CN104164409A - 含有犬gmcsf基因的重组犬瘟热病毒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及重组病毒疫苗领域，本发明公开了一种含有编码犬粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基因的重组犬瘟热病毒，更具体地，重组犬瘟热病毒是rCDV-GMCSF。本发明还公开了该重组犬瘟热病毒的制备方法。本发明运用反向遗传学操作技术，将犬GMCSF基因插入犬瘟热病毒的基因组内，构建了含有犬GMCSF基因的重组基因组全长cDNA克隆pCI-CDV-GMCSF，经RT-PCR、间接免疫荧光试验、电镜观察证实成功救获了表达GMCSF蛋白的重组犬瘟热病毒rCDV-GMCSF，且该重组犬瘟热病毒的生长滴度与野生型犬瘟热病毒无明显差异，为进一步研究GMCSF作为佐剂应用于犬瘟热弱毒疫苗株的免疫奠定了物质基础。

Description

含有犬GMCSF基因的重组犬瘟热病毒及其制备方法

技术领域

本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及一种含有编码犬粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的基因的重组犬瘟热病毒，更具体地，重组犬瘟热病毒是rCDV-GMCSF。本发明还公开了该重组犬瘟热病毒的制备方法。

背景技术

犬瘟热是犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV)引起多种动物的急性、热性、高度接触性和致死性传染病，常引起犬、貂、狐等动物发病，给犬和毛皮经济动物养殖业造成巨大损失，CDV自然感染宿主在不断扩大，除犬科动物外，还可感染大熊猫、小熊猫、狮、虎和豹等食肉目所有8个科、偶蹄目猪科、灵长目的猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物。疫苗接种能有效预防该病。

犬瘟热病毒属于副粘病毒科麻疹病毒属，基因组为非分节段的单股负链RNA，全长15,690个核苷酸，编码6个结构蛋白，依次为核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和大聚合酶蛋白(L)，负链RNA病毒的主要特点是基因组RNA不具有感染性，而且裸露的基因组RNA本身也不能作为模板，只有在与核蛋白(NP)结合成核糖核蛋白(RNP)复合体后，才能作为模板起始复制和转录，并表达和包装出具有感染性的子代病毒。

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte Macrophage Colony StimulatingFactor，GMCSF)是一种有广泛免疫活性的效应因子，能刺激粒细胞、单核细胞、T细胞的增殖、分化及功能成熟，激活树突状细胞增强其递呈抗原的能力；增强IL-2的产生，活化CD4+T细胞，提高其分泌抗体的能力，同时亦可增强CD8+T细胞的功能，提高细胞免疫水平。

犬瘟热的预防免疫主要是通过接种犬瘟热病毒弱毒疫苗进行工动免疫。无论是进口疫苗还是其复制品或国内生产的疫苗，虽有一定的效果，但都不能彻底控制犬瘟热的发生。因此，研发一种能够彻底控制犬瘟热的免疫原性高的病毒疫苗是亟待解决的问题。

发明内容

本发明选用我国临床上广泛应用的犬瘟热病毒弱毒疫苗株，利用反向遗传操作平台，构建了含有犬粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)基因的重组犬瘟热全长cDNA克隆pCI-CDV-GMCSF。应用构建的全长cDNA克隆，利用反向遗传操作技术救获了重组犬瘟热病毒rCDV-GMCSF，该重组病毒与亲本疫苗株的生长特性一致，并且GMCSF蛋白的表达具有遗传稳定性。

本发明的目的在于提供一种含有编码犬GMCSF蛋白的基因的重组犬瘟热病毒，所述重组犬瘟热病毒为rCDV-GMCSF，其基因组序列如SEQ ID NO.4所示。

在一个优选实施方案中，通过反向遗传操作技术在犬瘟热病毒弱毒疫苗中表达所述犬GMCSF蛋白，犬瘟热病毒弱毒疫苗优选CDV/R-20/8疫苗株。

在一个优选实施方案中，GMCSF基因位于所述犬瘟热病毒基因组编码的磷蛋白(P)基因和基质蛋白(M)基因之间的非编码区。

在一个优选实施方案中，所述编码犬粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子即GMCSF蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

