CN1197591C

CN1197591C - 一种无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗结核病药物上的用途

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Publication number: CN1197591C
Application number: CNB021235708A
Authority: CN
Inventors: 高尚先; 李守悌
Original assignee: NATIONAL INSTITUTE FOR CONTROL OF PHARMACEUTICAL AND BIOLOGICAL PRODUCTS
Current assignee: Shanghai Changrun Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2002-07-03
Filing date: 2002-07-03
Publication date: 2005-04-20
Anticipated expiration: 2022-07-03
Also published as: CN1465354A

Abstract

本发明公开了一种无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)在制备治疗结核病药物上的用途，其中所述NCP是由短棒状杆菌经破碎制备的无细胞制剂，粒度小于100nm，热原小于160EU/ml，蛋白质含量10-40%(g/g)，核酸含量3-25%(g/g)，其余为多糖。本发明的用途中，所述的NCP为纳米级、颗粒大小均一、吸收度和扩散度提高，低热原，无甲醛残留，可减少短棒状杆菌制剂(CPP)的发烧、胸痛、注射局部红肿、硬结等副作用；本发明的NCP与CPP具有相同的脾激活及抑瘤等生物学活性，以结核分枝杆菌感染的豚鼠为实验动物模型所做的实验证明，本发明NCP对结核分枝杆菌感染的豚鼠模型具有良好的治疗作用。

Description

一种无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗结核病药物上的用途

技术领域

本发明涉及一种免疫调节剂，特别是一种无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)在制备治疗结核病药物上的用途，属于药物领域。

背景技术

短棒状杆菌菌苗(CPV，1995版《中国生物制品规程》)或称短棒状杆菌制剂(CPP，2000版《中国生物制品规程》)是一种非特异性免疫调节剂。它是由短棒状杆菌(CP)经甲醛灭活后制成的死菌苗，其制备过程公开在1995版及2000版《中国生物制品规程》。目前应用的CPP制剂还有法国Merleux研究所生产的灭活菌苗；英国Wellcome药厂生产的灭活菌苗等。

CPP具有激活单核吞噬细胞系统的能力。CPP对免疫系统的作用主要表现在：激活单核巨噬细胞、使NK细胞活性增强、促进机体对多种抗原产生IgG和IgM、诱生干扰素、白细胞介素-2等，因此具有抗肿瘤和抗感染作用。

CPP的抗肿瘤作用已为许多实验和临床研究所证实。对实验动物接种肿瘤前后应用CPP，能显著抑制某些实体瘤(如乳腺癌、黑色素瘤等)、腹水型肿瘤及白血病的生长。肿瘤消退的动物对于再次攻击的肿瘤细胞有特异性的抵抗力。CPP对肿瘤转移亦有抑制作用。

CPP抗肿瘤及抗感染的核心是通过激活巨噬细胞，使其数量和质量大大提高，激活的巨噬细胞可将肿瘤细胞及感染的微生物杀死。

CPP作为免疫调节剂用于肿瘤及其它疾病的治疗已有数十年的历史，其通过激活单核巨噬细胞系统抗肿瘤、抗感染的效果已被公认。CPP作为一种非特异性免疫增强剂，其有效性是至今为止发现的最好的制品之一。但由于存在一定的副作用，如发烧、胸痛、注射局部易产生肿痛、硬结等副作用，限制了其应用。

结核病(TB)是严重危害人类健康的传染病，是我国重点控制的重大疾病之一，也是全球关注的公共卫生问题和社会问题。它是由结核分支杆菌引起的一种慢性传染病。肺是结核感染的主要和起始器官，除肺外，其它系统器官均可受累。本病病理特点为结核结节和干酪样坏死。临床多为慢性过程。

我国是世界上22个结核病高负担国家之一，目前患结核病的人数居世界第二位，其中80％在农村，现有结核杆菌感染者4亿人，结核病患者500万人，其中传染性肺结核病患者200万人。世界卫生组织(WHO)已把结核病与爱滋病、疟疾一起列为人类的最主要杀手。1993年，WHO曾向全世界发出结核病卷土重来的警告。

目前结核病治疗以化疗为主，现代合理规律的化疗可在几天内降低结核病灶内结核杆菌的活菌数目，多数结核杆菌可在2-4周内被灭活。但是对于在巨噬细胞内存活处于休眠状态结核杆菌疗效欠佳，需要治疗5个月甚至更长时间，因而该疗法有几种缺陷：(1)化疗尤其是一些不规律化疗导致耐药菌比例上升，根据结核病流行病学调查结果表明1979年原发耐药菌比例为26.2％而1985年上升至47.8％，给化疗带来极大困难。(2)化疗后残留结核杆菌仍然可以导致复发。(3)长期化疗直接增加患者经济承受能力与身体肝脏、肾脏毒性。为此，在化疗基础上对结核病患者辅以免疫治疗的疗法引起了广大研究者注意。

