JP2010529103A - 髄膜炎ワクチンの製剤化 - Google Patents

Abstract

液体Ｈｉｂ成分を用いて凍結乾燥髄膜炎菌成分を再構成し、それにより、混合髄膜炎ワクチンを生成させる。凍結乾燥髄膜炎菌成分は、水中油型エマルジョンを用いて再構成することもできる。一実施形態において、本発明は、（ｉ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型莢膜サッカリドの結合体を含む水性成分と、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜サッカリドの結合体を含む凍結乾燥成分とを含むキットを提供する。患者に投与するために、水性及び凍結乾燥成分を混合して、注射に適する混合液体ワクチンを得る。

Description

この出願は、米国仮出願第６０／９３３，２３５号（この完全な内容は、参考として本明細書に援用される）からの優先権を主張する。

本発明は、髄膜炎に対する免疫感作のための混合ワクチンを製剤化する分野に属する。

複数の病原性生物からの抗原を単一用量中に含むワクチンは、「多価」又は「混合」ワクチン、例えば、ジフテリア、破傷風、百日咳（「ＤＴＰ」）ワクチン並びに麻疹、流行性耳下腺炎、風疹（「ＭＭＲ」）ワクチンとして知られている。混合ワクチンは、特に小児科ワクチン接種における遵守の向上という臨床的利点につながる（例えば、参考文献１（非特許文献１）の２９章を参照）、注射を受ける回数が少ないという恩恵を患者に与える。しかし、同時に、それらは、抗原と他の成分との物理的及び生化学的不適合性、免疫学的干渉並びに安定性などの因子に起因する困難をもたらす。

これらの困難の一部は、ワクチンの適切な製剤によって対処することができる。例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型（「Ｈｉｂ」）の結合ＰＲＰ莢膜サッカリドは、水性条件で不安定となり得、そのため、ＩＮＦＡＮＲＩＸ（商標）シリーズ（ＰＥＤＩＡＲＩＸ（商標）を含む）におけるＨｉｂ含有ワクチンは、残りの抗原の水性製剤によって使用時に再構成する凍結乾燥Ｈｉｂ成分を含む。参考文献２（特許文献１）もＨｉｂ含有ワクチンの製剤を記述しており、Ｈｉｂ結合体が即座の再構成のために髄膜炎菌結合体と一緒に凍結乾燥されている。それと対照的に、参考文献３（特許文献２）は、さらなる成分（例えば、Ｈｉｂ又は肺炎球菌結合体）を凍結乾燥し、再構成することができる、髄膜炎菌結合体の完全に液体の製剤を記述している。参考文献２２（特許文献３）は、血清群Ａ（「ＭｅｎＡ」）結合体が他の血清群の結合体の液体製剤による再構成のために凍結乾燥されている、髄膜炎菌結合体の組合せについて述べている。

国際公開第０２／００２４９号パンフレット 国際公開第２００５／０３２５８３号パンフレット 国際公開第０３／００７９８５号パンフレット

ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ編、Ｖａｃｃｉｎｅｓ、第４版、２００４

Ｈｉｂ及び髄膜炎菌は、細菌性髄膜炎の２つの原因であり、Ｈｉｂ及び髄膜炎菌結合体のさらなる改良型のワクチン製剤を提供することが本発明の目的である。

本発明のいくつかの実施形態によれば、液体Ｈｉｂ成分を用いて凍結乾燥髄膜炎菌成分を再構成し、それにより、混合髄膜炎ワクチンを生成させる。

したがって、本発明は、（ｉ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型莢膜サッカリドの結合体を含む水性成分と、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜サッカリドの結合体を含む凍結乾燥成分とを含むキットを提供する。患者に投与するために、水性及び凍結乾燥成分を混合して、注射に適する混合液体ワクチンを得る。

本発明はまた、（ｉ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型莢膜サッカリドの結合体を含む水性成分と、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜サッカリドの結合体を含む凍結乾燥成分を混合する工程とを含む、混合ワクチンを調製する方法を提供する。

本発明はまた、水性Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ結合体と凍結乾燥Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ結合体とを合わせることによって調製される、（ｉ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型莢膜サッカリドの結合体と、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜サッカリドの結合体とを含む混合ワクチンを提供する。該ワクチンは、凍結乾燥安定化剤を含んでいてよい（下記を参照）。

液体成分
本発明のキット及び方法は、Ｈｉｂサッカリドの結合体を含む水性抗原性成分の使用を含む。Ｈｉｂ結合体の投与は、患者において好ましくは≧０．１５μｇ／ｍｌ、より好ましくは≧１μｇ／ｍｌの抗ＰＲＰ抗体濃度をもたらす。これらは、標準的な許容できる応答閾値である。

Ｈｉｂサッカリド抗原はよく知られており［例えば、参考文献１の１４章］、それらの調製は十分に記録に残されている［例えば、参考文献４〜１３］。Ｈｉｂサッカリドは、特に小児におけるその免疫原性を増大させるために担体タンパク質に結合させる。本発明は、あらゆる適切なＨｉｂ結合体を使用することができる。

Ｈｉｂ結合体のサッカリド部分は、多糖（例えば、全長ポリリボシルリビトールリン酸（ＰＲＰ）であってよいが、オリゴ糖（例えば、ＭＷが約１〜約５ｋＤａ）を用いることも可能である。オリゴ糖は、好都合には、精製ＰＲＰの断片化（例えば、加水分解による）と通常その後の所望のサイズの断片の精製により形成される。本発明の組成物が複合オリゴ糖を含む場合、オリゴ糖の調製を結合体化に先行させるべきである。

水性成分中のＨｉｂ結合体の濃度は、通常、０．５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、例えば、１μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ、１２μｇ／ｍｌ〜１６μｇ／ｍｌ等の範囲内にある。濃度は、約１５μｇ／ｍｌであってよい。

水性Ｈｉｂ成分は、アジュバント化されていなく（ｕｎａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）てもよく、又はアジュバントを含んでいてもよい。アジュバントが含まれている場合、それは一般的に、アルミニウム塩、例えば、リン酸塩又は水酸化物塩である。アジュバントが含まれている場合、Ｈｉｂ成分は、アルミニウム塩に吸着していてもよく、又は吸着していなくてもよい。リン酸アルミニウムアジュバントへの吸着はある状況において有利であることが報告された［１４］が、非吸着が他の状況において有利であることが報告された［２］。

様々な異なるＨｉｂ結合体が知られている。例えば、参考文献１の表１４−７に４種の異なるＨｉｂ結合体の特性が示されている。これらは、種々のパラメーター、例えば、担体タンパク質が異なっている。本発明は、ＣＲＭ１９７（「ＨｂＯＣ」におけるような）、破傷風トキソイド（「ＰＲＰ−ＧＴ」におけるような）及びＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜複合体（「ＰＲＰ−ＯＭＰ」におけるような）などのあらゆる適切な担体タンパク質（下記を参照）を用いることができる。

様々な水性Ｈｉｂ結合体が市販されており、本発明で用いることができる。例えば、ＷｙｅｔｈのＨＩＢＴＩＴＥＲ（商標）製品は、液体製剤として入手可能である。ＨＩＢＴＩＴＥＲ（商標）は、ＣＲＭ１９７担体を用い、各０．５ｍｌ用量（バイアル入りで供給される）は、０．９％塩化ナトリウム中１０μｇのサッカリドを含み、アジュバントは含まない。ＭｅｒｃｋのＰＥＤＶＡＸＨＩＢ（商標）製品も液体製剤として入手可能である。ＰＥＤＶＡＸＨＩＢ（商標）は、ＯＭＰＣ担体を用い、各０．５ｍｌ用量が０．９％塩化ナトリウム中７．５μｇのサッカリドと２２５μｇの硫酸ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントを含む。これは、ラクトース及びチメロサールを含まない。ＡＣＴＨＩＢ（商標）製品は、現在液体剤形で入手可能ではない。他の有用なＨｉｂ結合体は、アジピン酸リンカーを介してＣＲＭ_１９７に共有結合しているＨｉｂオリゴ糖を含む［１５、１６］。

Ｈｉｂ結合体は、水性成分中の唯一の抗原性成分であってよく、或いは１つ又は複数の追加の抗原が存在していてよい。例えば、水性成分は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原、不活性化ポリオウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原及び／又は肺炎球菌サッカリドのうち１つ又は複数を含んでいてよい。水性成分がアジュバント化され、Ｈｉｂ結合体、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原、不活性化ポリオウイルス抗原及びＢ型肝炎ウイルス表面抗原を含む場合、ＨＥＸＡＶＡＣ（商標）製品を用いることができる。水性成分がアジュバント化され、Ｈｉｂ結合体、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、全細胞百日咳抗原、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を含む場合、ＱＵＩＮＶＡＸＥＭ（商標）製品を用いることができる。水性成分がアジュバント化され、Ｈｉｂ結合体、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原及びポリオウイルス抗原を含む場合、ＰＥＤＩＡＣＥＬ（商標）製品を用いることができる。

非アジュバント化ＨＩＢＴＩＴＥＲ（商標）ワクチンのような市販の液体１価Ｈｉｂ結合体は、本発明で用いるのに好ましい水性成分である。Ｈｉｂ結合体と髄膜炎菌結合体とを合わせる場合にアジュバントを避ける明らかな利点は、参考文献２に記載されている。

凍結乾燥成分
本発明のキット及び方法は、髄膜炎菌莢膜サッカリドの結合体を含む凍結乾燥抗原性成分の使用を含む。髄膜炎結合体の投与は、好ましくは殺菌抗体反応をもたらし、ヒト補体を用いて測定される少なくとも４倍、好ましくは少なくとも８倍の関連する血清群の血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）力価の増加を伴う［１７］。ウサギ補体を用いてＳＢＡ力価を測定する場合、力価の増加は好ましくは少なくとも１２８倍である。

