨트롤 하에서만 식물-유래 성분을 사용할 수 있는 것이다.
탄소원
포도당과 글리세롤을 포함하는 코리네박테리움 디프테리아 성장에는 다양한 탄소원이 사용될 수 있다. 만약 탄소를 포함하는 질소원을 사용한다면 코리네박테리움 디프테리아가 아미노산으로부터 탄소를 동화시킬 수 있기 때문에 개별적 탄소원의 첨가는 반드시 필요한 것은 아니나 추가적 탄소원이 존재하는 경우의 발효 공정 중에서 성장률은 더욱 증가된다.
일반적으로 탄소원의 농도가 높을수록 배양에 의해 수득되는 독소의 수율은 더욱 증가된다. 그러나 포도당과 같은 단당류의 높은 농도는 배지 내의 삼투압을 증가시킴으로써 문제를 야기할 수 있다. 또한 코리네박테리움 디프테리아는 발효 과정 동안에 예를 들면 불충분한 통공 등에 의해 낮은 산소 조건 하에서 박테리아에 의한 혐기성 발효 부산물로써 젖산을 생성시킬 수 있다. 탄소원으로 단당류의 사용은 발효 배지 내의 젖산 축적에 의해 pH의 큰 저하를 야기시킨다. 발효 배지의 낮은 pH는 독소 생성을 감소시키거나 저해시키며 만약 독소의 고수율을 원한다면 반드시 피해야 하는 것이다. 단당류 대신에 이당류의 사용은 낮은 산소 조건 하에서 pH의 매우 작은 감소를 야기하고 따라서 독소 수율을 증가시킨다. 따라서 발효 조건 하에서 코리네박테리움 디프테리아의 최적 성장을 위한 탄소원의 대부분의 함량을 제공하기 위해 발효 배지 내의 이당류의 사용이 바람직하다.
하나의 실시태양에서 발효 배지는 탄소원으로써 적어도 0.08M의 이당류를 포함한다. 또 다른 실시태양에서 발효 배지는 탄소원으로써 0.08M 내지 0.16M의 이당류를 포함한다. 또 다른 실시태양에서 발효 배지는 탄소원으로 0.1M 내지 0.15M의 이당류를 포함하는 것이다. 특정 실시태양에서 본 발명의 발효 배지 내의 이당류의 농도는 약 0.15M이다.
다양한 이당류가 발효 배지의 제조 과정에서 본 발명의 발효 배지 내에 사용될 수 있다. 적합한 이당류는 슈크로즈, 락툴로즈, 탁토즈, 말토즈, 트레할로즈 및 셀로비오즈를 포함한다. 특정 실시태양에서 발효 배지의 이당류는 셀로비오즈 또는 말토즈와 같은 환원 이당류이다. 특정 실시태양에서 이당류는 말토즈이다.
코리네박테리움 디프테리아가 50g/L의 말토즈로 보충된 발효 배지 내에서 성장될 때 가장 우수한 수율로 디프테리아 독소를 생산할 수 있다.
인
인산염 형태의 인은 대부분의 생화학분자 내의 필수성분이다. 예를 들면 세포 멤브레인을 형성하는 DNA, RNA 및 인지질은 인산염을 포함하고 있다. 따라서 이는 본 발명의 발효 배지의 필수 성분이다. 만약 효모 추출물이 질소원으로 사용된다면 발효 배지에 인의 첨가가 통상적으로 요구되지는 않으며 그 이유는 효모 추출물은 예를 들면 뉴클레오타이드 또는 인지질과 같은 형태의 인산염을 충분히 포함하고 있기 때문이다.
성장 인자
배지 내의 코리네박테리움 디프테리아의 빠른 성장 기간 내에 배지의 몇몇 성분은 속도-제한요소가 될 수 있다. 발효 배지에 이러한 성분을 보충함으로써 디프테리아 독소의 수율은 더욱 향상될 수 있다. 또한 이러한 성분은 일반적으로 '성장인자'로 언급된다.
적합한 성장인자는 마그네??, 구리, 아연, 망간, 피메린산, 니코틴산 및 β-알라닌을 포함한다. 몇몇 실시태양에서 마그네슘은 MgSO4·7H2O의 형태로 제공되며, 구리는 CuSO4·5H2O의 형태로 제공되고, 망간은 MnCl2·4H2O의 형태로 제공된다.
철분원
배양 배지 내의 높은 철 농도는 코리네박테리움 디프테리아의 성장동안 디프테리아 독소의 발현을 억제한다. 배지로부터의 과도한 철 제거는 또한 코리네박테리움 디프테리아의 발효동안 고-수율 독소 생성을 수득하기 위해 필요하다. 배양 배지의 철제거 방법은 당업자에게 예를 들면 Stainer & Scholte[14]에 개시된 사항을 통해 공지되어 있다. 예를 들면 철은 효모 추출액으로부터 용액 내에 존재하는 철을 침전에 의해 제거할 수 있고 원심분리 및/또는 한외여과에 의해 침전물을 제거 할 수 있다.
철의 수준이 너무 낮아도 코리네박테리움 디프테리아의 성장에 부정적인 영향을 미친다. 철 제거 후에 또한 발효 배지는 성장 동안 철 원료를 계속 제공해야하며 디프테리아 독소의 생산을 억제하는 수준은 아니어야한다. 발효 배지 내 철의 주원료는 전통적으로 동물-유래된 질소원으로 사용되는 물질로부터 제공될 수 있다. 효모 추출액이 질소원으로 사용된다면 발효동안 고-수율의 디프테리아 독소 생산을 하는 수준으로 철 농도를 저하시킴으로써 철을 제거시킬 수 있다. 그러나 예를 들어 모든 철을 제거시킨 정도로 철 함량이 너무 낮아 박테리아의 성장이 저해된다면 발효 배지는 코리네박테리움 디프테리아 성장을 위해 철을 보충시켜야 한다.
하나의 실시태양에서 발효 배지는 Fe(Ⅲ)의 염을 포함한다. Fe(Ⅲ)염의 하나의 예로는 시트르산 철 암모니움이 있다. 다른 하나의 실시태양에서 발효 배지는 Fe(Ⅱ)의 염을 포함한다. Fe(Ⅱ)염의 하나의 예로는 황산 철 7-수화물이 있다. 하나의 실시태양에서 발효 배지 내의 Fe(Ⅱ) 또는 Fe(Ⅲ)의 시작농도는 1.5μM 내지 30μM이다. 다른 하나의 실시태양에서 Fe(Ⅱ) 또는 Fe(Ⅲ)의 시작농도는 3μM 내지 15μM이다. 또 다른 실시태양에서 Fe(Ⅱ) 또는 Fe(Ⅲ)의 시작농도는 5μM 내지 13μM이다. 특정 실시태양에서 Fe(Ⅱ) 또는 Fe(Ⅲ)의 시작농도는 10μM 내지 14μM이다.
발효 과정 전반에 존재하는 철의 함량을 충분히 유지하기 위해서는 철 보충물이 서방출 제형으로 일반적으로 첨가되며 이는 독소 생성을 억제하는 농도에 미치지 않게 하기 위함이다. 따라서 특정 실시태양에서 발효 배지는 철의 서방출 제형을 보충한다. 발효 배지에 보충되는 철 서방출 제형은 사용 하기 전에 발효 배지에 시트르산 철 암모니움 용액과 인산 용액을 첨가시키는 단계, 및 염화칼슘 용액을 첨가시켜 철을 침전시키는 단계를 통해 생성된다. 이는 발효 과정 중에 발효 배지에 철을 서서히 방출시켜 겔-유사 침전물을 형성시킨다. 철의 서방출 제형을 수득하기 위한 다른 방법은 당업자에게 명백히 알려져 있으며 다른 방법 역시 본 발명의 범위에 속한다.
배지 형성
발효 배지는 액체 배치 또는 고체배지로 제조될 수 있다. 한편으로는 발효 배지는 건조 파우더로 제조될 수도 있다. 하나의 실시태양에서 고체 배지는 액체 배지에 한천의 첨가로써 제조될 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 고체 배지는 코리네박테리움 디프테리아의 마스터 시드뱅크(seed bank)를 제조하는데 특히 유용하다. 마스터 시드는 실행(working) 시드를 준비하는데 사용될 수 있다. 실행 시드는 백신에 사용되는 디프테리아 독소의 제조를 위한 코리네박테리움 디프테리아의 대규모 성장을 위해 본 발명의 발효 배지를 접종시키기 위해 사용할 수 있다.
배지 제조
본 발명의 하나의 측면은 본 발명의 발효 배지의 제조방법에 관한 것이다. 하나의 실시태양에서 본 발명의 발효 배지의 제조방법은 질소원과 탄소원에 물을 또는 또다른 액상 배지를 첨가하는 단계를 포함한다. 질소원으로 사용되는 물질의 철 함량에 의존하여 이 방법은 철 보충물을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 또한 이 방법은 성장인자와 인을 첨가하는 단계를 포함한다.
특정 실시태양에서 본 발명의 발효 배지를 제조하는 방법은 물에 효모 추출물을 용해시키는 단계, 효모 추출물 내의 철성분을 제거하는 단계, 최종 농도가 적어도 0.08M이 되도록 이당류를 첨가하는 단계로 이루어져 있다.
또 다른 실시태양에서 본 발명은 발효 배지의 제조방법에 관한 것으로 이 때 상기 방법은 효모 추출물을 물에 용해시키는 단계, 효모 추출물에서 철을 제거하는 단계, Fe(Ⅱ) 또는 Fe(Ⅲ)염을 첨가하는 단계로 이루어져 있다. Fe(Ⅱ) 또는 Fe(Ⅲ)염은 서방출 제형의 철을 형성시키는 방법으로 첨가한다.
또 다른 실시태양에서 본 발명의 발효 배지를 제조하는 방법은 효모 추출물의 한외여과 단계를 포함한다.
또 다른 실시태양에서 본 발명은 발효 배지의 제조방법에 관한 것으로 이 때 제조방법은 저-만난 효모 추출물을 제조하는 단계 및 효모 추출물을 물에 용해시키는 단계를 포함한다.
상기한 방법의 어느 것도 본 발명의 발효 배지를 제조하기 위해 결합하여 사용할 수 있다. 예를 들면 본 발명의 발효 배지의 제조 과정은 효모 추출물을 물에 용해시키는 단계, 효모 추출물의 철을 제거하는 단계, 및 0.08M 내지 0.16M의 이당류를 첨가하는 단계에 하나 또는 그 이상의 한외여과 단계를 더욱 포함할 수 있다. 선택적으로 발효 배지를 사용하기 전에 Fe(Ⅱ) 또는 Fe(Ⅲ)염을 첨가시킬 수 있다.
배지의 용도
발효 배지는 본 발명의 발효 배지 내에서 코리네박테리움디프테리아 균주를 배양하는 단계를 포함하는 코리네박테리움 디프테리아 성장을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 실시를 위해 다양한 디프테리아 독소를 생성하는 코리네박테리움 디프테리아 균주를 사용할 수 있다. 특히 대규모의 디프테리아 독소를 생성시키는 코리네박테리움 디프테리아 균주 Park-Williams no.8(PW8)가 디프테리아 독소를 수득하기 위한 백신 생성에 일반적으로 사용된다[15]. 이 균주는 본 발명의 발효 배지를 사용할 때 고수율로 디프테리아 독소를 생성하는데 특히 적합하다.
바람직한 실시태양에서 코리네박테리움 디프테리아를 성장시키기 위한 방법은 동물-유래 성분이 제거되었거나 동물-유래 성분을 사용하지 않고 제조된 본 발명의 발효 배지에 실행 시드를 접종하는 단계를 포함한다. 가장 바람직한 실시태양에서 발효 배지 내에 코리네박테리움 디프테리아를 성장시키기 위해 마스터 시드뱅크를 창출시키는 단계를 거쳐 실행 시드를 제조하는 단계의 전체 공정을 동물-유래 성분 부재 하에서 시행하는 것이다. 또 다른 실시태양에서 마스터 시드뱅크와 실행시드는 동물-유래 성분을 포함하는 발효 배지를 이용하여 전통적인 방법으로 제조하지만 코리네박테리움 디프테리아의 발효 배양은 동물-유래 성분이 제거된 배지 내에서 시행하는 것이다.
코리네박테리움디프테리아는 호기성 조건 하에 배양시킨다. 충분한 통공은 높은 성장 속도를 성취하는 데 중요하다. 충분한 통공은 예를 들면 300L 볼텍스 발효조 내에 580rpm 내지 620rpm으로 교반시킴으로써 달성될 수 있다. 가압공기를 60L/분의 속도로 발효조에 첨가시킨다. 예를 들면 antifoam A와 같은 활성 실리콘 폴리머와 같은 거품제거제를 교반시 거품형성을 방지하기 위해 첨가할 수 있다.
종래의 코리네박테리움 디프테리아 산업적 발효는 동물-유래 성분이 제거된 발효 배지를 사용할 때에도 디프테리아 독소의 높은 수율을 성취할 수 없었다. 참고문헌 5에서는 동물-유래 성분이 제거된 발효 배지 100mL 내에서 코리네박테리움 디프테리아를 성장시키는 방법을 개시하고 있으며 이는 질소원으로 효모 추출물을 사용하여 오직 60Lf/mL 디프테리아 독소를 생성할 수 있었다. 참고문헌 6에서는 질소원으로써 효모 추출물과 모든 20개 필수 아미노산을 포함하는 동물-유래 성분이 제거된 발효 배지 240L에서 코리네박테리움디프테리아를 성장시켜 오직 최대 100 Lf/mL 디프테리아 독소를 생성할 수 있었다. 참고문헌 7에서는 주요 질소원으로 벼-밀 펩톤을 포함하는 동물 유래 성분이 제거된 발효 배지에서 오직 118 Lf/mL의 디프테리아 독소를 생성할 수 있었다. 효모 추출물을 벼-밀 펩톤 대신 사용한 경우 농도는 59 Lf/mL로 더욱 저하되었다.
이와 대조적으로 본 발명의 발효 배지는 디프테리아 독소 또는 그 유도체의 농도를 적어도 140 Lf/mL 이상 달성할 수 있도록 코리네박테리움 디프테리아를 성장시키는 데 특히 적합한 것이다. 통상적으로는 적어도 200 Lf/mL의 독소 농도가 성취 가능하다. 통상적인 수율은 200 Lf/mL 내지 250 Lf/mL 범위이다. 특정 실시태양에서 발효 배지 내의 디프테리아독소 또는 그 유도체의 농도는 200 Lf/mL을 초과하고 250 Lf/mL과 같거나 이보다 증가될 수 있다.
따라서 하나의 측면에서 본 발명은 디프테리아 독소 또는 그 유도체를 고수율로 산업적 규모로 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 동물-유래 성분이 제거된 발효 배지 100L 또는 그 이상에서 코리네박테리움디프테리아 균주를 배양시키는 단계, 발효 배지 내의 독소 또는 그 유도체의 농도가 적어도 140 Lf/mL을 제공할 수 있도록 배양물을 성장시키는 단계 및 발효 배지로부터 디프테리아 독소 또는 그 유도체를 분리시키는 단계로 이루어진 방법이다. 바람직한 실시태양에서 상기 방법은 인간 백신 사용에 적합한 디프테리아 독소를 제조하는 데 사용한다. 또 다른 실시태양에서 상기 방법은 예를 들면 CRM197과 같은 변이 디프테리아 독소와 같은 디프테리아 독소 유도체를 제조하는 데 사용하는 것이다.
특정 실시태양에서 적어도 100L의 발효 배지 양이 본 발명에 사용된다. 예를 들면 발효 배지의 양은 적어도 200L, 적어도 250L, 적어도 300L, 적어도 500L 또는 적어도 600L일 수 있다. 이러한 산업적 규모의 양은 인간 백신 생성에 적합한 것이다.
특정 실시태양에서 본 발명의 방법은 발효 배지 내에서 적어도 140 Lf/mL의 농도로 디프테리아독소 또는 그 유도체를 생성한다. 예를 들면 본 발명의 방법은 발효 배지 내에서 디프테리아 독소 또는 그 유도체의 농도를 적어도 150 Lf/mL, 적어도 200 Lf/mL, 적어도 250 Lf/mL로 성취할 수 있다.
특정 실시태양에서 본 발명의 디프테리아독소 또는 그 유도체를 제조하는 방법은 본 발명의 발효 배지 내에서 디프테리아독소 및 그 유도체를 발현시키는 코리네박테리움디프테리아 균주를 성장시키는 단계 및 발효 배지로부터 디프테리아 독소 또는 그 유도체를 분리시키는 단계를 포함하는 것이다.
하나의 실시태양에서 디프테리아독소 또는 그 유도체를 포함하는 발효 배지로부터 박테리아의 분리 방법은 원심분리에 의해 성취될 수 있다. 또 다른 실시태양에서 디프테리아독소 또는 그 유도체를 포함하는 발효 배지로부터 박테리아의 분리 방법은 여과에 의해 성취될 수 있다. 예를 들면 디프테리아 독소 또는 그 유도체를 포함하는 발효 배지를 여과수단에 의해 멸균시킬 수 있다. 어떤 실시태양에서 원심분리와 여과를 함께 적용하여 디프테리아 또는 그 유도체를 포함하는 발효 배지로부터 박테리아를 분리시킬 수 있다. 특정 실시태양에서 원심분리에 의한 분리는 디프테리아 독소와 그 유도체를 포함하는 발효 배지의 여과-멸균 이전에 수행될 수 있다. 하나의 실시태양에서 여과-멸균에 사용되는 필터는 쉐딩(shedding) 파이버를 사용할 수 없다. 또 다른 실시태양에서 여과-멸균에 사용되는 필터는 포아 규격이 0.22μm 이거나 이보다 작은 멤브레인을 사용한다. 특정 실시태양에서 디프테리아독소 또는 그 유도체를 포함하는 여과-멸균 발효배지에 페놀 이외의 보존제를 첨가시킬 수 있다. 바람직한 실시태양에서는 디프테리아 독소 또는 그 유도체를 포함하는 여과-멸균 발효 배지에 아무런 보존제도 첨가시키지 않는 것이다.
