JP2022110004A - 設計されたメガヌクレアーゼを使用した網膜色素変性症の治療 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒトロドプシン遺伝子対立遺伝子に見られる認識配列を認識及び切断するように設計された組換えメガヌクレアーゼを提供する。【解決手段】Ｐ２３Ｈ認識配列を認識及び切断する組換えメガヌクレアーゼであって、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、前記第１のサブユニットが前記Ｐ２３Ｈ認識配列の第１の認識ハーフサイトを認識し、且つ（ａ）特定のアミノ酸配列；及び（ｂ）第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、前記第２のサブユニットが前記Ｐ２３Ｈ認識配列の第２の認識ハーフサイトを認識し、（ａ）特定のアミノ酸配列；及び（ｂ）第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む、組換えメガヌクレアーゼである。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいて、２０１５年９月８日に出願さ
れた同時係属中の米国仮出願第６２／２１５，４６０号（この内容は、その全体が参照に
より組み込まれる）の優先権の利益を主張する。

発明の分野
本発明は、分子生物学及び組換え核酸技術の分野に関する。特に、本発明は、ヒトロド
プシン遺伝子対立遺伝子に見られる認識配列を認識及び切断するように設計された組換え
メガヌクレアーゼに関する。本発明は更に、網膜色素変性症を治療するための方法におけ
るこのような組換えメガヌクレアーゼの使用に関する。

発明の背景
網膜色素変性症（ＲＰ）は、網膜における視細胞の進行性変性による重度の視力障害を
引き起こす遺伝性変性眼疾患である。ＲＰは、最初に桿体視細胞が減少し、その結果、周
辺視力及び暗所視力が損なわれることを特徴とする。進行性桿体変性の後、網膜色素上皮
の異常及び錐体視細胞の劣化が起こる。疾患が進行するにつれて、患者は、夜盲症、進行
性視野狭窄、及び最終的には失明を経験する。ＲＰは３０００人に約１人が罹患しており
、単独で又は他の全身性障害と一緒に起こり得る。現在の所、ＲＰには有効な治療がない
。

ＲＰの遺伝的原因は、常染色体優性、常染色体劣性、Ｘ連鎖、又は母性由来であると特
定されている。常染色体優性型のＲＰは症例の３０～４０％を占めており（Ｍａ ｅｔ
ａｌ．（２１０５），Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ．１８（５：９２３６）：
１－６）、桿体視細胞及び網膜色素上皮で発現される遺伝子の突然変異に関連している。
ヒトロドプシン遺伝子（ＲＨＯ）は、常染色体優性ＲＰの病因に寄与することが示された
最初の遺伝子であり、この形態の疾患に関連する最も一般的な遺伝子である（ＭｃＷｉｌ
ｌｉａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．５：６１９－６２２；Ｄｒｙｊ
ａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ．３４３：３６４－３６６；Ｆａｒｒａｒ
ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ．２１：８５７－８６４）。実際、
ＲＨＯ突然変異は、全世界の常染色体優性ＲＰ症例の３０～４０％に関連し、米国の症例
の約２６．５％で観察されている（Ｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７７（３７）：３４１５０－３４１６０）。

ロドプシンは、光伝達の第１段階において、光刺激の電気シグナルへの変換に関与する
網膜桿体視細胞において発現される必須光色素である。ロドプシンは、１１－シス－レチ
ナール発色団に結合したオプシンタンパク質部分からなる光感受性Ｇタンパク質共役型受
容体として発現され、桿体視細胞の外部セグメントの円板膜の主成分である。

常染色体優性ＲＰに寄与することが示された最初のＲＨＯ突然変異は、ＲＨＯ遺伝子コ
ード配列の６８位におけるＣからＡへの突然変異（これは、コードタンパク質の２３位に
おけるプロリンからヒスチジンへの置換（Ｐ２３Ｈ）をもたらす）であった。この突然変
異は、本明細書では「ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ突然変異」と称され、前記突然変異を含むＲＨＯ
対立遺伝子は、本明細書では「突然変異ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ対立遺伝子」と称される。ＲＨ
Ｏ Ｐ２３Ｈ突然変異は、北米の常染色体優性ＲＰ症例で最も頻繁に報告されているＲＨ
Ｏ突然変異であり（Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ．２２：５６７－５７５）、単一の突然変異ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ対立遺伝子を有する
患者は、機能的野生型ＲＨＯ対立遺伝子の存在にもかかわらず、ＲＰを発症し得る。