结核病的免疫治疗以细胞免疫为主，体液免疫为辅，结核杆菌对化疗药物易产生耐受性。单独应用抗结核药物治疗，往往不易收到满意疗效。因此，对结核病人除用常规抗结核药物外，辅以免疫调节剂可以调整机体免疫功能，缩短疗程，减少化疗药物用量，减少化疗药物对肝、肾的毒性，减少复发，提高治愈率。

由于CPP是一种优良的非特异性免疫增强剂，如果通过新的技术手段降低其副作用，将会有着广泛的应用前景。

CPP为革兰氏阳性菌，本身无内毒素亦称脂多糖(LPS)，但目前CPP经鲎试剂法测定含有较多LPS，这主要是由于现有CPP制造及检定规程对其没有限量要求所致。

CPP是CP经甲醛灭活制成的死菌苗，残留有微量甲醛。由于甲醛对机体具有较强的刺激性，况且甲醛也是国际上公认的致癌物质，虽然CPP中甲醛残留量很少，但仍会对人体较为敏感的胸膜产生刺激性。

研究表明，药物加工到纳米级之后，可显著提高吸收度、扩散度，有利于降低药物的某些副作用，提高药效。

通常微生物细胞的破碎技术为机械法、非机械法两种。机械法包括：高压匀浆器、高速珠磨机、超声波震荡器，非机械法包括化学法、酶解法、渗透压冲击法、冻融法和干燥法。虽然细胞破碎的方法很多，但都难以将细胞破碎到粒度均一的纳米级。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)在制备治疗结核病药物上的用途，所述NCP为纳米级、颗粒大小均一、吸收度及扩散度提高，低热原、无甲醛残留，与全菌体制剂具有相同的脾激活及抑瘤等生物学活性，可减少CPP的发烧、胸痛、注射局部红肿、硬结等副作用，可用于结核病的治疗或辅助治疗。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种NCP在制备治疗结核病药物上的用途。

其中所述NCP为由CP经破碎制备的无细胞制剂，粒度小于100nm。

本发明所述的NCP的热原小于160EU/ml，蛋白质含量10-40％(g/g)，核酸含量3-25％(g/g)，其余为多糖。

优选热原小于60EU/ml，蛋白质含量20-30％(g/g)，核酸含量3-10％(g/g)，其余为多糖。

所述NCP的粒度优选为10-50nm。

本发明所述的NCP是通过下述步骤制备的：

1).CP工作种子批菌种连续2-4次传代后接种于大瓶或营养罐，在培养基中培养5-7天；

2).收集无杂菌污染的菌体，加热煮沸15-60分钟得到菌液；

3).无菌试验合格的菌液经洗涤后，用破碎装置破碎菌体；

4).菌体破碎后的悬液经离心后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液；

5).将悬液加热灭菌，得到NCP。

其中步骤1)中所述的CP学名为粉刺丙酸杆菌(propionibacterium acnes)，菌号为65101(76-27)、65102(H-84)或65103(77-1)，其中76-27亦称为7627，77-1亦称为771。

培养基为选自硫乙醇酸盐、蛋白胨、肝或酵母透析液中的一种，且为低热原培养基。

步骤1)中培养条件为36-37℃培养。

其中所述培养基中的硫乙醇酸盐培养基为不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基。优选不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基。

