CN1241937C - 多价肺炎球菌多糖结合疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了肺炎链球菌多糖-载体蛋白的偶联物，含该偶联物的疫苗及其制法。本发明的偶联物具有结构式：Pr-L-Ps，其中，Pr是载体蛋白，Ps是肺炎链球菌多糖，L是共价键、或连接基团，且Ps∶Pr的质量比为0.5-3.5∶1。本发明的偶联物可以刺激受体产生免疫应答，从而对于产生荚膜多糖成分的同类肺炎链球菌病原体形成保护。用本发明偶联物制备的多价肺炎球菌多糖结合疫苗不仅可有效使2岁以下的婴幼儿产生保护性免疫应答，而且特别针对亚洲(尤其是中国)的肺炎球菌。

Description

多价肺炎球菌多糖结合疫苗

技术领域

本发明涉及免疫学领域，更具体地涉及肺炎链球菌多糖-载体蛋白的偶联物，含该偶联物的疫苗及其制法。

背景技术

肺炎(pneumonia)系肺实质的急性炎症，为临床最常见的感染性疾病，自抗生素广泛应用后，其预后虽有明显改观，但发病率和死亡率仍未有下降，特别在婴幼儿、老年人和免疫抑制患者中较高。

肺炎可按解剖分布分类为大叶性、肺段性和间质性；为有利于治疗。目前诊断多按病因分类为细菌、病毒、支原体、真菌、立克次体、衣原体和原虫等感染性肺炎。

小儿肺炎为小儿常见病、多发病，是威胁小儿生命和健康的主要疾病。从病因分类法看，它包括细菌性(肺炎球菌，链球菌，金黄色葡萄球菌，肺炎杆菌，流感杆菌，绿脓杆菌，大肠杆菌等)、病毒性(腺病毒，呼吸道合胞病毒，流感病毒，副流感病毒等)、肺炎原浆菌性(又称支原体肺炎，原发性非典型性肺炎)、霉菌性、吸入性、过敏性与坠积性等。按病理分类包括大叶性、支气管性与间质性等。根据病程可分为急性(1个月内)、迁延性(1～3个月)和慢性(超过3个月)，其中支气管肺炎为肺炎中发病最多者，常年不断，尤以冬春两季更多。

支气管肺炎是婴幼儿时期常见病、多发病，3个月～2岁的幼儿多见，一年四季皆可发病，但以寒冷、气候多变的秋冬季节发病率最高，对小儿健康影响很大。婴幼儿年龄小，机体抵抗能力差，寒冷容易诱发感冒，感冒后损害气管、支气管直达肺组织，容易引起肺炎；幼儿肺组织弹力差，肺泡数量少，血循环丰富，容易发生肺部感染。治疗幼儿肺炎，轻者给以足量的抗生素静脉点滴和止咳化痰药物，病重者还要给以强心药物、氧气吸入、平喘治疗，一般7～8天就会痊愈。治疗不彻底就会转成慢性迁延性肺炎。婴幼儿发病的病原菌多为肺炎球菌。

肺炎球菌广泛分布在世界各地，常寄生在健康人的鼻咽部，约有40％-70％的人带菌，但多数无致病力或致病力极低。肺炎球菌能否致病，主要取决于细菌对组织的侵袭能力和机体抵抗力大小。它还可引起肺炎球菌败血症，感染肺炎球菌时细菌还可进入血液，继而引起脑膜炎、心内膜炎等症。在世界范围内，肺炎球菌每年至少使一百万儿童死亡。因此，预防肺炎的最好方法就是接种肺炎球菌疫苗。再说由于近年来，由于肺炎球菌对抗生素产生不同程度的耐药性，有的地区竟达到50％，给治疗肺炎带来了困难。故对于肺炎应重在预防，接种肺炎疫苗便是预防的一种好方法。

