ES2555786T3 - Formulación de vacunas contra la meningitis - Google Patents

Abstract

Un kit que comprende: (i) un componente acuoso, que comprende un conjugado de un sacárido capsular de Haemophilus influenzae de tipo B a una concentración en el intervalo de 0,5 μg/ml a 50 μg/ml, y (ii) un componente liofilizado, que comprende conjugados de sacáridos capsulares de Neisseria meningitidis de los serogrupos meningocócicos A, C, W135 e Y, en el que la cantidad de los sacáridos meningocócicos por serogrupo está entre 1 μg y 20 μg.

Description

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DESCRIPCION

Formulacion de vacunas contra la meningitis Campo de la tecnica

La presente invencion esta en el campo de la formulacion de vacunas de combinacion para inmunizar contra la meningitis.

Tecnica anterior

Las vacunas que contienen antigenos de mas de un organismo patogeno dentro de una sola dosis se conocen como vacunas "multivalentes" o "de combinacion", por ejemplo las vacunas contra la difteria, el tetanos y la tos ferina va("DTP") y las vacunas contra el sarampion, las paperas y la rubeola ("MMR"). Las vacunas combinadas ofrecen a los pacientes la ventaja de recibir un numero reducido de inyecciones, lo que conduce a la ventaja clmica de un mayor cumplimiento (por ejemplo, vease el capttulo 29 de la referencia 1), en particular para la vacunacion pediatrica. Al mismo tiempo, sin embargo, presentan dificultades debido a factores que incluyen: incompatibilidad ffsica y bioqmmica entre antigenos y otros componentes; interferencia inmunologica; y estabilidad.

Algunas de estas dificultades pueden abordarse mediante la formulacion adecuada de la vacuna. Por ejemplo, el sacarido capsular PRP conjugado de Haemophilus influenzae de tipo B ("Hib") puede ser inestable en condiciones acuosas y, por tanto, las vacunas que contiene Hib en la serie INFANRIX ™ (incluyendo PEDIARIX ™) incluyen un componente Hib liofilizado que se reconstituye en el momento de usar por una formulacion acuosa de los antfgenos restantes. La referencia 2 tambien describe la formulacion de vacunas que contienen Hib y el conjugado de Hib se liofiliza en combinacion con conjugados meningococicos, para la reconstitucion extemporanea. . En contraste, la referencia 3 describe formulaciones totalmente lfquidas de conjugados meningococicos, en las que otros componentes (por ejemplo, Hib o conjugados de neumococo) pueden liofilizarse y reconstituirse. La referencia 22 describe combinaciones de conjugados meningococicos en las que los conjugados del serogrupo A ("MenA") se liofilizan para su reconstitucion mediante formulaciones lfquidas de conjugados de otros serogrupos.

Hib y el meningococo son dos causas de la meningitis bacteriana y es un objeto de la invencion proporcionar mas y mejores formulaciones de vacunas para conjugados de Hib y meningococicos.

Divulgacion de la invencion

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, un componente lfquido de Hib se utiliza para reconstituir un componente meningococico liofilizado, produciendo de este modo una vacuna contra la meningitis combinada.

Por tanto, la invencion proporciona un kit que comprende: (i) ) un componente acuoso, que comprende un conjugado de un sacarico capsular de Haemophilus influenzae de tipo B a una concentracion en el intervalo de 0,5 |ig/ml a 50 |ig/ml; y (ii) un componente liofilizado, que comprende conjugados de sacaridos capsulares de Neisseria meningitidis de los serogrupos meningococicos A, C, W135 e Y, en los que la cantidad de los sacaridos meningococicos por serogrupo esta entre 1 |jg y 20 |ig. Para la administracion a un paciente, los componentes acuosos y liofilizados se combinan, para dar una vacuna lfquida combinada que es adecuada para la inyeccion.

La invencion tambien proporciona un procedimiento para preparar una vacuna combinada, que comprende la etapa de combinar (i) un componente acuoso, que comprende un conjugado de un sacarido capsular de Haemophilus influenzae de tipo B a una concentracion en el intervalo de 0,5 |ig/ml a 50 |ig/ml, y (ii) un componente liofilizado, que comprende conjugados de sacaridos capsulares de Neisseria meningitidis de los serogrupos meningococicos A, C, W135 e Y, en el que la cantidad de los sacaridos meningococicos por serogrupo esta entre 1 mg y 20 |ig.

La invencion tambien proporciona una vacuna que comprende: (i) un sacarido capsular conjugado de Haemophilus influenzae de tipo B a una concentracion en el intervalo de 0,5 |ig/ml a 50|ig/ml; y (ii) conjugados de sacaridos capsulares de Neisseria meningitidis, preparados mediante la combinacion de un conjugado de H. influenzae y conjugados liofilizados de N. meningitidis, en el que la cantidad de los sacaridos meningococicos por serogrupo esta entre 1 mg y 20 |ig. La vacuna puede incluir estabilizadores de liofilizacion (vease mas adelante).

El componente liquido

Los kits y procedimientos de la invencion implican el uso de un componente antigenico acuoso que incluye un conjugado de un sacarido de Hib. La administracion del conjugado de Hib se traduce preferentemente en una concentracion de anticuerpo anti-PRP en un paciente de > 0,15 jg / ml, y mas preferiblemente > 1 jg / ml. Estos son los umbrales de respuesta aceptables estandar.

Los antfgenos sacaridos de Hib son bien conocidos [por ejemplo, capttulo 14 de la referencia 1] y su preparacion esta bien documentada [por ejemplo, referencias 4 a 13]. El sacarido de Hib esta conjugado a una protema transportadora con el fin de potenciar su inmunogenicidad, especialmente en ninos. La invencion puede usar cualquier conjugado Hib.

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El resto sacarido del conjugado puede ser un polisacarido (por ejemplo, poliribosilribitol fosfato de longitud completa (PRP)), pero tambien es posible utilizar oligosacaridos (por ejemplo, PM de ~ 1 a ~ 5 kDa). Los oligosacaridos se forman de forma conveniente mediante fragmentacion del PRP purificado (por ejemplo, mediante hidrolisis), que normalmente ira seguida de la purificacion de los fragmentos del tamano deseado. Cuando la composicion de la invencion incluye un oligosacarido conjugado, la preparacion de oligosacaridos debe preceder a la conjugacion.

La concentracion de Hib conjugado en el componente acuoso esta en el intervalo de 0,5 |ig/ml a 50 |ig/ml por ejemplo de 1 |ig/ml a 20 |ig/ml, de 1 2|ig/ml a 16 |ig/ml, etc. La concentracion puede ser de aproximadamente 15 |jg/ml.

El componente acuoso de Hib puede estar sin adyuvante o puede incluir un adyuvante. Cuando se incluye un adyuvante, sera tipicamente una sal de aluminio por ejemplo una sal de fosfato o una sal de hidroxido. Cuando se incluye un adyuvante, el componente de Hib puede adsorberse a una sal de aluminio o puede no ser adsorbido. La adsorcion a adyuvantes de fosfato de aluminio se ha comunicado que es ventajosa en algunas circunstancias [14], mientras que se ha indicado que la no adsorcion es ventajosa en otras circunstancias [2].

Se conocen varios diferentes conjugados de Hib. Por ejemplo, la Tabla 14-7 de la referencia 1 muestra las caractensticas de cuatro conjugados de Hib diferentes. Estos se diferencian por varios parametros, por ejemplo, protema transportadora. La invencion se puede usar cualquier protema transportadora adecuada (vease mas adelante), tales como CRM197 (como en 'HbOC'), el toxoide tetanico (como en 'PRP-T') y el complejo de la membrana externa de N. meningitidis (como en 'PRP-OMP').

Diversos conjugados de Hib acuosos estan disponibles comercialmente y se pueden utilizar con la invencion. Por ejemplo, el producto de Wyeth HIBTITER ™ esta disponible en una formulacion lfquida. HIBTITER™ utiliza un vehmulo CRM197 y cada dosis de 0,5 ml (suministrada en viales) contiene 10 |jg de sacarido en cloruro de sodio al 0,9 %, sin adyuvante. El producto PEDVAXHIB™ de Merck tambien esta disponible en una formulacion lfquida. PEDVAXHIB™ utiliza un vehmulo OMPC y cada dosis de 0,5 ml contiene 7,5 mg de sacarido con 225 jg de adyuvante de sulfato hidroxifosfato de aluminio en cloruro de sodio al 0,9 %. Esta libre de tanto lactosa y timerosal. El producto ActHIB ™ no se encuentra disponible actualmente en forma lfquida. Otro conjugado de HIb util comprende un oligosacarido Hib unido covalentemente a CRM197 a traves de un ligador de acido adfpico [15,16].

