CN1218750C - 皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗及制备方法 - Google Patents

皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，特别提供了重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)与卡介苗(BCG)菌液的配比处方、冷冻干燥工艺，同时还提供了涉及该联合疫苗的保护剂、接种剂量、接种途径，属于疫苗生产制备工艺技术领域。该联合疫苗使新生儿接种一针疫苗，可预防乙型肝炎、结核病两种疾病。该联合疫苗含有冻干保护剂，使乙型肝炎病毒表面抗原稳定性提高；并去除单价乙型肝炎疫苗中的铝佐剂、甲醛和硫柳汞等不良成分，安全性提高；兼用卡介苗的强免疫佐剂作用，既增强体液免疫，又增强细胞免疫，使其效果优于单价乙型肝炎疫苗的效果。该联合疫苗采用皮内接种，以低剂量达到相同或超过其它途径高剂量接种的效果。

Description

皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗及制备方法
技术领域
本发明提供一种皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗(简称乙卡联合苗)，特别提供了皮内注射用重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)与卡介苗(BCG)菌液的配比处方、冷冻干燥工艺，同时还提供了涉及该联合疫苗的保护剂、接种剂量、接种途径，属于疫苗生产制备工艺技术领域。
背景技术
乙型肝炎和结核病均为传染性疾病，通过接种相应的疫苗，预防乙型肝炎和结核病一直很有成效。根据计划免疫规定，新生儿在出生24小时内必须接种乙型肝炎疫苗和卡介苗。现行使用的卡介苗为冻干制剂，上臂三角肌处皮内接种，现行使用的皮内注射用重组乙型肝炎疫苗为液体疫苗，含铝佐剂和防腐剂，上臂三角肌肌内接种，这两种疫苗均为单价疫苗，需同日分别接种。因为接种途径不同，以及现行的乙型肝炎疫苗含有防腐剂，因此，与卡介苗不能简单地混合使用，必须两针分别接种，这不仅给新生儿带来痛苦，也给接种增加了许多不便。乙型肝炎疫苗与卡介苗合为一针接种的问题成为本发明要实现的目的。
发明内容
本发明提供一种皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，使新生儿由原来的两针接种简化为一针接种，可达到原来接种两针的预防效果。
本发明还提供一种皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗的冻干剂型。
本发明进一步提供了一种皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗生产工艺，适合于工业化生产。
皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，其特征在于每支成品0.2ml含以下组分及含量：
重组乙型肝炎表面抗原    5微克～20微克
卡介菌                  80微克～120微克
明胶                    0.8～1.0毫克
蔗糖                    8～12毫克
氯化钾                  0.8～1.2毫克
谷氨酸钠                0.8～1.2毫克
氯化钠                  0.8～0.9毫克
余量为注射用水
pH 6.0～7.5
本发明皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗的具体制备方法，包括以下步骤：
(1)提供的卡介菌原液每毫升含以下成份及含量
卡介菌                  800～1200微克
明胶                8～10毫克
蔗糖                80～120毫克
氯化钾              8～12毫克
谷氨酸钠            8～12毫克
余量为注射用水
(2)提供皮内注射用重组乙型肝炎病毒表面抗原原液每毫升含以下成份及含量
皮内注射用重组乙型肝炎病毒表面抗原50～200微克。
氯化钠                   8～9毫克
余量为注射用水
(3)在步骤(1)和步骤(2)中所述两种原液按1∶1比例混合，得到联合疫苗半成品。
(4)在步骤(3)中得到的皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗半成品进行分装，每支0.2毫升。
(5)在步骤(4)中得到的分装品冷冻干燥，步骤为：干燥箱预冻3-4小时，制品冻结7-8小时，逐渐升温真空干燥8-10小时，恒温真空干燥7-8小时，全过程累计25～30小时，制备出皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗成品。
皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗的使用剂量及注射部位
小剂量皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，每支0.2ml含重组乙型肝炎病毒表面抗原5微克和卡介菌80～120微克，用0.2毫升注射用水溶解，取0.1毫升，上臂外侧三角肌中部略下处的皮肤皮内注射。
中剂量皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，每支0.2ml含重组乙型肝炎病毒表面抗原10微克和卡介菌80～120微克，用0.2毫升注射用水溶解，取0.1毫升，上臂外侧三角肌中部略下处的皮肤皮内注射。
大剂量皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，每支0.2ml含重组乙型肝炎病毒表面抗原20微克和卡介菌80～120微克，用0.2毫升注射用水溶解，取0.1毫升，上臂外侧三角肌中部略下处的皮肤皮内注射。
皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗与单价卡介苗免疫效果比较
实验组分别接种按本发明方法制备的三种规格乙卡联合苗，对照组接种同批卡介苗，每组接种4只豚鼠。5周时用结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)进行皮内试验，24～72小时判定局部反应硬结直径。重复实验三次。
PPD皮内试验后24小时后判定结果(见表1)，各实验组与同批对照组相比较，结果相近，t检验p＞0.05，无显著性差异。皮内注射用重组HBsAg对卡介苗免疫效果无影响。
                      表1 PPD皮内试验结果
组别 疫苗     HBsAg剂量μg/0.2ml 反应直径(mm) x±s p
实验1-1组实验1-2组实验1-3组对照1 乙卡联合苗乙卡联合苗乙卡联合苗卡介苗  510200     811.51010.5     129119.5     141310.59     8.58.5713     10.6±2.8610.5±2.129.6±1.7910.5±1.77   p＞0.05
实验2-1组实验2-2组实验2-3组对照2 乙卡联合苗乙卡联合苗乙卡联合苗卡介苗  510200     11.51410.514     1081412     12121110.5     98.59.58     10.6±1.3710.1±2.7111.2±1.9311.1±2.52   p＞0.05
实验3-1组实验3-2组实验3-3组对照3 乙卡联合苗乙卡联合苗乙卡联合苗卡介苗  510200     96.57.57.5     8.588.56.5     7121010     109811.5     8.6±1.258.8±2.328.5±1.088.8±2.28   p＞0.05
皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗与单价皮内注射用重组乙型肝炎疫苗免疫效果比较
按本发明方法制备的联合疫苗取消了原单价皮内注射用重组乙型肝炎疫苗中铝佐剂及防腐剂，而以卡介苗作为抗原同时又作为HBsAg的佐剂，本研究旨在探讨这种改变对皮内注射用乙肝表面抗原免疫原性的影响。
对照组按0、1、2免疫程序接种皮内注射用重组乙型肝炎疫苗，按每只豚鼠10μg/只剂量，腹腔接种。
实验组设三组，免疫程序同对照组(0、1、2)，第一针分组分别皮内接种含HBsAg 2.5μg(5μg/支)、5μg(10μg/支)、10μg(20μg/支)每支0.2毫升，三种剂量的皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗；第二针、第三针的免疫同对照组，都是采用单价皮内注射用重组乙型肝炎疫苗免疫，每只豚鼠10μg/只剂量，腹腔接种。
每次免疫后1个月采血，ELISA方法检测血清抗体滴度。结果见表2、3、4。
                 表2 实验组(2.5μg)与对照组(10μg)免疫效果比较
组别                             血清抗体几何平均滴度(GMT±S)
    S1   S2   S3
实验组对照组     66±0.13(n＝9)151±0.25(n＝8)p＞0.05   9164±0.47(n＝10)5596±0.43(n＝10)p＞0.05   17811±0.33(n＝9)11271±0.23(n＝11)p＞0.05
*S1、S2、S3分别为第一针、第二针、第三针免疫后抗体几何平均值
                  表3 实验组(5μg)与对照组(10μg)免疫效果比较
组别                        血清抗体几何平均滴度(GMT±S)
    S1   S2     S3
