CN102807970A - 犬瘟热病毒敏感细胞系及其建立方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株犬瘟热病毒敏感细胞系及其建立方法和应用，属于生物技术领域。本发明采用慢病毒四质粒包装系统，获得了一株表达犬源SLAM的稳定细胞系MDCK-CSL，其菌种保藏编号为：CGMCC No.5881。通过比较CDV标准株在MDCK-CSL和MDCK细胞上的繁殖情况，表明CDV-Snyder Hill标准毒株感染MDCK-CSL细胞系24小时即可观察到细胞相互融合、圆缩、明显死亡等细胞病变；而感染MDCK细胞持续6天仅表现为细胞生长缓慢，未出现细胞病变。本发明建立的CDV敏感细胞系MDCK-CSL，为CDV野毒株的分离及其完整的生物学特性研究提供了技术平台，也为犬瘟热病的防控奠定了基础。

Description

犬瘟热病毒敏感细胞系及其建立方法和应用

技术领域

本发明涉及一种用于病毒培养的敏感细胞系，特别涉及一种用于犬瘟热病毒培养的敏感细胞系，本发明还涉及该细胞系的建立方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术

犬瘟热（Canine distemper，CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）感染犬所引起的急性、高度接触性传染病。自1809年首次报道以来,该病已呈世界性分布，给养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业造成巨大危害。CDV属于副粘病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒属（Morbillivirus）。尽管CDV分为亚洲Ⅰ型（Asia-Ⅰ）、亚洲Ⅱ型（Asia-Ⅱ）、欧洲型（Europe）、美国Ⅱ型（USA-Ⅱ）、北极型（Arctic）和疫苗型（Vaccine）6个不同基因亚型，但公认只有一个血清型。CDV不易在环境中存活，现地分离病毒成功率低，限制了对CDV的研究。

目前分离CDV多采用犬肾细胞系（MDCK）、非洲绿猴肾细胞系（Vero）及绒猴B淋巴细胞系（B95a）。使用MDCK分离CDV野毒株时病毒所形成的细胞病变不明显且形成时间较长，而Vero会导致CDV毒力下降。虽然B95a分离CDV的成功率较高，但利用其所分离到的病毒株除能与犬源SLAM（SALM，CDV的已知受体）发生作用外，也能利用人源及绒猴源SLAM，人为的扩大CDV的宿主范围，给生物安全带来了严重隐患。因此建立能用于CDV分离与繁殖的敏感细胞系，在CDV的研究中具有重要意义。

在转染遗传物质到细胞基因组中的工作中，重组慢病毒载体是一个强大和有效地工具。慢病毒能作用于细胞周期的G0/G1期，同时具有嗜核性，所以可以感染分裂期细胞和非分裂期细胞，感染包括所有的哺乳动物细胞（神经元细胞、干细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞等）、干细胞和原代培养的细胞。慢病毒载体还具有转移基因片段容量大（9kb）、目的基因可整合至靶基因细胞组长期表达、免疫反应小等优点，所以获得了较广的应用范围。慢病毒载体也是RNAi表达的主要手段，同化学合成和酶切形成的siRNA相比具有几个优点：其一，可以携带GFP或荧光素酶等报告基因共表达，便于跟踪、选择和富集转染的细胞；其二，可以根据需要表达不同类型的小RNA分子（siRNA、shRNA或miRNA）；其三，具有较高的转染效率，使基因沉默维持较长时间。

本发明立足于CDV野毒株的分离及检测，采用慢病毒四质粒包装系统建立了用于分离CDV病毒株的敏感细胞系MDCK-CSL，为CDV野毒株的分离及其完整的生物学特性研究提供了技术平台，也为CDV感染进行早期诊断，防止CD感染蔓延，及制定CD防控策略提供了依据。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一株能够用于分离犬瘟热病毒株的敏感细胞系；

本发明的目的之二在于提供所述敏感细胞系在培养或分离犬瘟热病毒株中的应用。

本发明的目的是通过以下技术手段实现的：

本研究采用慢病毒四质粒包装系统，将犬源SLAM目的基因重组于转移载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro后，利用包装质粒pMDlg-pRRE，包膜蛋白表达质粒pMD2G，辅助基因质粒pRsv-REV，四质粒共同转染于293T细胞进行慢病毒的包装，经纯化浓缩后获得的病毒滴度为5.4×10⁸TU/ml。将包装后的慢病毒感染MDCK细胞，利用标志基因表达的绿色荧光蛋白（EGFP）及嘌呤霉素抗性，通过有限稀释法获得了一株表达犬源SLAM的犬瘟热病毒敏感细胞系。

本发明的一株犬瘟热病毒敏感细胞系，命名为MDCK-CSL，建议的分类命名为采用慢病毒重组构建的表达SLAM的MDCK细胞，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.5881，保藏日期为2012年3月6日。

利用间接免疫荧光及激光共聚焦技术对MDCK-CSL细胞系外源基因SLAM进行了定性及定位检测，在非嘌呤霉素压力维持下，该犬源SLAM外源基因至30代仍能在MDCK-CSL细胞膜上稳定表达。通过比较CDV标准株（Snyder Hill毒株）在MDCK-CSL和MDCK细胞上的繁殖情况，表明Snyder Hill标准毒株感染MDCK-CSL细胞系24h即可观察到细胞相互融合、圆缩、明显死亡等细胞病变；而感染MDCK细胞持续6d仅表现为细胞生长缓慢，未出现细胞病变。

