CN107929753A - 一种药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种药物组合物及其应用，所述药物组合物包括携带化学遗传基因的腺相关病毒和/或激活化学遗传基因的药物。本发明通过构建携带化学遗传基因的腺相关病毒并感染小鼠，靶向作用于骨髓腔内TH阳性神经元细胞，用药物激活能够特异性抑制神经元细胞的去甲肾上腺素分泌，达到安全有效且长时间的抑制交感神经并增加骨量的目的。本发明提供的药物组合物及其应用安全稳定、高效便捷，对神经细胞没有毒性，作用效果显著，具有巨大的应用前景和市场价值。

Description

一种药物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种药物组合物及其应用。
背景技术
交感神经是外周神经系统中一类重要的神经类型，交感神经的功能对于机体正常代谢的运转和腺体激素分泌的控制都发挥重要作用。由脊髓发出的神经纤维到交感神经节，再由此发出纤维分布到内脏、心血管和腺体。人体在正常情况下，功能相反的交感和副交感神经处于相互平衡制约中。当机体处于紧张活动状态时，交感神经活动起着主要作用。交感神经的初级节前神经元位于脊髓的胸腰部(thorako-lumbales System)。这些神经节互连成干，被称为“交感神经干”。节后神经元继续传递信号到目标器官，并使用神经递质去甲肾上腺素。但一些交感神经纤维没有换元就离开交感神经干，到达主动脉的椎前神经节，或者到达受支配器官的器官旁神经节。
在骨髓腔中有大量的交感神经末梢，交感神经的重要功能同其末梢释放的神经递质去甲肾上腺素密切相关，交感神经节后神经纤维释放的神经递质是去甲肾上腺素，去甲肾上腺素是非常重要的一类神经递质，可以通过与效应器上不同的受体结合而产生兴奋和抑制作用，这些受体分为两类，一类是α型肾上腺素受体(α-adrenergic receptors,α-ARs)，另一类是β型肾上腺素受体(β-adrenergic recrptors,β-ARs)，现有的研究已经证明成骨细胞和破骨细胞都存在肾上腺素能受体。甲肾上腺素可以抑制骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)向成骨分化，利用药物遗传学特异性抑制TH神经元，减少去甲肾上腺素的释放，从而增加MSCs向成骨方向分化，是成骨细胞数量增加，从而使骨量增加。交感神经除了对成骨细胞和破骨细胞的直接和间接作用外，还参与间充质干细胞成骨分化的调控过程。MSCs能够分泌种类众多的细胞因子和生长因子以及粘附分子和细胞外基质，对成骨细胞，破骨细胞以及造血干细胞的增殖、发育都有重要调控作用。成骨细胞和脂肪细胞的主要来源都是MSCs，且MSCs向成骨方向分化的减弱是导致骨质疏松的主要原因之一。关于β-AR在在未分化的MSCs上的表达已有报道，当应用异丙肾上腺素刺激β-AR后，会受cAMP/PKA通路介导，使MSCs向成骨方向分化受到抑制。
化学遗传学(Chemical genetics)调控技术是近几年快速发展的一种新兴技术，是指对一些生物大分子实行改造，包括核酸杂交、蛋白质激酶、各种代谢酶和G蛋白耦联受体(G protein–coupled receptors,GPCRs)，使其能和先前无法识别的小分子进行相互作用的过程。化学遗传学和分子遗传学一样，均是遗传学的一个分支，由于其可控的、可逆的(可以随时加入或除去化合物，从而启动或中断特定的反应)特性，已经在信号转导、药物开发、功能基因组学等方面的研究中得到了广泛的应用。
