JP7068413B2 - 設計されたメガヌクレアーゼを使用した網膜色素変性症の治療 - Google Patents
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Description
本出願は、35U.S.C.§119(e)に基づいて、2015年9月8日に出願された同時係属中の米国仮出願第62/215,460号(この内容は、その全体が参照により組み込まれる)の優先権の利益を主張する。
本発明は、分子生物学及び組換え核酸技術の分野に関する。特に、本発明は、ヒトロドプシン遺伝子対立遺伝子に見られる認識配列を認識及び切断するように設計された組換えメガヌクレアーゼに関する。本発明は更に、網膜色素変性症を治療するための方法におけるこのような組換えメガヌクレアーゼの使用に関する。
網膜色素変性症(RP)は、網膜における視細胞の進行性変性による重度の視力障害を引き起こす遺伝性変性眼疾患である。RPは、最初に桿体視細胞が減少し、その結果、周辺視力及び暗所視力が損なわれることを特徴とする。進行性桿体変性の後、網膜色素上皮の異常及び錐体視細胞の劣化が起こる。疾患が進行するにつれて、患者は、夜盲症、進行性視野狭窄、及び最終的には失明を経験する。RPは3000人に約1人が罹患しており、単独で又は他の全身性障害と一緒に起こり得る。現在の所、RPには有効な治療がない。
apy.22:567-575)、単一の突然変異RHO P23H対立遺伝子を有する患者は、機能的野生型RHO対立遺伝子の存在にもかかわらず、RPを発症し得る。
U.S.A.107(13):5961-5966)。P23Hロドプシンのミスフォールディングはまた、野生型ロドプシンの輸送又は機能を妨害することによって、細胞死に寄与し得る(Illing et al.,2002,Lin et al.,2007)。更に、P23Hロドプシンは、脱リン酸化の遅延を示すことが示されており、細胞死は、異常な細胞質Ca2+レベルに起因し得る(Saito et al.(2008)Clin.Opthamol.2:821-828)。
、一般的に、4つのファミリー:LAGLIDADG(配列番号96)ファミリー、GIY-YIGファミリー、His-Cysボックスファミリー、及びHNHファミリーに分類される。これらのファミリーは、触媒活性及び認識配列に影響を与える構造モチーフを特徴とする。例えば、LAGLIDADG(配列番号96)ファミリーのメンバーは、1コピー又は2コピーの保存されたLAGLIDADG(配列番号96)モチーフを有することを特徴とする(Chevalier et al.(2001),Nucleic Acids Res.29(18):3757-3774)。1コピーのLAGLIDADG(配列番号96)モチーフを有するLAGLIDADG(配列番号96)ホーミングエンドヌクレアーゼはホモ二量体を形成するのに対して、2コピーのLAGLIDADG(配列番号96)モチーフを有するメンバーは単量体として見られる。
Res.33:e178;Seligman et al.(2002),Nucleic Acids Res.30:3870-9,Arnould et al.(2006),J.Mol.Biol.355:443-58)。より最近では、モノLAGLIDADG(配列番号96)ホーミングエンドヌクレアーゼを合理的に設計する方法であって、多様なDNA部位(哺乳動物、酵母、植物、細菌及びウイルスのゲノム中の部位を含む)をターゲティングするようにI-CreI及び他のホーミングエンドヌクレアーゼを包括的に再設計することができる方法が記載された(国際公開第2007/047859号)。
Res.37:1650-62;Grizot,et al.(2009)Nucleic Acids Res.37:5405-19も参照のこと)。従って、機能的「一本鎖」メガヌクレアーゼは、単一の転写産物から発現され得る。このような操作されたメガヌクレアーゼは、極めて低頻度のオフターゲットカッティングを示す。一本鎖メガヌクレアーゼをコードする遺伝子を網膜細胞、好ましくは桿体視細胞に送達することによって、突然変異RHO P23H対立遺伝子を特異的かつ優先的に標的化、切断、及び不活性化して、P23Hロドプシンの発現を抑制することが可能である。
