CN1709505A - 多价细菌荚膜多糖－蛋白质结合物联合疫苗 - Google Patents
多价细菌荚膜多糖－蛋白质结合物联合疫苗 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1709505A CN1709505A CN 200510083042 CN200510083042A CN1709505A CN 1709505 A CN1709505 A CN 1709505A CN 200510083042 CN200510083042 CN 200510083042 CN 200510083042 A CN200510083042 A CN 200510083042A CN 1709505 A CN1709505 A CN 1709505A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- group
- polysaccharide
- capsular polysaccharide
- protein
- meningitis cocci
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及一种多价细菌荚膜多糖－蛋白质结合物联合疫苗制剂，特别是一种含A群、C群、Y群、W135群流行性脑脊髓膜炎球菌荚膜多糖－蛋白质结合物和b型嗜血流感杆菌荚膜多糖－蛋白质结合物的联合疫苗。
Description
技术领域：
本发明涉及一种多价细菌荚膜多糖与蛋白质共价结合物的联合疫苗制剂，特别是一种含A群、C群、Y群、W135群流行性脑脊髓膜炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物和b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-蛋白质结合物的联合疫苗。
背景技术：
流行性脑脊髓膜炎是一种具有悠久历史的人类传染性疾病，流行地域极广，遍及全球各大洲，至今仍未得到有效的控制。该病的病原体——脑膜炎奈瑟氏球菌只感染人类，人与人之间通过飞沫或分泌物直接传染，通常情况下，这种接触使对方成为一个健康带菌者，根据年龄和环境的不同，10-50％的人可成为带菌者。在人体抵抗力下降及特定环境影响下，脑膜炎奈瑟氏菌可以侵入血流，继而发病，通常发生在接触该菌后的一周内。该病来势非常凶猛，伴有严重脑膜感染的综合症状；严重的全身症状主要有败血症、休克、出血、紫癜、弥散性血管内凝血或内脏出血，病死率较高，尽管抗生素有较好的治疗效果，病死率仍维持在5～10％之间。
脑膜炎奈瑟氏菌是引起流行性脑脊髓膜炎(以下简称脑膜炎球菌)的病原菌，根据其荚膜多糖的特异性可将脑膜炎球菌分成A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y和Z13个血清群，所有血清群的细菌均可致病，但A、B、C、Y和W135毒力最强，上述5个血清群占病例数的95％以上，其中A群、C群传染性最强，是引起脑膜炎流行最常见的菌株。
A群流行性脑脊髓膜炎球菌荚膜多糖疫苗是第一个用于预防A群流行性脑脊髓膜炎球菌感染的疫苗，应用以后使A群流行性脑脊髓膜炎的发病率及病死率得以大幅度的降低。
A群脑膜炎球菌荚膜多糖疫苗研制成功之后，相继研制出了A/C群脑膜炎球菌荚膜多糖双价疫苗以及含A、C、Y、W135群四价脑膜炎球菌荚膜多糖成分的联合疫苗。由于各国均以A群脑膜炎球菌、C群脑膜炎球菌流行为主，因此，目前各国使用的疫苗主要为A群脑膜炎球菌荚膜多糖疫苗、或A/C群脑膜炎球菌荚膜多糖疫苗等。
b型嗜血流感杆菌(Hib)是引起儿童细菌性脑炎、肺炎、蜂窝组织炎等疾病的主要病原体。在使用有效的疫苗前，美国每年有1.6～2.5万多名儿童因Hib引起感染；其中60％的儿童患上最严重的Hib感染并发症——细菌性脑炎。其中10％因脑炎致死，许多幸存者则造成严重的永久性功能丧失。其他感染包括菌血症、肺炎、脓胸、心包炎、蜂窝组织炎、脓毒性关节炎及会咽炎等。1988～1991年期间，最初获准对大婴幼儿进行Hib结合疫苗接种，以后又获准对小婴幼儿进行接种，使Hib侵袭性疾病及相关的发病率及死亡率明显减少。过去几年里，Hib疾病患病人数降低了95％，美国疾病控制及预防中心将5岁以下儿童的Hib疾病作为一种可采用疫苗加以控制的疾病，并计划1996年消除；到1997年7月，该目标已接近实现但尚未完全达到。值得说明的是，在对18个月龄以下儿童广泛使用疫苗前，Hib疾病发病率已开始下降。其可能是由于接种Hib结合疫苗降低了较大儿童的无症状携带率，而导致了18个月龄以下儿童的感染风险降低。这种“群体免疫”作用所达到的效果是使用疫苗前未预料到的，Hib结合疫苗的成功免疫，为研究及预防由其他含多糖荚膜的细菌引起的感染提供了可借鉴的经验。
作为结合疫苗的载体，必须选择安全有效的蛋白质。这种蛋白质必须对人体没有毒性，也不会引起变态反应，同时又能增强多糖的免疫原性，因此可供选择的种类并不多。目前使用的载体主要为微生物来源的蛋白质，例如现成的白喉和破伤风类毒素，经基因突变发生减毒的白喉毒素(CRM-197)以及细菌的外膜蛋白质等，而且已经用于临床。蛋白质载体也可以源于与多糖同一菌种的致病菌，例如b型嗜血流感杆菌荚膜多糖偶联疫苗可以用该菌的外膜蛋白质作为载体；肺炎球菌荚膜多糖偶联疫苗可以用肺炎球菌的溶血素蛋白质作为载体，其优点是能具有对不同型别的肺炎球菌感染有交叉免疫保护效果。还有一些细菌的毒素蛋白质也可作为载体，例如霍乱毒素、霍乱毒素的B亚单位和大肠杆菌的不耐热肠毒素，因为它们同时还具有佐剂的效应。另外还有绿脓杆菌的外毒素A、P6和一些高分子外膜蛋白质，以及不相关的蛋白质如人血清蛋白等，但是这些蛋白质载体仍处于动物实验阶段，尚未用于临床。
至今已经研制成功多种不同的单价细菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗及7价肺炎球菌荚膜多糖-CRM197白喉类毒素结合疫苗。结合疫苗具有以下一些特点：(1)能增强婴幼儿对细菌荚膜多糖的免疫反应，这主要是由于结合疫苗能激活T辅助性淋巴细胞和形成T记忆细胞，重复接种能产生记忆性免疫增强作用，使主要为IgG的抗细菌荚膜多糖抗原的抗体水平剧增，对婴幼儿接种后能产生较为持久的免疫保护力。(2)细菌的多糖-蛋白质结合疫苗可成为二价疫苗。这是因为结合疫苗可同时产生针对多糖和蛋白质载体的抗体反应。(3)能增强老年人和某些免疫功能低下或有缺陷的病人对细菌荚膜多糖抗原的免疫反应。例如肺炎是老年人的常见病，肺炎球菌荚膜多糖和蛋白质的结合疫苗可以增强疫苗对老年人的免疫保护力。结合疫苗也可使一些缺乏对细菌荚膜多糖抗原产生免疫反应的个体产生高效价的抗多糖抗原的抗体。(4)结合疫苗具有载体蛋白质的效应。事先或同时接种蛋白质载体会刺激T淋巴细胞的增殖，因而能增强结合疫苗的免疫原性。
中国专利ZL 02159032.X公开了一种多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，主要涉及A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖与多种蛋白质载体的偶联与纯化方法及疫苗的配制方法，该专利所述的多糖-蛋白结合疫苗的价数为3价多糖，不含Y群、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗。
发明内容：
本发明提供了一种含A群，C群，Y群和W135群脑膜炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物以及b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-蛋白结合物的联合疫苗制剂。
本发明的联合疫苗制剂，由上述5种多糖-蛋白结合物混合制备的，其中5种结合物混合的重量比例在1∶0.5～2.5之间，优选的为1∶1-2之间，更优选的为1∶1，其中，重量比例是按多糖计算的，每一单位给药剂量的制剂中含有A群，C群，Y群和W135群脑膜炎球菌荚膜多糖以及b型嗜血流感杆菌荚膜多糖的量在5-25μg之间，所述每一单位给药剂量是指每次用量的制剂量，或每一制剂单位如注射剂1支中内容物的量。而本发明的制剂优选的为注射用的制剂，如粉针剂或水针剂。可皮下或肌肉注射。
本发明的联合疫苗制剂，其中的蛋白载体选自破伤风类毒素、白喉类毒素、人血清免疫球蛋白、B群流行性脑脊髓膜炎球菌外膜蛋白等。
本发明的联合疫苗制剂，其中多糖与蛋白载体的结合是以多糖用溴化氰或硼氰酸钠活化，然后与己二酰肼或其他同功能的化合物反应，在碳二亚胺的作用下与蛋白载体共价结合。
本发明的联合疫苗制剂，其特征在于，还可含有氢氧化铝或磷酸铝作为佐剂，加入量为0.10～1.5mg铝佐剂/每剂。其中每剂指每一单位给药剂量的制剂。
本发明的联合疫苗制剂，其特征在于，制剂中还可含有其他已知的可提高机体免疫的人细胞因子如GM-CSF、IL-2、IL-12、或单磷脂A、或胞壁酰二肽或其衍生物等，或与它们结合使用可提高机体免疫力。
本发明也可以用人血清IgG作为载体蛋白制备结合疫苗，其所含的蛋白载体——IgG的Fc片段可与人体内抗原呈递细胞表面的Fc受体结合，使其主动吞噬并处理抗原，增强多糖抗原的免疫原性。
本发明的联合疫苗可以和目前市售的多种含铝佐剂疫苗如氢氧化铝/磷酸铝吸附白喉-百日咳-破伤风疫苗、基因重组乙型肝炎疫苗、破伤风类毒素疫苗等混合使用。
本发明的联合疫苗制剂，可通过以下制备工艺制备：
多糖原料：选用A、C、Y、W135群脑膜炎球菌菌种、b型嗜血流感杆菌菌种经过发酵培养生产出A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖，其纯化步骤可以为目前通用的常规步骤，也可以采用本发明所述的大孔合成树脂精制细菌荚膜多糖的方法，该方法是，用聚苯乙烯/聚甲基丙烯酸酯大孔合成树脂吸附粗制多糖溶液中的色素、蛋白质及核酸类污染物，再以蛋白变性剂苯酚除去多糖溶液中残留的不能被大孔树脂吸附的微量蛋白，其中苯酚的用量为目前世界卫生组织推荐工艺的1/4至1/10。
载体蛋白原料：精制破伤风类毒素系用破伤风梭状芽孢杆菌菌种，在适宜的培养基中培养产生的毒素经甲醛脱毒、精制而成；其方法为常规制备方法。
精制白喉类毒素系用白喉杆菌菌种，在适宜的培养基中培养产生的毒素经甲醛脱毒、精制而成。其方法为常规制备方法。