在一个优选实施方案中，所述犬粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子即GMCSF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明的另一个目的在于提供本发明的重组犬瘟热病毒的制备方法，该方法包括：(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码犬粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子即GMCSF蛋白的基因的所述犬瘟热病毒的基因组cDNA序列，优选所述犬瘟热弱毒疫苗株是CDV/R-20/8；(2)构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述犬瘟热弱毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述犬瘟热弱毒疫苗的磷蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述犬瘟热弱毒疫苗的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；(3)将所述转录质粒和辅助质粒共转染所述犬瘟热病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；(4)从转染的宿主细胞的细胞悬液中拯救重组犬瘟热病毒。

将所述转录质粒和辅助质粒共转染所述犬瘟热病毒复制许可的宿主细胞的详细步骤如下：BHK-21细胞接种于六孔板中，待第二天生长至70％～80％单层时，采用磷酸钙转染试剂将构建好的转录质粒与辅助质粒共转染BHK-21细胞。转染步骤如下：(1)将氯化钙与各质粒混合静置，静置期间将BHK-21细胞消化下来，离心，弃掉DMEM；(2)将细胞加入氯化钙与质粒混合液中，吹打均匀，静置，静置期间将DMEM置于37℃温箱孵育；(3)将新的DMEM加入步骤(2)的混合液中，混匀后加入6孔板；(4)12h后43℃水浴热激2h；(5)24h后用含有10％DMSO的PBS液休克细胞2.5min，之后加入完全DMEM培养液继续于5％CO₂、37℃培养箱中培养。

在本发明的一个具体的实施方案中，将所述转录质粒和辅助质粒共转染所述犬瘟热病毒复制许可的宿主细胞的操作步骤如下所示：BHK-21细胞接种于六孔板中，待第二天生长至70％～80％单层时，采用磷酸钙转染试剂将构建好的转录质粒pCI-CDV-GMCSF与辅助质粒pCI-CDV-N、pCI-CDV-P、pCI-CDV-L共转染BHK-21细胞，转染量分别为5μg、1μg、0.8μg和0.5μg。转染步骤如下：(1)将氯化钙与各质粒混合静置，静置期间将BHK-21细胞消化下来，800g室温离心5min，弃掉DMEM；(2)将细胞加入氯化钙与质粒混合液中，吹打均匀，静置20min，静置期间将5％DMEM置于37℃温箱孵育；(3)将新的5％DMEM加入步骤(2)的混合液中，混匀后加入6孔板；(4)12h后43℃水浴热激2h；(5)24h后用含有10％DMSO的PBS液休克细胞2.5min，之后加入完全DMEM培养液继续于5％CO₂、37℃培养箱中培养。

在一个优选实施方案中，所述转录质粒是pCI-CDV-GMCSF，所述转录辅助质粒分别是质粒pCI-CDV-N、pCI-CDV-P、pCI-CDV-L。

在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是Vero细胞或BHK细胞。

具体而言，重组犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)作为新型的活病毒载体疫苗具有巨大的优势和应用前景。本研究以犬瘟热弱毒疫苗株CDV/R-20/8为亲本株，采用反向遗传操作技术救获了含有犬粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)基因的重组犬瘟热病毒rCDV-GMCSF，常规透射电镜观察病毒粒子形态，结果显示重组病毒rCDV-GMCSF具有完整的副粘病毒粒子形态，粒子的大小及形状与母本毒rCDV无明显差异；间接免疫荧光证实GMCSF蛋白在重组病毒rCDV-GMCSF感染的Vero细胞中获得高效表达；病毒一步生长试验显示，反向遗传救获的rCDV和rCDV-GMCSF的生长滴度峰值无明显差异。

本发明的优点和有益效果如下：本发明运用反向遗传学操作技术，将犬GMCSF插入犬瘟热病毒的基因组内，构建了含有犬GMCSF基因的重组基因组全长cDNA克隆pCI-CDV-GMCSF，GMCSF蛋白稳定高效表达，提高了重组犬瘟热病毒的免疫原性。为进一步研究GMCSF作为佐剂应用于犬瘟热弱毒疫苗株的免疫奠定了物质基础。

