CN1876181A - 犬科动物重要疫病系列弱毒联合疫苗制剂及制备工艺 - Google Patents

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CN1876181A CN 200610016784 CN200610016784A CN1876181A CN 1876181 A CN1876181 A CN 1876181A CN 200610016784 CN200610016784 CN 200610016784 CN 200610016784 A CN200610016784 A CN 200610016784A CN 1876181 A CN1876181 A CN 1876181A
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夏咸柱
黄耕
范泉水
钟志宏
李金中
胡桂学
何洪彬
乔军
余春
杨松涛
王承宇
高玉伟
王铁成
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Abstract

本发明公开犬科动物重要疫病系列弱毒联合疫苗制剂，包括一系列以犬狂犬病弱毒Rb/E3株、犬瘟热弱毒CDV/R－20/8株、犬冠状病毒弱毒YS1/V60株、犬副流感弱毒CPIV/A－20/8株、犬腺病毒弱毒YCA18株和犬细小病毒弱毒CR86106株作为疫苗毒株而制备的联合弱毒疫苗的制备工艺及制剂，用于犬狂犬病、犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒病、犬细小病毒病与犬冠状病毒病等犬科动物重要疫病的免疫预防。

Description

犬科动物重要疫病系列弱毒联合疫苗制剂及制备工艺
技术领域：
本发明涉及犬科动物疫病弱毒联合疫苗的制备方法，尤其是提供了犬科动物重要疫病系列弱毒联合疫苗制剂及制备工艺，用于犬科动物相应重要疫病的免疫预防，属于动物疫病防治技术领域。
背景技术：
在我国，随着犬、貉、狐等犬科毛皮动物养殖业不断发展，每年毛皮动物养殖数量达几百万只。但是，许多犬科动物重要疫病如狂犬病、犬瘟热、犬细小病毒性肠炎、犬传染性肝炎(狐狸脑炎)、犬传染性喉气管炎、犬副流感、犬冠状病毒性肠炎、犬钩端螺旋体病等疫病的不断发生严重威胁着犬及毛皮经济动物的健康，为此造成的经济损失巨大。同时，一些人兽共患疾病也直接威胁着人类的健康。
目前对上述疫病的有效防制办法是对动物进行疫苗的免疫预防接种，但由于现有疫苗保护率不高，免疫效果不理想，究其原因是因为个别疫苗毒种的免疫原性不强，有的甚至存在毒力返强现象。因此，急需研制更为安全有效的抗犬科动物重要疫病的疫苗制品。
发明内容：
本发明公开犬科动物重要疫病系列弱毒联合疫苗制剂，包括一系列以犬狂犬病弱毒Rb/E3株、犬瘟热弱毒CDV/R-20/8株、犬冠状病毒弱毒YS1/V60株、犬副流感弱毒CPIV/A-20/8株、犬腺病毒弱毒YCA18株和犬细小病毒弱毒CR86106株作为疫苗毒株而制备的联合弱毒疫苗的制备工艺及制剂，用于犬狂犬病、犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒病、犬细小病毒病与犬冠状病毒病等犬科动物重要疫病的免疫预防。
本发明的技术解决方案如下：将犬狂犬病弱毒Rb/E3株、犬瘟热弱毒CDV/R-20/8株分别接种Vero细胞；犬冠状病弱毒YS1/V60株、犬副流感弱毒CPIV/A-20/8株和犬腺病毒弱毒YCA18株分别接种MDCK细胞；犬细小病毒弱毒CR86106株接种F81细胞，收获细胞培养物，根据需要选择不同的制苗病毒液进行组合，并按一定比例混合后，加入保护剂，经真空冷冻干燥制成。
所述犬科动物主要是指犬、貉、狐、狼等。
制苗所使用毒种为本专利持有者自主分离并鉴定的毒株，其中犬狂犬病弱毒Rb/E3株为一株从进口ERA株疫苗中克隆的疫苗弱毒，犬瘟热弱毒CDV/R-20/8株为从进口疫苗中分离复壮获得的疫苗弱毒，犬冠状病毒弱毒YS1/V60株为从发病犬脏器中分离并驯化致弱的毒株，犬副流感弱毒CPIV/A-20/8株为从疫苗中分离复壮的疫苗弱毒，犬腺病毒弱毒YCA18株和犬细小病毒弱毒CR86106株为分离的自然弱毒株。
本发明还公开了一种疫苗冻干保护剂的配方及掺入比例，即保护剂中含有明胶12％、蔗糖40％，将以此配方制成的保护剂按1∶7的比例加入疫苗病毒混合液中，冻干后疫苗保存期在-20℃条件下可达2年以上。优于现有保护剂。
具体制备工艺包括以下步骤：
1、制苗用病毒液的制备
1.1狂犬病弱毒Rb/E3的制苗毒液用其生产用毒种Rb/E3同步接种Vero细胞(接种量1％)，转瓶培养，37℃培养1天后，第2天换维持液并改为35℃培养，逐日观察应无CPE，至第5天经-20℃和37℃冻融3次收获混合，以10000ml为1组，置-20℃待检备用，此时病毒滴度应不低于105.4个LD50/0.03mL(小鼠)。
1.2犬瘟热弱毒CDV/R-20/8的制苗毒液用其生产用毒种CDV/R-20/8同步接种Vero细胞(接种量2％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液并改为33℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现融合性CPE，冻融收获混合，以30000ml为1组，置-20℃待检备用，此时病毒滴度应不低于104.7个TCID50/0.1mL。