El conjugado de Hib puede ser el unico ingrediente antigenico en el componente acuoso, o puede haber uno o mas antfgenos adicionales. Por ejemplo, el componente acuoso puede incluir uno o mas de: un toxoide de la difteria, un toxoide del tetanos, el antfgeno(s) de tos ferina acelular, los antfgenos inactivados del virus de la polio, el antfgeno de la superficie del virus de la hepatitis B, y / o el sacarido neumococico. Cuando el componente acuoso esta adyuvado e incluye un conjugado de Hib, un toxoide de la difteria, un toxoide del tetanos, los antfgenos de tos ferina acelular, los antfgenos inactivados del virus de la polio y el antfgeno de la superficie del virus de la hepatitis B, se puede usar el producto HEXAVAC ™. Cuando el componente acuoso esta adyuvado e incluye un conjugado de Hib, un toxoide de la difteria, un toxoide del tetanos, los antfgenos de tos ferina de celulas enteras, el antfgeno de la superficie del virus de la hepatitis B, se puede usar el producto QUINVAXEM™. Cuando el componente acuoso esta adyuvado e incluye un conjugado de Hib, un toxoide de la difteria, un toxoide del tetanos, los antfgenos de tos ferina acelular, los antfgenos inactivados del virus de la polio, se puede usar el producto PEDIACEL™.

Las conjugados de Hib monovalentes lfquidos comercialmente disponibles son componentes acuosos preferidos para uso con la invencion, tales como la vacuna sin adyuvante HIBTITER ™. En la ref. 2 se mencionan ventajas aparentes de evitar un adyuvante cuando se combinan conjugados de Hib y meningococicos.

El componente liofilizado

Los kits y procedimientos de la invencion implican el uso de un componente antigenico liofilizado que incluye conjugados de sacaridos capsulares de los serogrupos meningococicos A, C, W135 e Y. La administracion del conjugado meningococico da como resultado preferiblemente una respuesta de anticuerpos bactericida, con un aumento del tftulo en el ensayo bactericida en suero (SBA) para el serogrupo relevante de al menos 4 veces y, preferiblemente, de al menos 8 veces, medido con complemento humano [17]. Si se usa complemento de conejo para medir los tftulos de SBA, el aumento del tftulo es, preferiblemente, de al menos 128 veces.

Las vacunas monovalentes conjugadas contra el serogrupo C se han aprobado para uso humano e incluyen MENJUGATE™, MENINGITEC™ y NEISVAC-C™. Se conocen mezclas de conjugados de los serogrupos A+C [19,20] y se han notificado mezclas de conjugados de los serogrupos A+C+W135+Y [21-24] y se aprobaron en 2005 como el producto acuoso MENACTRA™. El componente liofilizado usado con la invencion incluye los conjugados meningococicos A + C + W135 + Y.

Los conjugados pueden estar presentes en masas sustancialmente iguales, por ejemplo, la masa de sacarido de cada serogrupo esta dentro de ± 10 % de la otra. Una cantidad tfpica por serogrupo en el componente liofilizado esta entre 1 jg y 20 |ig, por ejemplo entre 2 y 10 |ig por serogrupo, o aproximadamente 4 jg. Como alternativa a una proporcion sustancialmente igual, se puede usar una doble masa de sacarido del serogrupo A.

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El sacarido capsular del meningococo del serogrupo A es un homopoKmero de N-acetil-D-manosamina-1-fosfato unido a (a1^-6), con O-acetilacion parcial en las posiciones C3 y C4. La acetilacion en la posicion C-3 puede ser del 70-95 %. Las condiciones usadas para purificar el sacarido pueden dar lugar a la O-acetilacion (por ejemplo, en condiciones basicas), pero es util conservar el OAc en esta posicion C3. En algunas realizaciones, al menos el 50 % (por ejemplo, al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o mas) de los residuos de manosamina en sacaridos del serogrupo A tambien esta O-acetilado en la posicion C-3. Los grupos acetilo pueden sustituirse con grupos bloqueantes para prevenir la hidrolisis [25], y estos sacaridos modificados siguen siendo sacaridos del serogrupo A dentro del significado de la invencion.

EL sacarido capsular del serogrupo C es un homopolfmero de acido sialico unido a (a 2^-9) (acido N- acetilneurammico o 'NeuNAc'). La estructura del sacarido se escribe como ^-9)-Neu p NAc 7/8 OAc-(a2^-. La mayona de las cepas del serogrupo C tienen grupos O-acetilo en C-7 y/o C-8 de los residuos de acido sialico, pero aproximadamente el 15 % de los aislamientos clmicos carecen de estos grupos O-acetilo [26,27]. La presencia o ausencia de grupos OAc genera epttopos unicos y la especificidad de la union del anticuerpo al sacarido puede afectar a su actividad bactericida contra las cepas O-acetiladas (OAc+) y des-O-acetiladas (O-Ac) [28-30]. Los sacaridos del serogrupo C usados con la invencion se pueden preparar a partir de cepas OAc+ u OAc-. Las vacunas conjugadas MenC aprobadas incluyen sacaridos tanto OAc-(NEISVAC-C™) como OAc+ (MENJUGATE™ & MENINGITEC™). En algunas realizaciones, las cepas para la produccion de los conjugados del serogrupo C son cepas OAc+, por ejemplo del serotipo 16, serosubtipo P1.7a,1, etc. Por tanto, se pueden usar cepas C:16:P1.7a,1 OAc+. Las cepas OAc+ del serosubtipo P1.1 tambien son utiles, tal como la cepa Cll.

El sacarido del serogrupo W135 es un polfmero de unidades del disacarido acido sialico-galactosa. Como el sacarido del serogrupo C, tiene O-acetilacion variable, pero en las posiciones 7 y 9 del acido sialico [31]. La estructura se escribe como: ^4)-D-Neup5Ac(7/90Ac)-a-(2^6)-D-Gal-a-(1^-.

El sacarido del serogrupo Y es similar al sacarido del serogrupo W135, a excepcion de que la unidad de disacarido de repeticion incluye glucosa en lugar de galactosa. Como el serogrupo W135, tiene O-acetilacion variable en las posiciones 7 y 9 del acido sialico [31]. La estructura del serogrupo Y se escribe como: ^4)-D-Neup5Ac(7/90Ac)-a- (2^6)-D-Glc-a-(1^.

Los sacaridos usados de acuerdo con la invencion pueden estar O-acetilados, como se ha descrito antes (por ejemplo, con el mismo patron de O-acetilacion que se ve en los sacaridos capsulares nativos) o pueden estar parcial o totalmente O-acetilados en una o mas posiciones de los anillos de sacarido, o pueden estar hiper-O-acetilados respecto a los sacaridos capsulares nativos,

Los restos sacaridos en los conjugados pueden comprender sacaridos de longitud completa como los preparados a partir de meningococos o pueden comprender fragmentos de sacaridos de longitud completa, es decir, los sacaridos pueden ser mas cortos que los sacaridos capsulares nativos que se ven en las bacterias. Por tanto, los sacaridos pueden estar despolimerizados, produciendose la despolimerizacion durante o despues de la purificacion del sacarido pero antes de la conjugacion. La despolimerizacion reduce la longitud de la cadena de los sacaridos. Un procedimiento de despolimerizacion implica el uso de peroxido de hidrogeno [21]. El peroxido de hidrogeno se anade a un sacarido (por ejemplo, para dar una concentracion final de H2O2 del 1 %) y la mezcla se incuba despues (por ejemplo, a aproximadamente 55 °C) hasta que se ha conseguido una reduccion deseada de la longitud de la cadena. Otro procedimiento de despolimerizacion implica hidrolisis acida [22]. Otros procedimientos de despolimerizacion se conocen en la tecnica. Los sacaridos usados para preparar los conjugados para usar de acuerdo con la invencion se pueden obtener mediante cualquiera de estos procedimientos de despolimerizacion. La despolimerizacion se puede usar para proporcionar una longitud de cadena optima para inmunogenicidad y/o para reducir la longitud de cadena para que los sacaridos se puedan manipular ffsicamente. En algunas realizaciones, los sacaridos tienen el siguiente intervalo de grados medios de despolimerizacion (Dp): A=10-20; C=12-22; W135=15-25; Y=15-25. En terminos de peso molecular, en lugar del Dp, los intervalos preferidos son, para todos los serogrupos: <100 kDa; 5 kDa-7 5kDa; 7 kDa-50 kDa; 8 kDa-35 kDa; 12 kDa-25 kDa; 15 kDa-22 kDa.

En algunas realizaciones, el peso molecular medio para los sacaridos de cada serogrupo meningococico A, C, W135 e Y puede ser mas de 50 kDa, por ejemplo >75 kDa, >100 kDa, >110 kDa, >120 kDa, >130 kDa, etc. [32], e incluso de hasta 1500 kDa, en concreto tal como se determina mediante MALLS. Por ejemplo: un sacarido de MenA puede estar en el intervalo 50-500 kDa por ejemplo 60-80 kDa; un sacarido de MenC puede estar en el intervalo de 100210 kDa; un sacarido de MenW135 puede estar en el intervalo de 60-190 kDa por ejemplo 120-140kDa; y / o un sacarido de MenY puede estar en el intervalo de 60-190 kDa por ejemplo 150-160kDa

Protemas vehmulo utiles (vease mas adelante) incluyen CRM197, el toxoide de la difteria y / o el toxoide del tetanos. Cuando el componente liofilizado incluye conjugados de mas de un serogrupo meningococico, los diversos conjugados pueden usar diferentes protemas vehmulo (por ejemplo, un serogrupo en CRM197, otro en el toroide del tetanos) o pueden usar la misma protema transportadora (por ejemplo, sacaridos de dos serogrupos conjugados por separado a CRM197 y, despues, combinados).