附图说明

图1.含有狂犬病毒糖蛋白G基因重组犬瘟热全长质粒pCI-CDV-RVG(图1A)；表达犬粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子即GMCSF基因重组犬瘟热全长质粒pCI-CDV-GMCSF(图1B)构建：其中“斜体大写字母序列”为PmeI酶切位点，“加下划线的小写字母”为基因转录终止信号序列GE，“加下划线的大写字母”为基因转录起始信号序列GS，“大写加粗的CTT”为基因间隔区核苷酸，“斜体加粗的序列GCCACCACC”为KozaK序列；

图2.重组犬瘟热病毒rCDV-GMCSF的RT-PCR鉴定结果；

图3.重组犬瘟热病毒rCDV-GMCSF感染Vero细胞的间接免疫荧光图片：(A)rCDV-GMCSF感染的Vero细胞；(B)未感染的Vero细胞；

图4.rCDV-GMCSF电子显微镜观察图(×40000)；

图5.rCDV-GMCSF和rCDV感染Vero细胞的生长动力学曲线；

图6.质粒pBluescript II KS+载体图谱；

图7.质粒pCI载体图谱。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例只是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。

实施例  含有编码犬粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)的基因的重组犬瘟热病毒的构建

1材料和方法

1.1材料

犬瘟热弱毒疫苗CDV/R-20/8购自中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所，表达狂犬病病毒糖蛋白的重组犬瘟热病毒全长cDNA克隆质粒pCI-CDV-RVG和表达CDV NP、P和L蛋白的辅助质粒pCI-CDVN、pCI-CDVP和pCI-CDVL由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存；BHK-21细胞(ATCC No.CCL-10)和Vero细胞(ATCC No.CCL-81)由本研究室保存，培养液均为含10％胎牛血清的DMEM；质粒pCI(Promega)和pBluescript II KS+(Clontech)由本研究室保存；Phusion DNA聚合酶，T₄DNA连接酶及其它限制性内切酶均购自NEB公司；感受态细胞购自TaKaRa公司；凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Axygen公司；RNA提取用TRIzol、鼠源反转录酶MLV、磷酸钙转染试剂盒，RPMI1640培养液购自Invitrogen；胎牛血清购自长春西诺生物科技有限公司；犬抗CDV全病毒高免血清由本研究室制备；荧光素(FITC)标记的兔抗犬二抗购自Sigma公司；荧光显微镜为BX51FL；Olympus，购自Olympus公司；Hanks液，犬淋巴细胞分离液，刀豆蛋白A(Con A)购自索莱宝公司。

1.2犬GMCSF基因的获取和序列分析

从GenBank获得犬GMCSF开放阅读框序列(GenBank AccessionNo.S49738)，设计一对引物(见表1)，上游引物起始密码子ATG前分别引入了GE、GS和KozaK序列，并在上下游引物中引入PmeI酶切位点，同时保证全长总碱基数为6的倍数。

无菌采取比格犬外周血10mL于抗凝采血管，以犬淋巴细胞分离液分离出单核细胞，用Hanks液洗涤后离心收集单核细胞，再用含10％胎牛血清、1％Con ARPMI1640培养液,于37℃、5％CO₂条件下培养20h,诱导产生细胞因子,收集诱导培养后的单核细胞。

使用TRIzol法提取诱导培养后的单核细胞RNA(方法见试剂说明书)。提取的RNA溶于DEPC水中，以鼠源反转录酶(MLV)进行反转录合成cDNA第一条链。以cDNA为模板利用上述引物进行PCR扩增GMCSF基因，经凝胶电泳回收后平端克隆至pBluescript II KS+载体EcoRV位点，克隆产物经序列测定正确后命名pB-GMCSF。

