CN104324370B - 疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备含猪肺炎支原体抗原的疫苗组合物的方法，其中，该方法包括：(1)培养猪肺炎支原体，灭活；(2)使用非离子表面活性剂处理步骤(1)灭活的猪肺炎支原体；以及(3)分离出该经使用非离子表面活性剂处理后的不可溶于非离子表面活性剂的抗原成分，加入佐剂。本发明还提供该制备方法制备的含猪肺炎支原体抗原的疫苗组合物去除免疫抑制成分，同时最大限度的保留了免疫活性成分；当与猪圆环病毒抗原共同作用时，对其没有抑制作用，对猪的肺病变有较好的保护效果。

Description

疫苗组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及含猪支原体肺炎抗原的疫苗组合物及其制备方法。

背景技术

猪支原体肺炎(Mycoplasmalpneumonia of swine,MPS)又称猪喘气病(李彦明,张映.猪肺炎支原体生物学研究进展,动物医学进展,2003,24(3):25-27)或猪地方性流行性肺炎，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)所引起的一种猪接触性慢性呼吸道疾病，分布十分广泛，以慢性、接触性、高度传染性、高发病率以及低死亡率等为特点，主要表现为咳嗽和呼吸困难，解剖可见肺组织呈肉变或大理石样病变。

衣阿华大学Ross研究发现：Mhp感染后淋巴细胞产生抗体的能力下降，细胞免疫力下降，肺泡巨噬细胞对病原的吞噬和清除能力亦下降，抑制性T细胞的活动增强，导致呼吸道免疫力减弱，抗病力下降，从而使其他病原体更容易侵入，可继发感染猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环等，从而导致多种疫苗接种失败。Mhp可经空气传播，易与其他细菌性疾病如猪肺疫、传染性胸膜肺炎等并发(王茂文,猪肺炎支原体病的特点及其防制措施.畜禽业,2008(2):16-17；Dee S,Otake S,Oliveira S,et al.Evidence of long distance airbornetransport of porcine reproductive and respiratory syndrome virus andMycoplasma hyopneumoniae.Veterinary research,2009,40(4):39)，对养猪业造成重大的经济损失，是当前最常发生、最广流行、最难净化的重要疫病之一。

中国专利申请CN88101554A公开了猪肺炎支原体膜蛋白含有免疫抑制成分的抗原蛋白，而且公开了用一种用非离子表面活性剂处理猪肺炎支原体膜的方法，进而是进行处理得到非免疫抑制的抗原的技术方案，但公开的技术方案需先得到猪肺炎支原体膜，得到膜的过程需要冻融循环、超声处理等，操作过程繁琐，且其抗原没有使用不含猪肺炎支原体菌体的上清培养液中的可溶性抗原。

专利申请TW 201345550A公开了一种猪肺炎支原体疫苗，采用不含猪肺炎支原体菌体的上清培养液的可溶性抗原通过蛋白质A过滤的技术方案，且公开了直接培养灭活的猪肺炎支原体疫苗影响猪圆环病毒疫苗的抗体效价，通过该发明公开的技术方案可以避免这种干扰。但其没有除去猪肺炎支原体的免疫抑制成分，且用蛋白质A柱处理增加了工艺步骤和造成污染的可能。

因此，采用简便的方法制备无猪肺炎支原体免疫抑制抗原且对猪圆环病毒疫苗不产生拮抗作用的猪肺炎支原体疫苗是本领域技术人员急需解决的技术问题。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明要解决的第一个问题是提供一种猪肺炎支原体疫苗，猪肺炎支原体疫苗不会导致免疫抑制的发生，其采用的技术方案为，使用非离子表面活性剂处理猪肺炎支原体培养物。

所述的非离子表面活性剂处理的猪肺炎支原体抗原是指在灭活的猪肺炎支原体培养物中加入非离子表面活性剂分离出非离子表面活性剂不可溶解部分。

本发明解决的第二个技术问题是提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物中包括猪肺炎支原体抗原和猪圆环病毒抗原，其中猪肺炎支原体抗原部分不对猪圆环病毒抗原产生干扰作用。

本发明的第一方面是一种制备含猪肺炎支原体抗原的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：(1)培养猪肺炎支原体，灭活；(2)使用非离子表面活性剂处理所述步骤(1)灭活的猪肺炎支原体；以及(3)分离出所述经使用非离子表面活性剂处理后的不可溶于非离子表面活性剂的抗原成分，加入佐剂。