实验组对照组     74±0.22(n＝8)151±0.25(n＝8)P＞0.05   10950±0.38(n＝9)5596±0.43(n＝10)P＞0.05     16882±0.42(n＝8)11271±0.23(n＝11)P＞0.05
                   表4 实验组(10μg)与对照组(10μg)免疫效果比较
组别                          血清抗体几何平均滴度(GMT±S)
    S1   S2   S3
实验组对照组     85±0.32(n＝9)151±0.25(n＝8)P＞0.05   12561±0.59(n＝10)5596±0.43(n＝10)P＞0.05   18756±0.43(n＝9)11271±0.23(n＝11)P＞0.05
从表2、表3、表4结果可见，2.5μg、5μg、10μg三种接种剂量的皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗第一针免疫结果，其抗体几何平均滴度均低于单价10μg重组乙型肝炎疫苗腹腔免疫对照组，但第二针、第三针加强免疫后，实验组(联合疫苗组)抗体滴度迅速上升，而且高于对照组，其结果证明，卡介苗对乙型肝炎疫苗的全程免疫效果不仅无不良影响，而且，还有增强免疫效果的作用。
不同剂量皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗对乙型肝炎病毒表面抗原免疫效果的影响
按本发明方法制备三种规格的该联合疫苗，分别含皮内注射用重组乙型肝炎病毒表面抗原为5μg/支、10μg/支、20μg/支，每支0.2毫升含卡介苗均为80～120μg。三种规格的联合疫苗每支用0.2毫升注射用水溶解，取0.1毫升皮内注射，接种“PPD皮内试验”阴性的豚鼠，并按每只豚鼠10μg/只剂量腹腔接种皮内注射用重组乙型肝炎疫苗进行免疫，ELISA方法检测血清抗体滴度。结果从表5可见，三种接种剂量的联合疫苗其免疫效果相近，各组抗体几何平均滴度均无显著性差异。
        表5 皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗三种接种剂量免疫效果比较
    接种剂量                            血清抗体几何平均滴度(GMT±S)
    S1     S2   S3
    10μg5μg2.5μg     85±0.32(n＝9)74±0.22(n＝8)66±0.13(n＝90)P＞0.05   12561±0.59(n＝10)10950±0.38(n＝9)9164±0.47(n＝10)P＞0.05   18756±0.43(n＝9)16882±0.42(n＝8)17811±0.33(n＝9)P＞0.05
皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗安全试验
取该联合疫苗及同批原液的卡介苗，注射用水溶解，选用“PPD皮内试验阴性”、体重300～400g的同性豚鼠，试验组皮下接种50人份联合疫苗，对照组皮下接种50人份卡介苗，每两周称重一次，观察6周后，解剖检查。
三批联合疫苗试验结果，豚鼠体重增加，解剖观察肝、脾、肺、肾、大网膜、肠系膜等脏器与卡介苗组无区别，均无结核病变。
本发明的积极效果在于，制备的皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，使新生儿接种一针疫苗，可预防乙型肝炎、结核病两种疾病，达到接种两针原有单价疫苗的效果。
本发明的积极效果还在于，本发明在制备皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗过程中，不是简单地将两种疫苗混合，而是将皮内注射用重组乙型肝炎病毒表面抗原蛋白与卡介苗菌体两者自然联合，去除了现行使用的乙型肝炎疫苗中铝佐剂、甲醛和硫柳汞等不良成分，提高安全性；在该联合疫苗中，兼用卡介苗的强免疫佐剂作用，既增强体液免疫，又增强细胞免疫，使其效果优于单价乙型肝炎疫苗。同时由于卡介苗的特殊性，必须皮内接种，这也成为该联合疫苗唯一的接种途径，而皮内接种一般为刺激机体免疫反应的最有效途径，它以低剂量接种达到相同或超过其它途径高剂量接种的效果。
本发明的积极效果还在于：该联合疫苗改变了现行使用的乙型肝炎疫苗的液体剂型为冻干剂型，提高了乙型肝炎表面抗原的热稳定性，液体乙型肝炎疫苗通常在37℃15天，效力就显著下降，甚至降为原始效力的一半。由于该联合疫苗含有冻干保护剂，使乙型肝炎病毒表面抗原热稳定性得到提高，37℃30天，ELISA检测未见下降，结果见表6。
           表6 联合疫苗37℃30天ELISA检测结果
    样品组     规格HBsAg量μg/0.2ml     原始结果     37℃30天结果
123 51020 6.7210.8319.65 6.3211.5121.33
具体实施方式
实施例1：
皮内注射用重组乙型肝炎病毒表面抗原原液的制备
