JP2022025081A - 血友病ａの治療に有用な操作されたヌクレアーゼ - Google Patents

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Abstract

【課題】第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１－２２の逆位を特徴とする血友病Ａの治療に有用な遺伝子操作されたヌクレアーゼを提供する。【解決手段】本発明は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のｉｎｔ２２ｈ－１配列内の認識配列を認識し切断する、操作されたヌクレアーゼを包含する。本発明はまた、遺伝子改変細胞を作製するためにこのような操作されたヌクレアーゼを使用する方法、並びに医薬組成物及び血友病Ａの治療方法におけるこのような細胞の使用を包含する。更に、本発明は、操作されたヌクレアーゼタンパク質、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸、又は本発明の遺伝子改変細胞を含む医薬組成物、及び血友病Ａを治療するためのこのような組成物の使用を包含する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月３日に出願された、「血友病Ａの治療に有用な操作されたヌ
クレアーゼ（ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ ＮＵＣＬＥＡＳＥＳ ＵＳＥＦＵＬ ＦＯＲ ＴＲ
ＥＡＴＭＥＮＴ ＯＦ ＨＥＭＯＰＨＩＬＩＡ Ａ）」と題される米国特許仮出願第６２
／３３ １，３３５号の優先権を主張し、その開示内容全体が参照により本明細書に組み
込まれる。
本発明は、分子生物学及び組換え核酸技術の分野に関する。特に、本発明は、第ＶＩＩ
Ｉ因子遺伝子のイントロン２２内、特にｉｎｔ２２ｈ－１配列内の認識配列に対する特異
性を有する操作されたヌクレアーゼに関する。このような操作されたヌクレアーゼは、第
ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１－２２の逆位を特徴とする血友病Ａの治療方法において
有用である。
ＥＦＳ－ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出する配列表への参照
本出願には、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表が含
まれており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１７年５月２日に作成
されたこのＡＳＣＩＩコピーは、１８２Ｗ０１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿Ｆ
ｉｎａｌという名称でサイズは１７２，８４７バイトである。
血友病Ａは、世界的に男性の５０００人に１人の発生率を有する一般的な遺伝性出血性
疾患である。この遺伝病は、Ｘ染色体上に位置付けられた凝固第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８）遺
伝子内の種々の突然変異から生じ得、この突然変異は、大きな欠失、挿入、逆位、及び点
突然変異を含む。臨床的に、血友病Ａは、患者の血漿中の相対的な第ＶＩＩＩ因子活性に
基づいて、軽症（５～３０％活性、患者の５０％）、中等症（２～５％活性、患者の１０
％）、又は重症（＜１％活性、患者の５０％）に分類することができる。現在のところ、
血友病Ａの治療法はない。標準療法は組換え第ＶＩＩＩ因子の投与を含むが、このアプロ
ーチは費用、頻繁な注射の必要性、及び治療の有効性を低下させる第ＶＩＩＩ因子不活性
化抗体が被験体に形成されることによって制限される。従って、血友病Ａの代替治療のた
めの明確な必要性が依然として存在する。第ＶＩＩＩ因子遺伝子の突然変異を標的とする
遺伝子治療は、治療に対する魅力的だが分かりにくいアプローチにとどまっている。
第ＶＩＩＩ因子は、凝固カスケードの必須成分である。タンパク質は、フォンビレブラ
ンド因子に結合した不活性形態で体内を循環する。傷害に応答して、第ＶＩＩＩ因子が活
性化され（第Ｖｉｌｌａ因子）、フォンビレブランド因子から分離し、次に凝固カスケー
ドの一部として第ＩＸａ因子と相互作用し、これによりフィルビンの形成及び安定な凝固
が生じる。多くの研究により、第ＶＩＩＩ因子は、肝臓の類洞内皮細胞及び肝臓以外の体
中の造血細胞によって産生されることが示唆されている。
Ｘ染色体上の第ＶＩＩＩ因子遺伝子は大きく、構造的に複雑であり、約１８０ｋｂ及び
２６エクソンを含む。野生型第ＶＩＩＩ因子遺伝子は２つのタンパク質をコードする。第
１のタンパク質は、エクソン１～２６に見出される９０３０塩基によってコードされ、２
３３２個のアミノ酸残基を含有する循環型を有する全長第ＶＩＩＩ因子タンパク質である
。第ＶＨＩｂ因子と呼ばれる第２のタンパク質は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子に存在する５つ
のエクソン中の２５９８塩基によってコードされる。得られるタンパク質は２１６個のア
ミノ酸を含み、現在知られていない機能を有する。
重度血友病Ａ症例の約４５％は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のイントロン２２に関与する染
色体内逆位によって引き起こされる。この逆位は、ｉｎｔ２２ｈ－１と呼ばれるイントロ
ン２２の約９．５ｋｂのセグメントが、Ｘ染色体上の第ＶＩＩＩ因子遺伝子に対して約４
００ｋｂ及び５００ｋｂテロメアに位置する２つの反復コピー（それぞれｉｎｔ２２ｈ－
２及びｉｎｔ２２ｈ－３と呼ばれる）の１つと再結合するときに生じる。組換えの後、因
子ＶＩＩＩ遺伝子のエクソン１－２２は、エクソン２３－２６に対してゲノムにおいて逆
位し、エクソン２３－２６によってコードされるアミノ酸が欠損している切断型の不活性
な第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現をもたらす（非特許文献１）。
エクソン１－２２の逆位に関与する上流の反復コピーは、ｉｎｔ２２ｈ－１の反対方向
に向いている。初期の研究は、ｉｎｔ２２ｈ－２及びｉｎｔ２２ｈ－３が両方ともｉｎｔ
２２ｈ－１に対して逆向きであり、いずれかの反復配列で再構成が起こることを可能にす
ることを示唆した。これはタイプＩの逆位とタイプＩＩの逆位と呼ばれた。しかしながら
、より最近のエビデンスは、ｉｎｔ２２ｈ－２とｉｎｔ２２ｈ－３がＸ染色体上で互いに
逆向きで見出され、不完全なパリンドロームの一部であることを示す（図１）。このパリ
ンドローム内の配列の組換えにより、ｉｎｔ２２ｈ－２とｉｎ２２ｈ－３はゲノム内の場
所を交換し、結果としてｉｎｔ２２ｈ－１に対してそれらの向きを変えることができる。
結果として、ｉｎｔ２２ｈ－１配列は、異なる状況において、ｉｎｔ２２ｈ－１に対して
反対向きにあるものに応じて、ｉｎｔ２２ｈ－２反復又はｉｎｔ２２ｈ－３反復と再結合
することができる（非特許文献２）。
注目すべきは、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のイントロン２２は、Ｆ８Ａ１（第ＶＩＩＩ因子
関連１）及びＦ８Ｂと呼ばれる２つのさらなる遺伝子のための双方向プロモーターとして
作用するＣｐＧアイランドを含有する。ＣｐＧアイランド及びイントロンなしのＦ８Ａ１
遺伝子（配列番号５）は両方ともｉｎｔ２２ｈ－１配列内（従って、ｉｎｔ２２ｈ－２及
びｉｎ２２ｈ－３内）に含有され、第ＶＩＩＩ因子遺伝子とは反対方向に転写される（非
特許文献３）。興味深いことに、本発明者らは、Ｆ８Ａ１遺伝子の配列が、イヌゲノムの
第ＶＩＩＩ因子遺伝子、特に第ＶＩＩＩ因子が欠失し第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１
－２２の逆位を示すイヌの臨床関連集団と有意な相同性を示す、ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝
子の唯一の領域であることを確認した（非特許文献４）。
本発明は、二本鎖切断を生じさせ、ｉｎｔ２２ｈ－１と第ＶＩＩＩ因子遺伝子のテロメ
アに位置する逆向き反復配列（ｉｎｔ２２ｈ－２又はｉｎｔ２２ｈ－３）との組換えを促
進するために、ｉｎｔ２２ｈ－１配列内のＤＮＡ配列を認識するように操作された、部位
特異的な希少切断エンドヌクレアーゼの使用を必要とする。本発明者らは、これらの領域
間のヌクレアーゼ誘導組換えが、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１－２２の逆位又は復
帰をもたらすことを見出した。
操作された部位特異的エンドヌクレアーゼを産生する方法は、当技術分野で公知である
。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ゲノム中の所定の部位を認識し
切断するように操作することができる。ＺＦＮは、ＦｏｋＩ制限酵素のヌクレアーゼドメ
インに融合したジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。ジ
ンクフィンガードメインは、長さが約１８塩基対の所定のＤＮＡ配列に結合するタンパク
質を産生するための合理的又は実験的手段によって再設計することができる。この操作さ
れたタンパク質ドメインをＦｏｋＩヌクレアーゼに融合することにより、ゲノムレベル特
異性を有するＤＮＡ切断を標的とすることが可能である。ＺＦＮは、広範囲の真核生物に
おける遺伝子の付加、除去、及び置換を標的とするために広く使用されている（非特許文
献５に概説されている）。
同様に、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を生成して、ゲノムＤＮＡ中
の特定の部位を切断することができる。ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮは、ＦｏｋＩヌクレ
アーゼドメインに融合した操作された部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含む（非特許文献
６に概説されている）。しかし、この場合、ＤＮＡ結合ドメインは、各々が単一のＤＮＡ
塩基対を特異的に認識するＴＡＬエフェクタードメインのタンデム配列を含む。
コンパクトＴＡＬＥＮは、二量体化の必要性を回避する代わりのエンドヌクレアーゼ構
造である（非特許文献７）。コンパクトＴＡＬＥＮは、Ｉ－ＴｅｖＩホーミングエンドヌ
クレアーゼからのヌクレアーゼドメインに融合した、操作された部位特異的ＴＡＬエフェ
クターＤＮＡ結合ドメインを含む。Ｆｏｋｌとは異なり、Ｉ－ＴｅｖＩは二本鎖ＤＮＡ切
断を行うために二量体化する必要がないので、コンパクトＴＡＬＥＮは単量体として機能
する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系に基づく操作されたエンドヌクレアーゼも当技術分野で知ら
れている（非特許文献８）。ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、２つの成分、即ち（１
）カスパーゼエフェクターヌクレアーゼ、典型的には微生物Ｃａｓ９と、（２）ヌクレア
ーゼをゲノム内の目的の位置に向ける約２０個のヌクレオチド標的配列を含む短い「ガイ
ドＲＮＡ」とを含む。異なる標的配列を各々有する同じ細胞内に複数のガイドＲＮＡを発
現させることにより、ゲノム中の複数の部位に同時にＤＮＡ切断を標的化することが可能
である。
本発明の好ましい実施形態では、ＤＮＡ切断誘発剤は、操作されたホーミングエンドヌ
クレアーゼ（「メガヌクレアーゼ」とも呼ばれる）である。ホーミングエンドヌクレアー
ゼは、植物及び真菌のゲノムに一般的に見られる１５～４０塩基対切断部位を認識する天
然ヌクレアーゼの群である。それらは、１型自己スプライシングイントロン及びインテイ
ンのような寄生ＤＮＡ要素と頻繁に関連している。それらは、細胞ＤＮＡ修復機構を補充
する染色体に二本鎖切断を生じさせることによって、宿主ゲノムの特定の位置で相同組換
え又は遺伝子挿入を自然に促進する（非特許文献９）。ホーミングエンドヌクレアーゼは
、通常、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－Ｃｙｓボ
ックスファミリー、及びＨＮＨファミリーの４つのファミリーに分類される。これらのフ
ァミリーは、触媒活性及び認識配列に影響を及ぼす構造モチーフを特徴とする。例えば、
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの
１つ又は２つのいずれかのコピーを有することによって特徴付けられる（非特許文献１０
を参照）。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの単一のコピーを有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧホー
ミングエンドヌクレアーゼはホモダイマーを形成するが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの
２つのコピーを有するメンバーはモノマーとして見出される。
Ｉ－ＣｒｅＩ（配列番号１）は、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅ
ｉｎｈａｒｄｔｉｉ）の葉緑体染色体中の２２塩基対の認識配列を認識し切断する、ホー
ミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーである。野生型Ｉ
－ＣｒｅＩ切断部位の優先性を改変するために、遺伝子選択技術が使用されている（非特
許文献１１）。Ｉ－ＣｒｅＩ及び他のホーミングエンドヌクレアーゼを包括的に再設計し
て、哺乳動物、酵母、植物、細菌、及びウイルスゲノム中の部位を含む広く拡散するＤＮ
Ａ部位を標的とすることができるモノＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ
を合理的に設計する方法が記載された（特許文献１）。
特許文献２に最初に記載されているように、Ｉ－ＣｒｅＩ及びその操作された誘導体は
通常は二量体であるが、第１のサブユニットのＣ末端を第２のサブユニットのＮ末端に接
合する短いペプチドリンカーを用いて、単一のポリペプチドに融合することができる（非
特許文献１２）。従って、機能的な「一本鎖」メガヌクレアーゼは、単一の転写物から発
現され得る。これは、操作されたメガヌクレアーゼで観察される非常に低い頻度のオフタ
ーゲット切断と相まって、それらを本発明にとって好ましいエンドヌクレアーゼにする。
重症血友病Ａにおける遺伝子治療のための遺伝子操作されたヌクレアーゼの使用は限定
されている。Ｐａｒｋらは、ＴＡＬＥＮを使用して、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中の第ＶＩＩ
Ｉ因子遺伝子のエクソン１の逆位を誘導し、多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を誘導することを
記載している（非特許文献１３）。エクソン１の逆位は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のイント
ロン１のｉｎｔｌｈ－１配列と第ＶＩＩＩ因子遺伝子のテロメアに位置する単一の相同領
域（ｉｎｔｌｈ－２）との間の相同組換えにより起こる血友病Ａの発生とも関連している
。この研究のために選択されたＴＡＬＥＮは、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞及びｉＰＳＣにおい
てそれぞれ１．９％及び１．４％の効率でこの短い配列の逆位を誘導するために、イント
ロン１相同領域内で切断した。著者らは更に、１．３％の同様の効率でｉＰＳＣにおける
エクソン１の復帰を実証した。
その後の研究で、Ｐａｒｋらは、重症血友病Ａに罹患している患者から得たｉＰＳＣに
おける、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１－２２の復帰を誘導するためのＣＲＩＳＰＲ
／Ｃａｓシステムの使用を報告した（非特許文献１４）。著者らは、エクソン１－２２の
逆位はエクソン１の逆位よりも８倍多いことに気付いたが、エクソン１－２２の逆位は復
帰させることが技術的により困難であることを強調し、一部の理由として、逆位の実質的
により大きなサイズ（１４０ｋｂｐと比較して６００ｋｂｐ）、及びＩｎｔ１ｈ－１配列
の２つの相同体のみと比較して、Ｘ染色体上のｉｎｔ２２ｈ－１配列の３つの相同体の存
在が挙げられる。実際、Ｐａｒｋらは、ｉｎｔ２２ｈ相同性領域内で切断することによっ
て、逆位６００－ｋｂｐセグメントの所望の復帰ではなく、Ｉｎｔ２２ｈ－１、ｉｎｔ２
２ｈ－２、及びｉｎｔ２２ｈ－３の相同体のいずれか２つに関与する望ましくない欠失や
逆位が誘導される可能性を除外するために、これら３つのｉｎｔ２２相同体領域の外側の
認識配列を特異的に標的にしている。このアプローチを用いて、著者らは、ｉＰＳ細胞に
おいて約３．７％の復帰頻度を観察した。
本発明は、いくつかの態様において当該技術を改善する。驚くべきことに、ｉｎｔ２２
ｈ相同体領域内の認識配列を標的化することを回避するための当該技術分野の示唆にもか
かわらず、本発明者らは、ｉｎｔ２２ｈ－１内の標的認識配列を標的化すると、第ＶＩＩ
Ｉ因子におけるエクソン１－２２の逆位又は復帰を高効率で生成できることを見出した。
更に、ｉｎｔ２２ｈ－１配列内で標的化されたいくつかの認識配列は、Ｆ８Ａ１配列内に
見出され、本発明者らは、これがイヌ第ＶＩＩＩ因子遺伝子と高度の相同性を共有する第
ＶＩＩＩ因子遺伝子の唯一の領域であることを見出した。従って、本発明の方法は、血友
病Ａに罹患しているヒト被験体だけでなく、同様にエクソン１－２２の逆位を発現する臨
床関連のイヌ血友病Ａ集団においても有用である。従って、本発明は、重症血友病Ａに対
するさらなる遺伝子治療アプローチのための当該分野における必要性を満たす。
国際公開第２００７／０４７８５９号 国際公開第２００９／０５９１９５号
Ｓａｕｎａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｌｏｏｄ １２５（２）：２２３－２２８ Ｂａｇｎａｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ４：５９１－５９８ Ｂｏｗｅｎ（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ：Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．５５：１２７－１４４ Ｌｏｚｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＰＮＡＳ ９９（２０）：１２９９１－１２９９６ Ｓ．Ｄｕｒａｉ ｅｔ ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３、５９７８（２００５） Ｍａｋ、ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．２３：９３－９ Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ， ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．４：１７６２ Ｒａｎ， ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．８：２２８１－２３０８；Ｍａｌｉ， ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄ．１０：９５７－６３ Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６）、Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：４９－９５ Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１８）：３７５７－３７７４ Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１－４１；Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．３３：ｅｌ７８；Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：３８７０－９、Ａｒｎｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００６）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３－５８ Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：１６５０－６２；Ｇｒｉｚｏｔ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：５４０５－１９ Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２０１４）、ＰＮＡＳ １１１（２５）：９２５３－９２５８ Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １７：２１３－２２０
本発明は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１－２２の逆位を特徴とする血友病Ａの治
療に有用な遺伝子操作されたヌクレアーゼを提供する。本発明の操作されたヌクレアーゼ
は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のｉｎｔ２２ｈ－１配列内の認識配列を認識し切断することに
より、ｉｎｔ２２ｈ－１配列と、Ｘ染色体上の第ＶＩＩＩ因子遺伝子に対してテロメアに
位置する同一の又は高度に相同な逆位反復配列との組換えを促進する。このような組換え
は、エクソン１－２２の復帰をもたらし、野生型第ＶＩＩＩ因子遺伝子を生成する。本発
明はまた、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のｉｎｔ２２ｈ－１配列内に位置する認識配列に対する
特異性を有する操作されたヌクレアーゼを利用する、血友病Ａの治療のための医薬組成物
及び方法を提供する。本発明は更に、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１－２２の逆位を
修正するように改変された遺伝子改変細胞、並びにこのような遺伝子改変細胞を含む薬学
的組成物及び血友病Ａの治療のためのその使用方法を提供する。
従って、一態様では、本発明は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のｉｎｔ２２ｈ－１配列内の認
識配列を認識し切断する操作されたメガヌクレアーゼを提供する。操作されたメガヌクレ
アーゼは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを含み、第１のサブユニットは、
認識配列の第１の認識ハーフサイトに結合し、第１の超可変領域（ＨＶＲ１）を含み、第
２のサブユニットは、認識配列の第２の認識ハーフサイトに結合し、第２の超可変領域（
ＨＶＲ２）を含む。
一実施形態では、ｉｎｔ２２ｈ－１配列は、配列番号３又は配列番号４に対して少なく
とも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の
配列同一性を有することができる。このような一実施形態では、ｉｎｔ２２ｈ－１配列は
、配列番号３又は配列番号４を含み得る。
別の実施形態では、認識配列は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のＦ８Ａ１コード配列内に存在
し得る。このような実施形態では、Ｆ８Ａ１コード配列は、配列番号５又は配列番号６に
対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又
はそれ以上の配列同一性を有することができる。別のこのような実施形態では、Ｆ８Ａ１
コード配列は、配列番号５又は配列番号６を含み得る。
別の実施形態では、認識配列は、配列番号７を含むことができる。
そのようないくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１９の残基２１５～２
７０又は配列番号２０－２１のいずれか１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に
対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
特定の実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１９の残基２１５，２１７，２１９，
２２１，２２３，２２４，２２９，２３１，２３３，２３５，２３７，２５９，２６１，
２６６及び２６８に対応する残基を含むことができるか、又は配列番号２０～２１のいず
れか１つの残基２４，２６，２８，３０，３２，３３，３８，４０，４２，４４，４６，
６８，７０，７５，及び７７を含むことができる。
特定の実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１９の残基２１５～２７０、又は配列
番号２０～２１のいずれか１つの残基２４～７９を含むことができる。
そのようないくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１９の残基２４～７９
、又は配列番号２０～２１のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列
に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
特定の実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１９の残基２４，２６，２８，３０，
３２，３３，３８，４０，４２，４４，６８，７０，７５，及び７７に対応する残基を含
むことができるか、又は配列番号２０～２１のいずれか１つの残基２１５、２１７，２１
９，２２１，２２３，２２４，２２９，２３１，２３３，２３５，２５９，２６１，２６
６，及び２６８に対応する残基を含むことができる。
特定の実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１９の残基２４～７９、又は配列番号
２０～２１のいずれか１つの残基２１５～２７０を含むことができる。
このような一実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１９の残基１９８～３４
４又は配列番号２０若しくは２１の残基７～１５３に対して少なくとも８０％、少なくと
も８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、若しくはそれ以上の配列同一性を有す
るアミノ酸配列を含むことができ、第２のサブユニットは、配列番号１９の残基７～１５
３又は配列番号２０若しくは２１の残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％、少な
くとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５、若しくはそれ以上の配列同一性を有
するアミノ酸配列を含むことができる。
別のそのような実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１９の残基１９８～３
４４又は配列番号２０若しくは２１の残基７～１５３を含むことができる。別のそのよう
な実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号１９の残基７～１５３又は配列番号２
０若しくは２１の残基１９８～３４４を含むことができる。
別のそのような実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖
メガヌクレアーゼであってもよく、リンカーは、第１のサブユニット及び第２のサブユニ
ットに共有結合する。
別のそのような実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１９～２１の
いずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。
別の実施形態では、認識配列は、配列番号９を含むことができる。
そのようないくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号２８～３１のいずれか
１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一
性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
ある実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号２８～３１のいずれか１つの残基２１５
，２１７，２１９，２２１，２２３，２２４，２３１，２３３，２３５，２３７，２６１
，２６６，及び２６８に対応する残基を含むことができる。
特定の実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号２８～３１のいずれか１つの残基２１
５～２７０を含むことができる。
そのようないくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号２８～３１のいずれか
１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を
有するアミノ酸配列を含むことができる。