步骤3)中所述的菌体是灭活菌，菌体浓度为50-500亿/ml。

所述破碎装置是将菌体破碎到小于100nm，优选粒度为10-50nm的超高压射流对撞机。

所述菌体破碎是在无菌条件下进行。

步骤3)中所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤至少2次。

步骤4)中所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤0-5次；

步骤4)菌体破碎后悬液的离心条件是在4℃-室温，6000-12000rpm下离心30-150分钟。

步骤5)中所述的加热为在60-65℃加热0.5-2小时。

本发明的制备方法中，进一步包括将步骤5)得到的NCP分装后，安瓿在60±2℃加热30分钟。

本发明中所述培养基优选为经过0.22或0.45μm膜过滤的培养基。

本发明所述的制备方法中，还包括将步骤5)得到的NCP冷冻干燥，得到冻干制剂。

本发明用于制备治疗结核病药物的NCP，热原小于160EU/ml，蛋白质含量10-40％(g/g)，核酸含量3-25％(g/g)，其余为多糖。

本发明NCP粒度小于100nm，优选粒度为10-50nm。

本发明中所述的无菌检验合格是指按照《中国生物制品规程》规定的方法检验不得有任何细菌生长。

本发明中由于采用低热原培养基，特别是硫乙醇酸盐，并经过严格的质控，以及整个制备过程中无菌低热原操作，保证了最终产物低热原和无杂菌污染。

本发明通过超高压射流对撞机将CP破碎至纳米级，通过选择不同的离心力(转速)，确定了离心提取条件，获得的沉淀部分为NCP，经多次动物实验证明，该制剂与全菌体制剂具有相同的脾激活及抑瘤等生物学活性，上清部分则无脾激活及抑瘤作用，因此，本发明用于制备治疗结核病药物的NCP具有良好的生物学活性。

为了消除CPP中残留甲醛对机体的刺激性，尤其是对敏感胸膜的刺激性，本发明中采用加热灭活替代了甲醛灭活。动物实验表明，加热灭活的NCP、CPP较甲醛灭活的CPP具有相同的脾激活及抑瘤等生物学活性。

超高压射流对撞机的工作原理是将混有被加工物的液体用高压泵(工作压力为10-3000kgf/cm²)加压后分成两股，以高速射流进入两片直径为8MM人造金刚石晶片组成的通道中，相向对撞后流出。由于液体的速度很高，流体相向对撞时产生很强的冲击波，使金刚石晶片产生高频、高强超声波。大功率高频超声波使被加工物颗粒瞬间粉碎、超微化。

本发明的制备过程中，为更好地破碎菌体，采用超高压射流对撞机，在菌体浓度为50-500亿/ml，工作压力为800-1500kgf/cm²的条件下破碎，破碎后的菌体悬液在4℃-室温下，6000-12000rpm离心30-150分钟，弃上清，沉淀用无菌生理盐水溶液洗涤0-5次后制成悬液，在60-65℃加温0.5-2小时，无菌试验合格后合并，经配制、分装，分装后安瓿在60±2℃加热15-60分钟，得到高质量、粒度和均一性良好的目的产品。

本发明的NCP是将CP的细胞破碎至纳米级，去除无效的上清部分制备的，产品具有低热原、无杂菌污染、无甲醛残留，颗粒具有纳米级，粒度均一，吸收度和扩散度提高，有利于人体吸收并提高药效；同时可减少发烧、胸痛，注射局部红肿、硬结等副作用，是一种有前途的免疫制剂。

根据需要，本发明的NCP可以制成无菌生理盐水的悬浮制剂，固体含量为1.0mg/ml或2.0mg/ml，也可以制成冻干粉针或适合药用的其他剂型。

本发明的NCP为免疫调节剂，可以用于癌性胸水、结合手术治疗早、中期肺癌，乳腺癌、鼻咽癌、晚期肺癌、黑色素瘤以及癌症体表转移灶的治疗，亦可用于牛皮癣、再生障碍性贫血、女阴白斑、感染性哮喘、结核病的治疗或辅助治疗。

下面结合附图和具体实施例详细描述本发明，所述的实施例用于描述本发明而不是限制本发明。

附图说明：

附图1是现有技术的CPP的电镜照片。

附图2是本发明的NCP的电镜照片。

具体实施方式

下面是本发明的具体实施例，其中CP学名为粉刺丙酸杆菌(propionibacterium acnes)，菌号为65101(76-27)、65102(H-84)公开于1993版《中国医学细菌菌种目录》，北京理工大学出版社(ISBN7-81013-859-6/R.7)，65103(77-1或771)公开于2000版《中国生物制品规程》，化学工业出版社。

实施例1

参照2000版《中国生物制品规程》中描述的方法进行细菌种子批的建立、检定以及其它检定。

本实施例中采用的培养基为北京三药科技开发公司出品的硫乙醇酸盐培养基(不含琼脂)，成分为：胰酪胨15g/l，酵母浸粉5g/l，葡萄糖5g/l，氯化钠2.5g/l，L-胱氨酸0.5g/l，硫乙醇酸钠0.5g/l。使用前将培养基用0.22μm膜过滤。