因此，本发明又提出了所述的犬瘟热病毒敏感细胞系在培养或分离犬瘟热病毒中的应用。

其中，所述的犬瘟热病毒可以为犬瘟热病毒野毒株。

利用现有的RT-PCR方法，对Snyder Hill毒株在MDCK-CSL细胞进行连续传代CDV核酸检测验证，结果证实在MDCK-CSL细胞连续传代后第5代仍可检测到病毒核酸。利用免疫印迹法（Western blotting）对Snyder Hill毒株在MDCK细胞及MDCK-CSL细胞进行连续传代进行抗原检测，在MDCK-CSL细胞连续传至第5代后仍可检测到目的条带，证明该犬源SLAM在MDCK-CSL细胞中具有良好地生物学活性。

对送检CDV疑似临床病料，在RT-PCR诊断为阳性的基础上，利用本发明所建立的表达犬源SLAM的稳定细胞系，接种MDCK-CSL细胞系后24h即可观察到细胞相互融合、圆缩、明显死亡等特征性细胞病变；对送检CDV疑似临床病料进行连续传代，RT-PCR方法仍可检测到该病毒存在。

本发明的一种用于分离犬瘟热病毒野毒株的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）疑似犬瘟热病病料的采集及处理

采集疑似犬瘟热病毒感染的动物粪便及血液，将其混合物经磷酸缓冲液重悬混匀后，4℃离心，取上清经滤膜除菌后分装于-70℃备用；

（2）病毒在MDCK-CSL的增值

将本发明所述的犬瘟热病毒敏感细胞系MDCK-CSL培养至细胞生长至80%单层后，弃去培养基，经磷酸缓冲液清洗2遍后，将步骤（1）处理过的病料上清接种于MDCK-CSL细胞感作2h后，弃去上清后换维持液培养至80%病变后收获病毒；

（3）病毒RNA的提取及cDNA合成

病变的MDCK-CSL细胞反复冻融3次后经提取病毒RNA，进行cDNA合成；

（4）CDV疑似病料的RT-PCR鉴定及H基因的扩增、克隆

利用现有的RT-PCR方法鉴定该疑似病料，并利用合成的用于扩增CDV H基因的引物进行PCR扩增，产物克隆于pMD18-T中，进行酶切鉴定。

其中，优选的，所述的用于扩增CDV的RT-PCR鉴定引物为：

N1上游5’-GATCATAGACGACCCTGATG-3’

N1下游5’-GACCCTTCGTCTACAATTTTG-3’

扩增片段144bp，95℃预变性5min，94℃变性30s，55.5℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

其中，优选的，所述的用于扩增CDV H基因的引物为：

上游：5’-GGGGTACCGCCACCATGCTCTCTTACCAAGACAAG-3’

下游：5’-AAGCGGCCGCTACCATCAAGGTTTTGAAC-3’。

本研究立足于CDV野毒株的分离及检测，建立CDV敏感细胞系MDCK-CSL，为CDV野毒株的分离及其完整的生物学特性研究提供了技术平台，也为犬瘟热病的防控奠定了基础。

附图说明

图1为慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro图谱；

图2为慢病毒载体pRsv-REV图谱；

图3为慢病毒载体pMDlg-pRRE图谱；

图4为慢病毒载体pMD2G图谱；

图5为SLAM基因PCR扩增结果及转移载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro的酶切结果；

M:DL15000Marker；1:载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puroo经Smi I单酶切结果;2:目的基因SLAM PCR扩增结果；3:DL2000 Marker

图6为重组质粒的PCR鉴定结果；

M：DL2000Marker；1~8：阳性克隆

图7为重组质粒中目的片段插入方向的确定；

M：DL2000；1~8：经Bam HI酶切后的重组质粒

图8为重组质粒的酶切鉴定；

M 1000Marker;1-3:重组质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro-SLAM经EcoR I和Not I酶切鉴定

图9为包装完成后的慢病毒感染293T 20h后结果；

A（明场）和B（荧光）

图10为不同浓度的慢病毒感染293T细胞后48h的结果；

A（明场）和A1（荧光）0.01μL病毒感染293T细胞后48h；B（明场）和B1（荧光）0.1μL病毒感染293T细胞后48h；C（明场）和C1（荧光）1.0μL病毒感染293T细胞后48h；

图11为流式细胞检测结果；

图12为阳性细胞的筛选结果；

A：明场；B：荧光

图13为激光共聚焦分析结果；

A:为B、C及D图的叠加;B:表达绿色荧光蛋白的MDCK-CSL；C:抗SLAM抗体标记的MDCK-CSL；D:经H3325染色后的细胞核

图14为不同代次MDCK-CSL细胞SLAM基因的RT-PCR检测结果；

M:DL 2000Marker;1:MDCK细胞;2:第2代MDCK-CSL细胞;3:第5代MDCK-CSL细胞;4:第10代MDCK-CSL细胞;5:第15代MDCK-CSL细胞;6:第20代MDCK-CSL细胞;7:第25代MDCK-CSL细胞;8:第30代MDCK-CSL细胞。