作为本发明的一种实施方式，所述猪肺炎支原体疫苗的制备方法包括如下步骤：

1)将猪肺炎支原体在合适的培养基中培养18小时至144小时；

2)将猪肺炎支原体培养物灭活；

3)在灭活的猪肺炎支原体培养物中加入终浓度为非离子表面活性剂0.1-2％(体积比)；

4)分离出非离子表面活性剂不可溶部分的抗原组分，加入佐剂以及药学上可以接受的载体。

任何猪肺炎支原体培养基都可以用于本发明例如猪肺炎支原体菌液的制备,除本发明实施例公开的培养基外，还包括PPLO肉汤(BD Biosciences目录编号21498)加入酵母抽提物、半胱氨酸、右旋糖苷和猪血清。

任何适合的猪肺炎支原体灭活方法都可用本发明，可通过化学或者物理的方法实现灭活，例如，物理方法的加热，化学方法的加入甲醛、二乙烯亚胺(BEI)一个优选实施方式所用的灭活剂为甲醛。

作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的制备方法中，所述步骤(1)猪肺炎支原体为猪肺炎支原体HN0613株；所述步骤(2)前还包括将所述灭活的猪肺炎支原体进行细胞破碎的步骤，所述细胞破碎的步骤不分离上清或分离的上清在所述细胞破碎后与破碎的细胞合并，所述细胞破碎的步骤包括冻融循环、超声处理、高压均质机处理。

作为本发明的一种实施方式，还可以在灭非离子表面活性剂处理前加入将细胞破碎的步骤，本领域常用的细胞破碎方法如冻融循环、超声处理、高压均质机处理均可以使用，优选使用高压均质机处理。

作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的制备方法中，所述步骤(2)中非离子表面活性剂加入量为终浓度占体系的体积比0.1％-2％，非离子表面活性剂包括烷基葡糖苷、Brij 35(C12E23聚氧乙烯二醇十二烷基醚)、Brij 58(C16E20聚氧乙烯二醇十二烷基醚)、Genapol、TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、Triton X-114(聚氧乙烯辛烷基苯酚醚)、吐温20(聚山梨醇20)、吐温80(聚山梨醇80)、Nonidet P40(又称为NP-40中文名乙基苯基聚乙二醇)、脱氧胆酸钠。

作为本发明的一种最优选实施方式，在本发明的制备方法中所述非离子表面活性剂加入量为终浓度占体系的体积比0.2％-1％，所述非离子表面活性剂为Triton-X114、Nonidet P40。

可用于本发明的非离子表面活性剂包括烷基葡糖苷、Brij35(C12E23聚氧乙烯二醇十二烷基醚)、Brij 58(C16E20聚氧乙烯二醇十二烷基醚)、Genapol、TritonX-100、Triton X-114、吐温20(聚山梨醇20)、吐温80(聚山梨醇80)、Nonidet P40(又称为NP-40中文名乙基苯基聚乙二醇)、脱氧胆酸钠、非离子型去污剂的优选的是Triton-X114、NonidetP40。

非离子表面活性剂的加入量有严格限制，加入量多会造成免疫原性蛋白的处理掉，加入量少不能完全除去免疫抑制蛋白。非离子表面活性量为灭活的猪肺炎支原体培养物中加入终浓度为非离子表面活性剂0.1％-2％(体积比)，优选的范围为0.1％-0.2％、0.2％-0.3％、0.3-0.4％、0.4％-0.5％、0.5％-0.6％、0.6-0.7％、0.7-0.8％、0.8-0.9％、0.9-1.0％、0.8-0.9％、0.9-1.0％、1.0-1.1％、1.1-1.2％、1.2-1.3％、1.3-1.4％、1.4-1.5％、1.5-1.6％、1.6-1.7％、1.7-1.8％、1.8-1.9％或1.9-2.0％。优选0.5-0.6％、0.6-0.7％、0.7-0.8％、0.8-0.9％、0.9-1.0％、0.8-0.9％、0.9-1.0％；再优选0.4-0.8％、最优选为0.5％。

作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的制备方法中，所述步骤(2)非离子表面活性剂的处理步骤为在0℃混匀5-10分钟；所述步骤(3)分离步骤为37℃+0.5℃离心取上清液作为抗原，所述不可溶于非离子表面活性剂的抗原成分为常温下不可溶于非离子表面活性剂的抗原成分。

