CN107541501B - 犬细小病毒毒株、疫苗组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种犬细小病毒S0425株以及以其抗原制备的疫苗组合物，该株在遗传学上属于现有流行株。本发明的疫苗组合物免疫动物后能使动物机体快速产生抗体，并且免疫效力持续时间长，在其免疫效力持续期内可对犬只产生完全保护，可以预防和/或治疗当前犬细小病毒相关疾病。

Description

犬细小病毒毒株、疫苗组合物及其应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种犬细小病毒毒株、疫苗组合物及应用。

背景技术

犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)属细小病毒科细小病毒属，为单股负链线性DNA病毒，无囊膜，对物理化学因素具有很强的抵抗力。1978年，澳大利亚的Kelly和加拿大的Thomson等同时从患肠炎的病犬粪便中分离获得犬细小病毒(Atwell RB,KellyWR.Canine parvovirus:a cause of chronic myocardial fibrosis and adolescentcongestive heart failure.Journal of Small Animal Practice,1980,21(11):609-620；Thomson GW,Gagnon AN.Canine gastroenteritis associated with a parvovirus-like agent.The Canadian Veterinary Journal,1978,19(12):346)。其后，美国、英国、德国、法国、意大利、俄罗斯和日本等国也相继发现了该病毒，该病在世界各地逐渐开始流行。为了区别于1967年由Binn等人从健康犬粪便中分离到的犬极细小病毒(Minute Virus ofCanine，MVC)(习惯也上被叫做CPV-1)，而将后来发现的病毒命名为犬细小病毒2型(CPV-2)。

在我国，梁士哲等于1982年首次报道了类似犬细小病毒感染性肠炎(梁士哲，渠川攻，魏喜仁等.犬传染性肠炎的研究I—腹泻犬粪便中检出的细小病毒颗粒.上海畜牧兽医通迅，1982,2(4):172)。次年，徐汉坤等正式报道了该病的流行(徐汉坤，郭保发，金准等.血凝和血凝抑制试验在犬群暴发犬细小病毒肠炎中的应用.中国畜禽传染病，1983,(4):43-45)。

自从发现以来，犬细小病毒经过约30年的进化，相继出现了多种遗传变异株，如CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c。

CPV主要感染犬科(Canidae)、猫科(Felidae)的动物，尤其对于幼犬，传染性极强，感染后死亡率可达91％。病犬是主要的传染源，其呕吐物、唾液、粪便中均有大量病毒。健康犬经消化道感染病毒后，病毒主要攻击两种细胞，一种是肠上皮细胞，一种是心肌细胞，分别表现肠炎症状和心肌炎症状(A fshar A..Canine Parvovirus infection-areview.Vet Bul l,1981,51:605-612.)。肠炎型的共同症状为严重的呕吐与严重的出血性腹泻。心肌炎型以幼犬多见,可以导致幼犬呼吸与心血管的衰竭。近年来，随着我国工作犬(军犬、警犬、导盲犬等)、实验用犬和宠物犬饲养量的大幅增加，犬细小病毒感染成为突出的问题，并给养犬业带来了重大的经济损失，成为危害养犬业重大疫病之一。

疫苗是预防和控制该病的主要措施，但是国内外的现有疫苗中涉及到的CPV毒株均为最早出现的CPV-2型，该型病毒已经被其遗传变异株：CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c替代，CPV-2型与其遗传变异株在氨基酸水平上有很大差异，国内检测到CPV-2b型的数目也越来越多，因此，亟需分离出国内流行的CPV野毒株，将其制备成疫苗用毒株以预防和/或治疗犬细小疫情蔓延，具有深远的现实意义。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种犬细小病毒毒株,其属于现有的流行遗传变异株，且其抗原免疫原性良好且提供的效力持久。

本发明涉及犬细小病毒S0425株，保藏号为CCTCC No.V201634。所述犬细小病毒S0425株(Canine Parvovirus,Strain S0425)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:V201634，保藏地址为中国·武汉·武汉大学，保藏日期为2016年6月14日。