图15为IFA检测SLAM在MDCK-CSL中的表达结果；

A（明场）MDCK-CSL细胞；A1（绿色荧光）MDCK-CSL细胞；A2（红色荧光）MDCK-CSL细胞；B（明场）MDCK细胞；B1（绿色荧光）MDCK细胞；B2（红色荧光）MDCK细胞

图16为SLAM在MDCK细胞中的生物活性检测结果；

A:MDCK-CSL细胞感染Snyder Hill毒株24h；A1:MDCK-CSL对照细胞；B:MDCK细胞感染Snyder Hill毒株6d；B1:MDCK对照细胞

图17为RT-PCR鉴定结果；

M:DL 2000Marker;1:第1代MDCK-CSL Snyder Hill细胞毒;2:第2代MDCK-CSL Snyder Hill细胞毒;3:第3代MDCK-CSL Snyder Hill细胞毒;4:第4代MDCK-CSL Snyder Hill细胞毒;5:第5代MDCK-CSL Snyder Hill细胞毒;6:阴性对照

图18为Western blot鉴定CDV在MDCK-CSL中的繁殖；

1:蛋白质分子质量标准；2：MDCK-CSL细胞；3：第四代MDCK-CSL细胞毒；4：第五代MDCK-CSL细胞毒；5：Snyder Hill标准毒株阳性对照

图19为分离毒株在MDCK和MDCK-CSL上的繁殖；

A:MDCK-CSL细胞感染野毒株24h；A1:MDCK-CSL感染后绿色荧光；B:MDCK细胞感染野毒株24h；B1:MDCK对照细胞

图20为分离毒株的RT-PCR检测结果；

M:DL2000Marker;1:CDV RT-PCR 2:阴性对照

图21为pMD18-T重组质粒的鉴定结果；

M1:DL2000Marker;M2:DL15000Marker;1:重组质粒EcoR Ⅰ酶切鉴定

图22为分离株与其他CDV疫苗株H基因同源性比较结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明具体实施例中涉及的材料及试剂

1、细胞与毒株

犬肾细胞(MDCK)、293T细胞购自中国科学院上海细胞生物库。pMD18-T克隆载体购自宝生物工程(大连)有限公司，pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro载体，慢病毒包装载体pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G，购自SBI公司。CDV标准毒株Snyder Hill，购自美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)，ATCC编号：VR-158TM。

2、常用生物学试剂

DMEM培养，标准胎牛血清，Ex Taq酶，DNA Marker DL2000，Ex Taq聚合酶，dNTP，Ribonuclease Inhibitor（40U/μL），M-MLV Reverse Transcriptase（200U/μL）均购自宝生物工程（大连）有限公司；Trizol购自Invitrogen公司；胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自Axygen公司；嘌呤霉素购自Sigma公司

3、主要仪器设备

台式低温高速离心机：Beckman Avanti30型；

超高速离心机：Beckman；

PCR循环仪：BIO-RADCYCLER；

CR21型高速立式离心机：日本日立（HITACHI）公司；

KADAK凝胶成像分析系统：ALPHA INNOTECH MULTILMAGE；

DHP-9162型恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；

电子天平：METTLER AE240；

核酸电泳仪：DYY-III-8B型；

791型磁力搅拌器：上海南汇电讯器材厂；

立式超低温保存箱：青岛海尔特种电器有限公司；

CENTRIFUGE 5810R型台式冷冻离心机：艾本德（EPPENDORF）公司；

生物安全柜：LABLONCO PURIRIER;

普通光学显微镜OLYMPUS CKX31型；

恒温水浴槽DK-80型购自上海精宏实验设备有限公司；

恒温培养摇床ZHWY-2102C购自上海智城分析仪器制造有限公司；

实施例1慢病毒介导表达犬源SLAM MDCK-CSL细胞系的建立

一、方法

1犬源SLAM重组慢病毒表达载体构建

1.1慢病毒表达载体信息

选择慢病毒转移质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro(SBI:CD513B-1)（Transfer Vector）为载体（载体图谱如图1所示）。将犬源SLAM目的基因构建到该载体后同包装质粒及包膜质粒共转293T细胞包装出慢病毒颗粒。

1.2pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro-SLAM载体构建

1)pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro载体酶切：

pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro使用Saw I进行酶切，酶切反应体系：

充分混匀后置37℃水浴4h，1%琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。

2)载体去磷：

将1)中酶切获得的载体片段做载体去磷：

(1)37℃反应25min

(2)65℃反应15min

3)pMD18-T-SLAM重组载体的构建

参考GenBank提交的AF325357序列，采用Oligo 6.0软件设计一对特异性引物SLAM-F/SLAM-R，目的片段大小1083bp，由上海生物工程公司合成。引物序列如下：

SL AM-F：5’-GCCGCCACCATGGATTCCAGGGGCTT-3’；(Kozark sequence)

