CN109628490A

CN109628490A - 一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒

Info

Publication number: CN109628490A
Application number: CN201910076621.0A
Authority: CN
Inventors: 黄娟; 单虎; 杨雅明
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2019-01-26
Filing date: 2019-01-26
Publication date: 2019-04-16

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，具体的，本发明公开了一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，由AAV2/9‑N‑shRNA3质粒和辅助质粒共转染AAV‑293细胞后得到shRNA重组腺相关病毒；所述干扰片段序列的Top strand如SEQ ID NO.7所示，bottom strand如SEQ ID NO.8所示；所述AAV2/9‑N‑shRNA3质粒，由经BamHI和EcoRI双酶切的pHBAAV‑U6‑CMV‑ZsGreen载体与干扰片段基因连接、转化后构建而成，并研究AAV2/9‑N‑shRNA3对预防犬瘟热的效果。

Description

一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒。

背景技术

犬瘟热(Canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。据报道，43个国家、272种不同的动物可以通过自然途径或者试验感染犬瘟热病毒。在自然条件下，犬瘟热病毒能够使犬科(狗、狐狸、豺、狼)、鼬科(鼬鼠、雪貂、水貂、水獭等)、浣熊科(浣熊、熊猫)、猫科动物(如狮子、东北虎、远东豹)等多科动物以及海狮和猴发生感染。敏感动物感染犬瘟热病毒后，典型症状是双相热，并出现抽搐、口吐白沫等神经症状和不同程度的胃肠炎、卡他性肺炎。在自然条件下，犬瘟热病毒通过上呼吸道和飞沫传播，发病率几乎达100％。其高发病率、高死亡率的流行特点对毛皮动物养殖业、珍稀动物及野生动物保护都造成了巨大损失。尤其是犬瘟热病毒可以感染灵长类动物，给人们以警示，犬瘟热病毒有可能发展成为能感染人的新病毒。

弱毒疫苗被广泛应用于预防犬和其它动物犬瘟热，然而，但被免疫动物不能得到完全保护，许多国家均有免疫群体暴发犬瘟热的报道，而且弱毒苗的使用，会在临床上带来散毒风险以及毒力返强的风险，临床上也不能通过抗体检测来鉴别野毒感染和疫苗免疫。因此，临床上亟需一种新型、安全、有效的生物制剂来预防犬瘟热。RNA干扰(RNAinterfernce，RNAi)的功能性中间分子—小干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)可引导一种内切酶复合物剪切有同源序列的靶mRNA，导致mRNA降解，从而引起转录后基因沉默机制，干扰基因表达。该技术能对抗病毒所表达mRNA等外源基因的侵害，尤其是以病毒载体表达发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)，具有特异、高效和持久的特点。腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，是微小病毒科依赖病毒属，病毒颗粒大小约为20～26nm，完整的生活周期需要辅助病毒(通常为腺病毒或疱疹病毒)参与，接种动物后一过性感染，不会在动物体内复制，不会污染环境，没有潜在散毒危险，而且迄今从未发现野生型AAV对人体致病，重组AAV基因组序列上去除了大部分的野生型AAV基因组元件，进一步保证了安全性；AAV有多种血清型，不同血清型对不同组织的亲和力不同，适用于各种体内感染实验，能介导基因的长期稳定表达(可达半年以上)，具有表达时效长的优点，因此构建CDV shRNA腺相关病毒，用来预防犬瘟热，可以解决现阶段弱毒疫苗存在的安全性问题。

发明内容

本发明通过重组腺相关病毒技术，构建shRNA重组腺相关病毒，来预防犬瘟热，解决现阶段弱毒疫苗存在的安全性问题。

本发明提供了一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，由AAV2/9-N-shRNA3质粒和过表达质粒、干扰质粒共转染AAV-293细胞后得到shRNA重组腺相关病毒；

其中，所述AAV2/9-N-shRNA3质粒是将干扰片段重组至pHBAAV-U6-CMV-ZsGreen载体得到的，所述干扰片段的序列的Top strand如SEQ ID NO.7所示，bottom strand如SEQID NO.8所示；