Por razones de estabilidad, un componente liofilizado puede incluir un estabilizador tal como lactosa, sacarosa y manitol, asf como mezclas de los mismos por ejemplo mezclas de lactosa / sacarosa, mezclas de sacarosa / manitol,

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etcetera. La vacuna final puede, por lo tanto, contener lactosa y / o sacarosa Utilizando una mezcla de sacarosa / manitol se puede acelerar el proceso de secado. Un componente liofilizado puede tambien incluir cloruro sodico. Los componentes solubles en el material liofilizado se conservaran en la composicion despues de la reconstitucion.

El componente liofilizado puede o no puede incluir un adyuvante, tal como una sal de aluminio.

El componente liofilizado preferiblemente no incluye un sacarido Hib.

Envasado de las composiciones de la invencion

Los componentes humedos y secos utilizados con la invencion deben mantenerse separados unos de otros antes de su uso. Por lo tanto se envasan por separado en la forma de un kit. El kit puede tomar varias formas.

En algunas realizaciones, los dos componentes se envasan en recipientes separados. En otras formas de realizacion, los dos componentes se envasan en camaras separadas de un unico recipiente, por ejemplo en recipientes separados de una jeringuilla de camaras multiples. Una jeringuilla de doble camara permite que dos composiciones individuales se mantengan separadas durante el almacenamiento, sino que se mezclen cuando se activa el embolo de la jeringuilla.

El material liofilizado por lo general se presentara en un vial sellado. El vial tendra una abertura (por ejemplo, un sello de goma, un cuello rompible, etcetera) que puede mantener la esterilidad al tiempo que permite la eliminacion de su contenido y / o la introduccion de material acuoso para la reconstitucion. Los viales pueden estar hechos de varios materiales por ejemplo de un vidrio, de un plastico, etcetera.

El material acuoso tambien puede presentarse en un vial, pero como alternativa puede presentarse en, por ejemplo, una jeringuilla. De nuevo, el recipiente sera capaz de mantener la esterilidad al tiempo que permite la eliminacion de su contenido. Una jeringuilla se puede aplicar con o sin una aguja unida a ella; en este ultimo caso, puede envasarse una aguja separada con la jeringuilla para su montaje y uso, y la jeringuilla tendra generalmente un capuchon en la punta para sellar la punta antes de la fijacion de una aguja. Se prefieren las agujas de seguridad. Son tfpicas las agujas de 2,54 cm cal 23, 2,54 cm cal 25 y 1,6 cm cal 25. El embolo en la jeringuilla puede tener un tope para evitar que el embolo sea retirado accidentalmente durante la aspiracion. Las jeringuillas pueden estar hechas de varios materiales por ejemplo de un vidrio, de un plastico, etcetera.

Un vial puede tener una tapa (por ejemplo, un cierre de tipo Luer) adaptada de modo que se pueda insertar en la tapa una jeringuilla precargada, expeler los contenidos de la jeringuilla hacia el interior del vial (por ejemplo, para reconstituir el material liofilizado en su interior) y de modo que los contenidos del vial se puedan volver a introducir en la jeringuilla. Tras la retirada de la jeringuilla del vial, se puede insertar una aguja y la composicion se puede administrar a un paciente. La tapa esta dentro de un sello o cubierta, de modo que el sello o cubierta ha de retirarse antes de poder acceder a la tapa.

Cuando el material se envasa en un recipiente, el recipiente generalmente se esterilizara antes de anadir el material al mismo.

Cuando se usa un recipiente de vidrio (por ejemplo, una jeringuilla o un vial), de forma util puede estar hecho de vidrio de borosilicato en lugar de un vidrio de cal sodada.

Reconstitucion

Antes de la administracion a un paciente, la invencion implica la reconstitucion de un componente antigenico liofilizado (que contiene los conjugados meningococicos) con un componente acuoso (que contiene el conjugado Hib). La reconstitucion puede implicar varias etapas.

Si los componentes estan presentes en una jeringuilla de varias camaras, el accionamiento de la jeringuilla combinaran los materiales acuosos y secos. Cuando los componentes estan presentes en recipientes separados, se pueden utilizar diferentes procesos de mezcla. En algunas realizaciones, el material acuoso en un vial puede extraerse a una jeringuilla (por ejemplo, a traves de una aguja), o puede ya estar presente en una jeringuilla. Despues, el material acuoso puede transferirse desde la jeringuilla a un vial que contiene el material liofilizado (por ejemplo, a traves de una aguja, que puede ser la misma o diferente de una aguja previamente utilizada para extraer el material acuoso de un vial). De este modo, el material liofilizado se reconstituye y puede extraerse (por ejemplo, a traves de una aguja, siendo de nuevo la misma o diferente de una aguja usada previamente) en una jeringuilla (por ejemplo, la misma o diferente de una jeringuilla usada previamente), a partir de la cual se puede inyectar en un paciente (por ejemplo, a traves de una aguja, siendo de nuevo la misma o diferente de una aguja usada previamente).

Una vez que el material liofilizado y el material acuoso se han combinado y estan presentes en un dispositivo de administracion (normalmente una jeringuilla), la composicion se puede administrar a un paciente. La reconstitucion tipicamente tendra lugar inmediatamente antes de la administracion a un paciente, por ejemplo no mas de 30 minutos antes de la inyeccion.

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Despues de la reconstitucion, una composicion para administracion a un paciente incluira conjugados de Hib y meningococicos. Un conjugado Hib se origina a partir de material acuoso original y un conjugado meningococico se origina a partir de material liofilizado original.

La masa de sacarido Hib en la vacuna reconstituida de la invencion esta en el intervalo de 0,5 |jg a 50 jg por ejemplo, de 1 - 20jg, de 10 - 15 jg, de 12 - 16 jg, etc. La cantidad puede ser de aproximadamente 12,5 jg. Una masa de menos de 5 jg puede ser adecuada [33] por ejemplo en el intervalo de 1-5 jg, 2-4 jg, o de aproximadamente 2,5 jg.

La masa del sacarido meningococico por serogrupo en la vacuna reconstituida esta entre 1 |jg y 20 |jg, por ejemplo entre 2 y 10 jg por serogrupo, o de aproximadamente 5 jg o de aproximadamente 10 jg. Los conjugados pueden ser presentes en masas sustancialmente iguales por ejemplo, la masa del sacarido de cada serogrupo esta dentro de + 10 % uno de otro. Como alternativa a una proporcion igual, se puede usar una masa doble del sacarido del serogrupo A. Por tanto, una vacuna puede incluir el sacarido MenA a 10 |ig y los sacaridos MenC, W135 e Y a 5 |ig cada uno.

En algunas realizaciones, la masa de sacarido DE Hib sera sustancialmente la misma que la masa de un sacarido del serogrupo meningococico particular. En algunas realizaciones, la masa del sacarido Hib sera mayor que (por ejemplo, al menos 1,5 x) la masa de un sacarido de serogrupo meningococico particular. En algunas realizaciones, la masa del sacarido Hib sera menor que (por ejemplo, al menos 1,5 x) la masa de un sacarido de serogrupo meningococico particular.

Cuando una composicion incluye sacaridos de mas de un serogrupo meningococico, existe una masa media de sacarido por serogrupo. Si se usan masas sustancialmente iguales de cada serogrupo, la masa media sera la misma masa que cada una individual; cuando se usan masas no iguales, la media sera diferente, por ejemplo con una cantidad de 10:5:5:5 jg para una mezcla Men-ACWY, la masa media es de 6,25 jg por serogrupo. En algunas realizaciones, la masa de sacarido DE Hib sera sustancialmente la misma que la masa media de un sacarido del serogrupo meningococico por serogrupo. En algunas realizaciones, la masa del sacarido Hib sera mayor que (por ejemplo, al menos 1,5 x) la masa media del sacarido meningococico por serogrupo. En algunas realizaciones, la masa del sacarido Hib sera menor que (por ejemplo, al menos 1,5 x) la masa media del sacarido meningococico por serogrupo [34].

Procedimientos de tratamiento y administracion de la vacuna

La invencion implica la coadministracion de conjugados de Hib y meningococicos en la forma de una vacuna de combinacion. Las composiciones reconstituidas son adecuadas para la administracion a pacientes humanos y la invencion proporciona un procedimiento para elevar una respuesta inmunitaria en un paciente, que comprende la etapa de administrar una composicion de la invencion al paciente.

La invencion tambien proporciona una composicion de la invencion para usar en medicina.

La invencion tambien proporciona el uso de (i) un componente acuoso, que comprende un conjugado de un sacarido capsular de Haemophilus influenzae de tipo B a una concentracion en el intervalo de 0,5 |ig/ml a 50 |ig/ml, y (ii) un componente liofilizado, que comprende conjugados de sacaridos capsulares de Neisseria meningitidis de los serogrupos meningococicos A, C, W135 e Y, en el que la cantidad de los sacaridos meningococicos por serogrupo esta entre 1 |ig y 20 |ig, en la fabricacion de un medicamento para la administracion a un paciente.