SLAM-R：5’-TCAGCTCTCTGGGAACGTCA-3’。

组织中mRNA的提取参照TRIzol LS Reagent的说明书，具体操作步骤如下：取犬淋巴组织80mg，加入100μL TRIzol，剪碎混匀后，加入1mL的TRIzol裂解液，上下颠倒10次混匀，室温静置10min充分裂解(此时可放入-70℃长期保存)。12000rpm离心5min，尽弃沉淀。加入200μL氯仿，盖紧EP管盖，温和混匀，室温放置15min。4℃ 12000rpm离心15min后，小心吸取上层水相RNA层，至另一EP管中(约600μL)，加入500μL的异丙醇，混匀后室温放置10min。4℃ 12000rpm离心10min，可见RNA呈透明或偏白色沉于管底。弃上清，加入1mL用RNase-free的DEPC水现用现配的75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。4℃ 11000rpm离心10min，尽弃上清。室温干燥5~10min。用10μLDEPC水55℃ 5min溶解RNA。紫外分光光度计定量RNA的浓度及纯度，立即反转录或-70℃保存。

RT：参照invitrogen First-Strand cDNA Synthesis Using SuperScript^TM Ⅱ ReverseTranscriptase使用说明书进行，具体操作如下：

20μL反转录体系：

充分混合后，于65℃水浴5min后，迅速冰浴1min，瞬离后，再在反应体系中加入：

5×First-Strand Buffer                 4μL

0.1M DTT                               2μL

RNaseOUT^TM RT Inhibitor（40U/μL）     1μL

温和混匀后，于25℃水浴2min后，加入1μL SuperScript^TM Ⅱ ReverseTranscriptase（200U）。然后于25℃水浴10min，42℃水浴50min。70℃ 15min灭活。所得的cDNA模板用于PCR扩增反应。

PCR：参照PrimeSTAR^TM DNA polymerase使用说明书的比例加入各成分。

50μL PCR反应体系：

PCR反应参数为94℃预变性5min，94℃变性30s，61.1℃退火30s，72℃延伸100s，共30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。取5μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小正确后，剩余部分经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下切取目的片段，按华舜小量胶回收试剂盒说明书进行目的片段的回收。

将回收后的目的片段与pMD-18-T载体连接。反应体系（10μL）为：目的片段4.5μL；pMD18-T Vector 0.5μL；2×Ligation Buffer 5μL，16℃连接1h。连接产物转化E.coli TG1感受态细胞，进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落，接种于5mL含（Amp⁺）/LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。使用上海华舜生物工程有限公司的质粒提取试剂盒提取过夜增菌培养物中的质粒，将提取的质粒用EcoR I（pMD18-T中酶切位点）进行酶切鉴定，酶切反应体系为20μL：

加入以上成分后离心混匀，37℃作用2h，酶切产物1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。将3个酶切鉴定确定为阳性的质粒送Invitrogen公司测序，将测序结果与Genbank中的序列进行比较分析。

4)pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro-SLAM载体构建

SLAM-F:5’-GCCGCCACCATGGATTCCAGGGGCTT-3’

SLAM-R:5’-TCAGCTCTCTGGGAACGTCA-3’

PCR反应体系：

PCR反应程序：

5)电泳鉴定：将pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro载体酶切产物和PCR产物加样到1％的琼脂糖胶。

6)胶回收：pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro载体酶切产物及SLAM的PCR产物做胶回收，实验步骤按胶回收试剂盒说明进行。

7)连接反应：将PCR产物及pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro载体酶切产物按下列反应体系进行连接反应。

连接体系：

pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP

以上体系在16℃连接仪连接过夜后，准备转化。

8)感受态细胞E.coli DH5α的制备

(1)从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3~5ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1:100~1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20~30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养；

(2)每组取培养液3个2ml转入2ml离心管中，在冰上冷却20~30min，于4℃，4000r/min离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；

(3)倒净上清培养液，用1ml冰冷的0.1mol/L CaCl₂溶液轻轻悬浮细胞，冰浴；

(4)0～4℃，4000r/min离心10min；

(5)弃去上清液，加入500μL冰冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，小心悬浮细胞。0~4℃，4000r/min离心10min；

(6)弃去上清液，加入100μL冰冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；

(7)制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。

9)转化：将10μL连接产物转化于E.coli DH5α感受态细胞，接种于含（Amp⁺）/Lb固体培养基，37℃培养过夜。挑取平板培养基上菌落后于5ml含有（Amp⁺）的液体LB培养基37℃振荡培养12h后做菌液PCR，对相应阳性克隆的质粒提取。对所提取的阳性质粒分别进行相应的酶切鉴定。

10)质粒的提取:

(1)过夜培养的5ml菌液用2ml做甘油菌保，剩余3ml分两次于一个1.5ml离心管中12,000×g离心1min，彻底去除上清；

(2)加入250μLBuffer S1，振荡器充分重悬细菌；

(3)加入250μL Buffer S2，颠倒混匀4～6次；注意：不能剧烈混合，否则会出现基因组DNA污染；

(4)加入250μL Buffer S2五min内加入350μL Solution III，轻轻颠倒混匀6～8次；

(5)12000g，离心10min；将上清转移到Miniprep柱中，Miniprep柱插于废液收集管中，12000g离心1min；注意：不要吸到沉淀，否则会出现基因组DNA和蛋白质污染；

(6)弃收集管中的废液，将Miniprep柱插于收集管中，加700μl Buffer W2到Miniprep柱中，12000g离心1min；重复该步骤一遍；

(7)弃收集管中的废液，将Miniprep柱放入同一支收集管中，12000×g离心1min彻底去除Buffer W2；

(8)将Miniprep柱放入新的干净的1.5ml离心管中，加50μL Eluent，室温放置1min后，12,000g离心1min；离心管中的溶液即为所抽提的质粒；37℃ 2h