血清群Ｃに対する混合１価ワクチンは、ヒトにおける使用について承認され、ＭＥＮＪＵＧＡＴＥ（商標）［１８］、ＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣ（商標）及びＮＥＩＳＶＡＣ−Ｃ（商標）を含む。血清群Ａ＋Ｃの結合体の混合物が知られており［１９、２０］、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙの結合体の混合物が報告され［２１〜２４］、水性ＭＥＮＡＣＴＲＡ（商標）製品として２００５年に承認された。本発明で用いる凍結乾燥成分は、１つ又は複数の髄膜炎菌結合体を含んでいてよい。血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５及びＹの２つ、３つ又は４つを含むことが一般的であり、例えば、Ａ＋Ｃ、Ａ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５、Ｃ＋Ｙ、Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｃ＋Ｙ、Ａ＋Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ等である。４つのすべての血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５及びＹのサッカリドを含む成分が好ましい。１つを超える血清群の結合体が含まれている場合、それらは実質的に等しい質量で存在していてよい。例えば、各血清群のサッカリドの質量は互いの±１０％以内である。凍結乾燥成分中の血清群当たりの一般的な量は、１μｇと２０μｇの間、例えば、血清群当たり２〜１０μｇ、又は約４μｇである。実質的に等しい比率に代わるものとして、２倍の質量の血清群Ａサッカリドを用いることができる。

血清群Ａの髄膜炎菌の莢膜サッカリドは、Ｃ３及びＣ４位に部分Ｏ−アセチル化を伴う（α１→６）結合Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−１−リン酸のホモポリマーである。Ｃ−３位のアセチル化は、７０〜９５％であり得る。サッカリドを精製するのに用いる条件は脱Ｏ−アセチル化をもたらし得る（例えば、塩基性条件下）が、ＯＡｃをこのＣ−３位に保持することは有用である。いくつかの実施形態において、血清群Ａサッカリドにおけるマンノサミン残基の少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上）がＣ−３位でＯ−アセチル化されている。アセチル基は、加水分解を防ぐために遮断基で置換することができ［２５］、そのような修飾サッカリドは、本発明の意味の範囲内で依然として血清群Ａサッカリドである。

血清群Ｃ莢膜サッカリドは、（α２→９）結合シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸又は「ＮｅｕＮＡｃ」）のホモポリマーである。該サッカリドの構造は、→９）−ＮｅｕｐＮＡｃ７／８ＯＡｃ−（α２→と書く。ほとんどの血清群Ｃ株は、シアル酸残基のＣ−７及び／又はＣ−８にＯ−アセチル基を有するが、臨床分離株の約１５％がこれらのＯ−アセチル基を欠いている［２６、２７］。ＯＡｃ基の存在又は非存在が特有のエピトープを発生させ、サッカリドに対する抗体の結合の特異性がＯ−アセチル化（ＯＡｃ−）及び脱Ｏ−アセチル化（ＯＡｃ＋）株に対するその殺菌活性に影響を及ぼす可能性がある［２８〜３０］。本発明で用いる血清群Ｃサッカリドは、ＯＡｃ＋又はＯＡｃ−株から調製することができる。認可済みＭｅｎＣ結合型ワクチンは、ＯＡｃ−（ＮＥＩＳＶＡＣ−Ｃ（商標））及びＯＡｃ＋（ＭＥＮＪＵＧＡＴＥ（商標）及びＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣ（商標））サッカリドを含む。いくつかの実施形態において、血清群Ｃ結合体の製造用の株は、例えば、血清型１６、血清亜型Ｐ１．７ａ、１等のＯＡｃ＋株である。したがって、Ｃ：１６：Ｐ１．７ａ、１ＯＡｃ＋株を用いることができる。Ｃ１１株などの血清亜型Ｐ１．１のＯＡｃ＋株も有用である。

血清群Ｗ１３５サッカリドは、シアル酸−ガラクトース二糖単位のポリマーである。血清群Ｃサッカリドと同様に、それは可変Ｏ−アセチル化を有するが、シアル酸７及び９位に有する［３１］。構造は→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇａｌ−α−（１→と書く。

血清群Ｙサッカリドは、二糖反復単位がガラクトースの代わりにグルコースを含むことを除いて、血清群Ｗ１３５サッカリドと類似している。血清群Ｗ１３５と同様に、それはシアル酸７及び９位に可変Ｏ−アセチル化を有する［３１］。血清群Ｙの構造は→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇｌｃ−α−（１→と書く。

本発明により用いられるサッカリドは、上述のようにＯ−アセチル化されていてよく（例えば、天然莢膜サッカリドに認められるのと同じＯ−アセチル化パターンを有する）、或いはそれらはサッカリド環の１つ又は複数の位置で部分的又は完全に脱Ｏ−アセチル化されていてよく、或いはそれらは天然莢膜サッカリドと比べて高Ｏ−アセチル化されていてよい。

結合体におけるサッカリド部分は、髄膜炎菌から調製される全長サッカリドを含んでいてよく、かつ／又は全長サッカリドの断片を含んでいてよい（すなわち、サッカリドは細菌に認められる天然莢膜サッカリドより短くてよい）。したがって、サッカリドは解重合してよく、解重合は、サッカリドの精製中又は後に起こるが、結合体化の前に起こる。解重合により、サッカリドの鎖長は減少する。１つの解重合法は、過酸化水素の使用を必要とするものである［２１］。過酸化水素をサッカリドに加え（例えば、最終Ｈ_２Ｏ_２濃度が１％になるように）、所望の鎖長の減少が達成されるまで混合物をインキュベートする（例えば、約５５℃で）。他の解重合法は、酸加水分解を必要とするものである［２２］。他の解重合法が当技術分野で知られている。本発明による使用のための結合体を調製するのに用いるサッカリドは、これらの解重合法のいずれかにより得ることができる。免疫原性をもたせるために最適な鎖長を提供し、かつ／又はサッカリドの物理的扱い易さのために鎖長を減少させるために、解重合を用いることができる。いくつかの実施形態において、サッカリドは、次の範囲の平均重合度（Ｄｐ）を有する：Ａ＝１０〜２０；Ｃ＝１２〜２２；Ｗ１３５＝１５〜２５；Ｙ＝１５〜２５。Ｄｐではなく、分子量に関しては、すべての血清群について有用な範囲は、＜１００ｋＤａ；５ｋＤａ〜７５ｋＤａ；７ｋＤａ〜５０ｋＤａ；８ｋＤａ〜３５ｋＤａ；１２ｋＤａ〜２５ｋＤａ；１５ｋＤａ〜２２ｋＤａである。

いくつかの実施形態において、髄膜炎菌の血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５及びＹのそれぞれのサッカリドの平均分子量は、５０ｋＤａを超えていてよい、例えば、≧７５ｋＤａ、≧１００ｋＤａ、≧１１０ｋＤａ、≧１２０ｋＤａ、≧１３０ｋＤａ等［３２］、及び特にＭＡＬＬＳにより決定されるように１５００ｋＤａまででさえあってよい。例えば、ＭｅｎＡサッカリドは５０〜５００ｋＤａ、例えば６０〜８０ｋＤａの範囲内にあってよく、ＭｅｎＣサッカリドは１００〜２１０ｋＤａの範囲内にあってよく、ＭｅｎＷ１３５サッカリドは６０〜１９０ｋＤａ、例えば１２０〜１４０ｋＤａの範囲内にあってよく、かつ／又はＭｅｎＹサッカリドは６０〜１９０ｋＤａ、例えば１５０〜１６０ｋＤａの範囲内にあってよい。

有用な担体タンパク質（下記を参照）は、ＣＲＭ１９７、ジフテリアトキソイド及び／又は破傷風トキソイドを含む。凍結乾燥成分が複数の髄膜炎菌血清群の結合体を含む場合、各種結合体は異なる担体タンパク質を用いてよく（例えば、ＣＲＭ１９７上で１つの血清群、破傷風トキソイド上で他の血清群）、或いはそれらは同じ担体タンパク質を用いてよい（例えば、２つの血清群のサッカリドがＣＲＭ１９７に別個に結合し、次に結合する）。

安定性の理由のために、凍結乾燥成分は、ラクトース、スクロース及びマンニトール並びにその混合物、例えば、ラクトース／スクロース混合物、スクロース／マンニトール混合物等などの安定化剤を含んでいてよい。したがって、最終ワクチンは、ラクトース及び／又はスクロースを含んでいてよい。スクロース／マンニトール混合物を用いることにより、乾燥工程を加速することができる。凍結乾燥成分は、塩化ナトリウムも含んでいてよい。凍結乾燥材料中の可溶性成分は、再構成後に組成物中に保持される。

凍結乾燥成分は、アルミニウム塩などのアジュバントを含んでいてよく、又は含んでいなくてもよい。

凍結乾燥成分は、Ｈｉｂサッカリドを含まないことが好ましい。

本発明の包装組成物
本発明で用いる湿及び乾燥成分は、使用前には互いに分離した状態に維持しなければならない。したがって、それらは、キットの形で別個に包装する。キットは、様々な形をとることができる。

いくつかの実施形態において、２つの成分を独立した容器内に包装する。他の実施形態において、２つの成分を単一容器の独立したチャンバー内、例えば、多チャンバーシリンジの独立した容器内に包装する。二チャンバーシリンジは、２つの個々の成分を保存中に別個に保持するが、シリンジのプランジャーを作動させるときに混合することができる。

凍結乾燥材料は、通常、密封バイアルに入れて提供される。バイアルは、その内容物の除去及び／又は再構成のための水性材料の導入を可能にしながらも無菌性を維持することができる開口部（例えば、ゴムシール、破壊可能ネック（ｂｒｅａｋａｂｌｅ ｎｅｃｋ）等）を有する。バイアルは、様々な材料、例えば、ガラス、プラスチック等から製造することができる。