독소 정제
본 발명의 특정 측면에서 디프테리아 톡소이드의 제조를 위해 디프테리아 독소는 해독 단계 이전에 정제된다. 톡소이드화 이전의 디프테리아 독소의 정제 단계는 해독 단계에서 디프테리아 독소에 예를 들면 단백질 및/또는 펩타이드와 같은 발효 배지로부터 유래된 성분의 가교-결합을 감소시킨다. 배지 성분의 가교-결합은 품질 제어에 문제를 야기시키는 낮은 균등(homogeneous) 제품을 유발시키기 때문에 유익하지 않은 것이며, 이는 또한 톡소이드 내에 트랩 알러겐(trap allergen)의 가능성을 지니는 것이다. 해독 단계 이전에 디프테리아독소의 정제는 이러한 불리함을 회피할 수 있다. 배양 배지 내에 동물-유래 성분의 회피 및 전-해독 정제의 결합을 통해 고순도 높은 역가의 톡소이드를 제공할 수 있다. 전-해독 정제를 행하는 경우에도[10] 코리네박테리움 디프테리아 배양 배지로부터의 동물-유래 성분의 잔류는 톡소이드화 단계에서 독소를 공유결합시켜 가교-결합케 할 수 있다. 이와 같은 가교 결합 물질은 통상적인 분석 에세이에 의해서는 검출되지 않을 수도 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 디프테리아 톡소이드를 제조하기 위해 사용되는 디프테리아 독소는 적어도 85% 순도를 지닌 것이다. 특정 실시태양에서 디프테리아 톡소이드를 제조하기 위해 사용되는 디프테리아 독소는 적어도 90% 순도를 지닌 것이다. 또 다른 특정 실시 태양에서 디프테리아 톡소이드를 제조하기 위해 사용되는 디프테리아 독소는 적어도 95% 순도를 지닌 것이다.
하나의 실시태양에서 본 발명에 따른 디프테리아톡소이드를 제조하기 위해 사용되는 디프테리아독소는 1,500 Lf/mg 질소보다 더 큰 순도를 지닌다. 특정 실시태양에서 디프테리아톡소이드를 제조하기 위해 사용되는 디프테리아독소는 2,000 Lf/mg 질소보다 더 큰 순도를 지닌다. 또 다른 특정 실시태양에서 디프테리아톡소이드를 제조하기 위해 사용되는 디프테리아독소는 2,100 Lf/mg 질소보다 더 큰 순도를 지닌다. 또 다른 특정 실시태양에서 디프테리아톡소이드를 제조하기 위해 사용되는 디프테리아독소는 2,700 Lf/mg 질소보다 더 큰 순도를 지닌다.
디프테리아 독소 또는 그 유도체는 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 발효 배지로부터 정제될 수 있다. 하나의 실시태양에서 정제 단계는 황산 암모니움 침전 단계를 포함하는 방법에 의해 수행되는 것이다. 특정 실시태양에서 발효 배지로부터 디프테리아 독소 또는 그 유도체의 정제는 음이온 크로마토그라피 단계를 포함하는 방법으로 수행될 수 있으며 이상적으로는 더 이상의 하부 크로마토그라피 단계를 요구하지 않는 것이다. 또 다른 실시태양에서 정제 단계는 하나 또는 그 이상의 한외여과 단계를 포함한다.
또 다른 실시태양에서 정제 단계 이후에 수득된 정제된 디프테리아 독소 벌크는 정용 여과에 의해 여과 멸균되고 농축되는 것이다. 이 단계는 미생물 오염에 의한 붕괴(degradation)와 활성 감소 없이 해독 단계 이전에 정제된 디프테리아 독소 벌크를 저장할 수 있게 한다. 벌크의 농축은 냉각 보관용적을 감소시킴으로써 추가적 이점을 제공할 뿐만 아니라 에너지 절약을 가능케 한다.
디프테리아 독소 및 그 유도체
본 발명은 명세서 내에 기재된 '디프테리아 독소 및 그 유도체'를 다음과 같이 정의한다. 그 유도체는 디프테리아 독소와 상호 작용하는 항체를 방출시킬 수 있는 유도체로써 기니아 피그에 접종시 디프테리아 독소와 면역학적으로 상호 작용하는 물질이다. 다양한 유도체가 이미 공지되어 있으며 종종 CRM 단백질(상호 작용 물질)로 언급되고 있으며 예를 들면 CRM9, CRM45, CRM102, CRM 103, CRM107을 들 수 있다[8]. 통상적인 그 유도체는 오직 예를 들면 1,2,3,4 또는 5개의 아미노산 변이, 단일 아미노산 삽입 치환 또는 삭제에 의해 야생형 독소와 구별되는 디프테리아 독소 변이체이다. 그러나 예를 들면 CRM45와 같은 트렁크화 변이체도 알려져 있다. 이러한 변이체는 성숙된 독소의 서브 유니트 A 및/또는 B 내에 존재할 수 있다. 서브 유니트 A는 독소의 효소 활성에 관여하고 반면 서브 유니트 B는 목적 숙주 세포에의 결합에 관여한다.
본 발명은 디프테리아 독소 유도체에 관한 한 바랍직한 유도체로써 CRM197[16,17]을 들 수 있으며 상기 유도체는 서브 유니트 A의 Gly-52의 야생형 잔기가 글루타메이트로 치환된 것으로 독소의 NAD:EF2 ADP-리보실트랜스퍼라제 활성을 감소시킨 것이다. 바람직한 실시태양에서 본 발명은 디프테리아 독소 유도체의 생산보다는 디프테리아 독소 이는 순차적으로 톡소이드의 생산에 사용되는 것으로 디프테리아 독소의 유도체에 관한 참고사항은 무시할 수 있는 것이다.
해독
하나의 측면에서 본 발명은 디프테리아 톡소이드를 제조하기 위해 디프테리아 독소를 해독하는 방법에 관한 것이다. 하나의 실시태양에서 본 발명은 디프테리아톡소이드를 제조하기 위한 방법에 관한 것으로, 이 방법은 (ⅰ) 동물-유래 성분이 제거된 발효 배지 내에서 디프테리아 독소를 발현하는 코리네박테리움 디프테리아의 균주를 배양 성장시키는 단계; (ⅱ) 정제된 디프테리아 독소를 얻기 위해 발효 배지로부터 디프테리아 독소를 정제하는 단계; (ⅲ) 정제된 디프테리아 독소에 바람직하게는 포름알데하이드와 같은 적합한 해독제를 첨가하는 단계; 및 (ⅳ) 디프테리아 톡소이드를 수득하기 위해 바람직하게는 포름알데하이드와 같은 해독제의 존재 하에서 정제된 디프테리아독소를 인큐베이션 시키는 단계;를 포함하는 것이다.
예를 들면 CMR197과 같은 디프테리아 독소의 비-독성 유도체도 해독과정에 해당될 수 있으며, 이와 같은 경우에는 바람직하게는 포름알데하이드와 같은 적합한 해독제와의 가교-결합의 목적은 일반적으로 독소 활성의 제거라기보다는 단백질 안정화에 있는 것이다.
하나의 실시태양에서 발효 배지는 효모 추출물을 포함한다. 특정 실시태양에서 효모 추출물은 모든 필수 아미노산의 유일한 원료이다. 또 다른 특정 실시태양에서 발효 배지는 본 발명의 발효 배지이다.
본 발명은 또한 (ⅰ) 발효 배지 내에서 디프테리아독소 또는 그 유도체를 발현하는 코리네박테리움 디프테리아 균수를 성장시키는 단계; (ⅱ) 디프테리아 독소 용액을 수득하기 위해 발효 배지로부터 디프테리아독소 또는 그 유도체를 분리시키는 단계; (ⅲ) 디프테리아 독소 용액으로부터 디프테리아 독소 농축물을 제조하는 단계; (ⅳ) 농축물에 아민과 함께 바람직하게는 포름알데하이드와 같은 적합한 해독제를 첨가시키는 단계; 및 (ⅴ) 디프테리아톡소이드를 수득하기 위해 아민과 해독제의 존재 하에서 농축액을 인큐베이션 시키는 단계;로 이루어진 디프테리아 톡소이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
독소 농도
해독과정 내에서 디프테리아 독소 또는 그 유도체의 농도는 백신 생산을 위한 대량의 디프테리아 톡소이드를 제공하기 위해 일련의 효율적인 산업적 공정을 제공한다는 점에서 특히 중요한 것이다. 안전성을 위하여 해독은 일반적으로 6주 이상의 기간동안 수행된다. 따라서 큰 용량이 해독과정에 진행될수록 추가적 저장공간을 필요로 하는 것이다. 또한 해독은 인큐베이터 내에서 36±2℃에서 진행된다. 따라서 작은 용량을 사용할수록 해독 과정에 필요한 에너지는 상당히 감소되는 것이다. 해독 단계 내에서 디프테리아 독소 또는 그 유도체의 농도가 높을수록 해독 단계에 사용되는 양은 더욱 줄어들 것이다. 농축에 의해 용량의 20배 감소는 300L 인큐베이터로부터 디프테리아 독소 또는 그 유도체가 20L 병에서 쉽게 처리될 수 있음을 의미한다. 따라서 정제 단계 후에 수득되는 정제 디프테리아 독소 벌크는 해독 단계 이전에 농축시키는 것이 바람직하다.
하나의 실시태양에서 농축물 내의 디프테리아 독소 또는 그 유도체의 농도는 최종 발효 배지 내의 디프테리아 독소 또는 그 유도체의 농도에 비해 적어도 20배 이상이다. 또 다른 실시태양에서 농도는 적어도 25배 이상, 예를 들면 적어도 30배 이상 또는 적어도 35배 이상이다.
통상적으로 농축물 내의 디프테리아 독소 또는 그 유도체의 농도는 2,000Lf/mL 내지 5,000 Lf/mL의 범위이다. 특정 실시태양에서 해독되는 농축물 내에 디프테리아 독소 또는 그 유도체의 농도는 적어도 2,000 Lf/mL 이상이다. 또 다른 실시태양에서 농도는 적어도 3,000 Lf/mL 이상이다. 특정 실시태양에서 농도는 적어도 5,000 Lf/mL 이상이다. 이와 같은 농도는 예를 들면 한외여과 또는 다른 알려진 방법에 의해 코리네박테리움디프테리아배양물로부터 정제 후에 수득되는 디프테리아 독소 용액을 농축시킴으로써 이루어지는 것이다.
바람직한 실시태양에서 예를 들면 디프테리아독소 또는 그 유도체와 같은 해독 단계의 출발물질은 예를 들면 본 발명의 발효 배지와 같은 효모 추출물을 포함하는 동물-유래 성분이 제거된 발효 배지 내에서 디프테리아 독소를 발현시키는 코리네박테리움디프테리아균주의 배양 성장에 의해 수득되는 것이다. 또 다른 바람직한 실시태양에서 디프테리아독소는 식물-유래 성분이 또한 제거된 발효 배지를 사용하여 제조되는 것이다.
아민 농도
포름알데하이드와 같은 적합한 해독제에 의해 해독 단계 내에서 아민의 포접(inclusion)은 디프테리아독소의 가교-결합이 다중 복합체로 전환시키는 것을 방지한다. 그러나 아민의 높은 농도는 해독제의 더 높은 농도를 요구한다. 포름알데하이드와 같은 해독제의 독성 때문에 톡소이드화 단계에서 낮은 아민의 농도가 더욱 바람직하며 이는 더 적은 해독제를 사용 가능케 하고 따라서 백신 생산과정 중에 더 적은 함량의 독성 폐기물을 생성시키는 것이다.
하나의 실시태양에서 해독과정 중에 첨가되는 아민의 농도는 0.1M 이내이다. 또 다른 실시태양에서 농도는 0.05M 이내이다. 또 다른 실시태양에서 농도는 0.025M 이내이다. 특정 실시태양에서 해독과정에 사용되는 아민의 농도는 0.025M 내지 0.1M 범위이다. 특정 실시태양에서 농도는 약 0.025M이다.
특정 실시태양에서 아민은 1차 또는 2차 아미노 그룹을 포함하는 분자량 200 달톤 이내의 지방족 디아민이다. 예를 들면 글리신, 알라닌, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산이 사용될 수 있다. 바람직하게는 아미노산은 2개의 염기성 아미노 그룹을 지닌 것이다. 더욱 바람직하게는 아미노산은 라이신이다. 라이신은 특히 등전점이 4.0 내지 5.0 인 범위를 지닐 때 디프테리아 톡소이드의 제조에 더욱 적합한 것이다.
일반적으로 아미노산과 같은 자연에 존재하는 아민의 사용이 바람직하고 이는 더 높은 생체적합성과 백신의 형태로 제조시 부작용의 위험성을 줄일 수 있기 때문이다. 한편 에틸렌디아민과 같은 아민이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
0.025M의 라이신과 1%의 포르말린 또는 40%(v/v) 포름알데하이드를 결합하여 사용하면 다중 복합체의 형성을 감소시킬 뿐 아니라 디프테리아 독소의 대다수가 단량체 형태로 존재하는 특히 바람직한 디프테리아 톡소이드 조성물을 생성시킬 수 있다.
해독제
디프테리아 독소의 독성으로 인한 백신접종 중에 부작용을 방지하기 위하여 독성은 예를 들면 적합한 해독제의 존재 하에 디프테리아독소 농축물을 인큐베이션 시키는 단계에 의해 제거된다. 만약 해독제의 농도가 너무 높게 사용된다면 디프테리아 톡소이드 벌크로 제조된 최종 백신은 인간에 사용하기에 적합하지 않은 양의 해독제 농도 수준을 포함할 수 있다. 따라서 오직 일정 해독제 농도 범위만이 인간 백신 생산을 위한 적합한 디프테리아 톡소이드 벌크의 제조를 위해 허용될 수 있다.
바이러스 또는 박테리아와 같은 미생물의 불활성화를 유도하는 어느 작용제도 단백질의 해독에 적합할 수 있다. 일반적으로 단백질 해독에 필요한 작용제의 농도는 바이러스와 같은 불활성화를 위해 사용되는 작용제의 농도보다 약 10 내지 20배 높다. 예를 들면 0.05%의 포르말린(40%(v/v)의 포름알데하이드)은 바이러스 불활성화에 충분하고 1%의 포르말린은 포름알데하이드 처리에 의한 단백질의 해독에 사용된다. 또한 해독을 위해 사용되는 온도는 바이러스의 불활성화에 필요한 온도보다 더 높을 수 있다. 그러나 단백질의 변성을 유도하게 되는 작용제, 농도 및 온도는 단백질 항원의 면역원성의 저하를 야기케 하여 인간 백신에 사용되는 디프테리아 톡소이드의 제조에 적합하지 않다.
적합한 해독제로는 포름알데하이드, 글루타르알데하이드 및 β-프로피올락톤(BPL)과 같은 알킬화제 및 수화페록사이드를 포함하는 과산화물을 포함한다. 특히 참고문헌 18에 기재된 다관능성 유기 페록사이드가 적합하다. 해독제로써 BPL의 사용은 참고문헌 19에 더 자세히 기재되어 있다.
포름알데하이드, 글루타르알데하이드, β-프로피올락톤(BPL) 및 수화페록사이드와 같은 과산화물을 사용한 디프테리아 독소의 처리는 분자내(intramolecular) 결합을 야기시킨다. 이러한 결합은 디프테리아 독소 내 아미노산 사슬이 서로 가교-결합시 형성되는 것이다. 발효 배지로부터의 잔류성분 뿐만 아니라 해독 과정에서 존재하는 아민은 해독제 존재시 디프테리아 독소를 또한 가교-결합시킨다. 따라서 특히 적합하고 바람직한 해독제는 가교-결합제이다.
하나의 실시태양에서 해독 과정 내의 바람직하게는 포르말린과 같은 적합한 해독 작용제의 농도는 0.5% 내지 1% 범위이다. 또 다른 실시태양에서 농도는 0.75% 내지 1% 범위이다. 특정 실시태양에서 해독제의 최종 농도는 약 1%이다.
해독제로써 포름알데하이드의 사용이 바람직하다. 최종농도 0.5% 내지 1%의 포르말린(예를 들면 40%(v/v) 포름알데하이드)은 적어도 2,000 Lf/mL의 디프테리아 독소 농축물의 독성을 제거하는 데 충분하다. 5,000 Lf/mL 디프테리아 독성 농축물에서도 1% 포르말린을 사용하여 해독시켰을 때 37℃에서 6주간 저장 후 다시 독성화되지는 않는 것으로 관찰되었다.
이와 같은 발견에 근거하여 1 Lf의 디프테리아독소 당 아민의 농도와 1 Lf 디프테리아 독소 당 포름알데하이드의 농도를 계산할 수 있다. 더욱 특정 실시태양에서 본 발명은 적어도 2,000 Lf/mL 농도의 디프테리아 독소 용액을 제조하는 단계; 1 Lf의 디프테리아독소 당 5nmol 이내의 아민과 1 Lf의 디프테리아 독소 당 12nmol 내지 55nmol의 포름알데하이드 바람직하게는 18nmol 내지 25nmol의 포름알데하이드를 첨가하는 단계; 및 디프테리아 톡소이드를 수득하기 위해 얻어진 용액을 인큐베이션 시키는 단계;로 이루어진 디프테리아 톡소이드의 제조방법에 관한 것이다. 통상적으로 용액 내의 디프테리아독소 또는 그 유도체의 농도는 2,000 Lf/mL 내지 5,000 Lf/mL 범위이다. 특정 실시태양에서 디프테리아 독소 농도는 5,000 Lf/mL이다. 아민은 바람직하게는 라이신이다.
해독을 위한 포름알데하이드는 예를 들면 수용액으로써 통상 포르말린 형태로 사용한다. 포르말린은 통상 약 40%(v/v) 포름알데하이드를 포함하는 포화된 수용액이다. 포르말린은 또한 적은 양의 메탄올과 같은 안전화제를 포함할 수 있으며 이는 산화 또는 중합을 방지한 것이다.
만약 포름알데하이드를 해독제로 사용한다면 본 발명의 해독 과정으로부터 생성된 디프테리아 톡소이드 용액은 오직 0.2g/L의 유리 포름알데하이드를 포함할 수 있으며 이는 용액 내에서 포름알데하이드가 단백질의 가교-결합을 형성시키지 못하는 정도이다. 예를 들면 본 발명의 해독 과정으로부터 생성된 디프테리아 톡소이드 용액은 0.1g/L 내지 0.15g/L의 유리 포름알데하이드를 포함한다.
이후 처리 단계
본 발명에 상응하는 디프테리아 톡소이드의 제조방법은 또한 하나 또는 그 이상의 여과-멸균 단계를 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서 해독에 사용되는 디프테리아 독소 농축물은 바람직하게는 포름알데하이드와 같은 적합한 해독제의 첨가 이전에 여과-멸균된다. 다른 하나의 실시태양에서 본 발명의 해독 과정으로부터 제조된 디프테리아 톡소이드는 여과-멸균된다. 또 다른 실시태양에서 디프테리아 독소 농축물과 디프테리아 톡소이드는 여과-멸균된다. 디프테리아 톡소이드의 제조단계 내에서 하나 또는 그 이상의 여과-멸균 단계를 진행하는 것은 오염된 박테리아의 성장을 방지하기 위한 보존제의 사용을 회피할 수 있는 이점이 있다. 보존제 사용의 회피는 본 발명의 디프테리아 톡소이드로 이루어진 백신을 인간에게 접종하였을 때 보존제에 의해 야기되는 부작용을 줄일 수 있다. 만약 보존제가 저장을 위해 디프테리아 톡소이드에 첨가된다면 페놀 이외의 보존제가 바람직하다. 바람직한 실시태양에서 디프테리아 톡소이드에 보존제를 첨가하지 않는 것이 바람직하다.