本发明所述的非离子表面活性剂处理的猪肺炎支原体培养物处理时间、温度按照本领域技术人员熟知的方法进行本发明的一种实施方式，对处理的时间和温度并无严格的要求，在其中一种实施方式中选用的在0℃混匀5-10分钟，放在37℃+0.5℃离心取上清液作为抗原。

任何猪肺炎支原体菌株均可以作为本发明的起始材料。适宜的猪肺炎支原体可以商业或者学术途径得来，包括诸如美国菌种保藏中心、中国典型培养物保藏中心、中国普通微生物菌种保藏中心、中国兽医微生物保藏中心获得，作为本发明的一种实施方式选用猪肺炎支原体HN0613株(Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613)，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址：中国武汉·武汉大学，保藏日期：2012年6月13日，保藏号为CCTCCNo.M2012230。

本发明疫苗可以按照公知常识加入药学上可以接受的载体，例如稳定剂、稀释剂、防腐剂，和缓释剂，稀释包括水、右旋糖酐、乙醇等诸如此类，等渗剂包括氯化钠、甘露醇、乳糖等诸如此类。稳定剂包括白蛋白，防腐剂包括硫柳汞、抗生素等诸如此类

本发明的第二方面是一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的所述方法制备的猪肺炎支原体抗原和佐剂。

本发明的第三方面是一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的所述方法制备的猪肺炎支原体抗原、佐剂以及其他抗原；所述其他抗原包括猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎病原(支气管败血波氏杆菌(D型)和产毒素多杀巴氏杆菌(C型))抗原、猪伪狂犬病毒抗原、猪霍乱病原(猪多杀性巴氏杆菌)抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种。

作为本发明的一种实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述疫苗组合物还包含灭活的猪圆环病毒全病毒抗原，所述制备的猪肺炎支原体抗原与灭活的猪圆环病毒全病毒抗原量为体积比80：10。

作为本发明的另外一种实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述疫苗组合物还包含灭活的猪圆环病毒全病毒抗原，或猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原。

本发明的另一目的在于提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括所述猪肺炎支原体疫苗组合物和其他抗原，所述其他抗原包括猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病毒抗原、猪霍乱病原抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种。优选地，所述其他抗原为猪圆环病毒抗原。

作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述其他抗原为猪圆环病毒抗原。

作为本发明的一种实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。

作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述佐剂为Gel佐剂。

作为本发明的一种实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述佐剂在所述疫苗组合物中的体积比为5～30％。

作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述佐剂在所述疫苗组合物中的体积比为10％。

本发明所用术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals Incorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。

本发明所用术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practicalapplication of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,NewYork,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccine design,the Subunit and adiuvant approach》(PlenumPress,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。

本发明所用术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BF Goodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allyl pentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。

本发明所用术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。

本发明所用术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。

优选地，所述佐剂为铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。

更优选地，所述佐剂在所述疫苗组合物中的体积比为5％-30％。

本发明的第四方面是所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪肺炎支原体感染导致的疾病的药物中的应用。

本发明的第五方面是所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪肺炎支原体感染和猪圆环病毒感染导致的疾病的药物中的应用。

本发明再一目的在于提供所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪支原体肺炎的药物中的应用。

本发明具有以下突出的优点：

(1)本发明制备的疫苗组合物，抗原纯化方法简单，去除免疫抑制成分的同时最大限度的保留了免疫活性成分，对猪的肺病变有较好的保护效果；

(2)本发明的制备方法制备的组合物对猪圆环病毒没有抑制作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明所用术语“猪支原体肺炎”在临床上的症状包括(但不限于)：呼吸症状(严重急性临床肺炎、咳嗽、呼吸困难、呼吸速迫)、发热、高度传染性、高发病率、低死亡率、坏死性细胞支气管炎及继发性细菌性呼吸道感染增加。

本发明所用术语“猪支原体肺炎疫苗组合物”是指能够用于预防和/或治疗由猪肺炎支原体感染所知病症或疾病的疫苗，该疫苗组合物可包括任何能够有效预防和/或治疗猪受猪肺炎支原体感染的疫苗。

本发明所用术语“预防和/或治疗”在涉及猪肺炎支原体感染时是指抑制猪肺炎支原体的复制、抑制猪肺炎支原体的传播或防止猪肺炎支原体在其宿主体内定居，以及减轻猪肺炎支原体感染的疾病或病症的症状。若细菌荷载量减少、肺部感染减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