水性材料もバイアルに入れて提供することができるが、代替として、例えば、シリンジに入れて提供することができる。この場合にも、容器は、その内容物の除去を可能にしながらも無菌性を維持することができる。シリンジは、それに取り付けられる針付きで又は針付きでない状態で供給することができ、後者の場合には、別個の針を、組立及び使用のためにシリンジとともに包装することができ、シリンジは、一般的に針の取り付けの前の先端部をシールするためのチップキャップを有する。安全な針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージ及び５／８インチ２５ゲージ針が一般的である。シリンジのプランジャーは、吸引中に偶発的に除去されることを防ぐためにストッパーを有していてよい。シリンジは、様々な材料、例えば、ガラス、プラスチック等から製造することができる。

バイアルは、あらかじめ充填されたシリンジをキャップに挿入し、シリンジの内容物をバイアル中に排出することができ（バイアル中の凍結乾燥材料を再構成するために）、またバイアルの内容物をシリンジ中に戻すことができるように構成されたキャップ（例えば、ルアロック）を有することができる。バイアルからシリンジを取り外した後、針を取り付け、組成物を患者に投与することができる。キャップにアクセスすることができる前にシール又はカバーを取り除かなければならないように、キャップをシール又はカバーの内部に配置することができる。

材料を容器内に包装する場合、容器は、通常、材料をそれに加える前に滅菌する。

ガラス容器（例えば、シリンジ又はバイアル）を用いる場合、それをソーダライムガラスでなく、ホウケイ酸ガラスから有用なように製造することができる。

再構成
患者に投与する前に、本発明は、水性成分（Ｈｉｂ結合体を含む）による凍結乾燥抗原性成分（少なくとも１つの髄膜炎菌結合体を含む）の再構成を必要とする。再構成は、様々な段階を含み得る。

成分が多チャンバーシリンジ中に存在する場合、シリンジの作動により水性材料と乾燥材料が混合する。成分が独立した容器中に存在する場合、種々の混合方法を用いることができる。いくつかの実施形態において、バイアル中の水性材料は、抜き取ってシリンジ中に入れることができる（例えば、針により）か、或いは既にシリンジ中に存在していてよい。水性材料は、次にシリンジから乾燥凍結材料を含むバイアル中に移すことができる（例えば、バイアルから水性材料を抜き取るのに以前に用いた針と同じ又は異なっていてよい針により）。凍結乾燥材料は、それにより再構成され、抜き取って（例えば、以前に用いた針と再び同じ又は異なる針により）シリンジ（例えば、以前に用いたシリンジと同じ又は異なる）に入れることができ、そのシリンジから患者に注射することができる（例えば、以前に用いた針と再び同じ又は異なる針により）。

凍結乾燥材料と水性材料が混合され、送達用具（一般的にシリンジ）中に存在しているならば、組成物を患者に投与することができる。再構成は、一般的に患者への投与の直前、例えば、注射前の３０分以内に行う。

再構成の後に、患者に投与するための組成物は、Ｈｉｂ及び髄膜炎菌結合体を含む。Ｈｉｂ結合体は、最初の水性材料に由来し、髄膜炎菌結合体は、最初の凍結乾燥材料に由来する。最初の水性材料は、髄膜炎菌結合体も含んでいてよい。例えば、凍結乾燥材料は、血清群Ａ及びＷ１３５の結合体を含んでいてよく、水性材料は、血清群Ｃの結合体を含む（Ｈｉｂ結合体に加えて）。

本発明の再構成ワクチン中のＨｉｂサッカリドの質量は、通常０．５μｇから５０μｇまでの範囲内、例えば、１〜２０μｇ、１０〜１５μｇ、１２〜１６μｇ等である。量は、約１２．５μｇであってよい。５μｇ未満の質量、例えば、１〜５μｇ、２〜４μｇの範囲内又は約２．５μｇが適する可能性がある［３３］。

再構成ワクチン中の血清群当たりの髄膜炎菌サッカリドの質量は、通常１μｇから２０μｇまで、例えば、血清群当たり２〜１０μｇ、又は約５μｇ若しくは約１０μｇである。２つ以上の血清群の結合体が含まれている場合、それらは実質的に等しい質量で存在していてよい。例えば、各血清群のサッカリドの質量は、互いの＋１０％の範囲内にある。等しい比率に代わるものとして、２倍の質量の血清群Ａサッカリドを用いることができる。したがって、ワクチンは、１０μｇのＭｅｎＡサッカリド並びにそれぞれ５μｇのＭｅｎＣ、Ｗ１３５及びＹサッカリドを含んでいてよい。

いくつかの実施形態において、Ｈｉｂサッカリドの質量は、特定の髄膜炎菌血清群サッカリドの質量と実質的に同じである。いくつかの実施形態において、Ｈｉｂサッカリドの質量は、特定の髄膜炎菌血清群サッカリドの質量より大きい（例えば、少なくとも１．５ｘ）。いくつかの実施形態において、Ｈｉｂサッカリドの質量は、特定の髄膜炎菌血清群サッカリドの質量より小さい（例えば、少なくとも１．５ｘ）。

組成物が複数の髄膜炎菌血清群のサッカリドを含む場合、血清群当たりのサッカリドの平均質量が存在する。各血清群の実質的に等しい質量を用いる場合、平均質量は、個々の各質量と同じであり、等しくない質量を用いる場合、平均値は異なり、ＭｅｎＡＣＷＹ混合物の量が１０：５：５：５μｇの場合、平均質量は血清群当たり６．２５μｇである。いくつかの実施形態において、Ｈｉｂサッカリドの質量は、血清群当たりの髄膜炎菌サッカリドの平均質量と実質的に同じである。いくつかの実施形態において、Ｈｉｂサッカリドの質量は、血清群当たりの髄膜炎菌サッカリドの平均質量より大きい（例えば、少なくとも１．５ｘ）。いくつかの実施形態において、Ｈｉｂサッカリドの質量は、血清群当たりの髄膜炎菌サッカリドの平均質量より小さい（例えば、少なくとも１．５ｘ）［３４］。

ワクチンの処理及び投与の方法
本発明は、混合ワクチンの形でのＨｉｂ及び髄膜炎菌結合体の併用投与を含む。再構成組成物は、ヒト患者に投与するのに適しており、本発明は、本発明の組成物を患者に投与する工程を含む、患者における免疫応答を惹起する方法を提供する。

本発明はまた、医療用の本発明の組成物を提供する。

本発明はまた、患者に投与するための薬剤の製造における、（ｉ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型莢膜サッカリドの結合体を含む水性成分と、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓｅ莢膜サッカリドの結合体を含む凍結乾燥成分との使用を提供する。

本発明はまた、免疫感作で使用するための、（ｉ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型莢膜サッカリドの結合体を含む水性成分と、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓｅ莢膜サッカリドの結合体を含む凍結乾燥成分との組合せを提供する。

本発明の再構成組成物は、好ましくは、髄膜炎菌髄膜炎及びＨｉｂ菌髄膜炎を含む細菌性髄膜炎の軽減又は予防用のワクチンである。

本発明の組成物の投与を受ける患者は、２歳未満、例えば、０〜１２カ月齢であってよい。患者の１つの特定の群は、１〜３カ月齢であり、髄膜炎菌結合型ワクチンの投与を以前に受けなかった。

十分な有効性を得るために、小児における一般的な一次免疫感作スケジュールは、複数回の投与を含んでいてよい。例えば、投与は、０、２及び４カ月時（時間０は初回投与）、０、１及び２カ月時、０及び２カ月時、０、２及び８カ月時等であってよい。初回投与（時間０）は、約２カ月齢時、又は約３カ月齢時に時々（例えば、０−２−８カ月スケジュールで）投与してよい。

組成物は、例えば、２歳の小児において追加抗原刺激投与としても用いることもできる。

本発明の組成物は、例えば、腕、脚又は臀部への筋肉内注射により投与することができる。

本発明の組成物がアルミニウムを用いたアジュバントを含む場合、保存中に成分の沈降が起こる可能性がある。したがって、水性組成物は、患者に投与する前に、再構成の前及び後に振とうすべきである。

結合体化
本発明は、莢膜サッカリドが担体タンパク質に結合したＨｉｂ及び髄膜炎菌結合体を使用する。共有結合体化のための有用な担体タンパク質は、ジフテリアトキソイド又は破傷風トキソイドなどの細菌トキシン又はトキソイド、或いはＣＲＭ１９７ジフテリアトキシン突然変異体などのその誘導体である［３５〜３７］。他の適切な担体タンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質［３８］、合成ペプチド［３９、４０］、熱ショックタンパク質［４１、４２］、百日咳タンパク質［４３、４４］、サイトカイン［４５］、リンホカイン［４５］、ホルモン［４５］、成長因子［４５］、Ｎ１９［４７］などの様々な病原体由来抗原からの複数のヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［４６］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅからのタンパク質Ｄ［４８〜５０］、ニューモリシン［５１］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［５２］、鉄取込みタンパク質［５３］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅからのトキシンＡ又はＢ［５４］などがある。

ジフテリアトキソイド（Ｄｔ）、破傷風トキソイド（Ｔｔ）及びＣＲＭ１９７が小児ワクチンに現在用いられている主な担体であり、例えば、ＧＳＫからのＨｉｂ結合体はＴｔを担体として用い、ＨＩＢＴＩＴＥＲ（商標）製品はＣＲＭ１９７を用い、ＰＲＥＶＥＮＡＲ（商標）中の肺炎球菌結合体はＣＲＭ１９７を用い、ＭＥＮＪＵＧＡＴＥ（商標）及びＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣ（商標）製品はＣＲＭ１９７を用い、ＮＥＩＳＶＡＣ−Ｃ（商標）はＴｔを用いる。