本发明还涉及一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的所述犬细小病毒S0425株或其3-30代培养物的抗原和药学上可接受的载体。

本发明还涉及所述疫苗组合物的制备方法，所述制备方法包括：将所述犬细小病毒S0425株培养增殖，灭活所述增殖的犬细小病毒S0425株，在灭活后的犬细小病毒S0425株加入药学上可接受的载体即得。

本发明还涉及所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬细小病毒感染相关疾病的药物中的应用。

本发明所分离的犬细小病毒毒株在遗传学上属于流行的犬细小病毒野毒株，用含该毒株的疫苗组合物免疫动物后能使动物机体快速产生较高滴度的特异性抗体，并且其免疫效力能够维持较长时间，在免疫效力维持期内可有效预防和/或治疗犬细小病毒引发的疫情。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

术语“犬细小病毒”(Canine Parvovirus，CPV)属细小病毒科细小病毒属，所引发的临床症状包括肠炎症状和心肌炎症状，肠炎型的共同症状为严重的呕吐与严重的出血性腹泻，心肌炎型可以导致幼犬呼吸与心血管的衰竭。

术语“犬细小病毒毒株(CPV毒株)”在本发明中若无特殊说明即为犬细小病毒野毒株(CPV野毒株)、犬细小病毒强毒株(CPV强毒株)、野生型CPV毒株，可互换使用。

本发明涉及犬细小病毒S0425株，保藏号为CCTCC No.V201634。

所述犬细小病毒毒株的分离方法，包括：将感染犬细小病毒的动物脏器、组织或样本病变处进行研磨或剪切和生理缓冲液浸泡处理，再将不同研磨液或浸泡处理液接种于F81细胞、CRFK细胞或MDCK细胞进行病毒分离，稳定传代直至出现细胞病变即可冻融收毒。其中，所述分离方法中感染犬细小病毒毒株的动物包括但不限于犬科(Canidae)动物、猫科(Felidae)动物。

所述分离方法中感染犬细小病毒毒株的动物脏器、组织或样本包括但不限于心脏、肠、肠内容物、粪便。

本发明涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的所述的犬细小病毒S0425株或其3-30代培养物的抗原和药学上可接受的载体。

术语“疫苗组合物”又称免疫原性组合物，是指一种含免疫原的制剂，包括如全细胞、灭活的或减毒的、活的病毒或细菌，或者多糖，或其组合，其被施用来刺激受体对存在于免疫原性组合物中一种或多种抗原的体液和细胞免疫反应。免疫接种是施用疫苗组合物并在宿主中刺激对抗原的免疫或免疫原性反应的过程，优选的宿主为动物诸如犬。

术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。

术语“犬细小病毒抗原”是指至少含有一种犬细小病毒抗原形式的任何组合物，所述犬细小病毒抗原可诱导、刺激或能抵抗犬细小病毒感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、减毒的或亚单位的抗原。其中，灭活的抗原可通过各种方法包括化学处理、物理处理(如声处理、照射、热)或任何其它足以阻止生物体复制或生长的常用方法来实现灭活而维持其免疫原性，优选将病原体在收集后灭活且任选地接受澄清净化，通过化学处理使用例如福尔马林或甲醛、β-丙内酯、乙烯亚胺、二元乙烯亚胺BEI、硫柳汞等；灭活的方法是本领域技术人员公知的，如通过β-丙内酯(Plana-Duran等，Vet.Microbiol.,1997,55:361-370)或通过BEI处理(US5587164)。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述的犬细小病毒S0425株或其培养物的抗原为灭活全病毒抗原，所述犬细小病毒S0425株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前10^5.0-10^9.0TCID₅₀/ml。

作为本发明的一种优选实施方式，所述犬细小病毒S0425株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前10^6.0-10^8.0TCID₅₀/ml。