现在有很多基于GPCRs改造的化学遗传学平台，例如基因编码受体的等位基因特异激活(allele-specific activation of genetically encoded receptors)、只能被合成配体激活的受体(receptors activated solely by synthetic ligands,RASSLs)、基因工程改造的受体(engineered receptors)和只由特定药物激活的受体(designerreceptors exclusively activated by designer drugs,DREADDs)。其中，DREADDs已成为应用最广泛的化学遗传学技术。现在有很多由叠氮平-N-氧化物(Clozapine-N-oxide,CNO)激活的DREADDs，他们会选择性地作用于不同的GPCR级联反应，包括激活Gq、Gi、Gs、Golf和β-arrestin，其中应用最广泛的是Gq-DREADD和Gi-DREADD。因此，应用于神经细胞内，则会进一步引起钠离子通道、钙离子通道的打开或关闭，从而诱发神经细胞膜电位的变化。
目前抑制交感神经主要手段是通过化学药物的方法来实现，如6羟基多巴胺。这类方法缺乏空间和组织的特异性，6羟基多巴胺为选择性TH神经元化学损毁剂，当注射动物体内，神经元末梢或胞体的膜转运体主动摄取到细胞内，经氧化生成神经毒物，如羟自由基和醌类物质，使TH神经元的抗氧化系统破坏，线粒体功能损伤，膜稳定性和DNA完整性的破坏，从而使神经元变性、死亡，会给外周交感神经系统造成不可逆的损伤。
因此，研发一种安全高效的通过特异抑制交感神经来增加骨量的药物组合物具有广阔的应用前景和市场价值。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种药物组合物及其应用，所述药物组合物包括携带化学遗传基因的腺相关病毒和/或激活化学遗传基因的药物。该药物组合物及其应用安全稳定高效便捷，对神经细胞没有毒性，作用效果显著，具有巨大的应用前景和市场价值。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括携带化学遗传基因的腺相关病毒和/或激活化学遗传基因的药物。
发明人在充分研究交感神经与成骨细胞、间充质干细胞的作用关系的基础上，结合化学遗传学手段，通过长期复杂的实验过程，研发出第一方面所述药物组合物，构建携带化学遗传基因的腺相关病毒载体并激活，成功验证所述药物组合物特异性长时程抑制交感神经，有效增加骨量。
优选地，所述的化学遗传基因为hM4Di，所述激活化学遗传基因的药物为叠氮平-N-氧化物溶液。
现在有很多由叠氮平-N-氧化物(Clozapine-N-oxide,CNO)激活的DREADDs，他们会选择性地作用于不同的GPCR级联反应，包括激活Gq、Gi、Gs、Golf和β-arrestin，其中应用最广泛的是Gq-DREADD和Gi-DREADD，hM4Di是Gi-DREADD的一种，在CNO的作用下，可以关闭神经细胞表面离子通道，从而到达抑制神经兴奋的目的。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述药物组合物用于制备增加骨量的药物的应用。
第三方面，本发明提供一种用于非治疗目的的增加骨量的方法，采用如第一方面所述的药物组合物，具体包括如下步骤：
(1)构建携带化学遗传基因的腺相关病毒；
(2)将步骤(1)得到的腺相关病毒感染TH神经元细胞，进行验证并标记胞体位置；
(3)将步骤(1)得到的腺相关病毒感染小鼠骨髓，再在腹腔注射叠氮平-N-氧化物溶液。
优选地，步骤(1)所述腺相关病毒的构建方法如下：
(1’)构建质粒：将化学遗传基因、红色荧光基因和神经细胞特异性启动子构建在pAAV质粒上，得到pAAV-syn DIO-hM4Di-mCherry；
(2’)转染细胞：将步骤(1’)得到的质粒与腺相关病毒的病毒包装质粒pHelper和pAAV-RC9共转293FT细胞；
(3’)收获病毒：转染后20-30h换液，换液后12-20h进行超速离心破膜，将破膜后悬液通过20％的蔗糖滤柱，收集上清，得到所述腺相关病毒。
优选地，所述转染后时间为20-30h，例如可以是20h、22h、24h、26h、28h或30h，优选为24h。
优选地，所述换液后时间为12-20h，例如可以是12h、14h、16h、18h或20h，优选为16h。