La invencion tambien proporciona una combinacion de de (i) un componente acuoso, que comprende un conjugado de un sacarido capsular de Haemophilus influenzae de tipo B a una concentracion en el intervalo de 0,5 |ig/ml a 50 |ig/ml, y (ii) un componente liofilizado, que comprende conjugados de sacaridos capsulares de Neisseria meningitidis de los serogrupos meningococicos A, C, W135 e Y, en el que la cantidad de los sacaridos meningococicos por serogrupo esta entre 1 |ig y 20 |ig, para usar en inmunizacion.

Las composiciones reconstituidas de la invencion son, preferiblemente, vacunas, para su uso en la reduccion o prevencion de la meningitis bacteriana, incluyendo la meningitis meningococica y la meningitis por HIb.

Los pacientes para recibir las composiciones de la invencion pueden ser de menos de 2 anos de edad por ejemplo con edades comprendidas entre 0-12 meses. Un grupo particular de pacientes tiene entre 1 y 3 mese de edad, y no ha recibido previamente una vacuna conjugada contra el meningococo.

Con el fin de tener una eficacia completa, un programa de inmunizacion primaria tfpica para un nino puede implicar la administracion de mas de una dosis. Por ejemplo , las dosis pueden estar en: 0, 2 y 4 meses (siendo al tiempo 0 la primera dosis); 0, 1 y 2 meses; 0 y 2 meses; 0, 2 y 8 meses; etcetera. La primera dosis (tiempo 0) puede administrase a aproximadamente los 2 meses de edad, o, algunas veces (por ejemplo en un calendario de 0-2-8 meses) aproximadamente a los 3 meses de edad.

Las composiciones tambien se pueden utilizar como dosis de refuerzo por ejemplo para los ninos, en el segundo ano de vida.

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Las composiciones de la invencion se pueden administrar mediante inyeccion intamuscular en, por ejemplo, el brazo, la pierna o las nalgas.

Cuando las composiciones de la invencion incluyen un adyuvante a base de aluminio, se puede producir sedimentacion de los componentes durante el almacenamiento. Por lo tanto, las composiciones acuosas deben agitarse antes y despues de la reconstitucion, antes de la administracion a un paciente.

Conjugacion

La invencion utiliza conjugados de Hib y meningococicos en lo que los sacaridos capsulares se conjugan con protemas vehmulo. Protemas vehmulo utiles para la conjugacion covalente son las toxinas bacterianas o toxoides, tales como el toxoide de la difteria o el toxoide del tetanos, o derivados de los mismos tales como el mutante de la toxina difterica CRM197 [35-37]. Otras protemas vehmulo adecuadas incluyen la protema de membrana externa de N. meningitidis [38], peptidos sinteticos [39,40], protemas del shock termico [41,42], protemas de pertussis [43,44], citocinas [45], linfocinas [45], hormonas [45], factores de crecimiento [45], protemas artificiales que comprenden multiples epttopos de celulas T CD4+ humanas de varios antigenos derivados de patogenos [46], tales como N19 [47], protema D de H. influenzae [48, -50], neumolisina [51], protema de superficie neumococica PspA [52], protemas de captacion de hierro [53], toxina A o B de C. difficile [54], etc.

El toxoide difterico (Dt), el toxoide del tetanos (TT) y CRM197 son los principales vehmulos actualmente en uso en las vacunas pediatricas, por ejemplo los conjugados de Hib de GSK utilizan Tt como vehmulo, el producto HIBTITER ™ utiliza CRM 197, los conjugados de neumococo en PREVENAR™ usan CRM197, los productos MENJUGATE™ y MENINGITEC™ utilizan CRM 197 y NEIS-VAC-C™ utiliza Tt.

Se pueden usar los conjugados con una proporcion sacarido:protema (p/p) de ente 1:5 (es decir, exceso de protema) y 5:1 (es decir, exceso de sacarido), por ejemplo proporciones entre 1:2 y 5:1 y proporciones entre :1.25 y 1:2.5. Como se describe en la referencia 55, conjugados de diferentes serogrupos en una mezcla pueden tener diferentes proporciones sacarido:protema, por ejemplo una puede tener una proporcion entre 1:2 y 1:5, mientras que otra tiene una proporcion entre 5:1 y 1:1.99.

Los conjugados se pueden usar junto con la protema transportadora libre [56]. Cuando una protema transportadora dada esta presente en forma tanto libre como conjugada en una composicion de la invencion, la forma no conjugada puede ser no superior al 5 % de la cantidad total de la protema transportadora en la composicion como un todo y, mas normalmente, presente a menos del 2 % en peso.

Se puede usar cualquier reaccion de conjugacion adecuada, con cualquier ligador adecuado cuando sea necesario.

Normalmente, el sacarido se activara o funcionalizara antes de la conjugacion. La activacion puede implicar, por ejemplo, reactivos de cianilacion tales como CDAP (por ejemplo, 1-ciano-4-dimetilamino piridinio tetrafluoroborato [57, 58 etc.]). Otras tecnicas adecuadas usan carbodiimidas, hidrazidas, esteres activos, norborano, acido p- nitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU; vease tambien la introduccion a la referencia 11).

Se pueden establecer enlaces a traves de un grupo ligador usando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en las referencias 59 y 60. Un tipo de enlace implica la aminacion reductora del polisacarido, acoplamiento del grupo amino resultante con un extremo de un grupo ligador de acido adfpico y, despues, acoplamiento de una protema en el otro extremo del grupo ligador de acido adfpico [61,62]. Otros ligadores incluyen p-propionamido [63], nitrofenil-etilamina [64], haluros de haloacilo [65], enlaces glicosfdicos [66], acido 6- aminocaproico [67], ADH [68], restos de C4 a C12 [69] etc. Tambien se puede usar condensacion con carbodiimida [70]. Como una alternativa al uso de un enlazador, se puede usar un enlace directo. Los enlaces directos a la protema pueden comprender oxidacion del polisacarido, seguida de aminacion reductora con la protema, tal como se ha descrito en, por ejemplo, las referencias 71 y 72.

Un procedimiento que implica la introduccion de grupos amino en el sacarido (por ejemplo, mediante sustitucion de los grupos =O terminales con -NH2), seguido por derivacion con un diester adfpico (por ejemplo, N- hidroxisuccinimido diester de acido adfpico) y se puede usar la reaccion con la protema transportadora. En otra reaccion util, un sacarido se derivatiza con un reactivo de cianilacion, seguido de acoplamiento a una protema (directa o despues de la introduccion de un grupo tiol o nucleofilo hidrazida en el vehmulo), sin la necesidad de usar un enlazador. Los reactivos de cianilacion adecuados incluyen tetrafluoroborato de 1-ciano-4- (dimetilamino) piridinio ('CDAP'), p-nitrofenilcianato y tetrafluoroborato de N-cianotrietilamonio ('CTEA').

Como se describe en la referencia 73, una mezcla puede incluir un conjugado con enlace sacarido/protema directo y otro conjugado con enlace a traves de un ligador. Esta disposicion se aplica en concreto cuando se usan conjugados sacaridos de diferentes serogrupos meningococicos, por ejemplo los sacaridos MenA y MenC se pueden conjugar a traves de un ligador, mientras que los sacaridos MenW135 y MenY se pueden conjugar directamente a una protema transportadora.

Despues de la conjugacion, los sacaridos libres y conjugados se pueden separar. Hay muchos procedimientos adecuados para esta separacion, incluidos cromatograffa hidrofobica, ultrafiltracion tangencial, diafiltracion etc.

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(veanse tambien las referencias 74 y 75, etc.). Si una vacuna comprende un sacarido dado tanto en forma libre como conjugada, la forma no conjugada es, de forma util, no mas que el 20 % en peso de la cantidad total de tal sacarido en la composicion como un todo (por ejemplo, <15 %, <10 %, <5 %, <2 %, <1%).

La cantidad de vetuculo (conjugado y no conjugado) de cada conjugado puede ser no superior a 100 |jg / ml, por ejemplo <30 jg / ml de la protema transportadora de cada conjugado. Algunas composiciones incluyen una concentracion total del vehfculo de menos de 500 jg / ml por ejemplo , < 400 jg / ml , <300 jg / ml, <200 jg / ml, <100 jg / ml, <5 0jg / ml, etc.

Caracteristicas de las composiciones de la invencion

Ademas de los componentes antigenicos descritos anteriormente, las composiciones de la invencion (tanto antes como despues de la mezcla) generalmente incluiran un componente no antigenico. El componente no antigenico puede incluir vetuculos, adyuvantes, excipientes, tampones, etc. ,como se describe en mas detalle a continuacion.

Las composiciones de la invencion normalmente incluiran uno o mas vetuculos farmaceuticos y/o excipientes. Un transportador tfpico es la solucion salina fisiologica tamponada con fosfato esteril y sin pirogenos. En la referencia 76 se puede encontrar una exhaustiva discusion de excipientes farmaceuticamente aceptables.