本发明所用术语“猪”是指任何属于猪科(Suidae)成员的动物。

术语抗原是指可在动物中产生抗体或T细胞反应或者二者都有的化合物、组合物或免疫原性物质。

本文定义疫苗或免疫组合物是指包含至少一种抗原的物质的组合物，该抗原在对所能引起免疫反应。

本实施例中分别以猪肺炎支原体HN0613株和PCV2SH株说明本发明。

本发明实施方式中，猪肺炎支原体HN0613株(Mycoplasma hyopneumoniae strainHN0613)，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址：中国武汉·武汉大学，保藏日期：2012年6月13日，保藏号为CCTCC No.M2012230。

本发明实施例中所采用的攻毒毒株为猪肺炎支原体CVCC354株，该毒株的保藏号为CVCC 354，保藏单位为国家兽医微生物菌种保藏管理中心。

本发明实施方式中，猪圆环病毒2型为PCV2SH株，保藏号为CGMCC No.2389，公开于专利文献CN101240264A。

本发明实施例中肺病变指数采用28分法进行评判。所述28分法是根据猪支原体肺炎的典型肺部眼观病变，对发病程度进行量化判定，包括肺尖叶、心叶、膈叶、中间叶出现的实质样病变，如“肉样变”、“胰样变”。肺炎病变评分标准为：2个尖叶、2个心叶、2个膈叶、1个中间叶共计7个肺叶，每个肺叶满分为4分，共计28分。根据发生实质病变的肺叶面积所占该叶的比例，分别对每个肺叶进行打分。无肺炎病变记为0分；病变面积比例为1％-25％，记为1分；病变面积比例26％-50％，记为2分；病变面积比例为51％-75％，记为3分；病变面积比例为76％-100％，记为4分。如肺叶正反两面均有病变，以病变面积大的一面进行记分。各个肺叶打分总和即为该发病株的肺炎病变得分。

本发明实施例统计分析方法为：统计7个肺叶的肺病变指数，确定病变程度。用SPSS计算机软件进行ANOVA分析，比较各组间差异，确定病变差异的有效性。

本发明中所用的pH7.2PBS液配方为：1000mL蒸馏水中加入NaCl 9g、Na₂HPO₄·12H₂O 6g、NaH₂PO₄·2H₂O 0.4g，本发明中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1 猪肺炎支原体的制备

1.1、制备猪肺炎支原体全菌抗原

冻干菌种猪肺炎支原体HN0613株启封后，按10％接种量接种液体培养基，37℃振荡培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获，经纯粹检，作为一级生产种子。取一级种子按5％接种量接种液体养基，37℃振荡培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获，经纯粹检，作为二级生产种子。将鉴定合格的猪肺炎支原体HN0603株的二级种子分别按5％(v/v)接种于液体培养基，37℃振荡培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获。使甲醛溶液的终浓度为0.3％(V/V)，37℃灭活24小时，其间每隔4小时搅拌1次，每次10min，灭活结束后将灭活菌液置2～8℃保存。

猪肺炎支原体液体培养基的配方:牛心浸出液(BD公司)300ml，双蒸水360m1，校正pH值到7.4,121℃灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份:Hank's平衡盐溶液(10×)40m1,0.25(W/V)酚红10m1,猪血清200m1，5％(W/V)水解乳蛋白100m1,25％W/V酵母浸出液20m1，10000IU/ml青霉素10ml。

1.2猪肺炎支原体纯化抗原的制备：将1.1制备的猪肺炎支原体灭活的培养物100ml加入体积比为0.5％(体积比)Triton X114混匀；至于0℃-5℃混匀30分钟，放在到37℃+0.5℃离心(4500转20分钟)取上清液，用pH7.2PBS液补充体积为100ml。

1.3猪肺炎支原体纯化抗原的制备：将1.1制备的猪肺炎支原体灭活的培养物100ml加入体积比为0.5％(体积比)NP-40混匀；至于0℃-5℃混匀30分钟，放在到37℃+0.5℃离心(4500转离心20分钟)取上清液，用pH7.2PBS液补充体积为100ml。

1.4按照1.3方法，加入体积比为1.0％(体积比)NP-40。

1.5按照1.3方法，加入体积比为0.2％(体积比)NP-40。

1.6猪肺炎支原体纯化抗原的制备：将1.1制备的猪肺炎支原体灭活的培养物100ml先经过高压均质机细胞破碎然后加入体积比为0.5％(体积比)NP-40混匀；至于0℃-5℃混匀30分钟，放在到37℃+0.5℃离心(4500转离心20分钟)取上清液，用pH7.2PBS液补充体积为100ml。