启开CP(学名粉刺丙酸杆菌，propionibacterium acnes)771(见《中国生物制品规程》)菌种管，每管含菌60亿，用毛细管吸取约0.2-0.3ml硫乙醇酸盐培养基(不含琼脂)，加在菌种管底部使之完全溶解后吸出，加入中管(容量38ml)中，用上述培养基8-10ml混合，置37℃培养2天。取菌液用上述培养基(菌液∶培养基体积比＝1∶9)混合，置37℃培养2天。取上述培养的菌液用上述培养基(按1∶9)混合，置37℃培养3天，收获菌液。逐瓶镜检，有杂菌污染者弃之。合并收集无杂菌污染的菌体加热煮沸15分钟，用超高压射流对撞击(日本Nanonizer Inc.产品，型号NMG-75-200)在1000kgf/cm²压力下破碎菌体3次；破碎后的悬液在室温、6000rpm离心90分钟，收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤沉淀3次，无菌检验(2000版《中国生物制品规程》)及热原检测(2000版《中国人民共和国药典》)合格后制成固体含量为0.5mg/ml的悬液，60℃加热1小时，得到NCP。

其中CP，学名为粉刺丙酸杆菌65103(77-1)或771。

经鲎试剂法(2000版《中华人民共和国药典》)检测(固体含量1mg/ml)，本发明的NCP热原20EU/ml；考马斯亮兰法(《生物化学实验原理和方法》，北京大学出版社)测定蛋白质含量25％(g/g)；紫外法(2000版《中国生物制品规程》)260nm测定核酸含量10％(g/g)；蒽酮法(2000版《中国生物制品规程》)测定多糖含量为10％(g/g)。考虑到蛋白质和核酸的测定结果比较准确，估计其余的多糖未测出。电镜测定粒度为60-100nm。

分装后，安瓿在60±2℃加热20分钟。

实施例2

参照实施例1的方法，将CP(学名粉刺丙酸杆菌，propionibacterium acnes)65101(76-27)连续4次传代后接种于营养罐，在硫乙醇酸盐培养基(不含琼脂)(使用前将培养基用0.45μm膜过滤)中，36-37℃培养6天；逐瓶镜检，有杂菌污染者弃之；合并收集无杂菌污染的菌体加热煮沸60分钟，用超高压射流对撞机在1500kgf/cm²压力下破碎菌体5次；破碎后的悬液8000rpm离心1小时，用无菌生理盐水洗涤沉淀5次，无菌检验(2000版《中国生物制品规程》)及热原检测(2000版《中国人民共和国药典》)合格后制成固体含量为2.0mg/ml的悬液，65℃加热60分钟，得到NCP。

经鲎试剂法(2000版《中华人民共和国药典》)检测(固体含量1mg/ml)，NCP热原160EU/ml；考马斯亮兰法(《生物化学实验原理和方法》，北京大学出版社)测定蛋白质含量40％(g/g)；紫外法(2000版《中国生物制品规程》)260nm测定核酸含量5％(g/g)；蒽酮法(2000版《中国生物制品规程》)测定多糖含量为20％(g/g)。考虑到蛋白质和核酸的测定结果比较准确，估计其余的多糖可能未测出。电镜检测粒度为10-50nm。参见图2，粒度均匀。图1为现有技术的CPP的电镜照片。

分装后，安瓿在60±2℃加热30分钟。

实施例3

参照实施例1的方法，将CP(学名粉刺丙酸杆菌，propionibacterium acnes)65102(H-84)连续4次传代后接种于营养罐，在蛋白胨培养基中36-37℃培养7天；逐瓶镜检，有杂菌污染者弃之；合并收集无杂菌污染的菌体加热煮沸30分钟，用超高压射流对撞机(日本Nanonizer Inc.产品，型号AQUA300)800kgf/cm²压力下破碎菌体10次；破碎后的悬液12000rpm离心，用无菌生理盐水洗涤沉淀4次，无菌检验(2000版《中国生物制品规程》)及热原检测(2000版《中华人民共和国药典》)合格后制成固体含量为1.0mg/ml的悬液，65℃加热100分钟，得到NCP。

经鲎试剂法(2000版《中华人民共和国药典》)检测(固体含量1mg/ml)NCP热原60EU/ml，考马斯亮兰法(《生物化学实验原理和方法》，北京大学出版社)测定蛋白质含量12％(g/g)，紫外法(2000版《中国生物制品规程》)260nm测定核酸含量25％(g/g)，蒽酮法(2000版《中国生物制品规程》)测定多糖含量为16％(g/g)，考虑到蛋白质和核酸的测定结果比较准确，估计其余的多糖未测出。电镜检测平均粒度为40-80nm，粒度均匀。分装后，安瓿在60±2℃加热30分钟。