1.3犬副流感弱毒CPIV/A-20/8的制苗毒液用其生产用毒种CPIV/A-20/8同步接种MDCK细胞(接种量2％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液并改为33℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现融合性CPE，冻融收获混合，以30000ml为1组，置-20℃待检备用，此时病毒滴度应不低于104.7个TCID50/0.1mL。
1.4犬腺病毒弱毒YCA18的制苗毒液用其生产用毒种YCA18单层接种MDCK细胞(接种量1％)37℃培养1天后，换维持液并改为33℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现葡萄串状CPE，冻融收获混合，以10000ml为1组，置-20℃待检备用，此时病毒滴度应不低于105.0个TCID50/0.1mL。
1.5犬细小病毒弱毒CR86106的制苗毒液用其生产用毒种CR86106同步接种F81细胞(接种量5％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液继续37℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现拉网样CPE，冻融收获混合，以12000ml为1组，置-20℃待检备用，此时病毒滴度应不低于105.0个TCID50/0.1mL。
1.6冠状病毒弱毒YS1/V60的制苗毒液用其生产用毒种YS1/V60同步接种MDCK细胞(接种量5％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液继续37℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现拉网样CPE，冻融收获混合，以30000ml为1组，置-20℃待检备用，此时病毒滴度应不低于104.7个TCID50/0.1mL。
2、半成品检验
2.1无菌检验  将收获的各瓶病毒培养物分别取样，按《中华人民共和国生物制品质量标准》所示方法进行，应无菌生长。
2.2病毒含量  按《中华人民共和国生物制品质量标准》方法进行，应符合规定。
3、配苗及分装
3.1混合组批
选择6种制苗毒液中的任意3种或4种或5种或6种进行组合，按一定比例混合病毒液，即制成不同功效的3联、4联、5联和6联疫苗弱毒混合液，放-20℃备用。
3.2加保护剂与分装
按保护剂与弱毒混合液之比为1∶7的比例加入明胶—蔗糖保护剂，充分混合，定量分装，迅速进行冷冻真空干燥。
4、成品检验
4.1性状检验  本品为微黄白色海棉状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解成粉红色透明状液体。
4.2无菌检验  每批成品随机抽样5～10瓶，按《中华人民共和国生物制品质量标准》所示方法进行，应无菌生长。
4.3支原体检验  每批成品随机抽样5～10瓶，按《中华人民共和国生物制品质量标准》所示方法进行，应无支原体生长。
4.4外源病毒检验  每批成品随机抽样5～10瓶，按《中华人民共和国生物制品质量标准》所示方法进行，均应符合标准。
4.5病毒含量测定  每批成品随机抽样5～10瓶，按《中华人民共和国生物制品质量标准》所示方法进行，应符合规定。
4.6安全检验  每批成品随机抽样50瓶，选择易感犬5头进行肌肉注射接种，每头犬10瓶，连续观察21天，应无任何发病症状。
4.7剩余水份测定  按《中华人民共和国生物制品质量标准》所示方法进行，应符合规定。
4.8真空度测定  按《中华人民共和国生物制品质量标准》所示方法进行，应符合规定。
本发明优点在于：所用毒株为自行分离鉴定，有些是疫苗株，有些为自然弱毒株，不同于现有专利的制苗毒株，免疫原性好，对靶动物安全。病毒增殖过程采用了不同于现有技术的条件，如培养细胞的不同、培养温度的不同，使得本发明工艺制备的疫苗病毒含量高，免疫效果确实的特点。本发明的保护剂可有效保护疫苗质量，在-20度条件下保存保质期可达2年以上。
具体实施方式：
下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。
实施例1
犬科动物狂犬病、犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒病、犬细小病毒病与犬冠状病毒病六联弱毒疫苗制备工艺及制剂
1病毒增殖
狂犬病弱毒Rb/E3的制苗毒液用其生产用毒种Rb/E3同步接种Vero细胞(接种量1％)，转瓶培养，37℃培养1天后，第2天换维持液并改为35℃培养，逐日观察应无CPE，至第5天收获混合，此时病毒滴度应不低于105.4个LD50/0.03mL；
犬瘟热弱毒CDV/R-20/8的制苗毒液用其生产用毒种CDV/R-20/8同步接种Vero细胞(接种量2％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液并改为33℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现融合性CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于104.7个TCID50/0.1mL；
犬副流感弱毒CPIV/A-20/8的制苗毒液用其生产用毒种CPIV/A-20/8同步接种MDCK细胞(接种量2％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液并改为33℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现融合性CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于104.7个TCID50/0.1mL；