残基7~153又は配列番号70~93のいずれか1つの残基198~344と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列;及び(b)第2の認識ハーフサイトに対する特異性を決定する第2の超可変(HVR2)領域を含む第2のサブユニットを更に含む。いくつかの実施形態では、P23H認識配列は配列番号1であり、組換えメガヌクレアーゼは、第1のサブユニット及び第2のサブユニットを含み、第1のサブユニットは、配列番号1の1つの第1の認識ハーフサイトを認識し、(a)配列番号6~69のいずれか1つの残基198~344又は配列番号70~93のいずれか1つの残基7~153と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列;及び(b)第1の認識ハーフサイトに対する特異性を決定する第1の超可変(HVR1)領域を含む。組換えメガヌクレアーゼは、配列番号1の第2のハーフサイトを認識する第2のサブユニットであって、(a)配列番号6~69のいずれか1つの残基7~153又は配列番号70~93のいずれか1つの残基198~344と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列;及び(b)第2の認識ハーフサイトに対する特異性を決定する第2の超可変(HVR2)領域を含む第2のサブユニットをさらに含む。
番号70~93のいずれか1つのそれぞれ位置215、219、235、237、及び261に対応する位置においてY若しくはM、F、H、S、及びWの1つ以上を含む。
クター、アデノウイルスベクター、又はAAVベクターであり得る。いくつかの特定の実施形態では、ウイルスベクターは、組換えAAVベクターであり得る。
ルスベクター、アデノウイルスベクター、又はAAVベクター等のウイルスベクターを使用して、標的細胞に導入され得る。いくつかの特定の実施形態では、組換えメガヌクレアーゼをコードする遺伝子は、組換えAAVベクターを使用して、標的細胞に送達される。
の任意の遺伝子改変細胞及び/又は本発明の方法に従って生産される任意の遺伝子改変細胞であって、野生型RHOタンパク質を発現する野生型RHO対立遺伝子と、P23H RHOタンパク質を発現しない破壊P23H対立遺伝子とを含む遺伝子改変細胞とを含み得る。いくつかの実施形態では、破壊P23H対立遺伝子は、メガヌクレアーゼ及びNHEJによる切断によって引き起こされる欠失突然変異を含む。
配列番号1は、1つのP23H認識配列(RHO-1/2)のヌクレオチド配列を示す。
す。
示す。
1.1 参考文献及び定義
本明細書で言及される特許及び科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立する。本明細書で引用される発行米国特許、許可出願、公開外国出願、及び参考文献(GenBankデータベース配列を含む)は、それぞれが参照により組み込まれると具体的且つ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
られ得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号6~93のいずれか1つの残基154~195を含むアミノ酸配列を有し得る。
、第2のタンパク質における改変と同じアミノ酸残基の置換であること、及び第1のタンパク質における改変のアミノ酸位置が、第2のタンパク質における改変のアミノ酸位置に対応又は合致することを示すために使用される。従って、X及びYが異なる数字であり得るという事実にもかかわらず、残基X及びYが配列アラインメントにおいて互いに対応する場合、第1のタンパク質におけるアミノ酸「A」への残基「X」の改変は、第2のタンパク質におけるアミノ酸「A」への残基「Y」の改変に対応するであろう。
らすC68A突然変異を含むRHO対立遺伝子配列(配列番号99)を指す。「ロドプシン」及び「野生型ロドプシン」という用語は互換的に使用され、野生型ロドプシン遺伝子によってコードされるタンパク質、特にNCBI参照配列NP_000530.1(配列番号100)によって特定されるタンパク質を指す。「P23Hロドプシン」という用語は、P23H置換を含む突然変異ロドプシンタンパク質、特に配列番号101に示されているタンパク質を指す。
、第2のタンパク質における改変と同じアミノ酸残基の置換であること、及び第1のタンパク質における改変のアミノ酸位置が、第2のタンパク質における改変のアミノ酸位置に対応又は合致することを示すために使用される。従って、X及びYが異なる数字であり得るという事実にもかかわらず、残基X及びYが配列アラインメントにおいて互いに対応する場合、第1のタンパク質におけるアミノ酸「A」への残基「X」の改変は、第2のタンパク質におけるアミノ酸「A」への残基「Y」の改変に対応するであろう。
本発明は、病原性P23Hロドプシンタンパク質をコードする突然変異RHO P23H対立遺伝子を標的化、切断、及び不活性化することによって、常染色体優性RPを修正又は予防し得るという仮説に部分的に基づくものである。驚くべきことに、組換えメガヌクレアーゼは、突然変異RHO P23H対立遺伝子に存在するP23H認識配列(例えば、配列番号1~4の1つ)を認識及び切断するように操作され得る。このような組換えメガヌクレアーゼは、対応する野生型対立遺伝子(配列番号96)と比べて、突然変異RHO P23H対立遺伝子を優先的に標的化及び切断し得る。切断部位におけるNHEJは、突然変異RHO P23H対立遺伝子の突然変異誘発及び破壊をもたらすが、機能的野生型RHO対立遺伝子は依然として、網膜の桿体視細胞において野生型ロドプシンを発現するほどにインタクトである。突然変異RHO P23H対立遺伝子の優先的不活性化及びP23Hロドプシン発現の破壊は、患者におけるRPの進行を予防し、遅延させ又は逆転させると予想される。