实施例4

其他同实施例1，不同之处在于破碎后的悬液在8000rpm离心1小时后，用冻干机冻干，得到粉针剂。

比较例1

采用2000版《中国生物制品规程》中描述的方法将CP(学名粉刺丙酸杆菌，propionibacterium acnes)771连续3次传代后接种于营养罐，在硫乙醇酸盐培养基(不含琼脂)中36-37℃培养5天；逐瓶镜检，有杂菌污染者弃之；合并收集无杂菌污染的菌体分别加热煮沸30、60分钟进行无菌试验，无菌试验合格的菌液经离心后，用新鲜无菌生理盐水溶液洗涤沉淀3次并制成悬液，60-65℃加热1小时，无菌检测合格后分装，安瓿在60±2℃加热30分钟，经检测两种样品每瓶含菌为6.0×10⁹。

比较例2

其他同比较例1，不同之处在于采集之无杂菌污染的菌体加入甲醛溶液至最终浓度约为0.5％(ml/ml)杀菌48小时，经检测每瓶含菌为6.0×10⁹，游离甲醛含量为0.06g/L。

实验例1

由比较例2看出，CPP中残留有微量的甲醛，甲醛能固定蛋白质，杀死细菌，但对机体具有较强的刺激性。CPP中甲醛残留量虽然很少(应不高于0.06g/l)，但仍会对人体，尤其是对敏感的胸膜产生刺激性。

本发明中按照2000版《中国生物制品规程》中第240-241页中CPP制造及检定规程中规定的方法对比较例1、2制备的CPP的脾激活及抑瘤生物学活性进行了试验，结果见表1。

同时，本发明中按照下述方法对本发明实施例1-4的NCP脾激活及抑瘤生物学活性进行了试验，结果见表1。

脾激活试验：用体重18-20g纯种小鼠(C₃H、615或C₅₇BL)，试验组及对照组各10只，雌雄各半。试验组每只小鼠腹腔分别注射CPP 0.5ml(含菌1.5×10⁹)及实施例1-3的NCP制剂0.5ml(1-3的NCP固体含量都调整到1mg/ml)，对照组注射同量生理氯化钠溶液。14天处死小鼠，分别称体重、脾重、计算脾指数，其指数应不低于2.0。

抑瘤实验(艾氏腹水瘤)：用体重18-20g纯种小鼠(C₃H、615、C₅₇BL、K-LACA或昆明鼠)，试验组及对照组各10只，雌雄各半。每只小鼠腹腔注射活的瘤细胞(5.0×10⁶/ml)0.2ml(用传代5-8天非血性腹水)。试验组于注射瘤细胞前1天及注射后次日起，连续腹腔分别注射CPP 0.25ml(含菌1.5×10⁹)及实施例1-3的NCP 0.25ml(1-3的NCP固体含量调整到2mg/ml)5次，每次间隔1天。对照组注射同量生理氯化钠溶液。对照组小鼠全部因癌性腹水死亡为起点计算试验组小鼠存活率，观察期30天，其存活率应不低于70％。

表1

	脾指数	抑瘤实验
	脾指数	抑瘤实验	CPP(甲醛灭活，比较例2)	＞2.0	合格
CPP(加热煮沸灭活30分钟，比较例1)	＞2.0	合格	CPP(甲醛灭活，比较例2)	＞2.0	合格
CPP(加热煮沸灭活30分钟，比较例1)	＞2.0	合格	CPP(加热煮沸灭活60分钟，比较例2)	＞2.0	合格
NCP(实施例1)	＞2.0	合格	CPP(加热煮沸灭活60分钟，比较例2)	＞2.0	合格
NCP(实施例1)	＞2.0	合格	NCP(实施例2)	＞2.0	合格
NCP(实施例3)	＞2.0	合格	NCP(实施例2)	＞2.0	合格
NCP(实施例3)	＞2.0	合格	NCP(实施例4)	＞2.0	合格

脾激活及抑瘤实验可说明CPP或NCP的生物学活性及药效。表1的结果表明，加热煮沸30分钟、加热煮沸60分钟、0.5％甲醛溶液灭活制备的CPP以及本发明的NCP，其小鼠脾激活及抑瘤实验效果相同，无明显差异，说明加热煮沸灭活以及破碎提取对CPP及NCP的生物学活性及药效无明显影响。

实验例2

本实验例涉及NCP的吸收性能及与CPP吸收性能的比较。

内容：家兔CPP及NCP皮内吸收实验。

家兔：1500-2000克，雌雄各半。

分组：分为CPP组及NCP组，每组各4只。

给药：每只兔背部皮内注射，对照组CPP组0.2ml/只(150亿/ml，相当于2.5mg/ml)，NCP组0.2ml/只(2.5mg/ml)，观察并测试注射局部，结果见表2。