人血清IgG系市售的静脉注射用生物制品，可以从市场上买到。
制备方法：经过活化的多糖原料和载体蛋白原料在碳二亚胺的作用下，通过共价键结合，形成多糖-蛋白结合物。具体是：A群流行性脑膜炎球菌荚膜多糖、C群流行性脑膜炎球菌荚膜多糖、Y群流行性脑膜炎球菌荚膜多糖、W135群流行性脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖分别与蛋白结合，制备各自的多糖-蛋白结合物原液，其方法为常规制备方法。然后，再按本发明规定的比例混合，制备多糖-蛋白结合疫苗。根据需要，可以加入氢氧化铝或磷酸铝佐剂后即成为含铝佐剂的疫苗。
本发明的联合疫苗制剂，以破伤风类毒素、白喉类毒素、B群脑膜炎球菌外膜蛋白(OMP)作为脑膜炎球菌荚膜多糖的载体蛋白免疫儿童，可唤起免疫系统对破伤风类毒素、白喉类毒素、OMP(先前感染B群脑膜炎球菌)的回忆反应，从而得到较好的对脑膜炎球菌荚膜多糖的免疫反应。
本发明的疫苗可用于免疫2月龄以上各年龄段的儿童，预防儿童罹患A、C、Y、W135群流行性脑脊髓膜炎球菌、b型嗜血流感杆菌引起的感染性疾病。它的特点是既能增强多糖抗原的免疫原性，又能减少婴幼儿接种疫苗的次数，减轻婴幼儿的痛苦和家长的精神负担。降低免疫接种成本，提高免疫覆盖率。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例一
A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖的提取
生产多糖疫苗可选用适宜培养基。生产用的液体培养基不含能与十六烷基三甲基溴化铵形成沉淀的成分。培养基中不含对人体有害或其它过敏原物质。
在适宜的培养基中接种菌种后，于对数生产期后或静止期前期收获。将培养物加入甲醛溶液杀菌或加热杀菌，以确保杀菌安全并不损伤菌体多糖为宜。将已杀菌的单一收获物(或合并收获物)离心去菌体，收集上清液，用50～100KD截留分子量的超滤膜浓缩已收获的上清液至原体积的1/8，加入十六烷基三甲基溴化铵混匀，室温搅拌60分钟，1-5℃静置6～12小时，15000×g高速离心收集沉淀物。沉淀物中加入氯化钙溶液，终浓度为1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，过滤除去不溶物，加入乙醇至最终浓度为25-35％(v/v)。1～10℃静置3小时以上，离心去除核酸沉淀物，收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷乙醇至最终浓度为70～80％(v/v)，充分振摇。离心收集沉淀，然后用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物(多糖粗制品)保存在-20℃以下待进行一步提取。
将粗制品溶解于中性醋酸钠缓冲液中，使其浓度达10～20mg/ml，然后流经用中性乙酸钠缓冲液预平衡的聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸酯大孔树脂层析柱，收集流出液，超滤浓缩，按1∶2体积用冷酚提取，离心收集上层水相清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析48～72小时或用3～100KD超滤膜超滤5次(1∶4～10)除去苯酚，加乙醇至最终浓度为75％～80％(v/v)。离心收集沉淀物，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上。离心后倾去上清液，用旋转蒸发器真空抽干残存的有机溶剂，获得多糖干粉，保存于-20℃以下。
用注射用水溶解多糖，所得溶液即为提取的多糖原液。原液经除菌过滤后，取样进行无菌试验、血清学试验及各项生化测定。除菌后的液体多糖应保存在-20℃或以下，待下一步与蛋白偶联。
采用本方法精制的荚膜多糖为白色粉末状物质，不含色素及脂类杂质，各项鉴定指标均符合现行世界卫生组织《脑膜炎球菌荚膜多糖疫苗制造及检定规程》(No.23，1986)的要求，精制过程中苯酚的用量仅为世界卫生组织推荐方法的1/4～1/10，极大地减轻了对环境的污染。
实施例二
荚膜多糖的裂解及纯化
将5克A群(或C、Y、W135群)奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖(或b型嗜血流感杆菌荚膜多糖，Hib)溶于10升1/10饱和度的乙酸钠缓冲液中(pH5.5～6.0，用乙酸调节酸碱度，室温)，室温下搅拌，充分溶解8～12小时，至溶液澄清透明，补加60℃预热的50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5～6.0)38.33升，不锈钢反应罐夹套内循环水加热，维持罐内多糖溶液温度在55-56℃，搅拌0.5小时，向罐内加入30％的过氧化氢1670ml，裂解多糖，裂解过程中维持搅拌速度100转/分钟。
多糖裂解过程通过跟踪多糖分子量的变化来监控，分子量的测定用岛津20AT HPLC TSK3000W液相色谱测定，每20分钟取样1次，检测反应罐内多糖分子量的大小。当多糖的分子大小主要分布在3～100KDa之间时，关闭自动加热装置，放掉反应罐夹套内的循环水，向夹套内通入-10℃乙二醇/水冷却液，至罐内液体温度达到4℃后，将乙二醇/水冷却液的温度调整为2℃，由温度自控系统依据罐内液体的温度控制夹套内冷媒循环系统的开闭。
将反应罐与装有3KDa聚醚砜超滤膜的超滤系统连接，启动超滤系统，浓缩至罐内液体量为5升。加入20升0.15mol/L无菌氯化钠溶液(4℃)，启动超滤系统，继续超滤至罐内液体为5升，重复此过程5次。在整个超滤过程中，始终控制罐内液体温度在2～4℃。超滤结束后，将超滤后的多糖溶液放置在2～4℃，备用。
实施例三
多糖与破伤风类毒素偶联及纯化
1.活化多糖
取A群(或C群、Y群、W135群)脑膜炎球菌荚膜多糖(或Hib)多糖400mg(4mg/ml，100ml)，用0.5M NaOH调pH至10.8，加200mg溴化氰，用0.5MNaOH维持pH在10.8±0.5左右1小时(22℃)。然后用0.5M HCl调pH至8.8，加入1450mg己二酰肼(ADH)，反应6分钟；用0.5M NaOH调pH至8.5，维持pH在8.5±0.5的范围内15分钟；4～8℃轻轻搅拌12小时。用预冷0.05MNaCl溶液透析48小时(4～8℃)，在此期间换液5次(或用3KD的聚醚砜超滤膜超滤)。用0.45μm滤膜过滤活化多糖-AH衍生物。
2.活化多糖与破伤风类毒素(TT)偶联(4～8℃冰水浴下操作)
将破伤风类毒素溶液的蛋白浓度调整为4mg/ml，分别取100ml加入到已活化的多糖-AH衍生物溶液中，充分混匀后，用0.5mol/L HCl调pH至5.7。加碳二亚胺(EDAC)4000mg，滴加盐酸维持溶液的pH在5.7±0.2范围内90分钟；用0.5mol/L NaOH调pH至6.8，用预冷0.2mol/L NaCl溶液透析12小时(4～8℃，或用截流分子量为100KD的聚醚砜滤膜超滤)，除去碳二亚胺(EDAC)及低分子物质。
3.多糖-蛋白结合物纯化及检定(4～8℃条件)
将多糖-TT结合物溶液超滤浓缩为40ml，经Sephacryl S-400HR(或Sephacryl S-1000、Sepharose CL-4B、Sepharose 4FF、TSK Toyopearl-65等)层析柱(3.5×100cm)纯化，以0.2mol/L NaCl流洗，流速为2.5ml/分钟，以206nm/280nm波长的在线式紫外检测器检测流出液的吸光值变化，收集含多糖-蛋白偶联物的洗脱峰，经0.22μm无菌无热原滤膜过滤后即为多糖-蛋白结合疫苗原液。
A群脑膜炎球菌荚膜多糖含量的测定按Bartlet，GR.J.，Journal of BiologicalChemistry 1959：234，466-468页刊载的方法，唾液酸含量的测定按Svennerholm，L.，Biochemica Biophysica Acta.1955：24，604-611页刊载的方法；O-乙酰基含量的测定采用Hesterin，S.Journal of Biological Chemistry，1949，180：249页刊载的方法。蛋白含量的测定采用Lowry，O.H.，et al.，Journal ofBiological Chemistry，1951，193：265-275页刊载的方法，内毒素含量测定采用《中华人民共和国药典》第三部附录XIIE方法。
采用上述多糖、TT反应比例制备的A群脑膜炎球菌荚膜多糖-TT结合物及Hib多糖-TT结合物中多糖与TT的重量比为0.2∶1～0.8∶1；C群脑膜炎球菌荚膜多糖与TT的重量比为0.6∶1～1.5∶1。Y群、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖与TT的重量比为0.3∶1～1.0∶1；游离多糖含量小于20％。LAL(内毒素)含量不超过5EU/μg多糖。
实施例四、
氢氧化铝佐剂吸附A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖结合疫苗的制备
将A群脑膜炎球菌荚膜多糖-TT结合疫苗原液、C群脑膜炎球菌荚膜多糖-TT结合疫苗原液、Y群脑膜炎球菌荚膜多糖-TT结合疫苗原液、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖-TT结合疫苗原液、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-TT结合疫苗原液分别稀释至200μg/ml(按多糖计算)，将以上5种稀释后的疫苗液各取等量放于一无菌容器内，充分混合后，加入氢氧化铝佐剂，充分混匀后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分装，即为每剂含A群、C群、Y群、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖各5～10μg的氢氧化铝吸附多糖-TT结合疫苗。
实施例五
磷酸铝佐剂吸附A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖结合疫苗的制备