ある実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号２８－３１のいずれか１つの残基２４，
２６，２８，３０，３２，３３，３８，４０，４２，４４，４６，６８，７０，７５，及
び７７に対応する残基を含むことができる。
更なる実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３０の残基７３に対応する残基を更に
含むことができる。
特定の実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号２８～３１のいずれか１つの残基２４
～７９を含むことができる。
このような一実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号２８～３１のいずれか１
つの残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０
％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことがで
き、第２のサブユニットは、配列番号２８～３１のいずれか１つの残基７～１５３に対し
て少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそ
れ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
別のそのような実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号２８～３１のいずれか
１つの残基１９８～３４４を含むことができる。別のそのような実施形態では、第２のサ
ブユニットは、配列番号２８～３１のいずれか１つの残基７～１５３を含むことができる
。
別のそのような実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖
メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニット及び第２のサブユニットに共
有結合する。
このような別の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号２８～３１の
いずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。
別の実施形態では、認識配列は配列番号１１を含むことができる。
そのようないくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４０の残基２４～７９
又は配列番号４１－４３のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に
対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
ある実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４０の残基２４，２６，２８，３０，３
２，３３，３８，４０，４２，４４，４６，６８，７０，７５，及び７７に対応する残基
を含むことができるか、又は配列番号４１～４３のいずれか１つの残基２１５，２１７，
２１９，２２１，２２３，２２４，２２９，２３１，２３３，２３５，２３７，２５９，
２６１，２６６，及び２６８に対応する残基を含むことができる。
特定の実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４０の残基２４～７９又は配列番号４
１～４３のいずれか１つの残基２１５～２７０を含むことができる。
そのようないくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４０の残基２１５～２
７０又は配列番号４１－４３のいずれか１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に
対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
ある実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４０の残基２１５，２１７，２１９，２
２１，２２３，２２４，２２９，２３１，２３３，２３５，２３７，２５９，２６１，２
６６，及び２６８に対応する残基を含むことができるか、又は配列番号４１～４３のいず
れか１つの残基２４，２６，２８，３０，３２，３３，３８，４０，４２，４４，４６，
６８，７０，７５，及び７７に対応する残基を含むことができる。
特定の実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４０の残基２１５～２７０又は配列番
号４１～４３のいずれか１つの残基２４～７９を含むことができる。
このような一実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４０の残基７～１５３又
は配列番号４１～４３のいずれか１つの残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％、
少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を
有するアミノ酸配列を含むことができ、第２のサブユニットは、配列番号４０の残基１９
８～３４４又は配列番号４１～４３のいずれか１つの残基７～１５３に対して少なくとも
８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列
同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
別のそのような実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４０の残基７～１５３
又は配列番号４１～４３のいずれか１つの残基１９８～３４４を含むことができる。別の
そのような実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４０の残基１９８～３４４又
は配列番号４１～４３のいずれか１つの残基７～１５３を含むことができる。
別のそのような実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖
メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニット及び第２のサブユニットに共
有結合する。
別のそのような実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４０～４３の
いずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。
別の実施形態では、認識配列は配列番号１３を含むことができる。
このようないくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５２～５５のいずれか
１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性
を有するアミノ酸配列を含むことができる。
ある実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５２－５５のいずれか１つの残基２４，
２６，２８，３０，３２，３３，３８，４０，４２，４４，６８，７０，７５，及び７７
に対応する残基を含むことができる。
特定の実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５２～５５のいずれか１つの残基２４
～７９を含むことができる。
そのようないくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５２～５５のいずれか
１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同
一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
ある実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５２－５５のいずれか１つの残基２１５
，２１７，２１９，２２１，２２３，２２４，２２９，２３１，２３３，２３５，２３７
，２５９，２６１，２６６，及び２６８に対応する残基を含むことができる。
特定の実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５２～５５のいずれか１つの残基２１
５～２７０を含むことができる。
そのような一実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５２～５５のいずれか１
つの残基７～１５３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、
少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、
第２のサブユニットは、配列番号５２～５５のいずれか１つの残基１９８～３４４に対し
て少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそ
れ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
別のそのような実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５２～５５のいずれか
１つの残基７～１５３を含むことができる。別のそのような実施形態では、第２のサブユ
ニットは、配列番号５２～５５のいずれか１つの残基１９８～３４４を含むことができる
。
別のそのような実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖
メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニット及び第２のサブユニットに共
有結合する。
別のそのような実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５２～５５の
いずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。
別の実施形態では、認識配列は配列番号１５を含むことができる。
そのようないくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号６４の残基２４～７９
又は配列番号６５－６７のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に
対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
特定の実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号６４の残基２４，２６，２８，３０，
３２，３３，４０，４２，４４，４６，６８，７０，７５，及び７７に対応する残基を含
むことができるか、又は配列番号６５～６７のいずれか１つの残基２１５、２１７，２１
９，２２１，２２３，２２４，２３１，２３３，２３５，２３７，２５９，２６１，２６
６，及び２６８に対応する残基を含むことができる。
特定の実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号６４の残基２４～７９又は配列番号６
５～６７のいずれか１つの残基２１５～２７０を含むことができる。
そのようないくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号６４の残基２１５～２
７０又は配列番号６５－６７のいずれか１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に
対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
ある実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号６４の残基２１５，２１７，２１９，２
２１，２２３，２２４，２２９，２３１，２３３，２３５，２３７，２５９，２６１，２
６６，及び２６８に対応する残基を含むことができるか、又は配列番号６５～６７のいず
れか１つの残基２４，２６，２８，３０，３２，３３，３８，４０，４２，４４，４６，
６８，７０，７５，及び７７に対応する残基を含むことができる。
特定の実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号６４の残基２１５～２７０又は配列番
号６５～６７のいずれか１つの残基２４～７９を含むことができる。
このような一実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号６４の残基７～１５３又
は配列番号６５～６７のいずれか１つの残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％、
少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を
有するアミノ酸配列を含むことができ、第２のサブユニットは、配列番号６４の残基１９
８～３４４又は配列番号６５～６７のいずれか１つの残基７～１５３に対して少なくとも
８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列
同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
別のそのような実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号６４の残基７～１５３
又は配列番号６５～６７のいずれか１つの残基１９８～３４４を含むことができる。別の
そのような実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号６４の残基１９８～３４４又
は配列番号６５～６７のいずれか１つの残基７～１５３を含むことができる。
別のそのような実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖
メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニット及び第２のサブユニットに共
有結合する。
別のそのような実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６４～６７の
いずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。
別の実施形態では、認識配列は配列番号１７を含むことができる。
そのようないくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号７６～７９のいずれか
１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一
性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
ある実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号７６－７９のいずれか１つの残基２１５
，２１７，２１９，２２１，２２３，２２４，２２９，２３１，２３３，２３５，２５９
，２６１，２６６，及び２６８に対応する残基を含むことができる。
特定の実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号７６～７９のいずれか１つの残基２１
５～２７０を含むことができる。
そのようないくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号７６～７９のいずれか
１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性
を有するアミノ酸配列を含むことができる。
ある実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号７６－７９のいずれか１つの残基２４，
２６，２８，３０，３２，３３，３８，４０，４２，４４，４６，６８，７０，７５，及
び７７に対応する残基を含むことができる。
特定の実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号７６～７９のいずれか１つの残基２４
～７９を含むことができる。
そのような一実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号７６～７９のいずれか１
つの残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０
％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことがで
き、第２のサブユニットは、配列番号７６～７９のいずれか１つの残基７～１５３に対し
て少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそ
れ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
別のそのような実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号７６～７９のいずれか
１つの残基１９８～３４４を含むことができる。別のそのような実施形態では、第２のサ
ブユニットは、配列番号７６～７９のいずれか１つの残基７～１５３を含むことができる
。
別のそのような実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖
メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニット及び第２のサブユニットに共
有結合する。
別のそのような実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７６～７９の
いずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。
別の態様では、本発明は、本発明の任意の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核
酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、単離された
ポリヌクレオチドはｍＲＮＡであり得る。
別の態様では、本発明は、本発明の任意の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核
酸配列を含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。
一実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は自己切断することができる。
別の実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、ウイルスベクターをコードする。このよう
な実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイル
ス、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得る。特定の実施形態では、ウイ
ルスベクターは、組換えＡＡＶベクターであり得る。
別の態様では、本発明は、本発明の任意の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核
酸配列を含むウイルスベクターを提供する。
一実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイ
ルス、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得る。特定の実施形態では、ウ
イルスベクターは、組換えＡＡＶベクターであり得る。
別の態様において、本発明は、血友病Ａを有する被験体の治療のための医薬組成物を提
供する。このような態様において、血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１－２
２の逆位によって特徴付けられる。医薬組成物は、薬学的に許容される担体と、（ａ）操
作されたヌクレアーゼをコードする核酸であって、インビボで標的細胞中に発現する操作
されたヌクレアーゼ又は（ｂ）操作されたヌクレアーゼタンパク質と、を含み、操作され
たヌクレアーゼは、標的細胞中の第ＶＩＩＩ因子遺伝子のｉｎｔ２２ｈ－１配列内に位置
する第１の認識配列に対する特異性を有する。
一実施形態では、ｉｎｔ２２ｈ－１配列は、配列番号３又は配列番号４に対して少なく
とも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の
配列同一性を有することができる。このような一実施形態では、ｉｎｔ２２ｈ－１配列は
、配列番号３又は配列番号４を含み得る。
別の実施形態では、第１の認識配列は、Ｆ８Ａ１コード配列内に存在し得る。そのよう
な実施形態では、Ｆ８Ａ１コード配列は、配列番号５又は配列番号６に対して少なくとも
８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列
同一性を有することができる。別のこのような実施形態では、Ｆ８Ａ１コード配列は、配
列番号５又は配列番号６を含み得る。
別の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、第１の認識配列と同一であるか又は高
度の相同性を有する第２の認識配列に対して特異性を有することができ、第２の認識配列
は、Ｘ染色体内の第ＶＩＩＩ因子遺伝子に対してテロメアの反復配列内に位置する。その
ような実施形態では、反復配列は、反復配列がｉｎｔ２２ｈ－１配列に対して反対向きで
あることを除いて、ｉｎｔ２２ｈ－１配列と同一であるか、又は高度の相同性を有する。
別の実施形態では、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸はｍＲＮＡであり得る。
別の実施形態では、医薬組成物は、核酸を含む組換えＤＮＡ構築物を含む。このような
一実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は自己切断することができる。
別の実施形態では、医薬組成物は、核酸を含むウイルスベクターを含む。このような一
実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス
、又はＡＡＶであり得る。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、組換えＡＡＶ
ベクターであり得る。
別の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、操作されたメガヌクレアーゼ、ＴＡＬ
ＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、コンパクトＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ、又はｍｅ
ｇａＴＡＬであり得る。特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、操作されたメ
ガヌクレアーゼであり得る。
操作されたヌクレアーゼが操作されたメガヌクレアーゼである別の実施形態では、第１
の認識配列は配列番号７を含むことができる。このような一実施形態では、医薬組成物は
、配列番号７を認識し切断する本発明の操作されたメガヌクレアーゼ（又はそれをコード
する核酸）を含むことができる。特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、
配列番号１９～２１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。
操作されたヌクレアーゼが操作されたメガヌクレアーゼである別の実施形態では、第１
の認識配列は配列番号９を含むことができる。このような一実施形態では、医薬組成物は
、配列番号９を認識し切断する本発明の操作されたメガヌクレアーゼ（又はそれをコード
する核酸）を含むことができる。特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、
配列番号２８～３１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。
操作されたヌクレアーゼが操作されたメガヌクレアーゼである別の実施形態では、第１
の認識配列は配列番号１１を含むことができる。このような一実施形態では、医薬組成物
は、配列番号１１を認識し切断する本発明の操作されたメガヌクレアーゼ（又はそれをコ
ードする核酸）を含むことができる。特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼ
は、配列番号４０～４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。
操作されたヌクレアーゼが操作されたメガヌクレアーゼである別の実施形態では、第１
の認識配列は配列番号１３を含むことができる。このような一実施形態では、医薬組成物
は、配列番号１３を認識し切断する本発明の操作されたメガヌクレアーゼ（又はそれをコ
ードする核酸）を含むことができる。特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼ
は、配列番号５２～５５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。
操作されたヌクレアーゼが操作されたメガヌクレアーゼである別の実施形態では、第１
の認識配列は配列番号１５を含むことができる。このような一実施形態では、医薬組成物
は、配列番号１５を認識し切断する本発明の操作されたメガヌクレアーゼ（又はそれをコ
ードする核酸）を含むことができる。特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼ
は、配列番号６４～６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。
操作されたヌクレアーゼが操作されたメガヌクレアーゼである別の実施形態では、第１
の認識配列は配列番号１７を含むことができる。そのような一実施形態では、医薬組成物
は、配列番号１７を認識し切断する本発明の操作されたメガヌクレアーゼ（又はそれをコ
ードする核酸）を含むことができる。特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼ
は、配列番号７６～７９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。
別の態様において、本発明は、血友病Ａを有する被験体を治療するための方法を提供す
る。このような態様において、血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１～２２の
逆位によって特徴付けられる。この方法は、（ａ）操作されたヌクレアーゼをコードする
核酸であって、操作されたヌクレアーゼがインビボで標的細胞中に発現する核酸又は（ｂ
）操作されたヌクレアーゼタンパク質を、被験体の標的細胞に送達することを含み、操作
されたヌクレアーゼは、標的細胞の第ＶＩＩＩ因子遺伝子のｉｎｔ２２ｈ－１配列内に位
置する第１の認識配列に対する特異性を有する、本発明の任意の操作されたヌクレアーゼ
である。
この方法の一実施形態では、この方法は、上記の本発明の医薬組成物を被験体に投与す
ることを含み、本発明の医薬組成物は、（ａ）本発明の操作されたヌクレアーゼをコード
する核酸であって、操作されたヌクレアーゼがインビボで標的細胞中に発現する核酸又は
（ｂ）本発明の操作されたヌクレアーゼタンパク質を含む。
この方法の別の実施形態では、操作されたヌクレアーゼ又は操作されたヌクレアーゼを
コードする核酸を、野生型第ＶＩＩＩ因子を発現することができる標的細胞、又は野生型
第ＶＩＩＩ因子を発現することができる細胞に分化する前駆細胞に送達することができる
。このような一実施形態では、標的細胞は肝細胞であり得る。特定の実施形態において、
肝細胞は、肝類洞内皮細胞であり得る。別のそのような実施形態では、肝細胞は、肝類洞
内皮細胞に分化する肝幹細胞等の前駆細胞であり得る。別のそのような実施形態では、標
的細胞は、造血内皮細胞であり得る。別のそのような実施形態において、標的細胞は、造
血内皮細胞に分化する前駆細胞であり得る。標的細胞は、エクソン１－２２の逆位を有す
る第ＶＩＩＩ因子遺伝子を含むことが理解される。
この方法の別の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、第１の認識配列を認識し切
断し、ｉｎｔ２２ｈ－１配列と反復配列との間の組換えを促進し、エクソン１－２２を復
帰させて野生型第ＶＩＩＩ因子遺伝子を生成する。
この方法の別の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、反復配列中の第２の認識配
列を更に認識し切断する。
この方法の別の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、操作されたメガヌクレアー
ゼ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、コンパクトＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ
、又はｍｅｇａＴＡＬであり得る。特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、操