术语“3-30代培养物”指将所述犬细小病毒S0425株在F81细胞、CRFK细胞或MDCK细胞上连续自然传代，至使其适应在F81细胞、CRFK细胞或MDCK细胞上生长复制(即在所述细胞上出现拉丝的细胞病变)后，继续在F81细胞、CRFK细胞或MDCK细胞上连续自然传代至第3-30代而获得的培养物。

术语“TCID₅₀”是指组织培养感染剂量，并且其被定义为感染50％的给定批次的已接种细胞培养所需的病毒稀释。各种方法可用于计算TCID₅₀，包括Sperman-Karber方法(如BW Mahy,HO Kangro.Virology methods manual,1996:25-46)、Reed-Muench方法。

术语“药学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除犬细小病毒抗原之外的其他所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(CambridgeBiotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica PharmaceuticalsIncorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂如可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccine design,the Subunit and adiuvant approach》(Plenum Press,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物的一种或多种。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practical application of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,New York,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。以

(BF Goodrich,Ohio,USA)的名称出售产品是特别合适的。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交联。这其中可提及卡波姆974P、934P和971P，最优选使用卡波姆971P。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；

优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；

优选地，乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂，或乳剂由油与乳化剂组合形成，乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油，烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯)；乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其

特别是L121))；

优选地，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆，优选为卡波姆974P、934P和971P；

优选地，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA；

优选地，所述佐剂为Gel A佐剂；

所述佐剂的浓度范围是从5％到50％V/V，优选5％V/V。

本发明还涉及所述疫苗组合物的制备方法，所述制备方法包括：将所述犬细小病毒S0425株培养增殖，灭活所述增殖的犬细小病毒S0425株，在灭活后的犬细小病毒S0425株加入药学上可接受的载体即得。

作为本发明的一种实施方式，所述灭活的全病毒抗原是通过将所述犬细小病毒毒株在细胞上连续自然传代而获得毒株细胞全病毒培养液，并经灭活剂灭活所得。

作为本发明的一种实施方式，所述灭活剂包括但不限于β-丙内酯BPL、二乙烯亚胺BEI、福尔马林、甲醛、N-乙酰乙烯亚胺AEI、盐酸聚六亚甲基胍PHMG；优选地，所述灭活剂为β-丙内酯BPL，其在所述疫苗组合物中的终浓度为0.025％V/V。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，

所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；

优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；

优选地，乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂，或乳剂由油与乳化剂组合形成，乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油，烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯)；乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其

特别是L121))；

优选地，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆，优选为卡波姆974P、934P和971P；

优选地，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA；

优选地，所述佐剂为Gel A佐剂；

所述佐剂的浓度范围是从5％到50％V/V，优选5％V/V。

在一些优选的实施方案中，所述疫苗组合物还包括非犬细小病毒抗原，所述非犬细小病毒抗原包括犬瘟热病毒(Canine Distemper)、犬腺病毒(Canine Adenovirus，含Ⅰ型和/或Ⅱ型)、犬钩端螺旋体(Leptospira Interrogans)、犬冠状病毒(CanineCoronavirus)、犬副流感病毒(Canine Parainfluenza Virus)、狂犬病病毒(RabiesVirus)、犬流感病毒(Canine Influenza Virus)、犬呼肠病毒(Canine Reovirus)、犬伪狂犬病毒(Pseudorabies)、犬轮状病毒(Rotavirus)、犬疱疹病毒(Canine Herpervirus)、犬病毒性乳头瘤病毒(Canine Viral papillomatosis)、犬极细小病毒(Canine MinuteVirus)、犬腮腺炎病毒(Canine Mumps Virus)和犬淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(CanineLymphocytic Choriomeingitis Virus)中的一种或多种；优选地包括犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬钩端螺旋体、犬冠状病毒、犬副流感病毒、狂犬病病毒以及犬流感病毒中的一种或多种。