Para controlar la tonicidad, es util incluir una sal fisiologica, tal como una sal de sodio. El cloruro sodico (NaCl) es una de estas sales, que puede estar presente a entre 1 y 20 mg/ml.

Las composiciones acuosas (antes y / o despues de la reconstitucion del material liofilizado) tendran generalmente una osmolalidad de entre 200 mOsm / kg y 400 mOsm / kg, por ejemplo entre 240 - 360 mOsm / kg, o dentro del intervalo de 290 - 320 mOsm / kg

Las composiciones de la invencion pueden incluir uno o mas tampones. Entre los tampones tfpicos se incluyen: un tampon fosfato; un tampon Tris; un tampon borato; un tampon succinato; un tampon histidina; o un tampon citrato. Normalmente, los tampones estaran incluidos en el intervalo de 5-20 mM. Tales tampones pueden incluirse en los componentes acuosos y / o liofilizados.

Generalmente, el pH de una composicion acuosa estara entre 5,0 y 7,5, y mas normalmente entre 5,0 y 6,0, para una estabilidad optima o entre 6,0 y 7,0.

Preferentemente, las composiciones de la invencion son esteriles.

Preferentemente, las composiciones de la invencion son apirogenas, por ejemplo que contienen < 1 UE (unidad de endotoxina, una medida estandar) por dosis y, preferentemente, < 0,1 UE por dosis.

Las composiciones de la invencion no tienen gluten.

Algunas vacunas de la invencion no estan adyuvadas. Otras vacunas de la invencion incluyen adyuvante. Las vacunas sin adyuvante se pueden preparar mediante la combinacion de componentes no adyuvados. Las vacunas con adyuvante se pueden realizar mediante la combinacion de varios componentes adyuvados y mediante la combinacion de componentes adyuvados y no adyuvadas o mediante la combinacion de componentes sin adyuvar con un adyuvante.

Cuando los antfgenos se adsorben, una composicion puede ser una suspension con un aspecto turbio. Este aspecto significa que la contaminacion microbiana no se puede ver facilmente y, por tanto, la vacuna contiene, preferentemente, un agente antimicrobiano. Esto es particularmente importante cuando la vacuna esta envasada en recipientes de multiples dosis. Los conservantes utiles para incluir son 2-fenoxietanol y/o timerosal. Se recomienda, sin embargo, no utilizar conservantes de mercurio (por ejemplo, timerosal) cuando sea posible. Se prefiere que las composiciones de la invencion contengan menos de aproximadamente 25 ng / ml de mercurio. Tales conservantes pueden incluirse en los componentes acuosos y / o liofilizados.

La concentracion de cualquier sal de aluminio en una composicion, expresado en terminos de Al3+ es, preferentemente, inferior a 5 mg/ml, por ejemplo < 4 mg/ml, < 3 mg/ml, 2 < mg/ml, < 1 mg/ml, <0,85 mg/ml, etc.

Las composiciones de la invencion pueden administrarse a los pacientes en dosis de 0,5 ml. Se entendera que las referencias a las dosis de 0,5 ml incluyen las variaciones normales, por ejemplo 0,5ml + 0,05 ml.

Adyuvantes

Las composiciones de la invencion pueden incluir un adyuvante, y este adyuvante puede comprender una o mas sales de aluminio, y en particular un adyuvante de fosfato de aluminio y / o un adyuvante de hidroxido de aluminio. Los componentes antigenicos utilizados para preparar las composiciones de la invencion pueden incluir adyuvantes de aluminio antes de usar, se "premezclan" o "preadsorben ■ en el adyuvante (s). Los adyuvantes de aluminio actualmente en uso normalmente se denominan adyuvantes de “hidroxido de aluminio” o “fosfato de aluminio”. No obstante, estos son nombres de consenso, ya que ninguna es una descripcion precisa del compuesto qmmico real

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que esta presente (por ejemplo, vease el capftulo 9 de la referencia 77). La invencion puede utilizar cualquiera de las sales "hidroxido" o "fosfato" que son de uso general como adyuvantes.

Los adyuvantes conocidos como “hidroxido de aluminio” son, normalmente, sales de oxihidroxido de aluminio, que normalmente son, al menos parcialmente, cristalinas. El oxihidroxido de aluminio, que se puede representar con la formula AIO(OH), se puede distinguir de otros compuestos de aluminio, tal como hidroxido de aluminio Al(OH)3, mediante espectroscopia de infrarrojos (IR), en particular mediante la presencia de una banda de adsorcion a 1070 cm-1 y un fuerte hombro a 3090-31o0cm-1 (capftulo 9 de ref. 77).

Los adyuvantes conocidos como “fosfato de aluminio” son, normalmente, sales de hidroxifosfatos de aluminio, que a menudo tambien una pequena cantidad de sulfato. Pueden obtenerse mediante precipitacion y las condiciones de reaccion y las concentraciones durante la precipitacion pueden influir sobre el grado de sustitucion del fosfato por hidroxilo en la sal. En general, los hidroxifosfatos tienen una proporcion molar de PO^Al entre 0,3 y 0,99. Los hidroxifosfatos se pueden distinguir de AIPO4 mediante la presencia de grupos hidroxilo. Por ejemplo, una banda del espectro IR a 3164 cm-1 (por ejemplo, cuando se sella a 200 °C) indica la presencia de hidroxilos estructurales (capftulo 9 de la ref. 77).

La proporcion molar PO4/Al3+ de un adyuvante de fosfato de aluminio estara, en general, entre 0,3 y 1,2, preferentemente entre 0,8 y 1,2, y, mas preferentemente, 0,95 + 0,1. Un adyuvante tipico es hidroxifosfato de aluminio amorfo con una proporcion molar PO4/Al entre 0,84 y 0,92, incluido a 0,6 mg de Al3+/ml. El fosfato de aluminio sera, en general, particulado. Los diametros tipicos de las particulas estan en el intervalo de 0,5-20 |im (por ejemplo, de aproximadamente 5-10 |im) despues de la adsorcion de cualquier antigeno.

El PZC de fosfato de aluminio esta inversamente relacionado con el grado de sustitucion de fosfato por hidroxilo, y este grado de sustitucion puede variar en funcion de las condiciones de reaccion y la concentracion de los reactantes usado para la preparacion de la sal mediante precipitacion. PZC tambien se altera cambiando la concentracion de iones fosfato libres en solucion (mas fosfato= PCZ mas acido) o anadiendo un tampon tal como un tampon de histidina (hace que el PZC sea mas basico). Los fosfatos de aluminio usados de acuerdo con la invencion tendran, en general, un PZC de entre 4,0 y 7,0, mas preferentemente entre 5,0 y 6,5, por ejemplo de aproximadamente 5,7.

Una solucion de fosfato de aluminio usada para preparar una composicion de la invencion puede contener un tampon (por ejemplo, un fosfato o una histidina o un tampon Tris), pero esto no siempre es necesario. La solucion de fosfato de aluminio es, preferentemente, esteril y apirogena. La solucion de fosfato de aluminio puede incluir iones fosfato acuosos libres, por ejemplo presentes a una concentracion entre 1,0 y 20 mM, preferentemente entre 5 y 15 mM, y mas preferentemente de aproximadamente 10 mM. La solucion de fosfato de aluminio puede tambien comprender cloruro sodico. La concentracion de cloruro sodico esta, preferentemente, en el intervalo de 0,1 a 100 mg/ml (por ejemplo, 0,5-50 mg/ml, 1-20 mg/ml, 2-10 mg/ml) y, mas preferentemente, es de aproximadamente 3 + 1 mg/ml. La presencia de NaCl facilita la medicion correcta del pH antes de la adsorcion de antigenos.

Otros antigenos que se pueden incluir

Ademas de incluir conjugado de sacaridos de N. meningitidis y Hib, las composiciones pueden incluir ademas uno o mas antigenos. Por ejemplo , pueden incluir antigenos de otros patogenos, especialmente de bacterias y / o virus. Los antigenos adicionales adecuados pueden seleccionarse a partir de:

un toxoide difterico ("D")

un toxoide del tetanos ("T")

un antigeno de la tos ferina ("P"), que suele ser acelular ("aP") un antigeno de la superficie del virus de la hepatitis B (HBV) ('HBsAg') vacuna antipoliomielftica inactivada (IPV) un antigeno de virus de hepatitis A (HAV) un sacarido capsular de Streptococus pneumoniae Estos antigenos normalmente se originan en el componente acuoso de la invencion.

Toxoide difterico

Corynebacterium diphtheria causa la difteria. La toxina de la difteria se puede tratar (por ejemplo, usando formalina o formaldettido) para eliminar la toxicidad mientras que conserva la capacidad de inducir anticuerpos espedficos anti- toxina despues de la inyeccion. Estos toxoides diftericos se utilizan en vacunas contra la difteria, y se divulgan con mas detalle en el capftulo 13 de la referencia 1. Los toxoides diftericos preferidos son los preparados por tratamiento con formaldettido. El toxoide de la difteria se puede obtener mediante el cultivo de C. diphtheriae en medio de

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crecimiento (por ejemplo, medio Fenton, o medio Linggoud y Fenton), que puede suplementarse con extracto de bovino, seguido de tratamiento formaldehtido, ultrafiltracion y precipitacion. El material toxoide puede tratarse despues mediante un proceso que comprende la filtracion y / o dialisis esteril.