作されたメガヌクレアーゼであり得る。
操作されたヌクレアーゼが操作されたメガヌクレアーゼである方法の別の実施形態では
、第１の認識配列は配列番号７を含むことができる。このような一実施形態では、操作さ
れたメガヌクレアーゼは、配列番号７を認識し切断する本発明の任意の操作されたメガヌ
クレアーゼであり得る。特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号
１９～２１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。
操作されたヌクレアーゼが操作されたメガヌクレアーゼである方法の別の実施形態では
、第１の認識配列は配列番号９を含むことができる。このような一実施形態では、操作さ
れたメガヌクレアーゼは、配列番号９を認識し切断する本発明の任意の操作されたメガヌ
クレアーゼであり得る。特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号
２８～３１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。
操作されたヌクレアーゼが操作されたメガヌクレアーゼである方法の別の実施形態では
、第１の認識配列は配列番号１１を含むことができる。このような一実施形態では、操作
されたメガヌクレアーゼは、配列番号１１を認識し切断する本発明の任意の操作されたメ
ガヌクレアーゼであり得る。特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列
番号４０～４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。
操作されたヌクレアーゼが操作されたメガヌクレアーゼである方法の別の実施形態では
、第１の認識配列は配列番号１３を含むことができる。このような一実施形態では、操作
されたメガヌクレアーゼは、配列番号１３を認識し切断する本発明の任意の操作されたメ
ガヌクレアーゼであり得る。特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列
番号５２～５５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。
操作されたヌクレアーゼが操作されたメガヌクレアーゼである方法の別の実施形態にお
いて、第１の認識配列は配列番号１５を含み得る。このような一実施形態では、操作され
たメガヌクレアーゼは、配列番号１５を認識し切断する本発明の任意の操作されたメガヌ
クレアーゼであり得る。特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号
６４～６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。
操作されたヌクレアーゼが操作されたメガヌクレアーゼである方法の別の実施形態では
、第１の認識配列は配列番号１７を含むことができる。このような一実施形態では、操作
されたメガヌクレアーゼは、配列番号１７を認識し切断する本発明の任意の操作されたメ
ガヌクレアーゼであり得る。特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列
番号７６～７９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むことができる。
本方法の別の実施形態では、被験体は哺乳動物であり得る。このような一実施形態では
、被験体はヒトであり得る。別のこのような実施形態では、被験体はイヌであり得る。
別の態様では、本発明は、野生型第ＶＩＩＩ因子遺伝子を含む遺伝子改変細胞の産生方
法を提供する。この方法は、（ａ）エクソン１－２２の逆位を有する第ＶＩＩＩ因子遺伝
子を含む細胞を得ることと、（ｂ）細胞に、（ｉ）操作されたヌクレアーゼをコードする
核酸配列であって、操作されたヌクレアーゼが細胞内に発現する核酸配列又は（ｉｉ）操
作されたヌクレアーゼタンパク質を導入することとを含み、ここで、操作されたヌクレア
ーゼは、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のｉｎｔ２２ｈ－１配列内の第１の認識配列に対する特異
性を有し、操作されたヌクレアーゼは、ｉｎｔ２２ｈ－１配列内の第１の認識配列を認識
し切断して、ｉｎｔ２２ｈ－１配列と第ＶＩＩＩ因子遺伝子のテロメアに位置する反復配
列との間の組換えを促進し、反復配列がｉｎｔ２２ｈ－１配列に対して逆向きであること
を除いて、反復配列はｉｎｔ２２ｈ－１配列と同一であるか、又は高度相同性を有し、組
換えはエクソン１－２２の復帰及び野生型第ＶＩＩＩ因子遺伝子を含む遺伝子改変細胞の
生成を引き起こす。
一実施形態では、細胞は真核細胞であり得る。そのような一実施形態では、真核細胞は
多能性細胞であり得る。そのような実施形態では、多能性細胞は、誘導多能性幹（ｉＰＳ
）細胞であり得る。特定の実施形態では、ｉＰＳ細胞は、ヒトｉＰＳ細胞又はイヌｉＰＳ
細胞であり得る。
別の実施形態では、ｉｎｔ２２ｈ－１配列は、配列番号３又は配列番号４に対して少な
くとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上
の配列同一性を有することができる。このような一実施形態では、ｉｎｔ２２ｈ－１配列
は、配列番号３又は配列番号４を含み得る。
別の実施形態では、第１の認識配列は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のＦ８Ａ１コード配列内
に存在し得る。そのような実施形態では、Ｆ８Ａ１コード配列は、配列番号３又は配列番
号４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５
％、又はそれ以上の配列同一性を有することができる。特定の実施形態では、Ｆ８Ａ１コ
ード配列は、配列番号３又は配列番号４を含むことができる。
別の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、第１の認識配列と同一であるか、又は
高度の相同性を有する第２の認識配列に対して特異性を有することができ、第２の認識配
列は、Ｘ染色体内の第ＶＩＩＩ因子遺伝子に対してテロメアの反復配列内に位置する。そ
のような実施形態では、反復配列は、反復配列がｉｎｔ２２ｈ－１配列に対して反対向き
であることを除いて、ｉｎｔ２２ｈ－１配列と同一であるか、又は高度の相同性を有する
。
別の実施形態では、核酸はｍＲＮＡであり得る。
別の実施形態では、組換えＤＮＡ構築物を用いて核酸を細胞に導入することができる。
このような一実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は自己切断することができる。
別の実施形態では、ウイルスベクターを用いて核酸を細胞に導入することができる。こ
のような一実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデ
ノウイルス、又はＡＡＶであり得る。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、組
換えＡＡＶベクターであり得る。
別の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、操作されたメガヌクレアーゼ、ＴＡＬ
ＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、コンパクトＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ、又はｍｅ
ｇａＴＡＬであり得る。特定の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、操作されたメ
ガヌクレアーゼであり得る。
別の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、配列番号７を含む認識配列を認識し切
断する本発明の任意の操作されたメガヌクレアーゼであり得る。このような一実施形態で
は、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１９～２１のいずれか１つのアミノ酸配列
を含むことができる。
別の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、配列番号９を含む認識配列を認識して
切断する本発明の任意の操作されたメガヌクレアーゼであり得る。このような一実施形態
では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号２８～３１のいずれか１つのアミノ酸配
列を含むことができる。
別の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、配列番号１１を含む認識配列を認識し
切断する、本発明の任意の操作されたメガヌクレアーゼであり得る。このような一実施形
態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４０～４３のいずれか１つのアミノ酸
配列を含むことができる。
別の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、配列番号１３を含む認識配列を認識し
切断する本発明の任意の操作されたメガヌクレアーゼであり得る。このような一実施形態
では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５２～５５のいずれか１つのアミノ酸配
列を含むことができる。
別の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、配列番号１５を含む認識配列を認識し
切断する本発明の任意の操作されたメガヌクレアーゼであり得る。このような一実施形態
では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６４～６７のいずれか１つのアミノ酸配
列を含むことができる。
別の実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、配列番号１７を含む認識配列を認識し
切断する本発明の任意の操作されたメガヌクレアーゼであり得る。このような一実施形態
では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７６～７９のいずれか１つのアミノ酸配
列を含むことができる。
別の態様では、本発明は、遺伝子改変細胞を提供し、ここで、遺伝子改変細胞は、野生
型第ＶＩＩＩ因子遺伝子を含み、本明細書に記載の本発明の方法に従って産生され、エク
ソン１－２２の逆位を有する第ＶＩＩＩ因子遺伝子を含む細胞から遺伝子改変細胞が産生
される。
別の態様において、本発明は、血友病Ａを有する被験体の治療のための医薬組成物を提
供する。このような態様において、血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１－２
２の逆位によって特徴付けられる。異なる実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容さ
れる担体及び本発明の任意の遺伝子改変細胞並びに／又は本発明の方法に従って産生され
た任意の遺伝子改変細胞を含み、遺伝子改変細胞は、野生型第ＶＩＩＩ因子遺伝子を含む
。
別の態様では、本発明は、血友病Ａを有する被験体を治療するための方法を提供する。
このような態様において、血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１～２２の逆位
によって特徴付けられる。この方法は、薬学的に許容される担体と本発明の任意の遺伝子
改変細胞とを含む本発明の医薬組成物を、被験体に投与することを含む。そのような遺伝
子改変細胞は、改変後の野生型第ＶＩＩＩ因子遺伝子を含む。
この方法の一実施形態では、遺伝子改変細胞を標的組織に送達することができる。この
ような一実施形態では、標的組織は肝臓であり得る。別のこのような実施形態では、標的
組織は、循環系であり得る。
この方法の別の実施形態では、遺伝子改変細胞は、遺伝子改変ｉＰＳ細胞であり得る。
このような一実施形態では、遺伝子改変ｉＰＳ細胞は、標的組織に送達されると第ＶＩＩ
Ｉ因子を発現する細胞に分化することができる。特定の実施形態では、遺伝子改変ｉＰＳ
細胞は、第ＶＩＩＩ因子を発現する肝類洞内皮細胞に分化することができる。別の特定の
実施形態では、遺伝子改変ｉＰＳ細胞は、第ＶＩＩＩ因子を発現する造血内皮細胞などの
造血細胞に分化することができる。
本方法の別の実施形態では、被験体は哺乳動物であり得る。このような一実施形態では
、被験体はヒトであり得る。別のこのような実施形態では、被験体はイヌであり得る。
別の態様では、本発明は、医薬品として使用するための、本明細書に記載の操作された
ヌクレアーゼ、特に操作されたメガヌクレアーゼを提供する。本発明は更に、第ＶＩＩＩ
因子遺伝子のエクソン１－２２の逆位を特徴とする、血友病Ａの治療用医薬品の製造にお
ける、本明細書に記載の操作されたヌクレアーゼ、特に操作されたメガヌクレアーゼの使
用を提供する。
別の態様では、本発明は、医薬品として使用するための単離されたポリヌクレオチドを
提供し、単離されたポリヌクレオチドは、本発明の操作されたヌクレアーゼ、特に操作さ
れたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む。本発明は、血友病Ａの治療用医薬品
の製造における、単離されたポリヌクレオチドの使用を更に提供し、これは第ＶＩＩＩ因
子遺伝子のエクソン１－２２の逆位によって特徴付けられ、単離されたポリヌクレオチド
は、操作されたヌクレアーゼ、特に操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を
含む。
別の態様では、本発明は、医薬品として使用するための組換えＡＡＶベクターを提供し
、組換えＡＡＶベクターは単離されたポリヌクレオチドを含み、単離されたポリヌクレオ
チドは、操作されたヌクレアーゼ、特に操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配
列を含む。本発明は更に、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１－２２の逆位を特徴とする
血友病Ａの治療用医薬品の製造における組換えＡＡＶベクターの使用を提供し、組換えＡ
ＡＶベクターは単離されたポリヌクレオチドを含み、単離されたポリヌクレオチドは、本
発明の操作されたヌクレアーゼ、特に操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列
を含む。
別の態様では、本発明は、医薬品として使用するための本発明の遺伝子改変細胞を提供
し、遺伝子改変細胞は、野生型第ＶＩＩＩ因子遺伝子を含むように改変されている。本発
明は更に、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１－２２の逆位を特徴とする血友病Ａの治療
用医薬品の製造における本発明の遺伝子改変細胞の使用を提供し、遺伝子改変細胞は、野
生型第ＶＩＩＩ因子遺伝子を含むように改変されている。
第ＶＩＩＩ因子遺伝子のイントロン１－２２の逆位を示す。ｉｎｔ２２ｈ－２及びｉｎｔ２２ｈ－３反復配列は、Ｘ染色体上のｉｎｔ２２ｈ－１配列のテロメアに位置する。更に、ｉｎｔ２２ｈ－２及びｉｎｔ２２ｈ－３は、不完全なパリンドロームの一部として互いに逆向きに見出される。このパリンドローム内の配列の組換えにより、ｉｎｔ２２ｈ－２とｉｎ２２ｈ－３はゲノム内の場所を交換し、結果としてｉｎｔ２２ｈ－１に対してそれらの向きを変えることができる。結果として、ｉｎｔ２２ｈ－１配列は、異なる状況において、ｉｎｔ２２ｈ－１に対して反対向きにあるものに応じて、ｉｎｔ２２ｈ－２反復又はｉｎｔ２２ｈ－３反復と再結合することができる。図１Ａは、ｉｎｔ２２ｈ－３がｉｎｔ２２ｈ－１に対して逆向きであり、これらの反復配列間で染色体内組換えが起こり、エクソン１－２２の図示された逆位を生じることを可能にする配置を示す。図１Ｂは、ｉｎｔ２２ｈ－２がｉｎｔ２２ｈ－１に対して逆向きであり、これらの反復配列間で染色体内組換えが起こり、エクソン１－２２の図示された逆位を生じることを可能にする配置を示す。 第ＶＩＩＩ因子遺伝子のＦ８Ｒ認識配列を示す。Ａ）本発明の組換えメガヌクレアーゼによって標的とされる各認識配列は、２つの認識ハーフサイトを含む。各認識ハーフサイトは、４塩基対の中央配列によって分離された９塩基対を含む。Ｆ８Ｒ１－２認識配列（配列番号７）は、Ｆ８Ｒ１及びＦ８Ｒ２と呼ばれる２つの認識ハーフサイトを含む。Ｆ８Ｒ３－４認識配列（配列番号９）は、Ｆ８Ｒ３及びＦ８Ｒ４と呼ばれる２つの認識ハーフサイトを含む。Ｆ８Ｒ９－１０認識配列（配列番号１１）は、Ｆ８Ｒ９及びＦ８Ｒ１０と呼ばれる２つの認識ハーフサイトを含む。Ｆ８Ｒ１１－１２認識配列（配列番号１３）は、Ｆ８Ｒ１１及びＦ８Ｒ１２と呼ばれる２つの認識ハーフサイトを含む。Ｆ８Ｒ１３－１４認識配列（配列番号１５）は、Ｆ８Ｒ１３及びＦ８Ｒ１４と呼ばれる２つの認識ハーフサイトを含む。Ｆ８Ｒ１５－１６認識配列（配列番号１７）は、Ｆ８Ｒ１５及びＦ８Ｒ１６と呼ばれる２つの認識ハーフサイトを含む。 本発明の組換えメガヌクレアーゼは、２つのサブユニットを含み、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットは、第１の認識ハーフサイト（例えば、Ｆ８Ｒ１、Ｆ８Ｒ３、Ｆ８Ｒ９、Ｆ８Ｒ１１、Ｆ８Ｒ１３、又はＦ８Ｒ１５）に結合し、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットは、第２の認識ハーフサイト（例えば、Ｆ８Ｒ２、Ｆ８Ｒ４、Ｆ８Ｒ１０、Ｆ８Ｒ１２、Ｆ８Ｒ１４、又はＦ８Ｒ１６）に結合する。組換えメガヌクレアーゼが一本鎖メガヌクレアーゼである実施形態では、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットは、Ｎ末端又はＣ末端サブユニットのいずれかとして位置することができる。同様に、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットは、Ｎ末端又はＣ末端サブユニットのいずれかとして位置することができる。 第ＶＩＩＩ因子遺伝子のイントロン２２に見られる認識配列を標的とする組換えメガヌクレアーゼを評価するためのＣＨＯ細胞におけるレポーターアッセイの模式図を示す。本明細書中に記載される組換えメガヌクレアーゼについては、レポーターカセットが細胞のゲノムに安定に組み込まれたＣＨＯ細胞株が産生された。レポーターカセットは、５’から３’の順序、即ち、ＳＶ４０初期プロモーター、ＧＦＰ遺伝子の５’２／３、本発明の操作されたメガヌクレアーゼの認識配列（例えば、Ｆ８Ｒ１－２認識配列）、ＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼの認識配列（国際公開第２０１２／１６７１９２号）、及びＧＦＰ遺伝子の３’２／３で構成されていた。このカセットで安定にトランスフェクトされた細胞は、ＤＮＡ切断誘発剤の非存在下ではＧＦＰを発現しなかった。メガヌクレアーゼは、各メガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡの形質導入によって導入された。メガヌクレアーゼ認識配列のいずれかでＤＮＡ切断が誘導されると、ＧＦＰ遺伝子の重複領域は互いに組換えられて機能的ＧＦＰ遺伝子を産生する。次いで、メガヌクレアーゼによるゲノム切断の頻度の間接的測定として、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現細胞の割合を決定することができる。 ＣＨＯ細胞レポーターアッセイで第ＶＩＩＩ因子遺伝子のｉｎｔ２２ｈ－１配列中の認識配列を認識し切断するための組換えメガヌクレアーゼの効率を示す。配列番号１９～２１，２８～３１，４０～４３，５２～５５，６４～６７，及び７６～７９に示される組換えメガヌクレアーゼを、Ｆ８Ｒ１～２認識配列（配列番号７）、Ｆ８Ｒ３－４認識配列（配列番号９）、Ｆ８Ｒ９－１０認識配列（配列番号１１）、Ｆ８Ｒ１１－１２認識配列（配列番号１３）、Ｆ８Ｒ１３－１４認識配列（配列番号１５）、又はＦ８Ｒ１５－１６認識配列（配列番号１７）を標的とするように操作して、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイで有効性についてスクリーニングした。示された結果は、各アッセイにおいて観察されたＧＦＰ発現細胞の割合を提供し、標的認識配列又はＣＨＯ－２３／２４認識配列を切断するための各メガヌクレアーゼの有効性を示す。更に、各アッセイの陰性対照（ｂｓ）が含まれていた。図５Ａは、Ｆ８Ｒ１－２認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図５Ｂ及び図５Ｃは、Ｆ８Ｒ３－４認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図５Ｄは、Ｆ８Ｒ９－１０認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図５Ｅは、Ｆ８Ｒ１１－１２認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図５Ｆは、Ｆ８Ｒ１３－１４認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図５Ｇは、Ｆ８Ｒ１５－１６認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。 ＣＨＯ細胞レポーターアッセイで第ＶＩＩＩ因子遺伝子のｉｎｔ２２ｈ－１配列中の認識配列を認識し切断するための操作されたメガヌクレアーゼの効率を示す。本発明が包含する操作されたメガヌクレアーゼを、Ｆ８Ｒ１－２（配列番号７）、Ｆ８Ｒ３－４（配列番号９）、Ｆ８Ｒ９－１０（配列番号１１）、Ｆ８Ｒ１１－１２（配列番号１３）、Ｆ８Ｒ１３－１４（配列番号１５）、又はＦ８Ｒ１５－１６（配列番号１７）の認識配列を標的とするように操作し、ヌクレオフェクション後１２日間にわたる複数の時点で、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおいて有効性についてスクリーニングした。示された結果は、分析の１２日間にわたる各アッセイにおいて観察されたＧＦＰ発現細胞の割合を提供し、標的認識配列又はＣＨＯ－２３／２４認識配列を切断するための各メガヌクレアーゼの有効性を時間の関数として示す。図６Ａは、Ｆ８Ｒ１－２認識配列を標的とするＦ８Ｒ１－２メガヌクレアーゼを示す。図６Ｂは、Ｆ８Ｒ３－４認識配列を標的とするＦ８Ｒ３－４メガヌクレアーゼを示す。図６Ｃは、Ｆ８Ｒ９－１０認識配列を標的とするＦ８Ｒ９－１０メガヌクレアーゼを示す。図６Ｄは、Ｆ８Ｒ１１－１２認識配列を標的とするＦ８Ｒ１１－１２メガヌクレアーゼを示す。図６Ｅは、Ｆ８Ｒ１３－１４認識配列を標的とするＦ８Ｒ１３－１４メガヌクレアーゼを示す。図６Ｆは、Ｆ８Ｒ１５－１６認識配列を標的とするＦ８Ｒ１５－１６メガヌクレアーゼを示す。 哺乳動物細胞におけるＦ８Ｒ認識配列の切断を示す。メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１－２及びＦ８Ｒ３－４を、ＨＥＫ２９３細胞におけるＴ７エンドヌクレアーゼアッセイによって切断し、それらの認識部位に挿入及び／又は欠失（ｉｎｄｅｌ）を引き起こす能力について試験した。 哺乳動物細胞の第ＶＩＩＩ因子遺伝子におけるエクソン１－２２の逆位を示す。この実験によって、Ｆ８Ｒ１－２及びＦ８Ｒ３－４メガヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの切断が、ＨＥＫ２９３細胞の第ＶＩＩＩ因子遺伝子におけるエクソン１－２２の逆位を刺激し得るかどうかを決定した。図８Ａでは、エクソン１－２２の正常な位置を検出することができるプライマーセット（Ｈ１Ｒ／Ｈ１Ｆ）を用いて、ＰＣＲによってゲノムＤＮＡを分析した。図８Ｂでは、エクソン１－２２の逆位を検出することができるプライマーセット（Ｈ１Ｒ／Ｈ２／３Ｒ）を用いて、ＰＣＲによってゲノムＤＮＡを分析した。 哺乳動物細胞の第ＶＩＩＩ因子遺伝子におけるエクソン１－２２の逆位を示す。この実験によって、Ｆ８Ｒ９－１０、Ｆ８Ｒ１１－１２、Ｆ８Ｒ１３－１４、及びＦ８Ｒ１５－１６メガヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの切断が、ＨＥＫ２９３細胞の第ＶＩＩＩ因子遺伝子におけるエクソン１－２２の逆位を刺激するかどうかを決定した。エクソン１－２２の正常な位置（Ｈ１Ｒ／Ｈ１Ｆ）又はエクソン１－２２の逆位（Ｈ１Ｒ／Ｈ２／３Ｒ）を検出することができるプライマーセットを用いて、ＰＣＲによってゲノムＤＮＡを分析した。２日目及び８日目からのＰＣＲ分析を各プライマーセットについて提供する。 ２９３細胞におけるＦ８Ｒヌクレアーゼによる第ＶＩＩＩ因子遺伝子の逆位及び逆デジタルＰＣＲによる効率の測定を示す。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．６９又はＦ８Ｒ１３－１４ｘ．１３ヌクレアーゼをそれぞれコードするｍＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、ゲノムＤＮＡを細胞から単離し、逆デジタルＰＣＲを実施して第ＶＩＩＩ因子ゲノム編集を決定した。 初代ヒトＴ細胞におけるＦ８Ｒヌクレアーゼによる第ＶＩＩＩ因子遺伝子の逆位及び長距離ＰＣＲによる編集の決定を示す。正常ヒトＴ細胞を、Ｆ８Ｒ３－４ｘ．４３ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後に、ゲノムＤＮＡを細胞から単離し、長距離ＰＣＲを実施して第ＶＩＩＩ因子ゲノム編集を決定した。 図１２Ａ～図１２Ｂは、初代ヒト患者Ｔ細胞におけるＦ８Ｒヌクレアーゼによる第ＶＩＩＩ因子遺伝子の復帰及び長距離ＰＣＲによる編集の決定を示す。血友病Ａ患者Ｔ細胞を、Ｆ８Ｒ３－４ｘ．４３、Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．６９又はＦ８Ｒ１５－１６ｘ．１４ヌクレアーゼをそれぞれコードするｍＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後に、ゲノムＤＮＡを細胞から単離し、長距離ＰＣＲを実施して第ＶＩＩＩ因子ゲノム編集を決定した。図１２Ａは、ＨＩＵ及びＨＩＤプライマーを用いて検出された、野生型第ＶＩＩＩ因子遺伝子配置に対応するＰＣＲバンドを示す。図１２Ｂは、Ｈ３Ｄ及びＨＩＤプライマーを用いて検出された、血友病Ａ関連第ＶＩＩＩ因子遺伝子逆位に対応するＰＣＲバンドを示す。
配列の簡単な説明
配列番号１は、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉ
ｉ）由来の野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ヒトｉｎｔ２２ｈ－１配列の核酸配列を示す。
配列番号４は、イヌｉｎｔ２２ｈ－１配列の核酸配列を示す。
配列番号５は、ヒトＦ８Ａ１配列の核酸配列を示す。
配列番号６は、イヌＦ８Ａ１配列の核酸配列を示す。
配列番号７は、Ｆ８Ｒ１－２認識配列（センス）の核酸配列を示す。
配列番号８は、Ｆ８Ｒ１－２認識配列（アンチセンス）の核酸配列を示す。
配列番号９は、Ｆ８Ｒ３－４認識配列（センス）の核酸配列を示す。
配列番号１０は、Ｆ８Ｒ３－４認識配列（アンチセンス）の核酸配列を示す。
配列番号１１は、Ｆ８Ｒ９－１０認識配列（センス）の核酸配列を示す。
配列番号１２は、Ｆ８Ｒ９－１０認識配列（アンチセンス）の核酸配列を示す。
配列番号１３は、Ｆ８Ｒ１１－１２認識配列（センス）の核酸配列を示す。
配列番号１４は、Ｆ８Ｒ１１－１２認識配列（アンチセンス）の核酸配列を示す。
配列番号１５は、Ｆ８Ｒ１３－１４認識配列（センス）の核酸配列を示す。
配列番号１６は、Ｆ８Ｒ１３－１４認識配列（アンチセンス）の核酸配列を示す。
配列番号１７はＦ８Ｒ１５－１６認識配列（センス）の核酸配列を示す。
配列番号１８は、Ｆ８Ｒ１５－１６認識配列（アンチセンス）の核酸配列を示す。
配列番号１９は、Ｆ８Ｒ１－２ｘ．２７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２０は、Ｆ８Ｒ１－２ｘ．１５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２１は、Ｆ８Ｒ１－２ｘ．９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２２は、Ｆ８Ｒ１－２ｘ．２７メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１結合モノマーのアミ
ノ酸配列を示す。
配列番号２３は、Ｆ８Ｒ１－２ｘ．１５メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１結合モノマーのアミ
ノ酸配列を示す。
配列番号２４は、Ｆ８Ｒ１－２ｘ．９メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１結合モノマーのアミノ
酸配列を示す。
配列番号２５は、Ｆ８Ｒ１－２ｘ．２７メガヌクレアーゼＦ８Ｒ２結合モノマーのアミ
ノ酸配列を示す。
配列番号２６は、Ｆ８Ｒ１－２ｘ．１５メガヌクレアーゼＦ８Ｒ２結合モノマーのアミ
ノ酸配列を示す。
配列番号２７は、Ｆ８Ｒ１－２ｘ．９メガヌクレアーゼＦ８Ｒ２結合モノマーのアミノ
酸配列を示す。
配列番号２８は、Ｆ８Ｒ３－４ｘ．４３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２９は、Ｆ８Ｒ３－４ｘ．７０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３０は、Ｆ８Ｒ３－４ｘ．４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３１は、Ｆ８Ｒ３－４Ｌ．５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３２は、Ｆ８Ｒ３－４ｘ．４３メガヌクレアーゼＦ８Ｒ３結合モノマーのアミ