1.7猪肺炎支原体纯化抗原的制备：将1.1制备的猪肺炎支原体灭活的培养物100ml先经过10，000离心去上清液部分经过PBS悬浮然后超声破碎后经过后加入体积比为0.5％(体积比)Triton X114混匀；置于0℃-5℃混匀30分钟，放在到37℃+0.5℃离心(4500转20分钟)取上清液，用pH7.2PBS液补充体积为100ml。

1.8将1.1制备的猪肺炎支原体灭活的培养物100ml先经过10，000离心去上清液部分沉淀经过PBS悬浮然后超声破碎后经过高压均质机细胞破碎后定容体积至100ml。

1.9将1.1制备的猪肺炎支原体灭活的培养物100ml先经过10，000离心取上清液部分，用pH7.2PBS液补充体积为100ml。

实施例2 猪支原体肺炎疫苗组合物的制备

将实施例1制备的猪肺炎支原体抗原与Montanide^TM Gel 01佐剂按表3中猪支原体肺炎疫苗组合物所含组分及比例混合在一起，以500-800r/min的转速搅拌10-15min，在终止搅拌前加入1％(体积比)硫柳汞溶液，使其终浓度不超过万分之一，充分振荡混匀，分装后2-8℃保存备用。

表1 猪肺炎支原体疫苗组合物的制备

实施例3 不同组分的猪支原体肺炎疫苗组合物效力试验

将实施例2所制备的疫苗组合物，分别免疫选14-21日龄仔猪50头(排除猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环2型和猪瘟)，共12组，5头/组，1mL/头。免疫后42天后，对所有猪气管注射猪肺炎支原体济南系强毒CVCC354株，100MID₅₀/头，观察28天后解剖，并观察肺部病变，按照28分法对肺部病变进行评分。攻毒后大约10天左右，空白对照组猪只(其中3只)陆续出现咳嗽、气喘等症状，皮毛不光滑；各试验组猪只的肺炎病变平均得分和表2。

表2 各试验组的肺病变得分和肺病变减少率

组号	免疫组分	肺炎病变平均得分
			1	疫苗A	3.2
2	疫苗B	2.4
			3	疫苗C	2.6
4	疫苗D	1.6
			5	疫苗E	2.4
6	疫苗F	0.6
			7	疫苗G	7.8
8	疫苗H	11.8
			9	疫苗I	5.8
空白对照组	PBS+Montanide<sup>TM</sup> Gel 01	15.6

试验结果显示：除了疫苗H外其它试验组疫苗相对于空白对照组的肺病变差异显著。试验结果表明疫苗B、疫苗C、疫苗D、疫苗E、疫苗F组有较好的免疫效果。经过TritonX114或者NP-40处理的支原体培养液的显示出了对预防猪肺炎支原体较好的效果，肺病变更低，效果最好的为经过高压均质机破碎菌体后经过NP-40处理的全细胞支原体培养液的疫苗F。除去菌体的上清液和经过处理的菌体疫苗J和疫苗G对猪肺炎支原体均有一定的效果。本实施例证明，采用灭活的猪肺炎支原体培养液(含有菌体和可溶性蛋白)所制备的疫苗经过表面活性剂处理能够有效预防猪肺炎支原体引起的肺病变。

实施例4、猪圆环病毒2型抗原的制备

猪圆环病毒2型SH株病毒液的制备：用转瓶细胞培养法，将长满单层的PK15细胞，倒去细胞培养液(MEM液体培养基中添加6％犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸)，将毒种液体积比按0.1～0.2TCID₅₀/个细胞的接种量接种于PK15细胞上，旋转细胞瓶2周，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液(步骤1.1所述)，置37℃旋转(10～12转/小时)培养。每日观察1～2次，细胞生长良好，37℃培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，病毒液用中空纤维滤柱(Millipore公司孔径10μm与0.45μm)过滤，除去细胞碎片。测定含圆环病毒量为为6×107.0TCID50/ml。过滤液中加入甲醛溶液(洛阳市化学试剂厂分析纯，含量为37％～40％)，使甲醛溶液的终浓度为0.2％(V/V)，37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次10min，灭活结束后将灭活病毒液置2～8℃保存。