优选地，步骤(2’)所述共转的转染试剂浓度为每200000个细胞用5-8mg/L的脂质体，例如可以是5mg/L、6mg/L、7mg/L或8mg/L，优选为6mg/L的脂质体。
优选地，步骤(3’)所述离心的转速为4000-6000g，例如可以是4000g、5000g或6000g，优选为5000g。
优选地，步骤(3’)所述换液后的培养液为含有丙酮酸钠的DMEM。
优选地，所述丙酮酸钠的浓度为4-8mM，例如可以是4mM、5mM、6mM、7mM或8mM，优选为5mM。
优选地，还包括计算所述腺相关病毒滴度的步骤；
优选地，所述腺相关病毒滴度为(1-3)×1012TU/mL，例如可以是1×1012TU/mL、2×1012TU/mL或3×1012TU/mL，优选为1×1012TU/mL。
优选地，步骤(2)所述腺相关病毒的感染浓度为细胞个数：病毒个数＝1:(400-600)，例如可以是1:400、1:450、1:500、1:550或1:600，优选为1:500；
优选地，步骤(2)所述神经元细胞为TH-cre转基因小鼠骨髓内TH神经元细胞。
优选地于，步骤(2)所述验证的时间为感染后18-23天，例如可以是18天、19天、20天、21天、22天或23天，优选为21天；
优选地，步骤(2)所述验证的方法为组织切片观察mCherry表达。
优选地，步骤(2)所述标记的观察方法为先免疫荧光染色，再用激光共聚焦扫描显微镜进行观察。
优选地，步骤(3)所述腺相关病毒的感染剂量为0.5-2微升，例如可以是0.5微升、1微升、1.5微升或2微升，优选为1微升；
优选地，步骤(3)所述腹腔注射的时间为病毒注射后4-7周，例如可以是4周、5周、6周或7周，优选为6周；
优选地，步骤(3)所述叠氮平-N-氧化物溶液的用量为1.0-2.0mg/Kg，例如可以是1.0mg/Kg、1.5mg/Kg或2.0mg/Kg，优选为1.0mg/Kg；
优选地，步骤(3)所述腹腔注射的频率为每36-52h注射一次，例如可以是36h、40h、44h、48h或53h，连续注射20-40天，例如可以是20天、25天、30天、35天或40天，优选为每48h注射一次，连续注射30天。
作为优选技术方案，一种用于非治疗目的的增加骨量的方法，采用如第一方面所述的药物组合物，具体包括如下步骤：
(1)构建携带化学遗传基因的腺相关病毒；
(1’)构建质粒：将化学遗传基因、红色荧光基因和神经细胞特异性启动子构建在pAAV质粒上，得到pAAV-syn DIO-hM4Di-mCherry；
(2’)转染细胞：将步骤(1’)得到的质粒与腺相关病毒的病毒包装质粒pHelper和pAAV-RC9共转293FT细胞，转染试剂浓度为每200000个细胞用5-8mg/L的脂质体；
(3’)收获病毒：转染后20-30h换液，换液后的培养液为含有4-8mM丙酮酸钠的DMEM，换液后12-20h进行超速离心破膜，离心的转速为4000-6000g，将破膜后悬液通过20％的蔗糖滤柱，收集上清，得到腺相关病毒，计算腺相关病毒的滴度，腺相关病毒的滴度为(1-3)×1012TU/mL。
(2)将步骤(1)得到的腺相关病毒感染TH-cre转基因小鼠骨髓内TH神经元细胞，腺相关病毒的感染浓度为细胞个数：病毒个数＝1:(400-600)，进行验证并标记胞体位置，验证的时间为感染后18-23天，验证的方法为组织切片观察mCherry表达，标记的观察方法为免疫荧光染色，用激光共聚焦扫描显微镜进行观察；
(3)将步骤(1)得到的腺相关病毒感染小鼠骨髓，感染剂量为0.5-2微升，再在腹腔注射叠氮平-N-氧化物溶液，腹腔注射的时间为病毒注射后4-7周，叠氮平-N-氧化物溶液的用量为1.0-2.0mg/Kg，腹腔注射的频率为每36-52h注射一次，连续注射20-40天。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)毒性低：本发明提供的药物组合物通过构建携带化学遗传基因的腺相关病毒载体，不影响去甲肾上腺素能神经细胞活性；