将A群脑膜炎球菌荚膜多糖-TT结合疫苗原液、C群脑膜炎球菌荚膜多糖-TT结合疫苗原液、Y群脑膜炎球菌荚膜多糖-TT结合疫苗原液、W群脑膜炎球菌荚膜多糖-TT结合疫苗原液、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-TT结合疫苗原液分别稀释至200μg/ml(按多糖计算)，将以上5种稀释后的疫苗液各取等量放于一无菌容器内，充分混合后，加入磷酸铝佐剂，充分混匀后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分装，即为每剂含A群、C群、Y群、W135脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖各5～10μg的磷酸铝吸附多糖-TT结合疫苗。
实施例六
A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖结合疫苗的制备
将A群脑膜炎球菌荚膜多糖-TT结合疫苗原液、C群脑膜炎球菌荚膜多糖-TT结合疫苗原液、Y群脑膜炎球菌荚膜多糖-TT结合疫苗原液、W群脑膜炎球菌荚膜多糖-TT结合疫苗原液、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-TT结合疫苗原液分别稀释至200μg/ml(按多糖计算)，将以上5种稀释后的疫苗液各取等量放于一无菌容器内，加入氯化钠溶液，充分混合后，4～8℃放置。按0.5ml/支的量分装，即为每剂含A群、C群、Y群、W135脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖各5～20μg的结合疫苗。
实施例七
A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖-TT、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-TT结合疫苗动物免疫试验
按上述实施例三、四、五方法制备的A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖-TT、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-TT结合疫苗，每毫升疫苗含A群、C群、Y群、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖各20μg。加三倍体积的铝稀释剂或生理盐水稀释后，即为动物实验用疫苗，分别于0、14天免疫SPF级BALB/C小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，免疫剂量为0.5ml(含每种多糖2.5μg)。分别于0、14、28天采集血液，分离血清，测定抗体滴度前将血清放置于-20℃。免疫动物的同时设生理盐水对照组及同剂量多糖疫苗对照组，以酶联免疫法(ELISA用酶标板以各群或型荚膜多糖-HAS结合物包被)测定血清IgG抗体滴度。结果见表1。结合疫苗第1次免后2周小鼠血清抗体滴度显著高于免前(p＜0.01)；第2次免后2周的抗体滴度显著高于第1次免后2周的抗体滴度(p＜0.05)。结合疫苗免后产生的抗体效价显著高于多糖疫苗免疫后产生的抗体效价。多糖疫苗1、2次免疫后产生的抗体效价无显著性差异。
实施例八
A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合疫苗
(一)B群脑膜炎球菌外膜蛋白的提取
B群脑膜炎球菌外膜蛋白(OMP)的提取方法按照孙银燕、胡绪敬报道的方法[见中华微生物学和免疫学杂志，1998，18(6)423-427]，蛋白含量的测定采用Lowry法。
(二)多糖与B群脑膜炎球菌外膜蛋白的偶联
1.活化多糖
取按实施例二制备的A群(或C、Y、W135)脑膜炎球菌(或Hib)多糖400mg(4mg/ml)，用0.5mol/LNaOH调pH至10.8，加入200mg溴化氰，用0.5mol/L NaOH维持pH在10.8±0.5左右1小时(22℃)。然后用0.5mol/L HCl调pH至8.8，加入1450mg己二酰肼(ADH)，反应6分钟；用0.5mol/L NaOH调pH至8.5，维持pH在8.5±0.5的范围内15分钟；4～8℃轻轻搅拌12小时。用预冷0.05mol/L NaCl溶液透析48小时(4～8℃)，在此期间换液5次(或用3KD的超滤膜超滤)。用0.2μm滤膜过滤活化多糖-AH衍生物。
2.活化多糖与B群脑膜炎球菌外膜蛋白偶联(4～8℃冰水浴下操作)
将B群脑膜炎球菌外膜蛋白溶液的蛋白浓度调整为4mg/ml，取100ml加入到已活化的多糖-AH衍生物溶液中，充分混匀后，用0.5mol/L HCl调pH至5.7。加碳二亚胺(EDAC)4000mg，滴加盐酸维持溶液的pH在5.7±0.2范围内90分钟；用0.5mol/L NaOH调pH至6.8，用预冷0.2mol/L NaCl溶液透析12小时(4～8℃，或用截流分子量为100KD的滤膜超滤)，除去碳二亚胺(EDAC)及低分子物质。
(三)多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合物纯化(4～8℃条件)
将多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合物溶液超滤浓缩为40ml，经SephacrylS-400HR(或Sephacryl S-1000、Sepharose CL-4B、Sepharose 4 FF、TSKToyopearl-65等)层析柱(柱长5×100cm)纯化，以0.2mol/L NaCl流洗，流速为1.5ml/分钟，以206nm/280nm波长的在线式紫外检测器检测流出液的吸光值变化，收集V0附近的洗脱峰，经0.2μm滤膜过滤后即为多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合疫苗原液。
(四)A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合疫苗的制备
将A群脑膜炎球菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合物原液、C群脑膜炎球菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合物原液、Y群脑膜炎球菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合物原液、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合物原液、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合物原液分别稀释至250μg/ml(按多糖计算)，将以上5种稀释后的疫苗液各取等量放于一容器内，充分混合后，加入不同量的生理盐水，即可制成含各型多糖10～50μg/ml的疫苗，充分混匀后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分装，即为每剂含A群、C群、Y群、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖各5～25μg的多糖-结合疫苗。
(五)氢氧化铝佐剂吸附A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合疫苗的制备
将A群脑膜炎球菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合物原液、C群脑膜炎球菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合物原液、Y群脑膜炎球菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合物原液、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合物原液、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合物原液分别稀释至200μg/ml(按多糖计算)，取相同体积的以上5种稀释后的疫苗液放于一灭菌后的容器内，充分混合后，加入氢氧化铝佐剂，充分混匀后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分装，即为每剂含A群、C群、Y群、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖各5～10μg的氢氧化铝吸附多糖结合疫苗。
(六)磷酸铝佐剂吸附A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合疫苗的制备
将A群脑膜炎球菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合物原液、C群脑膜炎球菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合物原液、Y群脑膜炎球菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合物原液、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合物原液、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合物原液分别稀释至200μg/ml(按多糖计算)，取相同体积的以上5种稀释后的疫苗液放于一灭菌后的容器内，充分混合后，加入等体积的磷酸铝佐剂，充分混匀后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分装，即为每剂含A群、C群、Y群、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖各5～10μg的磷酸铝吸附多糖结合疫苗。
实施例九
A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合疫苗动物免疫试验