肺炎球菌感染，一是来自自身带菌，当抵抗力降低时，肺炎球菌向下呼吸道侵犯引起肺炎；二是被来自带菌的别人或患者所传染，引起肺炎。人人都有发生这种肺炎的机会，但发生肺炎的高危人群包括：体弱的儿童和成年人；60岁以上的老年人；反复发作上呼吸道疾病，包括鼻窦炎、中耳炎的儿童和成年人；肺部疾病患者、心脏疾病患者、肝脏疾病患者、肾脏疾病患者、糖尿病患者、癌症患者、镰状细胞性贫血患者、何杰金氏病患者、免疫系统功能失常者、脾切除者(确定要进行脾切除的病人，应至少在术前15天接种疫苗)；确定要进行免疫抑制治疗者；长期居住在慢性病护理或长期护理机构者。以上人群均为应接种“多价肺炎球菌疫苗”的主要对象。

目前，我国使用的肺炎球菌疫苗，为“多价肺炎球菌多糖疫苗”(纽莫法23)。它是美国默沙东、法国巴斯德公司研制生产，经我国卫生部批准在全国推行。该疫苗包含了主要引起肺炎和败血症的23种肺炎球菌，可对90％的肺炎球菌产生免疫力，故称“多价”。一次注射后，15天可产生保护性抗体，保护期至少持续五年；必要时，在一次注射后第六年再注射一次。接种肺炎疫苗一般不会有什么反应。接种后少数人可出现注射部位疼痛、红肿等轻微反应；少于1％的接种者可出现低热；可在2-3天内自行恢复。过敏反应极为罕见。但该多糖疫苗的显著缺点是对3个月～2岁的婴幼儿无效。

肺炎球菌84个血清型不是每一个型都能同样地侵袭人体。引起疾病的肺炎球菌型别常因地区、年代和人群的不同而不同。美国1977年批准第一个14价肺炎球菌多糖疫苗投放市场。疫苗中的14个血清型肺炎球菌引起的肺炎，占侵袭性肺炎球菌性肺炎的68％。1983年来，一种重新配方的23价疫苗代替了14价疫苗，这23个血清型肺炎球菌引起85％以上的侵袭性感染。

我国于1981年5月～1985年7月，从病人不同标本中共分离712株肺炎球菌，按WHO推荐的丹麦方法和标准进行了分型，其中5型最多，其次是6、1、19、23、2、3及8型共8个型(群)，占全部肺炎球菌感染的63.6％，这8个型(群)都包括在23价肺炎疫苗中。

鉴于目前的23价肺炎多糖疫苗对2岁以下的婴幼儿的免疫原性较差，因此，本领域迫切需要开发新的可有效应用于2岁以下的婴幼儿的多价肺炎疫苗。

此外，本领域还迫切需要开发新的针对亚洲(尤其是中国)肺炎球菌的肺炎疫苗。

发明内容

本发明的目的就是提供一种有效应用于2岁以下的婴幼儿的、且针对亚洲(尤其是中国)肺炎球菌的多价肺炎疫苗。

在本发明的第一方面，提供了一种肺炎链球菌多糖-载体蛋白偶联物，它具有下式：

                        Pr-L-Ps

其中，Pr是载体蛋白，

Ps是肺炎链球菌多糖，

L是共价键、或连接基团，

且Ps∶Pr的质量比为0.5-3.5∶1。

在另一优选例中，所述的载体蛋白选自：破伤风类毒素蛋白、白喉类毒素蛋白、或其混合物。

在另一优选例中，所述的肺炎链球菌多糖是来自以下肺炎链球菌亚型的多糖：亚型4、6B、9V、14、18C、19F、23F或其组合。

在另一优选例中，所述的L是共价键。

在另一优选例中，所述的Ps∶Pr是质量比为0.5-3∶1。

在另一优选例中，所述的肺炎链球菌多糖是用以下步骤制备的：

(b1)向肺炎链球菌培养物中加入脱氧胆酸钠，进行杀菌；

(b2)离心去除菌体，收集上清；

(b3)加入乙醇至体积终浓度为70-90％；

(b4)离心去除色素、无机盐，收集沉淀；

(b5)重新溶解沉淀；

(b6)加入苯酚至体积终浓度为72-76％，以去除蛋白；

(b7)加入氯化钙至重量终浓度为1±0.2M，并加入乙醇至体积终浓度为5-35％；

(b8)离心去除沉淀的核酸杂质，取上清；

(b9)加入乙醇至体积终浓度为60-95％；

(b10)离心，收集沉淀物，获得纯化的肺炎链球菌多糖。

在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，它含有本发明上述的的肺炎链球菌多糖-载体蛋白偶联物和药学上可接受的载体。