2)非侵入：本发明提供的药物组合物含有的激活特异性受体的药物只需要腹腔注射即可，相对于光遗传技术无需进行埋置光纤，既不会因为无关变量而影响实验动物情绪，也不会因为额外负重影响小鼠行为，可实现在小鼠完全自由活动的情况下调控TH神经元的活动；
3)特异性：本发明提供的药物组合物利用化学遗传G蛋白“开关”的功能，对TH神经元释放去甲肾上腺素的进程进行精确控制，实现在体内精确调控骨髓腔内TH阳性神经末梢活动的功能。
4)药物作用时程长：本发明提供的药物组合物实验动物体内代谢需要一定的时间(小时量级)才能完成，因此能够在较长时程上影响神经元活动，实现长时间调控骨髓TH神经元活动，从而模拟长时间在体内调控骨髓内交感神经活动。
附图说明
图1是本发明实施例1中构建的病毒载体质粒的示意图；
图2为本发明实施例1中步骤(2)验证实验的结果图；
图3为本发明实施例1中步骤(2)标记实验的结果图；
图4为本发明实施4中骨密度仪扫描图，其中，图4(A)为实施例1的小鼠样品，图4(B)为对比例1的小鼠；
图5为本发明实施例4中骨密度仪数据统计图，其中CONTROL为对照组；
图6为本发明实施例4中病理切片结果图，其中，图6(A)为实施例1的小鼠样品，图6(B)为对比例2的小鼠样品。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1
(1)构建携带化学遗传基因的腺相关病毒；
(1’)构建质粒：将化学遗传基因、红色荧光基因和神经细胞特异性启动子构建在pAAV质粒上，得到pAAV-syn DIO-hM4Di-mCherry，示意图如图1所示；
(2’)转染细胞：将步骤(1’)得到的质粒与腺相关病毒的病毒包装质粒pHelper和pAAV-RC9共转293FT细胞，转染试剂浓度为每200000个细胞用5-8mg/L的脂质体；
(3’)收获病毒：转染后24h换液，换液后的培养液为含有5mM丙酮酸钠的DMEM，换液后16h进行超速离心破膜，离心的转速为5000g，将破膜后悬液通过20％的蔗糖滤柱，收集上清，得到腺相关病毒，计算腺相关病毒的滴度，腺相关病毒滴度为1×1012TU/mL。
(2)将步骤(1)得到的腺相关病毒感染TH-cre转基因小鼠骨髓内TH神经元细胞，腺相关病毒的感染浓度为细胞个数：病毒个数＝1:500，进行验证并标记胞体位置，验证的时间为感染后21天，验证的方法为组织切片观察mCherry表达，标记的观察方法为免疫荧光染色，用激光共聚焦扫描显微镜进行观察，结果如图2和图3所示；
(3)将步骤(1)得到的腺相关病毒感染小鼠骨髓，感染剂量为1微升，再在腹腔注射叠氮平-N-氧化物溶液，腹腔注射的时间为病毒注射后6周，叠氮平-N-氧化物溶液的用量为1.0mg/Kg，腹腔注射的频率为每36-52h注射一次，连续注射30天。
由图2可知，观察到mCherry红色荧光蛋白表达，证明腺相关病毒构建并感染成功；由图3可知，在颈上神经节可见到红色荧光蛋白表达，可确定骨髓腔内TH阳性神经末梢的胞体位于颈上神经节，可为后续治疗骨丢失或其他骨相关疾病提供参考位置。
实施例2
(1)构建携带化学遗传基因的腺相关病毒；
(1’)构建质粒：将化学遗传基因、红色荧光基因和神经细胞特异性启动子构建在pAAV质粒上，得到pAAV-syn DIO-hM4Di-mCherry；
(2’)转染细胞：将步骤(1’)得到的质粒与腺相关病毒的病毒包装质粒pHelper和pAAV-RC9共转293FT细胞，转染试剂浓度为每200000个细胞用5mg/L的脂质体；
(3’)收获病毒：转染后20h换液，换液后的培养液为含有4mM丙酮酸钠的DMEM，换液后12h进行超速离心破膜，离心的转速为4000g，将破膜后悬液通过20％的蔗糖滤柱，收集上清，得到腺相关病毒，计算腺相关病毒的滴度，腺相关病毒滴度为1×1012TU/mL。
(2)将步骤(1)得到的腺相关病毒感染TH-cre转基因小鼠骨髓内TH神经元细胞，腺相关病毒的感染浓度为细胞个数：病毒个数＝1:400，进行验证并标记胞体位置，验证的时间为感染后18天，验证的方法为组织切片观察mCherry表达，标记的观察方法为免疫荧光染色，用激光共聚焦扫描显微镜进行观察；