犬腺病毒弱毒YCA18的制苗毒液用其生产用毒种YCA18单层接种MDCK细胞(接种量1％)37℃培养1天后，换维持液继续培养，逐日观察，至75％以上细胞出现葡萄串状CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于105.0个TCID50/0.1mL；
犬细小病毒弱毒CR86106的制苗毒液用其生产用毒种CR86106同步接种F81细胞(接种量5％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液继续37℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现拉网样CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于105.0个TCID50/0.1mL；
冠状病毒弱毒YS1/V60的制苗毒液用其生产用毒种YS1/V60同步接种MDCK细胞(接种量5％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液继续37℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现拉网样CPE，收获，此时病毒滴度应不低于104.7个TCID50/0.1mL。
2收获
各病毒细胞培养物经-20℃/37℃反复冻溶3次，作为制苗毒液，-20℃保存。
3半成品检验
各病毒制苗毒液经无菌检验、病毒效价测定，达到要求后进行混合。
4配苗
将各病毒制苗毒液混合，以10万头剂为1批进行混合，其中Rb/E3毒液10000ml，CDV/R-20/8毒液30000ml，CPIV/A-20/8毒液30000ml，YCA18毒液10000ml，CR86106毒液30000ml，YS1/V60毒液30000ml，再按每10000mL湿苗加入明胶—蔗糖保护剂1428.5mL(保护剂与弱毒混合液之比为1∶7)，即为制作冻干疫苗的原液，放-20℃备用。
5分装
按《生物制品分装规程》进行分装，1.6-1.7mL每瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放-20℃待检。每一支疫苗中含有各弱毒的最小免疫剂量为：RV15个，CDV15个，CPIV15个，CAV10个，CPV10个，CCV10个。
6成品检验
按《中华人民共和国生物制品质量标准》所示方法对成品进行性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、病毒含量测定、安全检验、剩余水份测定、真空度测定，均需达到要求后方可使用，规格为1头剂/瓶。
实施例2
犬科动物狂犬病、犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒病、犬细小病毒病五联弱毒疫苗制备工艺及制剂
1、病毒增殖
狂犬病弱毒Rb/E3的制苗毒液用其生产用毒种Rb/E3同步接种Vero细胞(接种量1％)，转瓶培养，37℃培养1天后，第2天换维持液并改为35℃培养，逐日观察应无CPE，至第5天收获混合，此时病毒滴度应不低于105.4个LD50/0.03mL；
犬瘟热弱毒CDV/R-20/8的制苗毒液用其生产用毒种CDV/R-20/8同步接种Vero细胞(接种量2％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液并改为33℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现融合性CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于104.7个TCID50/0.1mL；
犬副流感弱毒CPIV/A-20/8的制苗毒液用其生产用毒种CPIV/A-20/8同步接种MDCK细胞(接种量2％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液并改为33℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现融合性CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于104.7个TCID50/0.1mL；
犬腺病毒弱毒YCA18的制苗毒液用其生产用毒种YCA18单层接种MDCK细胞(接种量1％)37℃培养1天后，换维持液继续培养，逐日观察，至75％以上细胞出现葡萄串状CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于105.0个TCID50/0.1mL；
犬细小病毒弱毒CR86106的制苗毒液用其生产用毒种CR86106同步接种F81细胞(接种量5％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液继续37℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现拉网样CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于105.0个TCID50/0.1mL；
2收获
各病毒细胞培养物经-20℃/37℃反复冻溶3次，作为制苗毒液，-20℃保存。
3半成品检验
各病毒制苗毒液经无菌检验、病毒效价测定，达到要求后进行混合。
4配苗