较佳地，所述偶联物中的肺炎链球菌多糖包括以下7种肺炎链球菌亚型的多糖：亚型4、6B、9V、14、18C、19F和23F。

在另一优选例中，所述的药物组合物是疫苗。

在本发明的第三方面，提供了一种制备肺炎链球菌多糖-载体蛋白偶联物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)培养肺炎链球菌，获得肺炎链球菌培养物；

(b)从肺炎链球菌中提取多糖；

(c)将提取的多糖与载体蛋白偶联，形成肺炎链球菌多糖-载体蛋白偶联物，其中所述的载体蛋白是破伤风类毒素蛋白、白喉类毒素蛋白、或其混合物。

在另一优选例中，步骤(b)包括：

(b1)向肺炎链球菌培养物中加入脱氧胆酸钠，进行杀菌；

(b2)离心去除菌体，收集上清；

(b3)加入乙醇至体积终浓度为70-90％；

(b4)离心去除色素、无机盐，收集沉淀；

(b5)重新溶解沉淀；

(b6)加入苯酚至体积终浓度为72-76％，以去除蛋白；

(b7)加入氯化钙至重量终浓度为1±0.2M，并加入乙醇至体积终浓度为5-35％；

(b8)离心去除沉淀的核酸杂质，取上清；

(b9)加入乙醇至体积终浓度为60-95％；

(b10)离心，收集沉淀物，获得纯化的肺炎链球菌多糖。

在另一优选例中，所述的偶联步骤(c)中先采用溴化氰活化多糖，然后再采用碳二亚胺将活化的多糖与蛋白共价偶联。

具体实施方式

本发明经过深入而广泛的研究，发现将肺炎链球菌的多糖与合适的载体蛋白偶联后所形成的偶联物能够有效地激发幼小动物的免疫应答，从而产生有效的预防保护作用。此外，本发明人还确定了特别适用于亚洲(尤其是中国)人群的肺炎球菌疫苗中的多糖类型，从而研制出了适用于婴幼儿的、且针对亚洲(尤其是中国)肺炎球菌的多价肺炎疫苗。

术语

如本文所用，“肺炎链球菌多糖-载体蛋白偶联物”指由肺炎链球菌多糖通过共价键或连接基团的连接于载体蛋白所形成的偶联物。在本发明中，所述的偶联物有时被简称为“本发明偶联物”。

如本文所用，术语“肺炎链球菌多糖”指来源的肺炎链球菌荚膜的多糖。所述荚膜多糖可用本领域常规的方法制备。在另一优选例中，所述多糖是用本发明人发明的特定方法提取的。

如本文所用，术语“载体蛋白”指任何能够与肺炎链球菌多糖偶联的、分子量为10-200KD的蛋白。优选的载体蛋白包括(但并不限于)：破伤风类毒素蛋白、白喉类毒素蛋白(例如CRM197无毒力的白喉菌株产生的白喉毒素蛋白)、或其他合适的载体蛋白或其混合物。一种特别优选的载体蛋白是破伤风类毒素蛋白，因为类毒素蛋白本身是一种免疫注射剂。

如本文所用，术语“肺炎球菌多糖结合疫苗”指含有本发明偶联物的疫苗组合物。

研究发现，在人类的免疫系统发展过程中，对胸腺非依赖性抗原的免疫反应是逐步的成熟，产生特异性抗体。即在婴幼儿只对胸腺依存性抗原如蛋白质抗原产生抗体，随着系统的发育，接着产生抗不同类型多糖的抗体。这个顺序最初在羊胎中被证实：它对两种蛋白抗原产生免疫应答，而对沙门氏菌或分枝杆菌多糖表面抗原无应答。用细菌性多糖疫苗接种婴幼儿的免疫实验，揭示了在两岁之前的应答模式都与羊胎中相似。

多糖类属于胸腺非依赖性抗原(TI)，在幼小动物及免疫系统特别是T辅助细胞发育较晚的婴幼儿产生较弱的免疫反应，不能形成有效的保护，而多糖在与载体蛋白结合后，成为胸腺依赖性抗原，成为对婴幼儿有效的疫苗。