表2

时间	兔号	NCP组	CPP组
时间	兔号	NCP组	CPP组	24小时结果	1#	0.2×0.2cm无红肿、硬结	0.8×0.8cm红肿、硬结
2#	0.2×0.2cm无红肿、硬结	0.8×0.8cm红肿、硬结			1#	0.2×0.2cm无红肿、硬结	0.8×0.8cm红肿、硬结
2#	0.2×0.2cm无红肿、硬结	0.8×0.8cm红肿、硬结	3#		0.2×0.2cm无红肿、硬结	0.8×0.8cm红肿、硬结
4#	0.2×0.2cm无红肿、硬结	0.8×0.8cm红肿、硬结	3#		0.2×0.2cm无红肿、硬结	0.8×0.8cm红肿、硬结
4#	0.2×0.2cm无红肿、硬结	0.8×0.8cm红肿、硬结	48小时结果		1#	0.2×0.2cm无红肿、硬结	1.0×1.0cm红肿、硬结
2#	0.2×0.2cm无红肿、硬结	1.0×1.0cm红肿、硬结			1#	0.2×0.2cm无红肿、硬结	1.0×1.0cm红肿、硬结
2#	0.2×0.2cm无红肿、硬结	1.0×1.0cm红肿、硬结		3#	0.2×0.2cm无红肿、硬结	1.0×1.0cm红肿、硬结
4#	0.2×0.2cm无红肿、硬结	1.0×1.0cm红肿、硬结		3#	0.2×0.2cm无红肿、硬结	1.0×1.0cm红肿、硬结

72小时结果	1#	0.2×0.2cm无红肿、硬结	1.2×1.2cm红肿、硬结
	1#	0.2×0.2cm无红肿、硬结	1.2×1.2cm红肿、硬结	2#	0.3×0.3cm无红肿、硬结	1.2×1.2cm红肿、硬结
	3#	0.3×0.4cm无红肿、硬结	1.5×1.5cm红肿、硬结	2#	0.3×0.3cm无红肿、硬结	1.2×1.2cm红肿、硬结
	3#	0.3×0.4cm无红肿、硬结	1.5×1.5cm红肿、硬结	4#	0.4×0.4cm无红肿、硬结	1.5×1.5cm红肿、硬结

结论：观察72小时，NCP易于被吸收，未产生明显红肿、硬结，CPP不易被吸收，产生了明显的红肿、硬结反应。此结果说明将比较例2的CPP的细胞破碎至纳米级制备的NCP更有利于机体的吸收，并能减少副作用。

实验例3

本实验例涉及NCP的动物急性毒性试验。

药物：采用实施例1的方法制备，但NCP含量31.7mg/ml，由中国药品生物制品检定所提供。

动物：昆明种小鼠，雌雄各半，由中国药品生物制品检定所动物中心提供。

最大给药量测定，取上述健康小鼠40只，随机分为两组，雌雄各半，给药组小鼠一次肌注最大浓度(31.7mg/ml)，最大体积(0.1m/每侧×2)的NCP，对照组一次肌注等体积生理盐水，记录以上两组给药前后第三天及第七天的体重与临床表现，结果见表3。

表3

组别	动物(只)	剂量mg/Kg	给药前体重g	给药后体重g第三天第七天	相当临床用药倍数
组别	动物(只)	剂量mg/Kg	给药前体重g	给药后体重g第三天第七天	相当临床用药倍数	NCP组	20	31.7	20.61±0.61	20.80±1.50 26.67±2.19	452.9
对照组	20	0	20.10±0.48	22.00±1.70 27.41±1.84		NCP组	20	31.7	20.61±0.61	20.80±1.50 26.67±2.19	452.9

上述结果表明，小鼠一次肌注最大剂量的NCP 31.7mg/ml，小鼠未出现死亡，未发现与给药有关的临床表现，也未发现给药对体重的影响，给药剂量相当临床用药量的452.9倍，说明人临床拟用剂量是一个安全剂量。

实验例4

本实施例涉及NCP对结核分枝杆菌感染豚鼠实验模型的药效学评价。以结核分枝杆菌感染的豚鼠为实验动物模型，观察了本发明NCP和对照药免疫增强剂乌体林斯，化疗药利福平加异烟肼的治疗效果。