将各病毒制苗毒液混合，以10万头剂为1批进行混合，其中Rb/E3毒液10000ml，CDV/R-20/8毒液30000ml，CPIV/A-20/8毒液30000ml，YCA18毒液10000ml，CR86106毒液30000ml，再按每10000mL湿苗加入明胶—蔗糖保护剂1428.5mL(保护剂与弱毒混合液之比为1∶7)，即为制作冻干疫苗的原液，放-20℃备用。
5分装
按《生物制品分装规程》进行分装，1.2-1.3mL每瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放-20℃待检。每一支疫苗中含有各弱毒的最小免疫剂量为：RV15个，CDV15个，CPIV15个，CAV10个，CPV10个。
6成品检验
按《中华人民共和国生物制品质量标准》所示方法对成品进行性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、病毒含量测定、安全检验、剩余水份测定、真空度测定，均需达到要求后方可使用，规格为1头剂/瓶。
实施例3
犬科动物狂犬病、犬瘟热、犬腺病毒病、犬细小病毒病四联弱毒疫苗制备工艺及制剂
1病毒增殖
狂犬病弱毒Rb/E3的制苗毒液用其生产用毒种Rb/E3同步接种Vero细胞(接种量1％)，转瓶培养，37℃培养1天后，第2天换维持液并改为35℃培养，逐日观察应无CPE，至第5天收获混合，此时病毒滴度应不低于105.4个LD50/0.03mL；
犬瘟热弱毒CDV/R-20/8的制苗毒液用其生产用毒种CDV/R-20/8同步接种Vero细胞(接种量2％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液并改为33℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现融合性CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于104.7个TCID50/0.1mL；
犬腺病毒弱毒YCA18的制苗毒液用其生产用毒种YCA18单层接种MDCK细胞(接种量1％)37℃培养1天后，换维持液继续培养，逐日观察，至75％以上细胞出现葡萄串状CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于105.0个TCID50/0.1mL；
犬细小病毒弱毒CR86106的制苗毒液用其生产用毒种CR86106同步接种F81细胞(接种量5％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液继续37℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现拉网样CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于105.0个TCID50/0.1mL；
2收获
各病毒细胞培养物经-20℃/37℃反复冻溶3次，作为制苗毒液，-20℃保存。
3半成品检验
各病毒制苗毒液经无菌检验、病毒效价测定，达到要求后进行混合。
4配苗
将各病毒制苗毒液混合，以10万头剂为1批进行混合，其中Rb/E3毒液10000ml，CDV/R-20/8毒液30000ml，YCA18毒液10000ml，CR86106毒液30000ml，再按每10000mL湿苗加入明胶—蔗糖保护剂1428.5mL(保护剂与弱毒混合液之比为1∶7)，即为制作冻干疫苗的原液，放-20℃备用。
5分装
按《生物制品分装规程》进行分装，1.0-1.2mL每瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放-20℃待检。每一支疫苗中含有各弱毒的最小免疫剂量为：RV15个，CDV15个，CAV10个，CPV10个。
6成品检验
按《中华人民共和国生物制品质量标准》所示方法对成品进行性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、病毒含量测定、安全检验、剩余水份测定、真空度测定，均需达到要求后方可使用，规格为1头剂/瓶。
实施例4
犬科动物犬瘟热、犬腺病毒病、犬细小病毒病三联弱毒疫苗制备工艺及制剂
1病毒增殖
犬瘟热弱毒CDV/R-20/8的制苗毒液用其生产用毒种CDV/R-20/8同步接种Vero细胞(接种量2％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液并改为33℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现融合性CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于104.7个TCID50/0.1mL；
犬腺病毒弱毒YCA18的制苗毒液用其生产用毒种YCA18单层接种MDCK细胞(接种量1％)37℃培养1天后，换维持液继续培养，逐日观察，至75％以上细胞出现葡萄串状CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于105.0个TCID50/0.1mL；
犬细小病毒弱毒CR86106的制苗毒液用其生产用毒种CR86106同步接种F81细胞(接种量5％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液继续37℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现拉网样CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于105.0个TCID50/0.1mL；