在本发明中，将多糖结合到蛋白载体上制成的结合疫苗可以克服婴幼儿对多糖抗原无应答的现象。结合疫苗的作用在于：使多糖抗原由胸腺非依赖性抗原(TI)转化为胸腺依赖性抗原后，使多糖类抗体的产量增加，特别在小孩的接种；反复注射时可产生免疫增强作用；刺激免疫系统的成熟，而产生主要为IgG的抗体反应；事先，或同时注射载体蛋白时会刺激T细胞的增殖，因而加强、增进结合疫苗达到最高的免疫反应。

本发明还提供了肺炎链球菌多糖-载体蛋白偶联物的制备方法。它包括步骤：

A、细菌培养：

肺炎链球菌的培养技术和条件可采用本领域的常规技术和条件。例如，从生产种子批中划板挑取菌种，接种于5毫升培养液中，扩大到500毫升培养液中，再次扩大到5升培养液中。培养条件为一般培养链球菌的条件。

B、多糖提取：

当细菌培养到OD≥1.5时，停止继续培养，加入脱氧胆酸钠杀菌。

离心，去除菌体，收集上清。

在上清液中加乙醇至体积终浓度为70-90％，离心收集沉淀的粗制多糖。在其他报道的工艺中没有这一步乙醇沉淀，这样容易使很多杂质带入下一步分离纯化，最终很难被去除掉，从而影响多糖的纯度。

沉淀物重新溶解后，加入苯酚除蛋白。

然后向溶液中加入CaCl₂至终浓度为1±0.2M和低浓度的乙醇，低浓度的乙醇可以沉淀细胞碎屑和一些其他杂质，但不能去除可溶性杂质。乙醇浓度不宜太低，否则不能起到沉淀效果；反之浓度太高会导致部分荚膜多糖共沉淀，影响得率。乙醇的浓度应在5％-35％范围内；较佳的，在10％-30％；最佳的，在20％-25％范围内。离心，去除核酸。此时溶液中已无固体碎屑、核酸、蛋白等杂质。

向溶液中加入高浓度的乙醇，乙醇浓度控制在60％-95％；较佳的，65％-90％；最佳的，70％-80％范围，可以将多糖沉淀下来，离心收集沉淀物即为精制多糖。

由于一定的荚膜多糖血清型的低聚糖重复单位的组份和环连的程度有着差异，所以在化学性质上的表现也会有所不同，调整乙醇的浓度，离心的时间和速率，可以得到更理想的分离效果。

C、多糖与载体蛋白的偶联

偶联步骤可以采用本领域常规的偶联技术和条件。例如，在多糖中加入溴化氰活化，再加入己二酰肼处理，衍化率约为1-3％。加入破伤风类毒素和碳二亚胺，反应得到肺炎球菌荚膜多糖与破伤风类毒素蛋白的化学共价偶联物，经分离纯化去除小分子化合物，得到最终的偶联物产品。

在一优选例中，本发明方法采用溴化氰活化与碳二亚胺分步反应，提高了多糖与蛋白的结合效率(约提高30％)，这较国外报道的单纯采用溴化氰活化的方法要好得多。

对于某些亚型的多糖可采用其他方法制备以提高效率。例如在多糖中加入高碘酸钠氧化，检测醛基，分子量大小和糖含量，再加入破伤风类毒素和硼氰氢化钠反应得到多糖-蛋白结合物。

该两种结合反应均可以获得多糖-载体蛋白结合物，但是由于不同亚型菌株荚膜多糖的结构和组成有所不同，两种反应的效率也存在着显著差异。因此应根据不同多糖选用不同的结合方法。较佳地，9V、14、18C、19F、23F型多糖采用溴化氰活化、碳二亚胺结合法；4、6B型多糖宜采用高碘酸钠氧化、硼氰氢化钠结合法制备。

分离偶联物的方法有乙醇沉淀法，凝胶过滤法、梯度离心法等等，这些方法皆为本领域专业人员所熟知。在一优选例中，采用DEAE离子交换柱进行色谱分离。将多糖-蛋白结合物悬浮于缓冲液中，缓冲液可使用100mM Tris，pH8.6。