하나의 실시태양에서 디프테리아 톡소이드의 제조방법은 미립자 여과 단계를 더욱 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서 본 방법은 저장을 위해 디프테리아 톡소이드를 농축하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 저장을 위해 높은 단백질 농도가 바람직하며 이는 디프테리아 톡소이드 벌크가 희석된 형태로 저장되는 경우보다 디프테리아 톡소이드 벌크의 더 적은 품질 저하를 유발하기 때문이다. 특정 실시태양에서 정용 여과에 의해 농축이 시행된다. 특정 실시태양에서 저장을 위한 디프테리아 톡소이드의 최종 농도는 10,000 Lf/mL이다. 따라서 본 발명은 또한 농축된 수용액 형태의 디프테리아 톡소이드를 예를 들면 적어도 일주일, 적어도 1달 또는 적어도 3달의 기간동안 저장하는 방법을 제공하며, 이 때 디프테리아 톡소이드의 농도는 적어도 5,000 Lf/mL, 적어도 7,500 Lf/mL, 적어도 10,000 Lf/mL 등이다.
다른 실시태양에서 디프테리아 톡소이드를 제조하기 위한 방법은 얻어진 디프테리아 톡소이드 용액의 pH를 6.0 내지 8.0으로 조정시키는 단계를 더욱 포함한다. 이 pH에서 디프테리아 톡소이드는 인간에게 접종하기에 안정하고 적합하다. 특정 실시태양에서 최종 디프테리아 톡소이드 용액의 pH는 7.2 내지 7.8로 조정되었다. 더욱 특정 실시태양에서 최종 디프테리아 톡소이드 용액의 pH는 7.5로 조정된다.
디프테리아
톡소이드
조성물
본 명세서 내에서 개시된 디프테리아 독소 또는 그 유도체의 해독 단계를 위해 채택하는 방법은 공지의 방법으로 제조된 톡소이드보다 더 높은 순도를 지니는 디프테리아독소의 일부를 제공한다. 특히 본 발명의 방법에 의해 생성되는 디프테리아 톡소이드는 가교-결합된 동물-유래 성분이 제거되어 있다. 발효 배지 및 해독 과정 내의 동물-유래 성분의 회피는 최종 물질에는 동물-유래 성분이 완전히 제거되어 있음을 의미하며 톡소이드화 과정에서 그 어느 성분도 독소와 공유결합으로 가교-결합되지 않음을 의미한다. 반면 동물-유래 성분을 포함하는 배지 내에서 성장시킨 후 제조되는 선행기술의 톡소이드는 필수적으로 가교-결합된 동물-유래 성분을 포함하는 것이다. 물론 이와 같은 성분은 통상적인 분석 에세이에 의해 감지되지 않을 수도 있다. 따라서 본 발명의 톡소이드는 프리온과 같은 물질이 완전히 제거된 균일한 조성물이기 때문에 매우 유익한 것이다.
어느 실시태양에서 동물-유래 성분이 제거된 디프테리아 독소의 생성에 사용되는 발효 배지는 또한 예를 들면 식물 펩톤과 같은 식물-유래 성분도 포함하지 않는다. 식물-유래 성분을 제거시킨 발효 배지를 사용함으로써 식물-유래 펩톤을 제조하기 위해 사용되는 식물 물질의 표면 위에 존재할 수 있는 위험한 바이러스의 도입이 차단된 추가적 이점을 지닌다. 따라서 본 발명의 특정 실시태양에서 디프테리아 톡소이드는 동물-유래 성분 및 식물-유래 성분 모두가 제거된 것이다.
특정 실시태양에서 디프테리아 독소 또는 그 유도체의 해독 단계는 적어도 90% 순도를 지니는 디프테리아톡소이드를 생성시킨다. 이 때 디프테리아 톡소이드의 순도는 HPLC 분석 내에서 피크 면적에 의해 계산되는 양으로 정제된 물질 내의 단백질 질량이 적어도 90% 이상임을 의미한다. 또 다른 특정 실시태양에서 본 명세서 내에 개시된 디프테리아 독소 또는 그 유도체의 해독 과정은 적어도 95% 순도를 지닌 디프테리아 톡소이드를 제공한다. 또 다른 특정 실시 태양에서 본 명세서 내에서 개시된 디프테리아 독소 또는 그 유도체의 해독 과정은 알러지 반응을 유발시키기에는 충분치 않은 양으로 효모 성분을 포함하는 디프테리아 독소를 제공하는 것이다.
다른 하나의 실시태양에서 디프테리아 독소 또는 그 유도체의 해독 단계는 1,500 Lf/mg 이상의 질소를 지니는 디프테리아 톡소이드를 생성시킨다. 또한 본 발명의 해독 단계로부터 제조된 바람직한 디프테리아톡소이드 용액은 1,500 Lf/mg 이상의 질소를 포함한다. 특정 실시태양에서 본 발명의 해독 단계로부터 제조된 바람직한 디프테리아톡소이드 용액은 2,000 Lf/mg 이상의 질소를 포함한다. 특정 실시태양에서 본 발명의 해독 단계로부터 제조된 바람직한 디프테리아톡소이드 용액은 2,100 Lf/mg 이상의 질소를 포함한다. 또 다른 특정 실시태양에서 본 발명의 해독 단계로부터 제조된 바람직한 디프테리아톡소이드 용액은 2,700 Lf/mg 이상의 질소를 포함한다.
본 발명은 또한 본 명세서 내에서 설명된 어느 방법들의 조합과도 관련이 있다. 예를 들면 본 발명의 발효 배지 내의 코리네박테리움 디프테리아 균주의 배양으로 이루어진 디프테리아 독소 또는 그 유도체의 제조 방법은 본 발명에 개시된 디프테리아 톡소이드를 제조하는 방법과 결합될 수 있다. 이러한 방법의 결합은 특히 유익한 것이며 그 이유는 본 방법에서는 동물-유래 성분의 채택 필요성 없이 고순도 정제된 디프테리아 톡소이드를 제공하기 위한 매우 높은 수율로 산업적 생산 방법을 제공하기 때문이다.
본 발명의 방법은 인간 백신의 제조에 사용하기에 적합한 조성물을 제공한다. 이는 적어도 5L의 용량을 지니며 적어도 1,500 Lf/mg 단백질 질소의 특정 순도를 지닌 동물-유래 성분이 제거된 가교-결합된 디프테리아 톡소이드를 제공하는 것이다. 어느 실시태양에서 이와 같은 벌크 조성물은 500 Lf/mL 이상 바람직하게는 1,000 Lf/mL 이상, 2,000 Lf/mL 이상, 3,000 Lf/mL 이상, 4,000 Lf/mL 이상, 5,000 Lf/mL 이상의 디프테리아 톡소이드 농도를 지닌 것이다. 벌크 조성물 내에 통상적인 디프테리아 톡소이드 농도는 2,000 Lf/mL 내지 5,000 Lf/mL 범위이다. 하나의 실시태양에서 상기 벌크 조성물은 2,000 IU/mL 이상의 바람직하게는 3,000 IU/mL 이상, 5,000 IU/mL 이상, 8,000 IU/mL 이상, 10,000 IU/mL 이상의 역가를 지닌다. 벌크 조성물의 용량은 5L 내지 2,000L 이고 바람직하게는 100L 내지 1,000L 범위이다. 통상적인 벌크 용량은 예를 들면 50L, 100L, 500L 및 1,000L이다. 디프테리아 톡소이드 벌크의 고농축된 대용량과 특정 순도 이상의 고역가는 본 발명을 종래의 방법 어느 것과도 구별될 수 있게 하는 것이며 이는 종래의 방법에서는 본 발명의 방법에 의해 성취되는 용량, 농도, 역가 및 순도 수준에 도달할 수 있을 정도로 적절한 조성물을 생산할 수 없었기 때문이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 디프테리아 톡소이드에 관한 것으로 이 때 디프테리아 톡소이드는 단량체:이량체 비율이 3:1 내지 8:1 범위이고 등전점이 4.0 내지 5.0 범위인 것이다. 하나의 실시태양에서 본 발명의 디프테리아 독소는 알러지 반응을 유발시키기에는 충분하지 않은 추적 가능한 양의 효모 성분을 포함하나 다른 실시태양에서 본 발명의 디프테리아 톡소이드는 동물-유래 성분 뿐만 아니라 이스트 성분 모두가 필수적으로 제거된 것이다. 특정 실시태양에서 본 발명의 디프테리아 톡소이드는 동물-유래 성분이 제거된 것이다. 바람직하게는 디프테리아 톡소이드는 해독제 잔기가 측정 가능한 수준에서 제거된 즉 가교-결합을 지니지 않은 것이다. 이 경우 유리된 상태의 해독제 잔기가 존재한다. 예를 들면 본 발명의 디프테리아 톡소이드는 0.001g/L 이하의 유리 포름알데하이드가 존재한다. 바람직하게는 본 발명의 디프테리아 톡소이드는 0.0001g/L 이하의 유리 포름알데하이드를 포함하는 것이다.
하나의 실시태양에서 본 발명의 조성물은 단량체 및 이량체 형태의 디프테리아 톡소이드를 포함한다. 이 때 적어도 80%의 디프테리아톡소이드는 단량체 형태이고 조성물 내에는 동물-유래 성분이 제거되어 있다.
하나의 측면에서 본 발명은 가교-결합된 동물-유래 성분이 제거된 디프테리아 톡소이드를 포함하는 인간 백신에 적합한 조성물에 관한 것이다. 이 때 상기 조성물은 유니트 용량 당 적어도 30IU의 역가를 지닌다. 하나의 특정 실시태양에서 본 발명의 조성물은 디프테리아 독소의 단량체:이량체 비율이 3:1 내지 8:1 범위를 지니는 것으로 디프테리아톡소이드는 조성물 상태에서 4.0 내지 5.0 범위의 등전점을 지닌다. 또 다른 특정 실시태양에서 본 발명의 조성물은 단량체 및 이량체 모두를 포함하는 디프테리아 톡소이드를 포함하는 것이며 이 때 적어도 70%의 디프테리아 톡소이드는 단량체 형태이다. 어느 실시태양에서 본 발명의 조성물은 코리네박테리움 디프테리아 이외에 적어도 하나의 병원체로부터 보호 항원을 포함한다. 보호항원은 B형 간염바이러스 표면항원, 파상풍 항원, 백일해 항원, Hib 항원, 수막염구균 항원, 폐렴구균 항원, 소아마비 항원이다.
백신 제형
본 발명은 또한 본 발명의 디프테리아 톡소이드를 포함하는 백신 조성물을 포함하는 것이다. 이러한 백신 조성물은 본 발명의 디프테리아 톡소이드 제조 방법을 사용하여 제조된다. 이 조성물에 있어서 디프테리아 톡소이드의 역가는 단일 유니트 용량 당 적어도 20IU 이상이어야 한다. 통상적인 조성물 내에서 디프테리아 톡소이드의 역가는 적어도 25IU/도스이고 바람직하게는 적어도 50IU/도스이다. 본 발명의 백신 조성물은 동물-유래 성분이 포함된 배지로부터 제조된 디프테리아톡소이드를 포함하는 백신 조성물에 부작용을 나타내는 환자에 투여에 더욱 적합한 것이다. 본 발명의 백신 조성물은 알러지 부작용이 발생할 수 있는 위험성을 지닌 환자의 접종에 더욱 적합한 것이다. 이는 예를 들면 소고기 알러지 또는 젖소 우유 알러지와 같은 동물-유래 성분에 알러지를 지닌 것으로 진단된 환자를 포함하는 것이다.
이러한 백신 조성물은 일반적으로 코리네박테리움 디프테리아 이외의 적어도 하나의 다른 병원체 항원을 포함하는 조합백신으로 개발될 수 있다. 본 발명에 따라 조합백신을 제조하기 위한 방법은 동물-유래 성분이 제거된 적어도 1,500 Lf/mg 단백질 질소의 특정 순도를 지닌 가교-결합 디프테리아 톡소이드를 코리네박테리움 디프테리아 이외의 다른 적어도 하나의 병원체 보호항원과 혼합하는 단계를 통상 포함한다. 통상적으로 디프테리아 톡소이드 벌크와 보호항원을 포함하는 백신 벌크 모두는 혼합단계 이전에 수용액으로 존재한다. 고농축 디프테리아톡소이드를 지닌 디프테리아 톡소이드 벌크 조성물은 다른 보호항원과 결합하기 이전에 물 또는 완충액과 같은 수용성 성분 내에서의 희석을 필요로할 수 있다. 단일 용량 바이알 내에 디프테리아톡소이드와 적어도 하나의 보호항원의 최종 혼합액을 분주시킴으로써 단일 유니트 용량이 제조된다.
예를 들면 혼합 백신으로 적어도 1000 단일 유니트 용량의 제조방법은 동물-유래 성분이 제거된 적어도 1500 Lf/mg 단백질 질소 특정 순도를 포함하는 가교-결합 디프테리아 톡소이드와 코리네박테리움 디프테리아 이외의 적어도 하나의 다른 병원체 보호항원을 조합백신을 수득하기 위해 혼합시키는 단계, 조합백신을 적어도 1000 단일 유니트 용량에 분주시키는 단계를 포함하고 여기서 이 방법으로 수득되는 각각의 단일 유니트 용량에 적어도 20IU의 디프테리아톡소이드를 포함시킬 수 있도록 주의깊게 인간 접종에 적합한 백신을 제조하는 것이다.
본 발명은 또한 조합백신 벌크를 제조하기 위해 예를 들면 파상풍 항원, 백일해 항원, B형 간염바이러스, 소아마비 등과 같은 디프테리아항원 이외의 적어도 하나 이상의 벌크 항원과 디프테리아 톡소이드 벌크를 혼합시키는 단계, 조합 백신벌크로부터 조합백신 내에 적어도 1000 유니트 용량 예를 들면 10000 이상 또는 50000 이상의 유니트 용량을 제조하는 단계로 이루어진 단일 용량 형태로 조합백신을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 이 때 (a) 각각의 유니트 용량은 인간 접종에 적합한 것이고 적어도 20IU의 디프테리아 톡소이드를 포함하며, (b) 디프테리아톡소이드 벌크는 동물-유래 성분이 제거된 가교-결합된 디프테리아 톡소이드를 포함하는 것으로 적어도 1500Lf/mg 단백질 질소 특이 순도와 적어도 2000IU/ml의 역가를 지니는 것이다. 디프테리아독소 벌크와 다른 항원의 벌크를 혼합하는 단계는 원하는 항원 농도를 제공하기 위해 수용액 내에서 희석된 혼합 단계를 포함할 수 있다.
추가적인 보호항원은 바이러스 및/또는 박테리아일 수 있다. 통상적인 박테리아 병원체는 클로스트리디움 테타니, 보르데텔라 펄투시스, 헤모필러스 인플루엔자 b형, 혈청그룹 A,B,C W135 및/또는 Y를 포함하는 네이세리아 메닝티디스 및 혈청형 6B, 14, 19F 및 23F를 포함하는 스트렙토코커스 뉴모니아일 수 있으며 이에 한정하는 것은 아니다. 또한 통상적인 바이러스 병원체는 소아마비 바이러스, A형 간염바이러스, 홍역바이러스, 볼거리바이러스, 풍진바이러스 및 수두대상포진바이러스 등이며 이로 한정하는 것은 아니다.
파상풍
클로스트리디움 테타니는 파상풍을 유발한다. 파상풍 독소는 보호 톡소이드를 공여할 수 있도록 처리될 수 있다. 파상풍 백신에 사용되는 톡소이드는 참고문헌 1의 27장에 상세히 개시되어 있다. 따라서 본 발명의 조합백신은 파상풍 톡소이드를 포함할 수 있다. 바람직한 파상풍 톡소이드는 포름알데하이드 처리되어 제조된 것이다. 파상풍 톡소이드는 예를 들면 우(bovine) 카제인으로부터 유래된 Latham 배지와 같은 성장 배지 내에서 클로스트리디움 테타니를 성장시키는 단계, 포름알데하이드를 처리하는 단계 및 한외여과 및 침전 단계를 통해 수득될 수 있다. 이 물질은 그 후 멸균-여과 및/또는 투석 단계에 의해 처리될 수 있다.
파상풍 톡소이드의 양은 톡소이드의 양으로 한정하여 Lf 단위로 표현될 수 있으며 이는 항독소의 국제단위로 사용되는 것으로 톡소이드는 최적의 응집 혼합물 내에서 생성되는 것이다[74]. NIBSC에서 응집 시험용 파상풍 톡소이드 1차 국제 표준 시약을 제공하며 이 시약에는 앰플 당 1000 Lf의 파상풍 단위를 포함하고 이를 통해 측정할 수 있는 것이다.
파상풍 톡소이드의 면역 역가는 국제 단위(IU)로 측정되고 앰플 당 적어도 469IU를 포함하는 예를 들면 NIBSC의 3차 국제 표준 2000에 흡착된 파상풍 톡소이드를 참조 백신으로 하여 통상 기니아 피그와 같은 실험동물 내에서 조성물에 의해 제공되는 보호 효과를 비교함으로써 측정된다. 본 발명의 조성물 내의 파상풍 독소 역가는 적어도 도스 당 35IU 바람직하게는 적어도 70IU/ml이다.
백일해
보르데텔라 펄투시스는 백일해의 원인균이다. 백신 내 백일해 항원은 불활성화된 보르데텔라 펄투시스 세포 형태로 전세포(wP)인 세포형이거나 비세포형(aP) 이다. 따라서 본 발명의 조합백신은 세포형 백일해 항원 또는 비세포형 백일해 항원을 포함할 수 있다.
세포용 백일해의 제조방법은 참고문헌 1의 21장에서 상세히 기재되어 있으며 예를 들면 보르데텔라 펄투시스의 1상 배양물의 열 불활성화에 의해 수득될 수 있다. 비세포 항원을 사용하는 경우에는 하나 또는 둘 바람직하게는 3개의 다음 항원들을 포함할 수 있다. (1) 해독된 백일해 항원 또는 백일해 톡소이드(PT), (2) 필라멘트형 헤마글루티닌(FHA), (3) 69kDa의 외부 멤브레인 단백질로 알려진 펄탁틴이다. 이들 3개의 항원들은 변형된 Stainer-Scholte 액체 배지 내에서 성장된 보르데텔라 펄투시스로부터 분리하여 바람직하게 제조된다.