(3)将步骤(1)得到的腺相关病毒感染小鼠骨髓，感染剂量为0.5微升，再在腹腔注射叠氮平-N-氧化物溶液，腹腔注射的时间为病毒注射后4周，叠氮平-N-氧化物溶液的用量为1.5mg/Kg，腹腔注射的频率为每36h注射一次，连续注射20天。
实施例2的实验结果与实施例1基本一致，在此不再赘述。
实施例3
(1)构建携带化学遗传基因的腺相关病毒；
(1’)构建质粒：将化学遗传基因、红色荧光基因和神经细胞特异性启动子构建在pAAV质粒上，得到pAAV-syn DIO-hM4Di-mCherry；
(2’)转染细胞：将步骤(1’)得到的质粒与腺相关病毒的病毒包装质粒pHelper和pAAV-RC9共转293FT细胞，转染试剂浓度为每200000个细胞用8mg/L的脂质体；
(3’)收获病毒：转染后30h换液，换液后的培养液为含有8mM丙酮酸钠的DMEM，换液后20h进行超速离心破膜，离心的转速为6000g，将破膜后悬液通过20％的蔗糖滤柱，收集上清，得到腺相关病毒，计算腺相关病毒的滴度，腺相关病毒滴度为3×1012TU/mL。
(2)将步骤(1)得到的腺相关病毒感染TH-cre转基因小鼠骨髓内TH神经元细胞，腺相关病毒的感染浓度为细胞个数：病毒个数＝1:600，进行验证并标记胞体位置，验证的时间为感染后23天，验证的方法为组织切片观察mCherry表达，标记的观察方法为免疫荧光染色，用激光共聚焦扫描显微镜进行观察；
(3)将步骤(1)得到的腺相关病毒感染小鼠骨髓，感染剂量为1微升，再在腹腔注射叠氮平-N-氧化物溶液，腹腔注射的时间为病毒注射后6周，叠氮平-N-氧化物溶液的用量为2.0mg/Kg，腹腔注射的频率为每48h注射一次，连续注射40天。
实施例3的实验结果与实施例1基本一致，在此不再赘述。
对比例1
设置病毒空壳对照组，感染小鼠骨髓，感染剂量为1微升，再在腹腔注射叠氮平-N-氧化物溶液，腹腔注射的时间为腺相关病毒注射后6周，叠氮平-N-氧化物溶液的用量为1.0mg/Kg，腹腔注射的频率为每48h注射一次，连续注射30天。
实施例4
用INALYZER公司骨密度仪扫描检测骨密度实施例1和对比例1的小鼠骨密度的进行功能验证，并进行统计，结果图4和图5所示；采用病理组织切片观察实施例1和对比例1的小鼠样品，结果如图6所示；
由图4和图5可知，长时程抑制骨髓腔内TH阳性神经末梢活动导致骨密度增加，实施例1的骨密度远大于对比例1。
由图6可知，实施例1与对比例1相比，骨小梁增粗，骨小梁上成骨细胞数量显著增加。
综上所述，本实验提供一种药物组合物及其应用，通过构建携带化学遗传基因的腺相关病毒，感染小鼠并靶向作用于TH阳性神经元细胞，腹腔注射药物后激活化学遗传基因，抑制神经元细胞分泌去甲肾上腺素以达到非治疗目的的增加骨量的效果，本发明提供的药物组合物特异性好，毒性低，安全高效稳定便捷，能够长时效抑制神经元细胞的活性，具有广阔的应用前景和效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括携带化学遗传基因的腺相关病毒和/或激活化学遗传基因的药物。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的化学遗传基因为hM4Di；
优选地，所述激活化学遗传基因的药物为叠氮平-N-氧化物溶液。
3.一种如权利要求1或2所述的药物组合物用于制备增加骨量的药物。
4.一种用于非治疗目的的增加骨量的方法，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的药物组合物，具体包括如下步骤：
(1)构建携带化学遗传基因的腺相关病毒；
(2)将步骤(1)得到的腺相关病毒感染TH神经元细胞，进行验证并标记胞体位置；
(3)将步骤(1)得到的腺相关病毒感染小鼠骨髓，再在腹腔注射叠氮平-N-氧化物溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述腺相关病毒的构建方法如下：
(1’)构建质粒：将化学遗传基因、红色荧光基因和神经细胞特异性启动子构建在pAAV质粒上，得到pAAV-syn DIO-hM4Di-mCherry；