2收获
各病毒细胞培养物经-20℃/37℃反复冻溶3次，作为制苗毒液，-20℃保存。
3半成品检验
各病毒制苗毒液经无菌检验、病毒效价测定，达到要求后进行混合。
4配苗
将各病毒制苗毒液混合，以10万头剂为1批进行混合，其中CDV/R-20/8毒液30000m1，YCA18毒液10000ml，CR86106毒液30000ml，再按每10000mL湿苗加入明胶—蔗糖保护剂1428.5mL，保护剂与弱毒混合液之比为1∶7，即为制作冻干疫苗的原液，放-20℃备用。
5分装
按《生物制品分装规程》进行分装，0.8mL-1.0mL每瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放-20℃待检。每一支疫苗中含有各弱毒的最小免疫剂量为：CDV15个，CAV10个，CPV10个。
6成品检验
按《中华人民共和国生物制品质量标准》所示方法对成品进行性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、病毒含量测定、安全检验、剩余水份测定、真空度测定，均需达到要求后方可使用，规格为1头剂/瓶。

Claims (9)

1、犬科动物犬瘟热、犬腺病毒病、犬细小病毒病三联弱毒疫苗制剂，其特征在于由以下组分组成：
犬瘟热病毒CDV/R-20/8株       0.3毫升
犬腺病毒YCA18株              0.1毫升
犬细小病毒CR86106株          0.3毫升
明胶-蔗糖保护剂              0.1毫升-0.2毫升
pH6.0～7.5。
2、犬科动物狂犬病、犬瘟热、犬腺病毒病、犬细小病毒病四联弱毒疫苗制剂，其特征在于由以下组分组成：
犬狂犬病毒Rb/E3株病毒液       0.1毫升
犬瘟热病毒CDV/R-20/8株        0.3毫升
犬腺病毒YCA18株               0.1毫升
犬细小病毒CR86106株           0.3毫升
明胶-蔗糖保护剂               0.1毫升-0.2毫升
pH6.0～7.5。
3、犬科动物狂犬病、犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒病、犬细小病毒病五联弱毒疫苗制剂，其特征在于由以下组分组成：
犬狂犬病毒Rb/E3株病毒液       0.1毫升
犬瘟热病毒CDV/R-20/8株        0.3毫升
犬副流感病毒CPIV/A-20/8株     0.3毫升
犬腺病毒YCA18株               0.1毫升
犬细小病毒CR86106株           0.3毫升
明胶-蔗糖保护剂               0.1毫升-0.2毫升
pH6.0～7.5。
4、犬科动物狂犬病、犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒病、犬细小病毒病与犬冠状病毒病六联弱毒疫苗制剂，其特征在于由以下组分组成：
犬狂犬病毒Rb/E3株病毒液       0.1毫升
犬瘟热病毒CDV/R-20/8株          0.3毫升
犬副流感病毒CPIV/A-20/8株       0.3毫升
犬腺病毒YCA18株                 0.1毫升
犬细小病毒CR86106株             0.3毫升
犬冠状病毒YS1/V60株             0.3毫升
明胶-蔗糖保护剂                 0.1毫升-0.2毫升
pH6.0～7.5。
5、权利要求1至4任意项所述的联合疫苗为冻干剂型。
6、权利要求1所述的联合疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)病毒增殖
犬瘟热弱毒CDV/R-20/8的制苗毒液用其生产用毒种CDV/R-20/8同步接种Vero细胞(接种量2％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液并改为33℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现融合性CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于104.7个TCID50/0.1mL；
犬腺病毒弱毒YCA18的制苗毒液用其生产用毒种YCA18单层接种MDCK细胞(接种量1％)37℃培养1天后，换维持液继续培养，逐日观察，至75％以上细胞出现葡萄串状CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于105.0个TCID50/0.1mL；
犬细小病毒弱毒CR86106的制苗毒液用其生产用毒种CR86106同步接种F81细胞(接种量5％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液继续37℃培养，逐日观察，75％以上细胞出现拉网样CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于105.0个TCID50/0.1mL；
(2)收获
各病毒细胞培养物经-20℃/37℃反复冻溶3次，-20℃保存；
(3)混合
根据所制联合疫苗组成将所需各病毒原液进行混合，以10万头剂为1批进行混合，其中CDV/R-20/g毒液30000ml，YCA18毒液10000ml，CRg6106毒液30000ml，再按每10000mL湿苗加入明胶—蔗糖保护剂1428.5mL，保护剂与弱毒混合液之比为1∶7，即为制作冻干疫苗的原液，放-20℃备用；