所述过表达质粒、干扰质粒分别为为pAAV-RC9质粒和pHelper质粒。

优选地，上述pHBAAV-U6-CMV-ZsGreen载体经BamHI和EcoRI双酶切后，与干扰片段基因连接后得到所述AAV2/9-N-shRNA3质粒。

本发明提供上述AAV2/9-N-shRNA3质粒的构建方法，包括如下步骤：

S1.人工合成干扰序列shRNA3：

Top strand：

gatccgccagtgaagagagttctcctgtctattcaagagatagacaggagaactctcttcactggttttttc

bottom strand：

aattgaaaaaaccagtgaagagagttctcctgtctatctcttgaatagacaggagaactctcttcactggcg

S2.将单链的引物退火成双链oligo序列，退火程序：95℃ 10min，75℃10min，55℃10min，35℃ 10min，15℃ 10min；

S3.用限制性内切酶BamHI和EcoRI对载体pHBAAV-U6-CMV-ZsGreen进行酶切，酶切完成后，胶回收；

S4.将S2得到的的退火产物和S3经过酶切的载体进行连接得到连接产物，即可得到AAV2/9-N-shRNA3质粒，转化至感受态细胞，备用。

优选地，S4中的连接反应体系(20uL)如下：退火产物1μl，酶切好的载体100-200ng，ligase buffer 2μl，T4ligase 1μl，H₂O补齐至20μl，以上连接反应体系在16℃过夜。

优选地，其特征在于，S4中的转化步骤包括：将连接产物以Cacl₂方法转化加入感受态细胞，于Amp抗性平板，37℃条件下培养过夜，得到转化后的NshRNA3；转化后的NshRNA3平板挑菌，于37℃条件下、250转/分钟，摇菌14小时，挑取阳性克隆子，保存备用。

优选地，其特征在于，所述感受态细胞为大肠杆菌菌株stbl3感受态细胞。

优选地，所述转染的反应体系如下:转染100mm平皿所需的转染复合物成分如下：10μL过表达质粒+20μLpHelper质粒+10μL AAV2/9-N-shRNA3+150μL转染试剂。

优选地，转染AAV-293细胞的转染试剂为Lipo转染试剂。

本发明的有益效果为：本发明通过重组腺相关病毒技术，构建shRNA重组腺相关病毒，用来预防犬瘟热，可以解决现阶段弱毒疫苗存在的安全性问题。

附图说明

图1为N shRNA3测序峰图。

图2为QPCR检测靶基因表达量示意图。

图3为WB结果示意图。

图4为灰度扫描结果示意图。

图5为标准曲线示意图。

具体实施方式

下面结合附图1-5以及具体实施例对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的方法，通常按照常规条件操作，未注明的材料来源均为市售，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。

一、AAV2/9-N-shRNA3质粒的构建及鉴定

S1.干扰片段序列设计

人工合成上述干扰序列shRNA3(生工生物工程股份有限公司(上海))。

S2.引物退火形成带粘性末端的双链片段

引物是由上海生工合成PAGE胶纯化的oligo序列，分别稀释至100μM，将单链的引物退火成双链oligo序列，退火程序：95℃ 10min，75℃ 10min，55℃10min，35℃ 10min，15℃ 10min。

S3.线性化载体的制备

用限制性内切酶对载体pHBAAV-U6-CMV-ZsGreen进行酶切，酶切体系(20μl)如下:

表1

37℃温浴1～3小时酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。

S4.干扰片段连接入载体

连接反应体系(20μl)如下：

表2

以上连接液在16℃过夜。

二、转化、测序与质粒提取

将连接产物以Cacl2法转化DH5a感受态细胞，转化后的N shRNA平板挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，将菌液送测序，测序引物为载体上U6通用引物，经测序验证正确的阳性克隆，进行质粒小提。

三、共转染实验

分组(NC、sh1、sh2、sh3)转染293T细胞，转染试剂是脂质体，每个孔5ul(质粒/转染试剂＝1：1.25)质粒用量是：NC组：过表达质粒2ug+干扰对照质粒2ug；sh1组：过表达质粒2ug+sh1干扰质粒2ug；sh2组：过表达质粒2ug+sh2干扰质粒2ug；sh3组：过表达质粒2ug+sh3干扰质粒2ug。转染48h于6孔板中收细胞做QPCR检测，转染72h于6孔板中收细胞做WB检测。

四、腺相关病毒包装

1.质粒扩增

构建好的慢病毒载体和辅助质粒进行大量抽提，浓度大于1μg/μL，A260/280在1.7～1.8之间可用于病毒包装。

2.包装细胞株AAV-293细胞的培养

培养条件为DMEM+10％FBS，37℃，5％CO2，相对湿度95％。随着传代次数的增加，AAV-293细胞会出现生长状态不佳等情况。为了防止此类现象的出现，我们需要对低代次细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