11)重组质粒鉴定：

(1)对重组质粒进行PCR鉴定

PCR鉴定引物：

SLAM-F：5’-GCCGCCACCATGGATTCCAGGGGCTT-3’

SLAM-R：5’-TCAGCTCTCTGGGAACGTCA-3’

(2)对重组质粒进行酶切鉴定

pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro-SLAM载体使用EcoR I和Not I进行酶切鉴定。

酶切反应体系：

反应条件如下：37℃，4h；

(3)重组质粒中所插入目的片段方向鉴定

分析慢病毒载体和SLAM基因序列318bp的位置的Bam HI酶切位点，反方向连入应切下318bp条带正方向连入应切下712bp的条带。

酶切反应体系:

12)测序：

将pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro-SLAM的2和3号克隆送上海英俊公司基因测序。

2慢病毒四质粒系统的包装

2.1四质粒系统基本信息和图谱

该慢病毒四质粒包装系统均购自于SBI公司

该慢病毒四质粒包装系统包括四种载体，分别为pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro、pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G，载体图谱为别依次为图1-4所示。

2.2慢病毒生产实验步骤

1)细胞接种：慢病毒包装细胞转染用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，重新接种于10cm²细胞培养皿（每个平皿接种细胞约为2~2.5×10⁶），37℃，5%CO₂培养箱内培养；

2)质粒和转染试剂的准备：制备慢病毒包装系统中四种质粒DNA溶液；加入无菌水定容至1800μL,再加入CaCl₂（2.5mol/L）溶液200μL混匀，加入2×BBS缓冲盐溶液2000μL，室温放置20~25min；

3)质粒转染：当细胞密度达60%~70%时转染.将各质粒和磷酸钙混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀，培养6~8h后弃去含有转染混和物的培养液，加入PBS 15ml，轻摇后弃去，重复该步骤3次；

4)更换培养基：每瓶细胞中加入含10%胎牛血清的细胞培养液6ml，继续培养48h；

5)收集病毒上清：收集转染后84h的293T细胞上清液；

6)病毒上清液离心、过滤：将收集的上清液于4℃，4000g离心10min，收集离心后的上清液；将上清液以0.45μm滤器过滤；

7)超速离心：于40ml超速离心管中，4℃，25000rpm/min离心2h；而后以预冷PBS或者500μL DMEM重旋病毒沉淀于4℃溶解过夜。

3慢病毒病毒滴度的测定

3.1预期滴度感染实验

分别取0.01μL，0.1μL及1.0μL体积的慢病毒感染细胞浓度为1×10⁵/孔的293T细胞，48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光表达量

3.2使用逐孔稀释滴度测定法实验步骤：

1)测定前一天，为测定滴度所需的293T细胞铺板，每个96孔中加1×10⁵个细胞，体积为100μL。根据病毒的预期滴度，准备7~10个无菌的Ep管。

2)在每个管中加入90μL的新鲜培养基。取待测定的病毒原液10μL加入到第一个管中，混匀后，取10μL加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。

3)选取所需的细胞孔，吸去90μL培养基。加入稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养。

4)24h后，加入新鲜培养基100μL。小心操作，不要吹起细胞。4天后，观察细胞生长状况，滴度检测用的细胞密度和状态比较接近，待每孔中细胞不少于10⁵细胞即可。

4嘌呤霉素对MDCK细胞的最低致死浓度

将嘌呤霉素按终浓度为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL。分别接种细胞融合率为80%的MDCK单层细胞。每个浓度4个重复，持续培养7天，选择能使MDCK细胞全部死亡的最低浓度为最小致死量（minimum lethal dose,MLD）。

5、慢病毒感染MDCK细胞MOI值的确定及阳性细胞株的筛选

5.1慢病毒感染MDCK细胞MOI值的确定

用24孔细胞培养板，进行MDCK细胞和293T细胞的感染预实验，实验前按照MOI分别为1、5、10、20、40、80、100设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。

1)第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5×10⁴个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。

2)第二天，准备病毒：将病毒滴度为5.4×10⁸TU/mL的慢病毒对照组按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，但是当MOI高于20时，在培养基中加入ploybrene（8μg/ml左右）来提高以期获得最佳的感染效率。

3)感染目的细胞：

(1)使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基；

(2)吸去培养基的培养器皿中的培养基；

(3)在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液；

(4)混匀后放于二氧化碳培养箱（37℃、5% CO₂）孵育过夜；

3)第四天，补充一定量的培养液，保持细胞生长状态良好；

4)第六天，感染效率检测：在倒置荧光显微镜观察荧光，估计慢病毒感染MDCK的效率；

5.2阳性细胞株（MDCK-CSL）的筛选

1)按照感染预实验所确定的MOI值，用含2% FBS的DMEM培养液稀释慢病毒原液后分别接种于生长50%单层的MDCK细胞。同时，每孔加入终浓度为6μg/ml的聚凝胺（Polybrene），于37℃5%的CO₂培养箱培养。