メガヌクレアーゼは、生細胞のゲノムにおいて部位特異的DNA切断を起こし得、このようなDNA切断は、突然変異誘発NHEJ修復を介して、又はトランスジェニックDNA配列との相同組換えを介して、ゲノムの永続的な改変をもたらし得る。NHEJは切断部位において突然変異誘発を生じさせ、対立遺伝子の不活性化をもたらし得る。NHEJ関連突然変異誘発は、早期停止コドンの生成、異常な非機能的タンパク質を生じさせるフレームシフト突然変異を介して対立遺伝子を不活性化し得るか、又はナンセンス介在性mRNA分解等の機構をトリガーし得る。NHEJを介して突然変異誘発を誘導するためのメガヌクレアーゼの使用は、特定の突然変異又は野生型対立遺伝子に存在する配列をターゲティングするために使用され得る。
ガヌクレアーゼである。一本鎖メガヌクレアーゼは、リンカーペプチドによって接続されたN末端サブユニット及びC末端サブユニットを含む。2つのドメインはそれぞれ、認識配列の半分(即ち、認識ハーフサイト)を認識し、DNA切断の部位は、2つのサブユニットの接触面付近の認識配列の中央にある。メガヌクレアーゼによるDNA切断が一組の4塩基対の3’一本鎖オーバーハングを生成するように、DNA鎖切断は、4塩基対によって相殺される。
のRHO1結合サブユニット領域及びRHO2結合サブユニット領域と、RHO2-L3-59メガヌクレアーゼのそれぞれRHO1結合サブユニット領域及びRHO2結合サブユニット領域との間のアミノ酸配列同一性を表す。
本発明を使用したRPの治療は、適切な組織の細胞において組換えメガヌクレアーゼを発現させ得ることを必要とする。本発明の組換えメガヌクレアーゼの送達のための標的組織は、眼の細胞、好ましくは眼の後部の細胞、更により好ましくは網膜の細胞(桿体視細胞を含む)である。組換えメガヌクレアーゼは、精製タンパク質として、又はメガヌクレアーゼをコードするRNA若しくはDNAとして送達され得る。一実施形態では、組換えメガヌクレアーゼタンパク質又は組換えメガヌクレアーゼをコードするmRNA若しくはベクターは、標的組織への直接的な注射を介して、標的細胞(例えば、網膜の細胞)に供給される。例えば、網膜下注射又は硝子体内注射を介した眼へのRNA、DNA、又は組換えAAVベクターの送達は、当技術分野で記載されている(例えば、Martin et al.(2002)Methods.28:267-275;Hauswirth et al.(2008)Human Gene Therapy.19(10):979-990;Johnson et al.(2008)Molecular Vision.14:2211-2226を参照のこと)。あるいは、メガヌクレアーゼタンパク質、mRNA、又はDNAは、循環系を介して全身送達され得る。
Acids Res.31:2717-2724)、Pep-1(Deshayes et al.(2004)Biochemistry 43:7698-7706及びHSV-1 VP-22(Deshayes et al.(2005)Cell Mol
Life Sci.62:1839-49が挙げられる。代替的な実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質/DNA/mRNAが標的細胞に結合し、標的細胞によってインターナリゼーションされるように、組換えメガヌクレアーゼ又は組換えメガヌクレアーゼをコードするDNA/mRNAは、標的細胞上で発現される特定の細胞表面受容体を認識する抗体に共有結合的又は非共有結合的にカップリングされる。あるいは、組換えメガヌクレアーゼタンパク質/DNA/mRNAは、このような細胞表面受容体の天然リガンド(又は、天然リガンドの一部)に共有結合的又は非共有結合的にカップリングされ得る。(McCall,et al.(2014)Tissue Barriers.2(4):e944449;Dinda,et al.(2013)Curr Pharm Biotechnol.14:1264-74;Kang,et al.(2014)Curr Pharm Biotechnol.15(3):220-30;Qian et al.(2014)Expert Opin Drug Metab Toxicol.10(11):1491-508)。眼の細胞への直接送達のためのターゲティングリガンドの例としては、RGD(Pollinger et al.(2013)PNAS.110(15):6115-6120)、トランスフェリン(Lajunen et al.(2014)Eur J Pharm Sci.62:23-32)及びヒアルロン酸(Martens et al.(2015)J Control Release.202:83-92)が挙げられる。