１：５（すなわち、タンパク質過剰）から５：１（すなわち、サッカリド過剰）までのサッカリド：タンパク質比（重量／重量）、例えば、１：２から５：１までの比及び１：１．２５から１：２．５までの比を有する結合体を用いることができる。参考文献５５に記載されているように、混合物中の異なる髄膜炎菌血清群結合体は、異なるサッカリド：タンパク質比を有することができ、例えば、１つは１：２から１：５までの比を有するのに対して、他は５：１から１：１．９９までの比を有していてよい。

結合体は、遊離担体タンパク質とともに用いることができる［５６］。所定の担体タンパク質が本発明の組成物中に遊離及び結合形の両方の形で存在する場合、非結合形は、全体として組成物中の担体タンパク質の総量の５％以下であってよく、より一般には２重量％未満で存在する。

必要な場合には適切なリンカーを用いた適切な結合体化反応を用いることができる。

サッカリドは、結合体化の前に一般的に活性化又は官能基化する。活性化は、例えば、ＣＤＡＰなどのシアニル化試薬（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸［５７、５８等］）を必要とする場合がある。他の適切な技術は、活性エステル、カルボジイミド、ヒドラジド、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを用いるものである（参考文献１１の導入も参照）。

リンカー基を介しての結合は、既知の手順、例えば、参考文献５９及び６０に記載されている手順を用いて行わせることができる。結合の１つの種類は、多糖の還元的アミノ化、得られたアミノ基をアジピン酸リンカー基の１つの末端とカップリングし、次にタンパク質をアジピン酸リンカー基の他の末端とカップリングする工程を含む［６１、６２］。他のリンカーとしては、β−プロピオンアミド［６３］、ニトロフェニルエチルアミン［６４］、ハロゲン化ハロアシル［６５］、グリコシド結合［６６］、６−アミノカプロン酸［６７］、ＡＤＨ［６８］、Ｃ_４〜Ｃ_１２部分［６９］などがある。カルボジイミド縮合も用いることができる［７０］。リンカーを用いることに代わるものとして、直接結合を用いることができる。タンパク質に対する直接結合は、例えば、参考文献７１及び７２に記載されているような、多糖の酸化の後のタンパク質を用いた還元的アミノ化を含んでいてよい。

アミノ基のサッカリドへの導入（例えば、末端＝Ｏ基を−ＮＨ_２で置換することによる）の後のアジピン酸ジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル）を用いた誘導体化及び担体タンパク質との反応を含む方法を用いることができる。他の有用な反応において、サッカリドをシアニル化試薬で誘導体化した後、タンパク質にカップリングさせ（直接、或いはチオール又はヒドラジド求核基の担体への導入後）、リンカーを用いる必要がない。適切なシアニル化試薬は、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムテトラフルオロホウ酸（「ＣＤＡＰ」）、シアン酸ｐ−ニトロフェニル及びテトラフルオロホウ酸Ｎ−シアノトリエチルアンモニウム（「ＣＴＥＡ」）などがある。

参考文献７３に記載されているように、混合物は、直接サッカリド／タンパク質結合を有する１つの結合体及びリンカーを介しての結合を有する他の結合体を含んでいてよい。この配合は、特に異なる髄膜炎菌血清群のサッカリド結合を用いる場合に適用され、例えば、ＭｅｎＡ及びＭｅｎＣサッカリドはリンカーを介して結合させることができるのに対して、ＭｅｎＷ１３５及びＭｅｎＹサッカリドは担体タンパク質に直接結合させることができる。

結合体化の後に、遊離及び結合サッカリドを分離することができる。この分離について、疎水性クロマトグラフィー、接線限外ろ過、ダイアフィルトレーション等を含む多くの適切な方法がある（参考文献７４及び７５等も参照）。ワクチンが遊離及び結合形の両方の形の所定のサッカリドを含む場合、非結合形は全体として組成物中の当サッカリドの総量の２０重量％以下であることが一般的である（例えば、≦１５％、≦１０％、≦５％、≦２％、≦１％）。

各結合体の担体（結合及び非結合）の量は、１００μｇ／ｍｌ以下、例えば、＜３０μｇ／ｍｌの各結合体の担体タンパク質であってよい。いくつかの組成物は、５００μｇ／ｍｌ未満、例えば、＜４００μｇ／ｍｌ、＜３００μｇ／ｍｌ、＜２００μｇ／ｍｌ、＜１００μｇ／ｍｌ、＜５０μｇ／ｍｌ等の担体の総濃度を含む。

本発明の組成物の特性
上述の抗原性成分に加えて、本発明の組成物（混合の前及び後）は、一般的に非抗原性成分を含む。非抗原性成分は、下でより詳細に述べるように、担体、アジュバント、賦形剤、緩衝剤等を含んでいてよい。

本発明の組成物は、通常、１つ又は複数の薬剤担体及び／又は賦形剤を含む。滅菌済みの発熱物質不含有リン酸緩衝生理食塩液は、一般的な担体である。薬剤学的に許容できる賦形剤の十分な考察は、参考文献７６で得られる。

張性を調節するために、ナトリウム塩などの生理的塩を含めることが有用である。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は、１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在していてよい、１つのそのような塩である。

水性組成物（凍結乾燥材料の再構成の前及び／又は後）は、一般的に２００ｍＯｓｍ／ｋｇから４００ｍＯｓｍ／ｋｇまで、例えば、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、又は２９０〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内の重量オスモル濃度を有する。

本発明の組成物は、１つ又は複数の緩衝剤を含んでいてよい。一般的な緩衝剤としては、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤又はクエン酸緩衝剤などがある。緩衝剤は、一般的に５〜２０ｍＭの範囲で含める。そのような緩衝剤は、水性及び／又は凍結乾燥組成物に含めることができる。

水性組成物のｐＨは、一般的に５．０〜７．５、より一般的には最適な安定性のために５．０〜６．０、又は６．０〜７．０である。

本発明の組成物は、好ましくは無菌性である。

本発明の組成物は、好ましくは非発熱性であり、例えば、１回投与当たり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的尺度）、好ましくは１回投与当たり＜０．１ＥＵを含む。

本発明の組成物は、グルテンを含まなくてよい。

本発明の一部のワクチンは、アジュバント化されていない。本発明の他のワクチンは、アジュバントを含む。非アジュバント化ワクチンは、非アジュバント化成分を混合することによって調製することができる。アジュバント化ワクチンは、複数のアジュバント添加成分を混合することによって、アジュバント化成分と非アジュバント化成分を混合することによって、又は非アジュバント化成分とアジュバントを混合することによって調製することができる。

抗原が吸着している場合、組成物は、濁った外観を有する懸濁液である可能性がある。この外観は、微生物汚染を容易に見ることができないことを意味し、したがって、ワクチンは保存剤を含んでいてよい。ワクチンを多用量容器に包装する場合に、これは特に重要である。含めるのに有用な保存剤は、２−フェノキシエタノール及びチメロサールである。しかし、可能な場合には水銀保存剤（例えば、チメロサール）を用いないことが推奨される。本発明の化合物は約２５ｎｇ／ｍｌ未満の水銀を含むことが好ましい。そのような保存剤は、水性及び／又は凍結乾燥成分に含まれていてよい。

Ａｌ^３＋により表した組成物中のあらゆるアルミニウム塩の濃度は、好ましくは５ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌ、＜０．８５ｍｇ／ｍｌ等である。

本発明の組成物は、患者に０．５ｍｌの用量で投与することができる。０．５ｍｌの用量への言及は、通常の変動、例えば、０．５ｍｌ±０．０５ｍｌを含むと理解される。

アジュバント
本発明の組成物は、アジュバントを含んでいてよく、このアジュバントは、１つ又は複数のアルミニウム塩、特に、リン酸アルミニウムアジュバント及び／又は水酸化アルミニウムアジュバントを含んでいてよい。本発明の組成物を調製するのに用いる抗原性成分は、用いる前にアルミニウムアジュバントを含んでいてよい。すなわち、それらは、アジュバントに「前混合」又は「前吸着」させる。現在用いられているアルミニウムアジュバントは、「水酸化アルミニウム」又は「リン酸アルミニウム」アジュバントと一般的に呼ばれている。しかし、いずれも存在する実際の化合物の正確な記述ではないので、これらは便宜上の名称である（例えば、参考文献７７の９章を参照）。本発明は、一般的にアジュバントとして用いられている「水酸化物」又は「リン酸」塩のいずれかを用いることができる。

「水酸化アルミニウム」として知られているアジュバントは、通常少なくとも部分的に結晶性である、一般的にアルミニウムオキシ水酸化物塩である。式ＡｌＯ（ＯＨ）により表すことができる、オキシ水酸化物アルミニウムは、赤外（ＩＲ）分光法により、特に１０７０ｃｍ^−１における吸着帯と３０９０〜３１００ｃｍ^−１における強いショルダーによって水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）_３）などの他のアルミニウム化合物と区別することができる（参考文献７７の９章）。

「リン酸アルミニウム」として知られているアジュバントは、しばしば少量の硫酸塩も含む、一般的にヒドロキシリン酸アルミニウムである。それらは沈殿により得ることができ、沈殿中の反応条件及び濃度が塩におけるヒドロキシルによるリン酸の置換の程度に影響を及ぼす可能性がある。ヒドロキシリン酸塩は、一般的に０．３〜０．９９のＰＯ_４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩は、ヒドロキシル基の存在によって厳密なＡｌＰＯ_４と区別することができる。例えば、３１６４ｍ^−１におけるＩＲスペクトル帯（例えば、２００℃に加熱したとき）は、構造ヒドロキシルの存在を示している（参考文献７７の９章）。

リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ_４／Ａｌ^３＋モル比は、一般的に０．３〜１．２、好ましくは０．８〜１．２、より好ましくは０．９５±０．１である。リン酸アルミニウムは、特にヒドロキシリン酸塩については一般的に非晶質である。一般的なアジュバントは、０．６ｍｇ Ａｌ^３＋／ｍｌで含まれる、０．８４〜０．９２のＰＯ_４／Ａｌモル比を有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムである。リン酸アルミニウムは、一般的に微粒子である。粒子の一般的な直径は、抗原の吸着後に０．５〜２０μｍの範囲内にある（例えば、約５〜１０μｍ）。

リン酸アルミニウムのＰＺＣは、ヒドロキシルによるリン酸の置換の程度と逆の関連性があり、この置換の程度は、沈殿により塩を調製するのに用いる反応条件及び反応物の濃度によって異なる可能性がある。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離のリン酸イオンの濃度を変化させること（より多くのリン酸＝より酸性のＰＺＣ）により、又はヒスチジン緩衝剤などの緩衝剤を加えること（ＰＺＣをより塩基性にする）により変化する。本発明により用いるリン酸アルミニウムは、一般的に４．０〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５、例えば、約５．７のＰＺＣを有する。

本発明の組成物を調製するのに用いるリン酸アルミニウム溶液は、緩衝剤（例えば、リン酸又はヒスチジン又はトリス緩衝剤）を含んでいてよいが、これは必ずしも必要ではない。リン酸アルミニウム溶液は、無菌性で、発熱物質不含であることが好ましい。リン酸アルミニウム溶液は、例えば、１．０〜２０ｍＭ、好ましくは５〜１５ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する遊離の水性リン酸イオンを含んでいてよい。リン酸アルミニウム溶液は、塩化ナトリウムも含んでいてよい。塩化ナトリウムの濃度は、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲内にあり（例えば、０．５〜５０ｍｇ／ｍｌ、１〜２０ｍｇ／ｍｌ、２〜１０ｍｇ／ｍｌ）、より好ましくは約３±１ｍｇ／ｍｌである。ＮａＣｌの存在により、抗原の吸着の前のｐＨの正しい測定が容易になる。

含めることができるさらなる抗原
結合Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ及びＨｉｂサッカリドを含むことに加えて、組成物は、１つ又は複数のさらなる抗原を含んでいてよい。例えば、それらは、他の病原体、特に細菌及び／又はウイルスからの抗原を含んでいてよい。適切なさらなる抗原は、以下から選択することができる。

・ジフテリアトキソイド（「Ｄ」）
・破傷風トキソイド（「Ｔ」）
・一般的に無細胞性（「ａＰ」）である、百日咳抗原（「Ｐ」）
・Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）
・不活性化ポリオウイルスワクチン（ＩＰＶ）
・Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原
・Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの筴膜サッカリド
これらの抗原は、本発明の水性成分に通常含まれる。

ジフテリアトキソイド
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅがジフテリアを引き起こす。ジフテリアトキシンは、処理すること（例えば、ホルマリン又はホルムアルデヒドを用いて）により、注射後の特異的抗トキシン抗体を誘導する能力を保持すると同時に毒性を除くことができる。これらのジフテリアトキソイドは、ジフテリアワクチンに用いられており、参考文献１の１３章により詳細に開示されている。好ましいジフテリアトキソイドは、ホルムアルデヒド処理により調製されるものである。ジフテリアトキソイドは、ウシ抽出物を添加されていてよい増殖培地（例えば、Ｆｅｎｔｏｎ培地又はＬｉｎｇｇｏｕｄ ＆ Ｆｅｎｔｏｎ培地）中でＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅを増殖させた後、ホルムアルデヒド処理し、限外ろ過し、沈殿させることにより得ることができる。トキソイド化物質は、次に滅菌ろ過及び／又は透析を含む方法により処理することができる。

ジフテリアトキソイドの量は、国際単位（ＩＵ）で表すことができる。例えば、ＮＩＢＳＣは、アンプル当たり１６０ＩＵを含む「ジフテリアトキソイド吸着第３国際標準１９９９（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｔｏｘｏｉｄ Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ １９９９）」［７８、７９］を供給している。ＩＵ系に代わるものとして、「Ｌｆ」単位（「凝集単位」又は「ライム凝集用量」（ｌｉｍｅｓ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｎｇ ｄｏｓｅ））は、１国際単位の抗トキシンと混合するとき、最適凝集混合物を生じさせるトキソイドの量と定義される［８０］。例えば、ＮＩＢＳＣは、アンプル当たり３００ＬＦを含む「ジフテリアトキソイド、プレイン（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｔｏｘｏｉｄ， Ｐｌａｉｎ）」［８１］を供給しており、またアンプル当たり９００ＬＦを含む「凝集試験用のジフテリアトキソイド用の第１国際参照試薬（Ｔｈｅ １ｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｆｏｒ Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｔｏｘｏｉｄ Ｆｏｒ Ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ）」［８２］を供給している。

組成物は、一般的に２０〜８０Ｌｆ、一般的に約５０Ｌｆのジフテリアトキソイドを含む。

ＩＵ測定により、組成物は一般的に少なくとも３０ＩＵ／用量を含む。

ジフテリアトキソイドは、実用的には水酸化アルミニウムアジュバント上に吸着されている。

破傷風トキソイド
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉが破傷風を引き起こす。破傷風トキシンを処理して、保護トキソイドを得ることができる。該トキソイドは、破傷風ワクチンに用いられており、参考文献１の２７章により詳細に開示されている。好ましい破傷風トキソイドは、ホルムアルデヒド処理により調製されるものである。破傷風トキソイドは、増殖培地（例えば、ウシカゼイン由来のＬａｔｈａｍ培地）中でＣ．ｔｅｔａｎｉを増殖させた後、ホルムアルデヒド処理し、限外ろ過し、沈殿させることにより得ることができる。該物質は、次に滅菌ろ過及び／又は透析を含む方法により処理することができる。

破傷風トキソイドの量は、国際単位（ＩＵ）で表すことができる。例えば、ＮＩＢＳＣは、アンプル当たり４６９ＩＵを含む「破傷風トキソイド吸着第３国際標準２０００（Ｔｅｔａｎｕｓ Ｔｏｘｏｉｄ Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ２０００）」［８３、８４］を供給している。ＩＵ系に代わるものとして、「Ｌｆ」単位（「凝集単位」又は「ライム凝集用量」（ｌｉｍｅｓ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｎｇ ｄｏｓｅ））は、１国際単位の抗トキシンと混合するとき、最適凝集混合物を生じさせるトキソイドの量と定義される［８０］。例えば、ＮＩＢＳＣは、アンプル当たり１０００ＬＦを含む「凝集試験用の破傷風トキソイド用の第１国際参照試薬（Ｔｈｅ １ｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｆｏｒ Ｔｅｔａｎｕｓ Ｔｏｘｏｉｄ Ｆｏｒ Ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ）」［８５］を供給している。

組成物は、一般的に５〜５０Ｌｆ、一般的に約２０Ｌｆのジフテリアトキソイドを含む。

ＩＵ測定により、組成物は一般的に少なくとも４０ＩＵ／用量を含む。

破傷風トキソイドは、水酸化アルミニウムアジュバント上に吸着させることができるが、これは必要でない（例えば、０〜１０％の総破傷風トキソイドの吸着を用いることができる）。

百日咳抗原
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓが百日咳を引き起こす。ワクチン中の百日咳抗原は、細胞性（不活性化Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ細胞の形の全細胞）又は無細胞性である。細胞性百日咳抗原の調製は、十分に文書化されており（参考文献１の２１章を参照）、例えば、それはＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの第Ｉ期培養の熱不活性化により得ることができる。しかし、代替として、無細胞性抗原を使用することができる。

無細胞性抗原を用いる場合、次の抗原の１つ、２つ又は（好ましくは）３つを用いることが好ましい：（１）解毒百日咳トキシン（百日咳トキソイド又は「ＰＴ」）、（２）繊維状赤血球凝集素（「ＦＨＡ」）、（３）パータクチン（「６９キロダルトン外膜タンパク質」としても知られている）。これらの３つの抗原は、好ましくは修正Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ液体培地中で増殖させたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養から分離することによって調製する。ＰＴ及びＦＨＡは発酵ブロスから分離することができる（例えば、ヒドロキシアパタイトゲル上への吸着により）のに対して、パータクチンは熱処理及び凝集（例えば、塩化バリウムを用いた）により細胞から抽出することができる。抗原は、連続的なクロマトグラフ及び／又は沈殿段階で精製することができる。ＰＴ及びＦＨＡは、例えば、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製することができる。パータクチンは、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製することができる。ＦＨＡ及びパータクチンは、本発明による使用の前にホルムアルデヒドにより処理することができる。ＰＴは、ホルムアルデヒド及び／又はグルタルアルデヒドによる処理により解毒することができる。この化学的解毒法に代わるものとして、ＰＴは酵素活性が突然変異によって低下した突然変異ＰＴであってよい［８６］が、化学的処理による解毒がより一般的である。

無細胞性百日咳抗原は、１つ又は複数のアルミニウム塩アジュバントに吸着させることができる。代わるものとして、それらは、非吸着状態で加えることができる。パータクチンを加える場合、それが既に水酸化アルミニウムアジュバント上に吸着していることが好ましい。ＰＴ及びＦＨＡは、水酸化アルミニウムアジュバント又はリン酸アルミニウムに吸着させることができる。ＰＴ、ＦＨＡ及びパータクチンのすべてが水酸化アルミニウムに吸着していることが有用である。