ノ酸配列を示す。
配列番号３３は、Ｆ８Ｒ３－４ｘ．７０メガヌクレアーゼＦ８Ｒ３結合モノマーのアミ
ノ酸配列を示す。
配列番号３４は、Ｆ８Ｒ３－４ｘ．４メガヌクレアーゼＦ８Ｒ３－結合モノマーのアミ
ノ酸配列を示す。
配列番号３５は、Ｆ８Ｒ３－４Ｌ．５メガヌクレアーゼＦ８Ｒ３結合モノマーのアミノ
酸配列を示す。
配列番号３６は、Ｆ８Ｒ３－４ｘ．４３メガヌクレアーゼＦ８Ｒ４結合モノマーのアミ
ノ酸配列を示す。
配列番号３７は、Ｆ８Ｒ３－４ｘ．７０メガヌクレアーゼＦ８Ｒ４結合モノマーのアミ
ノ酸配列を示す。
配列番号３８は、Ｆ８Ｒ３－４ｘ．４メガヌクレアーゼＦ８Ｒ４結合モノマーのアミノ
酸配列を示す。
配列番号３９は、Ｆ８Ｒ３－４Ｌ．５メガヌクレアーゼＦ８Ｒ４結合モノマーのアミノ
酸配列を示す。
配列番号４０は、Ｆ８Ｒ９－１０ｘ．７０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４１は、Ｆ８Ｒ９－１０ｘ．３８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４２は、Ｆ８Ｒ９－１０ｘ．２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４３は、Ｆ８Ｒ９－１０ｘ．８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４４は、Ｆ８Ｒ９－１０ｘ．７０メガヌクレアーゼＦ８Ｒ９結合モノマーのア
ミノ酸配列を示す。
配列番号４５は、Ｆ８Ｒ９－１０ｘ．３８メガヌクレアーゼＦ８Ｒ９結合モノマーのア
ミノ酸配列を示す。
配列番号４６は、Ｆ８Ｒ９－１０ｘ．２メガヌクレアーゼＦ８Ｒ９結合モノマーのアミ
ノ酸配列を示す。
配列番号４７は、Ｆ８Ｒ９－１０ｘ．８メガヌクレアーゼＦ８Ｒ９結合モノマーのアミ
ノ酸配列を示す。
配列番号４８は、Ｆ８Ｒ９－１０ｘ．７０メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１０結合モノマーの
アミノ酸配列を示す。
配列番号４９は、Ｆ８Ｒ９－１０ｘ．３８メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１０結合モノマーの
アミノ酸配列を示す。
配列番号５０は、Ｆ８Ｒ９－１０ｘ．２メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１０結合モノマーのア
ミノ酸配列を示す。
配列番号５１は、Ｆ８Ｒ９－１０ｘ．８メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１０結合モノマーのア
ミノ酸配列を示す。
配列番号５２は、Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．５６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５３は、Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．６９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５４は、Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．６６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５５は、Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．４１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５６は、Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．５６メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１１結合モノマー
のアミノ酸配列を示す。
配列番号５７は、Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．６９メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１１結合モノマー
のアミノ酸配列を示す。
配列番号５８は、Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．６６メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１１結合モノマー
のアミノ酸配列を示す。
配列番号５９は、Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．４１メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１１結合モノマー
のアミノ酸配列を示す。
配列番号６０は、Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．５６メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１２結合モノマー
のアミノ酸配列を示す。
配列番号６１は、Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．６９メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１２結合モノマー
のアミノ酸配列を示す。
配列番号６２は、Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．６６メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１２結合モノマー
のアミノ酸配列を示す。
配列番号６３は、Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．４１メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１２結合モノマー
のアミノ酸配列を示す。
配列番号６４は、Ｆ８Ｒ１３－１４ｘ．１３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６５は、Ｆ８Ｒ１３－１４ｘ．３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６６は、Ｆ８Ｒ１３－１４ｘ．１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６７は、Ｆ８Ｒ１３－１４ｘ．１１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６８は、Ｆ８Ｒ１３－１４ｘ．１３メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１３結合モノマー
のアミノ酸配列を示す。
配列番号６９は、Ｆ８Ｒ１３－１４ｘ．３メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１３結合モノマーの
アミノ酸配列を示す。
配列番号７０は、Ｆ８Ｒ１３－１４ｘ．１メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１３結合モノマーの
アミノ酸配列を示す。
配列番号７１は、Ｆ８Ｒ１３－１４ｘ．１１メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１３結合モノマー
のアミノ酸配列を示す。
配列番号７２は、Ｆ８Ｒ１３－１４ｘ．１３メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１４結合モノマー
のアミノ酸配列を示す。
配列番号７３は、Ｆ８Ｒ１３－１４ｘ．３メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１４結合モノマーの
アミノ酸配列を示す。
配列番号７４は、Ｆ８Ｒ１３－１４ｘ．１メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１４結合モノマーの
アミノ酸配列を示す。
配列番号７５は、Ｆ８Ｒ１３－１４ｘ．１１メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１４結合モノマー
のアミノ酸配列を示す。
配列番号７６は、Ｆ８Ｒ１５－１６ｘ．１４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７７は、Ｆ８Ｒ１５－１６ｘ．８５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７８は、Ｆ８Ｒ１５－１６ｘ．４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７９は、Ｆ８Ｒ１５－１６ｘ．７９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号８０は、Ｆ８Ｒ１５－１６ｘ１４メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１５結合モノマーの
アミノ酸配列を示す。
配列番号８１は、Ｆ８Ｒ１５－１６ｘ．８５メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１５結合モノマー
のアミノ酸配列を示す。
配列番号８２は、Ｆ８Ｒ１５－１６ｘ．４メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１５結合モノマーの
アミノ酸配列を示す。
配列番号８３は、Ｆ８Ｒ１５－１６ｘ．７９メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１５結合モノマー
のアミノ酸配列を示す。
配列番号８４は、Ｆ８Ｒ１５－１６ｘ．１４メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１６結合モノマー
のアミノ酸配列を示す。
配列番号８５は、Ｆ８Ｒ１５－１６ｘ．８５メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１６結合モノマー
のアミノ酸配列を示す。
配列番号８６は、Ｆ８Ｒ１５－１６ｘ．４メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１６結合モノマーの
アミノ酸配列を示す。
配列番号８７は、Ｆ８Ｒ１５－１６ｘ．７９メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１６結合モノマー
のアミノ酸配列を示す。
配列番号８８は、Ｕ１プライマーの核酸配列を示す。
配列番号８９は、Ｄ１プライマーの核酸配列を示す。
配列番号９０は、Ｕ３プライマーの核酸配列を示す。
配列番号９１は、ＦＷＤ１プライマーの核酸配列を示す。
配列番号９２は、ＲＥＶ１プライマーの核酸配列を示す。
配列番号９３は、ＦＷＤ３プライマーの核酸配列を示す。
配列番号９４は、ＨＩＵプライマーの核酸配列を示す。
配列番号９５は、ＨＩＤプライマーの核酸配列を示す。
配列番号９６は、Ｈ３Ｄプライマーの核酸配列を示す。
１．１ 参考文献と定義
本明細書で言及される特許及び科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立する。本明
細書に引用されるＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む、発行された米国特許、許可さ
れた出願、公開された外国出願及び参考文献は、あたかも参照によって各々が具体的かつ
個々に組み込まれるように、参照によって同程度に本明細書に組み込まれる。
本発明は、異なる形態で実施することができ、本明細書に記載の実施形態に限定される
ものと解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が完全且つ完全であり
、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。例えば、一実施形態に関して
図示された特徴は、他の実施形態に組み込むことができ、特定の実施形態に関して図示さ
れた特徴は、その実施形態から削除することができる。更に、本明細書に示唆された実施
形態に対する多くの変形及び追加は、本開示に照らして当業者には明らかであり、それら
は本発明から逸脱しない。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明
が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書
における本発明の説明に使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのもので
あり、本発明を限定することを意図しない。
本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が
参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、又は「ｔｈｅ」は、１又は複数を意味
することができる。例えば、「ａ」細胞は単一の細胞又は多数の細胞を意味することがで
きる。
本明細書で使用される場合、特に断りのない限り、「又は」という語は、「及び／又は
」の包括的な意味で使用され、「どちらか／又は」の排他的な意味で使用されるものでは
ない。
本明細書で使用される場合、「ヌクレアーゼ」及び「エンドヌクレアーゼ」という用語
は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する天然に存在する又は操作さ
れた酵素を指すために交換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「メガヌクレアーゼ」という用語は、１２塩基対を超える
認識配列で二本鎖ＤＮＡに結合するエンドヌクレアーゼを指す。好ましくは、本発明のメ
ガヌクレアーゼの認識配列は２２塩基対である。メガヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩに由
来するエンドヌクレアーゼであってもよく、例えばＤＮＡ結合特異性、ＤＮＡ切断活性、
ＤＮＡ結合親和性、又は二量化特性に関して、天然のＩ－ＣｒｅＩに対して改変されたＩ
－ＣｒｅＩの操作された変異体を指す。そのようなＩ－ＣｒｅＩの改変された変異体を産
生する方法は、当該分野で公知である（例えば、国際公開第２００７／０４７８５９号）
。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として二本鎖ＤＮＡに結合す
る。メガヌクレアーゼはまた、一対のＤＮＡ結合ドメインがペプチドリンカーを用いて単
一のポリペプチドに接合されている「一本鎖メガヌクレアーゼ」であってもよい。「ホー
ミングエンドヌクレアーゼ」という用語は、「メガヌクレアーゼ」という用語と同義であ
る。本発明のメガヌクレアーゼは、細胞内で発現したときに実質的に非毒性であり、本明
細書に記載の方法を用いて測定すると、細胞生存率に対する有害な影響やメガヌクレアー
ゼ切断活性の有意な低下は観察されない。
本明細書で使用される場合、「一本鎖メガヌクレアーゼ」という用語は、リンカーによ
って接合された一対のヌクレアーゼサブユニットを含むポリペプチドを指す。一本鎖メガ
ヌクレアーゼは、Ｎ末端サブユニット－リンカー－Ｃ末端サブユニットの構成を有する。
２つのメガヌクレアーゼサブユニットは、一般に、アミノ酸配列において同一ではなく、
同一ではないＤＮＡ配列を認識するであろう。従って、一本鎖メガヌクレアーゼは、典型
的には、偽パリンドローム又は非パリンドローム認識配列を切断する。一本鎖メガヌクレ
アーゼは、実際には二量体ではないが、「一本鎖ヘテロ二量体」又は「一本鎖ヘテロ二量
体メガヌクレアーゼ」と呼ばれ得る。明確にするために、他に特定しない限り、「メガヌ
クレアーゼ」という用語は、二量体又は一本鎖メガヌクレアーゼを指すことができる。
本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、２つのメガヌクレアーゼサブ
ユニットを単一のポリペプチドに接合するために使用される外因性ペプチド配列を指す。
リンカーは、天然タンパク質に見出される配列を有してもよく、又は天然タンパク質には
見出されない人工配列であってもよい。リンカーは、可撓性であり、二次構造が欠如して
いてもよく、又は生理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有していてもよい
。リンカーは、米国特許第８，４４５，２５１号に包含されるものを含むが、これらに限
定されない。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１９～２１，２８～３１，
４０～４３，５２～５５，６４～６７、又は７６～７９のいずれか１つの残基１５４～１
９５を含むアミノ酸配列を有し得る。
本明細書で使用される場合、「ＴＡＬＥＮ」という用語は、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメ
インの任意の部分に融合した１６－２２個のＴＡＬドメイン反復を含むＤＮＡ結合ドメイ
ンを含むエンドヌクレアーゼを指す。
本明細書で使用される場合、「コンパクトＴＡＬＥＮ」という用語は、Ｉ－ＴｅｖＩホ
ーミングエンドヌクレアーゼの任意の部分に任意の向きで融合した１６－２２個のＴＡＬ
ドメイン反復を有するＤＮＡ結合ドメインを含むエンドヌクレアーゼを指す。
本明細書で使用される場合、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」又は「ＺＦＮ」という
用語は、ＦｏｋＩ制限酵素のヌクレアーゼドメインに融合したジンクフィンガーＤＮＡ結
合ドメインを含むキメラエンドヌクレアーゼを指す。ジンクフィンガードメインは、合理
的又は実験的手段により再設計されて、長さが約１８塩基対であり、２～１０塩基対で分
離した一対の９塩基対のハーフサイトを含む所定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質を産
生する。ジンクフィンガーヌクレアーゼによる切断は、可変長の平滑末端又は５’オーバ
ーハンド（しばしば４つの塩基対）を作成することができる。
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ」という用語は、Ｃａｓ９等のカスパーゼ
と、ゲノムＤＮＡ中の認識部位にハイブリダイズすることによってカスパーゼのＤＮＡ切
断を指向するガイドＲＮＡとを含む、カスパーゼに基づくエンドヌクレアーゼを指す。
本明細書で使用される場合、「ｍｅｇａＴＡＬ」という用語は、操作された配列特異的
ホーミングエンドヌクレアーゼを有する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮ
Ａ結合ドメインを含む一本鎖エンドヌクレアーゼを指す。
本明細書で使用される場合、タンパク質に関して、「組換え」又は「操作された」とい
う用語は、タンパク質及びタンパク質を発現する細胞又は生物をコードする核酸に遺伝子
工学技術を適用した結果として、変化したアミノ酸配列を有することを意味する。核酸に
関して、「組換え」又は「操作された」という用語は、遺伝子工学技術を適用した結果と
して変化した核酸配列を有することを意味する。遺伝子工学技術には、限定されるもので
はないが、ＰＣＲ及びＤＮＡクローニング技術、トランスフェクション、形質転換及び他
の遺伝子導入技術、相同組換え、部位特異的突然変異誘発、並びに遺伝子融合が含まれる
。この定義に従って、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種
宿主におけるクローニング及び発現によって産生されたタンパク質は、組換え体とはみな
さない。
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、同種の遺伝子の対立遺伝子集団
における最も一般的な天然の対立遺伝子（即ち、ポリヌクレオチド配列）を指し、ここで
、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドは、その元の機能を有する。「野
生型」という用語は、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドも指す。野生
型対立遺伝子（即ち、ポリヌクレオチド）及びポリペプチドは、野生型配列に対して１又
は複数の変異及び／又は置換を含む変異体又は変異体の対立遺伝子及びポリペプチドと区
別される。野生型対立遺伝子又はポリペプチドは、生物に正常な表現型を付与することが
できるが、突然変異体又は変異体の対立遺伝子又はポリペプチドは、場合によっては、変
化した表現型を付与することができる。野生型ヌクレアーゼは、組換え体又は天然に存在
しないヌクレアーゼとは区別される。「野生型」という用語は、特定の遺伝子の野生型対
立遺伝子、あるいは比較目的のために使用される細胞、生物、及び／又は被験体を有する
細胞、生物、及び／又は被験体を指すこともできる。
本明細書で使用される場合、「遺伝子改変」という用語は、細胞又は生物、あるいはそ
れらの祖先において、ゲノムＤＮＡ配列が組換え技術によって故意に改変されたものを指
す。本明細書で使用される場合、「遺伝子改変」という用語は、「トランスジェニック」
という用語を包含する。
組換えタンパク質に関して本明細書で使用される場合、「改変」という用語は、参照配
列（例えば、野生型配列又は天然配列）に対する組換え配列中のアミノ酸残基の挿入、欠
失、又は置換を意味する。
本明細書で使用される場合、「認識配列」という用語は、エンドヌクレアーゼによって
結合及び切断されるＤＮＡ配列をいう。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、４つの塩
基対によって分離された一対の逆位９塩基対「ハーフサイト」を含む。一本鎖メガヌクレ
アーゼの場合、タンパク質のＮ末端ドメインは第１のハーフサイトに接触し、タンパク質
のＣ末端ドメインは第２のハーフサイトに接触する。メガヌクレアーゼによる切断は、４
塩基対の３’「オーバーハング」を生じる。「オーバーハング」又は「粘着末端」は、二
本鎖ＤＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断によって産生することができる短い一本鎖ＤＮ
Ａセグメントである。Ｉ－ＣｒｅＩに由来するメガヌクレアーゼ及び一本鎖メガヌクレア
ーゼの場合、オーバーハングは、２２塩基対認識配列の塩基１０～１３を含む。コンパク
トＴＡＬＥＮの場合、認識配列は、Ｉ－ＴｅｖＩドメインによって認識される第１のＣＮ
ＮＮＧＮ配列を含み、その後に長さが４－１６塩基対の非特異的スペーサーを含み、その
後にＴＡＬエフェクタードメインによって認識される１６－２２ｂｐの長さの第２の配列
（この配列は典型的には５’Ｔ塩基を有する）を含む。コンパクトＴＡＬＥＮによる切断
は、２つの塩基対の３’オーバーハングを生じる。ＣＲＩＳＰＲの場合、認識配列は、典
型的には１６～２４塩基対の配列であり、これにガイドＲＮＡが結合してＣａｓ９切断を
誘導する。ＣＲＩＳＰＲによる切断は平滑末端を産生した。ジンクフィンガーの場合、Ｄ
ＮＡ結合ドメインは、典型的には、２～１０塩基対により分離された一対の９塩基対「ハ
ーフサイト」を含む１８ｂｐ認識配列を認識し、ヌクレアーゼによる切断は、平滑末端又
は可変長の５’オーバーハング（４塩基対であることが多い）を作り出す。
本明細書で使用する「標的部位」又は「標的配列」という用語は、ヌクレアーゼの認識
配列を含む細胞の染色体ＤＮＡの領域を指す。
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ結合親和性」又は「結合親和性」という用語は、
メガヌクレアーゼが参照ＤＮＡ分子（例えば、認識配列又は任意の配列）と非共有に関連
する傾向を意味する。結合親和性は、解離定数Ｋｄによって測定される。本明細書で使用
される場合、参照認識配列に対するヌクレアーゼのＫｄが参照ヌクレアーゼに対して統計
的に有意な（ｐ＜０．０５）量だけ増加又は減少する場合、ヌクレアーゼは「変化した」
結合親和性を有する。
本明細書で使用される場合、「特異性」という用語は、認識配列と呼ばれる特定の塩基
対の配列でのみ、又は認識配列の特定のセットにおいてのみ、二本鎖ＤＮＡ分子を認識及
び切断するメガヌクレアーゼの能力を意味する。一組の認識配列は、特定の保存された位
置又は配列モチーフを共有するが、１つ以上の位置で縮重してもよい。高度に特異的なメ
ガヌクレアーゼは、１つ又は非常に少数の認識配列のみを切断することができる。特異性
は、当該分野で公知の任意の方法によって決定することができる。本明細書で使用される
場合、メガヌクレアーゼは、生理学的条件下で参照メガヌクレアーゼ（例えば野生型）に
結合されず切断されない認識配列に結合しそれを切断する場合、又は認識配列の切断率が
参照メガヌクレアーゼに対して生物学的に有意な量（例えば、少なくとも２倍、又は２倍
～１０倍）で増加又は減少する場合には、「変化した」特異性を有する。
本明細書で使用される場合、「相同組換え」又は「ＨＲ」という用語は、二本鎖ＤＮＡ
切断が相同ＤＮＡ配列を修復鋳型として用いて修復される、天然の細胞プロセスを指す（
例えば、Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６）、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：
１９５８－１９７６）。相同ＤＮＡ配列は、内因性染色体配列又は細胞に送達された外因
性核酸であり得る。
本明細書で使用される場合、「非相同末端結合」又は「ＮＨＥＪ」という用語は、二本
鎖ＤＮＡ切断が２つの非相同ＤＮＡセグメントの直接接合によって修復される、天然の細
胞プロセスをいう（例えば、Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６）、Ｆｒｏｎｔ．Ｂ
ｉｏｓｃｉ．１１：１９５８－１９７６を参照）。非相同末端結合によるＤＮＡ修復は誤
りを起こしやすく、修復部位でのＤＮＡ配列の付加又は欠失が頻繁に起こる。いくつかの
例では、標的認識配列における切断は、標的認識部位にＮＨＥＪを生じる。遺伝子のコー
ド配列中の標的部位のヌクレアーゼ誘導切断に続くＮＨＥＪによるＤＮＡ修復によって、
フレームシフト突然変異等、コード配列への突然変異を導入することができ、遺伝子機能
を破壊する。このように、操作されたヌクレアーゼは、細胞集団中の遺伝子を効果的にノ
ックアウトするために使用することができる。
アミノ酸配列及び核酸配列の両方に関して本明細書で使用される場合、「同一性割合」
、「配列同一性」、「類似性割合」、「配列類似性」等の用語は、整列したアミノ酸残基
又はヌクレオチド間の類似性を最大にする配列のアライメントに基づく、２つの配列の類
似性の程度の尺度を指し、これは配列のアライメントにおける同一又は類似の残基又はヌ
クレオチドの数、全ての残基又はヌクレオチドの数、及びギャップの存在及び長さの関数
である。標準的なパラメータを使用して配列類似性を決定するための様々なアルゴリズム
及びコンピュータプログラムが利用可能である。本明細書で使用される場合、配列類似性
は、アミノ酸配列のＢＬＡＳＴｐプログラム及び核酸配列のＢＬＡＳＴｎプログラムを用
いて測定され、両方ともＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて利用可能であり（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ
．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）、Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ｇｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｔｅｓ（１９９３
）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２；Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１
９９６）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅ
ｔ ａｌ．（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３ ８９－３
４０２；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００）、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７（１
－２）：２０３－１４に記載されている。本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配
列の類似性割合は、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムのパラメータ、即ち、ワードサイズ＝３、
ギャップオープニングペナルティ＝－１１、ギャップ伸長ペナルティ＝－１、及びスコア
リングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２に基づくスコアである。本明細書で使用される場
合、２つの核酸配列の類似性割合は、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズムのパラメータ、即ち、ワ
ードサイズ＝１１、ギャップオープニングペナルティ＝－５、ギャップ伸長ペナルティ＝