作为本发明的一种实施方式，所述的疫苗组合物还包括不同于犬细小病毒抗原的其他抗原，所述其他抗原包括犬瘟热病毒抗原、犬腺病毒Ⅰ型抗原、犬腺病毒Ⅱ型抗原、犬钩端螺旋体抗原、犬冠状病毒抗原、犬副流感病毒抗原、狂犬病病毒抗原、犬流感病毒抗原、犬呼肠病毒抗原、犬伪狂犬病毒抗原、犬轮状病毒抗原、犬疱疹病毒抗原、犬病毒性乳头瘤病毒抗原、犬极细小病毒抗原、犬腮腺炎病毒抗原、犬淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒抗原、以及犬支气管败血波氏杆菌抗原中的一种或多种。

优选地，所述其他抗原包括犬瘟热病毒抗原、犬腺病毒Ⅰ型抗原、犬腺病毒Ⅱ型抗原、犬钩端螺旋体抗原、犬冠状病毒抗原、犬副流感病毒抗原、狂犬病病毒抗原以及犬流感病毒抗原中的一种或多种。

术语“预防和/或治疗”在涉及犬细小病毒感染时是指抑制犬细小病毒的复制、抑制犬细小病毒的传播或防止犬细小病毒在其宿主体内定居，以及减轻犬细小病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

本发明还涉及所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬细小病毒感染相关疾病的药物中的应用。

优选地，所述犬细小病毒感染相关疾病包括肠炎型和心肌炎型犬细小病毒病。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1 犬细小病毒的分离、鉴定及含量测定

1.1犬细小病毒毒株的分离及鉴定

从临床上犬细小病毒感染的动物中分离CPV野毒株，感染动物的临床症状为：厌食，精神沉郁，体温升高，呕吐，排稀便、粘便甚至番茄酱样血便，发病后期呈脱水症状等，将其作为入选动物的标准。

用无血清RPMI-1640培养液将病犬的肠内容物稀释为10％V/V悬液，用0.22μm滤膜过滤除菌，并将滤液按10％V/V比例接种F81单层细胞(购自上海酶联检测技术有限公司)进行病毒分离，24～48小时出现拉丝的细胞病变，约96小时细胞病变达到80％以上，冻融收毒作为第1代病毒液；用同步接毒法将第1代所获得的病毒液接种F81细胞，接种24小时后出现拉丝的细胞病变，接种72～96小时后细胞病变达到80％以上，冻融收毒作为第2代病毒液；用同步接毒法将第2代所获得的病毒液接种F81细胞，接种24小时后出现拉丝的细胞病变，接种72～96小时后细胞病变达到80％以上，冻融收毒作为第3代病毒液。将第3代病毒液通过电镜观察来进行形态学检测，结果表明：可见具有典型的细小病毒特征的病毒粒子。

采用康洪涛(康洪涛.貉细小病毒分离鉴定及免疫原性研究.中国农业科学院硕士学位论文,2012)的间接免疫荧光法对上述第3代病毒液进行病毒特异性鉴定，结果显示：F81细胞接种病毒形成拉丝的细胞病变部位出现特异性绿色荧光，表明特异性良好。

通过基因分析测序鉴定所分离的上述病毒株属于CPV-2b型。

以上结果证实所分离的上述病毒株为犬细小病毒野毒株。

将上述分离的犬细小病毒株命名为S0425株，提交保藏。

1.2犬细小病毒含量的测定将所分离的S0425株在F81细胞扩增，将扩增后的S0425株按照Reed-Muench方法(参见殷震.动物病毒学.北京:科学出版社,1997)进行病毒含量测定，结果表明：该毒株的含量为10^7.0TCID₅₀/ml。

实施例2 犬细小疫苗组合物之灭活疫苗的制备及检验

2.1灭活疫苗的制备

将实施例1所分离、扩增的CPV S0425株经终浓度为0.025％V/V BPL(β-丙内酯)进行灭活，并按照《中国兽药典》(中国兽药委员会，2010年版三部，中国农业出版社，2010)方法对灭活后的犬细小病毒进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验，结果表明：CPV S0425株灭活后，未受到细菌、霉菌的污染，也未受到支原体和外源病毒的感染，纯净性良好。