2)培养48h后，弃掉旧培养液，更换10%FBS的DMEM培养液，同时加终浓度为5μg/ml的嘌呤霉素进行筛选。

3)待细胞长满后，一传二，继续用终浓度为5μg/ml的嘌呤霉素筛选并继续传代，至视野下80%为抗性细胞为止。

4)采用有限稀释法，筛选阳性细胞株。

6外源基因犬源SLAM在MDCK-CSL上的定位

1)MDCK-CSL细胞培养48h，细胞生长至单层，弃掉培养液，用4℃预冷的0.01M PBS清洗细胞两次，5min/次。

2)加入预冷4%多聚甲醛固定液，室温避光作用15min后，弃去固定液后再用PBS室温清洗细胞两次，5min/次。

3)按1:50稀释小鼠抗SLAM多抗血清，37℃水浴作用50min，PBS洗涤3次，5min/次。按1：200稀释DyLight 594标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1h后0.01M PBS清洗3次，10min/次。于荧光显微镜下观察结果。

4)最后加入1:10稀释的Hoechst 33258核染试剂室温避光作用10min，0.01MPBS清洗3次，10min/次。进行IFA分析后，于激光共聚焦显微镜下观察结果。

7、MDCK-CSL细胞系功能性检测

7.1CDV在MDCK-CSL细胞上培养特性

待24孔板培养的MDCK-CSL与MDCK生长至80%后，弃旧培养液后用0.01M PBS清洗2遍后，将已知参考毒株Snyder Hill以200 TCID50/孔分别接种于24孔板。37℃感作2h后，弃尽上清，每孔加入500μL含2% FBS的细胞维持液，同时设未接毒的MDCK-CSL及正常MDCK做对照，观察细胞病变。

7.2CDV在MDCK-CSL细胞上的传代检测

Snyder Hill在MDCK-CSL连续传代后，观察病变，取细胞毒采用现有的RT-PCR检测方法进行核酸鉴定。对MDCK-CSL第4、5代细胞毒采用免疫印迹技术（Western blotting）进行CDV蛋白检测。

1.弃培养基，用1×PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基，并以4:1的比例加入5×SDS上样缓冲液，然后样品煮沸10min。

2.电泳分离：上样40μL至SDS-PAGE胶电泳。

3.转膜：将PVDF膜放置甲醇浸泡3~5s,然后将PVDF膜、胶及滤纸侵于转移缓冲液中平衡10min。按照三层滤纸、PVDF膜、胶、三层滤纸（从下往上的顺序）将其装好后于2mA，1V，转膜3.5h时后取出杂胶膜

4.用25ml TBS洗膜5min，室温，摇动。

5.置膜与25ml 5%脱脂乳封闭缓冲液中37℃，1h，摇动。

6.15ml TBS/次洗3次（5min/次）

7.加入稀释度为1:5000CDV H蛋白单抗为一抗，37℃孵育1h，缓慢摇动。

8.15ml TBS/次洗3次（5min/次）

9.加入1:5000稀释度的辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗，37℃孵育1h，缓慢摇动。

10.15ml TBS/次洗3次（5min/次）。

11.DAB显色

二、结果

1、重组慢病毒表达载体的构建及鉴定

1.1重组慢病毒表达载体的构建及鉴定

将慢病毒转移载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro经Saw I进行单酶切，通过与目的片段以平末端相连的方式进行连接；以已构建犬源pMD18-T-SLAM重组质粒为模板，扩增出用于与慢病毒表达载体相连的目的片段（图5所示）。

1.1.1重组慢病毒表达质粒鉴定

(1)对菌液进行PCR鉴定，如图6所示

(2)目的片段连接方向鉴定

分析慢病毒载体和SLAM基因序列318bp位置的Bam HI酶切位点，反方向连入应切下318bp条带正方向连入应切下712bp的条带，酶切结果表明2号/3号/8号/是正确的方向插入的克隆（图7所示）。

(3)重组载体的酶切鉴定：对方向正确的三组载体使用EcoR I和Not I再次进行酶切鉴定，结果正确（图8）。

2、重组慢病毒滴度的测定

2.1慢病毒包装鉴定

将包装好的慢病毒感染293T细胞20h后，通过利用荧光显微镜下观察绿色荧光的表达，证明该慢病毒包装成功，结果理想（图9）。

2.2滴度检测结果

对包装后的慢病毒经纯化后，取不同剂量感染293T细胞后，经流式细胞仪检测细胞数（图10）。A图为0.01μL病毒感染293T后48h。B图为0.1μL病毒感染293T后48h。C图为1.0μL病毒感染293T后48h。尽量控制滴度检测用的细胞密度和状态比较接近，在24孔体系中控制会有一定的难度，而滴度检测只需要保证每孔中细胞不少于10⁵ Cells即可，按照10⁵ Cells来计算病毒滴度，如果细胞量大于10⁵ Cells病毒滴度会被低估。由此通过不同体积病毒感染293T细胞后，最终确定取0.1μL病毒感染293T细胞后上流式细胞仪检测阳性细胞数量。

慢病毒滴度检测结果如图11所示。

根据流式细胞仪检测结果计算滴度公式：

Titer(293T-transducing units/ml)=100000(target cells)×(% of RFP-positivecells/100)/volume of supernatant(in ml).