按实施例八制备的A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖结合疫苗，每毫升含A群、C群、Y群、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖各20μg。加三倍体积的铝稀释剂或生理盐水稀释，即为动物实验用疫苗，分别于0、14天免疫SPF级BALB/C小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)10只，免疫剂量为0.5ml(含每种多糖2.5μg)。分别于0、14、28天采集血液，分离血清，测定抗体滴度前将血清放置于-20℃。免疫时设生理盐水对照组及同剂量多糖疫苗对照组，以酶联免疫法(ELISA用酶标板以各群或型荚膜多糖-HAS结合物包被)测定血清IgG抗体滴度。结果见表2。结合疫苗第1次免后2周小鼠血清抗体滴度显著高于免前(p＜0.01)；第2次免后2周的抗体滴度显著高于第1次免后2周的抗体滴度(p＜0.05)。
实施例十
A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-鼠IgG结合疫苗(动物试验用)
(一)多糖与鼠IgG的偶联
1.活化多糖
取A群(或C、Y、W135)脑膜炎球菌(或Hib)多糖400mg(4mg/ml)，用0.5mol/L NaOH调pH至10.8，加入200mg溴化氰，用0.5mol/L NaOH维持pH在10.8±0.5左右1小时(22℃)。然后用0.5mol/L HCl调pH至8.8，加入1450mg己二酰肼(ADH)，反应6分钟；用0.5mol/L NaOH调pH至8.5，维持pH在8.5±0.5的范围内15分钟；4～8℃轻轻搅拌12小时。用预冷0.05mol/L NaCl溶液透析48小时(4～8℃)，在此期间换液5次(或用3KD的超滤膜超滤)。用0.2μm滤膜过滤活化多糖-AH衍生物。
2.活化多糖与鼠IgG偶联(4～8℃冰水浴下操作)
将鼠IgG的蛋白浓度调整为4mg/ml，取100ml加入到已活化的多糖-AH衍生物溶液中，充分混匀后，用0.5mol/L HCl调pH至5.7。加碳二亚胺(EDAC)4000mg，滴加盐酸维持溶液的pH在5.7±0.2范围内90分钟；用0.5mol/L NaOH调pH至6.8，用预冷0.2mol/L NaCl溶液透析12小时(4～8℃，或用截流分子量为100KD的滤膜超滤)，除去碳二亚胺(EDAC)及低分子物质。
(二)多糖-蛋白结合物纯化(4～8℃条件)
将多糖-蛋白结合物溶液超滤浓缩为40ml，经Sephacryl S-400HR(或Sephacryl S-1000、Sepharose CL-4B、Sepharose 4FF、TSK Toyopearl-65等)层析柱(柱长5×100cm)纯化，以0.2mol/L NaCl流洗，流速为1.5ml/分钟，以206nm/280nm波长的在线式紫外检测器检测流出液的吸光值变化，收集V0附近的洗脱峰，经0.2μm滤膜过滤后即为多糖-鼠IgG结合疫苗原液。
(三)A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-鼠IgG结合疫苗的制备
将A群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物原液、C群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物原液、Y群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物原液、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物原液、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-鼠IgG结合物原液分别稀释至250μg/ml(按多糖计算)，将以上5种稀释后的疫苗液各取等量放于一容器内，充分混合后，加入不同量的生理盐水，即可制成含各型多糖10～50μg/ml的疫苗，充分混匀后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分装，即为每剂含A群、C群、Y群、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖各5～25μg的多糖-鼠IgG结合疫苗。
(四)氢氧化铝佐剂吸附A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-鼠IgG结合疫苗的制备
将A群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物原液、C群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物原液、Y群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物原液、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物原液、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖鼠IgG结合物原液-分别稀释至200μg/ml(按多糖计算)，取相同体积的以上5种稀释后的疫苗液放于一灭菌后的容器内，充分混合后，加入氢氧化铝佐剂，充分混匀后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分装，即为每剂含A群、C群、Y群、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖各5～10μg的氢氧化铝吸附多糖结合疫苗。
(五)磷酸铝佐剂吸附A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-鼠IgG结合疫苗的制备
将A群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物原液、C群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物原液、Y群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物原液、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物原液、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-鼠IgG结合物原液分别稀释至200μg/ml(按多糖计算)，取相同体积的以上5种稀释后的疫苗液放于一灭菌后的容器内，充分混合后，加入等体积的磷酸铝佐剂，充分混匀后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分装，即为每剂含A群、C群、Y群、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖各5～10μg的磷酸铝吸附多糖结合疫苗。
实施例十一
A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-鼠IgG结合疫苗动物试验
(一)多糖-鼠IgG结合疫苗动物免疫试验
按实施例十制备的A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-鼠IgG结合疫苗，每毫升疫苗含A群、C群、Y群、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖各20μg。加三倍体积的铝稀释剂或生理盐水稀释后，即为动物实验用疫苗，分别于0、14天免疫SPF级BALB/C小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)10只，免疫剂量为0.5ml(含每种多糖2.5μg)。分别于0、14、28天采集血液，分离血清，测定抗体滴度前将血清放置于-20℃。免疫动物的同时设生理盐水对照组及同剂量多糖疫苗对照组，以酶联免疫法(ELISA用酶标板以各群或型荚膜多糖-HAS结合物包被)测定血清IgG抗体滴度。结果见表3。结合疫苗第1次免后2周小鼠血清抗体滴度显著高于免前(p＜0.01)；第2次免后2周的抗体滴度显著高于第1次免后2周的抗体滴度(p＜0.05)。
(二)多糖-鼠IgG结合物急性毒性试验
多糖-鼠IgG结合物类似于小鼠感染后恢复期形成的多糖-鼠IgG抗原-抗体复合物，抗原-抗体复合物有可能对机体的肝脏、脾脏、肾脏等造成一定程度的免疫损伤，本试验以相当于人拟用剂量500～1000倍的多糖-鼠IgG结合物进行急性毒性试验，观察其安全性。由于C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖的主要成分均为唾液酸，本试验仅以含唾液酸量最高的C群脑膜炎球菌荚膜多糖进行试验。
1、A群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物急性毒性试验
A群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物类似于小鼠感染A群脑膜炎球菌恢复期形成的多糖-鼠IgG抗原-抗体复合物，抗原-抗体复合物有可能对机体的肝脏、脾脏、肾脏等造成一定程度的免疫损伤，本试验以相当于人用剂量500～1000倍的多糖-鼠IgG结合物进行急性毒性试验，观察其安全性。
试验动物为SPF级BALB/C小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，每组20只，雌雄各半，体重18-22克。
试验分组：试验组1，A群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物；试验组2，氢氧化铝吸附A群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物；试验组3，A群脑膜炎球菌荚膜多糖；对照组，生理盐水。