－２、マッチ報酬＝１、及びミスマッチペナルティ＝－３に基づくスコアである。
２つのタンパク質又はアミノ酸配列の改変に関して本明細書で使用される場合、「対応
する」という用語は、第１のタンパク質における特定の改変が第２のタンパク質における
改変と同じアミノ酸残基の置換であり、第１のタンパク質における改変のアミノ酸位置は
、２つのタンパク質が標準的な配列アライメント（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを用
いて）に供される場合に、第２のタンパク質における改変のアミノ酸位置に対応するか、
又は整列することを示すために使用される。従って、配列アライメントにおいて残基Ｘ及
び残基Ｙが互いに対応する場合には、第１のタンパク質におけるアミノ酸「Ａ」に対する
残基「Ｘ」の修飾は、第２のタンパク質におけるアミノ酸「Ａ」に対する残基「Ｙ」の修
飾に対応し、残基Ｘ及び残基Ｙは異なる数であってもよい。
本明細書で使用される場合、「認識ハーフサイト」、「認識配列ハーフサイト」、又は
単に「ハーフサイト」という用語は、ホモ二量体又はヘテロ二量体メガヌクレアーゼのモ
ノマーによって、又は一本鎖メガヌクレアーゼの１つのサブユニットによって認識される
、二本鎖ＤＮＡ分子中の核酸配列を意味する。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、比較的高い変動性を有する
アミノ酸を含むメガヌクレアーゼモノマー又はサブユニット内の局在配列を指す。超可変
領域は、約５０～６０個の連続残基、約５３～５７個の連続残基、又は好ましくは約５６
残基を含むことができる。いくつかの実施形態では、超可変領域の残基は、配列番号１９
～２１，２８～３１，４０～４３，５２～５５，６４～６７，又は７６－７９のいずれか
１つの位置２４－７９又は位置２１５－２７０に対応し得る。超可変領域は、認識配列中
のＤＮＡ塩基に接触する１以上の残基を含むことができ、単量体又はサブユニットの塩基
選択を変化させるように改変することができる。超可変領域はまた、メガヌクレアーゼが
二本鎖ＤＮＡ認識配列と関連するときにＤＮＡ骨格に結合する１つ以上の残基を含むこと
ができる。そのような残基は、ＤＮＡ骨格及び標的認識配列に対するメガヌクレアーゼの
結合親和性を変化させるように改変することができる。本発明の異なる実施形態では、超
可変領域は、変動性を示す１～２０残基を含み、塩基選択及び／又はＤＮＡ結合親和性に
影響を及ぼすように改変することができる。特定の実施形態では、超可変領域は、可変性
を示す約１５～１８残基を含み、塩基選択及び／又はＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼすよ
うに改変することができる。いくつかの実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列
番号１９～２１，２８～３１，４０～４３，５２～５５，６４～６７、又は７６～７９の
いずれか１つの位置２４，２６，２８，３０，３２，３３，３８，４０，４２，４４，４
６，６８，７０，７２，７３，７５，及び７７の１つ以上に対応する。他の実施形態では
、超可変領域内の可変残基は、配列番号１９～２１，２８～３１，４０～４３，５２～５
５，６４～６７、又は７６～７９のいずれか１つの位置２１５，２１７，２１９，２２１
，２２３，２２４，２２９，２３１，２３３，２３５，２３７，２５９，２６１，２６３
，２６４，２６６，及び２６８の１つ以上に対応する。
本明細書で使用される場合、「第ＶＩＩＩ因子遺伝子」、「Ｆ８遺伝子」等の用語は、
凝固第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする、Ｘ染色体上に位置付けられた遺伝子を指す
。ヒトでは、遺伝子ＩＤ番号２１５７としてＮＣＢＩによって同定された第ＶＩＩＩ因子
遺伝子は、Ｘ染色体上の塩基対１５４，８３５，７８８から塩基対１５５，０２６，９３
４に位置付けられる。イヌでは、第ＶＩＩＩ因子遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０
０１００３２１２．１によって同定される遺伝子であり得る。「第ＶＩＩＩ因子遺伝子」
という用語は、野生型第ＶＩＩＩ因子遺伝子と、機能的な第ＶＩＩＩ因子タンパク質の産
生を可能にする天然に存在する多型及び／又は突然変異を含む第ＶＩＩＩ因子遺伝子の両
方を含み得ることが理解される。
本明細書で使用する場合、「ｉｎｔ２２ｈ－１」及び「ｉｎｔ２２ｈ－１配列」という
用語は、約９．５ｋｂのサイズを有する第ＶＩＩＩ因子遺伝子のイントロン２２内に位置
する配列を指し（Ｂａｇｎａｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔ
ｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ４：５９１－５９８）、Ｇｅｎ
Ｂａｎｋにより受託番号ＡＹ６１９９９９．１として同定されたヒト配列を更に指すこと
ができる。ｉｎｔ２２ｈ－１配列は、ＣｐＧアイランド、Ｈ２ＡＦＢ１ヒストンタンパク
質のコード配列、及び第ＶＩＩＩ因子関連タンパク質１（Ｆ８Ａ１、イントロン２２タン
パク質とも呼ばれる）のコード配列を含むことを特徴とする。ｉｎｔ２２ｈ－１配列は、
Ｘ染色体上の第ＶＩＩＩ因子遺伝子のテロメアに位置する少なくとも１つの反復配列と同
一であるか、又はそれと高い相同性を有するとして更に特徴付けられる。ヒトでは、ｉｎ
ｔ２２ｈ－２及びｉｎｔ２２ｈ－３と呼ばれる２つの反復配列が、Ｘ染色体上の第ＶＩＩ
Ｉ因子遺伝子のテロメアに位置している。本発明の特定の実施形態では、ヒトｉｎｔ２２
ｈ－１配列は配列番号３を含むことができる。本発明の他の特定の実施形態では、イヌｉ
ｎｔ２２ｈ－１配列は、配列番号４を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「Ｆ８Ａ１コード配列」及び「イントロン２２タンパク質
コード配列」という用語は互換的に使用され、Ｆ８Ａ１タンパク質をコードする、ｉｎｔ
２２ｈ－１配列内に位置する配列を指す。Ｆ８Ａ１コード配列にはイントロンが無く、第
ＶＩＩＩ因子遺伝子とは反対方向に転写される。一実施形態では、野生型ヒトＦ８Ａ１コ
ード配列は、配列番号５を含むことができる。別の実施形態では、野生型イヌＦ８Ａ１コ
ード配列は、配列番号６を含むことができ、ヒトＦ８Ａ１コード配列と約７５％の相同性
を有する。Ｆ８Ａ１コード配列への言及は、野生型Ｆ８Ａ１配列と、機能的Ｆ８Ａ１タン
パク質の産生を可能にする天然に存在する多型及び／又は突然変異を含むＦ８Ａ１配列と
、を含むことが理解される。
本明細書で使用される場合、「逆位」及び「エクソン１－２２の逆位」という用語は、
第ＶＩＩＩ因子遺伝子のｉｎｔ２２ｈ－１配列と、Ｘ染色体上の第ＶＩＩＩ因子遺伝子の
テロメアに位置する同一又は密接に関連した逆向きの反復配列との間で染色体内相同組換
え事象が起こる、第ＶＩＩＩ因子遺伝子の突然変異を指し、エクソン２３－２６に関して
エクソン１－２２の逆位をもたらす。
本明細書で使用される場合、「復帰」という用語は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン
１－２２の逆位を含む、細胞における染色体内相同組換え事象を指し、ｉｎｔ２２ｈ－１
配列内で二本鎖切断が発生し、Ｘ染色体上の第ＶＩＩＩ因子遺伝子のテロメアにある反復
配列との組換えを促進する。このような組換えは、エクソン１－２２の修正された配向及
び機能的な野生型第ＶＩＩＩ因子遺伝子の産生を生じる。
「組換えＤＮＡ構築物」、「組換え構築物」、「発現カセット」、「発現構築物」、「
キメラ構築物」、「構築物」、及び「組換えＤＮＡ断片」という用語は、本明細書では互
換的に使用され、核酸断片である。組換え構築物は、限定されるものではないが、天然に
は一緒に見出されない調節及びコード配列を含む核酸断片の人工的な組み合わせを含む。
例えば、組換えＤＮＡ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は
同じ供給源に由来し、天然に見出されるものとは異なる様式で配置された調節配列及びコ
ード配列を含み得る。このような構築物は、単独で使用してもよく、又はベクターと組み
合わせて使用してもよい。
本明細書で使用される場合、「ベクター」又は「組換えＤＮＡベクター」は、所定の宿
主細胞においてポリペプチドをコードする配列の転写及び翻訳が可能な複製系及び配列を
含む構築物であり得る。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知の
宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依存する。ベクターは、制限なく、プラ
スミドベクター及び組換えＡＡＶベクター、又は本発明のメガヌクレアーゼをコードする
遺伝子を標的細胞に送達するのに適した当該分野で公知の任意の他のベクターを含むこと
ができる。当業者は、本発明の単離されたヌクレオチド又は核酸配列のいずれかを含む宿
主細胞を首尾よく形質転換、選択、及び増殖させるために、ベクター上に存在しなければ
ならない遺伝的要素を十分に認識している。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、ウイルスベクターを指すこともできる。
ウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイ
ルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が含まれるが、これらに限定
されない。
本明細書で使用する「対照」又は「対照細胞」は、遺伝子改変細胞の遺伝子型又は表現
型における変化を測定するための参照点を提供する細胞を指す。対照細胞は、例えば（ａ
）野生型細胞、即ち、遺伝子改変細胞を生じる遺伝子変更のための出発物質と同じ遺伝子
型の細胞、（ｂ）遺伝子改変細胞と同じ遺伝子型の細胞であるが、ヌル構築物で形質転換
された（即ち、目的の形質に対して既知の効果を有さない構築物を有する）細胞、又は（
ｃ）遺伝子改変細胞と遺伝的に同一であるが、変化した遺伝子型又は表現型の発現を誘導
する条件又は刺激又は更なる遺伝子改変に曝されていない細胞を含み得る。
本明細書で使用される場合、「自己切断」組換えＤＮＡ構築物は、エンドヌクレアーゼ
のための少なくとも１つのコード配列と、同じエンドヌクレアーゼのための少なくとも１
つの認識配列とを含む、ＤＮＡ構築物を指す。細胞内で発現すると（即ち、インビボ）、
エンドヌクレアーゼは認識配列を認識して切断し、ＤＮＡ構築物の線状化をもたらす。
２つのタンパク質又はアミノ酸配列の改変に関して本明細書で使用される場合、「対応
する」という用語は、第１のタンパク質における特定の改変が第２のタンパク質における
改変と同じアミノ酸残基の置換であり、第１のタンパク質における改変のアミノ酸位置は
、２つのタンパク質が標準的な配列アライメント（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを用
いて）に供される場合に、第２のタンパク質における改変のアミノ酸位置に対応するか、
又は整列することを示すために使用される。従って、配列アライメントにおいて残基Ｘ及
び残基Ｙが互いに対応する場合には、第１のタンパク質におけるアミノ酸「Ａ」に対する
残基「Ｘ」の修飾は、第２のタンパク質におけるアミノ酸「Ａ」に対する残基「Ｙ」の修
飾に対応し、残基Ｘ及び残基Ｙは異なる数であってもよい。
本明細書で使用される場合、「治療」又は「被験体を治療する」という用語は、野生型
被験体において第ＶＩＩＩ因子を通常発現する細胞中の第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン
１－２２の逆位を修正する目的で、本発明の操作されたヌクレアーゼ又は本発明の操作さ
れたヌクレアーゼをコードする核酸を、血友病Ａを有する被験体に投与することを指す。
このような治療は、被験体における第ＶＩＩＩ因子の循環レベルを上昇させるのに十分な
多数の細胞における第ＶＩＩＩ因子遺伝子の修正、及び被験体における血友病Ａの１以上
の症状の部分的又は完全な緩和をもたらす。「治療」又は「被験体を治療する」という用
語は、野生型第ＶＩＩＩ因子遺伝子を含む遺伝子改変細胞を本発明の方法に従って被験体
に投与することを更に指し、ここで、遺伝子改変細胞は、標的組織に送達され、被験体に
おける第ＶＩＩＩ因子の循環レベルを上昇させるのに十分な量で、第ＶＩＩＩ因子を産生
するか、又は第ＶＩＩＩ因子を産生する細胞に分化して、血友病Ａの１以上の症状の部分
的又は完全な緩和をもたらす。いくつかの態様では、本発明の操作されたヌクレアーゼ、
それをコードする核酸、又は本発明の遺伝子改変細胞は、本発明の医薬組成物の形態で治
療中に投与される。
本明細書で使用される場合、変数の数値範囲の列挙は、本発明が、その範囲内の値のい
ずれかに等しい変数で実施され得ることを伝えることを意図する。従って、本質的に離散
的な変数の場合、変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の整数値に等しくなり得る
。同様に、本質的に連続する変数の場合、変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の
実数値と等しくなり得る。限定ではなく例として、０と２の間の値を有すると記載される
変数は、変数が本質的に離散的である場合には、０、１、又は２の値を取ることができ、
変数が本質的に連続している場合には、０．０、０．１、０．０１、０．００１、又は≧
０且つ≦２である任意の他の実数値を取ることができる。
２．１ 本発明の原理
本発明は、部分的に、操作されたヌクレアーゼが、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１
－２２の逆位を修正することによって血友病Ａを治療するために使用され得るという仮説
に基づく。より具体的には、ヌクレアーゼは、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のｉｎｔ２２ｈ－１
配列内に存在する認識配列を認識し切断して、二本鎖切断を生じるように操作することが
できる。次いで、ｉｎｔ２２ｈ－１配列と、Ｘ染色体上の第ＶＩＩＩ因子遺伝子のテロメ
アにある反復配列との間で、染色体内相同組換えが起こり、被験体の標的細胞中に、エク
ソン１－２２の復帰と、機能的な野生型第ＶＩＩＩ因子遺伝子の産生とが生じる。
本発明はまた、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１－２２の逆位を含む多能性細胞（例
えば、誘導された多能性幹（ｉＰＳ）細胞）は、上記の同じメカニズムによって第ＶＩＩ
Ｉ因子遺伝子を修正するために得ることができ、本発明の操作されたヌクレアーゼ（又は
それをコードする核酸）に接触させることができるという仮説にも部分的に基づく。次い
で、このような多能性細胞を、血友病Ａを有する被験体に投与することができ、ここで、
細胞は標的組織（例えば、肝臓又は循環系）に送達され、被験体において野生型第ＶＩＩ
Ｉ因子を発現する細胞に分化する。
従って、本発明は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のｉｎｔ２２ｈ－１配列内の認識配列を認識
し切断する、操作されたヌクレアーゼ、特に操作された組換えメガヌクレアーゼを包含す
る。本発明はまた、遺伝子改変細胞を作製するためにこのような操作されたヌクレアーゼ
を使用する方法、並びに医薬組成物及び血友病Ａの治療方法におけるこのような細胞の使
用を包含する。更に、本発明は、操作されたヌクレアーゼタンパク質、操作されたヌクレ
アーゼをコードする核酸、又は本発明の遺伝子改変細胞を含む医薬組成物、及び血友病Ａ
を処置するためのこのような組成物の使用を包含する。
２．２ 第ＶＩＩＩ因子遺伝子のｉｎｔ２２ｈ－１配列内の認識配列を認識し切断するた
めのヌクレアーゼ
当分野では、部位特異的ヌクレアーゼを使用して生存細胞のゲノム中でＤＮＡ切断を行
うことが可能であり、このようなＤＮＡ切断は、ゲノム内に同一又は高度に相同なＤＮＡ
配列を有する切断された標的部位の相同組換えによって、ゲノムの永続的改変を生じさせ
ることができることは公知である。
従って、異なる実施形態では、様々な異なるタイプのエンドヌクレアーゼが本発明の実
施に有用である。一実施形態では、本発明は、操作された組換えメガヌクレアーゼを用い
て実施することができる。別の実施形態では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は
ＣＲＩＳＰＲニッカラーゼを用いて実施することができる。所定のＤＮＡ部位を認識する
ＣＲＩＳＰＲ及びＣＲＩＳＰＲニッカラーゼの作製方法は、当該分野で公知であり、例え
ば、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．８：２２８１－３０８が
挙げられる。別の実施形態では、本発明は、ＴＡＬＥＮ又はコンパクトＴＡＬＥＮを使用
して実施することができる。所定のＤＮＡ部位に結合するＴＡＬＥドメインの作製方法は
、当該分野で公知であり、例えば、Ｒｅｙｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０：４６０－５が挙げられる。別の実施形態では、本発明はジンク
フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いて実施することができる。更なる実施形態では
、本発明はｍｅｇａＴＡＬを使用して実施することができる。
好ましい実施形態では、本発明を実施するために使用されるヌクレアーゼは、一本鎖メ
ガヌクレアーゼである。一本鎖メガヌクレアーゼは、Ｎ末端サブユニットと、リンカーペ
プチドによって接合されたＣ末端サブユニットと、を含む。２つのドメインの各々は、認
識配列の半分（即ち、認識ハーフサイト）を認識し、ＤＮＡ切断の部位は、２つのサブユ
ニットの界面付近の認識配列の中央にある。ＤＮＡ鎖切断は、メガヌクレアーゼによるＤ
ＮＡ切断が４塩基対の３’一本鎖オーバーハングの対を生成するように、４塩基対によっ
て相殺される。
いくつかの例では、本発明の組換えメガヌクレアーゼは、Ｆ８Ｒ１－２認識配列（配列
番号７）を認識して切断するように操作されている。Ｆ８Ｒ１－２認識配列は、ｉｎｔ２
２ｈ－１配列及びＦ８Ａ１配列の両方の中に位置する。このような組換えメガヌクレアー
ゼは、本明細書では集合的に「Ｆ８Ｒ１－２メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的なＦ
８Ｒ１－２メガヌクレアーゼは、配列番号１９～２２に提供される。
更なる例では、本発明の組換えメガヌクレアーゼは、Ｆ８Ｒ３－４認識配列（配列番号
９）を認識して切断するように操作されている。Ｆ８Ｒ３－４認識配列は、ｉｎｔ２２ｈ
－１配列及びＦ８Ａ１配列の両方の中に位置する。このような組換えメガヌクレアーゼは
、本明細書では集合的に「Ｆ８Ｒ３－４メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的なＦ８Ｒ
３－４メガヌクレアーゼは、配列番号２８～３１に提供される。
更なる例では、本発明の組換えメガヌクレアーゼは、Ｆ８Ｒ９－１０認識配列（配列番
号１１）を認識して切断するように操作されている。このような組換えメガヌクレアーゼ
は、本明細書では集合的に「Ｆ８Ｒ９－１０メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的なＦ
８Ｒ９－１０メガヌクレアーゼは、配列番号４０～４３に提供される。
更なる例では、本発明の組換えメガヌクレアーゼは、Ｆ８Ｒ１１－１２認識配列（配列
番号１３）を認識して切断するように操作されている。このような組換えメガヌクレアー
ゼは、本明細書では集合的に「Ｆ８Ｒ１１－１２メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的
なＦ８Ｒ１１－１２メガヌクレアーゼは、配列番号５２～５５に提供される。
更なる例では、本発明の組換えメガヌクレアーゼは、Ｆ８Ｒ１３－１４認識配列（配列
番号１５）を認識して切断するように操作されている。このような組換えメガヌクレアー
ゼは、本明細書では集合的に「Ｆ８Ｒ１３－１４メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的
なＦ８Ｒ１３－１４メガヌクレアーゼは、配列番号６４～６７に提供される。
更なる例では、本発明の組換えメガヌクレアーゼは、Ｆ８Ｒ１５－１６認識配列（配列
番号１７）を認識し、切断するように操作されている。このような組換えメガヌクレアー
ゼは、本明細書では集合的に「Ｆ８Ｒ１５－１６メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的
なＦ８Ｒ１５－１６メガヌクレアーゼは、配列番号７６～７９に提供される。
本発明の組換えメガヌクレアーゼは、第１の超可変領域（ＨＶＲ１）領域を含む第１の
サブユニットと、第２の超可変領域（ＨＶＲ２）を含む第２のサブユニットと、を含む。
更に、第１のサブユニットは、認識配列の第１の認識ハーフサイト（例えば、Ｆ８Ｒ１、
Ｆ８Ｒ３、Ｆ８Ｒ９、Ｆ８Ｒ１１、Ｆ８Ｒ１３、又はＦ８Ｒ１５ハーフサイト）に結合し
、第２のサブユニットは、認識配列の第２の認識ハーフサイト（例えば、Ｆ８Ｒ２、Ｆ８
Ｒ４、Ｆ８Ｒ１０、Ｆ８Ｒ１２、Ｆ８Ｒ１４、又はＦ８Ｒ１６ハーフサイト）に結合する
。組換えメガヌクレアーゼが一本鎖メガヌクレアーゼである実施形態では、ＨＶＲ１領域
を含み第１のハーフサイトに結合する第１のサブユニットがＮ末端サブユニットとして位
置し、ＨＶＲ２領域を含み第２のハーフサイトに結合する第２のサブユニットがＣ末端サ
ブユニットとして位置するように、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを配向さ
せることができる。代替となる実施形態では、ＨＶＲ１領域を含み第１のハーフサイトに
結合する第１のサブユニットがＣ末端サブユニットとして位置し、ＨＶＲ２領域を含み第
２のハーフサイトに結合する第２のサブユニットがＮ末端サブユニットとして位置するよ
うに、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを配向させることができる。本発明の
例示的なＦ８Ｒ１－２メガヌクレアーゼを表１に示す。本発明の例示的なＦ８Ｒ３－４メ
ガヌクレアーゼを表２に示す。本発明の例示的なＦ８Ｒ９－１０メガヌクレアーゼを表３
に示す。本発明の例示的なＦ８Ｒ１１－１２メガヌクレアーゼを表４に示す。本発明の例
示的なＦ８Ｒ１３－１４メガヌクレアーゼを表５に示す。本発明の例示的なＦ８Ｒ１５－
１６メガヌクレアーゼを表６に示す。
表１．Ｆ８Ｒ１－２認識配列（配列番号７）を認識し切断するように操作された例示的な
組換えメガヌクレアーゼ
Figure 2022025081000001
＊「Ｆ８Ｒ１サブユニット％」及び「Ｆ８Ｒ２サブユニット％」は、各メガヌクレアーゼ
のＦ８Ｒ１結合及びＦ８Ｒ２結合サブユニット領域と、Ｆ８Ｒ１－２ｘ．２７メガヌクレ
アーゼのそれぞれＦ８Ｒ１結合及びＦ８Ｒ２結合サブユニット領域との間のアミノ酸配列
同一性を表す。
表２．Ｆ８Ｒ３－４認識配列（配列番号９）を認識し切断するように操作された例示的な
組換えメガヌクレアーゼ
Figure 2022025081000002
＊「Ｆ８Ｒ３サブユニット％」及び「Ｆ８Ｒ４サブユニット％」は、各メガヌクレアーゼ
のＦ８Ｒ３結合及びＦ８Ｒ４結合サブユニット領域と、Ｆ８Ｒ３－４ｘ．４３メガヌクレ
アーゼのそれぞれＦ８Ｒ３結合及びＦ８Ｒ４結合サブユニット領域との間のアミノ酸配列
同一性を表す。
表３．Ｆ８Ｒ９－１０認識配列（配列番号１１）を認識し切断するように操作された例示
的な組換えメガヌクレアーゼ
Figure 2022025081000003
＊「Ｆ８Ｒ９サブユニット％」及び「Ｆ８Ｒ１０サブユニット％」は、各メガヌクレアー
ゼのＦ８Ｒ９結合及びＦ８Ｒ１０結合サブユニット領域と、Ｆ８Ｒ９－１０ｘ．７０メガ
ヌクレアーゼのそれぞれＦ８Ｒ９結合及びＦ８Ｒ１０結合サブユニット領域との間のアミ
ノ酸配列同一性を表す。
表４．Ｆ８Ｒ１１－１２認識配列（配列番号１３）を認識し切断するように操作された例
示的な組換えメガヌクレアーゼ
Figure 2022025081000004
＊「Ｆ８Ｒ１１サブユニット％」及び「Ｆ８Ｒ１２サブユニット％」は、各メガヌクレア
ーゼのＦ８Ｒ１１結合及びＦ８Ｒ１２結合サブユニット領域と、Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．５
６メガヌクレアーゼのそれぞれＦ８Ｒ１１結合及びＦ８Ｒ１２結合サブユニット領域との
間のアミノ酸配列同一性を表す。
表５．Ｆ８Ｒ１３－１４認識配列（配列番号１５）を認識し切断するように操作された例
示的な組換えメガヌクレアーゼ
Figure 2022025081000005
＊「Ｆ８Ｒ１３サブユニット％」及び「Ｆ８Ｒ１４サブユニット％」は、各メガヌクレア
ーゼのＦ８Ｒ１３結合及びＦ８Ｒ１４結合サブユニット領域と、Ｆ８Ｒ１３－１４ｘ．１
３メガヌクレアーゼのそれぞれＦ８Ｒ１３結合及びＦ８Ｒ１４結合サブユニット領域との
間のアミノ酸配列同一性を表す。
表６．Ｆ８Ｒ１５－１６認識配列（配列番号１７）を認識し切断するように操作された例
示的な組換えメガヌクレアーゼ
Figure 2022025081000006
＊「Ｆ８Ｒ１５サブユニット％」及び「Ｆ８Ｒ１６サブユニット％」は、各メガヌクレア
ーゼのＦ８Ｒ１５結合及びＦ８Ｒ１６結合サブユニット領域と、Ｆ８Ｒ１５－１６ｘ．１
４メガヌクレアーゼのそれぞれＦ８Ｒ１５結合及びＦ８Ｒ１６結合サブユニット領域との
間のアミノ酸配列同一性を表す。
２．３ エンドヌクレアーゼの送達方法及び発現方法
本発明は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のイントロン２２配列内に見出される認識配列を認識
し切断する操作されたヌクレアーゼを用いて遺伝子改変細胞を産生する方法を提供する。
本発明は更に、薬学的に許容される担体と、本発明の操作されたヌクレアーゼ（又は操作
されたヌクレアーゼをコードする核酸）と、を含む医薬組成物を投与することによって、
被験体における血友病Ａを治療する方法を提供する。いずれの場合においても、本発明は
、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１－２２の逆位を含み、且つ典型的には第ＶＩＩＩ因
子を健康な被験体において発現する適切な細胞（例えば、肝類洞内皮細胞若しくは造血内
皮細胞、又はそれらに分化する前駆細胞）のＤＮＡ／ＲＮＡに、本発明の操作されたヌク
レアーゼが送達可能及び／又は発現可能であることが必要である。
本発明の操作されたヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、又は好ましくは、操作され
たヌクレアーゼをコードする核酸として、細胞に送達することができる。このような核酸
は、ＤＮＡ（例えば、環状若しくは線状プラスミドＤＮＡ又はＰＣＲ産物）又はＲＮＡ（
例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。操作されたヌクレアーゼコード配列がＤＮＡ形態で送達
される実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ遺伝子の転写を促進する
ためにプロモーターに作動可能に連結されるべきである。本発明に適した哺乳動物プロモ
ーターは、サイトメガロウイルス初期（ＣＭＶ）プロモーター（Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ
ａｌ．（１９８４）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８１（３）：６
５９－６３）又はＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ及びＣｈａｍｂｏｎ（１９
８１）、Ｎａｔｕｒｅ．２９０（５８０４）：３０４－１０）等の構成型プロモーター、
並びにテトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｄｉｎｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１
９９２）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２（９）：４０３８－４５）等の誘導性プロ
モーターを含む。本発明の操作されたヌクレアーゼはまた、合成プロモーターに作動可能
に連結され得る。合成プロモーターには、ＪｅＴプロモーター（国際公開第２００２／０
１２５１４号）が含まれるが、これに限定されない。
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、操作されたヌ
クレアーゼをコードする遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれる可能性を低減するため、細
胞に送達される。操作されたヌクレアーゼをコードするこのようなｍＲＮＡは、インビト
ロ転写等の当該分野で公知の方法を用いて産生させることができる。いくつかの実施形態
において、ｍＲＮＡは、７－メチル－グアノシンを用いてキャップされる。いくつかの実
施形態では、ｍＲＮＡはポリアデニル化されていてもよい。
別の特定の実施形態において、本発明のエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、一本
鎖ＤＮＡ鋳型を用いて細胞に導入することができる。一本鎖ＤＮＡは、操作されたヌクレ
アーゼをコードする配列の上流及び／又は下流に５’及び／又は３’ＡＡＶ逆位末端反復
（ＩＴＲ）を更に含むことができる。他の実施形態では、一本鎖ＤＮＡは、操作されたヌ
クレアーゼをコードする配列の上流及び／又は下流に５’及び／又は３’相同性アームを
更に含むことができる。