经上述处理的初步分离产物，再经过分子筛柱进行分离，去除未结合的蛋白。分离后的溶液经除菌过滤后，即为多糖结合疫苗的半成品，可按一定的剂量比配制成有效剂量的多价疫苗组合物。

本发明还提供了一种药物组合物(包括疫苗组合物)，它含有本发明的多糖-载体蛋白偶联物以及药学上可接受的载体。合适的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。本发明的药物组合物还可各种本领域常用的佐剂。

本发明的药物组合物可以被制成针剂、片剂和胶囊等各种制剂，其中含有免疫有效量的活性成分(即本发明的多糖-载体蛋白偶联物)，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。

本发明的药物组合物可通过常规给药方式给药，其中包括(但并不限于)：口服、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、或皮内给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明多糖-载体蛋白偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点在于：

(1)采用的肺炎球菌亚型是在中国分离得到的地方菌株，这些菌株产生的肺炎球菌荚膜多糖是在我国境内引起肺炎症状的主要病原。因此采用本地致病菌株产生的荚膜多糖作为免疫原更有针对性的治疗作用。

(2)本发明采用的制备肺炎球菌多糖的工艺是经优化的工艺，操作简单，成本低，易控制。

(3)本发明采用的制备多糖结合疫苗的化学偶联方法是采用溴化氰活化或还原胺化法两种不同的偶联方式相结合，提高了多糖与蛋白结合的效率，也提高了结合疫苗的稳定性。

(4)本发明所采用的结合蛋白是破伤风类毒素蛋白，不同于国外报道的其他蛋白。采用该类毒素蛋白的优点在于：该类毒素蛋白本身是一种免疫注射剂，其临床应用的安全性已得到验证；该蛋白价格便宜，生产方便；该蛋白与多糖结合的效率较高(可以达到70％以上的水平)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1  肺炎链球菌亚型的选择

我国1981年5月-1985年7月，从病人不同标本中分离712株肺炎球菌，按WHO推荐的丹麦方法和标准进行了分型，分成42个型(群)，没有发现40、42和47型，其中5型最多，其次是6、1、19、23、2、3及8共8个型(群)共453株，占63.6％。不同病种的主要血清型不同，肺炎主要为：1、5、14和6型；脑膜炎以2、5、6、1、27和14型为主；中耳炎则以19、6、5、23、3和14型为常见。肺炎球菌的主要流行菌型有时会发生变迁，因此，菌型监测是一项十分重要的工作，它是确定肺炎球菌疫苗血清型的组合、积极预防肺炎球菌感染的重要科学依据。

在实际应用中，选择几种亚型的多价疫苗基本上可以覆盖对于其他全部亚型的免疫保护。这是因为各亚型多糖之间存在着交叉免疫的原因。

本发明人针对引起我国儿童病因的几种主要亚型进行了筛选，挑选出10种亚型作为多价多糖免疫原，而其中七种亚型是更主要的，它们是亚型4、6B、9V、14、18C、19F和23F。这些亚型是我国流行病观察中分离得到的，针对中国肺炎病原更具针对性。

实施例2  肺炎链球菌荚膜多糖的制备

A、细菌培养：

分别选用4、6B、9V、14、18C、19F和23F亚型的肺炎链球菌。从生产种子批中划板挑取菌种，接种于5毫升培养液中，扩大到500毫升培养液中，再次扩大到5升培养液中。培养条件为一般培养链球菌的条件。