一、药物：

受试药——参照实施例2的方法制备的NCP，固体含量15mg/ml。

对照药——乌体林斯注射液(草分枝杆菌EU36)17.2μg/ml，成都金星健康药业公司分装(德国Sanum-Kehlbe公司原装)，批号000321。

化疗药——异烟肼(INH)纯粉，北京永康制药厂提供，批号000313。

利福平(RFP)胶囊---四川制药有限公司提供，批号000308。

二、动物：普通级纯白色健康豚鼠，体重350-400克，每组15只，雌7只雄8只，中国医学科学院实验动物研究所提供，合格证号：京许字071号。

三、菌株：结核分枝杆菌H37RV，编号35810，中国药品生物制品检定所菌苗一室提供。

四、实验方法：

1.攻击菌的制备：挑取接种于罗氏鸡蛋培养基，37℃培养三周的结核分枝杆菌菌苔研磨后，以8uM硝酸纤维素膜过滤制备成单细胞菌悬液，分装于小试管，-20℃冷藏，冷藏两周后活菌计数待用。

2.模型对照及感染模型的制备(攻击)：取冷藏后的结核分枝杆菌菌悬液，融解后按已知活菌数稀释至25000CFU/ml，于PPD皮试阴性豚鼠腹股沟部皮下注射0.2ml菌液。

3.试验分组及给药方法：将感染豚鼠随机分成下述6组

(1)模型对照组 (生理盐水)1ml/次/只

(2)化疗组 INH20mg+RFP3.3mg/kg/次

(3)乌体林斯组 17.2μg/次/只

(4)N.C.P组 3mg/次/只

(5)N.C.P组 1mg/次/只

(6)N.C.P组 0.33mg/次/只

五、给药方法：

(一)、NCP各剂量组及乌体林斯组于攻击后3、10、17天时肌肉注射给药，共3次。

(二)、化疗组于攻击后次日开始每周口服给药5次至第九周解剖前终止，共8周40次。

(三)、迟发变态反应于攻击后2、4、8周进行，豚鼠背部皮内注射PPD10IU/0.2ml，注射后24小时测定皮肤硬结大小。

六、观察指标及结果：

(一)脾菌分离数(CFU)测定(此项测定作为评价结核分枝杆菌感染及治疗效果的重要指标)：实验第5、7、9周时分三批解剖动物，取1/2脾脏置研磨器内研磨，加入2ml生理盐水混匀制成组织匀浆，接种前加入等量4％的硫酸以杀死杂菌，经10倍稀释制成10^-3-10^-8浓度的组织悬液，每管罗氏培养基内接种0.1ml，每种浓度接种两管。37℃培养4-9周，于5、7、9周进行活菌计数，活菌数以(CFU)表示，以10为底取对数后用T检验方法进行统计学处理。结果见表5。

表5.豚鼠脾活菌数(CFU)分离结果

豚鼠脾活菌数(CFU)对数值

实验分组给药剂量 5周 7周 9周

N X SD N X SD N X SD

模型对照组生理盐水 3 6.53 0.13 3 7.52 0.08 7 8.27 0.25

化疗组INH20mg/kg/次 3 培养6周未见菌 3 培养6周未见菌 6 0.48 1.18

+ RFP3.3mg/kg/次生长生长

乌体林斯组1.72μg/次 3 3.10 0.18 3 3.26 0.09 8 1.03 0.89

NCP组3mg/次 3 3.23 0.14 3 3.07 0.10 9 3.08 0.19

NCP组1mg/次 3 3.80 0.05 3 1.27 1.10 9 2.99 0.19

NCP组0.33mg/次 3 3.70 0.20 3 3.44 0.28 8 2.96 0.25

(二)结果

1、化疗组、乌体林斯组及NCP各剂量组与模型对照组比较在实验5、7.9周时，CFU T检验均P＜0.05，有显著性差异。

2、NCP各剂量组5、7、9周时比较，CFU T检验均P＞0.05，无显著性差异。

3、NCP各剂量组疗效与乌体林斯组相近，但低于化疗组。

(三)迟发变态反应：测量NCP各剂量组2、4、8周时PPD皮试后24小时的皮肤硬结大小，与化疗组及乌体林斯组比较，观察其对迟发变态反应的影响。结果见表2。

表6.豚鼠迟发变态反应结果(mm)