(4)分装
将疫苗混合液按要求进行分装，每瓶0.8-1.0mL，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放-20℃待检；
(5)冻干
在步骤(4)中得到的分装品冷冻干燥，步骤为：冷凝器降至-40℃以下，制品-40℃--70℃预冻2-4小时，逐渐升温至40℃--35℃，真空干燥8-10小时，30～35℃恒温真空干燥7-8小时，全过程累计25～30小时，制备出犬科动物重要疫病联合疫苗成品。
7、权利要求2所述的联合疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)病毒增殖
狂犬病弱毒Rb/E3的制苗毒液用其生产用毒种Rb/E3同步接种Vero细胞，接种量为1％，转瓶培养，37℃培养1天后，第2天换维持液并改为35℃培养，逐日观察应无CPE，至第5天收获混合，此时病毒滴度应不低于105.4个LD50/0.03mL；
犬瘟热弱毒CDV/R-20/8的制苗毒液用其生产用毒种CDV/R-20/8同步接种Vero细胞(接种量2％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液并改为33℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现融合性CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于104.7个TCID50/0.1mL；
犬腺病毒弱毒YCA18的制苗毒液用其生产用毒种YCA18单层接种MDCK细胞(接种量1％)37℃培养1天后，换维持液继续培养，逐日观察，至75％以上细胞出现葡萄串状CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于105.0个TCID50/0.1mL；
犬细小病毒弱毒CR86106的制苗毒液用其生产用毒种CR86106同步接种F81细胞(接种量5％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液继续37℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现拉网样CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于105.0个TCID50/0.1mL；
(2)收获
各病毒细胞培养物经-20℃/37℃反复冻溶3次，-20℃保存；
(3)混合
根据所制联合疫苗组成将所需各病毒原液进行混合，以10万头剂为1批进行混合，其中Rb/E3毒液10000ml，CDV/R--20/8毒液30000ml，YCA18毒液10000ml，CR86106毒液30000ml，再按每10000mL湿苗加入明胶—蔗糖保护剂1428.5mL(保护剂与弱毒混合液之比为1∶7)，即为制作冻干疫苗的原液，放-20℃备用；
(4)分装
将疫苗混合液按要求进行分装，每瓶1.0-1.2mL，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放-20℃待检；
(5)冻干
在步骤(4)中得到的分装品冷冻干燥，步骤为：冷凝器降至-40℃以下，制品-40℃--70℃预冻2-4小时，逐渐升温至-40℃--35℃，真空干燥8-10小时，30～35℃恒温真空干燥7-8小时，全过程累计25～30小时，制备出犬科动物重要疫病联合疫苗成品。
8、权利要求3所述的联合疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)病毒增殖
狂犬病弱毒Rb/E3的制苗毒液用其生产用毒种Rb/E3同步接种Vero细胞，接种量为1％，转瓶培养，37℃培养1天后，第2天换维持液并改为35℃培养，逐日观察应无CPE，至第5天收获混合，此时病毒滴度应不低于105.4个LD50/0.03mL；
犬瘟热弱毒CDV/R-20/8的制苗毒液用其生产用毒种CDV/R-20/8同步接种Vero细胞(接种量2％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液并改为33℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现融合性CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于104.7个TCID50/0.1mL；
犬副流感弱毒CPIV/A-20/8的制苗毒液用其生产用毒种CPIV/A-20/8同步接种MDCK细胞(接种量2％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液并改为33℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现融合性CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于104.7个TCID50/0.1mL；
犬腺病毒弱毒YCA18的制苗毒液用其生产用毒种YCA18单层接种MDCK细胞(接种量1％)37℃培养1天后，换维持液继续培养，逐日观察，至75％以上细胞出现葡萄串状CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于105.0个TCID50/0.1mL；