Ther.1:63-70;Greig et al.(2014),PLoS One.Nov 13;9(11):e112268)。代替的な実施形態では、ウイルスベクターは、循環系を介して全身送達される。当技術分野では、様々なAAVベクターが様々な組織に局在する傾向があることが公知である。網膜標的組織では、例えば、AAV血清型1、2、5、8、及び9を用いて、網膜視細胞の有効な形質導入が示されている(Petrs-Silva et al.(2014),Clinical Ophthalmology.8:127-136)。AAVベクターはまた、宿主細胞において第2鎖DNA合成を必要としないように自己相補的であり得る(McCarty et al.(2001),Gene Ther.8:1248-54)。
物を提供する。このような医薬組成物は、公知の技術に従って調製され得る。例えば、Remington,The Science And Practice of Pharmacy(21sted.2005)を参照のこと。本発明の医薬製剤の製造では、エンドヌクレアーゼポリペプチド(又は、それをコードするDNA/RNA)は、典型的には、薬学的に許容され得る担体と混合され、得られた組成物が被験体に投与される。当然のことながら、担体は、製剤中の任意の他の成分と適合性であるという意味において許容され得るものでなければならず、被験体に有害なものであってはならない。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、被験体における疾患の治療において有用な1つ以上の更なる薬剤又は生物学的分子を更に含み得る。同様に、更なる薬剤及び/又は生物学的分子は、別個の組成物として同時投与され得る。
本発明の実施形態は、本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼ及びその変異体を包含する。本発明の更なる実施形態は、本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド及びこのようなポリヌクレオチドの変異体を包含する。
%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、又は約99%の配列同一性を有するであろう。実施形態のポリペプチド又はサブユニットの生物学的に活性な変異体は、そのポリペプチド又はサブユニットとわずか約1~40個のアミノ酸残基、わずか約1~20個、わずか約1~10個、わずか約5個、わずか4個、3個、2個、又は更には1個のアミノ酸残基が異なり得る。
and Gaastra,eds.(1983),Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company,New York)及びそれらの中で引用されている参考文献を参照のこと。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Dayhoff et al.(1978),Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)(これは、参照により本明細書に組み込まれる)のモデルにおいて見出され得る。保存的置換(例えば、あるアミノ酸と、類似の特性を有する別のアミノ酸との交換)が最適であり得る。
P23H認識配列を認識及び切断するメガヌクレアーゼの評価
突然変異RHO P23H対立遺伝子に存在するP23H認識配列の1つ(即ち、配列番号1)を認識及び切断するように、組換えメガヌクレアーゼ(配列番号6~93)(本明細書では、「RHO1-2メガヌクレアーゼ」と総称される)を操作した(図1Aを参照のこと)。各RHO1-2組換えメガヌクレアーゼは、SV40由来のN末端ヌクレアーゼ局在化シグナルと、第1のメガヌクレアーゼサブユニットと、リンカー配列と、第2のメガヌクレアーゼサブユニットとを含む。各RHO1-2メガヌクレアーゼ中の第1のサブユニットは配列番号1のRHO1認識ハーフサイトに結合し、第2のサブユニットはRHO2認識ハーフサイトに結合する(図1Bを参照のこと)。
RHO1-2メガヌクレアーゼが配列番号1のP23H認識配列を認識及び切断し得るかを決定するために、以前に記載されているCHO細胞レポーターアッセイを使用して、各RHO1-2メガヌクレアーゼを評価した(国際公開第2012/167192号の図4を参照のこと)。アッセイを実施するために、細胞のゲノムに組み込まれた非機能的緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子発現カセットを有する一組のCHO細胞レポーター株を生産した。メガヌクレアーゼによるいずれかの認識配列の細胞内切断が相同的組換え事象を刺激して、機能的GFP遺伝子が生じるように、一組の認識配列によって各細胞株のGFP遺伝子を中断した。