組成物は、一般的に１〜５０μｇ／用量のＰＴ、１〜５０μｇ／用量のＦＨＡ及び１〜５０μｇのパータクチンを含む。

ＰＴ、ＦＨＡ及びパータクチンに加えて、無細胞性百日咳ワクチンにフィムブリエ（例えば、凝集原２及び３）を含めることが可能である。

Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ウイルス性肝炎を引き起こす既知の作用物質の１つである。ＨＢＶビリオンは、外部タンパク質包膜又はキャプシドによって囲まれている内部コアからなっており、ウイルスコアは、ウイルスＤＮＡゲノムを含む。キャプシドの主成分は、一般的に分子量が約２４ｋＤａの２２６アミノ酸ポリペプチドである、ＨＢＶ表面抗原、又はより一般的に、「ＨＢｓＡｇ」として知られているタンパク質である。すべての既存のＢ型肝炎ワクチンは、ＨＢｓＡｇを含み、この抗原を正常ワクチン接種者に投与したとき、それはＨＢＶ感染を防御する抗ＨＢｓＡｇ抗体の産生を刺激する。

ワクチン製造業者は、ＨＢｓＡｇを２つの方法で製造している。第１の方法は、ＨＢＶ感染中に大量のＨＢｓＡｇが肝臓で合成され、血流中に放出されているので、慢性Ｂ型肝炎キャリヤーの血漿からの微粒子状の抗原を精製することを含む。第２の方法は、組換えＤＮＡ法によりタンパク質を発現させることを含む。本発明の方法で用いるＨＢｓＡｇは、酵母細胞において組換えにより発現させることが好ましい。適切な酵母は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）又はＨａｎｅｎｓｕｌａ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａなど）宿主などがある。

ＨＢｓＡｇは、通常非グリコシル化型である。天然ＨＢｓＡｇ（すなわち、血漿精製製品中に存在する）と異なり、酵母発現ＨＢｓＡｇは一般的に非グリコシル化型であり、これが本発明で用いるＨＢｓＡｇの最も好ましい形態である。その理由は、それが高度に免疫原性であり、血液製剤汚染のリスクなしに調製することができるためである。

ＨＢｓＡｇは、一般的に、リン脂質を含む脂質マトリックスを含む、実質的に球形粒子（平均直径が約２０ｎｍ）の形態である。酵母発現ＨＢｓＡｇ粒子は、天然ＨＢＶビリオンに認められないホスファチジルイノシトールを含む可能性がある。該粒子は、免疫系を刺激するために無毒性量のＬＰＳも含んでいてよい［８７］。ＨＢｓＡｇは、リン脂質、ホスファチジルイノシトール及びポリソルベート２０を含む脂質マトリックスを含む粒子の形態であってよい。

すべての既知のＨＢＶサブタイプは、共通の決定因子「ａ」を含む。他の決定因子及び下位決定因子と組み合わせることにより、ａｙｗ１、ａｙｗ２、ａｙｗ３、ａｙｗ４、ａｙｒ、ａｄｗ２、ａｄｗ４、ａｄｒｑ−及びａｄｒｑ＋の９つのサブタイプが特定された。これらのサブタイプのほかに、免疫感作した個体で検出されたＨＢＶ突然変異体（「エスケープ突然変異体」）などの他の変異体が発生した。本発明で用いる通常のＨＢＶサブタイプは、サブタイプａｄｗ２である。

「Ｓ」配列に加えて、表面抗原は、前Ｓ１及び／又は前Ｓ２配列のすべて又は一部などの前Ｓ配列のすべて又は一部を含んでいてよい。

ＨＢｓＡｇの量は、一般的にマイクログラム単位で表し、ワクチン用量当たりのＨＢｓＡｇの一般的な量は、５〜５μｇ、例えば、１０μｇ／用量である。

ＨＢｓＡｇは、最終ワクチン中（よく知られているＥＮＧＥＲＩＸ−Ｂ（商標）製品中のような）の水酸化アルミニウムアジュバントに吸着させてよく、又は非吸着のままであってよく、一般的にはリン酸アルミニウムアジュバントに吸着させる［８８］。

不活性化ポリオウイルスワクチン
ポリオウイルスは、灰白髄炎を引き起こす。本発明は、経口ポリオウイルスワクチンを使用せずに、参考文献１の２４章により詳細に開示されているようなＩＰＶを使用することができる。

ポリオウイルスは、細胞培養中で増殖させることができ、好ましい培養は、サル腎臓由来のベロ細胞系を使用するものである。ベロ細胞は、ミクロ担体上で好都合に培養することができる。増殖後、ビリオンを限外ろ過、ダイアフィルトレーション及びクロマトグラフィーなどの技術を用いて精製することができる。患者に投与する前に、ポリオウイルスを不活性化しなければならないが、これはホルムアルデヒドによる処理により達成することができる。

灰白髄炎は、３種類のポリオウイルスの１つにより引き起こされる可能性がある。３つの種類は、類似しており、同じ症状を引き起こすが、抗原性が非常に異なり、１つの種類による感染は他の種類による感染を防御しない。したがって、本発明において１型ポリオウイルス（例えば、Ｍａｈｏｎｅｙ株）、２型ポリオウイルス（例えば、ＭＥＦ−１株）及び３型ポリオウイルス（例えば、Ｓａｕｋｅｔｔ株）の３つのポリオウイルス抗原を用いることが好ましい。ウイルスは、好ましくは個別に増殖させ、精製し、不活性化し、次いで、混合して、本発明で使用するバルク３価混合物を得る。

ＩＰＶの量は、一般的に「ＤＵ」単位（「Ｄ抗原単位」［８９］）で表される。用量当たりウイルスの種類当たり１〜１００ＤＵ、例えば、約８０ＤＵの１型ポリオウイルス、約１６ＤＵの２型ポリオウイルス及び約６４ＤＵの３型ポリオウイルスを含めることが通常である。

ポリオウイルス抗原は、本発明の組成物を作製するのに用いる前にアルミニウム塩アジュバントに吸着させないことが好ましいが、保存中にワクチン組成物中のアルミニウムアジュバントに吸着した状態になる可能性がある。

Ａ型肝炎ウイルス抗原
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）は、ウイルス性肝炎を引き起こす既知の作用物質の１つである。ＨＡＶワクチンは、参考文献１の１５章に開示されている。有用なＨＡＶ成分は、不活性化ウイルスに基づいており、不活性化はホルマリン処理により達成することができる。ウイルスは、ＭＲＣ−５細胞などのヒト胚肺二倍体線維芽細胞上で増殖させることができる。ＣＲ３２６Ｆも用いることができるが、有用なＨＡＶ株は、ＨＭ１７５である。細胞は、ウイルスの増殖を可能にする条件下で増殖させることができる。細胞を溶解し、得られる懸濁液を限外ろ過及びゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより精製することができる。

ＥＵ（Ｅｌｉｓａ単位）で測定される、ＨＡＶ抗原の量は、一般的に少なくとも約５００ＥＵ／ｍｌである。

肺炎球菌サッカリド
結合肺炎球菌抗原は、担体タンパク質に結合したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの莢膜サッカリド抗原を含む［例えば、参考文献９０〜９２を参照］。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの複数の血清型のサッカリドを含めることが通常であり、５〜１１種の異なる血清型の多糖を含む結合ワクチン［９３］と同様に、２３種の異なる血清型の多糖の混合物が広く用いられている。例えば、ＰＲＥＶＮＡＲ（商標）［９４］は、各サッカリドを還元的アミノ化によりＣＲＭ１９７に個別に結合させ、０．５ｍｌの用量当たり２μｇの各サッカリド（４μｇの血清型６Ｂ）を含む、７つの血清型の抗原（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ及び２３Ｆ）を含む。

本発明の組成物は、少なくとも血清型６Ｂ、１４、１９Ｆ及び２３Ｆのサッカリド抗原を含んでいてよい。さらなる血清型は、１、３、４、５、７Ｆ、９Ｖ及び１８Ｃから選択することができる。肺炎球菌の血清型の７価（ＰＲＥＶＮＡＲ（商標）におけるような）、９価（例えば、ＰＲＥＶＮＡＲの７血清型＋１及び５）、１０価（例えば、ＰＲＥＶＮＡＲの７血清型＋１、５及び７Ｆ）及び１１価（例えば、ＰＲＥＶＮＡＲの７血清型＋１、３、５及び７Ｆ）保護範囲が特に有用である。

通常、組成物は、存在する各血清型の用量当たり１μｇ〜２０μｇ（サッカリドとして測定される）を含む。

水中油型エマルジョンアジュバントを含む凍結乾燥結合体
髄膜炎菌結合体を含む改善されたワクチン用製剤を提供することが本発明のさらなる態様の目的であり、水中油型エマルジョンを用いて、複数の髄膜炎菌血清群の莢膜サッカリドを含む凍結乾燥髄膜炎菌成分を再構成する。

したがって、本発明は、（ｉ）水中油型エマルジョン成分と、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの２つ以上の血清群に由来する莢膜サッカリドの結合体を含む凍結乾燥成分とを含むキットを提供する。患者に投与するために、エマルジョン及び凍結乾燥成分を混合して、注射に適する液体ワクチンを得る。

本発明はまた、（ｉ）水中油型エマルジョン成分と、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの２つ以上の血清群に由来する莢膜サッカリドの結合体を含む凍結乾燥成分とを合わせる工程を含む、ワクチンを調製する方法を提供する。

本発明はまた、水中油型エマルジョン成分とＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの２つ以上の血清群に由来する莢膜サッカリドの凍結乾燥結合体とを合わせることによって調製される、水中油型エマルジョン中にＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜サッカリドの結合体を含むワクチンを提供する。該ワクチンは、凍結乾燥安定化剤を含んでいてよい（下記を参照）。