不適切にＰ２３Ｈ置換フォールドを含むロドプシンタンパク質は、桿体視細胞の小胞体
に蓄積し、１１－シス－レチナール発色団によって再構成しない。常染色体優性ＲＰの多
くの症例では、ミスフォールディングＰ２３Ｈロドプシンは、桿体視細胞の変性及び死に
寄与する。蓄積したＰ２３Ｈロドプシンはプロテアソーム及びリソソーム分解を受け、Ｅ
Ｒストレス及び細胞アポトーシスを誘導し得るＥＲ関連アンフォールディングタンパク質
応答を刺激することが示されている（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ．３１８：９４４－９４９；Ｇｏｒｂａｔｙｕｋ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰＮＡＳ
Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７（１３）：５９６１－５９６６）。Ｐ２３Ｈロドプシンのミスフォ
ールディングはまた、野生型ロドプシンの輸送又は機能を妨害することによって、細胞死
に寄与し得る（Ｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００
７）。更に、Ｐ２３Ｈロドプシンは、脱リン酸化の遅延を示すことが示されており、細胞
死は、異常な細胞質Ｃａ２＋レベルに起因し得る（Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００８
）Ｃｌｉｎ．Ｏｐｔｈａｍｏｌ．２：８２１－８２８）。

栄養療法、医薬品、及び遺伝子療法を含む複数の戦略が、常染色体優性ＲＰを治療する
ために追求されている。遺伝子療法アプローチは、常染色体優性ＲＰを治療するための間
接的又は直接的な戦略のいずれかを採用している。間接的アプローチは、病原性突然変異
タンパク質の発現に直接影響を与えずに、桿体視細胞の生存を促進することを目的として
いる。例えば、桿体視細胞におけるアポトーシスを阻害するために、遺伝子療法を使用し
て、ＧＤＮＦ等の神経栄養因子及びＸＩＡＰ等の抗アポトーシスタンパク質が網膜細胞に
導入されている。

対照的に、遺伝子療法における直接的アプローチは、常染色体優性ＲＰの病因に直接寄
与するタンパク質のレベルを調節しようとしている。ＲＨＯ関連常染色体優性ＲＰとの関
連では、Ｐ２３Ｈロドプシンのプロテアソーム分解を増強する戦略があったが、動物モデ
ルでは有意な成功が見られなかった。別の戦略は標的ＲＮＡ療法を利用して、機能的野生
型対立遺伝子の発現を維持しながら、突然変異ＲＨＯ対立遺伝子をサイレンシングしてい
る。このようなアプローチはリボザイム及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用して、ラット
における突然変異ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ導入遺伝子によって産生された特定のｍＲＮＡ転写産
物をターゲティングしている。

更なる戦略は、野性型ＲＨＯ対立遺伝子及び突然変異ＲＨＯ対立遺伝子の両方を非特異
的にサイレンシングし、それと同時に、野生型ＲＨＯの代替コピーを送達して野生型タン
パク質を発現させることによって、「抑制及び代替」アプローチを追求している。例えば
、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙらは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを利用して、ヘテロ接
合性Ｐｒｏ２３Ｈｉｓ＋／－マウスにおいて、野生型及び突然変異ＲＨＯ対立遺伝子の両
方をターゲティング及び抑制するように設計されたショートヘアピンＲＮＡを送達及び発
現させ、ＲＨＯ代替遺伝子も送達及び発現させた（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（２
００７）Ａｍｅｒ．Ｊ．ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．８１：１２７－１３５）
。同様に、Ｐａｌｆｉらは、ＡＡＶベクターを使用して、ＲＨＯ代替遺伝子をＲｈｏ－／
－ノックアウトマウスに送達することを実証した（Ｐａｌｆｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０
）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２１：３１１－３２３）。しかしながら、こ
のようなアプローチでは、ＲＨＯ代替レベルが過度に高い場合、毒性及びオフターゲット
効果が誘導され得る。更に、ＲＮＡｉアプローチのオフターゲット効果は公知の合併症で
あり、長さが２１塩基対を超えるｓｉＲＮＡは、動物モデルにおいて網膜変性を誘導し得
ることが示されている（Ｋｌｅｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ
．２０（１）：１０１－１０８）。