両方の細胞株において、認識配列の一方はRHO遺伝子に由来しており(配列番号1又は配列番号5のいずれか)、第2の認識配列は、「CHO-23/24」と称される対照メガヌクレアーゼによって特異的に認識された。配列番号1のP23H認識配列及びCHO-23/24認識配列を含むCHOレポーター細胞は、本明細書では「RHO1-2細胞」と称される。RHO1-2メガヌクレアーゼ(配列番号6~93)の1つをコードするか、又はCHO-23/34メガヌクレアーゼをコードするプラスミドDNAをRHO1-2細胞にトランスフェクトした。製造業者の説明書に従ってLipofectamine 2000(ThermoFisher)を使用して、96ウェルプレート中で、50ngのプラスミドDNAを約4×105個のCHO細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、フローサイトメトリーによって細胞を評価して、非トランスフェクト陰性対照(RHO1-2bs)と比較したGFP陽性細胞の割合を決定した。RHO1-2メガヌクレアーゼは全て、P23H認識配列を含む細胞株では、陰性対照を有意に超える頻度で、及びCHO-23/24陽性対照と同程度か又はそれを超える頻度で、GFP陽性細胞を生じさせることが見出されたが、これは、各RHO1-2メガヌクレアーゼが、細胞中の目的のP23H認識配列を効率的に認識及び切断することができたことを示している(図5を参照のこと)。
これらの研究では、本発明によって包含されるRHO1-2メガヌクレアーゼ(配列番号6~93)は、細胞中の配列番号1のP23H認識配列をターゲティング及び切断し得ることが実証された。
P23H認識配列に対するメガヌクレアーゼの特異性
配列番号1のP23H認識配列に対するRHO1-2メガヌクレアーゼ(配列番号6~93)の特異性を決定するために、対応する野生型RHO認識配列(配列番号5)(本明細書では、「RHO3-4認識配列」と称される)及びCHO-23/24認識配列を含むCHOレポーター細胞株を前述のように作製した。得られた細胞は、本明細書では「RHO3-4細胞」と称される。
RHO1-2メガヌクレアーゼをRHO1-2細胞又はRHO3-4細胞に導入して、組換えメガヌクレアーゼが、配列番号1のP23H認識配列と、対応する野生型認識配列(配列番号5)とを識別し得るかを決定した。前述のようにmRNAのエレクトロポレーションによって、RHO1-2メガヌクレアーゼmRNAをRHO1-2細胞又はRHO3-4細胞に導入し、3~5日後にGFP陽性細胞のパーセントを決定した。図7に示されているように、RHO3-4細胞よりもGFP陽性RHO1-2細胞の割合が高いことから明らかなように、試験したRHO1-2メガヌクレアーゼはそれぞれ、RHO3-4認識配列と比べてP23H認識配列を優先的に切断した(図7A~7Eを参照のこと)。その後の実験では、野生型RHO3-4認識配列(配列番号5)を優先的に標的化及び切断する組換えメガヌクレアーゼを開発することができたことが示された。上記CHO細胞レポーターアッセイを使用して評価した場合、このセットのメガヌクレアーゼは、RHO1-2細胞よりも高い割合のGFP陽性RHO3-4細胞をもたらすことが見出された(図7Fを参照のこと)。
本発明者らは、本発明によって包含されるRHO1-2メガヌクレアーゼが、対応する野生型RHO3-4認識配列(配列番号5)と比べて、配列番号1のP23H認識配列を優先的に切断することを実証した。
組換えメガヌクレアーゼを発現させるための組換えAAVベクターの作製及び発現
CHOレポーター細胞においてRHO1-2メガヌクレアーゼを発現するように、組換えAAVベクターを設計した。図8Aに示されているように、組換えAAVベクターは、5’から3’に、第1の逆方向末端反復(ITR)と、メガヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたCMVプロモーターと、第2の逆方向末端反復とを含む。この研究では、RHO-1/2-L2-49メガヌクレアーゼのコード配列を組換えAAVベクターに組み込んだ。
RHO1-2細胞におけるRHO-1/2-L2-49メガヌクレアーゼの発現のために、HEK-293細胞において標準的なトリプルトランスフェクションプロトコールを使用して、組換えAAVベクター(rAAV-RHO-1/2)を調製した(Drittanti et al.(2001),J Gene Med.3:59-71)。3つのウイルス濃度のrAAV-RHO-1/2ベクターをRHO1-2CHOレポーター細胞に形質導入した。形質導入の24時間後、細胞を溶解し、ポリクローナルメガヌクレアーゼ特異的抗体又はβ-アクチン特異的対照抗体を使用してウエスタンブロットによって分析した。図8Bに示されているように、3つのウイルス濃度全てにおいて、RHO-1
/2-L2-49の発現が観察された。