別の特定の実施形態では、本発明のエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子は、線状化
したＤＮＡ鋳型を用いて細胞に導入することができる。いくつかの例では、エンドヌクレ
アーゼをコードするプラスミドＤＮＡは、環状プラスミドＤＮＡが細胞に導入される前に
線状化するように、１以上の制限酵素によって消化され得る。
別の特定の実施形態では、本発明のエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子は、自己切
断性組換えＤＮＡ構築物上の細胞に導入することができる。このような構築物は、エンド
ヌクレアーゼのための少なくとも１つのコード配列と、同じエンドヌクレアーゼのための
少なくとも１つの認識配列とを含むことができる。細胞内で発現すると（即ち、インビボ
）、エンドヌクレアーゼは認識配列を認識して切断し、ＤＮＡ構築物の線状化をもたらす
。
精製されたヌクレアーゼタンパク質は、本明細書で以下に更に詳述されるものを含む、
当技術分野で公知の種々の異なるメカニズムによってゲノムＤＮＡを切断するために、細
胞に送達することができる。
本発明の組換えメガヌクレアーゼを送達するための標的組織には、肝臓の細胞、好まし
くは肝類洞内皮細胞、あるいは肝類洞内皮細胞に分化する前駆細胞が含まれるが、これら
に限定されない。標的組織は、循環系の細胞、好ましくは造血内皮細胞、あるいは造血内
皮細胞に分化する前駆細胞も含むことができるが、これらに限定されない。考察したよう
に、本発明のエンドヌクレアーゼは、精製タンパク質として、又はエンドヌクレアーゼを
コードするＲＮＡもしくはＤＮＡとして送達することができる。一実施形態では、エンド
ヌクレアーゼタンパク質、又はｍＲＮＡ、又はエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡベ
クターは、標的組織に直接的に注射を介して標的細胞（例えば、肝臓の細胞又は循環系の
細胞）に供給される。あるいは、エンドヌクレアーゼタンパク質、ｍＲＮＡ、又はＤＮＡ
は、循環系を介して全身的に送達することができる。
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼを
コードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、公知の技術に従って、薬学的に許容される担体中に、全
身投与又は標的組織への投与のために製剤化される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈ
ｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ
ｅｄ．２００５）を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において、タンパク質／
ＲＮＡ／ｍＲＮＡは、典型的には、薬学的に許容される担体と混合される。担体はもちろ
ん、製剤中の他の成分と適合性があるという意味で許容されなければならず、患者に有害
であってはならない。担体は、固体若しくは液体、又はその両方であってもよく、単位用
量製剤として化合物と共に製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼを
コードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、細胞浸透性ペプチド又は標的リガンドに結合され、細胞
取り込みを促進する。当該分野で公知の細胞浸透性ペプチドの例には、ポリアルギニン（
Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．
１６：１６２４－９）、ＨＩＶウイルス由来のＴＡＴペプチド（Ｈｕｄｅｃｚ ｅｔ ａ
ｌ．（２００５）、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２５：６７９－７３６）、ＭＰＧ（Ｓｉｍ
ｅｏｎｉ、ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７
１７－２７２４）、Ｐｅｐ－１（Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：７６９８－７７０６、及びＨＳＶ－１ ＶＰ－２２（Ｄｅｓｈ
ａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６２：１８
３９－４９）が含まれる。別の実施形態では、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエン
ドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、エンドヌクレアーゼタンパク質／ＤＮ
Ａ／ｍＲＮＡが標的細胞に結合し、且つ標的細胞によって内在化されるように、標的細胞
上に発現される特異的細胞表面受容体を認識する抗体に共有結合的又は非共有結合的に結
合される。あるいは、エンドヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡは、このような
細胞表面受容体の天然リガンド（又は天然リガンドの一部）に共有結合的又は非共有結合
的に結合することができる。（ＭｃＣａｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｔｉｓｓｕｅ
Ｂａｒｒｉｅｒｓ．２（４）：ｅ９４４４４９；Ｄｉｎｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）
Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２６４－７４；Ｋａｎｇ ｅｔ
ａｌ．（２０１４）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５ （３）：２
２０－３０； Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ
Ｍｅｔａｂ Ｔｏｘｉｃｏｌ．１０（１１）：１４９１－５０８）。
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼを
コードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、肝臓の所望の領域内に（例えば、肝類洞内皮細胞若しく
は造血内皮細胞、又はそれらに分化する前駆細胞に近接して）注射又は移植するための生
分解性ヒドロゲル内にカプセル化される。ヒドロゲルは、頻繁な注射を必要とせずに、標
的組織の所望の領域に治療ペイロードの持続的且つ調整可能な放出を提供することができ
、刺激応答性材料（例えば温度応答性ヒドロゲル及びｐＨ応答性ヒドロゲル）は、環境的
又は外因的に当てはまる合図に応答してペイロードを放出するように設計することができ
る（Ｋａｎｇ Ｄｅｒｗｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｔｒａｎｓ Ａｍ Ｏｐｈｔ
ｈａｌｍｏｌ Ｓｏｃ．１０６：２０６－２１４）。
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼを
コードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、当技術分野で公知の方法を用いて、ナノ粒子に共有結合
的に、好ましくは非共有結合的に結合するか、あるいはそのようなナノ粒子内にカプセル
化される（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２
０１４）。ナノ粒子は、その長さスケールが＜１μｍ、好ましくは＜１００ｎｍであるナ
ノスケール送達システムである。このようなナノ粒子は、金属、脂質、ポリマー、又は生
物学的高分子から構成されるコアを用いて設計されてもよく、エンドヌクレアーゼタンパ
ク質、ｍＲＮＡ又はＤＮＡの複数のコピーをナノ粒子コアに結合させるか又はカプセル化
することができる。これは、各細胞に送達されるタンパク質／ｍＲＮＡ／ＤＮＡのコピー
数を増加させ、従って、各エンドヌクレアーゼの細胞内発現を増加させて、標的認識配列
が切断される可能性を最大にする。このようなナノ粒子の表面をポリマー又は脂質（例え
ば、キトサン、カチオン性ポリマー、又はカチオン性脂質）で更に修飾して、表面が追加
の官能性を付与するコア－シェルナノ粒子を形成して、細胞送達及びペイロードの取り込
みを増強してもよい（Ｊｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．
３３（３０）：７６２１－３０）。有利には、ナノ粒子を標的化分子に更に結合させて、
ナノ粒子を適切な細胞型に導き、及び／又は細胞取り込みの可能性を高めてもよい。その
ような標的化分子の例には、細胞表面受容体に特異的な抗体、及び細胞表面受容体の天然
リガンド（又は天然リガンドの一部）が含まれる。
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼを
コードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、カチオン性脂質を用いてリポソーム内にカプセル化又は
複合化される（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ； Ｚｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２
０１５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。３３：７３－８０； Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａ
ｌ．（２０１１）Ｊ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２０１１：８６３７３４を参照）。リポソ
ーム及びリポプレックス製剤は、ペイロードを分解から保護し、標的部位での蓄積及び保
持を促進し、標的細胞の細胞膜との融合及び／又は破壊により細胞の取り込み及び送達効
率を促進することができる。
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼを
コードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ポリマー足場（例えば、ＰＬＧＡ）内にカプセル化され
るか、又はカチオン性ポリマー（例えばＰＥＩ、ＰＬＬ）を用いて複合化される（Ｔａｍ
ｂｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｔｈｅｒ Ｄｅｌｉｖ．２（４）：５２３－５３６
）。ポリマー担体は、ポリマー侵食及び薬物拡散の制御によって調整可能な薬物放出速度
を提供するように設計することができ、高効率の薬物カプセル化によって、所望の標的細
胞集団への細胞内送達まで治療有効量の保護を提供することができる。
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼタンパク質、又は組換えメガヌクレ
アーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ミセルに自己集合する両親媒性分子と組み合わ
される（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９（１１）：９５
６－６６）。ポリマーミセルは、親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）で
形成されたミセルシェルを含んでもよく、親水性ポリマーは、凝集を防止し、電荷相互作
用をマスクし、非特異的相互作用を減少させることができる。
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼを
コードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、標的細胞への投与及び／又は送達のために、エマルジョ
ン又はナノエマルジョン（即ち、平均粒子直径＜１ｎｍ）に製剤化される。「エマルジョ
ン」という用語は、限定するものではないが、水中油型、油中水型、水中油中水型、又は
油中水中油型の分散液又は液滴を指し、水不混和相が水相と混合されると、無極性残基（
例えば、長い炭化水素鎖）を水から離れるように移動させ、極性頭部基を水に向かって移
動させる疎水力の結果として形成することができる脂質構造体を含む。これらの他の脂質
構造体には、単層、少重膜（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌｌａｒ）層、及び多重層脂質小胞体、
ミセル及びラメラ相が含まれるが、これらに限定されない。エマルジョンは、水相及び親
油相（典型的には油及び有機溶媒を含有する）から構成される。エマルジョンはまた、１
種以上の界面活性剤を含有することが多い。ナノエマルジョン製剤は、例えば、米国特許
出願第２００２／００４５６６７号及び第２００４／００４３０４１号、並びに米国特許
第６，０１５，８３２号、第６，５０６，８０３号、第６，６３５，６７６号、及び第６
，５５９，１８９号に記載されているように周知であり、これらの各々は参照によりその
全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼを
コードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、多官能性ポリマー結合体、ＤＮＡデンドリマー、及びポ
リマーデンドリマーに共有結合しているか、又は非共有結合している（Ｍａｓｔｏｒａｋ
ｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｎｏｓｃａｌｅ．７（９）：３８４５－５６、Ｃｈ
ｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．９７（１）：１２３－４３
）。デンドリマー生成は、ペイロードの容量及びサイズを制御することができ、高い薬物
ペイロード容量を提供することができる。更に、複数の表面基の提示を利用して、安定性
を改善し、非特異的相互作用を低減し、細胞特異的標的化及び薬物放出を増強することが
できる。
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子は、ウイルスベ
クターを用いて送達される。そのようなベクターは、当技術分野で公知であり、レトロウ
イルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウ
イルス（ＡＡＶ）ベクターが含まれる（Ｖａｎｎｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３ Ｎ
ｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１－２２）に概説されている）。いくつかの実施形態
では、ウイルスベクターは、標的組織に直接注射される。別の実施形態では、ウイルスベ
クターは、循環系を介して全身に送達される。当分野では、異なるＡＡＶベクターが異な
る組織に局在する傾向があることが知られている。肝標的組織では、肝細胞の効果的な形
質導入が、例えばＡＡＶ血清型２，８，及び９で示されている（Ｓａｎｄｓ（２０１１）
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８０７：１４１－１５７）。ＡＡＶベクターはまた
、宿主細胞において第２鎖ＤＮＡ合成を必要としないように自己相補的であり得る（Ｍｃ
Ｃａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１２４８－５４）。
一実施形態では、エンドヌクレアーゼ遺伝子送達のために使用されるウイルスベクター
は、自己制限ウイルスベクターである。自己制限ウイルスベクターは、ベクター内の組換
えメガヌクレアーゼの認識配列の存在に起因して、細胞又は生物において持続時間が制限
され得る。従って、自己制限ウイルスベクターを操作して、プロモーター、本明細書に記
載のエンドヌクレアーゼ、及びＩＴＲ内のエンドヌクレアーゼ認識部位のコードを提供す
ることができる。自己制限ウイルスベクターは、エンドヌクレアーゼ遺伝子を細胞、組織
、又は生物に送達して、エンドヌクレアーゼが発現され、ゲノム内の内因性認識配列で細
胞のゲノムを切断することができるようにする。送達されたエンドヌクレアーゼはまた、
自己制限ウイルスベクター自体の中にその標的部位を見出し、この標的部位でベクターを
切断する。切断されると、ウイルスゲノムの５’及び３’末端は、エキソヌクレアーゼに
よって曝露されて分解され、ウイルスを殺し、エンドヌクレアーゼの産生を停止する。
エンドヌクレアーゼ遺伝子がＤＮＡ形態（例えばプラスミド）及び／又はウイルスベク
ター（例えばＡＡＶ）を介して送達される場合、それらはプロモーターに作動可能に連結
されなければならない。いくつかの実施形態では、これは、ウイルスベクター（例えば、
レンチウイルスベクターのＬＴＲ）又は周知のサイトメガロウイルス初期プロモーター又
はＳＶ４０ウイルス初期プロモーター由来の内因性プロモーター等のウイルスプロモータ
ーであり得る。好ましい実施形態では、メガヌクレアーゼ遺伝子は、標的細胞において遺
伝子発現を優先的に駆動するプロモーターに作動可能に連結される。肝臓特異的プロモー
ターの例としては、限定されないが、ヒトα－１抗トリプシンプロモーター及びアポリポ
タンパク質Ａ－ＩＩプロモーターが挙げられる。
１回の治療で第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１－２２が恒久的に復帰し、患者の標的
細胞の割合の中に機能性野生型遺伝子が生じることが想定される。しかし、復帰の頻度が
低い場合、又は標的細胞の大きな割合を修正する必要がある場合、各患者に複数回の治療
を行う必要があり得る。
２．４ 医薬組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体と本発明の操作されたヌ
クレアーゼ、又は薬学的に許容される担体と本発明の操作されたヌクレアーゼをコードす
る核酸を含む単離されたポリヌクレオチドとを含む、医薬組成物を提供する。他の実施形
態では、本発明は、標的組織に送達することができ、そこで次に細胞が野生型第ＶＩＩＩ
因子を発現する細胞に分化することができる、薬学的に許容される担体と、本発明の遺伝
子改変細胞と、を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、第ＶＩＩＩ因子遺
伝子のエクソン１－２２の逆位によって特徴付けられる血友病Ａを有する被験体の治療に
有用であり得る。
このような医薬組成物は、公知の技術に従って調製することができる。例えば、Ｒｅｍ
ｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍ
ａｃｙ（２１ｓｔ．ｅｄ．２００５）を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造にお
いて、エンドヌクレアーゼポリペプチド（又はそれをコードするＤＮＡ／ＲＮＡ）は、一
般的には、薬学的に許容される担体と混合され、得られた組成物が被験体に投与される。
担体はもちろん、製剤中の他の成分と適合性があるという意味で許容されなければならず
、被験体に有害であってはならない。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、
被験体における疾患の治療に有用な１以上の追加の薬剤又は生物学的分子を更に含むこと
ができる。同様に、追加の薬剤及び／又は生物学的分子は、別個の組成物として同時投与
することができる。
２．５ 組換えＡＡＶベクターの産生方法
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の方法における使用のための組換えＡ
ＡＶベクターを提供する。組換えＡＡＶベクターは、典型的には、ＨＥＫ－２９３等の哺
乳動物細胞株で産生される。ウイルスのｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子は、その自己複製
によって治療遺伝子（例えば、エンドヌクレアーゼ遺伝子）が送達される余地を作ること
を防ぐためにベクターから除去されるため、パッケージング細胞株においてトランスで供
給する必要がある。更に、複製を支持するために必要な「ヘルパー」（例えば、アデノウ
イルス）成分を提供することが必要である（Ｃｏｔｓ Ｄ、Ｂｏｓｃｈ Ａ、Ｃｈｉｌｌ
ｏｎ Ｍ（２０１３）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３（５）：３７０－８１）。し
ばしば、組換えＡＡＶベクターは、「ヘルパー」成分をコードする第１のプラスミドと、
ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子を含む第２のプラスミドと、ウイルスにパッケージングされる介
在ＤＮＡ配列を含有するウイルス性ＩＴＲを含む第３のプラスミドとで細胞株がトランス
フェクトされる、三重トランスフェクションを用いて産生される。キャプシドに包まれた
ゲノム（目的のＩＴＲ及び関与する介在遺伝子）を含むウイルス粒子は、その後、凍結融
解サイクル、超音波処理、界面活性剤、又は当技術分野で公知の他の手段によって細胞か
ら単離される。次いで、塩化セシウム密度勾配遠心分離又はアフィニティークロマトグラ
フィーを用いて粒子を精製し、続いて細胞、組織、又はヒト患者などの生物の目的の遺伝
子に送達する。
組換えＡＡＶ粒子は、典型的には細胞中に産生（製造）させるため、部位特異的エンド
ヌクレアーゼがパッケージング細胞中で発現しないことを確実にするように、本発明を実
施する際に注意を払わなければならない。本発明のウイルスゲノムは、エンドヌクレアー
ゼの認識配列を含むため、パッケージング細胞株で発現する任意のエンドヌクレアーゼは
、ウイルスゲノムがウイルス粒子にパッケージングされる前にウイルスゲノムを切断する
ことができる。このことは、パッケージング効率の低下及び／又は断片化したゲノムのパ
ッケージングを生じる。以下を含むいくつかのアプローチを使用して、パッケージング細
胞におけるエンドヌクレアーゼ発現を防止することができる。
１．エンドヌクレアーゼを、パッケージング細胞において活性ではない組織特異的プロモ
ーターの制御下に置くことができる。例えば、筋肉組織にエンドヌクレアーゼ遺伝子を送
達するためにウイルスベクターを開発する場合、筋特異的プロモーターを使用することが
できる。筋特異的プロモーターの例には、Ｃ５－１２（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００４
）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：７８３－９２）、筋特異的クレアチンキナーゼ（
ＭＣＫ）プロモーター（Ｙｕａｓａ、ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９
：１５７６－８８）、又は平滑筋２２（ＳＭ２２）プロモーター（Ｈａａｓｅ ｅｔ ａ
ｌ．（２０１３）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：４９－５４）が含まれる。ＣＮ
Ｓ（ニューロン）特異的プロモーターの例には、ＮＳＥ、シナプシン、及びＭｅＣＰ２プ
ロモーターが含まれる（Ｌｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄ
ｉｓ．４８：１７９－８８）。肝特異的プロモーターの例には、アルブミンプロモーター
（Ｐａｌｂ等）、ヒトα１－抗トリプシン（Ｐａ１ＡＴ等）、及びヘモペキシン（Ｐｈｐ
ｘ等）が含まれる（Ｋｒａｍｅｒ、ＭＧ ｅｔ ａｌ．、（２００３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ
ａｐｙ ７：３７５－８５）。眼特異的プロモーターの例には、オプシン、及び角膜上皮
特異的Ｋ１２プロモーターが含まれる（Ｍａｒｔｉｎ ＫＲＧ、Ｋｌｅｉｎ ＲＬ、及び
Ｑｕｉｇｌｅｙ ＨＡ（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ（２８）：２６７－７５）（Ｔｏｎｇ
Ｙ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ、９：９５６－６６）。これらの
プロモーター又は当該分野で公知の他の組織特異的プロモーターは、ＨＥＫ－２９３細胞
において高度に活性ではなく、従って、本発明のウイルスベクターに組み込まれた場合に
、パッケージング細胞において有意なレベルのエンドヌクレアーゼ遺伝子発現を生じるこ
とは期待されない。同様に、本発明のウイルスベクターは、不適合組織特異的プロモータ
ー（即ち、周知のＨｅＬａ細胞株（ヒト上皮細胞）及び肝特異的ヘモペキシンプロモータ
ーを用いる）の使用と共に他の細胞株を使用することを企図している。組織特異的プロモ
ーターの他の例には、滑膜肉腫ＰＤＺＤ４（小脳）、Ｃ６（肝臓）、ＡＳＢ５（筋肉）、
ＰＰＰ１Ｒ１２Ｂ（心臓）、ＳＬＣ５Ａ１２（腎臓）、コレステロール調節ＡＰＯＭ（肝
臓）、ＡＤＰＲＨＬ１（心臓）、及び一因性奇形シンドロームＴＰ７３Ｌ（筋肉）が含ま
れる。（Ｊａｃｏｘ Ｅ ｅｔ ａｌ．、（２０１０）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ｖ．５（８）
：ｅ１２２７４）。
２．代替として、ベクターは、エンドヌクレアーゼが発現されにくい異なる種に由来する
細胞にパッケージングすることができる。例えば、ウイルス粒子は、非哺乳類パッケージ
ング細胞において活性ではない、周知のサイトメガロウイルス初期プロモーター又はＳＶ
４０ウイルス初期プロモーター等の哺乳動物プロモーターを用いて、微生物、昆虫、又は
植物細胞中に産生させることができる。好ましい実施形態では、Ｇａｏらによって記載さ
れているようなバキュロウイルス系を用いてウイルス粒子を昆虫細胞中に産生させる（Ｇ
ａｏ、Ｈ．、ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３１（２）：１３
８－４３）。哺乳動物プロモーターの制御下にあるエンドヌクレアーゼは、これらの細胞
中で発現する可能性は低い（Ａｉｒｅｎｎｅ、ＫＪ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ．
Ｔｈｅｒ．２１（４）：７３９－４９）。更に、昆虫細胞は、哺乳動物細胞とは異なるｍ
ＲＮＡスプライシングモチーフを利用する。従って、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）イント
ロン又はＳＶ４０ラージＴ抗原イントロン等の哺乳動物イントロンをエンドヌクレアーゼ
のコード配列に組み込むことが可能である。これらのイントロンは昆虫細胞のプレｍＲＮ
Ａ転写物から効率的にスプライシングされないため、昆虫細胞は機能的エンドヌクレアー
ゼを発現せず、全長ゲノムをパッケージングする。対照的に、得られた組換えＡＡＶ粒子
が送達される哺乳動物細胞は、プレｍＲＮＡを適切にスプライスし、機能的エンドヌクレ
アーゼタンパク質を発現する。Ｈａｉｆｅｎｇ Ｃｈｅｎは、ＨＧＨ及びＳＶ４０ラージ
Ｔ抗原イントロンを使用して、昆虫パッケージング細胞中の毒性タンパク質バルナーゼ及
びジフテリア毒素断片Ａの発現を減弱させ、これらの毒素遺伝子を担持する組換えＡＡＶ
ベクターの産生を可能にすることを報告した（Ｃｈｅｎ、Ｈ（２０１２）Ｍｏｌ Ｔｈｅ
ｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．１（１１）：ｅ５７）。
３．エンドヌクレアーゼ遺伝子は、エンドヌクレアーゼ発現のために小分子誘導因子が必
要とされるように、誘導性プロモーターに作動可能に連結され得る。誘導性プロモーター
の例には、Ｔｅｔ－Ｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｃｈｅｎ Ｈ、ｅｔ ａｌ．（２
０１５）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（ｊ）１５（１）：４））及びＲｈｅｏＳｗｉ
ｔｃｈシステム（Ｉｎｔｒｅｘｏｎ；Ｓｏｗａ Ｇ、ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｓｐｉｎ
ｅ、３６（１０）：Ｅ６２３－８）が含まれる。両方のシステム及び当該分野で公知の類
似のシステムは、小分子活性化因子（それぞれドキシサイクリン又はエクジソン）に応答
して転写を活性化するリガンド誘導性転写因子（それぞれＴｅｔリプレッサー及びエクジ
ソン受容体の変異体）に依存する。このようなリガンド誘導性転写活性化因子を用いて本
発明を実施することは、１）対応する転写因子に応答するプロモーターの制御下にエンド
ヌクレアーゼ遺伝子を配置することであって、エンドヌクレアーゼ遺伝子が転写因子の結
合部位を有することと、２）パッケージングされたウイルスゲノム中の転写因子をコード
する遺伝子を含むことと、を含む。転写活性化因子が同じ細胞にも供給されない場合、組
換えＡＡＶ送達後に標的細胞又は組織中にエンドヌクレアーゼが発現しないため、後者の
ステップが必要である。次いで、転写活性化因子は、コグネイト小分子活性化因子で処理
された細胞又は組織中にのみエンドヌクレアーゼ遺伝子発現を誘導する。このアプローチ
は、小分子誘導因子がいつ、そしてどの組織に送達されるかを選択することによって、エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子発現を空間－時間的に調節することができるため有利である。し
かしながら、担持能力が著しく制限されたウイルスゲノムに誘導因子を含める必要性は、
このアプローチの欠点を作り出す。
４．別の好ましい実施形態では、組換えＡＡＶ粒子は、エンドヌクレアーゼの発現を妨げ