试验方法：分别于0、14天肌肉注射A群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物2.5mg/kg/0.2ml(按多糖计算，试验组1)、氢氧化铝吸附A群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物2.5mg/kg/0.2ml(试验组2)、A群脑膜炎球菌荚膜多糖2.5mg/kg/0.2ml(试验组3)，对照组同期注射生理盐水0.2ml/只。第2次给药后7天、28天每组各处死半数小鼠，摘取肝、脾、肾，秤重，观察病变，将脏器用10％福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色，镜检观察病理学情况。
试验结果：各组试验动物在两次给药后均未见异常，试验期间未发生死亡，各试验组动物体重与对照组相比无显著性差异。处死动物剖检时，各组试验动物主要脏器未见异常，各给药组动物脏器重量和脏器系数与对照组没有显著性差异。肝、脾、肾显微切片镜检无异常改变。证明该试验剂量的多糖-鼠IgG结合物对小鼠是安全的。
2、C群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物急性毒性试验
C群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物类似于小鼠感染C群脑膜炎球菌恢复期形成的多糖-鼠IgG抗原-抗体复合物，抗原-抗体复合物有可能对机体的肝脏、脾脏、肾脏等造成一定程度的免疫损伤，本试验以相当于人拟用剂量500～1000倍的多糖-鼠IgG结合物进行急性毒性试验，观察其安全性。
试验动物为SPF级BALB/C小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，每组20只，雌雄各半，体重18-22克，随机分组。
试验分组：试验组1，C群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物；试验组2，氢氧化铝吸附C群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物；试验组3，C群脑膜炎球菌荚膜多糖；对照组，生理盐水。
试验方法：分别于0、14天肌肉注射C群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物2.5mg/kg/0.2ml(按多糖计算，试验组1)、氢氧化铝吸附C群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物2.5mg/kg/0.2ml(试验组2)、C群脑膜炎球菌荚膜多糖2.5mg/kg/0.2ml(试验组3)，对照组同期注射生理盐水0.2ml/只。第2次给药后7天、28天每组各处死半数小鼠，摘取肝、脾、肾，秤重，观察病变，将脏器用10％福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色，镜检观察病理学情况。
试验结果：各组试验动物在两次给药后均未见异常，试验期间未发生死亡，各试验组动物体重与对照组相比无显著性差异。处死动物剖检时，各组试验动物主要脏器未见异常，各给药组动物脏器重量和脏器系数与对照组没有显著性差异。第2次给药后7、28天处死的动物C群脑膜炎球菌荚膜多糖试验组肝、肾显微切片镜检异常，出现肝细胞肿胀、变性，肾小管上皮细胞肿胀，肾小球未见异常；其他试验组显微镜下无异常。证明该试验剂量的C群脑膜炎球菌荚膜多糖-鼠IgG结合物对小鼠是安全的。
3、Hib多糖-鼠IgG结合物急性毒性试验
Hib多糖-鼠IgG结合物类似于小鼠感染Hib恢复期形成的多糖-鼠IgG抗原-抗体复合物，抗原-抗体复合物有可能对机体的肝脏、脾脏、肾脏等造成一定程度的免疫损伤，本试验以相当于人拟用剂量500～1000倍的和Hib多糖-鼠IgG结合物进行急性毒性试验，观察其安全性。
试验动物为SPF级BALB/C小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，每组20只，雌雄各半，体重18-22克，随机分组。
试验分组：试验组1，Hib多糖-鼠IgG结合物；试验组2，氢氧化铝吸附Hib多糖-鼠IgG结合物；试验组3，Hib多糖；对照组，生理盐水。
试验方法：分别于0、14天肌肉注射Hib多糖-鼠IgG结合物2.5mg/kg/0.2ml(按多糖计算，试验组1)、氢氧化铝吸附Hib多糖-鼠IgG结合物2.5mg/kg/0.2ml(试验组2)、Hib多糖2.5mg/kg/0.2ml(试验组3)，对照组同期注射生理盐水0.2ml/只。第2次给药后7天、28天每组各处死半数小鼠，摘取肝、脾、肾，秤重，观察病变，将脏器用10％福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色，镜检观察病理学情况。
试验结果：各组试验动物在两次给药后均未见异常，试验期间未发生死亡，各试验组动物体重与对照组相比无显著性差异。处死动物剖检时，各组试验动物主要脏器未见异常，各给药组动物脏器重量和脏器系数与对照组没有显著性差异。第2次给药后7、28天处死的动物Hib多糖试验组肝、肾显微切片镜检异常，出现肝细胞肿胀、变性，肾小管上皮细胞肿胀，肾小球未见异常；其他试验组显微镜下无异常。证明该试验剂量的Hib多糖-鼠IgG结合物对小鼠是安全的。
实施例十二
A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-人IgG结合疫苗
(一)多糖-人IgG的偶联
1.活化多糖
取A群(或C、Y、W135)脑膜炎球菌(或Hib)多糖400mg(4mg/ml)，用0.5mol/LM NaOH调pH至10.8，加入200mg溴化氰，用0.5mol/LNaOH维持pH在10.8±0.5左右1小时(22℃)。然后用0.5mol/L HCl调pH至8.8，加入1450mg己二酰肼(ADH)，反应6分钟；用0.5mol/L NaOH调pH至8.5，维持pH在8.5±0.5的范围内15分钟；4～8℃轻轻搅拌12小时。用预冷0.05mol/L NaCl溶液透析48小时(4～8℃)，在此期间换液5次(或用3KD的超滤膜超滤)。用0.2μm滤膜过滤活化多糖-AH衍生物。
2.活化多糖与人IgG偶联(4～8℃冰水浴下操作)
将人IgG(静脉注射用人血清免疫球蛋白，武汉生物制品研究所)的蛋白浓度稀释为4mg/ml，取100ml加入到已活化的多糖-AH衍生物溶液中，充分混匀后，用0.5mol/L HCl调pH至5.7。加碳二亚胺(EDAC)4000mg，滴加盐酸维持溶液的pH在5.7±0.2范围内90分钟；用0.5mol/L NaOH调pH至6.8，用预冷0.2mol/L NaCl溶液透析12小时(4～8℃，或用截流分子量为100KD的滤膜超滤)，除去碳二亚胺(EDAC)及低分子物质。
(二)多糖-人IgG结合物纯化(4～8℃条件)
将多糖-人IgG结合物溶液超滤浓缩为40ml，经Sephacryl S-400HR(或Sephacryl S-1000、Sepharose CL-4B、Sepharose 4FF、TSK Toyopearl-65等)层析柱(柱长5×100cm)纯化，以0.2mol/L NaCl流洗，流速为1.5ml/分钟，以206nm/280nm波长的在线式紫外检测器检测流出液的吸光值变化，收集V0附近的洗脱峰，经0.2μm滤膜过滤后即为多糖-人IgG结合疫苗原液。
(三)A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-人IgG结合疫苗的制备
将A群脑膜炎球菌荚膜多糖-人IgG结合物原液、C群脑膜炎球菌荚膜多糖-人IgG结合物原液、Y群脑膜炎球菌荚膜多糖-人IgG结合物原液、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖-人IgG结合物原液、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-人IgG结合物原液分别稀释至250μg/ml(按多糖计算)，将以上5种稀释后的疫苗液各取等量放于一容器内，充分混合后，加入不同量的生理盐水，即可制成含各型多糖10～50μg/ml的疫苗，充分混匀后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分装，即为每剂含A群、C群、Y群、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖各5～25μg的多糖-结合疫苗。
(四)氢氧化铝佐剂吸附A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-人IgG结合疫苗的制备
将A群脑膜炎球菌荚膜多糖-人IgG结合物原液、C群脑膜炎球菌荚膜多糖-人IgG结合物原液、Y群脑膜炎球菌荚膜多糖-人IgG结合物原液、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖-人IgG结合物原液、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-人IgG结合物原液-分别稀释至200μg/ml(按多糖计算)，取相同体积的以上5种稀释后的疫苗液放于一灭菌后的容器内，充分混合后，加入氢氧化铝佐剂，充分混匀后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分装，即为每剂含A群、C群、Y群、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖各5～10μg的氢氧化铝吸附多糖结合疫苗。
(五)磷酸铝佐剂吸附A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-人IgG结合疫苗的制备