PT와 FHA는 예를 들면 하이드록시아파타이트 겔에 흡착에 의하여 배지 브로스로부터 분리되는 반면에 펄탁틴은 예를 들면 염화바륨을 사용하여 열 처리 및 응집에 의해 세포로부터 추출될 수 있다. 항원은 순차적인 크로마토그라피 및/또는 침전 단계를 통해 정제된다. PT 및 FHA는 소수성 크로마토그라피, 친화성 크로마토그라피 및 크기 배제 크로마토그라피에 의해 정제될 수 있다. 펄탁틴은 이온 교환 크로마토그라피, 소수성 크로마토그라피 및 크기 배제 크로마토그라피에 의해 정제될 수 있다. FHA 및 펄탁틴은 본 발명에 따른 사용 이전에 포름알데하이드로 처리될 수 있다. PT는 포름알데하이드 및/또는 글루타르알데하이드로 처리하여 바람직하게 해독된다. 이 화학적 해독 방법의 대안으로써 PT는 효소활성이 돌연변이에 의해 감소된 변이 PT를 사용할 수 있지만[23] 화학처리에 의한 해독이 좀 더 일반적이다.
wP 항원의 양은 국제 단위(IU)로 측정된다. 예를 들면 NIBSC는 백일해 항원 3차 국제 표준을 제공하며[24] 이는 앰플 당 46IU를 포함한다. 각각의 앰플은 미국 불투명(opacity) 표준에 따라 180 불투명 유니트에 상당하는 것인 10L의 박테리아 현탁액을 8L의 M/15 Sorensen 완충액 pH 7.0으로 희석시킨 수용액의 2.0ml 알리쿼트의 동결-건조 잔류물을 포함한다. IU 시스템의 대안으로 OU 유니트(불투명도 유니트)를 사용할 수 있으며 예를 들면 4OU는 약 1IU에 해당한다. 본 발명의 조성물 내의 wP 항원의 농도는 일반적으로 적어도 8IU/ml 예를 들면 4IU/도스이다.
aP 항원의 양은 일반적으로 μg으로 표현된다. 백신 내 PT의 농도는 일반적으로 5μg/ml, 16μg/ml, 20μg/ml 또는 50μg/ml이다. 백신 내 FHA의 농도는 일반적으로 10μg/ml, 16μg/ml 또는 50μg/ml이다. 백신 내 펄탁틴의 농도는 일반적으로 5μg/ml, 6μg/ml 또는 16μg/ml이다.
Hib
헤모필러스 인플루엔자 b형(Hib)은 박테리아성 수막염의 원인균이다. Hib 백신은 예를 들면 참고문헌 1의 14장에 기재된 협막다당 항원에 근거하여 제조되며 이의 제조 방법은 예를 들면 참고문헌 25 내지 34에 잘 개시되어 있다. 헤모필러스 인플루엔자 박테리아는 동물-유래 성분 부재 하에서 배양될 수 있다. Hib 다당체는 특히 소아에게 그의 면역원성을 증가시키기 위해 전달 단백질에 결합되어 있다. 통상적인 이러한 콘쥬게이트를 형성하는 전달 단백질은 파상풍 통소이드, 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소의 CRM197 유도체 또는 수막염구균 혈청그룹 B로부터의 외부 멤브레인 단백질 복합체일 수 있다. 따라서 본 발명의 조합백신은 전달 단백질에 콘쥬게이트된 Hib 협막 다당체를 포함할 수 있는 것이다.
파상풍 톡소이드는 바람직한 전달체로써 PRP-T로 통상 언급되는 제품을 사용한다. PRP-T는 시아노겐 브로마이드를 사용하는 Hib 협막 다당체를 활성화시키는 단계, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드의 통상 염산염 형태로 에디프산 링커로 사용하여 활성화된 다당체를 커플링시키는 단계 및 링커-다당체 성분을 파상풍 톡소이드 전달 단백질과 반응시키는 단계에 의해 제조될 수 있다. 콘쥬게이트의 다당체 성분은 Hib 박테리아로부터 제조된 전체 길이 폴리리보실리보톨 포스페이트(PRP) 및/또는 전체 길이 PRP의 단편을 포함할 수 있다. 1:5 (과량의 단백질) 내지 5:1(과량의 다당체)의 다당체:단백질의 비율(w/w)을 지닌 접합체(conjugate)가 사용될 수 있으며 상기 비율은 1:2 내지 5:1 바람직하게는 1:1.25 내지 1:2.5 범위이다. 바람직한 백신으로써 다당체 대 전달 단백질의 중량 비율은 1:2.5 내지 1:3.5 사이이다. 파상풍 톡소이드가 항원뿐만 아니라 전달 단백질로써 존재하는 백신의 경우 콘쥬게이트 내의 다당체 대 전달 단백질의 중량 비율은 1:0.3 내지 1:2 범위이다[35]. Hib 콘쥬게이트의 투여는 0.15μg/ml 이상의 항-PRP 항체 농도, 바람직하게는 1μg/ml 이상의 항체 농도를 야기시키며 이러한 항체 농도가 표준 응답 역치이다.
Hib 항원의 양은 일반적으로 다당체 μg로 표현된다. 백신 내에서 다당체의 농도는 일반적으로 10μg/ml 내지 30 μg/ml 범위이며 예를 들면 20μg/ml이다.
수막염구균
네이세리아 메닝티디스는 박테리아성 수막염의 원인균이다. 유기체의 협막 다당체를 기초로 하여 다양한 네이세리아 메닝티디스의 A, B, C, H, I, K, L, 29E, W135, X, Y 및 Z를 포함하는 혈청그룹이 확인되었다. 네이세리아 메닝티디스 박테리아는 동물-유래 성분의 부재 하에서 배양될 수 있다. 질병과 가장 관련이 있는 혈청그룹은 A, B, C, W135 및 Y이다. 혈청그룹 A, C, W135 및 Y에 대한 현재의 백신은 협막 다당체 항원에 기초하고 있으나 이러한 접근 방법은 혈청그룹 B에는 적합하지 않으며 따라서 단백질 항원 및 외부-멤브레인 비시클이 대신 사용된다[36]. 협막 다당체는 면역원성을 증진시키기 위해 전달 단백질과 접합된다. 통상적인 전달 단백질은 NIMENRIX와 같은 상품명을 지닌 파상풍 톡소이드, MENACTRA와 같은 상품명을 지닌 디프테리아 톡소이드 및 MENVEO와 같은 상품명을 지닌 디프테리아 독소 유도체 CRM197이다. 따라서 본 발명의 조합백신은 하나 또는 그 이상 예를 들면 2, 3 또는 4개의 협막 다당체와 (1) 네이세리아 메닝티디스 혈청그룹 A, (2) 네이세리아 메닝티디스 혈청그룹 C, (3) 네이세리아 메닝티디스 혈청그룹 W135 및/또는 (4) 네이세리아 메닝티디스 혈청그룹 Y에서 선택된 전달 단백질과의 콘쥬게이트를 포함하는 것이다.
콘쥬게이트의 다당체 성분은 수막염구균으로부터 제조된 전체 길이 다당체 및/또는 그 유도체의 단편을 포함할 수 있다. 혈청그룹 C 다당체는 OAc+ 또는 OAc- 균주로부터 제조될 수 있다. 혈청그룹 A 다당체를 위해 바람직하게는 적어도 50% 예를 들면 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 만노사민(mannosamine) 잔기가 C-3 위치에서 O-아세틸화 되어있다. 1:10(과량의 단백질) 내지 10:1(과량의 다당체)의 다당체:단백질 비율(w/w)을 지닌 수막염구균의 콘쥬게이트가 사용될 수 있으며 상기 비율은 예를 들면 1:5 내지 5:1, 1:2.5 내지 2.5:1 또는 1:1.25 내지 1.25:1 범위이다. 콘쥬게이트의 투여는 적어도 4배 바람직하게는 적어도 8배 이상의 관련된 혈청그룹보다 혈청 박테리시달 에세이(SBA) 역가의 증가를 야기시킨다. SBA 역가는 어린 토끼 보체(complement) 또는 인간 보체를 사용해 측정될 수 있다.
수막염구균 항원의 함량은 일반적으로 다당체 μg로 표현된다. 백신 내 다당체의 농도는 일반적으로 혈청그룹 당 5μg/ml 내지 30μg/ml 범위이며 예를 들면 10μg/ml 또는 20μg/ml이다.
폐렴구균
스트렙토코커스 뉴모니아는 박테리아성 수막염균의 원인균이다. Hib 및 수막염구균과 같이 현존하는 백신은 협막 다당체에 기초하고 있다. 스트렙토코커스 뉴모니아 박테리아는 동물-유래 성분의 부재 하에서 배양될 수 있다. 따라서 본 발명의 조합백신은 전달 단백질에 콘쥬게이트 된 폐렴구균 협막 다당체를 포함할 수 있다.
스트렙토코커스 뉴모니아의 하나 이상의 혈청형의 다당체, 특히 적어도 혈청형 6B, 14, 19F 및 23F의 다당체를 포함하는 것이 바람직하다. 또 다른 혈청형은 1, 3, 4, 5, 7F, 9V 및 18C에서 선택되는 것이 바람직하다. 예를 들면 혈청형 23 내의 서로 다른 혈청형으로부터의 다당체 혼합물이 사용되고 있으며 또한 혈청형 5와 혈청형 11 간의 다당체를 콘쥬게이트 시킨 백신이 사용되고 있다[38]. 예를 들면 상품명 PREVNAR는 7개의 혈청형(4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F)의 콘쥬게이트된 다당체를 포함하며 상품명 SYNFLORIX는 10개의 혈청형(1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F)의 콘쥬게이트된 다당체를 포함한다. 다당체는 전달 단백질에 콘쥬게이트 되는 것이 바람직하며 예를 들면 참고문헌 40 내지 42에 개시되어 있다. 전형적인 전달 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소의 유도체 CRM197 및 헤모필러스 인플루엔자 단백질 D이다. 상품명 PREVNAR 내의 다당체는 환원성 아민화반응에 의해 CRM197과 개별적으로 콘쥬게이트 되어 있으며 0.5ml 도스(혈청형 6B 4μg) 당 2μg의 다당체를 지닌다. 상품명 SYNFLORIX는 3개의 다른 전달 단백질과 다른 혈청그룹을 위해 서로 다른 함량을 지닌 다당체 혼합물을 사용한다.
페렴구균 항원의 함량은 일반적으로 다당체 μg로 표현된다. 페렴구균 콘쥬게이트의 농도는 다당체로 측정되며 일반적으로 각 혈청형 당 2μg/ml 내지 20μg/ml 범위이다.
B형 간염바이러스
B형 간염바이러스(HBV)는 바이러스성 간염의 원인 바이러스이다. HBV 비리온은 외측 단백질 코트 또는 캡시드로 둘러싸인 내부 코어로 이루어져 있으며 바이러스 코어는 바이러스 DNA 게놈을 포함하고 있다. 캡시드의 주성분은 HBV 표면 항원 또는 통상 HBsAg로 알려진 단백질이며 이는 일반적으로 분자량이 24kDa 이하인 226-아미노산 폴리펩타이드이다. 모든 현존하는 간염 B 백신은 HBsAg를 포함하며 이 항원을 정상적인 백신 접종자에게 투여할 때 HBV 감염에 보호적인 항-HBsAg 항체 생성을 자극시킨다. 따라서 본 발명의 조합백신은 HBsAg를 포함할 수 있다.
백신 제조를 위해 HBsAg는 2가지 방법으로 제조될 수 있다. 첫 번째 방법은 만성 간염 B 전달체의 혈장으로부터 미립자 형태의 항원을 정제시키는 단계로 이루어진 것으로 다량의 HBsAg가 간에서 합성되고 HBV 감염 동안 혈관 내로 분비된다. 두 번째 방법은 DNA 재조합 방법에 의한 단백질의 발현단계로 이루어진다. 본 발명의 방법에 의한 사용을 위한 HBsAg는 효모 세포 내에서 재조합 형태로 발현되어야 한다. 적합한 효모는 사카로미세스 세레비시에와 같은 사카로미세스, 한센눌라 폴리모르파와 같은 한센눌라 또는 피키아 숙주를 포함한다. 효소는 동물-유래 성분의 부재 하에서 배양될 수 있다.
예를 들면 혈장 정제 제품인 천연 HBsAg와 달리 효모 발현된 HBsAg는 일반적으로 글리코실화 되어있지 않으며 이는 본 발명의 사용을 위한 HBsAg 형태로써 가장 바람직한 것이다. 효모 발현 HBsAg는 높은 면역원성을 지니고 혈액 제품의 오염 위험성 없이 제조될 수 있다. 재조합 효모로부터 HBsAg를 정제하기 위한 다양한 방법들이 이미 공지되어 있다.
HBsAg는 약 20nm의 평균 직경을 지닌 실질적으로 구형인 입자이며 인지질을 포함하는 지질 매트릭스를 포함한다. 효모 발현 HBsAg 입자는 천연 HBV 비리온으로부터 발견되지 않는 포스파티딜이노시톨을 포함할 수 있다. 또한 이 입자는 면역 체계를 자극하기 위하여 비 독성 양의 LPS를 포함할 수 있다[43]. 입자는 만약 효모에 의해 파쇄되어 사용하는 경우에는 예를 들면 폴리소르베이트 20과 같은 비 이온성 계면활성제를 첨가시킬 수 있다.
HBsAg는 HBV 서브타입 adw2로부터가 바람직하다.
HBsAg의 바람직한 정제 방법은 세포 파쇄 이후에 한외여과; 크기 배제 크로마토그라피; 음이온 교환 크로마토그라피; 초원심분리; 염석; 및 멸균 여과 단계로 이루어진다. 세포질은 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜을 사용한 세포 파쇄 후에 침전될 수 있으며 용액 내로 HBsAg를 보내고 한외여과 시킨다.
HBsAg의 정제 후에 예를 들면 시스테인과 함께 투석시키고 HBsAg 제조 시 사용될 수 있는 티메로살과 같은 수은 보존제를 제거시켜 사용할 수 있다.
HBsAg 함량은 통상적으로 마이크로그람으로 표시된다. 본 발명의 조성물 내의 HBsAg의 농도는 바람직하게는 60μg/ml 이하, 더욱 바람직하게는 55μg/ml 이하, 50μg/ml 이하, 45μg/ml 이하 또는 40μg/ml이하이다. 통상적인 농도는 약 20μg/ml이고 바람직하게는 도스 당 10μg이다.
소아마비 바이러스
폴리오바이러스는 소아마비의 원인이다. 불활성화된 소아마비 바이러스 백신(IPV)는 참고문헌 1의 24장에 상세히 기술되어 있으며 이미 수년전부터 알려져왔다. 본 발명의 조합백신은 불활성화된 소아마비 바이러스 항원을 포함할 수 있다.
소아마비 바이러스는 세포 배양으로 성장시킬 수 있고 바람직한 배양은 원숭이 신장에서 유래된 Vero 세포주를 사용한다. Vero 세포는 마이크로담체에 의해 손쉽게 배양될 수 있다. 증식 후 한외여과, 정용 여과 및 크로마토그라피와 같은 방법을 사용하여 정제시킬 수 있다. 바람직하게는 소와 같은 동물 재료가 세포 배양에 사용하는 경우에는 전염성 해면상뇌증(TSE), 특히 우해면상뇌증(BSE)이 없는 재료로부터 수득된 것이어야만 한다. 바람직하게는 소아마비 바이러스는 동물-유래 성분이 제거된 배지 내에서 세포 배양시켜 성장시킨 것이다.
환자에게 접종하기 이전에 소아마비 바이러스는 불할성화 시켜야 하고 이는 포름알데하이드 처리로 성취될 수 있다. 폴리오마이엘리티스(poliomyelitis)는 3가지 형태의 소아마비 바이러스 중 하나의 원인이다. 3가지 형태는 유사하고 동일한 증상을 야기시키나 이들은 항원성에서는 서로 다르고 한 형태의 감염은 다른 형태의 감염을 보호할 수 없다. 소아마비 바이러스 1형(예를 들면 Mahoney 스트레인), 소아마비 바이러스 2형(예를 들면 MEF-1 스트레인) 및 소아마비 바이러스 3형(예를 들면 Saukett 스트레인)으로 구성된 3개의 소아마비 바이러스 항원을 사용하는 것이 본 발명에서 더욱 바람직하다. 바이러스는 증식, 정제 및 개별적 불활성화시킨 후 본 발명에 사용하기 위하여 3개의 벌크 혼합물을 제공하기 위해 서로 결합시킨다. IPV의 함량은 통상 DU 유니트(D-항원 유니트)로 표현된다[46]. 예를 들면 도스 당 소아마비 바이러스 형태 당 1DU 내지 100DU 이내의 함량을 지닌 것이 바람직하게 사용되고, 1형 소아마비 바이러스 약 40DU, 2형 소아마비 바이러스 약 8DU, 3형 소아마비 바이러스 약 32DU를 포함하는 것이고 예를 들면 1형 10~20DU, 2형 2~4DU, 3형 8~20DU와 같이 더 적은 용량을 사용하는 것도 가능하다[47,48].
IPV 성분을 사용하는 경우에는 소아마비 바이러스는 Vero 세포를 사용하여 증식시키고 백신 조성물은 바람직하게는 10ng/ml 이하, 더 바람직하게는 1ng/ml 이하, 500pg/ml 이하, 50pg/ml 이하의 Vero 세포 DNA를 포함하는 것이고 10ng/ml 이하의 Vero 세포 DNA는 50 염기쌍 길이보다 크다.
조합백신의 제조방법
백신 내에 사용되는 병원체에 대한 항원성 성분은 약어로 통상 언급되고 있으며 이는 D 는 디프테리아 톡소이드, T는 파상풍 톡소이드, P는 예를 들면 적어도 PT, FHA 및 펄탁틴을 포함하는 비세포 백일해 항원 Pa와 세포 백일해 항원 Pw를 의미하며 Hib는 콘쥬게이트된 헤모필러스 인플루엔자 b 협막 다당체를 의미하고 MenA, MenB, MenC, MenW 및 MenY는 수막염구균 혈청그룹 각각이 개별적으로 전달 단백질에 콘쥬게이트된 것을 의미하며 IPV는 3가 불활성화된 소아마비 바이러스를 의미하며 Spn은 폐렴구균을 의미한다.
D 성분이 본 명세서 내에 개시된 디프테리아톡소이드를 의미할 때, 본 발명의 바람직한 실시태양은 다음과 같은 조합백신인 것이다.
D, T, HBsAg
D, T, Pw, HBsAg
D, T, Pw, HBsAg, Hib
D, T, Pw, HBsAg, Hib, MenA, MenC
D, T, Pw, HBsAg, Hib, MenA, MenC, MenW135
D, T, Pw, HBsAg, Hib, MenA, MenC, MenY
D, T, Pw, HBsAg, Hib, MenA, MenC, MenW135, MenY
D, T, Pa, HBsAg
D, T, Pa, Hib
D, T, Pa, HBsAg, Hib
D, T, Pa, HBsAg, IPV
D, T, Pa, HBsAg, IPV, Hib
D, T, Pa, HBsAg, IPV, Hib, Spn
D, T, Pa, HBsAg, IPV, Hib, MenC
D, T, Pa, HBsAg, IPV, Hib, MenC, MenA
D, T, Pa, HBsAg, IPV, Hib, MenC, MenY
D, T, Pa, HBsAg, IPV, Hib, MenC, MenW135
D, T, Pa, HBsAg, IPV, Hib, MenC, MenA, MenW135, MenY
이 조합백신은 상기한 항원으로 구성되어 있거나 추가적 병원체에 대한 항원을 더욱 포함할 수 있다. 따라서 이들은 개별적으로 사용할 수도 있고 추가적 백신의 성분으로 사용할 수도 있다.