Las cantidades del toxoide de la difteria pueden expresarse en unidades internacionales (UI). Por ejemplo, el NIBSC suministra el 'Diphtheria Toxoid Adsorbed Third International Standard 1999' [78,79], que contiene 160 UI por ampolla. Como una alternativa al sistema de UI, la unidad 'Lf ("unidades de floculacion" o la "dosis de floculacion") se define como la cantidad de toxoide que, cuando se mezcla con una Unidad Internacional de antitoxina, produce una mezcla optima de floculacion [ 80]. Por ejemplo , el NIBSC suministra 'toxoide difterico, sencillo"[8l] , que contiene 300 LF por ampolla, y tambien suministra' “el primer reactivo de referencia internacional para el toxoide difterico para el ensayo de floculacion” '[82] , que contiene 900 LF por ampolla.

Las composiciones incluyen tipicamente entre 20 y 80 Lf de toxoide de la difteria, tipicamente aproximadamente 50 Lf.

Por mediciones de UI, las composiciones incluiran tipicamente al menos 30 UI / dosis.

El toxoide de la difteria se adsorbe utilmente sobre un adyuvante de hidroxido de aluminio.

Toxoide del tetanos

Clostridium tetani causa el tetanos. La toxina del tetano puede tratarse para dar un toxoide protector. Los toxoides se utilizan en vacunas contra el tetanos, y se divulgan con mas detalle en el captiulo 27 de la referencia 1. Los toxoides del tetanos preferidos son los preparados por tratamiento con formaldehtido. El toxoide del tetanos se puede obtener cultivando C. tetani en medio de crecimiento (por ejemplo, un medio Latham derivado de casema bovina), seguido de tratamiento con formaldefndo, ultrafiltracion y precipitacion. El material puede tratarse despues mediante un proceso que comprende la filtracion y / o dialisis esteril.

Las cantidades del toxoide del tetanos pueden expresarse en unidades internacionales (UI). Por ejemplo, el NIBSC suministra el 'Tetanus Toxoid Adsorbed Third International Standard 2000' [83,84], que contiene 469 UI por ampolla. Como una alternativa al sistema de UI, la unidad 'Lf' ("unidades de floculacion" o la "dosis de floculacion") se define como la cantidad de toxoide que, cuando se mezcla con una Unidad Internacional de antitoxina, produce una mezcla optima de floculacion [ 80]. Por ejemplo, el NIBSC proporciona el Primer reactivo de referencia internacional para el toxoide del tetanos para el ensayo de floculacion' [85] que contiene 1000 LF por ampolla.

Las composiciones incluiran tipicamente entre 5 y 50 Lf de toxoide de la difteria, tipicamente aproximadamente 50 Lf.

Por mediciones de UI, las composiciones incluiran tipicamente al menos 40 UI / dosis.

El toxoide del tetanos puede estar adsorbido en un adyuvante de hidroxido de aluminio, pero esto no es necesario (por ejemplo, se puede usar adsorcion de entre el 0-10 % del toxoide del tetanos total).

Antigenos de la tos ferina

Bordetella pertussis provoca la tos ferina. Los antigenos de Pertussis en las vacunas son celulares (celulas enteras, en forma de celulas de B. pertussis inactivadas) o acelulares. La preparacion de antigenos de pertussis celulares esta bien documentado [por ejemplo, vease el captiulo 21 de ref. 1] por ejemplo, se puede obtener mediante inactivacion por calor de cultivo en fase I de B. pertussis. Como una alternativa, sin embargo, se pueden usar antigenos acelulares.

Cuando se usan antigenos acelulares, se prefiere utilizar uno, dos o (preferiblemente) tres de los siguientes antigenos: (1) toxina pertussis destoxificada (toxoide de pertussis, o 'TP'); (2) hemaglutinina filamentosa ("FHA"); (3) pertactina (tambien conocida como la “protema de membrana externa de 69 kiloDalton '). Estos tres antigenos se preparan preferiblemente por aislamiento de cultivo de B. pertussis en crecimiento en medio tiquido Stainer-Scholte modificado. TP y FHA pueden aislarse del caldo de fermentacion (por ejemplo, por adsorcion en gel de hidroxiapatita), mientras que la pertactina se pueden extraer de las celulas por tratamiento termico y floculacion (por ejemplo, utilizando cloruro de bario). Los antigenos pueden purificarse en etapas cromatograficas y/o de precipitacion sucesivas. TP y FHA pueden purificarse mediante, por ejemplo , cromatogratia hidrofobica, cromatogratia de afinidad y cromatogratia de exclusion por tamano. La pertactina puede purificarse mediante, por ejemplo, cromatogratia de intercambio ionico, cromatogratia hidrofoba y cromatogratia de exclusion por tamano. FHA y pertactina se pueden tratar con formaldehtido antes de usar de acuerdo con la invencion. TP puede destoxificarse mediante tratamiento con formaldehtido y / o glutaraldehtido. Como alternativa a este procedimiento de destoxificacion qmmica, la TP puede ser un mutante de TP en el que la actividad enzimatica se ha reducido mediante mutagenesis [86], pero la desintoxicacion mediante tratamiento qmmico es mas usual.

Los antigenos de pertussis acelulares pueden ser adsorbidos sobre uno o mas adyuvantes de sales de aluminio. Como alternativa, se pueden anadir en un estado no adsorbido. Cuando se anade pertactina, preferentemente ya se

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ha adsorbido sobre un adyuvante de hidroxido de aluminio. PT y FHA pueden ser adsorbidos sobre un adyuvante de hidroxido de aluminio o un fosfato de aluminio. La adsorcion de todos TP, FHA y pertactina al hidroxido de aluminio es util.

Las composiciones incluiran tfpicamente: 1-50 |ig/dosis de TP; 1-50 |ig / dosis de FHA; y 1-50 |ig de pertactina.

Ademas de TP, FHA y pertactina, es posible incluir fimbrias (por ejemplo, los aglutinogenos 2 y 3) en una vacuna contra la tos ferina acelular.

Antiaeno de superficie del virus de la hepatitis B.

El virus de la hepatitis B (HBV) es uno de los agentes conocidos que causa hepatitis viral. El virion del HBV consta de un nucleo interno rodeado por una protema externa o capsida, y el nucleo viral contiene el genoma de ADN del virus. El componente principal de la capsida es una protema conocida como antfgeno de superficie del HBV o, mas habitualmente, 'HBsAg', que normalmente es un polipeptido de 226 aminoacidos con un peso molecular de -24 kDa. Todas las vacunas para la hepatitis B existentes contienen HBsAg y, cuando este antigeno se administra a un vacunado normal, estimula la produccion de anticuerpos anti-HBsAg, que protegen contra la infeccion por HBV.

Para la fabricacion de vacunas, el HBsAg se ha realizado de dos modos: El primer procedimiento implica purificar el antfgeno en forma particulada a partir del plasma de portadores de hepatitis B cronica, ya que se sintetizan grandes cantidades de HBsAg en el hugado y se liberan en la corriente sangumea durante una infeccion del HBV. El segundo modo implica expresar la protema mediante procedimientos de ADN recombinante. El HBsAg para usar con el procedimiento de la invencion se expresa, preferentemente, de forma recombinante en celulas de levadura. Las levaduras adecuadas incluyen, por ejemplo, los huespedes Saccharomyces (como S. cerevisiae) o Hanensula (como H .polymorpha).

El HBsAg esta preferiblemente no glicosilado. Al contrario que el HBsAg nativo (es decir, como en el porducto purificado de plasma), el HBsAg que se expresa en levaduras esta, en general, no glicosilado y esta es la forma mas preferida de HBsAg para uso con la invencion, porque es altamente inmunogeno y puede prepararse sin el riesgo de contaminacion del producto sangumeo.

El HBsAg estara generalmente en forma de partmulas sustancialmente esfericas (diametro promedio de aproximadamente 20 nm), incluida una matriz lipfdica que comprende fosfolfpidos. Las partmulas de HBsAg expresado en levaduras puede incluir fosfatidinilinositol, que no es encuentra en los viriones de HBV naturales. Las partmulas pueden tambien incluir una cantidad no toxica de LPS con el fin de estimular el sistema inmunitario [87]. El HBsAg preferido esta en la forma de partmulas que incluyen una matriz lipfdica que comprende fosfolfpidos, fosfatidilinositol y polisorbato 20.

Todos los subtipos conocidos de HBV contienen el determinante comun 'un'. Combinado con otros determinantes y subdeterminantes, se han identificado nueve subtipos: aywl, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq- y adrq+. Ademas de estos subtipos, han emergido otras variantes, como mutantes de HBV que han sido detectados en individuos inmunizados ("mutantes de escape"). El subtipo de HBV habitual con la invencion es el subtipo adw2.

Ademas de la secuencia "S”, un antfgeno de superficie puede incluir toda o parte de una secuencia pre-S, tal como toda o parte de una secuencia pre-S1 y/o pre-S2.