本次病毒制备的滴度:

SLAM慢病毒滴度为：5.4×10⁸TU/ml

3、嘌呤霉素对正常MDCK的最低致死浓度

将嘌呤霉素按终浓度为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL。分别接种细胞融合率为80%的MDCK单层细胞。每个浓度4个重复，持续培养7天，后发现当嘌呤霉素的浓度为5μg/ml时MDCK细胞全部死亡。故在细胞筛选中嘌呤霉素的使用浓度为5μg/ml（表1）。

表1嘌呤霉素对正常MDCK细胞最低致死浓度

++++:细胞100%死亡+++:细胞80%死亡++:细胞20%死亡+：细胞5%死亡

4、重组慢病毒感染MDCK时MOI值的确定及阳性细胞株的筛选

4.1慢病毒感染MDCK细胞MOI的确定

以MOI=1时的293T(此时细胞的感染达到80%)为对照，根据所设立的不同MOI值与其比对，经观察当与293T细胞感染达到80%时确定其MOI值为20。但当MOI值继续升高从40至100的三组中，虽然阳性率随着MOI的升高而逐渐扩大，但在实验的后续几天观察到，阳性MDCK细胞出现大量死亡及大面积细胞融合现象发生，其细胞形态及状态与MOI值为20实验组相比区别很大（表2）。

表2MDCK细胞感染复数的确定

4.2阳性细胞株的筛选

通过嘌呤霉素连续五代加压筛选及有限稀释法获得阳性细胞，通过荧光显微镜观察每个细胞均有绿色荧光。结果如图12所示，图A为明场下观察，图B为荧光下观察，结果理想。

其中筛选得到一株能够表达犬源SLAM蛋白的MDCK稳定细胞系，命名为MDCK-CSL，建议的分类命名为采用慢病毒重组构建的表达SLAM的MDCK细胞，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.5881，保藏日期为2012年3月6日。

5、犬源SLAM目的基因在MDCK-CSL上的定位

利用激光共聚焦技术观察，结果如图13所示，图B为MDCK-CSL中表达的EGPF为绿色；图C为DyLight 594标记的羊抗鼠IgG为红色；图D，MDCK-CSL细胞核经核染试剂作用后为蓝色。A图为图B、C、D的叠加。通过三组图的叠加可以证实，该外源基因犬源SLAM在MDCK-CSL细胞膜上表达。

6、对不同代次MDCK-CSL细胞SLAM基因的RT-PCR检测

对外源基因SLAM在RNA水平稳定性的检测，分别选取第2代，第5代，第10代，第15代，第20代，第25代及第30代等不同代次MDCK-CSL细胞，平行提取总RNA反转录后进行PCR检测，同时设立正常MDCK细胞作为阴性对照。结果见图14，图中2~8泳道分别为MDCK-CSL第2、5、10、15、20、25、30代细胞，1泳道为阴性对照。实验证明，MDCK-CSL细胞在非嘌呤霉素抗性培养环境中传至第30代后仍能保持外源基因SLAM在RNA水平的稳定转录。

7、SLAM蛋白在MDCK-CSL细胞中连续传代后表达鉴定

利用间接免疫荧光法鉴定SALM蛋白在MDCK-CSL细胞中传至第30代后表达情况，一抗为小鼠抗SLAM蛋白多克隆血清，二抗为DyLight 594标记的羊抗鼠IgG。荧光显微镜下观察，可以看到MDCK-CSL细胞与抗SLAM蛋白多克隆血清发生特异性反应（图15）图A为明场中第30代MDCK-CSL细胞，图A1为第30代MDCK-CSL细胞自身EGFP的表达，图A2为红色DyLight 594标记羊抗鼠IgG荧光二抗的红色荧光，说明其与鼠抗SLAM多抗发生特异性结合后细胞呈红色。图B为明场中正常MDCK细胞，图B1为荧光下正常MDCK细胞，因未表达EGFP而成黑色，图B2为荧光下正常MDCK细胞未与鼠抗SLAM多抗发生特异性结合而无红色荧光。结果进一步证明SLAM在MDCK-CSL细胞传至第30代仍获得稳定表达。

8、MDCK-CSL细胞系功能性检测

8.1CDV在MDCK-CSL上培养特性

将Snyder Hill以200TCID50/孔分别接种MDCK-CSL和MDCK单层细胞。经24h后观察到正常的MDCK细胞仅表现为生长缓慢，而MDCK-CSL细胞已出现大量死亡及拉网的现象，细胞发生融合现象，并出现圆缩等典型的CPE变化。而正常的MDCK在接种3d后仅观察到生长缓慢，且无CPE变化（图16）。

8.2CDV在MDCK-CSL上生长能力试验

1）病毒核酸检测验证：

Snyder Hill在MDCK-CSL连续传代至第五代后，取第1至5代细胞毒进行RT-PCR鉴定（图17）。结果显示，MDCK-CSL在第五代仍能检测到CDV。

2）病毒蛋白检测验证

通过核酸检测验证后证明CDV在MDCK-CSL细胞第4、5代仍能检测到病毒核酸，为了进一步证明CDV在MDCK-CSL中具有繁殖能力。故对其利用免疫印迹技术再次对第4、5代接毒MDCK-CSL细胞进行CDV蛋白检测，结果如图18所示。结果证实，第4、5代接毒MDCK-CSL细胞能够检测出CDV蛋白，进一步肯定了CDV在MDCK-CSL细胞上的繁殖。证明了该MDCK-CSL细胞系的功能性成立。