B、多糖提取：

(b1)当细菌培养到OD≥1.5时，停止继续培养，加入脱氧胆酸钠杀菌。

(b2)14000g离心，去除菌体，收集上清。

(b3)在上清液中加乙醇至浓度分别为70％、80％和90％。

(b4)离心去除色素、无机盐等杂质，收集沉淀的粗制多糖。

(b5)加入蒸馏水，使沉淀物重新溶解。

(b6)加入苯酚至体积终浓度为72-76％，从而去除蛋白。

(b7)然后向溶液中加入CaCl₂至终浓度为1M和低浓度的乙醇至体积终浓度分别为10％、20％和30％。

(b8)离心去除核酸，取上清。此时上清溶液中已无固体碎屑、核酸、蛋白等杂质。

(b9)向溶液中加入高浓度的乙醇至体积终浓度分别为65％、75％、85％和95％，分别将多糖沉淀下来。

(b10)离心收集沉淀物，即为精制的肺炎链球菌多糖。

对上述不同条件所获得的多糖进行检测，发现质量基本相近。

实施例3

肺炎链球菌多糖的质量鉴定

精制的多糖质量对于结合反应的影响很大，如果多糖样品不纯，会影响结合反应的效率，使结合率大大下降，从而使最终产品中多糖与多糖蛋白结合物的比例发生变化，多糖蛋白结合物在最终产品中比例的减少会降低对T细胞刺激作用，因此控制多糖中间产品的质量显得尤为关键。

本发明人经过多次反复试验，对不同亚型的肺炎链球菌多糖总结出下列数据，作为对多糖质量的控制标准。当然这并非是唯一标准。

亚型	核酸	蛋白	总氮	总磷	分子大小(Kd)	糖醛酸	氨基己糖	甲基戊糖
									4	≤2	≤3	≤2	4-6	≤0.15		≥40
6B	≤2	≤2	≤2	0-2	≤0.50			≥15
									9V	≤1	≤2	≤2	0.5-3	≤0.45	≥15	≥13
14	≤2	≤5	≤2	1.5-4	≤0.30		≥20
									18C	≤2	≤3	≤2	0-1	≤0.15		≥14
19F	≤2	≤3	≤2	1.4-3.5	≤0.20		≥12.5	≥20
									23F	≤2	≤2	≤2	0-1	≤0.15			≥37

注：以上各项指标的检测，可按照通用化学检测标准作为参照。这些方法是本领域及化工领域的专业人员所熟知的。

实施例4  多糖与蛋白的偶联

在本实施例中，对9V、14、18C、19F、23F型多糖采用溴化氰活化、碳二亚胺结合法制备，对4、6B型多糖采用高碘酸钠氧化、硼氰氢化钠结合法制备。

(a)溴化氰活化、碳二亚胺结合法

将实施例2制得的9V、14、18C、19F、23F型等不同亚型的多糖中加入溴化氰活化(多糖与溴化氰的重量比例为1∶0.5)，再加入己二酰肼处理，衍化率为1-3％。再加入破伤风类毒素和碳二亚胺(19.17mg/ml)，反应得到肺炎球菌荚膜多糖与破伤风类毒素蛋白的化学共价偶联物。采用DEAE离子交换柱进行色谱分离，即将多糖-蛋白结合物悬浮于缓冲液中，缓冲液可使用100mM Tris，pH8.6，去除小分子化合物，得到纯化的偶联物产品。

本工艺采用溴化氰活化与碳二亚胺分步反应提高了多糖与蛋白的结合效率(约提高30％)，较国外报道的单纯采用溴化氰活化的方法要好得多。

(b)碘酸钠活化、硼氰氢化钠结合法

将实施例2制得的4、6B型等不同亚型的多糖中加入高碘酸钠氧化(多糖与高碘酸钠之比为1M∶1.2-1.8M)，检测醛基，分子量大小和糖含量，再加入破伤风类毒素和硼氰氢化钠(多糖与硼氰氢化钠之比为1M∶1.2-1.8M)，反应得到多糖—蛋白结合物。

采用100KD的超滤器纯化，以去除残留的，硼氰氢化钠，得到初步纯化的偶联物。

(c)再次纯化

对于(a)和(b)两种方法制备的初步分离产物，再经过分子筛柱进行分离，去除未结合的蛋白。分离后的溶液经除菌过滤后，即为多糖结合疫苗的半成品，可按一定的剂量比配制成有效剂量的多价疫苗组合物。

实施例5  多价多糖结合疫苗的配制

将上述生产的各个多糖结合疫苗(七份)用无菌注射用水稀释至终浓度为10ug/ml，然后取等体积的各种多糖结合疫苗(七份)，混合，配成每毫升含有10ug七种多糖结合疫苗混合的多价多糖结合疫苗。根据药物试验效果可以稀释成每毫升0.1至10ug七价多糖结合疫苗制剂。