将A群脑膜炎球菌荚膜多糖-人IgG结合物原液、C群脑膜炎球菌荚膜多糖-人IgG结合物原液、Y群脑膜炎球菌荚膜多糖-人IgG结合物原液、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖-人IgG结合物原液、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-人IgG结合物原液分别稀释至200μg/ml(按多糖计算)，取相同体积的以上5种稀释后的疫苗液放于一灭菌后的容器内，充分混合后，加入磷酸铝佐剂，充分混匀后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分装，即为每剂含A群、C群、Y群、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖各5～10μg的磷酸铝吸附多糖结合疫苗。
表1、A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-TT结合疫苗免疫BALB/C小鼠的血清抗体滴度*
| 组别 | 血清采集时间(天) | 血清抗体滴度 | ||||||||||
| 抗A群多糖 | 抗C群多糖 | 抗Y群多糖 | 抗W135群多糖 | 抗Hib多糖 | ||||||||
| GMT | SD | GMT | SD | GMT | SD | GMT | SD | GMT | SD | |||
| A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-TT结合疫苗 | 氢氧化铝佐剂 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 |
| 第14天 | 2425 | 1.63 | 2599 | 1.77 | 3429 | 1.67 | 2425 | 1.79 | 2599 | 1.93 | ||
| 第28天 | 29406 | 1.56 | 20792 | 1.59 | 33779 | 1.95 | 33779 | 1.99 | 23886 | 2.43 | ||
| 磷酸铝佐剂 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | |
| 第14天 | 3429 | 1.67 | 3676 | 1.73 | 2785 | 1.73 | 2785 | 1.55 | 2985 | 1.67 | ||
| 第28天 | 33775 | 1.79 | 44572 | 1.73 | 36199 | 2.11 | 23886 | 2.29 | 27437 | 1.67 | ||
| 无佐剂 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | |
| 第14天 | 459 | 1.89 | 746 | 1.99 | 3939 | 1.77 | 2111 | 1.79 | 1493 | 1.67 | ||
| 第28天 | 8445 | 1.95 | 13718 | 1.83 | 36204 | 1.80 | 11143 | 1.89 | 16889 | 1.79 | ||
| A、C、Y、W135群膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖疫苗 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | |
| 第14天 | 171 | 1.44 | 78 | 4.78 | 123 | 1.39 | 152 | 1.43 | 72 | 4.63 | ||
| 第28天 | 214 | 1.24 | 186 | 1.48 | 200 | 1.39 | 200 | 1.39 | 152 | 1.43 | ||
| 生理盐水 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | |
| 第14天 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | ||
| 第28天 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | ||
*每组试验动物10只，血清的起始稀释度为1∶100，连续2倍稀释，最高稀释度为1∶102400。
免前血清、生理盐水对照组血清的稀释方法同其他试验组，1∶100阴性的，血清抗体滴度按1计算。
表2、A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-B群脑膜炎球菌外膜蛋白联合疫苗免疫BALB/C小鼠的血清抗体滴度*
| 组别 | 血清采集时间(天) | 血清抗体滴度 | ||||||||||
| 抗A群多糖 | 抗C群多糖 | 抗Y群多糖 | 抗W135群多糖 | 抗Hib多糖 | ||||||||
| GMT | SD | GMT | SD | GMT | SD | GMT | SD | GMT | SD | |||
| A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-OMP结合疫苗 | 氢氧化铝佐剂 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 2 | 4.29 | 2 | 4.29 |
| 免后14天 | 1715 | 1.67 | 2111 | 1.79 | 1600 | 1.59 | 1600 | 1.76 | 2599 | 1.93 | ||
| 免后28天 | 13718 | 1.99 | 20794 | 1.59 | 20794 | 1.59 | 16889 | 1.79 | 14703 | 2.04 | ||
| 磷酸铝佐剂 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | |
| 免后14天 | 1838 | 2.05 | 3200 | 1.76 | 1600 | 1.59 | 1393 | 1.73 | 1970 | 1.60 | ||
| 免后28天 | 22286 | 2.05 | 44572 | 1.73 | 22286 | 1.73 | 11143 | 1.55 | 18101 | 1.63 | ||
| 无佐剂 | 免前 | 1 | 1.00 | 3 | 6.97 | 2 | 4.29 | 2 | 4.29 | 1 | 1.00 | |
| 免后14天 | 246 | 1.59 | 566 | 1.80 | 3200 | 1.76 | 1056 | 1.43 | 1299 | 1.93 | ||
| 免后28天 | 5198 | 1.77 | 2425 | 1.95 | 11942 | 1.83 | 7879 | 1.93 | 9051 | 1.80 | ||
| A、C、Y、W135群膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖疫苗 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1 | |
| 免后14天 | 115 | 1.34 | 68 | 4.47 | 68 | 4.46 | 127 | 1.44 | 49 | 7.96 | ||
| 免后28天 | 152 | 1.43 | 141 | 1.44 | 152 | 1.43 | 174 | 1.34 | 152 | 1.43 | ||
| 生理盐水 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | |
| 免后14天 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | ||
| 免后28天 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | ||
*每组试验动物均为SPF BALB/C小鼠10只，血清的起始稀释度为1∶100，连续2倍稀释，最高稀释度为1∶102400。
免前血清、生理盐水对照组血清的稀释方法同其他试验组，1∶100阴性的，血清抗体滴度按1计算。
表3A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-鼠IgG结合疫苗免疫BALB/C小鼠的血清抗体滴度*
| 组别 | 血清采集时间(天) | 血清抗体滴度 | ||||||||||
| 抗A群多糖 | 抗C群多糖 | 抗Y群多糖 | 抗W135群多糖 | 抗Hib多糖 | ||||||||
| GMT | SD | GMT | SD | GMT | SD | GMT | SD | GMT | SD | |||
| A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖-鼠IgG结合疫苗 | 氢氧化铝佐剂 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 |
| 第14天 | 2599 | 1.59 | 2263 | 1.44 | 3429 | 1.67 | 2425 | 1.62 | 2985 | 1.67 | ||
| 第28天 | 15071 | 5.69 | 27437 | 1.67 | 36199 | 1.80 | 33775 | 1.79 | 25598 | 1.76 | ||
| 磷酸铝佐剂 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | |
| 第14天 | 3676 | 1.55 | 2786 | 1.73 | 2425 | 1.79 | 2785 | 1.73 | 1969 | 1.40 | ||
| 第28天 | 38797 | 1.43 | 38797 | 1.79 | 41587 | 1.60 | 29403 | 2.19 | 29404 | 1.73 | ||
| 无佐剂 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | |
| 第14天 | 566 | 1.80 | 857 | 1.99 | 2985 | 184 | 1715 | 2.14 | 1493 | 1.67 | ||
| 第28天 | 11143 | 2.19 | 19399 | 1.79 | 33779 | 1.79 | 15758 | 2.23 | 16889 | 1.62 | ||