Las cantidades de HBsAg se expresan tfpicamente en microgramos, y una cantidad tfpica de HBsAg por dosis de vacuna es de entre 5 y 5 |ig por ejemplo 10 |jg / dosis.

Aunque el HBsAg puede estar adsorbido a un adyuvante de hidroxido de aluminio en la vacuna final (como en el conocido producto ENGERIX-B ), o puede permanecer no adsorbido, por lo general estara adsorbido a un adyuvante de fosfato de aluminio [88].

Vacuna inactivada contra el virus de la polio

El virus de la polio causa la poliomielitis. En lugar de usar la vacuna contra el poliovirus oral, la invencion puede usar IPV, como se divulga con mas detalle en el capftulo 24 de la referencia 1.

Los poliovirus pueden cultivarse en cultivo celular y un cultivo preferido usa una lmea celular Vero, derivada de rinon de mono. Las celulas Vero pueden cultivarse de manera conveniente en microvehmulos. Despues del crecimiento, los viriones pueden purificarse mediante tecnicas tales como ultrafiltracion, diafiltracion y cromatograffa. Antes de la administracion a los pacientes, los virus de la polio deben ser inactivados y esto se puede lograr mediante tratamiento con formaldehfdo.

La poliomielitis puede estar causada por uno de tres tipos de poliovirus. Los tres tipos son similares y causan smtomas identicos, pero son antigenicamente muy diferentes y la infeccion por un tipo no protege contra la infeccion por los otros. Se prefiere, por lo tanto, usar tres antfgenos de poliovirus en la invencion: poliovirus de Tipo 1 (por ejemplo, cepa Mahoney) , poliovirus de Tipo 2 (por ejemplo, cepa MEF-1) y poliovirus de Tipo 3 (por ejemplo cepa

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Saukett). Los virus preferiblemente se cultivan, purifican e inactivan individualmente y despues se combinan para dar una mezcla trivalente a granel para el uso con la invencion.

Las cantidades de IPV se expresan tipicamente en la unidad 'UD' (la "unidad de D-antigeno" [89]). Es habitual usar entre 1-100 UD por tipo viral por dosis, por ejemplo, aproximadamente 80 UD del poliovirus de Tipo 1, aproximadamente 16 UD del poliovirus de Tipo 2, y aproximadamente 64 UD de poliovirus de tipo 3.

Los antigenos de poliovirus estan preferiblemente no adsorbidos a ningun adyuvante de sal de aluminio antes de ser usados para hacer las composiciones de la invencion, pero se pueden volver adsorbidos en adyuvante(s) de aluminio en la composicion de la vacuna durante el almacenamiento.

Antigenos del virus de la hepatitis A

El virus de la hepatitis A (VHA) es uno de los agentes conocidos que causa hepatitis viral. Las vacunas contra el VHC se divulgan en el capftulo 15 de la referencia 1. Un componente util del VHA se basa en el virus inactivado, y la inactivacion se puede lograr mediante tratamiento con formalina. Los virus pueden cultivarse en fibroblastos diploides de pulmon embrionario humano, tales como celulas MRC-5. Una cepa util del VHA es HM175, aunque tambien se puede utilizar CR326F. Las celulas pueden cultivarse en condiciones que permitan el crecimiento viral. Las celulas se lisan y la suspension resultante pueden purificarse mediante ultrafiltracion y cromatogratia de permeacion en gel.

La cantidad de antigeno del VHA medida en UE (Unidades ELISA), es tipicamente al menos aproximadamente 500 UE / ml.

Sacaridos neumococicos

Los antigenos neumococicos conjugados comprenden antigenos sacaridos capsulares de Streptococcus pneumoniae conjugados con protemas vedculo [por ejemplo, referencias 90 a 92]. Es normal para incluir sacaridos de mas de un serotipo de S. pneumoniae: las mezclas de polisacaridos de 23 serotipos diferentes se utilizan ampliamente, como son vacunas conjugadas con polisacaridos de entre 5 y 11 serotipos diferentes [93]. Por ejemplo, PREVNAR™ [94] contiene antigenos de siete serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, y 23F) con cada sacarido conjugado individualmente con CRM197 mediante aminacion reductora, con 2 |ig de cada sacarido por dosis de 0,5 ml (4 |ig de serotipo 6B).

Las composiciones de la invencion pueden incluir antigenos sacaridos para al menos los serotipos 6B, 14, 19F y 23F. Los serotipos adicionales se pueden seleccionar de: 1, 3, 4, 5, 7F, 9V y 18C. La cobertura de los serotipos neumococicos heptavalentes (como en PREVNAR™), nonavalentes (por ejemplo los 7 serotipos de PREVNAR, mas 1 y 5), decavalentes (por ejemplo los 7 serotipos de PREVNAR, mas 1, 5 y 7F) y undecavalentes (por ejemplo, los 7 serotipos de PREVNAR, mas 1, 3, 5, y 7F) es particularmente util.

Tfpicamente, una composicion incluira entre 1 |jg y 20 |jg (medido como sacarido) por dosis de cada serotipo que este presente.

General

El termino “que comprende" abarca (que incluye” ademas de “constituido por”, por ejemplo una composicion “que comprende” X puede estar constituido solo por X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X + Y.

La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo, una composicion que esta “sustancialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra “sustancialmente” puede omitirse de la definicion de la invencion.

El termino “aproximadamente” en relacion con un valor numerico x significa, por ejemplo, x ± 10%.

A menos que se indique espedficamente, un procedimiento que comprende una etapa de mezclar dos o mas componentes no requiere ningun orden espedfico de mezcla. Por tanto, los componentes se pueden mezclar en cualquier orden. Cuando hay tres componentes, dos componentes se pueden combinar entre sf y, despues, la combinacion puede combinarse con el tercer componente, etc.

Las concentraciones de los conjugados se definen en el presente documento en terminos de masa de sacarido, con el fin de evitar la variacion debida a la eleccion del vedculo.

Cuando un antigeno se describe como “adsorbido” en un adyuvante, se prefiere que al menos el 50 % (en peso) de dicho antigeno se adsorbe, por ejemplo el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o mas. Se prefiere que el toxoide de la difteria y el toxoide del tetanos sean ambos totalmente adsorbidos, es decir, ninguno es detectable en el sobrenadante. Tambien se prefiere la adsorcion total de HBsAg.

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Cuando se usan materiales animales (y particularmente bovinos) en el cultivo de celulas, deberan obtenerse de fuentes que esten libres de encefalopatias espongiformes transmisibles (EST) y, en particular, libres de encefalopatfa espongiforme bovina (EEB).

Modos para realizar la invencion

Los conjugados de sacarido meningococico se han preparada como se describe en la referencia 22. Los conjugados de cada uno de los serogrupos A, C, W135 e Y se han combinado sin adyuvante para dar una mezcla meningococica conjugada tetravalente. Esta mezcla puede ser liofilizada en presencia de un estabilizador, tal como una mezcla sacarosa / manitol, para dar un componente meningococico liofilizado que se puede reconstituir cuando sea necesario en el futuro. El material liofilizado se llena en viales, en una cantidad que proporcionara 5 |jg de cada sacarido (10 jg de serogrupo A) despues de la reconstitucion.

La vacuna HIBTITER ™ (Wyeth) y Liquid PedvaxHIB ™ se compran. La vacuna HIBTITER™ no esta adyuvada, mientras que Liquid PedvaxHIB ™ contiene un adyuvante de sal de aluminio. Ambas vacunas se suministran en viales de vidrio.

El contenido de un vial de vidrio se extraen en una jeringuilla a traves de una aguja y se inyectan en un vial que contiene material liofilizado. Despues de mezclado suave, el contenido se eliminan a traves de una aguja en una jeringuilla nueva. La aguja de la jeringuilla se reemplaza con una aguja de inyeccion y la vacuna reconstituida se inyecta en un sujeto de ensayo.

En los estudios iniciales de los animales, se utilizan ocho grupos de diez ratones CD1. El grupo 1 recibe una vacuna conjugada de MenACWY preparada mediante la mezcla del conjugado MenA liofilizado con una mezcla de MenCWY lfquido, tal como se describe en la referencia 22. El Grupo 2 recibe una vacuna de MenACWY preparada mediante la reconstitucion acuosa de MenACWY liofilizado. Grupos 3 a 5 reciben la misma vacuna en el grupo 2, pero reconstituido con: (3) un conjugado Hib-OMPC con adyuvante de aluminio sulfato hidroxifosfato, por ejemplo PEDVAXHIB™; (4) un conjugado de CRM197-Hib adsorbido en fosfato de aluminio; o (5) un conjugado CRM197-Hib no adsorbido, por ejemplo HIBTITER™. Estas tres vacunas de Hib lfquidas se administran sin conjugados meningococicos a los grupos 6 a 8 para que coincida con los grupos 3 a 5, respectivamente. Las vacunas se administran por via subcutanea en volumenes de 200 jl los dfas 0, 14 y 28. Las dosis son 1 jg de sacarido de MenCWY, 2 jg de sacarido MenA y 2,5 jg de sacarido Hib. Los sueros extrafdos los dfas 0, 28 y 42 se analizan para determinar su actividad bactericida contra las cepas de meningococo y para las respuestas anti-PRP. En las variantes de estos experimentos, el grupo 4 recibe un conjugado CRM197-Hib que esta adyuvado pero no adsorbido en fosfato de aluminio

En el estudio SS-07-02, los resultados de inmunogenicidad despues de tres dosis fueron los siguientes, expresados como el % de respondedores para los cinco conjugados y tambien, para los conjugados meningococicos, como los tttulos medios geometricos (GMT).