以前に、Ｚｈａｎｇの米国特許出願公開第２０１２／０２０４２８２号（「Ｚｈａｎｇ
出願」）では、ヒトＲＨＯ遺伝子中のＤＮＡ標的を切断するための設計されたヌクレアー
ゼの使用が開示された。Ｚｈａｎｇ出願では、突然変異ＲＨＯ対立遺伝子の発現を標的化
及び調節するためのいくつかのアプローチが開示された。具体的には、Ｚｈａｎｇ出願で
は、ＲＨＯ遺伝子発現のリプレッサーとして、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）及
びＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質等の操作されたＤＮＡ結合ドメインを使用
することが議論された。また、Ｚｈａｎｇ出願には、調節ドメイン又は機能ドメインに作
動可能に連結されたＺＦＰ又はＴＡＬＥ結合ドメインを含む融合タンパク質が記載された
。機能ドメインは、ＲＨＯ遺伝子発現を下方制御する転写リプレッサードメインであり得
る。あるいは、機能ドメインは、転写活性化ドメインであり得る。更に、機能ドメインは
、ヌクレアーゼドメインを含み得る。ヌクレアーゼドメインに連結すると、得られる融合
タンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及びＴＡＬＥヌクレアーゼ（Ｔ
ＡＬＥＮ）を含む。

ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮに加えて、Ｚｈａｎｇ出願では、野生型及び／又は突然変異ＲＨ
Ｏ対立遺伝子の発現を標的化及び阻害するためのメガヌクレアーゼの使用が議論されてい
る。Ｚｈａｎｇ出願には、認識配列における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介してＲＨＯ
遺伝子発現を破壊するための、及び代替野生型ＲＨＯ遺伝子配列を導入して野生型ロドプ
シンタンパク質を発現させるための、このようなメガヌクレアーゼの使用が記載されてい
る。しかしながら、Ｚｈａｎｇ出願によって同定されたＲＨＯ遺伝子中の認識配列は、野
生型ＲＨＯ遺伝子に見られる３組のＺＦＮ標的部位に限定される（Ｚｈａｎｇ出願の表２
を参照のこと）。

また、Ｌｅｍａｉｒｅ及びＡｒｎｏｕｌｄの米国特許出願公開第２０１３／０１８３２
８２号（「Ｌｅｍａｉｒｅ出願」）では、ＲＨＯ遺伝子中のＤＮＡ標的を切断するための
設計されたメガヌクレアーゼの使用が開示された。Ｌｅｍａｉｒｅ出願では、３つの遺伝
子療法戦略の１つにおいて使用するためにＲＨＯ遺伝子の様々な領域を標的化するように
設計されたメガヌクレアーゼが開示された。第１の戦略は遺伝子修正であり、操作された
メガヌクレアーゼは特定の突然変異の近傍の認識配列に特異的であり、その部位における
二本鎖切断を誘導し、対応する非突然変異対立遺伝子配列のゲノムへの相同組換えに依拠
する。Ｌｅｍａｉｒｅ出願に開示された第２の戦略はエクソンノックインであり、病的突
然変異の発現を防止しながら、メガヌクレアーゼを使用して合成野生型コード配列をゲノ
ムに導入することによって、機能的タンパク質を再構築する。Ｌｅｍａｉｒｅ出願に開示
された第３の戦略は突然変異誘発による遺伝子不活性化であり、ゲノム中の標的認識配列
における二本鎖切断を誘導するメガヌクレアーゼと、突然変異を誘導する切断部位におけ
るＮＨＥＪとに依拠する。

したがって、当技術分野では、ＲＰの治療のために、ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ対立遺伝子を優
先的に標的化及び不活性化し得る方法が依然として必要である。

米国特許出願公開第２０１２／０２０４２８２号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０１８３２８２号明細書