(2’)转染细胞：将步骤(1’)得到的质粒与腺相关病毒的病毒包装质粒pHelper和pAAV-RC9共转293FT细胞；
(3’)收获病毒：转染后20-30h，优选24h换液，换液后12-20h，优选16h进行超速离心破膜，将破膜后悬液通过20％的蔗糖滤柱，收集上清，得到所述腺相关病毒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2’)所述共转的转染试剂浓度为每200000个细胞用5-8mg/L的脂质体，优选为6mg/L的脂质体；
优选地，步骤(3’)所述离心的转速为4000-6000g，优选为5000g；
优选地，步骤(3’)所述换液后的培养液为含有丙酮酸钠的DMEM；
优选地，所述丙酮酸钠的浓度为4-8mM，优选为5mM。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其特征在于，还包括计算所述腺相关病毒的滴度的步骤；
优选地，所述腺相关病毒滴度为(1-3)×1012TU/mL，优选为1×1012TU/mL。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述腺相关病毒的感染浓度为细胞个数：病毒个数＝1:(400-600)，优选为1:500；
优选地，步骤(2)所述神经元细胞为TH-cre转基因小鼠骨髓内TH神经元细胞；
优选地于，步骤(2)所述验证的时间为感染后18-23天，优选为21天；
优选地，步骤(2)所述验证的方法为组织切片观察mCherry表达；
优选地，步骤(2)所述标记的观察方法为先免疫荧光染色，再用激光共聚焦扫描显微镜进行观察。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述腺相关病毒的感染剂量为0.5-2微升，优选为1微升；
优选地，步骤(3)所述腹腔注射的时间为病毒注射后4-7周，优选为6周；
优选地，步骤(3)所述叠氮平-N-氧化物溶液的用量为1.0-2.0mg/Kg，优选为1.0mg/Kg；
优选地，步骤(3)所述腹腔注射的频率为每36-52h注射一次，连续注射20-40天，优选为每48h注射一次，连续注射30天。
10.一种用于非治疗目的的增加骨量的方法，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的药物组合物，具体包括如下步骤：
(1)构建携带化学遗传基因的腺相关病毒；
(1’)构建质粒：将化学遗传基因、红色荧光基因和神经细胞特异性启动子构建在pAAV质粒上，得到pAAV-syn DIO-hM4Di-mCherry；
(2’)转染细胞：将步骤(1’)得到的质粒与腺相关病毒的病毒包装质粒pHelper和pAAV-RC9共转293FT细胞，转染试剂浓度为每200000个细胞用5-8mg/L的脂质体；
(3’)收获病毒：转染后20-30h换液，换液后的培养液为含有4-8mM丙酮酸钠的DMEM，换液后12-20h进行超速离心破膜，离心的转速为4000-6000g，将破膜后悬液通过20％的蔗糖滤柱，收集上清，得到腺相关病毒，计算腺相关病毒的滴度，腺相关病毒滴度为(1-3)×1012TU/mL。
(2)将步骤(1)得到的病毒感染TH-cre转基因小鼠骨髓内TH神经元细胞，腺相关病毒的感染浓度为细胞个数：病毒个数＝1:(400-600)，进行验证并标记胞体位置，验证的时间为感染后18-23天，验证的方法为组织切片观察mCherry表达，标记的观察方法为；
(3)将步骤(1)得到的腺相关病毒感染小鼠骨髓，感染剂量为0.5-2微升，再在腹腔注射叠氮平-N-氧化物溶液，腹腔注射的时间为病毒注射后4-7周，叠氮平-N-氧化物溶液的用量为1.0-2.0mg/Kg，腹腔注射的频率为每36-52h注射一次，连续注射20-40天。
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