实施例6  单价肺炎球菌多糖—破伤风类毒素偶联物的质量控制

在生产制备肺炎链球菌多糖多价结合疫苗前，应对每一种单价肺炎球菌多糖—破伤风类毒素偶联物的质量进行严格鉴定。

在本实施例中，对实施例4和5制备的结合疫苗进行质量检测。

一、测试方法

(a)总糖含量测定

1.样品测定

精确量取1.0ml液体样品，加蒽酮硫酸混合液4.0ml匀，水浴20分钟后在分光光度计上620nm波长测定A值。

2.标准曲线测定

精确量取100ug/ml标准葡萄糖液0ml 0.2ml 0.4ml 0.6ml 0.8ml 1.0ml以蒸馏水补加至1.0ml。其余操作同样品检定。以标准葡萄糖浓度与对应A值进行回归运算，求出回归方程。

3.结果计算

以样品检测A值根据回归方程，计算样品含量。

(b)蛋白质含量测定

1.样品

精确量取一定体积样品(含蛋白质50ug左右)于试管中，加5ml碱性铜液，混匀，于室温放置10分钟，快速加入0.5ml酚试剂，混匀，于室温放置30分钟，用650nm波长或红色滤光片比色(呈色后，如发现混浊，经3000r/min离心15分钟后再比色)。

2.标准曲线

精确量取标准蛋白质溶液(100ug/ml)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置于试管中，加蒸馏水补至1ml，其余操作同样品，可得一标准曲线。

3.计算

从标准曲线查出样品相当标准蛋白质溶液之ml数A：

样品蛋白质含量(g/ml)＝A×0.01％/样品ml数

(c)荚膜多糖抗原分子大小测定

1.多糖抗原Kd值的测定

1.1取约1ml样品(含多糖抗原3～5mg)。加于已标定的琼脂糖4B胶柱上，用0.2mol/L氯化钠溶液流洗，流洗液用量为柱床总体积的1.5倍，每管收集2～4ml，同时于206nm波长下自动监测，记录洗流液图谱，由加样起至多糖峰峰顶流洗体积为Ve，计算分配系数(Kd)。

Kd＝(Ve-Vo)/(Vi-Vo)

1.2Kd≤0.3多糖抗原回收率的计算

用求积仪分别计算Kd值0.3以前组分峰的面积除以所有组分峰的总面积，即得Kd≤0.3多糖抗原回收率。

(d)游离蛋白

用HPLC排阻层析法可将游离载体蛋白从偶联物中分离。大偶联物分子首先洗脱，随后是较小分子量的游离蛋白。用210nm紫外检测器检测待测时间段的洗脱峰。

(e)游离糖

将样品吸附到固相基质后(氢氧化铝作为吸附剂)，把游离糖与糖蛋白偶联物分离，游离糖出现在洗脱液中。然后用蒽酮法检测洗脱液及初始样品的糖含量，以确定原液中游离糖的百分比。还需用Lowry法测定洗脱液蛋白含量，以确定吸附过程已将偶联物全部去除。

(f)结合物的动物试验

1.家兔：

2～4ug/0.5ml剂量的各型偶联物注射家兔后可引起显著的免疫应答反应。单独注射多糖或氧化后被封闭的多糖与载体蛋白的混合物不产生免疫应答或仅有较低抗体增长。

2.小鼠：

NIH或雌性BALb/c小鼠，按阴性对照组，阳性对照组，疫苗组各20只，每只0.5ug/0.2ml，0、14、21日免疫，28日采血(收集血清)，用ELISA法检测各组抗体滴度。

(g)鉴别试验

双向琼脂免疫扩散试验：一个特定的抗血清能够特异地识别其特定组分。实验的有效性依赖于每种型各批特定的抗血清。每批抗血清在实验前均需用蛋白质-糖偶联物作稀释度实验。通过该实验可得出最佳的稀释浓度。当检品与其相应的抗血清发生反应时，该检品判为合格，每次实验均需要有一个阳性及阴性标准品对照。