按《中国生物制品规程》2000版“皮内注射用(CHO细胞)重组乙型肝炎疫苗制检规程”进行。将适宜代数的含乙型肝炎病毒表面抗原基因的工程细胞CHO-C28扩增、传代，接种15L转瓶或生物反应器，37℃培养，收获培养液，纯化HBsAg，其纯度达95％以上，除菌过滤，用生理盐水稀释至50～200μg/ml。
实施例2：
卡介苗原液的制备
按《中国生物制品规程》2000版“皮内注射用卡介苗制检规程”进行，菌种在苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培养基以及液体苏通培养基上传代、培养。收集菌膜压干，低温下研磨，加入保护剂稀释成0.8～1.2mg/ml浓度。
实施例3：
皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗冷冻干燥保护剂的制备
按下列配方配制冷冻干燥保护剂：
成分                   重量组分含量(克/百毫升)
明胶                   0.8～1.0
蔗糖                   8～12
氯化钾                 0.8～1.2
谷氨酸钠            0.8～1.2
按注射用水加至100毫升的比例进行配比。
pH 6.0～7.5
实施例4：
皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗半成品的制备
其半成品组份及每毫升含量：
重组乙型肝炎表面抗原    25微克～100微克
卡介菌                  400微克～600微克
明胶                    4～5毫克
蔗糖                    40～60毫克
氯化钾                  4～6毫克
谷氨酸钠                4～6毫克
氯化钠                  4～4.5毫克
余量为注射用水
pH 6.0～7.5
实施例5：
皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗成品的制备
干燥箱预冻-40℃3-4小时，再将重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗半成品分装，-40℃冷冻7-8小时，逐渐升温真空干燥8-10小时，30-35℃恒温真空干燥7-8小时，全过程累计25～30小时，即得冷冻干燥的重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗成品。冻干后成品为白色疏松体，水份≤3％(g/g)。

Claims (3)

1.一种皮内注射用重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗，其特征在于由以下组分组成：
每支成品0.2毫升含以下组分及含量：
重组乙型肝炎表面抗原          5微克20微克
卡介菌                        80微克～120微克
明胶                          0.8～1.0毫克
蔗糖                          8～12毫克
氯化钾                        0.8～1.2毫克
谷氨酸钠                      0.8～1.2毫克
氯化钠                        0.8～0.9毫克
余量为注射用水
pH6.0～7.5。
2.权利要求1所述的联合疫苗为冻干剂型。
3.权利要求1所述的联合疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)提供卡介菌原液每毫升含以下成份及含量：
卡介菌                        800～1200微克
明胶                          8～10毫克
蔗糖                          80～120毫克
氯化钾                        8～12毫克
谷氨酸钠                       8～12毫克
余量为注射用水
pH6.0～7.5；
 (2)提供重组乙型肝炎病毒表面抗原原液每毫升含以下成份及含量：
重组乙型肝炎病毒表面抗原50～200微克
氯化钠                  8～9毫克
余量为注射用水
pH6.0～7.5；
(3)在步骤(1)和步骤(2)中所述两种原液按1∶1比例混合，得到联合疫苗半成品；
(4)在步骤(3)中得到的重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗半成品进行分装，每支0.2毫升；
(5)在步骤(4)中得到的分装品冷冻干燥，步骤为：干燥箱-40℃预冻3-4小时，制品-40℃冷冻7-8小时，逐渐升温真空干燥8-10小时，30～35℃恒温真空干燥7-8小时，全过程累计25～30小时，制备出重组乙型肝炎卡介苗联合疫苗成品。
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