3.病毒包装

第一天：将AAV-293细胞传代到100mm平皿中用于转染，操作完毕后置于37℃，5％CO2，95％相对湿度的培养箱中。

第三天：转染

(1)细胞观察：确认细胞密度达到约80～90％的汇合率即可进行转染。

(2)脂质体转染：Opti-MEM需在37℃水浴中预热。

转染100mm平皿所需的转染复合物成分如下：

(3)换液：转染后6h更换含10％胎牛血清FBS的新鲜完全培养基。

(4)细胞收集：转染后72h，将含AAV颗粒的细胞用细胞刮轻轻刮下，收集于15mL离心管中，150×g离心3min收集细胞，去除培养上清，用PBS洗一次，最后再用300μL PBS重悬细胞。

(5)细胞破碎：准备37℃恒温水浴锅和液氮，将装有细胞的离心管在液氮及37℃水浴反复冻融三次。4℃，2000×g，5min，去除细胞碎片，收集含AAV颗粒的裂解上清。

病毒纯化

(1)全能核酸酶处理：每1mL病毒粗提物中加入0.1μL Benonase酶，37℃水浴1h，除去病毒液中的细胞基因组及残留的质粒DNA。600×g，4℃，离心10min，取上清。

(2)柱纯化：

取出上步得到的上清液，加入PBS将体积补足4mL，用0.45μM滤膜过滤。加入1/4病毒体积的Buffer P，充分混匀，于4℃放置过夜。1500×g，4℃离心30min，弃上清，可观察到明显的病毒沉淀。加4mL Buffer S溶解重悬病毒沉淀，1400×g，4℃离心5min。将澄清的上清液转移到一支干净的试管中，重复一次上述步骤，将澄清的上清液转移到另一支干净的试管。将上步所得澄清病毒液加入到试剂盒提供的超滤管中，1400×g离心20min，直到样品体积达到300μL左右。将病毒样品转移到一个干净的管子里，再加100μL Buffer S清洗浓缩管，收集病毒。柱平衡。将树脂柱放入到15mL离心管中，150×g离心2min。去除柱子底部的封口，重新放入到15mL离心管中，拧松帽子，让Buffer能随重力流下，待液体流尽，加入4mLBuffer S，让其随重力流下。将上述得到的腺相关病毒样品，一滴一滴缓慢加入到柱子中，让其结合到树脂上。将4mL Buffer ES加入树脂中，洗脱AAV颗粒。将上步得到的4mL AAV病毒样品液体，加入到超滤管中，1400×g离心30min，得到约200μL AAV。收集最终得到的纯化后的病毒，于-80℃保存。

五.滴度检测

1、引物序列

本实验中采用SYBRGreenⅠ法来检测AAV基因组含量，从而测定AAV滴度。

2.SYBRGreen Ⅰ法检测AAV基因组含量

(1)使用DNase I及蛋白酶K消化AAV病毒样品，所得AAV基因组DNA进行稀释。

(2)稀释标准品质粒，设置标准品的拷贝梯度为10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰

(3)配置QPCR反应体系，每个样品和标准品设计3个复孔，QPCR体系如下：

(4)进行QPCR反应，程序如下：

六、动物实验

将AAV2/9-N-shRNA3及对照病毒AAV2/9-GFP以10^-12剂量分别静脉接种3只45～60日龄健康幼犬(病毒、抗体双阴性)，7天后以10ID₅₀剂量的CDV病毒攻毒，每日观察症状，记录体温，持续观察21日。

结果

1.siRNA序列和shRNA序列

对照病毒载体上siRNA序列和shRNA序列如下：

siRNA序列：ttctccgaacgtgtcacgtaa，如SEQ ID NO.3

shRNA序列：

干扰序列设计如下：

筛选出的siRNA3序列：ccagtgaagagagttctcctgtcta，如SEQ ID NO.6

设计的shRNA3序列：

2.AAV2/9-N-shRNA3质粒测序结果分析

N shRNA3测序结果如序列表如SEQ ID NO.9所示，测序峰图如图1所示

3.AAV2/9-N-shRNA3质粒体外抑制试验

(1)QPCR

QPCR检测靶基因表达量如图2所示，结果表明：hGAPDH和N溶解曲线较好，证明RNA抽提和QPCR过程无问题。

shRNA3质粒转染后，N在293细胞中的表达量有所下调，下调效率约达到80％(以样品vector对照为参照)。

(2)Western blot

shRNA3的AAV病毒载体和过表达载体共转293细胞后，WB结果如图3所示，灰度扫描如图4所示，N的表达量有所下调。

4.实时荧光定量PCR检测腺相关病毒滴度

(1)Roche LC96实时荧光定量PCR仪所测Ct值数据如下：

(2)标准曲线制作

以每组AAV标准品的Ct(average)为纵坐标Y，其对应的拷贝数的对数为横坐标X，做标准曲线，得出标准曲线的函数公式及R平方值(标准曲线如图5所示)。

(3)待测样品滴度计算

将待测AAV样品ct均值，代入4.2所得公式，计算所加入AAV模板拷贝数X，再换算成滴度。换算公式为：AAV病毒滴度＝10^x×40000(稀释倍数)v.g./mL