将购自Seppic公司的Gel A佐剂与灭菌生理盐水稀释或浓缩后的CPV S0425株混合至表1所述的终浓度，再加入1％m/m的硫柳汞溶液至其终浓度为0.01％m/m，并充分混匀，即得灭活疫苗1、2、3。

表1疫苗组合物之灭活疫苗所含组分详情

名称	CPV S0425株终含量(TCID<sub>50</sub>/ml)	佐剂	佐剂终含量(V/V)
				疫苗1	10<sup>5.0</sup>	Gel A	5％
疫苗2	10<sup>7.0</sup>	Gel A	5％
				疫苗3	10<sup>9.0</sup>	Gel A	5％

按《中国兽药典》(2010版)对灭活疫苗1、2、3中的β-丙内酯和汞类防腐剂残留量进行测定，结果：均符合兽用生物制品通则的规定。

2.2灭活疫苗的安全性试验

2.2.1一次单剂量接种的安全性试验

采用50日龄左右的健康易感犬(血球凝集抑制(HI)抗体≤1∶4)20只，随机分成4组，5只/组，其中第1-3组分别经皮下接种1ml/只灭活疫苗1、2、3，第4组皮下注射1ml生理盐水，作为空白对照。相同条件下饲养，观察14天，每天观察犬的食欲、精神、体温、眼鼻、粪便是否正常，注射部分及全身是否有不良反应。结果(见表2)：一次单剂量接种易感犬后，犬的精神状态良好、饮食欲正常，体温和粪便正常，无眼鼻分泌物产生，注射部位及全身未见不良反应，所有犬均健活。

表2灭活疫苗对犬一次单剂量接种的安全性试验结果

2.2.2单剂量重复接种的安全性试验

采用50日龄左右的健康易感犬(中和抗体≤1∶4)20只，随机分成4组，5只/组，其中第1-3组分别经皮下接种首次免疫1ml/只灭活疫苗1、2、3，并于首次免疫后第14天时加强免疫1ml/只，第4组皮下注射1ml生理盐水，作为空白对照。相同条件下饲养，观察14天，每天观察犬的食欲、精神、体温、眼鼻、粪便是否正常，注射部分及全身是否有不良反应。结果(见表3)：单剂量重复接种易感犬后，犬的精神状态良好、饮食欲正常，体温和粪便正常，注射部位及全身未见不良反应，所有犬均健活。

表3灭活疫苗对犬单剂量重复接种的安全性试验结果

2.2.3一次超剂量接种的安全性试验

采用50日龄左右的健康易感犬(中和抗体≤1∶4)20只，随机分成4组，5只/组，其中第1-3组分别经皮下接种4ml/只灭活疫苗1、2、3，第4组皮下注射1ml生理盐水，作为空白对照。相同条件下饲养，观察14天，每天观察犬的食欲、精神、体温、眼鼻、粪便是否正常，注射部分及全身是否有不良反应。结果见表4：一次超剂量接种易感犬后，犬的精神状态良好、饮食欲正常，体温和粪便正常，注射部位及全身未见不良反应，所有犬都健活。

表4灭活疫苗对犬一次超剂量接种的安全性试验结果

以上结果表明：无论是一次单剂量接种、单剂量重复接种或者一次超剂量接种，灭活疫苗1、2、3用于免疫犬均是安全的。

2.4灭活疫苗的效力试验

采用50日龄左右的健康易感犬(中和抗体≤1∶4)20只，随机分成4组，5只/组，其中第1-3组分别经皮下接种1ml/只灭活疫苗1、2、3，第4组皮下注射1ml生理盐水，作为空白对照。相同条件下饲养，观察14天发现犬的食欲、精神、体温、眼鼻、粪便均正常，注射部分及全身均无不良反应。在免疫后第21天，使用犬细小病毒强毒株CPV-YN株(参见中国专利CN101942419A)攻击试验犬，攻毒后每天观察犬的食欲、精神、体温、眼鼻、粪便是否正常，以及注射部位及全身是否有不良反应，并计算攻毒保护率，结果见表5。