表1表达犬GMCSF全长基因组克隆质粒构建用引物

注：“斜体大写字母序列”为PmeI酶切位点，“加下划线的小写字母”为基因转录终止信号序列，“加下划线的大写字母”为基因转录起始信号序列，“大写加粗的CTT”为基因间隔区核苷酸，“斜体加粗的序列GCCACCACC”为KozaK序列。

1.3表达犬GMCSF基因的重组病毒基因组全长cDNA克隆的构建

将1.2中经测序正确的质粒pB-GMCSF用PmeI限制性内切酶消化后回收GMCSF片段，并连接入同样酶切去磷酸化的表达狂犬病病毒糖蛋白的重组犬瘟热病毒全长cDNA克隆质粒pCI-CDV-RVG P基因与M基因之间，构建含有GMCSF的重组基因组全长cDNA克隆pCI-CDV-GMCSF。

1.4重组病毒的拯救

BHK-21细胞接种于六孔板中，待第二天生长至70％～80％单层时，采用磷酸钙转染试剂将构建好的转录质粒pCI-CDV-GMCSF与辅助质粒pCI-CDV-N、pCI-CDV-P、pCI-CDV-L共转染BHK-21细胞，转染量分别为5μg、1μg、0.8μg和0.5μg。详细的转染步骤如下：(1)将氯化钙与各质粒混合静置，静置期间将BHK-21细胞消化下来，800g室温离心5min，弃掉DMEM；(2)将细胞加入氯化钙与质粒混合液中，吹打均匀，静置20min，静置期间将5％DMEM置于37℃温箱孵育；(3)将新的5％DMEM加入步骤(2)的混合液中，混匀后加入6孔板；(4)12h后43℃水浴热激2h；(5)24h后用含有10％DMSO的PBS液休克细胞2.5min，之后加入完全DMEM培养液继续于5％CO₂、37℃培养箱中培养。4d后刮下细胞，将细胞悬液混匀，取300μl细胞悬液接种于生长过夜、密度约60％～70％的单层Vero细胞，感作1h后加入含有5％胎牛血清的DMEM，于5％CO₂、37℃培养箱中培养4～6d后，显微镜下观察细胞病变情况，待细胞出现病变时，收获细胞悬液，作为第一代种毒保存于﹣80℃冰箱。拯救成功的具有感染性的表达GMCSF的重组犬瘟热病毒命名为rCDV-GMCSF。

1.5重组犬瘟热病毒rCDV-GMCSF RT-PCR鉴定

分别取拯救重组病毒rCDV-GMCSF与母本毒rCDV250μl，按Trizol法提取基因组RNA，以鼠源反转录酶MLV合成cDNA第一条链，以设计鉴定引物(GMCSFJDF：5’-GAAGTTCTCAAGCAGCCC-3’；GMCSFJDR：5‘-CCTACCATCGGGATAAGTGGTA-3’)进行PCR扩增，将扩增产物回收并进行测序分析，以确定拯救重组病毒基因组中含有GMCSF基因。

1.6重组犬瘟热病毒rCDV-GMCSF间接免疫荧光鉴定

将Vero细胞接种于24孔板中，第二天待细胞生长至70％～80％单层时，以无血清DMEM培养液重组犬瘟热病毒rCDV-GMCSF种毒液进行10倍系列稀释，取10³倍病毒稀释液接种于24孔板中，接种量为100μl/孔。于5％CO₂、37℃培养箱中培养3d，弃去培养上清，以PBS缓冲液洗涤细胞两次，室温下以3％多聚甲醛固定30min，PBST洗涤三遍。以1％BSA按1:200倍稀释犬抗CDV高免血清为一抗加入24孔板中室温摇床孵育30min，PBST洗涤三遍后，加入1:200倍稀释FITC标记的羊抗狗荧光二抗，室温摇床作用30min，PBST洗涤三遍，荧光显微镜观察检测结果。