| A、C、Y、W135群膜炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖疫苗 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | |
| 第14天 | 156 | 1.43 | 132 | 1.43 | 141 | 1.44 | 162 | 1.39 | 123 | 1.39 | ||
| 第28天 | 246 | 1.39 | 230 | 1.34 | 230 | 1.55 | 230 | 1.55 | 200 | 1.39 | ||
| 生理盐水 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | |
| 第14天 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | ||
| 第28天 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | ||
*每组试验动物10只，血清的起始稀释度为1∶100，连续2倍稀释，最高稀释度为1∶102400。
免前血清、生理盐水对照组血清的稀释方法同其他试验组，1∶100阴性的，血清抗体滴度按1计算。
Claims (11)
1、一种多价细菌多糖-蛋白质结合物联合疫苗制剂，其特征在于，含有有效量的A群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖-蛋白结合物，C群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜荚膜多糖-蛋白结合物，Y群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖-蛋白结合物，W135群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖-蛋白结合物和b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-蛋白结合物，它们之间的重量比例在1∶0.5～2.5之间。
2、权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，重量比例是按多糖计算的，每一单位给药剂量的制剂中含有A群，C群，Y群和W135群脑膜炎球菌荚膜多糖以及b型嗜血流感杆菌荚膜多糖的量在5-25μg之间。
3、权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，其中的蛋白载体选自破伤风类毒素、白喉类毒素、人血清免疫球蛋白或B群流行性脑脊髓膜炎球菌外膜蛋白。
4、权利要求1的联合疫苗制剂，其中的多糖选自未经降解的荚膜多糖或经化学方法裂解的分子量在3-100KDa之间的多糖。
5、权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，荚膜多糖-蛋白结合物的多糖和蛋白是通过共价键结合的，其中多糖与蛋白的加入量是等量或有0.5～5倍量的差别。
6、权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，还含有氢氧化铝或磷酸铝作为铝佐剂，加入量为0.1～1.5mg铝佐剂/剂。
7、权力要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，还含有可提高人体免疫反应的人细胞因子、单磷脂A或胞壁酰二肽或其衍生物。
8、权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，是注射剂，用于皮下或肌肉注射。
9、权利要求1的联合疫苗制剂在制备用于预防A群、C群、Y群、W135群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌、b型流感嗜血杆菌引起的感染的疫苗中的应用。
10、权利要求1的联合疫苗制剂的制备方法，其特征在于，包括多糖原料的制备，载体蛋白原料的制备，多糖-蛋白结合物的制备，多糖-蛋白结合物按比例混合的步骤：其中多糖原料的制备是用A、C、Y、W135群脑膜炎球菌菌种、b型嗜血流感杆菌菌种经过发酵培养生产出A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖和b型嗜血流感杆菌荚膜多糖，这些多糖的纯化方法采用大孔合成树脂精制细菌荚膜多糖的方法，该方法是，用聚苯乙烯/聚甲基丙烯酸酯大孔合成树脂吸附粗制多糖溶液中的色素、蛋白质及核酸类污染物，再以蛋白变性剂苯酚除去多糖溶液中残留的不能被大孔树脂吸附的微量蛋白，其中苯酚的用量为目前世界卫生组织推荐工艺的1/4至1/10。
11、权利要求1的联合疫苗制剂可以不含b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-蛋白结合物，用于预防A群、C群、Y群、W135群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌引起的感染。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200510083042 CN1709505B (zh) | 2005-07-13 | 2005-07-13 | 多价细菌荚膜多糖-蛋白质结合物联合疫苗 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200510083042 CN1709505B (zh) | 2005-07-13 | 2005-07-13 | 多价细菌荚膜多糖-蛋白质结合物联合疫苗 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1709505A true CN1709505A (zh) | 2005-12-21 |
| CN1709505B CN1709505B (zh) | 2010-06-16 |
Family
ID=35705836
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200510083042 Active CN1709505B (zh) | 2005-07-13 | 2005-07-13 | 多价细菌荚膜多糖-蛋白质结合物联合疫苗 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1709505B (zh) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010529103A (ja) * | 2007-06-04 | 2010-08-26 | ノバルティス アーゲー | 髄膜炎ワクチンの製剤化 |
| CN101829337A (zh) * | 2010-04-20 | 2010-09-15 | 深圳市孚沃德生物技术有限公司 | 针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫组合物 |
| CN102759619A (zh) * | 2012-07-16 | 2012-10-31 | 武汉科前动物生物制品有限责任公司 | 一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒及应用 |
| US8398983B2 (en) | 2005-06-27 | 2013-03-19 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Immunogenic composition |
| CN103007268A (zh) * | 2012-12-26 | 2013-04-03 | 天津康希诺生物技术有限公司 | 一种低剂量多价结合疫苗组合物及用途 |
| CN103059149A (zh) * | 2011-10-19 | 2013-04-24 | 天士力制药集团股份有限公司 | 一种prp核糖提取方法 |
| CN101688174B (zh) * | 2007-07-10 | 2015-07-29 | 赛诺菲巴斯德有限公司 | B型流感嗜血杆菌的培养介质 |
| CN105641690A (zh) * | 2016-02-03 | 2016-06-08 | 成都康华生物制品有限公司 | 一种四价流脑-Hib联合疫苗的制备方法 |
| CN106399257A (zh) * | 2016-06-22 | 2017-02-15 | 云南沃森生物技术股份有限公司 | 抗a群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用 |
| WO2017036138A1 (zh) * | 2015-08-31 | 2017-03-09 | 成都欧林生物科技股份有限公司 | A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺 |
| CN108883192A (zh) * | 2016-03-15 | 2018-11-23 | 默沙东和惠康基金会合资的希勒曼实验室私人有限公司 | 新型多糖-蛋白质结合物及其获取工艺 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102327605B (zh) * | 2011-08-25 | 2013-01-30 | 成都康华生物制品有限公司 | 四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1296715B2 (en) * | 2000-06-29 | 2015-12-23 | SmithKline Beecham Biologicals S.A. | Multivalent vaccine composition |
| CN1168501C (zh) * | 2002-12-27 | 2004-09-29 | 北京绿竹生物技术有限责任公司 | 一种多糖-蛋白结合疫苗 |
-
2005
- 2005-07-13 CN CN 200510083042 patent/CN1709505B/zh active Active