实验分组给药剂量 2周 4周 8周

N X SD N X SD N X SD

模型对照组生理盐水 15 5.13 0.23 14 9.58 0.97 7 14.49 0.96

化疗组 INH20mg 15 4.71 1.32 13 7.02 1.25 6 10.70 0.96

+RFP3.3mg/kg/次

乌体林斯组17.2μg/次 15 4.96 1.19 15 10.92 1.39 8 10.93 1.43

NCP组3mg/次 15 5.52 1.31 15 8.01 2.12 9 12.68 4.25

NCP组 1mg/次 15 5.21 1.02 15 7.96 2.60 9 11.87 2.08

NCP组0.33mg/次 15 5.78 1.07 14 8.26 2.17 8 12.17 2.04

皮试结果(测量值)＝横径十竖径/2

(四)结果

1.2周时各实验组未见明显迟发变态反应。

2.化疗组及NCP各剂量组4周和8周时迟发变态反应强度均低于模型对照组，P＜0.05有显著性差异。

3.4周时NCP各剂量组迟发变态反应强度均低于乌体林斯组，P＜0.05有显著性差异，至8周时两者反应强度相近，P＞0.05。

(五)病理切片：动物解剖后脾作组织切片镜下观察，结果见表7。

表7.豚鼠脾脏病理切片镜下组织学分析

脾脏病变镜下分级百分比(％)

实验分组 5周 7周 9周

(给药剂量)

分级 N (％) N (％) N (％)

模型对照组 + 3 3/3 100 3 2/3 66.6 7 2/7 28.5

(生理盐水) ++ 28.5

+++ 1/3 33.4 43.0

化疗组 + 3 3/3 100 3 1/3 33.3 6 6/6 100

(INH20mg ++ 1/3 33.3

十RFP3.3mg/kg/次) +++ 1/3 33.3

乌体林斯组 + 3 3/3 100 3 1/3 33.3 8 4/8 50.0

(17.2μg/次) ++ - 2/8 25.0

+++ 2/3 66.7 2/8 25.0

NCP组 + 3 3/3 100 3 3/3 100 9 4/9 44.4

(3mg/次) ++ 2/9 22.2

+++ 3/9 33.4

NCP组 + 3 3/3 100 3 3/3 100 9 1/9 11.1

(1mg/次) ++ 5/9 55.5

+++ 3/9 33.3

NCP组 + 3 3/3 100 3 3/3 100 8 4/8 50.0

(0.33mg/次) ++ 3/8 37.5

+++ 1/8 12.5

注释：病理分级标准：+--有渗出性改变，++--有结核结节形成，+++--有广泛干酪样病理改变。其中++--+++为结核特异性病理改变。

(六)结果

1.模型对照组在整个实验期间，脾脏的镜下组织学病理改变程度随时间而加重，9周时最为严重。

2.实验7周时，NCP各剂量组均未出现结核特异性病理改变，而乌体林斯组则66％出现+++结核特异性病理改变。

3.实验9周时，NCP各剂量组及乌体林斯组镜下均出现+--+++的病理改变，但除个别组外，均轻于模型对照组，化疗组随疗程的延长病理改变有所好转。

通过上述药效实验可以看出：

1.免疫调节剂NCP各剂量组对结核分枝杆菌感染的豚鼠模型经过9周治疗后，豚鼠脾菌分离数明显低于模型对照组，但高于化疗组，与对照药乌体林斯组相近。表明NCP对结核分枝杆菌感染的豚鼠模型具有良好的治疗作用。

2.实验7周时，NCP各剂量组豚鼠脾脏镜下病理改变比对照药乌体林斯组为优，均未出现结核特异性病理改变，而乌体林斯组66％出现结核特异性病理改变。但实验9周时，二者相近。

3.实验4周时，NCP各剂量组迟发变态反应强度均低于对照药乌体林斯组，至8周时二者的反应强度相近。

Claims

1.一种无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗结核病药物上的用途。

2.根据权利要求1所述的无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗结核病药物上的用途，其中所述无细胞短棒状杆菌制剂是由短棒状杆菌，经破碎制备的无细胞制剂，制剂粒度小于100nm。

3.根据权利要求1或2所述的无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗结核病药物上的用途，其中所述的无细胞短棒状杆菌制剂热原小于160EU/ml，蛋白质含量为10-40质量百分数，核酸含量3-25质量百分数，其余为多糖。

4.根据权利要求1或2所述的无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗结核病药物上的用途，其中所述无细胞短棒状杆菌制剂的粒度为10-50nm。

5.根据权利要求2所述的无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗结核病药物上的用途，其中所述的短棒状杆菌，菌号为76-27、H-84或77-1。

6.根据权利要求2或5所述的无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗结核病药物上的用途，其中所述的短棒状杆菌为77-1。

7.根据权利要求1或3所述的无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗结核病药物上的用途，其中所述的无细胞短棒状杆菌制剂热原小于60EU/ml，蛋白质含量20-30质量百分数，核酸含量3-10质量百分数，其余为多糖。