1.7重组病毒rCDV-GMCSF电镜观察

分别收集拯救重组病毒rCDV-GMCSF与母本毒rCDV感染Vero细胞上清，采用磷钨酸负染法制备样本，常规透射电镜观察病毒粒子形态。

1.8重组病毒rCDV-GMCSF与母本毒rCDV在Vero细胞上的生长动力学比较

将救获重组病毒rCDV-GMCSF与母本毒rCDV分别按MOI为0.01接种生长过夜、密度约为70％～80％单层Vero细胞，37℃感作1h后，PBS洗2次，加入含2％胎牛血清的DMEM培养液，5％CO2、37℃继续培养，分别于感染后24h、48h、72h、96h和120h收获上述感染病毒的细胞；将上述不同时间段收获的病毒液冻融1次后，做10倍连续稀释，分别取100μl各稀释度病毒液接种铺于24孔板、过夜生长至密度约为70％～80％单层Vero细胞，37℃感作1h后，加入含2％胎牛血清的DMEM培养液，5％CO₂、37℃培养，每个稀释度做4个重复；感染后第5天显微镜下观察细胞病变，计算各时间点收取重组病毒rCDV-GMCSF与母本毒rCDV病毒滴度(TCID₅₀)，并绘制病毒生长动力学曲线，以评价两种病毒在Vero细胞上的生长动力学特点。

2结果

2.1含有犬GMCSF基因的重组CDV基因组全长cDNA克隆的构建

用TRIzol法提取的诱导培养后的单核细胞RNA以鼠源反转录酶(MLV)进行反转录合成cDNA第一条链。以合成的cDNA为模板利用GMCSF-F/GMCSF-R引物进行PCR扩增获得犬GMCSF基因的片段，大小为500bp。经凝胶电泳回收后克隆至pBluescript II KS+载体EcoRV位点，测序正确的质粒命名为pB-GMCSF。pB-GMCSF的序列如SEQ ID No.3所示。pB-GMCSF用PmeI限制性内切酶消化后回收GMCSF片段，并连接入同样酶切处理的pCI-CDV-RVG，构建成含有GMCSF基因的重组基因组全长cDNA克隆pCI-CDV-GMCSF(图1)。pCI-CDV-GMCSF的序列如SEQ ID No.4所示。

2.2重组病毒的拯救及RT-PCR鉴定结果

为了从cDNA克隆中拯救出感染性rCDV-GMCSF，以pCI-CDV-GMCSF及表达犬瘟热病毒N、P和L蛋白辅助质粒pCI-CDV-N、pCI-CDV-P、pCI-CDV-L以磷酸钙试剂盒共转染BHK-21细胞，4天后，刮取细胞，将细胞悬液混和均匀记为F1代，取其中300μl悬液接种于单层长至70％～80％Vero细胞，培养4～6d，显微镜下观察细胞病变，待细胞病变达80％时收获病毒记为F2代。按上述方法连续传至F5代。以鉴定引物GMCSFJDF/GMCSFJDR通过RT-PCR鉴定结果表明重组病毒rCDV-GMCSF可特异地扩增出大小985bp的条带，而母本毒仅扩增出大小为482bp的条带，结果与预期相符。结果表明通过反向遗传操作技术成功救获具有感染性的含有犬GMCSF基因的重组犬瘟热病毒rCDV-GMCSF(图2)。

2.3间接免疫荧光检测救获的病毒

为进一步鉴定所救获的重组病毒，以救获的重组病毒rCDV-GMCSF进行10倍系列稀释，取10³倍病毒稀释液接种于密度约为70％～80％单层Vero细胞，3天后以3％多聚甲醛固定细胞，分别以1:200倍稀释犬抗CDV高免血清为一抗、1:200倍稀释羊抗狗FITC标记抗体为二抗进行间接免疫荧光染色。结果显示，重组犬瘟热病毒rCDV-GMCSF感染细胞显示阳性绿色荧光信号(图3A)，而未感染病毒的Vero细胞则显示阴性荧光信号(图3B)。结果表明通过反向遗传技术成功救获具有感染性的重组犬瘟热病毒rCDV-GMCSF。