조합백신을 제조하기 위한 항원성분을 결합시키는 단계에서 항원은 각각 첨가되거나 이미 혼합된 형태일 수 있다. 조합백신이 D 및 T 항원과 추가적 항원을 포함하는 경우에 조합백신의 제조를 위해서는 D-T 성분이 이미 혼합된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 2가 성분은 다른 항원과 결합될 수 있다. D, T 및 Pw 항원을 사용하는 경우에는 D-T-Pw 성분의 이미 혼합된 형태를 사용하는 것이 바람직하고 조합백신의 제조를 위해 이 성분을 사용하는 것이다.
D-T 혼합물을 사용하는 경우에는 혼합물 내의 디프테리아 톡소이드 대 파상풍 톡소이드의 비율은 통상 2:1 내지 3:1(Lf 유니트로 측정시)사이이고 바람직하게는 2.4:1 내지 2.6:1 사이이며 예를 들면 2.5:1이다.
콘쥬게이트를 위한 전달 단백질
콘쥬게이트화된 다당체 항원은 전달 단백질을 포함하며 이는 다당체에 공유 결합상태로 직접 또는 링커를 통해 부착되어 있다. 콘쥬게이션 기술에 관한 일반적 정보는 참고문헌 34에 나타나 있다.
다양한 단백질이 전달물질로써 알려져 있고 바람직한 전달 단백질은 디프테리아톡소이드 예를 들면 본 발명에서 생성된 디프테리아 톡소이드 또는 파상풍 톡소이드와 같은 박테리아 톡소이드를 들 수 있다. 다른 적합한 전달 단백질은 이에 한정되는 것은 아니나 디프테리아 독소의 CRM197 변이체[49,50], 네이세리아 메닝티디스 외벽 멤브레인 단백질[51], 합성 펩타이드[52,53], 열충격 단백질[54,55], 백일해 단백질[56,57], 사이토카인[58], 림포카인[58], 호르몬[58], 성장인자[58], 다양한 병원체 유래 항원으로부터 다중 인간 CD4+ T 세포 에피토프를 포함하는 인공 단백질[59], N19와 같은 인공 단백질[60], 헤모필러스 인플루엔자로부터의 단백질 D[61,62], 폐렴구균 표면 단백질 PspA[63], 뉴몰리신[64], 철-업테이크 단백질[65], 클로스트리디움 디피실로부터의 독소 A 또는 독소B[66], 스트렙토코커스 아갈락티에 단백질[67] 등이다.
다당체에 담체의 부착은 바람직하게는 담체 단백질 내의 라이신 잔기 또는 아르기닌 잔지의 측쇄사슬 내에 -NH2 그룹을 통해 부착시키는 것이다. 예를 들면 시스테인의 측쇄사슬 내에 -SH 그룹의 부착도 가능하다.
다당체 대 단백질의 비율(w/w)은 1:5(과량의 단백질) 내지 5:1(과량의 다당체) 사이인 콘쥬게이트가 바람직하다.
조성물은 소량의 유리 담체를 포함할 수 있다. 개별적 항원으로써 포함되는 어떠한 담체를 무시할 경우 콘쥬게이트 되지 않은 담체의 함량은 전체 조성물 내의 전달 단백질의 총 함량 대비 5% 이내가 바람직하고 더욱 바람직하게는 2중량% 이내로 존재하는 것이다.
상품명 SYNFLORIX 내에서 담체 억제의 위험성을 감소시키기 위해 조성물 내에 하나 이상의 형태의 전달 단백질을 포함하는 것이 가능하다.
콘쥬게이트의 함량은 담체의 선택에 의한 차이를 회피하기 위해서 다당체의 질량 형태로 일반적으로 표시되며 예를 들면 담체와 다당체를 포함하는 전체 콘쥬게이트 용량이 개별적 용량보다 더 큰 것이다.
애쥬번트
본 발명의 백신은 애쥬번트를 포함한다. 포접을 위한 가장 널리 사용되는 애쥬번트는 수산화알루미늄 및/또는 인산알루미늄과 같은 알루미늄염이다. 조합백신 내의 항원들은 부분적으로 또는 전체적으로 알루미늄염에 흡착된다.
수산화알루미늄으로 알려진 애쥬번트는 통상적으로 알루미늄 옥시하이드록사이드염으로 적어도 부분적으로 결정화되어있는 것이다. 알루미늄 옥시하이드록사이드는 AlO(OH)식으로 표시될 수 있으며 이는 예를 들면 수산화알루미늄 Al(OH)3와 같은 다른 알루미늄 화합물과는 적외선(IR) 흡광도에 의해 구별될 수 있는 것으로 특히 1070cm-1에서의 흡광밴드와 3090cm-1 내지 3100cm-1에서의 강한 숄더에 의해 구별되는 것이다(참고문헌 68 제 9장). 수산화알루미늄 애쥬번트의 결정화도는 회절 밴드의 반가폭(WHH)에 의해 확인될 수 있으며 더 작은 결정 크기로 인해 더 큰 선 확장을 나타내는 약한 결정 입자인 것이다. 표면 면적은 WHH의 증가에 따라 증가하며 더 높은 WHH 수치를 지닌 애쥬번트는 항원 흡착에 더 큰 용량을 지닌 것이다. 예를 들면 투과 전자 현미경에 나타난 바와 같이 섬유상 모르폴로지는 수산화알루미늄 애쥬번트에게 통상적인 것으로 예를 들면 약 2nm 직경을 지닌 바늘형상의 입자이다. 수산화알루미늄 애쥬번트의 등전점(pI)은 약 11이고 애쥬번트 그 자체가 생리적 pH에서 양성표면 전하를 지닌다. 수산화알루미늄 애쥬번트의 경우 pH 7.4에서 Al+++ 1mg 당 1.8mg 내지 2.6mg의 단백질 흡착력을 지니는 것으로 보고되어 있다.
인산알루미늄으로 통상 알려진 애쥬번트는 알루미늄 하이드록시포스페이트로써 예를 들면 알루미늄 하이드록시포스페이트 설페이트와 같은 소량의 설페이트를 또한 포함하는 것이다. 이들은 침전에 의해 수득될 수 있고 침전시 반응 조건과 농도는 염 내에서 하이드록시기의 포스페이트 치환 정도에 영향을 미친다. 하이드록시포스페이트는 PO4/Al 몰 비율로 0.3 내지 1.2 사이이다. 하이드록시포스페이트는 하이드록시 그룹의 존재라는 면에서 엄격하게는 AlPO4와는 구별되는 것이다. 예를 들면 200℃로 가열시 3164cm-1 IR 흡광밴드는 구조적 하이드록실기의 존재를 표시한다(참고문헌 68 제 9장). 인산알루미늄 애쥬번트의 PO4/Al3 + 몰 비율은 통상 0.3 내지 1.2 사이이고 바람직하게는 0.8 내지 1.2 사이 더욱 바람직하게는 0.95±0.1이다. 인산알루미늄은 하이드록시포스페이트염에 의해 통상 무정형으로 PO4/Al이다. 통상적인 애쥬번트는 무정형 알루미늄 하이드록시포스페이트로써 PO4/Al 몰 비율이 0.84 내지 0.92 사이이고 이는 0.6mg Al3 +/ml를 포함하는 것이다. 인산알루미늄 예를 들면 투과 전자 현미경에 의해 나타내는 플레이트 유사 형상과 50nm 범위의 1차 입자 등으로 입자화되는 것이다. 입자의 통상적인 직경은 항원 흡착 이후에 0.5μm 내지 20μm 범위이고 바람직하게는 5μm 내지 10μm 범위이다. 인산알루미늄 애쥬번트의 경우 pH 7.4에서 Al+++ 1mg 당 0.7mg 내지 1.5mg의 흡착력을 지니는 것으로 보고되어 있다.
인산알루미늄의 PZC는 하이드록시를 위한 인산치환 정도에 관련하여 반비례하는 것으로 치환의 정도는 침전에 의해 염의 제조를 위해 사용되는 반응 조건 및 반응물의 농도에 의해 변화될 수 있다. PZC는 용액 내의 유리 포스페이트 이온의 농도의 변화에 따라 변화될 수 있으며 더 많은 포스페이트는 PZC의 더 많은 산성화에 관련되어 있고 PZC는 히스티딘 완충액으로 PZC를 더욱 염기성으로 만들 수 있는 완충액을 첨가시켜 변화시킬 수도 있다. 본 발명에 따라 사용되는 인산알루미늄은 일반적으로 4.0 내지 7.0의 PZC를 지니고 더욱 바람직하게는 5.0 내지 6.5 이내이며 예를 들면 약 5.7이다.
환자에게 투여하기 위한 조성물 내의 Al+++의 농도는 바람직하게는 10mg/ml 이하이고 예를 들면 5mg/ml 이하, 4mg/ml 이하, 3mg/ml 이하, 2mg/ml 이하, 1mg/ml 이하이다. 본 발명의 조성물 내의 바람직한 Al+++ 범위는 0.3mg/ml 내지 1mg/ml 더욱 바람직하게는 0.3mg/ml 내지 0.5mg/ml이다. 최대 0.85mg/도스가 통상적이다.
하나의 실시태양에서 디프테리아톡소이드는 알루미늄염 애쥬번트에 흡착되어 있으며 예를 들면 수산화알루미늄 애쥬번트에 흡착되어 있다.
파상풍 톡소이드를 포함하는 조합백신 내에는 파상풍 톡소이드가 수산화알루미늄 애쥬번트에 흡착되어 있으나 반드시 흡착될 필요는 없다. 예를 들면 총 파상풍 톡소이드의 0% 내지 10% 정도만 흡착되어도 사용 가능하다.
전세포 백일해 항원을 포함하는 조합백신 내에는 wP 항원이 수산화알루미늄 애쥬번트 및/또는 인산알루미늄 애쥬번트에 바람직하게 결합되어 있는 것이다.
비세포 백일해 항원을 포함하는 조합백신 내에는 백일해 항원이 하나 또는 그 이상의 알루미늄염 애쥬번트에 흡착되어 있거나 흡착되지 않은 상태로 첨가될 수 있다. 조성물 내에 펄탁틴이 존재하는 경우에는 본 발명의 방법에 의해 사용하기 전에 수산화알루미늄 애쥬번트에 흡착되어 있는 것이 바람직하다. PT와 FHA는 본 발명의 방법에 따라 사용하기 전에 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄에 흡착될 수 있다. 바람직한 실시태양에서 PT, FHA 및 펄탁틴은 각각 별개로 본 발명의 방법에 따라 사용하기 전에 수산화알루미늄에 미리 흡착시켜 사용하는 것이다.
Hib 항원과 알루미늄 염을 포함하는 조합백신의 경우 Hib 콘쥬게이트는 흡착되지 않거나 예를 들면 인산알루미늄 애쥬번트에 흡착된 상태로 사용할 수 있다[69]. 이와 같이 흡착된 상태는 D-T-Pw-Hib-HBsAg 항원을 포함하는 백신에 특히 유용하다. 예를 들면 수막염구균, 폐렴구균과 같은 다른 콘쥬게이트된 항원을 예를 들면 인산알루미늄과 같은 알루미늄염에 유사하게 흡착시켜 사용하거나 흡착시키지 않은 상태로 사용할 수 있다[70].
IPV 항원은 본 발명의 방법에 따라 사용하기 전에 어느 애쥬번트에도 흡착시키지 않는 것이나 이들 항원은 다른 성분에 유래하는 알루미늄 염에 흡착될 수 있다.
HBsAg를 포함하는 조합백신의 경우 HBsAg는 참고문헌 71에 개시된 방법에 의해 인산알루미늄에 흡착시킬 수 있다. 인산알루미늄의 흡착은 잘 알려진 HBsAg에 수산화알루미늄을 흡착시킨 상품명 ENGERIX-B와는 대조적인 것이다. 참고문헌 72에 언급된 바와 같이 인산 알루미늄은 수산화알루미늄보다 HBsAg에 더 적합한 애쥬번트 일 수 있다.
디프테리아및 파상풍 톡소이드를 HBsAg 결합 이전에 혼합시킴을 특징으로 하는 본 발명의 방법에 있어서 D-T 혼합물은 D 및 T 항원이 모두 흡착된 형태로 수산화알루미늄을 포함하는 것이 바람직하다.
디프테리아톡소이드, 파상풍 톡소이드 및 전세포 백일해 항원을 HBsAg 결합 이전에 혼합시킴을 특징으로 하는 본 발명의 방법에 있어서 D-T-Pw 혼합물은 D 및 T 항원이 모두 흡착된 형태로 수산화알루미늄을 포함하는 것이 바람직하며 인산 알루미늄 애쥬번트를 포함할 수도 있다.
본 발명의 백신에 포함된 애쥬번트의 경우 애쥬번트를 다양한 단계에서 첨가시킬 수 있다. 예를 들면 2가 D-T 혼합물은 본 발명의 방법에 사용하기 이전에 알루미늄염 애쥬번트를 흡착시켜 사용하는 것과 같이 조합백신 제조에 사용하기 이전에 항원을 애쥬번트에 결합시켜 사용할 수 있다. 그러나 항원을 혼합한 후에 애쥬번트를 첨가하거나 항원에 애쥬번트를 순차적으로 첨가할 수도 있고 예를 들면 수용성 애쥬번트를 제조한 후 항원을 첨가하여 개별적 또는 혼합된 형태로 흡착시킬 수 있는 것이다.
추가 비-항원 성분
본 발명의 백신 조성물은 담체, 부형제, 완충액 등을 포함할 수 있다.
생리 활성을 제어하기 위해 조성물은 나트륨염과 같은 생리용 염류를 포함할 수 있다. 염화나트륨(NaCl)이 바람직하고 이는 1mg/ml 내지 20mg/ml 범위로 존재할 수 있다. 특정 실시태양에서 염화나트륨의 농도는 8mg/ml 내지 9mg/ml 범위이고 바람직하게는 8.5mg/ml이다.
조성물은 200mOsm/kg 내지 400mOsm/kg, 바람직하게는 240mOsm/kg 내지 360mOsm/kg의 삼투압을 지니며 가장 바람직하게는 280mOsm/kg 내지 320mOsm/kg을 지닌다. 삼투압은 백신 접종에 기인하는 통증을 저하시키기 위해 이미 보고되어 있다[73]. 그러나 삼투압을 이 범위로 유지하는 것이 그 밖의 이유로 인해 바람직한 것이다.
본 발명의 조성물은 하나 또는 그 이상의 완충액을 포함할 수 있다. 통상적인 완충액은 인산염 완충액, Tris 완충액, 보레이트 완충액, 숙신산염 완충액, 히스티딘 완충액 또는 시트르산염 완충액이다. 완충액은 통상 5mM 내지 20mM 범위이다.
본 발명의 조성물은 하나 또는 그 이상의 보존제를 포함할 수 있으며 특정 실시태양에서 본 조성물은 보존제를 포함하지 않는 것이다. 바람직한 조성물은 실질적으로 예를 들면 티메로살과 같은 수은 보존제를 0.1μg/ml 이하의 수은 농도로 제거한 것이며 가장 바람직하게는 수은이 검출되지 않는 것이다. 이는 본 발명의 방법에 따라 첨가하기 이전에 항원 제재로부터 수은 보존제를 제거시키거나 조성물에 사용되는 성분의 제조시 티메로살의 사용을 회피함으로써 성취될 수 있는 것이다. 그러나 만약 HBsAg와 같은 본 발명의 조성물에 사용하기 이전에 보존제를 처리하여야 하는 성분이 존재하는 경우에는 수은 보존제의 극소량의 존재가 피할 수 없을 수도 있다. 안정성을 위해 최종 조성물은 25ng/ml 이하의 수은을 포함하는 것이 바람직하다.
어느 실시태양에서 본 발명의 디프테리아톡소이드를 포함하는 조성물은 페놀 이외의 보존제를 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서 보존제는 티메르폰산 나트륨이다. 또 다른 실시태양에서 보존제는 2-페녹시에탄올(2-PE)이다. 만약 2-PE를 사용한다면 (a) 100Lf 디프테리아톡소이드 당 2.5mg 내지 3.5mg 이내의 바람직하게는 약 3mg이 존재하거나 (b) 100Lf 파상풍 톡소이드 당 7mg 내지 8mg 이내의 바람직하게는 약 7.5mg을 사용하는 것이다. 본 발명의 조성물 내에 2-PE 농도는 3g/l 내지 8g/l 예를 들면 4g/l 내지 6g/l, 바람직하게는 약 5g/l가 바람직하다. 특정 실시태양에서 본 발명의 조성물은 167Lf의 디프테리아톡소이드, 67Lf의 파상풍 톡소이드 및 5mg의 2-PE를 포함하는 것이다.
본 발명의 조성물은 계면 활성제를 실질적으로 포함하지 않는 것이다. 특히 본 발명의 조성물은 솔베이트 80의 실질적인 제거가 필요하며 이는 솔베이트 80을 0.1μg/ml 이하로 함유하는 것이다. 바람직하게는 솔베이트 80이 검출되지 않는 것이다. 만약 HBsAg를 포함하는 조성물의 경우 효모 분쇄를 위해 사용되는 경우 일반적으로 솔베이트 20을 포함할 수 있다[44].
본 발명의 조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 7.5이고 더욱 바람직하게는 5.0 내지 6.0이 최적 안정성을 위해 요구된다. 디프테리아톡소이드 및/또는 파상풍 톡소이드가 존재하는 경우 6.0 내지 7.0 사이이다. 본 발명의 방법은 또한 포장 이전에 백신 벌크의 pH 조절 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 바람직하게는 파이로겐 물질을 포함하지 않는 것이며 도스 당 1EU 이하 이 때 단위는 엔도톡신 표준 측정단위이며 1EU는 0.2ng의 FDA 참조 표준 엔도톡신 EC-2 'RSE'와 균등한 것이고 바람직하게는 도스 당 0.1EU 이하이다.
본 발명의 조성물은 글루텐을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 멸균상태인 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 수용액 형태인 것이 바람직하다. 제조 공정 내에서 원하는 최종 농도를 제공하기 위해 항원의 희석이 WFI(주사용 수)와 함께 수행될 수 있다.