rAAV-RHO-1/2ベクターをRHO1-2細胞又はRHO3-4細胞に形質導入して、対応する野生型RHO3-4認識配列(配列番号5)と比べた、配列番号1のP23H認識配列の認識及び切断に関するAAV送達RHO-1/2-L2-49メガヌクレアーゼの特異性を実証した。図9に示されているように、形質導入の3日後、AAV送達RHO-1/2-L2-49メガヌクレアーゼは、使用したウイルス濃度全てにおいて、RHO3-4細胞よりも高い割合のGFP陽性RHO1-2細胞を誘導したが、これは、メガヌクレアーゼが突然変異配列を優先的に認識及び切断することを示している。
RHO-1/2-L2-49メガヌクレアーゼ又はGFPをコードする組換えAAVベクターを形質導入したRHO1-2細胞をシクロヘキシミドで処理してタンパク質翻訳を停止させ、細胞において発現されたタンパク質の安定性を決定した。シクロヘキシミド処理後の様々な時点(0時間、1.5時間、6時間、及び22時間)において細胞を溶解し、ウエスタンブロット分析によって、RHO-1/2-L2-49、GFP、及びβ-アクチンのタンパク質レベルを決定した。図10に示されているように、RHO-1/2-L2-49タンパク質はGFPよりも有意に長く存続し、22時間後において、メガヌクレアーゼタンパク質の減少は見られなかった。
この研究は、組換えAAVベクターを使用して、本発明によって包含されるRHO1-2メガヌクレアーゼを細胞において発現させ得ること、及びこのようなメガヌクレアーゼが、対応する野生型RHO3-4配列(配列番号5)と比べて、配列番号1のP23H認識配列を優先的に認識及び切断することを示している。更に、この研究は、組換えAAVベクターを使用して発現させた場合、RHO1-2メガヌクレアーゼタンパク質が細胞において安定であることを実証している。
AAVによって送達したRHO1-2メガヌクレアーゼによる、レポーター細胞におけるRHO1-2認識配列の切断
この研究の目的は、ウイルス形質導入によってRHO1-2メガヌクレアーゼを哺乳動物細胞において発現させ得ることを実証することであり、RHO1-2認識配列を切断するそれらの能力を更に実証することであった。
これらのAAV粒子が、RHO3-4認識配列(配列番号5)ではなくRHO1-2認識配列(配列番号1)を認識して特異的に切断することができる機能的RHO1-2メガヌクレアーゼを送達し得るかを決定するために、以前に記載されているCHOレポーター株(国際公開第2012/167192号を参照のこと)においてそれらを試験した。アッセイを実施するために、細胞のゲノムに組み込まれた非機能的緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子発現カセットを有する一組のCHO細胞レポーター株を生産した。メガヌクレアーゼによる認識配列の細胞内切断が相同的組換え事象を刺激して、機能的GFP遺伝子が生じるように、RHO1-2認識配列又はRHO3-4認識配列のいずれかによって各細胞株のGFP遺伝子を中断した。RHO1-2認識配列を含むCHOレポーター細胞は、この実験では「P23H RHO細胞」と称される。RHO3-4認識配列を含むCHOレポーター細胞は、この実験では「WT RHO細胞」と称される。GFPレポーターカセットを有しない野生型対照細胞は、この実験では「CHO K細胞」と称される。
RHO細胞及びWT RHO細胞からのみ、全細胞溶解物を調製した。再現性の指標を得るために、2回反復用の溶解物を採取した。(タンパク質濃度によって決定した)等量の溶解物をSDS-PAGEによって分離し、膜に転写し、GFP、I-CreIメガヌクレアーゼ又はβ-アクチン(ローディング対照用)のいずれかに対する抗体を使用してプローブした。RHO1-2メガヌクレアーゼは、I-CreIに対するポリクローナル抗体を用いて検出可能である。
まとめると、これらのデータは、本発明のRHO1-2メガヌクレアーゼのための発現カセットを有する組換えscAAVがCHOレポーター株に感染して、RHO1-2メガヌクレアーゼの発現をもたらすことができ、次いでこれが、WT RHO3-4認識ではなくP23H RHO1-2認識配列(配列番号1)を特異的に切断することができることを実証している。
RPのマウスモデルにおけるP23H対立遺伝子のインビボ切断
この研究の目的は、本発明のRHO1-2メガヌクレアーゼが、マウス網膜の視細胞内においてインビボでRHO1-2認識配列を標的化及び切断し得るかを決定することであった。
PCRバンドのディープシーケンシングにより、1サンプル当たり5×105個の配列が得られた。GFPをコードするscAAVを注射した網膜は、RHO1-2認識配列においてインデル(挿入又は欠失)を有する約4×103個の配列を示し、0.54%のバックグラウンドが確立された。RHO2-L5-14メガヌクレアーゼをコードするAAVを注射したマウス網膜から単離したDNAでは、インデルが3.92%で検出され、バックグラウンドよりも約7倍高かった(表3)。他の実験(データは示さず)では、対照マウスはより低頻度のインデルを示し、典型的には約0.01%であった。