るリプレッサーを発現する哺乳動物細胞株に産生される。転写リプレッサーは当該分野で
公知であり、Ｔｅｔリプレッサー、Ｌａｃリプレッサー、Ｃｒｏリプレッサー、及びＬａ
ｍｂｄａリプレッサーを含む。エクジソン受容体などの多くの核内ホルモン受容体は、そ
れらの同族ホルモンリガンドの非存在下で転写リプレッサーとしても作用する。本発明を
実施するために、パッケージング細胞は、転写リプレッサーをコードするベクターでトラ
ンスフェクト／形質導入され、ウイルスゲノム中のエンドヌクレアーゼ遺伝子（パッケー
ジングベクター）は、プロモーターに作動可能に結合され、このプロモーターは、リプレ
ッサーがプロモーターをサイレンシングするように、リプレッサーのための結合部位を含
むように改変されている。転写リプレッサーをコードする遺伝子は、種々の位置に配置す
ることができる。この遺伝子は、別のベクターにコードすることができ、ＩＴＲ配列の外
側のパッケージングベクターに組み込むことができ、ｃａｐ／ｒｅｐベクター又はアデノ
ウイルスヘルパーベクターに組み込むことができ、又は最も好ましくは、構成的に発現さ
れるようにパッケージング細胞のゲノムに安定に組み込むことができる。転写リプレッサ
ー部位を組み込むために一般的な哺乳動物プロモーターを改変する方法は、当技術分野で
公知である。例えば、Ｃｈａｎｇ及びＲｏｎｉｎｓｏｎは、強力な構成的ＣＭＶ及びＲＳ
ＶプロモーターをＬａｃリプレッサーのオペレーターを含むように改変し、改変プロモー
ターからの遺伝子発現がリプレッサーを発現する細胞で大きく減弱したことを示した（Ｃ
ｈａｎｇ ＢＤ及びＲｏｎｉｎｓｏｎ ＩＢ（１９９６）Ｇｅｎｅ １８３：１３７－４
２）。非ヒト転写リプレッサーの使用は、エンドヌクレアーゼ遺伝子の転写が、リプレッ
サーを発現するパッケージング細胞においてのみ抑制され、得られる組換えＡＡＶベクタ
ーで形質導入される標的細胞又は組織においては抑制されないことを確実にする。
２．６ 操作されたヌクレアーゼ変異体
本発明の実施形態は、本明細書に記載の操作されたヌクレアーゼ及びその変異体を包含
する。本発明の更なる実施形態は、本明細書に記載のエンドヌクレアーゼをコードする核
酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド及びそのようなポリヌクレオチドの変異体を包
含する。
本明細書で使用される場合、「変異体」は、実質的に類似の配列を意味することを意図
する。「変異体」ポリペプチドは、天然のタンパク質の１以上の内部部位における１以上
のアミノ酸の欠失若しくは付加、及び／又は天然のポリペプチドの１以上の部位における
１以上のアミノ酸の置換によって、「天然の」ポリペプチドから派生したポリペプチドを
意味することを意図する。本明細書で使用される場合、「天然の」ポリヌクレオチド又は
ポリペプチドは、変異体が由来する親配列を含む。実施形態によって包含される変異体ポ
リペプチドは生物学的に活性である。即ち、それらは天然のタンパク質の所望の生物学的
活性を保持し続けており、即ち、例えば、Ｆ８Ｒ１－２認識配列（配列番号７）、Ｆ８Ｒ
３－４認識配列（配列番号９）、Ｆ８Ｒ９－１０認識配列（配列番号１１）、Ｆ８Ｒ１１
－１２認識配列（配列番号１３）、Ｆ８Ｒ１３－１４認識配列（配列番号１５）、又はＦ
８Ｒ１５－１６認識配列（配列番号１７）を含む、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のｉｎｔ２２ｈ
－１配列に見出される認識配列を認識し切断する能力を保持し続けている。そのような変
異体は、例えばヒトの操作から生じ得る。実施形態の天然のポリペプチドの生物学的に活
性な改変体（例えば、配列番号１９～２１，２８～３１，４０～４３，５２～５５，６４
～６７、又は７６～７９）、又は本明細書に記載されているサブユニットを結合する認識
ハーフサイトの生物学的に活性な変異体は、本明細書の他の箇所に記載されている配列ア
ライメントプログラム及びパラメータによって決定されるように、天然のポリペプチド又
は天然のサブユニットのアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、約４５％、約５０％
、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％
、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％
、又は約９９％の配列同一性を有する。実施形態のポリペプチド又はサブユニットの生物
学的に活性な変異体は、そのポリペプチド又はサブユニットと、わずか約１－４０個のア
ミノ酸残基、わずか約１－２０個、わずか約１－１０個、約５、わずか４，３，２個、又
は更には１個のアミノ酸残基だけ異なり得る。
実施形態のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断、及び挿入を含む様々な方法
で変化させることができる。そのような操作のための方法は、当技術分野において一般的
に知られている。例えば、アミノ酸配列変異体は、ＤＮＡ中の突然変異によって調製する
ことができる。突然変異誘発及びポリヌクレオチド変更の方法は、当技術分野において周
知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８２：４８８－４９２、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７－３８２、米国特許第４，８７３，１９２号
、Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃ
ｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びそこに引用されている参考文献を参照されたい。
目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関するガイダ
ンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．
Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）に記載されている。あるアミノ酸を同
様の特性を有する別のアミノ酸と交換するなどの保存的置換が最適であり得る。
野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインに対する実質的な数のアミ
ノ酸修飾が以前に同定されており（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号）、これは
単独で又は組み合わせて、ＤＮＡ認識配列ハーフサイト内の個々の塩基において特異性が
変更された組換えメガヌクレアーゼを生じ、得られる合理的に設計されたメガヌクレアー
ゼは、野生型酵素とは異なるハーフサイト特異性を有するようになる。表７は、認識ハー
フサイトの各ハーフサイト位置（－１～－９）に存在する塩基に基づいて、特異性を増強
するために組換えメガヌクレアーゼモノマー又はサブユニットにおいてなされ得る、可能
性のある置換を提供する。
Figure 2022025081000007
Figure 2022025081000008
太字の項目は野生型の接触残基であり、本明細書で使用される「改変」を構成しない。星
印は、残基がアンチセンス鎖上の塩基と接触することを示す。
ポリヌクレオチドの場合、「変異体」は、天然のポリヌクレオチド内の１以上の部位で
１以上のヌクレオチドの欠失及び／又は付加を含む。当業者は、実施形態の核酸の変異体
が、オープンリーディングフレームが維持されるように構築されることを認識するであろ
う。ポリヌクレオチドの場合、保存的変異体には、遺伝コードの縮重のために、実施形態
のポリペプチドの１つのアミノ酸配列をコードする配列が含まれる。変異体ポリヌクレオ
チドには、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いて生成されるが、実施形態の組換えメ
ガヌクレアーゼを依然としてコードするような、合成由来のポリヌクレオチドが含まれる
。一般に、実施形態の特定のポリヌクレオチドの変異体は、本明細書の他の箇所に記載さ
れている配列アライメントプログラム及びパラメータによって決定されるように、その特
定のポリペプチドに対して少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０
％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％約８５％、約９０％、約９１％、約９２％
、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又はそれ
以上の配列同一性を有する。実施形態の特定のポリヌクレオチドの変異体（即ち、参照ポ
リヌクレオチド）は、変異ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと参照ポ
リヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとの間の配列同一性割合を比較するこ
とによって評価することもできる。
本明細書に包含されるタンパク質配列の欠失、挿入、及び置換は、ポリペプチドの特徴
において根本的な変化を生じることは期待されない。しかし、置換、欠失、又は挿入の正
確な効果をそれに先立って予測することが困難な場合、当業者は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子
のｉｎｔ２２ｈ－１配列内に見出される認識配列を優先的に認識及び切断する能力につい
てポリペプチドをスクリーニングすることによって、その効果が評価されることを理解す
るであろう。
本発明を以下の実施例によって更に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するも
のと解釈されるべきではない。当業者であれば、日常的な実験を用いて、本明細書に記載
の特定の物質及び手順に対する多数の等価物を認識し、又は確認することができるであろ
う。そのような等価物は、以下の実施例に従う請求項の範囲に包含されることが意図され
る。
実施例１
Ｆ８Ｒ認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼの特徴付け
１．Ｆ８Ｒ１－２認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼ
本明細書で「Ｆ８Ｒ１－２メガヌクレアーゼ」と集合的に呼ばれる組換えメガヌクレア
ーゼ（配列番号１９～２１）は、Ｆ８Ｒ１－２認識配列（配列番号７）を認識し切断する
ように操作され、Ｆ８Ｒ１－２認識配列（配列番号７）は、ヒト及びイヌ第ＶＩＩＩ因子
遺伝子、具体的にはｉｎｔ２２ｈ－１配列内、より具体的にはＦ８Ａ１配列内に存在する
。各Ｆ８Ｒ１－２組換えメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０に由来するＮ末端ヌクレアーゼ局
在化シグナルと、第１のメガヌクレアーゼサブユニットと、リンカー配列と、第２のメガ
ヌクレアーゼサブユニットと、を含む。各Ｆ８Ｒ１－２メガヌクレアーゼの第１のサブユ
ニットは配列番号７のＦ８Ｒ１認識ハーフサイトに結合し、第２のサブユニットはＦ８Ｒ
２認識ハーフサイトに結合する（図２参照）。
Ｆ８Ｒ１結合サブユニット及びＦ８Ｒ２結合サブユニットは、それぞれＨＶＲ１及びＨ
ＶＲ２と呼ばれる５６塩基対超可変領域を各々含む。Ｆ８Ｒ１結合サブユニットは、ＨＶ
Ｒ１領域の外側で高度に保存されている。同様に、Ｆ８Ｒ２結合サブユニットも、ＨＶＲ
２領域の外側で高度に保存されている。配列番号１９～２１のＦ８Ｒ１結合領域は、それ
ぞれ配列番号２２～２４として提供される。配列番号２２～２４の各々は、メガヌクレア
ーゼＦ８Ｒ１－２ｘ．２７（配列番号１９）のＦ８Ｒ１結合領域である配列番号２２と少
なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号１９～２１のＦ８Ｒ２結合領域は、そ
れぞれ配列番号２５～２７として提供される。配列番号２５～２７の各々は、メガヌクレ
アーゼＦ８Ｒ１－２ｘ．２７（配列番号１９）のＦ８Ｒ２結合領域である配列番号２５と
少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
２．Ｆ８Ｒ３－４認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼ
本明細書で「Ｆ８Ｒ３－４メガヌクレアーゼ」と集合的に呼ばれる組換えメガヌクレア
ーゼ（配列番号２８～３１）は、Ｆ８Ｒ３－４認識配列（配列番号９）を認識し切断する
ように操作され、Ｆ８Ｒ３－４認識配列（配列番号９）は、ヒト及びイヌ第ＶＩＩＩ因子
遺伝子、具体的にはｉｎｔ２２ｈ－１配列内、より具体的にはＦ８Ａ１配列内に存在する
。各Ｆ８Ｒ３－４組換えメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０に由来するＮ末端ヌクレアーゼ局
在化シグナルと、第１のメガヌクレアーゼサブユニットと、リンカー配列と、第２のメガ
ヌクレアーゼサブユニットと、を含む。各Ｆ８Ｒ３－４メガヌクレアーゼの第１のサブユ
ニットは配列番号９のＦ８Ｒ３認識ハーフサイトに結合し、第２のサブユニットはＦ８Ｒ
４認識ハーフサイトに結合する（図２を参照）。
Ｆ８Ｒ３結合サブユニット及びＦ８Ｒ４結合サブユニットは、それぞれＨＶＲ１及びＨ
ＶＲ２と呼ばれる５６塩基対超可変領域を各々含む。Ｆ８Ｒ３結合サブユニットは、ＨＶ
Ｒ１領域の外側で高度に保存されている。同様に、Ｆ８Ｒ４結合サブユニットも、ＨＶＲ
２領域の外側で高度に保存されている。配列番号２８～３１のＦ８Ｒ３結合領域は、それ
ぞれ配列番号３２～３５として提供される。配列番号３２～３５の各々は、メガヌクレア
ーゼＦ８Ｒ３－４ｘ．４３（配列番号２８）のＦ８Ｒ３結合領域である配列番号３２と少
なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号２８～３１のＦ８Ｒ４結合領域は、そ
れぞれ配列番号３６～３９として提供される。配列番号３６～３９の各々は、メガヌクレ
アーゼＦ８Ｒ３－４ｘ．４３（配列番号２８）のＦ８Ｒ４結合領域である配列番号３６と
少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
３．Ｆ８Ｒ９－１０認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼ
本明細書で「Ｆ８Ｒ９－１０メガヌクレアーゼ」と集合的に呼ばれる組換えメガヌクレ
アーゼ（配列番号４０～４３）は、ヒト及びイヌ第ＶＩＩＩ因子遺伝子、具体的にはｉｎ
ｔ２２ｈ－１配列内に存在するＦ８Ｒ９－１０認識配列（配列番号１１）を認識し切断す
るように操作された。各Ｆ８Ｒ９－１０組換えメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０に由来する
Ｎ末端ヌクレアーゼ局在化シグナルと、第１のメガヌクレアーゼサブユニットと、リンカ
ー配列と、第２のメガヌクレアーゼサブユニットと、を含む。各Ｆ８Ｒ９－１０メガヌク
レアーゼの第１のサブユニットは配列番号１１のＦ８Ｒ９認識ハーフサイトに結合し、第
２のサブユニットはＦ８Ｒ１０認識ハーフサイトに結合する（図２を参照）。
Ｆ８Ｒ９結合サブユニット及びＦ８Ｒ１０結合サブユニットは、それぞれＨＶＲ１及び
ＨＶＲ２と呼ばれる５６塩基対超可変領域を各々含む。Ｆ８Ｒ９結合サブユニットは、Ｈ
ＶＲ１領域の外側で高度に保存されている。同様に、Ｆ８Ｒ１０結合サブユニットも、Ｈ
ＶＲ２領域の外側で高度に保存されている。配列番号４０～４３のＦ８Ｒ９結合領域は、
それぞれ配列番号４４～４７として提供される。配列番号４４～４７の各々は、メガヌク
レアーゼＦ８Ｒ９－１０ｘ．７０（配列番号４０）のＦ８Ｒ９結合領域である配列番号４
４と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号４０～４３のＦ８Ｒ１０結合領
域は、それぞれ配列番号４８～５１として提供される。配列番号４８～５１の各々は、メ
ガヌクレアーゼＦ８Ｒ９－１０ｘ．７０（配列番号４０）のＦ８Ｒ１０結合領域である配
列番号４８と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
４．Ｆ８Ｒ１１－１２認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼ
本明細書で「Ｆ８Ｒ１１－１２メガヌクレアーゼ」と集合的に呼ばれる組換えメガヌク
レアーゼ（配列番号５２～５５）は、ヒト及びイヌ第ＶＩＩＩ因子遺伝子、具体的にはｉ
ｎｔ２２ｈ－１配列内に存在するＦ８Ｒ１１－１２認識配列（配列番号１３）を認識し切
断するように操作された。各Ｆ８Ｒ１１－１２組換えメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０に由
来するＮ末端ヌクレアーゼ局在化シグナルと、第１のメガヌクレアーゼサブユニットと、
リンカー配列と、第２のメガヌクレアーゼサブユニットと、を含む。各Ｆ８Ｒ１１－１２
メガヌクレアーゼの第１のサブユニットは配列番号１３のＦ８Ｒ１１認識ハーフサイトに
結合し、第２のサブユニットはＦ８Ｒ１２認識ハーフサイトに結合する（図２を参照）。
Ｆ８Ｒ１１結合サブユニット及びＦ８Ｒ１２結合サブユニットは、それぞれＨＶＲ１及
びＨＶＲ２と呼ばれる５６塩基対超可変領域を各々含む。Ｆ８Ｒ１１結合サブユニットは
、ＨＶＲ１領域の外部で高度に保存されている。同様に、Ｆ８Ｒ１２結合サブユニットも
、ＨＶＲ２領域の外側で高度に保存されている。配列番号５２～５５のＦ８Ｒ１１結合領
域は、それぞれ配列番号５６～５９として提供される。配列番号５６～５９の各々は、メ
ガヌクレアーゼＦ８Ｒ１１－１２ｘ．５６（配列番号５２）のＦ８Ｒ１１結合領域である
配列番号５６と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号５２～５５のＦ８Ｒ
１２結合領域は、それぞれ配列番号６０～６３として提供される。配列番号６０～６３の
各々は、メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１１－１２ｘ．５６（配列番号５２）のＦ８Ｒ１２結合
領域である配列番号６０と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
５．Ｆ８Ｒ１３－１４認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼ
本明細書で「Ｆ８Ｒ１３－１４メガヌクレアーゼ」と集合的に呼ばれる組換えメガヌク
レアーゼ（配列番号６４～６７）は、ヒト及びイヌ第ＶＩＩＩ因子遺伝子、具体的にはｉ
ｎｔ２２ｈ－１配列内に存在するＦ８Ｒ１３－１４認識配列（配列番号１５）を認識し切
断するように操作された。各Ｆ８Ｒ１３－１４組換えメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０に由
来するＮ末端ヌクレアーゼ局在化シグナルと、第１のメガヌクレアーゼサブユニットと、
リンカー配列と、第２のメガヌクレアーゼサブユニットと、を含む。各Ｆ８Ｒ１３－１４
メガヌクレアーゼの第１のサブユニットは配列番号１５のＦ８Ｒ１３認識ハーフサイトに
結合し、第２のサブユニットはＦ８Ｒ１４認識ハーフサイトに結合する（図２参照）。
Ｆ８Ｒ１３結合サブユニット及びＦ８Ｒ１４結合サブユニットは、それぞれＨＶＲ１及
びＨＶＲ２と呼ばれる５６塩基対超可変領域を各々含む。Ｆ８Ｒ１３結合サブユニットは
、ＨＶＲ１領域の外側で高度に保存されている。同様に、Ｆ８Ｒ１４結合サブユニットも
、ＨＶＲ２領域の外側で高度に保存されている。配列番号６４～６７のＦ８Ｒ１３結合領
域は、それぞれ配列番号６８～７１として提供される。配列番号６８～７１の各々は、メ
ガヌクレアーゼＦ８Ｒ１３～１４ｘ．１３（配列番号６４）のＦ８Ｒ１３結合領域である
配列番号６８と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号６４～６７のＦ８Ｒ
１４結合領域は、それぞれ配列番号７２～７５として提供される。配列番号７２～７５の
各々は、メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１３～１４ｘ．１３（配列番号６４）のＦ８Ｒ１４結合
領域である配列番号７２と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
６．Ｆ８Ｒ１５－１６認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼ
本明細書で「Ｆ８Ｒ１５－１６メガヌクレアーゼ」と集合的に呼ばれる組換えメガヌク
レアーゼ（配列番号７６～７９）は、ヒト及びイヌ第ＶＩＩＩ因子遺伝子、具体的にはｉ
ｎｔ２２ｈ－１配列内に存在するＦ８Ｒ１５－１６認識配列（配列番号１７）を認識し切
断するように操作された。各Ｆ８Ｒ１５－１６組換えメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０に由
来するＮ末端ヌクレアーゼ局在化シグナルと、第１のメガヌクレアーゼサブユニットと、
リンカー配列と、第２のメガヌクレアーゼサブユニットと、を含む。各Ｆ８Ｒ１５－１６
メガヌクレアーゼの第１のサブユニットは配列番号１７のＦ８Ｒ１５認識ハーフサイトに
結合し、第２のサブユニットはＦ８Ｒ１６認識ハーフサイトに結合する（図２を参照）。
Ｆ８Ｒ１５結合サブユニット及びＦ８Ｒ１６結合サブユニットは、それぞれＨＶＲ１及
びＨＶＲ２と呼ばれる５６塩基対超可変領域を各々含む。Ｆ８Ｒ１５結合サブユニットは
、ＨＶＲ１領域の外側で高度に保存されている。同様に、Ｆ８Ｒ１６結合サブユニットも
、ＨＶＲ２領域外で高度に保存されている。配列番号７６～７９のＦ８Ｒ１５結合領域は
、それぞれ配列番号８０～８３として提供される。配列番号８０～８３の各々は、メガヌ
クレアーゼＦ８Ｒ１５－１６ｘ．１４（配列番号７６）のＦ８Ｒ１５結合領域である配列
番号８０と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号７６～７９のＦ８Ｒ１６
結合領域は、それぞれ配列番号８４～８７として提供される。配列番号８４～８７の各々
は、メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１５－１６ｘ．１４（配列番号７６）のＦ８Ｒ１６結合領域
である配列番号８４と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
７．ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおけるＦ８Ｒ認識配列の切断
Ｆ８Ｒ１－２、Ｆ８Ｒ３－４、Ｆ８Ｒ９－１０、Ｆ８Ｒ１１－１２、Ｆ８Ｒ１３－１４
、及びＦ８Ｒ１５－１６メガヌクレアーゼがそれらのそれぞれの認識配列（それぞれ配列
番号７，９、１１，１３，１５，及び１７）を認識し切断できるかどうかを決定するため
に、以前に記載されたＣＨＯ細胞レポーターアッセイを用いて各組換えメガヌクレアーゼ
を評価した（国際公開第２０１２／１６７１９２号及び図４を参照）。アッセイを実施す
るために、細胞のゲノムに組み込まれた非機能性緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子発
現カセットを担持するＣＨＯ細胞レポーター株を産生させた。各細胞株のＧＦＰ遺伝子は
、メガヌクレアーゼによるいずれかの認識配列の細胞内切断が機能的ＧＦＰ遺伝子をもた
らす相同的組換え事象を刺激するように、一対の認識配列によって中断された。
この研究のために開発したＣＨＯレポーター細胞株において、ＧＦＰ遺伝子に挿入され
た１つの認識配列は、Ｆ８Ｒ１－２認識配列（配列番号７）、Ｆ８Ｒ３－４認識配列（配
列番号９）、Ｆ８Ｒ９－１０認識配列（配列番号１１）、Ｆ８Ｒ１１－１２認識配列（配
列番号１３）、Ｆ８Ｒ１３－１４認識配列（配列番号１５）、又はＦ８Ｒ１５－１６認識
配列（配列番号１７）であった。ＧＦＰ遺伝子に挿入された第２の認識配列は、「ＣＨＯ
－２３／２４」と呼ばれる対照メガヌクレアーゼによって認識され切断されるＣＨＯ－２
３／２４認識配列であった。Ｆ８Ｒ１－２認識配列とＣＨＯ－２３／２４認識配列とを含
むＣＨＯレポーター細胞を「Ｆ８Ｒ１－２細胞」と呼ぶ。Ｆ８Ｒ３－４認識配列とＣＨＯ
－２３／２４認識配列とを含むＣＨＯレポーター細胞を「Ｆ８Ｒ３－４細胞」と呼ぶ。Ｆ
８Ｒ９－１０認識配列とＣＨＯ－２３／２４認識配列とを含むＣＨＯレポーター細胞を「
Ｆ８Ｒ９－１０細胞」と呼ぶ。Ｆ８Ｒ１１－１２認識配列とＣＨＯ－２３／２４認識配列
とを含むＣＨＯレポーター細胞を「Ｆ８Ｒ１１－１２細胞」と呼ぶ。Ｆ８Ｒ１３－１４認
識配列とＣＨＯ－２３／２４認識配列とを含むＣＨＯレポーター細胞を「Ｆ８Ｒ１３－１
４細胞」と呼ぶ。Ｆ８Ｒ１５－１６認識配列とＣＨＯ－２３／２４認識配列とを含むＣＨ
Ｏレポーター細胞を「Ｆ８Ｒ１５－１６細胞」と呼ぶ。
ＣＨＯレポーター細胞を、それらの対応する組換えメガヌクレアーゼをコードするプラ
スミドＤＮＡでトランスフェクトするか（例えば、Ｆ８Ｒ１－２細胞を、Ｆ８Ｒ１－２メ
ガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした）、又はＣＨＯ－
２３／３４メガヌクレアーゼをコードするプラスミドでトランスフェクトした。各アッセ
イにおいて、４ｅ５ ＣＨＯレポーター細胞を、製造者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔ
ａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて９６ウェルプレ
ート中の５０ｎｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの
４８時間後、細胞をフローサイトメトリーによって評価して、トランスフェクトされてい
ない陰性対照（Ｆ８Ｒｂｓ）と比較したＧＦＰ陽性細胞の割合を決定した。図５Ａ～図５
Ｇに示すように、全てのＦ８Ｒメガヌクレアーゼは、対応する認識配列を含む細胞株にお
いて陰性対照を有意に超える頻度でＧＦＰ陽性細胞を産生することが見出された。
ＣＨＯレポーター細胞にメガヌクレアーゼを導入した後、２，５，７，９，及び１２日
目にＰＣＳ７－８メガヌクレアーゼの有効性を時間依存的に測定した。この研究では、製
造者の指示に従ってＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（商標）を使用
して、Ｆ８Ｒ１－２、Ｆ８Ｒ３－４、Ｆ８Ｒ９－１０、Ｆ８Ｒ１１－１２、Ｆ８Ｒ１３－
１４、又はＦ８Ｒ１５－１６細胞（１．０×１０６個）に、細胞ごとに対応するメガヌク
レアーゼｍＲＮＡの１×１０６コピーをエレクトロポレーションした。トランスフェクシ
ョン後の指定された時点で、細胞をフローサイトメトリーによって評価し、ＧＦＰ陽性細
胞の割合を決定した。ＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼも、陽性対照として各時点で
含めた。
図６Ａ～図６Ｆに示すように、多数の異なるＦ８Ｒメガヌクレアーゼによって産生され
た％ＧＦＰは、各研究の時間経過にわたって比較的一貫しており、細胞における持続的な
切断活性及び実質的な毒性の欠如を示している。他のＦ８Ｒメガヌクレアーゼは、研究の
時間経過にわたって％ＧＦＰ発現のいくらかの変動性を示した。
８．結論
これらの研究は、本発明に包含されるＦ８Ｒメガヌクレアーゼが、細胞中のそれぞれの
認識配列を効率的に標的とし切断することができることを実証した。
実施例２
ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子におけるエクソン１－２２の逆位
１．哺乳動物細胞の認識配列におけるｉｎｄｅｌの生産
Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイによって、認識部位で切断し挿入及び／又は欠失（ｉ
ｎｄｅｌ）を引き起こす能力について、メガヌクレアーゼＦ８Ｒ１－２及びＦ８Ｒ３－４
を試験した。ＨＥＫ２９３細胞に、各ヌクレアーゼをコードする２００ｎｇのｍＲＮＡを
トランスフェクトした。トランスフェクションの７日後に細胞を採取し、ｇＤＮＡを抽出
した。このｇＤＮＡを、Ｆ８Ｒ３－４ｆ．３５７プライマー及びＦ８Ｒ１－２ｒ．４６７
プライマーを用いたＰＣＲ反応における鋳型として使用した。次いで、得られたＰＣＲ産
物をＴ７エンドヌクレアーゼを用いて分析し、ｉｎｄｅｌの存在を明らかにした（図７）
。図７は、モック処理（レーン１）、又はＦ８Ｒ１－２ｘ．１５（レーン２）、Ｆ８Ｒ１
－２ｘ．２７（レーン３）、Ｆ８Ｒ３－４ｘ．４３（レーン４）、Ｆ８Ｒ３－４ｘ．７０
（レーン５）で処理したＨＥＫ２９３細胞からのＰＣＲ／Ｔ７エンドヌクレアーゼ反応を
搭載したアガロースゲルを示す。レーン４及びレーン５のより低い分子量のバンドは、Ｔ
７エンドヌクレアーゼ陽性の結果及び標的認識配列におけるｉｎｄｅｌの存在を示す。
２．哺乳動物細胞におけるエクソン１－２２の逆位
Ｆ８Ｒ１－２及びＦ８Ｒ３－４メガヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの切断がエクソン
１－２２の逆位を刺激するかどうかを決定するために、まず、Ｆ８Ｒ１－２又はＦ８Ｒ３
－４メガヌクレアーゼをコードする２００ｎｇのｍＲＮＡでＨＥＫ２９３細胞をトランス
フェクトし、７日後にｇＤＮＡを採取した。プライマーセットＨ１Ｒ／Ｈ１Ｆを用いたＰ
ＣＲによってｇＤＮＡを分析して、正常エクソン１－２２の位置を検出し、プライマーセ
ットＨ１Ｒ／Ｈ２／３Ｒを用いて逆位エクソン１－２２の位置を検出した（図８）。図８
Ａは、モック処理（レーン１）、又はＦ８Ｒ１－２ｘ．１５（レーン２）、Ｆ８Ｒ１－２
ｘ．２７（レーン３）、Ｆ８Ｒ３－４ｘ．４３（レーン４）、Ｆ８Ｒ３－４ｘ．７０（レ
ーン５）で処理したＨＥＫ２９３細胞からのＨ１Ｒ／Ｈ１ＦプライムＰＣＲ反応を搭載し