表5灭活疫苗的效力试验结果

免疫疫苗	动物编号	接种剂量	发病数	死亡数	保护率
						疫苗1	61-65	1ml/只	0/5	0/5	100％
疫苗2	66-70	1ml/只	0/5	0/5	100％
						疫苗3	71-75	1ml/只	0/5	0/5	100％
空白对照组	76-80	1ml生理盐水	5/5	1/5	—

由表5可知：灭活疫苗1、2、3对50日龄左右的健康易感犬分别进行免疫，1ml/只，免疫后21天，口服10ml犬细小病毒强毒株进行攻毒，疫苗1、疫苗2和疫苗3对犬的保护率均为100％，表明灭活疫苗1、2、3具有良好的保护效果。

2.5免疫持续期检测

采用28日龄左右的健康易感犬(血球凝集抑制(HI)抗体≤1∶4)20只，随机分成4组，5只/组，其中第1-3组分别经皮下接种1ml/只灭活疫苗1、2、3，第4组皮下注射1ml生理盐水，作为空白对照。相同条件下饲养，首免后7天、14天、21天，采血测抗体滴度，第21天时再加强免疫一次，首免后每隔3个月进行采血，采用血凝抑制试验(参照中国专利CN103387996A)检测抗体效价；连续观察检测24个月，结果见表6。

表6灭活疫苗对犬免疫持续期试验抗体效价均值检测结果

由表6可知：灭活疫苗1、2、3分别二次免疫犬后在长达18个月内抗CPV抗体均值都维持在较高的水平，均≥1:256，在其有效抗体维持期间能均对注射犬完全保护(HI>1∶128)；并且在首次免疫后第7天即开始产生特异性抗体，第14天即产生较高滴度的特异性抗体。表明灭活疫苗1、2、3能够使机体在免疫后短时间内产生较高滴度的特异性抗体，并且能够在长达18个月甚至更长时间内预防犬细小病毒病的疫情。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (8)

1.犬细小病毒S0425株，保藏号为CCTCC No.V201634。

2.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求1所述的犬细小病毒S0425株或其3-30代培养物的抗原和药学上可接受的载体，所述的药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂为5％V/V的GelA佐剂。

3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述犬细小病毒S0425株或其培养物的抗原为灭活全病毒抗原，所述犬细小病毒S0425株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前10^5.0-10^9.0TCID₅₀/ml。

4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述犬细小病毒S0425株或其培养物的灭活全病毒抗原含量为灭活前10^6.0-10^8.0TCID₅₀/ml。

5.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述的疫苗组合物还包括其他抗原，所述其他抗原包括犬瘟热病毒抗原、犬腺病毒Ⅰ型抗原、犬腺病毒Ⅱ型抗原、犬钩端螺旋体抗原、犬冠状病毒抗原、犬副流感病毒抗原、狂犬病病毒抗原、犬流感病毒抗原、犬呼肠病毒抗原、犬伪狂犬病毒抗原、犬轮状病毒抗原、犬疱疹病毒抗原、犬病毒性乳头瘤病毒抗原、犬极细小病毒抗原、犬腮腺炎病毒抗原、犬淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒抗原和犬支气管败血波氏杆菌抗原中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述其他抗原包括犬瘟热病毒抗原、犬腺病毒Ⅰ型抗原、犬腺病毒Ⅱ型抗原、犬钩端螺旋体抗原、犬冠状病毒抗原、犬副流感病毒抗原、狂犬病病毒抗原和犬流感病毒抗原中的一种或多种。

7.一种权利要求2所述的疫苗组合物的制备方法，所述制备方法包括：将所述犬细小病毒S0425株培养增殖，灭活所述增殖的犬细小病毒S0425株，在灭活后的犬细小病毒S0425株加入药学上可接受的载体即得。

8.根据权利要求2～6任一项所述疫苗组合物在制备预防肠炎型和心肌炎型犬细小病毒病的药物中的应用。