实施例2CDV敏感细胞系的应用

2.1疑似CD病料的采集及处理

从某宠物医院临床表现为眼鼻浓样分泌物、体温高达40℃以上、呕吐、腹泻等症状的疑似犬瘟热感染病犬中，采集粪便及血液。胶体金检测结果，PCR检测结果均为阳性。CAV、CPV检测结果为阴性。将其混合物经pH 7.4PBS重悬混匀后，4℃6000rpm离心20min后，取上清经0.45μM滤膜除菌后分装于-70℃备用。

2.2病毒在MDCK-CSL的增值

MDCK-CSL细胞系培养至细胞生长至80%单层后，弃去培养基经pH 7.4PBS清洗2遍后，将处理过的病料上清接种于MDCK-CSL细胞感作2h后，弃去上清后换维持液于37℃，5% CO₂培养箱培养至80%病变后收获病毒。

2.3病毒RNA的提取及cDNA合成

病变的MDCK-CSL细胞反复冻融3次后经QIAamp Viral RNA Kit提取试剂盒提取病毒RNA，具体操作方法参照说明书进行。并按照反转录试剂盒操作说明书进行cDNA合成。

2.4CDV疑似病料的RT-PCR鉴定及H基因的扩增、克隆

利用现有的用于检测CDV RT-PCR方法鉴定该疑似病料，用于扩增CDV的RT-PCR鉴定引物为：

N1上游5’-GATCATAGACGACCCTGATG-3’

N1下游5’-GACCCTTCGTCTACAATTTTG-3’

扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，55.5℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

利用本发明已经设计并合成的CDV H基因扩增引物进行H基因的扩增：

上游：5’-GGGGTACCGCCACCATGCTCTCTTACCAAGACAAG-3

下游：5’-AAGCGGCCGCTACCATCAAGGTTTTGAAC-3’

将扩增得到的片段克隆于pMD18-T中，进行酶切鉴定。

2.5结果

2.5.1病毒在MDCK-CSL细胞系上的繁殖

处理过的疑似病料上清接种于单层MDCK-CSL细胞，12h后出现细胞相互融合、圆缩、死亡等明显的细胞病变效应（CPE）。24h后MDCK-CSL细胞大量脱落，细胞崩解产生大量的细胞碎片及细胞拉网现象，出现典型的细胞融合现象（图19）。而正常的MDCK在接毒24h后仍未见任何变化，进一步证明了该所建细胞系的功能性及其敏感性。

2.5.2疑似病料的RT-PCR鉴别检测及H基因序列扩增

将细胞培养物提取病毒RNA后反转录成cDNA，进行CDV RT-PCR的鉴别检测，扩增片段144bp（图20所示），结果判定为阳性。确定该分离毒株为野毒株。引物扩增其H基因后，克隆于pMD18-T中得到重组质粒，重组质粒经酶切鉴定获得约1800bp与2700bp两个片段，大小与预期结果一致。pMD18-T重组质粒的酶切鉴定结果如图21所示。

2.5.3XQ分离株H基因序列分析

对所选已知参考毒株进行核苷酸分子进化分析，确定该分离株的基因亚型为Asia-Ⅰ型，命名为XQ。与Vaccine型进行核苷酸同源性分析见图22。结果显示分离株XQ与Onderstepoort,CDV3,Convac,Lederle等疫苗株的核苷酸序列同源率在90.2-91.4%之间。

Claims (6)

1.一株犬瘟热病毒敏感细胞系，命名为MDCK-CSL，其特征在于所述的细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.5881，保藏日期为2012年3月6日。

2.权利要求1所述的犬瘟热病毒敏感细胞系在培养或分离犬瘟热病毒中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的犬瘟热病毒为犬瘟热病毒野毒株。

4.一种用于分离犬瘟热病毒野毒株的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）疑似犬瘟热病病料的采集及处理

采集疑似犬瘟热病毒感染的动物粪便及血液，将其混合物经磷酸缓冲液重悬混匀后，4℃离心，取上清经滤膜除菌后分装于-70℃备用；

（2）病毒在MDCK-CSL的增值

权利要求1所述的犬瘟热病毒敏感细胞系MDCK-CSL培养至细胞生长至80%单层后，弃去培养基经磷酸缓冲液清洗2遍后，将步骤（1）处理过的病料上清接种于MDCK-CSL细胞感作2h后，弃去上清后换维持液培养至80%病变后收获病毒；

（3）病毒RNA的提取及cDNA合成

病变的MDCK-CSL细胞反复冻融3次后经提取病毒RNA，进行cDNA合成；

（4）CDV疑似病料的RT-PCR鉴定及H基因的扩增、克隆

利用现有的RT-PCR方法鉴定该疑似病料，并利用合成的用于扩增CDV H基因的引物进行PCR扩增，产物克隆于pMD18-T中，进行酶切鉴定。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤（4）中用于CDV疑似病料的RT-PCR鉴定的引物为：

N 1上游5’-GATCATAGACGACCCTGATG-3’

N 1下游5’-GACCCTTCGTCTACAATTTTG-3’。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤（4）中用于扩增CDV H基因的引物为：

上游：5’-GGGGTACCGCCACCATGCTCTCTTACCAAGACAAG-3

下游：5’-AAGCGGCCGCTACCATCAAGGTTTTGAAC-3’。

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