たアガロースゲルを示す。レーン６は、未処理のヒト細胞ｇＤＮＡ鋳型を用いた対照ＰＣ
Ｒを含む。レーン７は鋳型なしのＰＣＲ陰性対照を含む。図８Ｂは、モック処理（レーン
１）、又はＦ８Ｒ１－２ｘ．１５（レーン２）、Ｆ８Ｒ１－２ｘ．２７（レーン３）、Ｆ
８Ｒ３－４ｘ．４３（レーン４）、Ｆ８Ｒ３－４ｘ．７０（レーン５）で処理したＨＥＫ
２９３細胞からのＨ１Ｒ／Ｈ２／３ＲプライムＰＣＲ反応を搭載したアガロースゲルを示
す。レーン６は、未処理のヒト細胞ｇＤＮＡ鋳型を用いた対照ＰＣＲを含む。レーン７は
鋳型なしのＰＣＲ陰性対照を含む。図８ＢのＰＣＲ断片の存在は、本発明に包含されるＦ
８Ｒメガヌクレアーゼを用いたエクソン１－２２の逆位の成功を示す。
Ｆ８Ｒ９－１０、Ｆ８Ｒ１１－１２、Ｆ８Ｒ１３－１４、及びＦ８Ｒ１５－１６メガヌ
クレアーゼによるゲノムＤＮＡの切断がエクソン１－２２の逆位を刺激するかどうかを決
定するために、まず、各個々のヌクレアーゼをコードする２００ｎｇのｍＲＮＡでＨＥＫ
２９３細胞をトランスフェクトし、トランスフェクション後２日目及び８日目にｇＤＮＡ
を採取した。プライマーセットＨ１Ｒ／Ｈ１Ｆを用いたＰＣＲによって、ｇＤＮＡを分析
して、正常エクソン１－２２の位置を検出し、プライマーセットＨ１Ｒ／Ｈ２／３Ｒで逆
位エクソン１－２２の位置を検出した（図９）。図９は、モック処理（レーン１）、又は
Ｆ８Ｒ９－１０ｘ．３８（レーン２）、Ｆ８Ｒ９－１０ｘ．７０（レーン３）、Ｆ８Ｒ１
１－１２ｘ．５６（レーン４）、Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．６９（レーン５）、Ｆ８Ｒ１３－
１４ｘ．３（レーン６）、Ｆ８Ｒ１３－１４ｘ．１３（レーン７）、Ｆ８Ｒ１５－１６ｘ
．１４（レーン８）、Ｆ８Ｒ１５－１６ｘ．８５（レーン９）で処理したＨＥＫ２９３細
胞からのＨ１Ｒ／Ｈ１ＦプライムＰＣＲ反応（上）及びＨ１Ｒ／Ｈ２／３ＲプライムＰＣ
Ｒ反応（下）を搭載したアガロースゲルを示す。レーン１０は、未処理のヒト細胞ｇＤＮ
Ａ鋳型を用いた対照ＰＣＲを含む。レーン１１は鋳型なしのＰＣＲ陰性対照を含む。Ｈ１
Ｒ／Ｈ２／３ＲプライムＰＣＲ反応（図９の下半分）におけるＰＣＲ断片の存在は、本発
明に包含されるＦ８Ｒメガヌクレアーゼを用いたエクソン１－２２の逆位の成功を示して
いる。
実施例３
２９３細胞中のＦ８Ｒヌクレアーゼによる第ＶＩＩＩ因子遺伝子の逆位及び逆デジタルＰ
ＣＲによる効率の決定
１．材料と方法
この研究は、本発明に包含されるＦ８Ｒヌクレアーゼが、ＨＥＫ２９３細胞における血
友病Ａ特異的第ＶＩＩＩ因子遺伝子の逆位をもたらし得ることを実証した。更に、記載さ
れた方法を用いて、Ｆ８Ｒヌクレアーゼ媒介性第ＶＩＩＩ因子遺伝子逆位の効率を決定す
ることができる。
製造者の指示に従ってＢｉｏ－Ｒａｄ ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ ＸＣｅｌｌを用いて、
それぞれＦ８Ｒ１１－１２ｘ．６９又はＦ８Ｒ１３－１４ｘ．１３ヌクレアーゼをコード
するｍＲＮＡ（５μｇ）を、ＨＥＫ２９３細胞（２×１０６）にトランスフェクトした。
トランスフェクションの２日後に、ゲノムＤＮＡを細胞から単離し、逆デジタルＰＣＲを
実施して第ＶＩＩＩ因子ゲノム編集を決定した。トランスフェクトされていない細胞から
単離したゲノムＤＮＡは対照として役立った。
ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢｃｌｌで完全消化した。消化されたＤＮＡを
、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて環状化し、製造者の指示に従ってＢｉｏ－Ｒａｄ ＱＸ
２００ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して逆デジタルＰＣＲによって分
析した。正常なヒトゲノムＤＮＡにおいて、Ｂｃｌｌ消化物は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子の
イントロン２２中のｉｎｔ２２ｈ－１反復を包含する約２１ｋｂの断片、及びｉｎｔ２２
ｈ－１の約０．５Ｍｂ上流に位置付けられたｉｎｔ２２ｈ－１反復のほぼ同一の逆向きの
コピーを包含する約１６ｋｂの断片を生成する。
逆デジタルＰＣＲでは、上記の２つの環状Ｂｃｌｌ断片を、それぞれのＢｃｌｌ部位に
隣接するプライマーで増幅する。Ｕ１プライマー及びＤ１プライマーは、第ＶＩＩＩ因子
遺伝子のイントロン２２におけるｉｎｔ２２ｈ－１反復の上流及び下流にそれぞれ結合し
、Ｕ３プライマーは、ｉｎｔ２２ｈ－１の約０．５Ｍｂ上流に位置付けられたｉｎｔ２２
ｈ－１反復のほぼ同一の逆向きのコピーの上流に結合する。全てのプライマーは、従来の
ＰＣＲに対して反対向きでゲノムＤＮＡに結合し、Ｂｃｌｌ断片が環状化された場合にの
みアンプリコンを生成する。
Ｕ１：［５’－ＣＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＴ－３’］（配列番号８８）
Ｄ１：［５’－ＡＣＡＴＡＣＧＧＴＴＴＡＧＴＣＡＣＡＡＧＴ－３’］（配列番号８９）
Ｕ３：［５’－ＴＣＣＡＧＴＣＡＣＴＴＡＧＧＣＴＣＡＧ－３’］（配列番号９０）
Ｕ１／Ｄ１プライマーを用いたＨＥＫ２９３ゲノムＤＮＡの逆デジタルＰＣＲは、Ｔａ
ｑＭａｎプローブを用いて検出することができる約０．５ｋｂのアンプリコンを生じるが
、Ｕ３／Ｕ１プライマーを用いたＰＣＲは、増幅産物を生成しない。
ｉｎｔ２２ｈ－１とその遠位コピーとの間のゲノム断片の首尾良い逆位の際に、逆位断
片上に位置付けられているＵ１プライマー結合部位は、Ｄ１及びＵ３プライマー結合部位
に対して再配向される。Ｕ１／Ｄ１ ＰＣＲはＰＣＲ産物の生成に失敗するが、Ｕ３／Ｕ
１ ＰＣＲは約０．５ｋｂのアンプリコンを生じ、これは同じＴａｑＭａｎプローブで検
出することができる。
２．結果
Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．６９又はＦ８Ｒ１３－１４ｘ．１３ヌクレアーゼでそれぞれ処理
したＨＥＫ２９３細胞及びＨＥＫ２９３細胞由来のゲノムＤＮＡを、逆デジタルＰＣＲに
よって分析した。未処理のＨＥＫ２９３細胞から単離したゲノムＤＮＡからは、Ｕ１／Ｄ
１断片のみが増幅され、Ｕ３／Ｕ１ ＰＣＲはシグナルを生成しなかった（図１０、モッ
ク）。Ｆ８Ｒヌクレアーゼ処理ＨＥＫ２９３細胞からのゲノムＤＮＡを用いると、Ｕ１／
Ｄ１及びＵ３／Ｕ１の両方のアンプリコンが検出された（図１０、Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．
６９及びＦ８Ｒ１３－１４ｘ．１３）。ヌクレアーゼ処理により、編集されたゲノム及び
編集されていないゲノムの両方の細胞の混合集団が生成されたため、Ｕ１／Ｄ１断片は、
Ｆ８Ｒヌクレアーゼ処理ＨＥＫ２９３細胞のゲノムＤＮＡから依然として増幅された。デ
ジタルＰＣＲは数百から数千の染色体等価物の平行分析を可能にするため、第ＶＩＩＩ因
子遺伝子の逆位効率を計算することができる。このアッセイによって検出された第ＶＩＩ
Ｉ因子遺伝子の総数のうち４％及び３０％は、それぞれヌクレアーゼＦ８Ｒ１３－１４ｘ
．１３及びＦ８Ｒ１１－１２ｘ．６９の活性の結果として逆位を示した。
３．結論
逆デジタルＰＣＲによって、ヌクレアーゼＦ８Ｒ１１－１２ｘ．６９及びＦ８Ｒ１３－
１４ｘ．１３で処理したＨＥＫ２９３細胞における第ＶＩＩＩ因子遺伝子の逆位が検出さ
れた。更に、逆デジタルＰＣＲを用いて、編集効率を計算することができた。ヌクレアー
ゼ（Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．６９）に依存して、ＨＥＫ２９３細胞中の検出された第ＶＩＩ
Ｉ因子遺伝子の３０％までが編集された。重要なことに、この研究は、第ＶＩＩＩ因子遺
伝子逆位がｉｎｔ２２ｈ反復内のＤＮＡ二本鎖切断によって誘導され得ることを実証する
。両方のヌクレアーゼは、ｉｎｔ２２ｈ反復内の認識配列を標的とし、潜在的に染色体あ
たり３つの二本鎖切断を導入する。
実施例４
初代ヒトＴ細胞におけるＦ８Ｒヌクレアーゼによる第ＶＩＩＩ因子遺伝子の逆位及び長距
離ＰＣＲによる編集の決定
１．材料と方法
この研究は、本発明に包含されるＦ８Ｒヌクレアーゼが、正常野生型ヒトＴ細胞におけ
る血友病Ａ特異的第ＶＩＩＩ因子遺伝子の逆位をもたらし得ることを実証した。正常ヒト
Ｔ細胞（１×１０６）を、製造者の指示に従ってＬｏｎｚａ ４Ｄヌクレオフェクターを
用いて、Ｆ８Ｒ３－４ｘ．４３ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）でトランス
フェクトした。トランスフェクションの３日後に、ゲノムＤＮＡを細胞から単離し、長距
離ＰＣＲを実施して第ＶＩＩＩ因子ゲノム編集を決定した。トランスフェクトされていな
い正常なヒトＴ細胞から単離されたゲノムＤＮＡは対照として役立った。
この長距離ＰＣＲでは、ゲノムＤＮＡをＦＷＤ１／ＲＥＶ１プライマーとＦＷＤ３／Ｆ
ＷＤ１プライマーとの間でそれぞれ増幅した。
ＦＷＤ１：［５’－ＣＣＣＴＴＡＣＡＧＴＴＡＴＴＡＡＣＴＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＧＧＴ
ＴＣＡＴＴＣＣ－３’］（配列番号９１）
ＲＥＶ１：［５’－ＣＣＣＣＧＧＣＡＣＴＴＧＡＡＡＧＴＡＧＣＡＧＡＴＧＣＡＡＧＡＡ
ＧＧＧＣＡＣＡ－３’］（配列番号９２）
ＦＷＤ３：［５’－ＡＣＴＡＴＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧＡＡＣＴＴＣＣＣＣＴＣＴＣ
ＡＴＡ－３’］（配列番号９３）
ＦＷＤ１プライマー及びＲＥＶ１プライマーは、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のイントロン２
２におけるｉｎｔ２２ｈ－１反復の上流及び下流にそれぞれ結合し、ＦＷＤ３プライマー
は、ｉｎｔ２２ｈ－１の約０．５Ｍｂ上流に位置付けられたｉｎｔ２２ｈ－１反復のほぼ
同一の逆向きのコピーの上流に結合する。
ＦＷＤ１／ＲＥＶ１プライマーを用いた正常なヒトゲノムＤＮＡの長距離ＰＣＲは約１
０ｋｂのアンプリコンを生じ、ＦＷＤ３／ＦＷＤ１プライマーを用いたＰＣＲは増幅産物
を生成しない。
ｉｎｔ２２ｈ－１とその遠位コピーとの間のゲノム断片の首尾良い逆位の際に、逆位断
片上に位置付けられているＦＷＤ１プライマー結合部位は、ＲＥＶ１及びＦＷＤ３プライ
マー結合部位に対して再配向される。ＦＷＤ１／ＲＥＶ１ ＰＣＲはＰＣＲ産物の生成に
失敗し、ＦＷＤ３／ＦＷＤ１ ＰＣＲは約９．７ｋｂのアンプリコンを生じる。ＰＣＲ断
片をアガロースゲル電気泳動で分析し、臭化エチジウムで可視化する。
２．結果
正常ヒトＴ細胞及びＦ８Ｒ３－４ｘ．４３ヌクレアーゼで処理した正常ヒトＴ細胞由来
のゲノムＤＮＡを、長距離ＰＣＲによって分析した（図１１）。未処理の正常ヒトＴ細胞
から単離したゲノムＤＮＡから増幅されたのはＦＷＤ１／ＲＥＶ１断片のみであった（レ
ーン２及びレーン５）。Ｆ８Ｒ３－４ｘ．４３ヌクレアーゼ処理した正常ヒトＴ細胞のゲ
ノムＤＮＡをＰＣＲ鋳型として使用すると、ＦＷＤ１／ＲＥＶ１プライマー及びＦＷＤ３
／ＦＷＤ１プライマーの両方の組み合わせが、それぞれサイン約１０ｋｂ及び約９．７ｋ
ｂのアンプリコンを生じる（レーン３及びレーン６）。ヌクレアーゼ処理により、編集さ
れたゲノムと編集されていないゲノムとの混合細胞集団が生成されたため、ＦＷＤ１／Ｒ
ＥＶ１断片は、Ｆ８Ｒ３－４ｘ．４３処理した正常ヒトＴ細胞のゲノムＤＮＡから依然と
して増幅することができる。
３．結論
Ｆ８Ｒ３－４ｘ．４３メガヌクレアーゼは、ｉｎｔ２２ｈ領域内で二本鎖切断を生じさ
せることにより、ヒトＴ細胞における第ＶＩＩＩ因子遺伝子の逆位を生成することができ
、この逆位は長距離ＰＣＲによって検出することができた。
実施例５
初代ヒト患者Ｔ細胞におけるＦ８Ｒヌクレアーゼによる第ＶＩＩＩ因子遺伝子の復帰と長
距離ＰＣＲによる編集の決定
１．材料と方法
この研究は、本発明に包含されるＦ８Ｒヌクレアーゼが、血友病Ａ患者Ｔ細胞における
血友病Ａ特異的第ＶＩＩＩ因子遺伝子逆位の復帰を誘導し得ることを実証した。
製造者の指示に従ってＬｏｎｚａ ４Ｄヌクレオフェクターを用いて、Ｆ８Ｒ３－４ｘ
．４３、Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．６９、又はＦ８Ｒ１５－１６ｘ．１４ヌクレアーゼをそれ
ぞれコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を血友病Ａ患者Ｔ細胞（１×１０６）にトランスフェ
クトした。トランスフェクションの３日後に、ゲノムＤＮＡを細胞から単離し、長距離Ｐ
ＣＲを実施して第ＶＩＩＩ因子ゲノム編集を決定した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を
コードするｍＲＮＡでトランスフェクトした患者Ｔ細胞から単離されたゲノムＤＮＡは対
照として役立った。
この長距離ＰＣＲでは、ＨＩＵ／ＨＩＤプライマーとＨ３Ｄ／ＨＩＤプライマーとの間
でそれぞれゲノムＤＮＡを増幅した。
ＨＩＵ：［５’－ＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＴＣＣＡＴＴＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＣＡＴＴＡＴ
ＧＣＴＧＡＣ－３’］（配列番号９４）
ＨＩＤ：［５’－ＧＧＣＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＧ
ＴＧＣＡＡＴＡ－３’］（配列番号９５）
Ｈ３Ｄ：［５’－ＣＡＣＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＧＡＧＧＧＴＧＴＧＧＧＡＴＡ
ＡＧＡＡ－３’］（配列番号９６）
ＨＩＵプライマー及びＨＩＤプライマーは、第ＶＩＩＩ因子遺伝子のイントロン２２に
おけるｉｎｔ２２ｈ－１リピートの上流及び下流にそれぞれ結合し、Ｈ３Ｄプライマーは
、ｉｎｔ２２ｈ－１の約０．５Ｍｂ上流に位置付けられたｉｎｔ２２ｈ－１反復のほぼ同
一の逆向きのコピーの下流に結合する。
ＨＩＵ／ＨＩＤプライマーを用いた正常ヒトゲノムＤＮＡの長距離ＰＣＲは約１２ｋｂ
のアンプリコンを生じ、Ｈ３Ｄ／ＨＩＤプライマーを用いたＰＣＲは増幅産物を生成しな
い。逆に、ＨＩＵ／ＨＩＤプライマーを用いた血友病Ａ遺伝子逆位を有する患者細胞から
のゲノムＤＮＡの長距離ＰＣＲは、ＰＣＲ産物を生成することができず、Ｈ３Ｄ／ＨＩＤ
ＰＣＲは約１１ｋｂのアンプリコンを生じる。
２つの逆向きｉｎｔ２２ｈ反復間の患者Ｔ細胞におけるゲノム断片の首尾良い復帰の際
に、逆位断片上に位置付けられているＨＩＵプライマー結合部位は、Ｈ３Ｕ及びＨＩＤプ
ライマー結合部位に対して再配向される。ＨＩＵ／ＨＩＤ ＰＣＲは、１２ｋｂアンプリ
コンを生じ、第ＶＩＩＩ因子遺伝子の野生型配置への復帰を示す。ＰＣＲ断片をアガロー
スゲル電気泳動で分析し、臭化エチジウムで可視化した。
２．結果
Ｆ８Ｒ３－４ｘ．４３、Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．６９、又はＦ８Ｒ１５－１６ｘ．１４ヌ
クレアーゼ（又は対照としてのＧＦＰ）をコードするｍＲＮＡで処理した血友病Ａ患者Ｔ
細胞由来のゲノムＤＮＡを、長距離ＰＣＲで分析した（図１２）。ＧＦＰ ｍＲＮＡで処
理した患者Ｔ細胞から単離されたゲノムＤＮＡからは、Ｈ３Ｕ／ＨＩＤ断片のみが増幅さ
れ得る（レーン１ａ及びレーン１ｂ）。Ｆ８Ｒ３－４ｘ．４３、Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．６
９、又はＦ８Ｒ１５－１６ｘ．１４ヌクレアーゼ処理した患者Ｔ細胞のゲノムＤＮＡをＰ
ＣＲ鋳型として使用すると、ＨＩＵ／ＨＩＤプライマー及びＨ３Ｄ／ＨＩＤプライマーの
両方の組み合わせが、それぞれサイン野生型（約１２ｋｂ）及び逆位（約１１ｋｂ）のア
ンプリコンを生じた（レーン３ａ及びレーン３ｂ：Ｆ８Ｒ３－４ｘ．４３、レーン４ａ及
びレーン４ｂ：Ｆ８Ｒ１１－１２ｘ．６９、レーン５ａ及びレーン５ｂ：Ｆ８Ｒ１５－１
６ｘ．１４）。ヌクレアーゼ処理により、編集されたゲノムと編集されていないゲノムと
の細胞の混合集団が生成されたため、Ｈ３Ｕ／ＨＩＤ断片は、Ｆ８Ｒヌクレアーゼ処理し
た患者Ｔ細胞のゲノムＤＮＡから依然として増幅されていた。
３．結論
本発明に包含されるＦ８Ｒメガヌクレアーゼは、インビトロで血友病Ａ患者Ｔ細胞の野
生型配置に戻る逆位第ＶＩＩＩ因子遺伝子の復帰を誘導することができ、この復帰は長距
離ＰＣＲによって検出することができた。

Claims (46)

  1. 第ＶＩＩＩ因子遺伝子のｉｎｔ２２ｈ－１配列内の認識配列を認識し切断する操作され
    たメガヌクレアーゼであって、
    前記操作されたメガヌクレアーゼは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを含
    み、前記第１のサブユニットは、前記認識配列の第１の認識ハーフサイトに結合し、第１
    の超可変領域（ＨＶＲ１）を含み、前記第２のサブユニットは、前記認識配列の第２の認
    識ハーフサイトに結合し、第２の超可変領域（ＨＶＲ２）を含む、操作されたメガヌクレ
    アーゼ。
  2. 前記認識配列が前記第ＶＩＩＩ因子遺伝子のＦ８Ａ１コード配列内にある、請求項１に
    記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  3. 前記Ｆ８Ａ１コード配列が、配列番号５又は配列番号６と少なくとも９５％の配列同一
    性を有する、請求項２に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  4. 前記認識配列が配列番号９を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の操作されたメ
    ガヌクレアーゼ。
  5. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号２８～３１のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応
    するアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項
    ４に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  6. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号２８～３１のいずれか１つの残基２１５，２１７，２１
    ９，２２１，２２３，２２４，２３１，２３３，２３５，２３７，２６１，２６６，及び
    ２６８に対応する残基を含む、請求項４又は５に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  7. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号２８～３１のいずれか１つの残基２１５～２７０を含む
    、請求項４～６のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  8. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号２８～３１のいずれか１つの残基２４～７９に対応する
    アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求
    項４～７のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  9. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号２８～３１のいずれか１つの残基２４，２６，２８，３
    ２，３３，３８，４０，４２，４４，４６，６８，７０，７５，及び７７に対応する残基
    を含む、請求項４～８のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  10. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号３０の残基７３に対応する残基を更に含む、請求項４～
    ９のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  11. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号２８～３１のいずれか１つの残基２４～７９を含む、請
    求項４～１０のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  12. 前記第１のサブユニットが、配列番号２８～３１のいずれか１つの残基１９８～３４４
    に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユ
    ニットが、配列番号２８～３１のいずれか１つの残基７～１５３に対して少なくとも８０
    ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４～１１のいずれか１項に記載の操
    作されたメガヌクレアーゼ。
  13. 前記第１のサブユニットが、配列番号２８～３１のいずれか１つの残基１９８～３４４
    を含む、請求項４～１２のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  14. 前記第２のサブユニットが、配列番号２８～３１のいずれか１つの残基７～１５３を含
    む、請求項４～１３のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  15. 前記操作されたメガヌクレアーゼがリンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、前
    記リンカーが前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットとを共有結合する、請求
    項４～１４のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  16. 前記操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号２８～３１のいずれか１つのアミノ酸配
    列を含む、請求項４～１５のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。
  17. 請求項１～１６のいずれか１項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼをコードする
    核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  18. 前記単離されたポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項１７に記載の単離されたポ
    リヌクレオチド。
  19. 請求項１～１６のいずれか１項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼをコードする
    核酸配列を含む、組換えＤＮＡ構築物。
  20. 前記組換えＤＮＡ構築物が、請求項１～１６のいずれか１項に記載の前記操作されたメ
    ガヌクレアーゼをコードする前記核酸配列を含むウイルスベクターをコードする、請求項
    １９に記載の組換えＤＮＡ構築物。
  21. 前記ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求
    項１９又は２０に記載の組換えＤＮＡ構築物。
  22. 請求項１～１６のいずれか１項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼをコードする
    核酸配列を含む、ウイルスベクター。
  23. 前記ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項２２に記載のウイルスベ
    クター。
  24. 第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１－２２の逆位を特徴とする血友病Ａを有する被験体
    を治療するための医薬組成物であって、
    前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体と、
    （ａ）操作されたヌクレアーゼをコードする核酸であって、前記操作されたヌクレアーゼ
    がインビボで発現する、核酸、又は
    （ｂ）操作されたヌクレアーゼタンパク質
    と、を含み、
    前記操作されたヌクレアーゼは、前記第ＶＩＩＩ因子遺伝子のｉｎｔ２２ｈ－１配列内
    に位置する第１の認識配列に対する特異性を有する、医薬組成物。
  25. 前記第１の認識配列がＦ８Ａ１コード配列内にある、請求項２４に記載の医薬組成物。
  26. 前記Ｆ８Ａ１コード配列が、配列番号５又は配列番号６と少なくとも９５％の配列同一
    性を有する、請求項２５に記載の医薬組成物。
  27. 前記操作されたヌクレアーゼが、前記第１の認識配列と同一である第２の認識配列に対
    して特異性を有し、前記第２の認識配列が、Ｘ染色体の前記第ＶＩＩＩ因子遺伝子のテロ
    メアの反復配列に位置し、前記反復配列は、前記反復配列が前記ｉｎｔ２２ｈ－１配列に
    対して逆向きであることを除いて、前記ｉｎｔ２２ｈ－１配列と同一である、請求項２４
    ～２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  28. 前記核酸がｍＲＮＡである、請求項２４～２７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  29. 前記医薬組成物が、前記核酸を含む組換えＤＮＡ構築物を含む、請求項２４～２７のい
    ずれか１項に記載の医薬組成物。
  30. 前記医薬組成物が、前記核酸を含むウイルスベクターを含む、請求項２４～２７のいず
    れか１項に記載の医薬組成物。
  31. 前記ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項３０に記載の医薬組成物
    。
  32. 前記操作されたヌクレアーゼが、操作されたメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフ
    ィンガーヌクレアーゼ、コンパクトＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ、又はｍｅｇａＴＡＬであ
    る、請求項２４～３１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  33. 前記操作されたヌクレアーゼが操作されたメガヌクレアーゼである、請求項２４～３２
    のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  34. 前記第１の認識配列が配列番号９を含む、請求項３３に記載の医薬組成物。
  35. 前記核酸が、請求項４～１６のいずれか１項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼ
    をコードする、請求項３４に記載の医薬組成物。
  36. 前記操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号２８～３１のいずれか１つのアミノ酸配
    列を含む、請求項３５に記載の医薬組成物。
  37. 第ＶＩＩＩ因子遺伝子のエクソン１－２２の逆位を特徴とする血友病Ａを有する被験体
    を治療する方法であって、前記方法が、前記被験体に請求項２４～３６のいずれか１項に
    記載の前記医薬組成物を投与することを含む、方法。
  38. 前記操作されたヌクレアーゼ又は前記操作されたヌクレアーゼをコードする前記核酸が
    、野生型被験体において第ＶＩＩＩ因子を発現する細胞又は野生型被験体において第ＶＩ
    ＩＩ因子を発現する細胞に分化する前駆細胞に送達される、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記細胞が肝類洞内皮細胞である、請求項３７又は３８に記載の方法。
  40. 前記細胞が、肝類洞内皮細胞に分化する前駆細胞である、請求項３７又は３８に記載の
    方法。
  41. 前記操作されたヌクレアーゼが、前記ｉｎｔ２２ｈ－１配列と前記反復配列との間の組
    換えを促進するために前記第１の認識配列を認識し切断し、野生型第ＶＩＩＩ因子遺伝子
    を生成させるためにエクソン１－２２を復帰させる、請求項３７～４０のいずれか１項に
    記載の方法。
  42. 前記操作されたヌクレアーゼが、前記反復配列中の前記第２の認識配列を更に認識し切
    断する、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記操作されたヌクレアーゼが操作されたメガヌクレアーゼである、請求項３７～４２
    のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記医薬組成物が、請求項１～１６のいずれか１項に記載の前記操作されたメガヌクレ
    アーゼをコードする核酸を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記被験体がヒトである、請求項３７～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記被験体がイヌである、請求項３７～４４のいずれか１項に記載の方法。
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