本発明はまた、患者に投与するための薬剤の製造における、（ｉ）水中油型エマルジョンと、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの２つ以上の血清群に由来する莢膜サッカリドの結合体を含む凍結乾燥成分との使用を提供する。

本発明はまた、免疫感作で使用するための、（ｉ）水中油型エマルジョンと、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの２つ以上の血清群に由来する莢膜サッカリドの結合体とを含む凍結乾燥成分の組合せを提供する。

本発明のこの態様のための凍結乾燥成分の特性は、２つ以上の血清群の複合体を常に含むことを除いて、上述の通りである。さらに、水中油型エマルジョンを用いる場合、凍結乾燥成分は一般的にアジュバントを含まない。

包装（例えば、キット形、独立容器、多チャンバーシリンジ、バイアル等）、再構成、投与（例えば、患者、スケジュール、注射等）、結合体化（例えば、担体タンパク質、サッカリド：タンパク質比、結合等）及び最終組成物（例えば、担体、重量オスモル濃度、緩衝剤、ｐＨ等）の特性も上述の通りである。エマルジョンは、水性Ｈｉｂ成分について上述したのと同じ方法に必要な変更を加えて用いることができる。

本発明のこの態様による組成物は、上述のようなさらなる非髄膜炎抗原、例えばＤ、Ｔ、Ｐ、ＨＢＶ、ＩＰＶ、ＨＡＶ及び／又は肺炎球菌抗原を含んでいてよい。上述のように、これらは、水性成分中、例えば、エマルジョンアジュバント中に存在していてよい。

本発明のこの態様のワクチンは、髄膜炎菌結合体及びエマルジョンに加えてＨｉｂ結合体を含むことが有利であり得る。Ｈｉｂ結合体は、最初は、例えば、凍結乾燥髄膜炎菌結合体とともに凍結乾燥形であるか、又は水性形であってよい。いくつかの実施形態において、Ｈｉｂ結合体は、エマルジョンとの混合物中に存在し、Ｈｉｂ／エマルジョン混合物を用いて凍結乾燥髄膜炎菌結合体を再構成してよい。

本発明は、水中油型エマルジョン中に２つ以上（例えば、２、３又は４つ）のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群の莢膜サッカリド及びＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型莢膜サッカリドの結合体を含むワクチンを提供する。本発明のこの態様において有用なＨｉｂ結合体の特性は、例えば、（ｉ）結合体化、（ｉｉ）サッカリド部分の長さ、（ｉｉｉ）担体タンパク質及び（ｉｖ）髄膜炎菌結合体に対する用量比に関して上でより詳細に開示している。

本発明で用いることができる特定の水中油型エマルジョンは、以下を含むが、それらに限定されない。

・スクアレン、トゥイーン８０及びスパン８５のサブミクロンエマルジョン。エマルジョンの容積組成は、スクアレン約５％、ポリソルベート８０約０．５％及びスパン８５約０．５％（又はこれらの量の２倍、２×濃度）であってよい。重量に換算すると、これらの量はスクアレンが４．３％、ポリソルベート８０が０．５％、スパン８５が０．４８％となる。このアジュバントは、「ＭＦ５９」として知られている。ＭＦ５９エマルジョンは、クエン酸イオン、例えば、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液を含むことが有利である。

・スクアレン、トコフェロール及びトゥイーン８０のエマルジョン。エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水を含んでいてよい。エマルジョンは、スパン８５（例えば、１％）及び／又はレシチンも含んでいてよい。これらのエマルジョンは、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロール及び０．３〜３％のトゥイーン８０を有していてよく、より安定なエマルジョンを与える比であるので、スクアレン：トコフェロールの重量比は好ましくは≦１（例えば、０．９０）である。スクアレン及びトゥイーン８０は、約５：２の容積比又は約１１：５の重量比で存在していてよい。１つのそのようなエマルジョンは、トゥイーン８０を２％溶液が得られるようにＰＢＳに溶解し、次いで、この溶液の９０ｍｌを（５ｇのＤＬ−α−トコフェロール及び５ｍｌのスクアレン）の混合物と混合し、次いで、混合物を微小流動化することにより作製することができる。得られるエマルジョンは、例えば、１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径を有するサブミクロン油小滴を有していてよい。エマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬ及び／又はサポニン（例えば、ＱＳ２１）も含んでいてよい。

・スクアレン、トコフェロール及びトリトン界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００）のエマルジョン。エマルジョンは、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（「３ｄ−ＭＰＬ」）も含んでいてよい。エマルジョンは、リン酸緩衝液を含んでいてよい。

・スクアレン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８ブロックコポリマー、卵ホスファチジルコリン、グリセロール及びトロフェロールを含むエマルジョン［９５］。

・スクアレン、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、トリトン界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００）及びトコフェロール（例えば、コハク酸α−トコフェロール）を含むエマルジョン。エマルジョンは、約７５：１１：１０の質量比でこれらの３つの成分を含んでいてよく（例えば、７５０μｇ／ｍｌポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌトリトンＸ−１００及び１００μｇ／ｍｌコハク酸α−トコフェロール）、これらの濃度は、抗原からのこれらの成分の寄与を含むべきである。エマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬも含んでいてもよい。エマルジョンは、ＱＳ２１などのサポニンも含んでいてもよい。水相は、リン酸緩衝液を含んでいてよい。

・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）及び疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、モノオレイン酸ソルビタン又は「スパン８０」などのソルビタンエステル又はマンニドエステル）を含むエマルジョン。エマルジョンは、好ましくは熱可逆性であり、かつ／又は２００ｎｍ未満のサイズを有する少なくとも９０％の油小滴を有する［９６］。エマルジョンは、アルジトール、凍結保護剤（例えば、ドデシルマルトシド及び／又はスクロースなどの糖）及び／又はアルキルポリグリコシドのうち１つ又は複数も含んでいてもよい。エマルジョンは、化学構造が糖環を含まないようなＴＬＲ４アゴニストも含んでいてもよい［９７］。そのようなエマルジョンは凍結乾燥することができる。

・スクアレン、ポロキサマー１０５及びＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン［９８］。アジュバント化ワクチン中のこれらの成分の最終濃度（重量）は、５％スクアレン、４％ポロキサマー１０５（プルロンポリオール）及び２％Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ８５（ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル／カプリントリグリセリド）である。

・スクアレン、ポリソルベート８０及びポロキサマー４０１（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１）のエマルジョン。エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４を用いて製剤化することができる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドの有用な送達媒体であり、「ＳＡＦ−１」アジュバント［９９］（０．０５〜１％Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％スクアレン、２．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１及び０．２％ポリソルベート８０）中でトレオニル−ＭＤＰとともに用いられている。このエマルジョンは、「ＡＦ」アジュバント［１００］（５％スクアレン、１．２５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１及び０．２％ポリソルベート８０）中と同様に、Ｔｈｒ−ＭＤＰを含めずに用いることもできる。微小流動化が好ましい。

・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質及び０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献１０１に記載されているように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン及びカルジオリピンである。サブミクロンの小滴サイズが有利である。

・非代謝性油（軽鉱油など）及び少なくとも１つの界面活性剤（レシチン、トゥイーン８０又はスパン８０など）のサブミクロン水中油型エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−リポファイル結合体（脂肪族アミンの脱アシルサポニンへのグルクロン酸のカルボキシル基を介しての添加により生成する参考文献１０２に記載されているＧＰＩ−０１００など）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド及び／又はＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどの添加物を含めることができる。

・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡ又はＱＳ２１）及びステロール（例えば、コレステロール）がらせん状ミセルとして会合しているエマルジョン［１０３］。

・鉱油、非イオン性親油性エトキシル化脂肪アルコール及び非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコール及び／又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［１０４］。

・鉱油、非イオン性親油性エトキシル化脂肪アルコール及び非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコール及び／又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［１０４］。

スクアレンを含むエマルジョンが好ましい。

一般
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」並びに「からなる」を含む。例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、専らＸからなっていてよく、或いは別のもの、例えば、Ｘ＋Ｙを含んでいてよい。

「実質的に」という語は、「完全に」を除外しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない可能性がある。必要な場合、「実質的に」という語は本発明の定義から割愛してよい。

数値ｘに関する「約」という用語は、例えば、ｘ≒１０％を意味する。

特に述べない限り、２つ以上の成分を混合する工程を含む方法は、混合の特定の順序を必要としない。したがって、成分はあらゆる順序で混合することができる。３つの成分が存在する場合、２つの成分を互いに混合することができ、次にその配合物を第３の成分と混合することができる等である。

担体の選択に起因する変動を避けるために、結合体の濃度は、本明細書ではサッカリドの質量により定義する。

抗原がアジュバントに「吸着」されていると記述されている場合、その抗原の少なくとも５０％（重量）、例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又はそれ以上が吸着されていることが好ましい。ジフテリアトキソイド及び破傷風トキソイドが両方とも完全に吸収されている、すなわち、上清中に何も検出されないことが好ましい。ＨＢｓＡｇの完全な吸着も好ましい。

動物（及び特にウシ）材料を細胞の培養に用いる場合、それらは、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥｓ）がない、特に牛海綿状脳症（ＢＳＥ）がない供給元から入手すべきである。

髄膜炎菌サッカリド結合体は、参考文献２２に記載されている通りに調製した。血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５及びＹのそれぞれの結合体をアジュバントを用いずに混合して、４価髄膜炎菌結合体混合物を得た。この混合物をスクロース／マンニトール混合物などの安定化剤の存在下で凍結乾燥して、将来必要なときに再構成することができる凍結乾燥髄膜炎菌成分を得ることができる。凍結乾燥材料を、再構成の後に５μｇの各サッカリド（血清群Ａについては１０μｇ）を提供する量でバイアルに充填する。