测定结果：

AAV2/9-N-shRNA3滴度＝10^8.51×40000＝1.3×10¹³v.g./mL

对照病毒AAV2/9-GFP滴度＝10^8.54×40000＝1.4×10¹³v.g./mL

5.动物试验

在观察期内，对照组动物均表现出明显的临床症状，AAV2/9-N-shRNA3干扰组除1只犬在病毒接种13日出现临床症状(体温升高，精神沉郁，检测到排毒)，其余2只犬无任何异常，说明AAV2/9-N-shRNA3能够预防犬瘟热。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒

<141> 2019-01-26

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgcactgtg tttgctgacg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaaaggagct gacaggtggt 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttctccgaac gtgtcacgta a 21

<210> 4

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatccgttct ccgaacgtgt cacgtaattc aagagattac gtgacacgtt cggagaattt 60

tttc 64

<210> 5

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aattcaaaaa attctccgaa cgtgtcacgt aatctcttga attacgtgac acgttcggag 60

aacg 64

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccagtgaaga gagttctcct gtcta 25

<210> 7

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gatccgccag tgaagagagt tctcctgtct attcaagaga tagacaggag aactctcttc 60

actggttttt tc 72

<210> 8

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aattgaaaaa accagtgaag agagttctcc tgtctatctc ttgaatagac aggagaactc 60

tcttcactgg cg 72

<210> 9

<211> 536

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaggatccg ccagtgaaga gagttctcct 60

gtctattcaa gagatagaca ggagaactct cttcactggt tttttcaatt ctagttatta 120

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 180

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 240

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 300

gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 360

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 420

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 480

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttc 536

Claims

1.一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，其特征在于，由AAV2/9-N-shRNA3质粒和过表达质粒、干扰质粒共转染AAV-293细胞后得到预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒；

其中，所述AAV2/9-N-shRNA3质粒是将干扰片段重组至pHBAAV-U6-CMV-ZsGreen载体得到的，所述干扰片段的序列的Top strand如SEQ ID NO.7所示，bottom strand如SEQ IDNO.8所示；

2.根据权利要求1所述的预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，其特征在于，pHBAAV-U6-CMV-ZsGreen载体经BamHI和EcoRI双酶切后，与干扰片段基因连接后得到所述AAV2/9-N-shRNA3质粒。

3.根据权利要求1所述的预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，其特征在于，AAV2/9-N-shRNA3质粒的构建方法，包括如下步骤：

S1.人工合成干扰序列shRNA3：

Top strand：

gatccgccagtgaagagagttctcctgtctattcaagagatagacaggagaactctcttcactggttttttc

bottom strand：

aattgaaaaaaccagtgaagagagttctcctgtctatctcttgaatagacaggagaactctcttcactggcg

S2.引物退火形成带粘性末端的双链片段

将单链的引物退火成双链oligo序列，退火程序：95℃ 10min，75℃ 10min，55℃10min，35℃ 10min，15℃ 10min；

S3.用限制性内切酶BamHI和EcoRI对载体pHBAAV-U6-CMV-ZsGreen进行双酶切，双酶切完成后，胶回收；

S4.将S2得到的退火产物和S3经过酶切的载体进行连接得到连接产物，即可得到AAV2/9-N-shRNA3质粒，转化至感受态细胞，备用。

4.根据权利要求3所述的预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，其特征在于，S4中的连接反应体系如下：退火产物1μl，酶切好的载体100-200ng，ligase buffer 2μl，T4ligase 1μl，H₂O补齐至20μl，以上连接反应体系在16℃过夜。

5.根据权利要求3所述的预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，其特征在于，S4中的转化步骤包括：将连接产物以Cacl₂方法转化加入感受态细胞，于Amp抗性平板，37℃条件下培养过夜，得到转化后的N shRNA3，；转化后的N shRNA3平板挑菌，于37℃条件下、250转/分钟，摇菌14小时，挑取阳性克隆子，保存备用。

6.根据权利要求4所述的预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，其特征在于，所述感受态细胞为大肠杆菌菌株stbl3感受态细胞。

7.根据权利要求1所述的预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，其特征在于，所述共转染的反应体系如下:转染100mm平皿所需的转染复合物成分如下：10μL过表达质粒+20μLpHelper质粒+10μL AAV2/9-N-shRNA3+150μL转染试剂。

8.根据权利要求1所述的预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，其特征在于，转染AAV-293细胞的转染试剂为Lipo转染试剂。