MenA MenC MenW135 MenY Hib

MGT % MGT % MGT % MGT % %

1

272 100 154 100 146 100 111 100 -

2

656 100 239 100 106 100 233 100 -

3

1882 100 1533 100 1380 100 530 100 37,5

4

116 87,5 205 100 231 100 91 87.5 87,5

5

111 100 70 87,5 66 75 38 75 75

6

- - - - - - - - 50

7

- - - - - - - - 62,5

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- - - - - - - - 50

Por tanto, la combinacion de Hib lfquido con MenACWY liofilizado puede dar una composicion que conserva la eficacia contra las cinco bacterias. Se ven buenos resultados en el grupo 3 (reconstitucion con un conjugado de Hib lfquido con un adyuvante de sulfato de hidroxifosfato de aluminio) y el grupo 4 (reconstitucion con un conjugado Hib de lfquido con un adyuvante de fosfato de aluminio). El Grupo 3 dio los tftulos de anti-meningococicos mas altos, con 100 % respondedores contra todos los serogrupos, pero solo tuvo un modesto numero de respondedores al antfgeno

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Hib. La mejor respuesta anti-Hib se observo en el grupo 4, y las respuestas anti-meningococicas tambien fueron razonables, en particular contra el serogrupo W135 [3].

Los grupos 3 y 4 tambien mostraron buenas respuestas inmunes despues de dos dosis (datos no mostrados) y las respuestas anti-MenY, en particular, fueron mas altas en estos dos grupos que en los grupos 1, 2 o 5 (tanto en terminos de GMT como de % de respondedores). El grupo 4 mostro los tftulos anti-meningococicos mas altos despues de 2 dosis con 100 % respondedores contra todos los serogrupos.

En los grupos 4 y 5, la presencia de los conjugados meningococicos aumento las respuestas inmunes contra el sacarido Hib (comparese el grupo 8 con el grupo 5, y el grupo 7 con el grupo 4). En los grupos 3 y 4, en los que el antfgeno Hib lfquido estaba adyuvado, la presencia del conjugado de Hib aumento los tftulos anti-W135 (en comparacion con el grupo 2), pero esta mejora no se observo en el grupo 5, usando Hib sin adyuvar.

En experimentos paralelos, los conjugados se reconstituyeron utilizando una emulsion de escualeno en agua (MF59). Tres grupos (9 a 11) recibieron: 9) conjugados MenACWY liofilizados, (10) un conjugado CRM197-Hib o

(11) una mezcla de los dos. Los resultados de inmunogenicidad despues de 3 dosis fueron los siguientes:

MenA MenC MenW135 MenY Hib

MGT % MGT % MGT % MGT % %

2 y 8

656 100 239 100 106 100 233 100 50

9

1011 100 501 100 423 100 501 100 -

10

- - - - - - - - 87,5

11

1470 100 600 100 640 100 374 100 100

Por tanto, la emulsion de escualeno en agua mejora la eficacia de los conjugados meningococicos y de Hib, con la combinacion de MenACWY + Hib + emulsion ofrecen una excelente inmunogenicidad.

Los estudios de estabilidad en los conjugados de sacaridos de Hib y MenA en los productos combinados 4 y 5 tambien se realizaron mediante RMN en un penodo de 24 horas a temperatura ambiente. Ambos de estos sacaridos contienen enlaces fosfodiester y, por tanto, son susceptibles a la descomposicion hidrolttica durante el almacenamiento en forma acuosa. Despues de la reconstitucion de la mezcla de MenA-CWY liofilizada con Hib lfquido, sin embargo, los sacaridos tanto MenA como Hib permanecieron completamente estables en presencia o ausencia de un adyuvante de fosfato de aluminio, sin despolimerizacion detectable.

Debe entenderse que la invencion se ha descrito unicamente a modo de ejemplo y que se pueden realizar modificaciones permaneciendo dentro del alcance de la invencion reivindicada.

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Claims (19)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un kit que comprende: (i) un componente acuoso, que comprende un conjugado de un sacarido capsular de Haemophilus influenzae de tipo B a una concentracion en el intervalo de 0,5 |ig/ml a 50 |ig/ml, y (ii) un componente liofilizado, que comprende conjugados de sacaridos capsulares de Neisseria meningitidis de los serogrupos meningococicos A, C, W135 e Y, en el que la cantidad de los sacaridos meningococicos por serogrupo esta entre 1 |ig y 20 |ig.
2. 2. Un procedimiento para preparar una vacuna combinada, que comprende la etapa de combinar (i) un componente acuoso, que comprende un conjugado de un sacarido capsular de Haemophilus influenzae de tipo B a una concentracion en el intervalo de 0,5 |ig/ml a 50 |ig/ml, y (ii) un componente liofilizado, que comprende conjugados de sacaridos capsulares de Neisseria meningitidis de los serogrupos meningococicos A, C, W135 e Y, en el que la cantidad de los sacaridos meningococicos por serogrupo esta entre 1 mg y 20 |ig.
3. 3. Una vacuna combinada que comprende: (i) un sacarido capsular conjugado de Haemophilus influenzae de tipo B a una concentracion en el intervalo de 0,5 |ig/ml a 50 |ig/ml; y (ii) conjugados de sacaridos capsulares de Neisseria meningitidis de los serogrupos A, C, W135 e Y meningococicos, preparados mediante la combinacion de un conjugado de H.i nfluenzae y conjugados liofilizados de N. meningitidis, en el que la cantidad de los sacaridos meningococicos por serogrupo esta entre 1 |ig y 20 |ig.
4. 4. El kit, el procedimiento o la vacuna de cualquier reivindicacion precedente, en el que el componente acuoso incluye un adyuvante.
5. 5. El kit, el procedimiento o la vacuna de cualquier reivindicacion precedente, en el que el conjugado de H. influenzae conjugado es adsorbido en fosfato de aluminio.
6. 6. El kit, el procedimiento o la vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el componente acuoso no esta adyuvado.
7. 7. El kit, el procedimiento o la vacuna de cualquier reivindicacion precedente, en el que la administracion del conjugado de H. influenzae da lugar a una concentracion de anticuerpo anti-PRP en un paciente de >0,15 |ig/ml.
8. 8. El kit, el procedimiento o la vacuna de cualquier reivindicacion precedente, en el que el sacarido de H. influenzae se conjuga a una protema transportadora seleccionada del grupo que consiste de CRM197, toxoide del tetanos y el complejo de membrana externa de N. meningitidis.
9. 9. El kit o procedimiento de cualquier reivindicacion precedente, en el que el componente acuoso comprende uno o mas de: un toxoide de la difteria, un toxoide del tetanos, el antfgeno(s) de tos ferina acelular, los antfgenos inactivados del virus de la polio, el antfgeno de la superficie del virus de la hepatitis B, y / o el sacarido neumococico.
10. 10. El kit, el procedimiento o la vacuna de cualquier reivindicacion precedente, en el que la administracion del o los conjugados de N. meningitidis da como resultado una respuesta de anticuerpos bactericida.
11. 11. El kit, el procedimiento o la vacuna de cualquier reivindicacion precedente, en el que el sacarido capsular de Haemophilus influenzae de tipo B y los sacaridos capsulares de Neisseria meningitidis estan conjugados con una toxina o toxoide bacteriano.
12. 12. El kit, el procedimiento o la vacuna de cualquier reivindicacion precedente, en el que el o los sacaridos de N. meningitidis esta / estan conjugados a una protema transportadora seleccionada del grupo que consiste en CRM197, toxoide de la difteria y toxoide del tetanos.
13. 13. El kit, el procedimiento o la vacuna de cualquier reivindicacion precedente, en el que el componente liofilizado incluye un estabilizante.
14. 14. El kit, el procedimiento o la vacuna de cualquier reivindicacion precedente, en el que el componente liofilizado incluye un adyuvante.
15. 15. El kit, el procedimiento o la vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el componente liofilizado no incluye adyuvante.
16. 16. El kit, el procedimiento o la vacuna de cualquier reivindicacion precedente, en el que el componente liofilizado no incluye un sacarido de Hib.
17. 17. . La vacuna de cualquier reivindicacion precedente, que incluye uno o mas tampones.
18. 18. La vacuna de cualquier reivindicacion precedente, en el que la vacuna comprende uno o mas de: un toxoide de la difteria, un toxoide del tetanos, el antfgeno(s) de tos ferina acelular, los antigenos inactivados del virus de la polio, el antfgeno de la superficie del virus de la hepatitis B, y / o el sacarido neumococico.
19. 19. La vacuna de cualquier reivindicacion precedente para usar como medicamento.