각각의 항원성 성분의 잔류물질은 본 발명의 최종 백신 조성물 내에 검출 가능한 양으로 존재할 수도 있다. 예를 들면 만약 포름알데하이드를 디프테리아톡소이드, 파상풍 및 백일해 제조에 사용한다면 최종 백신 제품은 예를 들면 10μg/ml 이하, 바람직하게는 5μg/ml이하의 검출 가능한 양의 포름알데하이드가 잔류될 수 있다. 배지 또는 안정화제가 소아마비 바이러스 제형 예를 들면 Medium 199를 위해 사용될 수 있으며 이는 최종백신에 이전될 수 있다. 이와 유사하게 예를 들면 알라닌, 아르기닌, 아스파테이트, 시스테인 및/또는 시스틴, 글루타메이트, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 프롤린 및/또는 히드록시프롤린, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 트리프토판, 타이로신 및/또는 발린과 같은 유리 아미노산, 예를 들면 콜린, 아스코르베이트와 같은 비타민, 제 2 인산나트륨, 제 1 인산칼륨, 칼슘, 포도당, 황산아데닌, 페놀레드, 아세트산나트륨, 염화칼륨과 같은 물질들이 최종 백신에 100μg/ml이하로 바람직하게는 각각 10μg/ml이하로 잔류할 수 있다. 예를 들면 IPV 성분으로부터의 황산네오마이신과 같은 네오마이신, 특히 IPV 성분으로부터의 황산폴리마이신 B와 같은 폴리마이신 B와 같은 다른 항원 제재 성분이 도스 당 수 나노그람 이하 수준으로 존재할 수 있다. 항원 제재 내에 유래한 추가적 성분이 최종 백신 내에 항원의 완전한 정제가 아닌 경우 잔류할 수 있다. 매우 적은 양의 보르데텔라 펄투시스, 코리네박테리움 디프테리아, 클로스트리디움 테타니 및 사카로미세스 세레비시에 단백질 및/또는 게놈 DNA가 존재할 수 있다. 잔류 성분의 함량을 최소화하기 위해 항원 제재는 본 발명의 방법이 사용되는 항원에 대해 이전에 이러한 성분들을 제거하는 처리를 행하는 것이다.
본 발명의 포장 조성물
본 발명은 환자에게 투여하기 위해 분배될 수 있는 개별 도스로 포장되기에 적합한 벌크 물질을 제공할 수 있다. 상기한 농도는 최종 포장 도스 내의 통상적인 농도이며 따라서 벌크 백신의 농도는 이보다 더욱 높을 수 있고 한편으로는 희석에 의해 최종 농도가 저하될 수도 있다. 농축된 벌크 디프테리아 톡소이드 조성물은 예를 들면 다른 항원 또는 애쥬번트와 같은 다른 물질과 결합되기 이전에 물 또는 완충액과 같은 수용액 성분으로 통상 희석시킬 수 있다.
인간 근육 내 백신은 0.5ml의 개별 용량으로 일반적으로 투여한다. 본 발명의 방법은 따라서 콘테이너 내에 0.5ml의 혼합물 샘플로 추출하고 포장시키는 단계를 포함하는 것이다. 0.5ml 도스는 일반적인 편차, 예를 들면 0.5ml±0.05ml를 지닌 것으로 이해된다. 다중 도스 상황을 위해 예를 들면 10-도스 다중도스 콘테이너를 위한 5ml 또는 10% 초과시킨 5.5ml를 단일 콘테이너에 추출 팩킹하여 제조된 다중 도스 용량을 제조할 수도 있다.
본 발명의 방법은 사용하기 위하 콘테이너 내에 백신을 포장하는 단계를 포함한다. 적합한 콘테이너는 바이알 및 바람직하게는 멸균된 일회용 주사기를 포함한다.
본 발명의 조성물의 경우 바이알 형태로 포장되며 이 바이알은 유리 때는 플라스틱 물질로 제조되는 것이 바람직하다. 바이알은 조성물을 첨가하기 이전에 멸균된 것이 바람직하다. 라텍스-민감 환자에 대한 문제를 회피하기 위해 바이알은 라텍스 제거 마개로 봉합시키는 것이 바람직하다. 바이알은 1회용 도스의 백신을 포함하거나 예를 들면 10도스와 같은 하나의 도스 단위보다 큰 것일 수 있다. 다중 도스 바이알을 사용하는 경우 각각의 도스는 멸균된 바늘과 멸균조건 하의 주사기로 처치되고 바이알 성분의 오염을 회피하도록 주의하여야 한다. 바람직한 바이알은 무색-유리로 제조된 것이다.
바이알은 이미 채워진 주사기가 캡을 통해 투입되기 적합한 캡 예를 들면 Luer lock와 같은 캡을 지닐 수 있다. 주사기 내의 함유물은 바이알로 분출되고 즉 그 안에 동결건조된 물질이 재조립되며 바이알의 물질은 주사기로 다시 이동될 수 있는 것이다. 바이알로부터 주사기를 제거시킨 후에 바늘이 부착될 수 있고 조성물은 환자에게 투여될 수 있다. 캡은 밀봉 또는 커버 내부에 바람직하게 위치하며 밀봉 또는 커버는 캡의 접근 전에 제거되어야 하는 것이다.
성분이 주사기 내로 이송할 수 있도록 포장된 경우에는 주사기는 그것에 부착되어 있는 바늘을 통상 지니지 않을 것이며 이는 별개의 바늘이 주사기에 공급되어 서로 조립하여 사용할 수도 있는 것이다. 안전 바늘이 바람직하다. 1-인치 23-게이지, 1-인치 25-게이지 및 5/8-인치 25-게이지 바늘이 통상적이다. 주사기는 필-오프 라벨로 제공될 수 있으며 함유물의 로트 번호와 유효기간이 보관 기록의 편리를 위해 인쇄되어 제공될 수 있다. 주사기 내의 플런저는 플런저가 흡인동안 사고로 제거되는 것을 방지하기 위해 고정기를 포함할 수 있다. 주사기는 라텍스 고무 캡 및/또는 플런저를 지닐 수 있다. 일회용 주사기는 단일 도스의 백신을 포함한다. 주사기는 바늘 부착 이전에 모서리 밀봉을 위한 모서리 캡을 지닐 수 있으며 모서리 캡은 바람직하게는 부틸고무로 제조된다. 만약 주사기와 바늘이 별개로 포장된 경우에는 바늘은 부틸고무 쉴드에 적합한 것이 바람직하다. 그레이 부틸고무가 바람직하다. 바람직한 주사기는 상품명 Tip-Lok으로 상품화된 것이다. 주사기 또는 바이알과 같은 유리 콘테이너를 사용하는 경우 콘테이너는 소다석회 글라스보다 보로실리케이트 글라스로 제조되는 것이 바람직하다.
조성물이 콘테이너에 포장된 이후에 콘테이너는 배송을 위해 예를 들면 카드보드 박스와 같은 박스로 포장시키며 이 때 박스에는 예를 들면 상품명과 같은 백신의 명세, 예를 들면 간염 B 재조합 등과 같은 백신 내 항원의 목록과 함유된 콘테이너 예를 들면 일회용 프리-필드 Tip-Lok 주사기 또는 10×0.5ml 싱글-도스 바이알의 상세, 0.5ml 도스를 포함하는 것과 같은 용량, 오직 성인용, 오직 소아용과 같은 경고문, 유효기간, 적응증, 환자 번호 등에 관한 라벨을 부착시킬 수 있다. 각각의 박스는 하나 이상의 포장된 백신 예를 들면 특히 바이알로 5개 또는 10개 포장된 백신을 포함한다. 만약 백신이 주사기에 함유되어 있는 경우에는 포장에는 주사기의 사진을 나타낼 수도 있다.
백신은 동일한 박스 내에 예를 들면 투여 지침서, 백신 내의 항원의 상세와 같은 백신의 상세를 포함하는 설명서를 함께 포장시킬 수 있다. 지침서 내에는 예를 들면 백신 투여 후 아나필리스 반응이 있는 경우에 대비하여 아드레날린 용액을 준비하시오 라는 경고문을 삽입할 수 있다.
포장 백신은 2℃ 내지 8℃ 사이에서 바람직하게 보관한다. 그러나 동결시켜서는 안된다.
백신은 제조과정 중에 예를 들면 모든 항원 성분이 수용액 또는 현탁액에 존재하는 전부-액체형으로 제공되거나 백신은 일정 성분만이 액체형이고 다른 성분은 동결-건조 형태로 제공될 수 있다. 따라서 최종 백신은 (a) 수용성 항원을 포함하는 첫 번째 성분; 및 (b) 동결-건조된 항원을 포함하는 두 번째 성분; 등의 2개의 서로 다른 성분을 혼합시켜 사용하는 사용 직전에 혼합시키는 형태일 수도 있다. 2개의 성분은 예를 들면 바이알 및/또는 주사기와 같은 별개의 콘테이너를 사용하는 것이 바람직하며 본 발명은 성분 (a)와 성분 (b)를 지닌 키트를 제공한다. 이러한 형태는 특히 Hib 및/또는 수막염구균 및/또는 폐렴구균 콘쥬게이트와 같은 콘쥬게이트 성분을 포함하는 백신의 경우 특히 유용한 것이며 그 이유는 D, T, P 및 HBsAg 성분이 액체형으로 바람직한 반면 이들 성분은 동결-건조된 형태에서 더욱 안정하기 때문이다. 따라서 콘쥬게이트는 본 발명의 사용 이전에 동결-건조시킬 수 있다. 예를 들면 안정화제와 같은 추가적 성분도 동결-건조 이전에 첨가할 수 있다. 포함되는 바람직한 안정화제는 유당, 슈크로즈 및 만니톨 등이며 예를 들면 유당/슈크로즈 혼합물, 슈크로즈/만니톨 혼합물 형태로 사용할 수 있다. 최종 백신은 유당 및/또는 슈크로즈를 포함할 수 있다. 슈크로즈/만니톨 혼합물을 사용하여 건조 과정을 더욱 빠르게 진행시킬 수 있다.
따라서 본 발명은 다음과 같은 단계로 이루어진 2-콘테이너 조합백신의 제조방법을 제공하는 것이다.
- 상기한 바와 같이 단 상기 하나 또는 그 이상의 항원은 콘쥬게이트된 협막 다당체 항원을 포함하지 않는 수용성 조합백신을 제조하는 단계;
- 상기 수용성 조합백신을 예를 들면 주사기와 같은 첫 번째 콘테이너에 포장시키는 단계;
- 동결-건조된 형태로 콘쥬게이트된 협막 다당체 항원을 제조하는 단계;
- 상기 동결-건조된 항원을 예를 들면 바이알과 같은 두 번째 콘테이너에 포장시키는 단계; 및
- 첫 번째 콘테이너와 두 번째 콘테이너를 서로 함께 하나의 키트에 포장시키는 단계. 키트는 내과의사를 통해 분배된다.
백신의 처리 및 투여방법
본 발명의 조성물은 인간 환자에 투여하기에 적합한 것이다. 본 발명은 환자에게 본 발명의 조성물을 투여하는 단계로 이루어진 환자에게 면역 반응을 야기하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 조성물은 상기한 바와 같이 0.5ml 도스로 환자에게 바람직하게 투여할 수 있는 것이다.
본 발명은 또한 의학으로 사용하기 위한 본 발명의 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명은 또한 코리네박테리움 디프테리아의 감염을 방지하기 위한 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 코리네박테리움 디프테리아의 감염에 대한 방지 및/또는 처리를 위해 사용되는 바람직한 백신이다. 본 발명의 조성물은 동물-유래 성분에 대해 알러지를 지닌 환자에게 특히 유용하게 사용하는 것이다. 예를 들면 소고기 알러지 또는 젖소 우유 알러지를 지닌 환자에게 특히 적합한 것으로 동물-유래 성분을 포함하는 배지에서 제조된 디프테리아톡소이드의 반응에 따른 알러지 반응을 회피할 수 있는 것이다. 알러지 반응은 디프테리아 톡소이드와 같은 첫 번째 투여 이후에 나타나는 것뿐만 아니라 연이은 추가접종을 통해 발생하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 따라서 추가접종시 특히 유용한 것이다. 알러지 반응의 위험성을 지닌 소아뿐만 아니라 성인에게도 본 발명의 조성물은 유익한 장점을 지닌다.
본 발명은 또한 본 발명의 디프테리아 톡소이드를 포함하는 본 명세서에 기재된 항원 조성물을 백신 제조에 사용하는 용도를 제공하는 것이다.
충분한 효과를 나타내기 위해 통상적인 소아에 대한 1차 면역화 스케쥴은 하나 이상의 도스를 투여하는 것에 관련된다. 예를 들면 투여는 다음과 같은 스케쥴로 이루어지며 이 때 0은 첫 번째 투여를 의미한다. 0 및 6개월 스케쥴; 0 및 1,2,6개월 스케쥴; 0, 21일 및 6~12개월 스케쥴; 2,4 및 6개월 스케쥴; 3,4 및 5개월 스케쥴; 6, 10 및 14주 스케쥴 또는 0,1,2,6 및 12개월 스케쥴이다.
조성물은 예를 들면 소아에게 생후 2년째에 추가접종을 시행할 수 있다.
본 발명의 조성물은 예를 들면 팔이나 다리 부위에 근육 내로 주사 투여 할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 백신은 별개의 백신과 동일한 시점에서 환자에게 투여할 수 있으며 이 때 사용되는 별개의 백신은 상품명 Prevnar와 같은 폐렴구균 콘쥬게이트 백신, 인플루엔자 백신, 로터바이러스 백신 또는 MMR 백신과 같은 백신을 들 수 있다.
본 발명의 조성물이 알루미늄 기반 애쥬번트를 포함하는 경우에 보관시 조성물의 세틀링이 발생할 수 있다. 조성물은 환자에게 투여 전 흔들어 사용하여야 한다. 흔들어진 조성물은 탁한 흰색 현탁액일 수 있다.
디프테리아톡소이드
측정을 위한 정량
유니트
조성물 내의 디프테리아 독소 및/또는 톡소이드의 정량은 통상 Lf 유니트 즉 응집 유니트 또는 라임 응집 도스 또는 응집 한계 등으로 측정될 수 있다. 항-독소 국제 유니트를 혼용하여 사용할 수 있으며 최적 응집 혼합물을 생성하는 독소/톡소이드의 양으로 정의되는 것이다[74,75]. 예를 들면 NIBSC는 디프테리아톡소이드 Plain[76]을 공급하고 이는 앰플 당 300Lf를 포함하는 것이다. 응집 테스트를 위한 디프테리아톡소이드의 1차 국제 참고 시약[77]에는 앰플 당 900Lf를 포함하고 있다. 조성물 내의 디프테리아독소 또는 톡소이드의 농도는 이와 같은 참고 시약에 대해 정량화된 대조 물질과 비교하여 응집 에세이를 사용하여 결정될 수 있다.
단백질 제재의 순도는 총 단백질에 대한 특정 단백질의 비율로 표현될 수 있다. 조성물 내의 디프테리아독소/톡소이드의 순도는 일반적으로 투석되지 않는 단백질 질소의 질량 유니트 당 Lf 디프테리아톡소이드의 유니트로 표시될 수 있다. 예를 들면 매우 순수한 독소/톡소이드는 1700Lf/mg N 이상의 순도를 지닌다. 이는 조성물 내의 모든 단백질 또는 거의 모두의 단백질이 디프테리아 독소/톡소이드인 것을 나타낸다[78].
본 발명의 조성물 내의 디프테리아톡소이드의 면역 역가는 일반적으로 국제단위(IU)로 표시된다. 역가는 통상 기니아 피그와 같은 실험동물 내에서 조성물이 제공하는 보호 효과를 대조 백신과 비교함으로써 얻어질 수 있는 것이며 이는 IU로 측정될 수 있는 것이다. NIBSC는 3차 국제 표준에 흡착된 디프테리아 톡소이드 1999[79,80]를 제공하고 있으며 이는 앰플 당 160IU를 포함하고 에세이의 측정에 적합한 것이다.
3단계의 희석 에세이를 본 발명의 조성물의 역가를 결정하기 위해 사용할 수 있다. 면역시킨 이후에 기니아 피그는 복강 또는 피하 루트로부터 체혈된다. 또 다른 실시태양에서 기니아 피그 대신에 마우스를 사용할 수도 있다. 기니아 피그 또는 마우스가 체혈되면 각개 동물의 항독소 레벨을 독소 중화 테스트에 의해 측정하고 상기 독소 중화 테스트는 테스트되는 백신의 유효성을 확인하기 위해 생체 내 또는 생체 내 혈청학적 방법을 사용하여 측정하는 것이다. 하나의 실시태양에서 동물-유래 성분을 포함하는 배지에서 생성된 디프테리아톡소이드를 효력 검증에 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물의 역가는 적절한 통계학적 방법을 사용하여 계산될 수 있다. 3단계의 희석 에세이에서 역가 측정치의 95% 신뢰구간은 예측 역가의 50% 내지 200% 범위이고 예측 역가의 95% 신뢰구간의 최저 한계는 단일 인간 도스 당 30IU를 넘지 않아야 하는 것이다. 바람직한 실시태양에서 본 발명의 조성물의 역가는 단일 도스 당 적어도 30IU이다. 하나의 희석 테스트를 행한 경우에 테스트 백신의 역가가 인간 도스 당 30IU보다 월등히 크게 나타난다.
일반 사항
'포함하는'이라는 용어는 '포함'이라는 용어와 또는 '구성된'이라는 용어와 혼용하여 사용할 수 있고 이는 X라는 성분을 배타적으로 사용하거나 예를 들면 X+Y와 같이 이에 추가 성분을 포함할 수 있다.
'실질적으로'라는 용어는 '완벽한'을 포함하는 것으로 'Y가 실질적으로 제거된 조성물'이란 표현은 Y가 완전히 제거된 것을 의미할 수 있다. 필요에 따라 실질적으로는 본 발명의 정의에서 제외될 수 있다.
'약'이라는 용어는 x수치에 관련된 것으로 예를 들면 x±10%을 의미한다.
특별히 기술하지 않는 한 2개 또는 그 이상의 성분을 혼합시키는 단계를 포함하는 방법은 특정 혼합 순서를 요구하지 않는다. 따라서 성분들은 어느 순서로든 혼합될 수 있다. 3개의 성분이 있는 경우 2개의 성분이 서로 조합되고 3번째 성분이 연이어 조합될 수 있다.
항원이 애쥬번트에 '흡착된'이라는 기재는 바람직하게는 중량 비율로 항원의 적어도 50%가 흡착된 것이며 예를 들면 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 그 이상이 흡착된 것이다. 디프테리아톡소이드와 HBsAg는 모두 적어도 90% 이상 흡착된 것이 바람직하며 예를 들면 원심분리 이후 상등액에 검출되지 않을 정도로 충분히 흡착된 것이 이상적이다.
본 명세서 내에 기재된 조성물은 가교-결합된 동물-유래 성분을 포함하는 디프테리아 톡소이드가 바람직하게는 제거된 것이다.
(실시예 1) 철제거 효모 추출물 용액의 제조
PTK 효모 추출물을 Ohly GmbH(독일)로부터 구매하였으며 하기 문장에서 요약된 바와 같은 참고문헌 14로부터의 방법을 응용하여 철을 제거시켰다.