实施例5、猪圆环病毒、猪肺炎支原体联合疫苗疫苗的配制以及猪肺炎支原体抗原对猪圆环病毒抗原的影响

将实施例1制备的猪肺炎支原体抗原和实施例4制备的猪圆环病毒抗原以及Montanide^TM Gel 01佐剂10％(体积比)按表3中各组分及比例混合在一起，以500-800r/min的转速搅拌10-15min，在终止搅拌前加入1％(体积比)硫柳汞溶液，使其终浓度不超过万分之一，充分振荡混匀，用相对效力法(猪圆环病毒疫苗2型杆状病毒疫苗质量标准效力检验项下规定)以圆环病毒单苗为参考疫苗测定其它各联苗组的相对效力。

表3 猪圆环病毒、猪肺炎支原体联合疫苗疫苗以及猪圆环疫苗的相对效力

试验结果显示：经过表面活性剂处理的疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗6，以及离心处理的不含上清液的菌体均对猪圆环病毒效价没有干扰，而猪肺炎支原体培养物抗原、以及猪肺炎支原体培养物离心后的上清液对猪圆环病毒的相对效价有干扰。证明采用灭活的猪肺炎支原体培养液(含有菌体和可溶性蛋白)所制备的疫苗经过表面活性剂处理能够去除拮抗猪猪圆环病毒抗原的成分。

实施例6 疫苗相容性检验

取猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)(普莱柯生物工程股份有限公司，批号1407053A)，用实施例4制备的疫苗2～5和参考稀释液(无菌注射用水)，按照使用说明，灭活疫苗部分1头份/瓶(2ml)复原。20±3℃放置2h，依照猪繁殖与呼吸综合征活疫苗滴定方法检验。通过与参考稀释液的比较，评估待检稀释液对病毒活性组分的影响，病毒组分的滴定结果如表13，差值均不超过0.7log10(欧洲兽用疫苗标准)。本发明的疫苗可以用作冻干的活病毒抗原的稀释剂。

表4 疫苗相容性检验结果

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (12)

1.一种制备含猪肺炎支原体抗原的疫苗组合物的方法，其中，所述方法由下列步骤组成：

(1)培养猪肺炎支原体，灭活，所述培养的猪肺炎支原体包括上清液和其中的菌体；

(2)使用非离子表面活性剂处理所述步骤(1)灭活的猪肺炎支原体，非离子表面活性剂加入量为终浓度占体系的体积比0.1％-2％；以及

(3)分离出所述经使用非离子表面活性剂处理后的不可溶于非离子表面活性剂的抗原成分，加入佐剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(1)猪肺炎支原体为猪肺炎支原体HN0613株。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(2)中非离子表面活性剂包括烷基葡糖苷、Brij 35(C12E23聚氧乙烯二醇十二烷基醚)、Brij 58(C16E20聚氧乙烯二醇十二烷基醚)、Genapol、TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、Triton X-114(聚氧乙烯辛烷基苯酚醚)、吐温20(聚山梨醇20)、吐温80(聚山梨醇80)、Nonidet P40(又称为NP-40中文名乙基苯基聚乙二醇)、脱氧胆酸钠。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(2)中所述非离子表面活性剂加入量为终浓度占体系的体积比0.2％-1％，所述非离子表面活性剂为Triton-X114、Nonidet P40。

5.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的根据权利要求1～4任一项所述方法制备的抗原和佐剂。

6.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的根据权利要求1～4任一项所述方法制备的抗原、佐剂以及其他抗原；所述其他抗原包括猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎病原体抗原、猪伪狂犬病毒抗原、猪霍乱病原抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包含灭活的猪圆环病毒全病毒抗原，或猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原；所述制备的猪肺炎支原体抗原与灭活的猪圆环病毒全病毒抗原量为体积比80：10。

8.根据权利要求5～7任一项所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种，所述佐剂在所述疫苗组合物中的体积比为5～30％。

9.根据权利要求5～7任一项所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂为Gel佐剂。

10.根据权利要求5～7任一项所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂在所述疫苗组合物中的体积比为10％。

11.根据权利要求5所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪肺炎支原体感染导致的疾病的药物中的应用。

12.根据权利要求6～7任一项所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪肺炎支原体感染和猪圆环病毒感染导致的疾病的药物中的应用，其中，所述疫苗组合物含有猪肺炎支原体抗原和猪圆环病毒抗原。