ディープシーケンシングのデータは、RHO2-L5-14メガヌクレアーゼをコードするAAVの網膜下注射が、切断及び非相同末端結合後に、網膜色素変性症のマウスモデルにおいてP23H RHO1-2認識配列の突然変異をもたらしたことを実証している。
1.網膜細胞のウエスタンブロット分析
AAV送達後の野生型マウスの網膜細胞においてRHO2-L5-14メガヌクレアーゼを発現させ得ることを確認するために、上記のように網膜下注射によって、RHO2-L5-14をコードするscAAVを5匹の野生型マウスに投与した。OS(左)及びOD(右)の両方の眼に感染させた。注射の30日後に網膜を切開し、全細胞溶解物を調製し、上記のように抗I-CreI抗体を使用してウエスタンブロット分析を実施した。
ウエスタンブロット分析により、マウスに網膜下送達したRHO2L-5-14をコードするscAAVがRHO1-2メガヌクレアーゼの発現をもたらしたことが実証された。ヒトP23H RHO遺伝子に関するマウスモデルからのインデルデータと一緒に総合すると、これらのデータは、RHO1-2メガヌクレアーゼのAAV送達が、P23H RHO対立遺伝子に欠失を引き起こすのに有効であることを示唆している。
Claims (13)
- 薬学的に許容される担体と、配列番号1からなるP23H認識配列を認識及び切断する設計されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、を含み、
前記設計されたメガヌクレアーゼは、第1のサブユニット及び第2のサブユニットを含み、
前記第1のサブユニットが前記P23H認識配列の第1の認識ハーフサイトと結合し、且つ第1の超可変(HVR1)領域を含み、
前記第2のサブユニットが前記P23H認識配列の第2の認識ハーフサイトと結合し、且つ第2の超可変(HVR2)領域を含み、
前記設計されたメガヌクレアーゼは、配列番号7と少なくとも97%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、医薬組成物。 - 前記第1のサブユニットが、配列番号7の残基198~344と少なくとも97%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第2のサブユニットが、配列番号7の残基7~153と少なくとも97%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記第1のサブユニットが、配列番号7の残基198~344を含む、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
- 前記第2のサブユニットが、配列番号7の残基7~153を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記組換えメガヌクレアーゼが、配列番号7のアミノ酸配列を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記設計されたメガヌクレアーゼが、配列番号5からなる認識配列と比べて、配列番号1からなるP23H認識配列を優先的に認識及び切断する、請求項1~5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記ポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを含み、前記設計されたメガヌクレアーゼをコードする前記核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項1~6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記組換えAAVベクターが血清型5である、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記組換えAAVベクターが血清型2である、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記組換えAAVベクターが自己相補的AAVベクターである、請求項7~9のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記プロモーターが網膜細胞特異的プロモーターである、請求項7~10のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記プロモーターが桿体視細胞特異的プロモーターである、請求項7~11のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記プロモーターがヒトGタンパク質共役型受容体プロテインキナーゼ1(GRK1)プロモーターである、請求項7~12のいずれか1項に記載の医薬組成物。
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