용액은 상업적으로 이용 가능한 PTK 효모 추출물을 물에 용해시켜 제조하였다. 효모 추출 용액을 60℃로 가열시키고 Na2HPO4·2H2O와 KH2PO4를 첨가시켰다. 용액의 pH는 수산화나트륨을 첨가시켜 9.3으로 조정하였다. 용액은 79℃로 더 가열시키고 CaCl2 용액을 첨가시켰다. 연이어 용액을 85℃로 가열시키고 10분간 인큐베이션시켰다. 그 후 효모 추출 용액을 25℃에서 3일간 냉각시킨다.
형성된 어느 침전물도 원심분리로 제거시켰다. 철 제거 효모 추출 용액의 pH를 초산을 첨가하여 8.4로 조정시켰다. 용액을 한외여과시키고 이어서 오토클레이브에서 134℃, 90분간 멸균시켰다. 철 제거 효모 추출 용액의 최종 조성은 표 1에 나타내었다.
| 성분 | 함량 |
| PTK 효모 추출물 | 102.48g |
| Na2HPO4·2H2O | 5.02g |
| KH2PO4 | 1.33g |
| CaCl2·2H2O | 4.21g |
| 수산화나트륨 용액 | 31.10ml |
| 아세트산 용액 | 13.96ml |
| 물 | Ad 1000ml |
(실시예 2) 발효 배지의 제조
발효 배지를 제조하기 위해 물에 용해시킨 말토즈 1수화물, 젖산 나트륨 용액, 성장인자 용액, 물 및 L-시스테인 용액을 순서대로 철 제거 효모 추출물에 첨가시켰다. 그 다음 단계에서 Fe(Ⅲ) 시트르산 암모늄 용액과 인산 용액을 순서대로 첨가시킨다. 이어서 염화칼슘 용액을 첨가시켜 철의 침전을 유도하고 철을 포함하는 겔의 형성을 유도하였다. 이는 철이 독소 생성의 억제 없이 박테리아 성장 기간 동안 발효 배지 내에 서서히 방출되는 것이다. 마지막 단계에서 발효 배지의 pH를 20% 아세트산 용액 또는 10% 암모늄 용액을 필요에 따라 첨가함으로써 7.3으로 조정시킨다. 성장 인자 용액의 조성은 표 2에 나타내었다.
| 성분 | 함량 |
| MgSO4·7H2O | 225g |
| β-알라닌 | 2.3g |
| 피메린산 | 150mg |
| 니코틴산 | 4.6g |
| CuSO4·5H2O | 500mg |
| ZnSO4·7H2O | 500mg |
| MnCl2·4H2O | 240mg |
| 25% 염산 | 2.6ml |
| 물 | Ad 1000ml |
발효 배지의 최종 조성을 표 3에 나타낸다.
모든 성분을 첨가시킨 후에 발효 배지는 오토클레이브에서 134℃, 90분간 살균시킨다. 오토클레이브된 발효 배지를 여과 멸균시킨 후 2∼10℃에서 저장시킨다.
| 성분 | 함량 |
| PTK 효모 추출물 | 34.38g |
| Na2HPO4·2H2O | 1684.13mg |
| KH2PO4 | 497.48mg |
| CaCl2·2H2O | 2.13g |
| 수산화나트륨 용액 | 10.43ml |
| 아세트산 용액 | 4.69ml |
| 말토즈 수화물 | 49.68g |
| 젖산 나트륨 용액 | 2.07ml |
| MgSO4·7H2O | 1.8g |
| β-알라닌 | 18.41mg |
| 피메린산 | 1.20mg |
| 니코틴산 | 36.83mg |
| CuSO4·5H2O | 4.00mg |
| ZnSO4·7H2O | 4.00mg |
| MnCl2·4H2O | 1.92mg |
| 25% 염산 | 0.70ml |
| L-시스테인 용액 | 280.19mg |
| 시트르산 철 암모늄 용액 | 3.23mg |
| K2HPO4·3H2O | 201.48mg |
| 물 | Ad 1000ml |
(실시예 3) 조-디프테리아 독소의 제조
발효 배지에 이미 배양되어 준비된 실행 시드로부터의 코리네박테리움 디프테리아를 접종시켰다. 실행 시드와 마스터 시드 모두가 상기한 바와 같이 발효 배지를 사용하여 제조되었다.
총 용량 300L의 발효조에 발효 배지를 채우고 주 배양을 시행하기 전에 발효 배지 내에서 1차 배양을 희석시켜 진행하였다. 주 배양은 36℃에서 560rpm으로 20시간 동안 인큐베이션시켜 진행한다. 인큐베이션 후 620rpm으로 24시간 더 연속하여 배양시킨다. 발효 과정을 통해 200 Lf/ml 내지 250 Lf/ml 농도의 디프테리아 독소를 생성시켰다.
발효 배지로부터 원심분리에 의해 박테리아를 분리시켰다. 배지 상등액을 최초 0.5㎛ 필터로 시작하여 단계적으로 0.2㎛ 필터까지 여과시킨다. 시트르산 완충액을 첨가시킨 후 조-디프테리아 독소 용액을 수득하고 5mM의 시트르산 염으로 최종 농도를 조정시킨다. 용액을 재생 셀룰로즈 멤브레인을 이용하여 pH 6.5 5mM 시트르산 염을 5배 용량 첨가시켜 30kDa 이상의 물질을 컷-오프 시킨 후 정용여과시키면서 농축시킨다. 이를 통해 약 300L를 약 50L로 용량을 감소시킨다. 잔류된 농축 디프테리아 독소 용액을 0.2㎛ 필터에 통과시킨다. 얻어지는 멸균 농축 디프테리아 독소 용액을 '디프테리아 독소 농축물 1'이라고 표시하고 추후 사용을 위해 보관시킨다.
정제 이전에 완충액 교환을 시행한다. 디프테리아 독소 농축물 1을 재생 셀룰로즈 멤브레인을 이용하여 pH 7.5의 25mM 트리스-버퍼를 5배 용량 첨가시켜 30kDa을 컷오프시키며 정용여과시킨다. 트리스-버퍼 용액을 Z 탄소 필터를 사용하여 여과시키고 다시 0.2㎛의 필터에 통과시킨다. 얻어지는 멸균 트리스-버퍼화 디프테리아 독소 용액을 '디프테리아 독소 농축물 2'로 표시한다.
실시예 3에 기재된 단계의 플로우 차트를 표 1에 나타내었다.
(실시예 4) 조-디프테리아 독소의 정제
상기 실시예에서 기재된 발효 공정에 의해 생산되는 조-디프테리아 독소를 더욱 정제시키기 위해 음이온 크로마토그래피를 적용시켰다. 50L 발효조 내수득물을 다음 방법을 사용하여 정제 재생산시킬 수 있었다.
디프테리아 독소 농축물을 Merck Chemicals로부터 구매한 음이온 교환 겔 매트릭스 컬럼 Factogel EMD TMAE 위에 로딩시킨다. 정제된 디프테리아 독소를 pH 7.5의 25 mM 트리스/90mM NaCl 완충액으로 용출시킨다. 컬럼에 로딩된 80%의 단백질은 NaCl 완충액과 함께 단순 용출 단계에 의해 회수될 수 있었다. 최초 용량 50L의 조-디프테리아 독소 용액은 10L 정제 디프테리아 독소 용액으로 감소되었다. 음이온 교환 컬럼으로부터 용출물은 85% 이상의 순도를 나타내었다. 음이온 교환 컬럼에 로딩하기 이전 및 로딩한 이후 용출되는 디프테리아 독소 용액의 대표 크로마토그램을 도 2에 나타낸다.
연이어 용출물을 pH 7.5의 0.1M 인산나트륨으로 더 농축시키기 위해 정용여과시키고 얻어진 버퍼화 디프테리아 독소 용액의 순도를 90% 이상으로 증가시킨다. 정용여과 이전 및 이후의 디프테리아 독소 용액의 대표 크로마토그램을 도 3에 나타낸다.
(실시예 5) 적합한 해독 조건의 수립
본 실시예는 37℃에서 6주간 보관시 다시 독성화되지 않는 비가역적으로 해독된 디프테리아 독소(일반적으로 톡소이드라 칭함)를 수득하기 위한 해독 조건을 결정하기 위한 시험을 기재한 것이다.
실시예 4에서 제조된 정제 디프테리아 독소를 pH 7.0, 7.5 및 8.0에서 PBS에 의해 투석시킨다. 독소 농축물은 혼탁도 에세이 및 응집 에세이에 의해 결정되었다. 상기 2개 에세이의 결과를 표 4에 요약한다.
| pH | 혼탁도 에세이 [Lf/mL] |
응집 에세이 [Lf/mL] |
| 7.0 | 1528 | 1071 |
| 7.5 | 1564 | 1071 |
| 8.0 | 3728 | 2500 |
A. 적합한 포름알데하이드 및 라이신 농축물의 수립
각각의 pH에 대해 500 Lf/ml에 상응하는 디프테리아 독소에 한정된 용량의 1M 라이신(pH 조정 및 멸균 여과된)을 첨가하여 5ml 샘플을 제조하고 또한 0M, 0.025M, 0.05M 및 0.1M 라이신을 첨가한 샘플을 함께 제조한다. 12.5μL(0.25%) 포름알데하이드(FA) 40%를 첨가시키고 각각 2, 3 또는 4일 동안 해독작용을 실시한다. 총 30 포르밀화 조건 하에서 반복하여 시험한다(표 5 참조). 본 명세서에 사용된 최종 농도 0.5% 포름알데하이드는 40%(v/v) 포름알데하이드를 포함하는 포화 용액을 1:200으로 희석시킨 것을 의미하고 최종 농도 1%의 포름알데하이드는 40%(v/v) 포름알데하이드를 포함하는 포화 용액을 1:100으로 희석시킨 것을 의미한다.
| 라이신 농도 | pH 7.0 | pH 7.5 | pH 8.0 | 포르말린 함량 | |||
| 0M | 1 | 2 | 21 | 22 | 41 | 42 | 0.50% |
| 0.025M | 3 | 4 | 23 | 24 | 43 | 44 | 0.50% |
| 5 | 6 | 25 | 26 | 45 | 46 | 0.75% | |
| 7 | 8 | 27 | 28 | 47 | 48 | 1.00% | |
| 0.05M | 9 | 10 | 29 | 30 | 49 | 50 | 0.50% |
| 11 | 12 | 31 | 32 | 51 | 52 | 0.75% | |
| 13 | 14 | 33 | 34 | 53 | 54 | 1.00% | |
| 0.1M | 15 | 16 | 35 | 36 | 55 | 56 | 0.50% |
| 17 | 18 | 37 | 38 | 57 | 58 | 0.75% | |
| 19 | 20 | 39 | 40 | 59 | 60 | 1.00% | |
60개의 샘플을 37℃에서 교반없이 6주간 보관시키고 연이어 1L NaCl 용액(8.5g/L NaCl)으로 10,000의 분자량을 컷-오프시키는 기능을 지닌 슬라이드-A-라이저를 사용하여 4단계로 투석시키고 멸균 여과시킨다. 하기한 바와 같이 모든 분석은 이 물질에 기초한 것이다.
재독성화
디프테리아 혼탁도 에세이의 결과에 의해 각각의 샘플을 NaCl 용액(8.5g/L NaCl)으로 희석시켜 각각 50Lf/mL(소아용 백신) 및 3 Lf/mL(성인 백신)를 제조한 후 37℃에서 6주간 보관한다. 3 및 6주 후에 Vero 세포 시험을 통해 디프테리아 독소 제제의 독성을 측정하였다.
Vero
세포 시험
재독성화 기간 이후뿐만 아니라 해독 단계 이후에 잔류된 디프테리아 독소의 존재를 측정하기 위하여Vero 세포 시험을 시행하였다. Vero 세포는 72시간 동안 서로 다르게 희석된 샘플로 인큐베이션 시켰다. 연이어 세포 생존능을 현미경으로 측정하고 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT) 에세이를 사용하여 정량시켰다. 한편 크리스탈 바이올렛을 Vero 세포 배양액에 첨가시켜 사멸 세포를 측정한다. 모든 시험은 디프테리아 독소에 매우 민감하게 나타났다. Vero 세포의 대상은 0.001 mLf/mL 이하의 독소로 저해되었다.
해독 후 또는 재독성화조건 하에서 3 및 6주간 경과후 모두에서 독소는 검출되지 않았다. 이에 따라 모든 포르밀화 조건에서 라이신에 관계없이 비가역적인 톡소이드를 제공하는 것으로 판단된다.
서로 다른 해독 조건의 효과성의 편차를 위해 몇 개의 다른 분석 방법을 사용하였다.
아미노산 분석
투석이 매우 효과적임을 나타내는 비-가수분해 샘플 번호3, 5, 7, 9, 13, 15, 19 및 47에서 라이신이 검출되지 않았다. 가수분해 후 라이신 함량은 결정되지 않았다.
HPLC
-
SEC
TSK 3000 SWXL을 사용한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 톡소이드의 분자량 분포 에세이를 수립하였다. 크로마토그램은 모든 샘플에 매우 유사하게 나타났으며 용출 후 약 19분 후에 주 단량체 피크(83-95%)와 17분에 작은 이량체 피크(5 17%)가 나타났다.
문헌에 나타난 바와 동일하게 FA 처리는 오직 소량의 디프테리아 이량체를 야기시킨다. 또한 이와 유사하게 미세한 차이가 체류 시간 및 이량화 정도에 따라 발견되었다(표 6 및 7 참조). 일반적으로 더 높은 FA 농도와 더 낮은 라이신 농도는 주 피크의 더 낮은 체류 시간을 야기시켰으며 이는 단량체의 더 큰 분자량에 상응하는 것이다. 이는 또한 FA 처리가 증가될수록 포르밀화의 정도가 더 높아짐을 의미한다.
| 라이신 농도 | pH 7.0 | pH 7.5 | pH 8.0 | 포르말린 함량 | |||
| 0M | 1 |
2 19.65 |
21 |
22 19.50 |
41 |
42 19.43 |
0.50% |
| 0.025M | 3 |
4 19.37 |
23 |
24 19.36 |
43 |
44 19.37 |
0.50% |
| 5 |
6 19.23 |
25 |
26 19.32 |
45 |
46 19.23 |
0.75% | |
| 7 |
8 19.47 |
27 |
28 19.08 |
47 |
48 19.12 |
1.00% | |
| 0.05M | 9 |
10 19.40 |
29 |
30 19.33 |
49 |
50 19.40 |
0.50% |
| 11 |
12 19.35 |
31 |
32 19.27 |
51 |
52 19.37 |
0.75% | |
| 13 |
14 19.13 |
33 |
34 19.20 |
53 |
54 19.22 |
1.00% | |
| 0.1M | 15 |
16 19.72 |
35 |
36 19.67 |
55 |
56 19.62 |
0.50% |
| 17 |
18 19.65 |
37 |
38 19.50 |
57 |
58 19.58 |
0.75% | |
| 19 |
20 19.47 |
39 |
40 19.37 |
59 |
60 19.52 |
1.00% | |
| 라이신 농도 | pH 7.0 | pH 7.5 | pH 8.0 | 포르말린 함량 | |||
| 0M | 1 |
2 12.2 |
21 |
22 13.6 |
41 |
42 13.0 |
0.50% |
| 0.025M | 3 |
4 9.4 |
23 |
24 11.0 |
43 |
44 9.2 |
0.50% |
| 5 |
6 9.8 |
25 |
26 8.7 |
45 |
46 7.7 |
0.75% | |
| 7 |
8 8.6 |
27 |
28 7.6 |
47 |
48 7.9 |
1.00% | |
| 0.05M | 9 |
10 10.2 |
29 |
30 11.0 |
49 |
50 7.2 |
0.50% |
| 11 |
12 9.6 |
31 |
32 9.2 |
51 |
52 5.7 |
0.75% | |
| 13 |
14 8.9 |
33 |
34 9.3 |
53 |
54 4.4 |
1.00% | |
| 0.1M | 15 |
16 10.7 |
35 |
36 16.6 |
55 |
56 9.8 |
0.50% |
| 17 |
18 9.4 |
37 |
38 13.5 |
57 |
58 9.4 |
0.75% | |
| 19 |
20 9.2 |
39 |
40 9.5 |
59 |
60 7.6 |
1.00% | |
라이신의 영향력은 FA의 영향력보다 더 큰 것으로 판단되었으며 이는 파라미터의 더 넓은 변이에 근거한 것이다. 연구된 범위 내에서 pH는 아무런 영향력을 나타내지 않는 것으로 판단된다.
라이신이 제거된 샘플은 일반적 경향을 나타내지 않았다. 이들은 0.025M 라이신에 비해 더 긴 용출 시간과 더 많은 양의 이량체를 나타낸다. 라이신에 존재하에 FA는 N-하이드록시메틸레이트 라이신을 바람직하게 생성시킨다. 이 중간체는 FA 단독보다 독소에 더 큰 반응성을 나타내며 이는 더 큰 포르밀화와 감소된 이량화에 의해 설명된다.
Superdex 200 HR 10/30 컬럼 상에서 샘플번호 2, 3, 7, 15 및 47을 살펴보면 이러한 경향을 판단할 수 있다. 포밀화는 1% FA 40%와 0.025M 라이신을 첨가할 때 최고로 나타났다.
IEF
등전점전기영동(IEF)를 통해 FA 처리 정도를 평가하였다. FA가 양성 전하 아미노 그룹과 반응하기 때문에 산성 그룹은 더 우세해질 것이다. 이와 같은 결과는 pI의 저하이다.
선별된 샘플번호 1, 7, 15, 41, 47 및 55를 시험하였다(도 4 참조). 이들의 크로마토그래피 형태에 명백한 차이가 나타나기 때문에 모든 30개의 샘플의 그 pI를 측정하였다(도 5-8 참조). 이 연구의 결과를 표 8에 요약하였다.
| 샘플 설명 | pI 범위 |
| 종래 제품의 톡소이드 | 4.8 ~ 3.5 |
| 라이신이 없는 해독 | 4.8 ~ 4.0 |
| 0.025M의 라이신이 첨가된 해독 | 5.0 ~ 4.1 |
| 0.05M의 라이신이 첨가된 해독 | 5.2 ~ 4.3 |
| 0.1M의 라이신이 첨가된 해독 | 5.4 ~ 4.4 |
| CRM, 역가 테스트 실패 | 5.4 ~ 4.6 |
이론적인 판단에 일치하여 더 많은 FA 처리를 적용할수록, 즉 더 높은 FA 농도와 더 낮은 라이신 농도로 처리할수록 pI는 더 낮아진다. 또한 라이신의 영향력은 FA의 영향력보다 더 큰 것으로 나타났으며 pH 의존은 나타나지 않았다.
라이신을 포함하지 않거나 오직 0.025M 라이신을 포함하는 모든 샘플은 조-디프테리아 독소가 해독되고 톡소이드가 정제되기 이전의 종래 생산된 톡소이드의 범위에 비교될 수 있는 pI 범위를 나타내었다. 오직 그 범위는 좁아졌으며 이는 출발 물질의 더 높은 순도를 아마 반영하는 것이다.