二、结果

各项试验结果如下表所示。

项目	方法	4	6B	9V	14	18C	19F	23F
									分子量(kd≤0.3)	层析法	≥40％	≥40％	≥40％	≥50％	≥40％	≥40％	≥40％
糖含量(ug/ml)	蒽酮法	≥50	≥50	≥50	≥50	≥50	≥50	≥50
									糖/蛋白	糖/蛋白质量比	0.7-2.2	0.6-1.0	0.8-2.8	1.0-3.0	0.6-2.0	0.6-1.5	0.5-1.5
鉴别试验	双扩法	阳性	阳性	阳性	阳性	阳性	阳性	阳性
									游离蛋白(w/w)	排阻层析法	≤1％	≤1％	≤1％	≤1％	≤1％	≤1％	≤1％
游离糖(w/w)	蒽酮法	≤25％	≤25％	≤25％	≤25％	≤25％	≤25％	≤25％
									残余氰基(pg/ug)	氰基比色法	≤300	≤300	≤300	≤300	≤300	≤300	≤300
动物试验	兔或小鼠血清抗体	阳性	阳性	阳性	阳性	阳性	阳性	阳性

这些结果表明，本发明的多价肺炎球菌多糖结合疫苗符合质量要求，而且可以用于免疫动物产生抗肺炎链球菌的抗体。

多糖与载体蛋白共价结合后所形成的偶联物使多糖由胸腺非依赖性抗原转变为胸腺依赖性抗原，使用于婴幼儿能产生对多糖抗原的免疫应答反应，形成有效的保护。多糖—蛋白偶联物制作过成中对各种理化指标的控制及动物试验，保证了偶联物结合疫苗在婴幼儿中使用的安全有效。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种肺炎链球菌多糖-载体蛋白偶联物，其特征在于，它具有下式：

                           Pr-L-Ps

其中，Pr是载体蛋白，

Ps是肺炎链球菌多糖，

L是共价键、或连接基团，

且Ps∶Pr的质量比为0.5-3.5∶1，

其中，所述的肺炎链球菌多糖是以下7种肺炎链球菌亚型的多糖混合物：亚型4、6B、9V、14、18C、19F和23F。

2.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述的载体蛋白选自：破伤风类毒素蛋白、白喉类毒素蛋白、或其混合物。

3.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述的载体蛋白是破伤风类毒素蛋白。

4.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述的L是共价键。

5.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述的Ps∶Pr是质量比为0.5-3∶1。

6.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述的肺炎链球菌多糖是用以下步骤制备的：

(b1)向肺炎链球菌培养物中加入脱氧胆酸钠，进行杀菌；

(b2)离心去除菌体，收集上清；

(b3)加入乙醇至体积终浓度为70-90％；

(b4)离心去除色素、无机盐，收集沉淀；

(b5)重新溶解沉淀；

(b6)加入苯酚至体积终浓度为72-76％，以去除蛋白；

(b7)加入氯化钙至重量终浓度为1±0.2M，并加入乙醇至体积终浓度为5-35％；

(b8)离心去除沉淀的核酸杂质，取上清；

(b9)加入乙醇至体积终浓度为60-95％；

(b10)离心，收集沉淀物，获得纯化的肺炎链球菌多糖。

7.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1所述的肺炎链球菌多糖-载体蛋白偶联物和药学上可接受的载体。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，它是疫苗。

9.一种制备权利要求1所述的肺炎链球菌多糖-载体蛋白偶联物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)培养肺炎链球菌，获得肺炎链球菌培养物；

(b)从肺炎链球菌中提取多糖；

(c)将提取的多糖与载体蛋白偶联，形成肺炎链球菌多糖-载体蛋白偶联物，其中所述的载体蛋白是破伤风类毒素蛋白、白喉类毒素蛋白、或其混合物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(b)包括：

(b1)向肺炎链球菌培养物中加入脱氧胆酸钠，进行杀菌；

(b2)离心去除菌体，收集上清；

(b3)加入乙醇至体积终浓度为70-90％；

(b4)离心去除色素、无机盐，收集沉淀；

(b5)重新溶解沉淀；

(b6)加入苯酚至体积终浓度为72-76％，以去除蛋白；

(b7)加入氯化钙至重量终浓度为1±0.2M，并加入乙醇至体积终浓度为5-35％；

(b8)离心去除沉淀的核酸杂质，取上清；

(b9)加入乙醇至体积终浓度为60-95％；

(b10)离心，收集沉淀物，获得纯化的肺炎链球菌多糖。