ＨＩＢＴＩＴＥＲ（商標）ワクチン（Ｗｙｅｔｈ）及び液体ＰＥＤＶＡＸＨＩＢ（商標）を購入する。ＨＩＢＴＩＴＥＲ（商標）ワクチンはアジュバント化されていないが、液体ＰＥＤＶＡＸＨＩＢ（商標）はアルミニウム塩アジュバントを含む。両ワクチンは、ガラスバイアル入りで供給される。

ガラスバイアルの内容物を針を介してシリンジ中に抜き取り、凍結乾燥材料を含むバイアルに注入する。緩やかに混合した後、内容物を針を介して新たなシリンジ中に取り出す。シリンジの針を注射針と交換し、再構成ワクチンを試験対象に注射する。

最初の動物試験において、１０匹のＣＤ１マウスの８つの群を用いる。群１には、参考文献２２に記載されているように凍結乾燥ＭｅｎＡ結合体と液体ＭｅｎＣＷＹ混合物を混合することによって調製したＭｅｎＡＣＷＹ結合型ワクチンを投与する。群２には凍結乾燥ＭｅｎＡＣＷＹの水性再構成により調製したＭｅｎＡＣＷＹワクチンを投与する。群３〜５には、（３）硫酸ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントを含むＨｉｂ−ＯＭＰＣ結合体、例えば、ＰＥＤＶＡＸＨＩＢ（商標）、（４）リン酸アルミニウムに吸着させたＣＲＭ１９７−Ｈｉｂ結合体、又は（５）非吸着ＣＲＭ１９７−Ｈｉｂ結合体、例えば、ＨＩＢＴＩＴＥＲ（商標）で再構成したこと以外は群２と同じワクチンを投与する。これらの３つの液体Ｈｉｂワクチンを、髄膜炎菌結合体を含めずに群３〜５にそれぞれ対応する群６〜８に投与する。ワクチンは０、１４及び２８日目に２００μｌの容量で皮下に投与する。用量は、１μｇのＭｅｎＣＷＹサッカリド、２μｇのＭｅｎＡサッカリド及び２．５μｇのＨｉｂサッカリドである。０、２８及び４２日目に採取した血清を髄膜炎菌株に対する殺菌活性及び抗ＰＲＰ反応について試験する。これらの実験の変形形態において、群４に、アジュバント化されているが、リン酸アルミニウムに吸着していないＣＲＭ１９７−Ｈｉｂ結合体を投与する。

試験ＳＳ−０７−０２において、５つの結合体に対するレスポンダーの％として、また髄膜炎菌結合体については幾何平均力価（ＧＭＴｓ）として表した、３回の投与後の免疫原性結果は以下の通りであった。

したがって、液体Ｈｉｂと凍結乾燥ＭｅｎＡＣＷＹとの配合により５つのすべての細菌に対する有効性を保持している組成物を得ることができる。良好な結果が群３（硫酸ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントを含む液体Ｈｉｂ結合体による再構成）及び群４（リン酸アルミニウムアジュバントを含む液体Ｈｉｂ結合体による再構成）で認められた。群３は、最高の抗髄膜炎菌力価とすべての血清群に対する１００％レスポンダーを示したが、Ｈｉｂ抗原に対するレスポンダーの大きくない数を示した。最良の抗Ｈｉｂ反応が群４に認められ、抗髄膜炎菌反応も、特に血清群Ｗ１３５に対して妥当であった［３］。

群３及び４はまた、２回の投与後に良好な免疫反応を示し（データは示さず）、抗ＭｅｎＹ反応は特にこれらの２つの群で群１、２又は５より高かった（ＧＭＴｓとレスポンダー％の両方について）。群４は２回の投与後に最高の抗髄膜炎菌力価とすべての血清群に対する１００％レスポンダーを示した。

群４及び５において、髄膜炎菌結合体の存在がＨｉｂサッカリドに対する免疫反応を増大させた（群８を群５と、群７を群４と比較）。液体Ｈｉｂ抗原をアジュバント化した、群３及び４において、Ｈｉｂ結合体の存在が抗Ｗ１３５力価を増大させた（群２と比較）が、この増大は、非アジュバント化Ｈｉｂを用いた、群５では認められなかった。

並行実験において、結合体を水中スクアレンエマルジョン（ＭＦ５９）を用いて再構成した。３群（９〜１１）には（９）凍結乾燥ＭｅｎＡＣＷＹ結合体、（１０）ＣＲＭ１９７−Ｈｉｂ結合体又は（１１）２つの混合物を投与した。３回の投与後の免疫原性結果は以下の通りであった。

したがって、水中スクアレンエマルジョンは、髄膜炎菌及びＨｉｂ結合体の有効性を改善し、ＭｅｎＡＣＷＹ＋Ｈｉｂ＋エマルジョンの配合は、優れた免疫原性をもたらす。

配合製品４及び５中のＭｅｎＡ及びＨｉｂサッカリド結合体における安定性試験を室温で２４時間にわたりＮＭＲを用いて実施した。これらのサッカリドの両方がホスホジエステル結合を含み、したがって、水性形態での保存中に加水分解による分解を受けやすい。しかし、凍結乾燥ＭｅｎＡＣＷＹ混合物を液体Ｈｉｂで再構成した後に、ＭｅｎＡ及びＨｉｂサッカリドの両方がリン酸アルミニウムアジュバントの存在下又は非存在下で完全に安定のままであり、検出できる解重合はなかった。

本発明がほんの一例として記述され、本発明の範囲及び精神内に留めながらも改変を行うことができることは理解されよう。

参考文献（これらの内容は、参考として本明細書に援用される）

Claims (26)

1. （ｉ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型莢膜サッカリドの結合体を含む水性成分と、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜サッカリドの結合体を含む凍結乾燥成分とを含むキット。
2. （ｉ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型莢膜サッカリドの結合体を含む水性成分と、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜サッカリドの結合体を含む凍結乾燥成分とを合わせる工程を含む、混合ワクチンを調製するための方法。
3. 水性Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ結合体と凍結乾燥Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ結合体とを合わせることによって調製される、（ｉ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型莢膜サッカリドの結合体と、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜サッカリドの結合体とを含む混合ワクチン。
4. 前記水性成分がアジュバントを含む、請求項１〜３のいずれかに記載のキット、方法又はワクチン。
5. 前記Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ結合体がリン酸アルミニウムに吸着している、請求項１〜４のいずれかに記載のキット、方法又はワクチン。
6. 前記水性成分がアジュバント化されていない、請求項１から３のいずれか一項に記載のキット、方法又はワクチン。
7. 水中油型エマルジョン中に２つ以上のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型由来の莢膜サッカリドの結合体を含むワクチン。
8. 前記Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ結合体の投与が、患者において＞０．１５μｇ／ｍｌの抗ＰＲＰ抗体濃度をもたらす、請求項１〜７のいずれかに記載のキット、方法又はワクチン。
9. 前記水性成分中のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ結合体の濃度が０．５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌの範囲内にある、請求項１〜８のいずれかに記載のキット、方法又はワクチン。
10. 前記Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅサッカリドが、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド及びＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜複合体からなる群より選択される担体タンパク質に結合体化している、請求項１〜９のいずれかに記載のキット、方法又はワクチン。
11. 前記水性成分が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞性百日咳抗原、不活性化ポリオウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原及び／又は肺炎球菌サッカリドのうち１つ又は複数を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載のキット又は方法。
12. ワクチンを調製するためのキットであって、該キットは、（ｉ）水中油型エマルジョン成分と、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの２つ以上の血清群に由来する結合体化莢膜サッカリドを含む凍結乾燥成分とを含む、キット。
13. （ｉ）水中油型エマルジョン成分と、（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの２つ以上の血清群に由来する莢膜サッカリドの結合体を含む凍結乾燥成分とを合わせる工程を含む、ワクチンを調製するための方法。
14. 水中油型エマルジョン成分とＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの２つ以上の血清群に由来する莢膜サッカリドの凍結乾燥結合体とを合わせることによって調製される、水中油型エマルジョン中にＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜サッカリドの結合体を含むワクチン。
15. 前記Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ結合体の投与が殺菌抗体反応をもたらす、請求項１〜１４のいずれかに記載のキット、方法又はワクチン。
16. 前記凍結乾燥成分が髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５及びＹのうち２つ、３つ又は４つを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載のキット、方法又はワクチン。
17. 前記凍結乾燥成分が髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５及びＹのそれぞれに由来する莢膜サッカリドを含む、請求項１６に記載のキット、方法又はワクチン。
18. 血清群当たりの髄膜炎菌莢膜サッカリドの量が１μｇ〜２０μｇである、請求項１７に記載のキット、方法又はワクチン。
19. 前記Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓサッカリドがＣＲＭ１９７、ジフテリアトキソイド及び破傷風トキソイドからなる群より選択される担体タンパク質に結合体化している、請求項１〜１８のいずれかに記載のキット、方法又はワクチン。
20. 前記凍結乾燥成分が安定化剤を含む、請求項１６に記載のキット、方法又はワクチン。
21. 前記凍結乾燥成分がアジュバントを含む、請求項１〜２０のいずれかに記載のキット、方法又はワクチン。
22. 前記凍結乾燥成分がアジュバントを含まない、請求項１から２０のいずれか一項に記載のキット、方法又はワクチン。
23. 前記凍結乾燥成分がＨｉｂサッカリドを含まない、請求項１〜２２のいずれかに記載のキット、方法又はワクチン。
24. １つ又は複数の緩衝剤を含む、請求項１〜２３のいずれかに記載のワクチン。
25. ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原、不活性化ポリオウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原及び／又は肺炎球菌サッカリドのうち１つ又は複数を含む、請求項１〜２４のいずれかに記載のワクチン。
26. 請求項１〜２５のいずれかに記載のワクチンを患者に投与する工程を含む、患者における免疫応答を惹起する方法。