犬细小病毒弱毒CR86106的制苗毒液用其生产用毒种CR86106同步接种F81细胞(接种量5％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液继续37℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现拉网样CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于105.0个TCID50/0.1mL；
(2)收获
各病毒细胞培养物经-20℃/37℃反复冻溶3次，-20℃保存；
(3)混合
根据所制联合疫苗组成将所需各病毒原液进行混合，以10万头剂为1批进行混合，其中Rb/E3毒液10000ml，CDV/R-20/8毒液30000ml，CPIV/A-20/8毒液30000ml，YCA18毒液10000ml，CR86106毒液30000ml，再按每10000mL湿苗加入明胶—蔗糖保护剂1428.5mL(保护剂与弱毒混合液之比为1∶7)，即为制作冻干疫苗的原液，放-20℃备用；
(4)分装
将疫苗混合液按要求进行分装，每瓶1.2-1.3mL，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放-20℃待检；
(5)冻干
在步骤(4)中得到的分装品冷冻干燥，步骤为：冷凝器降至-40℃以下，制品-40℃--70℃预冻2-4小时，逐渐升温至-40℃--35℃，真空干燥8-10小时，30～35℃恒温真空干燥7-8小时，全过程累计25～30小时，制备出犬科动物重要疫病联合疫苗成品。
9、权利要求4所述的联合疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)病毒增殖
狂犬病弱毒Rb/E3的制苗毒液用其生产用毒种Rb/E3同步接种Vero细胞，接种量为1％，转瓶培养，37℃培养1天后，第2天换维持液并改为35℃培养，逐日观察应无CPE，至第5天收获混合，此时病毒滴度应不低于105.4个LD50/0.03mL；
犬瘟热弱毒CDV/R-20/8的制苗毒液用其生产用毒种CDV/R-20/8同步接种Vero细胞(接种量2％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液并改为33℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现融合性CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于104.7个TCID50/0.1mL；
犬副流感弱毒CPIV/A-20/8的制苗毒液用其生产用毒种CPIV/A-20/8同步接种MDCK细胞(接种量2％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液并改为33℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现融合性CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于104.7个TCID50/0.1mL；
犬腺病毒弱毒YCA18的制苗毒液用其生产用毒种YCA18单层接种MDCK细胞(接种量1％)37℃培养1天后，换维持液继续培养，逐日观察，至75％以上细胞出现葡萄串状CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于105.0个TCID50/0.1mL；
犬细小病毒弱毒CR86106的制苗毒液用其生产用毒种CR86106同步接种F81细胞(接种量5％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液继续37℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现拉网样CPE，收获混合，此时病毒滴度应不低于105.0个TCID50/0.1mL；
冠状病毒弱毒YS1/V60的制苗毒液用其生产用毒种YS1/V60同步接种MDCK细胞(接种量5％)，转瓶培养，37℃培养1天后，换维持液继续37℃培养，逐日观察，至75％以上细胞出现拉网样CPE，收获，此时病毒滴度应不低于106.0个TCID50/0.1mL。
(2)收获
各病毒细胞培养物经-20℃/37℃反复冻溶3次，-20℃保存；
(3)混合
根据所制联合疫苗组成将所需各病毒原液进行混合，以10万头剂为1批进行混合，其中Rb/E3毒液10000ml，CDV/R-20/8毒液30000ml，CPIV/A-20/8毒液30000ml，YCA18毒液10000ml，CR86106毒液30000ml，YS1/V60毒液30000ml，再按每10000mL湿苗加入明胶—蔗糖保护剂1428.5mL(保护剂与弱毒混合液之比为1∶7)，即为制作冻干疫苗的原液，放-20℃备用；
(4)分装
将疫苗混合液按要求进行分装，每瓶1.6-1.7mL，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放-20℃待检；
(5)冻干
在步骤(4)中得到的分装品冷冻干燥，步骤为：冷凝器降至-40℃以下，制品-40℃--70℃预冻2-4小时，逐渐升温至-40℃--35℃，真空干燥8-10小时，30～35℃恒温真空干燥7-8小时，全过程累计25～30小时，制备出犬科动物重要疫病联合疫苗成品。
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