2.4电镜观察检测救获的病毒

为鉴定上述救获的重组病毒，分别取F3代重组病毒rCDV-GMCSF与母本毒rCDV各50μl，采用磷钨酸负染法制备样本，常规透射电镜观察病毒粒子形态，结果显示重组病毒rCDV-GMCSF(图4A)具有完整的副粘病毒粒子形态，粒子的大小及形状与母本毒rCDV无明显差异(图4B)。结果表明通过反向遗传技术成功救获具有感染性的重组犬瘟热病毒rCDV-GMCSF。

2.5重组病毒与母本毒在Vero细胞上的生长动力学比较

为比较重组病毒rCDV-GMCSF和母本毒rCDV在Vero细胞上的生长动力学特点，分别将两种病毒按MOI为0.01接种于生长过夜、密度约为70％～80％单层Vero细胞，分别于感染后24h、48h、72h、96h和120h收获病毒液，将上述不同时间点收取的病毒冻融一次后，分别作10倍连续稀释后，接种于24孔板中生长过夜、密度约为70％～80％单层Vero细胞，5天后显微镜下观察细胞病变情况，根据Reed-Muench法计算病毒滴度(TCID₅₀)。结果显示，重组病毒rCDV-GMCSF和母本毒rCDV相比生长滴度达到峰值的时间推迟至72h，但生长滴度峰值无明显差异(图5)。

Claims (13)

1.一种重组犬瘟热病毒，其特征在于，所述重组犬瘟热病毒在其基因组中插入犬GMCSF基因。

2.根据权利1所述的重组犬瘟热病毒，其特征在于，所述重组犬瘟热病毒是由弱毒疫苗株CDV/R-20/8构建而成。

3.根据权利要求1或2所述的重组犬瘟热病毒，其特征在于，所述犬GMCSF基因位于所述犬瘟热病毒中编码磷蛋白基因P和编码基质蛋白基因M之间的非编码区。

4.根据权利要求1或2所述的重组犬瘟热病毒，其特征在于，所述犬GMCSF基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

5.根据权利要求1或2所述的重组犬瘟热病毒，其特征在于，所述犬GMCSF基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

6.一种权利要求1所述的重组犬瘟热病毒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)构建转录质粒，所述转录质粒包括其中插入犬GMCSF基因的所述犬瘟热病毒的基因组cDNA序列；

(2)构建一个或多个转录辅助质粒，所述转录辅助质粒编码所述犬瘟热病毒的核蛋白N、磷蛋白P、和/或大聚合酶蛋白L；

(3)将所述转录质粒和所述辅助质粒共转染所述犬瘟热病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的所述宿主细胞；

(4)从转染的所述宿主细胞的细胞悬液中拯救所述重组犬瘟热病毒。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的详细过程如下：BHK-21细胞接种于六孔板中，待第二天生长至70％～80％单层时，采用磷酸钙转染试剂将构建好的转录质粒与辅助质粒共转染BHK-21细胞，转染步骤如下：(1)将氯化钙与各质粒混合静置，静置期间将BHK-21细胞消化下来，离心，弃掉DMEM；(2)将BHK-21细胞加入氯化钙与质粒混合液中，吹打均匀，静置，静置期间将DMEM置于37℃温箱孵育；(3)将新的DMEM加入步骤(2)得到的混合液中，混匀后加入6孔板；(4)12h后43℃水浴热激2h；(5)24h后用含有10％DMSO的PBS液休克细胞2.5min，之后加入完全DMEM培养液继续于5％CO2、37℃培养箱中培养。

8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述转录质粒是pCI-CDV-GMCSF。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述pCI-CDV-GMCSF的转染量为5μg。

10.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述转录辅助质粒是三个，所述三个转录辅助质粒分别编码所述犬瘟热病毒的所述核蛋白N、所述磷蛋白P、所述大聚合酶蛋白L。

11.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述转录辅助质粒分别是pCI-CDV-N、pCI-CDV-P、pCI-CDV-L。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述pCI-CDV-N、所述pCI-CDV-P、所述pCI-CDV-L的转染量分别是1μg、0.8μg和0.5μg。

13.根据权利要求6或7所述的制备方法，其中所述宿主细胞是Vero细胞或BHK细胞。