그러나 더 높은 라이신 농도는 더 낮은 정도의 포밀화를 유도하였다. 이들 샘플의 pI 패턴은 실패된 CRM 샘플과 유사하였으며 이는 높은 pI를 지닌 샘플은 역가 테스트를 만족하지 못한다는 가정을 야기케 한다.
결론
본 연구의 범위 내에서 모든 디프테리아 독소 샘플은 해독되었으며 37℃에서 6주간 보관 후 재독성화는 나타나지 않았다. HPLC와 IEF 연구 모두는 1% FA 40%와 0.025M 라이신에서 포르밀화 정도가 최고인 것으로 나타났다.
라이신을 포함하지 않는 샘플 조차도 균등하게 잘 해독되었음을 나타내지만 소량의 라이신이 더 낮은 이량화를 위해 바람직한 것이다.
B. 적합한 디프테리아 독소 농도 및 해독 시간의 수립
더 높은 독소 농도(500-5000 Lf)와 해독 시간(14, 28 및 42일) 모두가 조사되었다. 정제된 디프테리아 독소 농축물(12,500 Lf/mL, 20 mmol/L)을 0.1 mol/L의 인산완충액으로 희석시키고 여과 멸균시킨다. 최종 독소 농도 및 샘플 조성을 표 9에 나타내었다.
| 샘플 번호 | 디프테리아 독소 [Lf/mL] |
라이신[M] | 포르말린[%] |
| 1 2 3 |
500 2000 5000 |
0 0 0 |
1 1 1 |
| 4 5 6 7 8 |
500 1000 2000 3000 5000 |
0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 |
1 1 1 1 1 |
| 9 10 11 12 |
2000 2000 2000 2000 |
0.025 0.050 0.025 0.100 |
2 2 4 4 |
각각의 샘플을 위해 100mL 용량으로 제조되었고 포름알데하이드 첨가 후 2, 4 및 6주 후에 5mL의 각각의 샘플을 채취하여 투석시키고 단 유리 포름알데하이드 농도의 결정을 제외시킨 후 분석시킨다.
12, 28 및 42일 후의 혼탁도 시험 결과를 표 10에 나타내었다.
| 샘플 번호 | 이론치 [Lf/mL] |
14일 후 [Lf/mL] |
28일 후 [Lf/mL] |
42일 후 [Lf/mL] |
| 1 | 500 | 216 | 276 | 244 |
| 2 | 2000 | 1454 | 1354 | 1196 |
| 3 | 5000 | 4493 | 3014 | 3058 |
| 4 | 500 | 492 | 478 | 374 |
| 5 | 1000 | 1097 | 1066 | 946 |
| 6 | 2000 | 2236 | 2016 | 2035 |
| 7 | 3000 | 3089 | 3170 | 2860 |
| 8 | 5000 | 5158 | 5980 | 5736 |
| 9 | 2000 | 2080 | 1939 | 2285 |
| 10 | 2000 | 2028 | 2184 | 2215 |
| 11 | 2000 | 1830 | 1716 | 1716 |
| 12 | 2000 | 2010 | 1792 | 1980 |
포름알데하이드와 라이신으로 해독시킨 샘플은 42일 경과 후에도 활성(Lf/mL)의 저하를 나타내지 않았다. 라이신이 없는 샘플은 라이신을 지닌 샘플에 비해 더 낮은 Lf/mL 수치를 나타내었다. 활성의 큰 저하는 14일 후에 나타났으며 28일 및 42일 후에는 오직 약한 활성의 저하만이 나타났다.
모든 샘플에 상기한 바와 같은 Vero 세포 에세이를 통해 잔류 독성을 측정하였으며 이를 정제된 독소 및 표준품과 비교하였다. 샘플은 100 내지 300 Lf/mL의 ED50 수치를 나타내었으며 이는 독소의 수치보다 105∼106배 높은 것이다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 디프테리아 톡소이드는 50∼500Lf/mL의 수치를 나타내었다. 해독화 과정의 시간 의존성은 관찰되지 않았다. 이는 14일 후에 독성이 완전히 제거된 것 같았다. 샘플 1 내지 12의 Vero 세포 에세이 결과를 표 11에 요약하였다.
| 14일 후 50% 값 [Lf/mL] |
28일 후 50% 값 [Lf/mL] |
42일 후 50% 값 [Lf/mL] |
|
| 1 | 167.20 | 146.74 | 238.44 |
| 2 | 187.19 | 192.86 | 174.16 |
| 3 | 391.50 | 176.66 | 260.2 |
| 4 | 138.66 | 122.95 | 135.03 |
| 5 | 203.20 | 165.04 | 200.06 |
| 6 | 206.27 | 140.82 | 241.65 |
| 7 | 231.74 | 200.30 | 259.97 |
| 8 | 217.26 | 196.18 | 308.04 |
| 9 | 149.81 | 184.65 | 306.23 |
| 10 | 128.67 | 167.13 | 231.52 |
| 11 | 164.14 | 151.70 | 239.53 |
| 12 | 116.40 | 128.29 | 190.53 |
| 표준 | 0.00031 | 0.00017 | 0.00071 |
| 표준 | 0.00045 | 0.00162 | 0.00041 |
| 독소 | 0.00055 | 0.00665 | 0.01234 |
| 독소 | 0.00168 | 0.00682 | 0.00046 |
이와 같은 발견은 유리 포름알데하이드의 측정 후에 얻어진 결과에 의해 지지되는 것이다. 해독 후 14일 후에 모든 샘플은 최초 농도에 비해 더 낮은 유리 포름알데하이드 농도를 나타내었으며 그 후 30일 동안 더 이상의 포름알데하이드는 소비되지 않았다. 투석 이전에 샘플 1 내지 12의 유리 포름알데하이드 농도를 결정하는 에세이의 결과를 표 12에 요약하였다.
| 이론적 출발치 | 14일 후 [g/l] |
28일 후 [g/l] |
42일 후 [g/l] |
|
| 1 | 3.8 | 3.6 | 3.0 | 3.6 |
| 2 | 3.8 | 3.5 | 2.9 | 3.4 |
| 3 | 3.8 | 3.2 | 2.7 | 3.3 |
| 4 | 3.8 | 2.4 | 1.9 | 2.0 |
| 5 | 3.8 | 2.3 | 1.9 | 1.9 |
| 6 | 3.8 | 2.2 | 1.9 | 1.9 |
| 7 | 3.8 | 2.4 | 1.8 | 1.8 |
| 8 | 3.8 | 2.0 | 1.6 | 1.7 |
| 9 | 7.6 | 4.8 | 4.2 | 4.4 |
| 10 | 7.6 | 3.2 | 3.1 | 2.6 |
| 11 | 15.2 | 11.9 | 10.7 | 11.7 |
| 12 | 15.2 | 7.3 | 6.2 | 6.3 |
SEC에 의한 샘플의 분석은 해독 후 14일 후에 더 이상의 반응이 진행되지 않음을 나타내었다(도 9-11 참조). SEC 분석은 라이신의 존재 및 부재하에 해독 과정 내에서 더 높은 독소 농도의 영향력을 포함하는 것은 아니다. 독소 농도가 증가할수록 이량체와 다량체의 획분은 증가하였다(도 9-11 참조). 이량체와 다량체의 형성은 라이신의 존재 및 부재 하에 관찰되었다. 그러나 라이신은 가교결합 반응을 현저히 억제시켜 그의 부재시보다 더 적은 이량체의 형성을 야기시켰다. 즉 라이신의 부재시 33% 이량체가 존재함에 비해 0.025 mM 라이신 2000 Lf/ml에서는 10% 이량체가 존재한다. 표 11, 샘플 2 및 6 참조하라. 샘플 1 내지 12 각각의 이량체의 퍼센트를 표 13에 나타내었다.
| 14일 후 이량체[%] |
28일 후 이량체[%] |
42일 후 이량체[%] |
|
| 1 | 9 | 10 | 12 |
| 2 | 28 | 32 | 33 |
| 3 | 51 | 56 | 58 |
| 4 | 2 | 2 | 2 |
| 5 | 5 | 5 | 5 |
| 6 | 10 | 10 | 10 |
| 7 | 14 | 14 | 15 |
| 8 | 23 | 23 | 24 |
| 9 | 9 | 9 | 10 |
| 10 | 9 | 8 | 8 |
| 11 | 9 | 10 | 10 |
| 12 | 9 | 9 | 9 |
각각의 피크의 분자량을 분석하기 위한 SEC 내의 광 산란 감지기를 결합한 분석에서 주 피크는 60kDa의 분자량을 지닌 단량체임을 확인하였다. 작은 피크는 120kDa의 이량체였으며 일정 샘플 내에서 180kDa의 삼량체 또는 다량체가 검출되었다.
(실시예 6) 신규한 방법에 의해 제조된 디프테리아 톡소이드의 역가
역가 연구가 European Pharmacopoeia(1997, 3차 개정, 유럽 카운슬, 스트라스부르그, 프랑스, 디프테리아 백신의 에세이(흡착), pp.113-115)의 요구 조건에 일치하여 수행되었다.
조-디프테리아 독소가 이전 실시예에서 기재한 바와 같이 제조되었다. 조-디프테리아 독소의 정제 및 해독을 위해 실시예 4에 기재된 정제 공정과 실시예 5에 기재된 최적 해독 공정을 결합하여 시행하였으며 결합된 공정에 의한 결과를 도 12에 나타내었다.
디프테리아 독소를 상기한 바와 같이 음이온 교환 크로마토그래피로 정제시켰다. 용출액의 독소 농도는 5000Lf/mL로 조정시켰다. 농축 디프테리아 독소 용액을 pH 7.5 인산 완충액에서 최종 농도 1%의 FA(40% 용액)와 실시예 5에 기재된 바와 같이 0.025M 최종 농도의 라이신을 첨가시켜 해독시켰다. 수득된 디프테리아 톡소이드를 희석시키고 순차적으로 수산화알루미늄에 흡착시켰다. 최종 백신 제형의 조성을 표 14에 나타내었다.
백신 제형의 역가를 기니아 피그를 통해 측정하였다. 소아용 백신의 경우 최소 신뢰 한계가 적어도 30 IU/도스인 경우 역가 시험을 통과한 것이다. 역가 시험의 결과를 표 14에 요약하였다.
| 샘플 | 디프테리아 독소 [Lf/mL] |
파상풍 독소 [Lf/mL] |
IPV | Al(OH)3 [mg/mL] |
삼투압 [mosm/kg] |
pH | 역가 [IU/도스] |
| D 백신 (소아) |
50 | - | - | 3.24 | 266 | 6.20 | 39 통과 |
| D 백신 (소아) |
50 | - | - | 3.15 | 267 | 6.40 | 48 통과 |
| D 백신 (소아) |
50 | - | - | 3.15 | 267 | 6.40 | 35 통과 |
| Td-IPV (성인) |
4 | 10 | 80/16/64 | 1.95 | 290 | 6.86 | 5 통과 |
| Dt 백신 (소아) |
34 | 20 | - | 3.28 | 271 | 6.37 | 33 통과 |
| DT 농도 | 167 | 67 | - | 7.36 | 314 | 6.30 | 39 통과 |
*역가 시험을 위해 농축물을 50 Lf/mL 디프테리아 독소 및 30Lf/mL 파상풍 독소로 희석시켰다.
(실시예 7) 디프테리아 톡소이드 조성의 분석
도 12에 나타난 바와 같은 공정에 의해 제조된 디프테리아 톡소이드를 포함하는 조성물을 +2 내지 8℃에서 12개월 간 보관하였다. 전체 생산 공정 중 아무런 보존제도 조성물에 첨가하지 않았다. 각각의 시점에서 샘플의 일부를 역가 테스트, 순도 테스트, 응집 테스트, HPLC 분석, pH 측정, 독성 및 멸균 테스트 및 유리 라이신, 포름알데하이드, 염화나트륨, 황산염 및 인산염의 함량을 측정하기 위한 화학적 분석을 행하였다. 역가와 독성은 기니아 피그로 시험하였다. 그 결과를 표 15에 요약하였다.
모든 시점에서 조성물은 순도 요건 및 역가 요건을 폭넓게 초과하는 것이었다. 이와 유사하게 잔류 포름알데하이드 농도는 허용 한계인 0.2mg/ml 이하였다.
| 시험항목 | 요구조건 | 저장기간 | ||
| 0 | 6 | 12 | ||
| 디프테리아 역가 e.p. (I.U/ml) 1.l-u.l |
l.l>=2.0 | 10 6-15 |
10 8-14 |
|
| 질소 항원 순도 (Lf/mg N) |
>=1500 | 2710 | 2740 | 2128 |
| 질소 항원 순도 (Lf/mg N)/새 방법 |
>=1500 | 2865 | 2825 | 2279 |
| Lf 함량(Lf) | - | 10000 | 10000 | 8000 |
| 질소 첫 번째 테스트 (mg/ml) |
Lf/mgN 및 Lf로 측정 | 3.69 | 3.65 | 3.76 |
| 질소 두 번째 테스트 (mg/ml)/새 방법 |
Lf/mgN 및 Lf로 측정 | 3.49 | 3.54 | 3.51 |
| 라이신 함량(nmol/ml) | <=550 | 555 | 테스트안함 | 876 |
| HPLC 분석 | - | 충족 | 충족 | 충족 |
| pH | 7.2-7.8 | 7.54 | 7.7 | 7.7 |
| 염화나트륨(mg/ml) | 8-9 | 7.94 | 8.0 | 7.95 |
| 포름알데하이드(mg/ml) | <=0.2 | 0.100 | 0.143 | 0.163 |
| 인산염(μg/ml) | <=15 | <=0.10 | 0.10 | <=0.10 |
| 황산염 | 측정되지 않음 | 충족 | 충족 | 충족 |
| 비정상 독성 음성 실험 | Acc.to.Ph.Eur | 충족 | 충족 | 충족 |
| 독성(5명중 생존자) | 5(독성없음) | 5 | 5 | 5 |
| 멸균시험 | Acc.to Ph.Eur | 충족 | 충족 | 충족 |
e.p. = 예측 역가
meets spec = 요구 조건 충족
n.t.= 테스트하지 않았음
l.l. = 한계 최저치 이하
* = 역가는 성인용 흡착 디프테리아 백신과 같은 백신 시제품 조성으로 측정하였음.
상기한 실시예는 본 발명의 설명을 위한 것으로 이의 변형이 본 발명의 범위 및 정신 내에서 가능한 것으로 이해될 것이다.
참고문헌
[1] Vaccines. (eds. Plotkin & Orenstein). 4th edition, 2004, ISBN: 0-7216-9688-0.
[2] New Generation Vaccines (eds. Levine et al.) 2nd edition, 1997. ISBN: 0-8247-0061-9.
[3] Kattan et al. (May 2011), J. Allergy. Clin. Immunol. 128(1):215-218
[4] Orhan & Sekerel (2003), Allergy 58(2):127-131
[5] European patent 1849860
[6] WO2005/056773
[7] WO2006/042542
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Claims (17)
- ⅰ) 동물 유래 성분이 제거된 발효 배지 내에서 디프테리아 독소를 발현하는 코리네박테리움 디프테리아 균주 배양물을 성장시키는 단계;
ⅱ) 85% 내지 95% 순도를 지닌 디프테리아 독소 용액을 수득하기 위해 발효 배지로부터 디프테리아 독소를 정제하는 단계;
ⅲ) 농축 용액을 수득하기 위해 디프테리아 독소 용액 내의 디프테리아 독소의 농도를 적어도 2000 Lf/ml로 조정시키는 단계;
ⅳ) 해독화된 용액을 수득하기 위해 농축 용액에 (a) 최종 농도 0.025M 이내의 아미노산, 및 (b) 최종 농도 0.75 내지 1%의 포르말린을 첨가시키는 단계; 및
ⅴ) 디프테리아 톡소이드를 수득하기 위해 해독화된 용액을 인큐베이션 시키는 단계;
로 이루어진 인간 백신 제조를 위한 디프테리아 톡소이드의 생산 방법
- 제 1항에 있어서, 아미노산은 글리신 또는 라이신임을 특징으로 하는 방법
- 제 1항에 있어서, 상기 발효 배지는 철 제거 효모 추출물; 적어도 0.08M의 이당류; 1.5μM 내지 30μM의 용해성 Fe2 +/Fe3 +; 인, 마그네슘, 구리, 아연, 망간, 피멜리산, 니코틴산 및 베타-아닐린; 을 포함하고,
배양액 내에서 디프테리아 독소가 적어도 140 Lf/mL의 농도로 성장됨을 특징으로 하는 방법
- 제 3항에 있어서, 상기 디프테리아 독소 농도는 적어도 200 Lf/mL임을 특징으로 하는 방법
- 제 3항에 있어서, 상기 효모 추출물은 야생형 균주보다 적어도 30% 이상 더 적은 만난을 포함하는 효모 균주로부터 수득됨을 특징으로 하는 방법
- 제 3항에 있어서, 상기 이당류는 0.08M 내지 0.16M 농도로 존재함을 특징으로 하는 방법
- 제 3항에 있어서, 상기 철은 Fe(Ⅲ) 염임을 특징으로 하는 방법
- 제 7항에 있어서, Fe(Ⅲ) 염은 서방출성 철 제형을 위해 인산과 칼슘염을 복합시켜 발효 배지에 첨가함을 특징으로 하는 방법
- 제 1항에 있어서, 상기 디프테리아 독소는 적어도 1500 Lf/mg 단백질 질소 농도로 정제됨을 특징으로 하는 방법
- 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 디프테리아 톡소이드
- 제 10항의 디프테리아 톡소이드와 코리네박테리움 디프테리아 이외의 적어도 하나의 병원체에 대한 보호 항원을 포함하는 다가 백신 조성물을 제조하는 방법
- 제 11항의 방법에 따라 수득된 다가 백신 조성물
- 85% 내지 95% 순도를 지닌 디프테리아 독소로부터 해독시켜 제조된 가교결합 디프테리아 톡소이드를 포함하는 인간 백신 조성물에 있어서, 상기 톡소이드는 동물 유래 단백질의 가교 결합이 존재하지 않으며 적어도 60 IU/mL 역가를 지님을 특징으로 하는 백신 조성물
- 제 13항에 있어서, 백신 조성물 내의 적어도 70% 디프테리아 톡소이드는 크기 배제 크로마토그래피 방법으로 측정시 단량체 형태임을 특징으로 하는 백신 조성물
- 제 13항에 있어서, 백신 조성물은 단량체 및 이량체, 디프테리아 톡소이드를 포함하고 디프테리아 톡소이드 내의 단량체:이량체 비율은 3:1 내지 8:1이며 디프테리아 톡소이드의 등전점은 4.0 내지 5.0 이내임을 특징으로 하는 백신 조성물
- 제 13항에 있어서, 디프테리아 톡소이드는 적어도 1500 Lf/mg 디프테리아 독소 단백질 순도를 지님을 특징으로 하는 백신 조성물
- 제 13항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움 디프테리아 이외의 적어도 하나의 병원체에 대한 보호 항원을 더욱 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물
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