Cited By (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8883163B2 (en) | 2005-06-27 | 2014-11-11 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Immunogenic composition |
| US9486515B2 (en) | 2005-06-27 | 2016-11-08 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Immunogenic composition |
| US9931397B2 (en) | 2005-06-27 | 2018-04-03 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Immunogenic composition |
| US9789179B2 (en) | 2005-06-27 | 2017-10-17 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Immunogenic composition |
| US10166287B2 (en) | 2005-06-27 | 2019-01-01 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Immunogenic composition |
| US10245317B2 (en) | 2005-06-27 | 2019-04-02 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Immunogenic composition |
| US11241495B2 (en) | 2005-06-27 | 2022-02-08 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Immunogenic composition |
| US9358279B2 (en) | 2005-06-27 | 2016-06-07 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Immunogenic composition |
| US8431136B2 (en) | 2005-06-27 | 2013-04-30 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Immunogenic composition |
| US8398983B2 (en) | 2005-06-27 | 2013-03-19 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Immunogenic composition |
| JP2010529103A (ja) * | 2007-06-04 | 2010-08-26 | ノバルティス アーゲー | 髄膜炎ワクチンの製剤化 |
| CN101688174B (zh) * | 2007-07-10 | 2015-07-29 | 赛诺菲巴斯德有限公司 | B型流感嗜血杆菌的培养介质 |
| CN101829337B (zh) * | 2010-04-20 | 2012-06-06 | 深圳市孚沃德生物技术有限公司 | 针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫组合物 |
| CN101829337A (zh) * | 2010-04-20 | 2010-09-15 | 深圳市孚沃德生物技术有限公司 | 针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫组合物 |
| CN103059149A (zh) * | 2011-10-19 | 2013-04-24 | 天士力制药集团股份有限公司 | 一种prp核糖提取方法 |
| CN103059149B (zh) * | 2011-10-19 | 2016-08-31 | 天士力制药集团股份有限公司 | 一种prp多糖提取方法 |
| CN102759619A (zh) * | 2012-07-16 | 2012-10-31 | 武汉科前动物生物制品有限责任公司 | 一种猪链球菌2型荚膜多糖抗体的酶联免疫试剂盒及应用 |
| CN103007268A (zh) * | 2012-12-26 | 2013-04-03 | 天津康希诺生物技术有限公司 | 一种低剂量多价结合疫苗组合物及用途 |
| WO2017036138A1 (zh) * | 2015-08-31 | 2017-03-09 | 成都欧林生物科技股份有限公司 | A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺 |
| CN105641690A (zh) * | 2016-02-03 | 2016-06-08 | 成都康华生物制品有限公司 | 一种四价流脑-Hib联合疫苗的制备方法 |
| CN108883192A (zh) * | 2016-03-15 | 2018-11-23 | 默沙东和惠康基金会合资的希勒曼实验室私人有限公司 | 新型多糖-蛋白质结合物及其获取工艺 |
| CN106399257A (zh) * | 2016-06-22 | 2017-02-15 | 云南沃森生物技术股份有限公司 | 抗a群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1709505B (zh) | 2010-06-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1709505A (zh) | 多价细菌荚膜多糖－蛋白质结合物联合疫苗 | |
| CN1159064C (zh) | 甲型链球菌多糖免疫原性组合物及方法 | |
| CN1163270C (zh) | 修饰的脑膜炎球菌多糖偶联物疫苗 | |
| CN105693830B (zh) | 脑膜炎双球菌组合物及其方法 | |
| CN103656631B (zh) | 多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白缀合物组合物及其制备方法 | |
| TWI602575B (zh) | 豬肺炎黴漿菌疫苗 | |
| CN107267466B (zh) | 一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法 | |
| CN1610560A (zh) | 多价脑膜炎球菌多糖－蛋白质缀合疫苗 | |
| CN1060408A (zh) | 改进的疫苗组合物 | |
| CN1228086C (zh) | 联合疫苗的制备方法 | |
| CN107961369B (zh) | 多价脑膜炎球菌缀合疫苗及其制备方法 | |
| CN1168501C (zh) | 一种多糖-蛋白结合疫苗 | |
| CN1241937C (zh) | 多价肺炎球菌多糖结合疫苗 | |
| CN1209163C (zh) | 脑膜炎球菌疫苗及其制备方法 | |
| CN1218750C (zh) | 皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗及制备方法 | |
| CN108295253A (zh) | 一种A、C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌/乙型脑炎联合疫苗 | |
| CN1401328A (zh) | 流行性脑脊髓膜炎多糖－蛋白结合疫苗 | |
| CN1911444A (zh) | 伤寒、副伤寒外膜蛋白疫苗 | |
| CN111471658A (zh) | 一种病毒纯化方法及经由该方法制备得到的二联灭活疫苗 | |
| CN1314449C (zh) | 乙型脑炎病毒疫苗和脑膜炎球菌结合疫苗组成的联合疫苗 | |
| CN110917344A (zh) | 一种液体疫苗组合物及其应用 | |
| CN1990041A (zh) | 肾综合征出血热Vero细胞双价纯化疫苗及其工业化生产方法 | |
| KR20200021933A (ko) | 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 x 캡슐 다당류의 급속 고수율 정제 방법 | |
| CN114805554B (zh) | 抗猪链球菌和副猪嗜血杆菌的精制卵黄抗体注射剂及其制备方法 | |
| CN1404873A (zh) | 一种伤寒疫苗 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee |
Owner name: BEIJING ZHIFEI LVZHU BIOPHARMACEUTICAL CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: BEIJING LUZHOU BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO., LTD. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 100176 No. 22 Tongji North Road, Beijing economic and Technological Development Zone Patentee after: Beijing Zhifei Lvzhu Biopharmaceutical Co., Ltd. Address before: 100176 No. 22 Tongji North Road, Beijing economic and Technological Development Zone Patentee before: Beijing Luzhou Biological Pharmaceutical Co., Ltd. |