Ｍａ ｅｔ ａｌ．（２１０５），Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ．１８（５：９２３６）：１－６ ＭｃＷｉｌｌｉａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．５：６１９－６２２；Ｄｒｙｊａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ．３４３：３６４－３６６；Ｆａｒｒａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ．２１：８５７－８６４ Ｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７７（３７）：３４１５０－３４１６０ Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２２：５６７－５７５ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１８：９４４－９４９；Ｇｏｒｂａｔｙｕｋ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７（１３）：５９６１－５９６６ Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｌｉｎ．Ｏｐｔｈａｍｏｌ．２：８２１－８２８ Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｍｅｒ．Ｊ．ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．８１：１２７－１３５ Ｐａｌｆｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２１：３１１－３２３ Ｋｌｅｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（１）：１０１－１０８

本発明は、Ｐ２３Ｈ認識配列を認識及び切断するように操作された組換えメガヌクレア
ーゼを提供する。本発明は更に、組換えメガヌクレアーゼ（又はコードされた組換えメガ
ヌクレアーゼ）が、突然変異ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ対立遺伝子上に存在するＰ２３Ｈ認識配列
を優先的に標的化及び切断するように、このような組換えメガヌクレアーゼ又はこのよう
な組換えメガヌクレアーゼをコードする遺伝子を、ＲＰを有する患者の細胞に送達するこ
とを含む方法を提供する。ＮＨＥＪは切断部位において起こり、突然変異ＲＨＯ Ｐ２３
Ｈ対立遺伝子の突然変異誘発及び破壊をもたらすが、機能的野生型ＲＨＯ対立遺伝子は依
然として、網膜の桿体視細胞において野生型ロドプシンを発現するほどにインタクトであ
る。突然変異ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ対立遺伝子の優先的な不活性化及びＰ２３Ｈロドプシン発
現の破壊は、患者におけるＲＰの進行を遅延させ、予防し又は逆転させると予想される。

従って、いくつかの実施形態では、本発明は、突然変異ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ対立遺伝子に
存在するが野生型ＲＨＯ対立遺伝子に存在しないＰ２３Ｈ認識配列を認識及び切断するよ
うに操作された組換えメガヌクレアーゼを提供する。本発明は更に、ＲＰ、好ましくは常
染色体優性ＲＰを治療するための方法であって、突然変異ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ対立遺伝子を
優先的に標的化及び切断する方法における、このような組換えメガヌクレアーゼの使用を
提供する。このように、Ｐ２３Ｈロドプシンの発現は、メガヌクレアーゼ切断部位におけ
るＮＨＥＪによって抑制されるが、機能的野生型ＲＨＯ対立遺伝子は依然として、網膜の
桿体視細胞において野生型ロドプシンを発現するほどにインタクトである。

従って、本発明は、目的の遺伝子座中の特定のＤＮＡ配列を認識するように操作された
部位特異的レアカッティングホーミングエンドヌクレアーゼ（「メガヌクレアーゼ」とも
称される）の使用を含む。ホーミングエンドヌクレアーゼは、植物及び真菌のゲノムに一
般に見られる１５～４０塩基対の切断部位を認識する天然に存在するヌクレアーゼのグル
ープである。それらは、グループ１自己スプライシングイントロン及びインテイン等の寄
生生物ＤＮＡエレメントに関連することが多い。それらは、染色体において二本鎖切断を
生じさせて細胞ＤＮＡ修復機構をリクルートすることによって、宿主ゲノム中の特定の位
置における相同組換え又は遺伝子挿入を自然に促進する（Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６）
，Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：４９－９５）。ホーミングエンドヌクレアーゼは
、一般的に、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号９６）ファミリー、ＧＩ
Ｙ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックスファミリー、及びＨＮＨファミリーに分
類される。これらのファミリーは、触媒活性及び認識配列に影響を与える構造モチーフを
特徴とする。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号９６）ファミリーのメンバーは、１
コピー又は２コピーの保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号９６）モチーフを有する
ことを特徴とする（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１８）：３７５７－３７７４）。１コピーのＬＡＧＬＩＤＡ
ＤＧ（配列番号９６）モチーフを有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号９６）ホーミング
エンドヌクレアーゼはホモ二量体を形成するのに対して、２コピーのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ
（配列番号９６）モチーフを有するメンバーは単量体として見られる。

操作された部位特異的組換えメガヌクレアーゼを生産するための方法は、当技術分野で
公知である。Ｉ－ＣｒｅＩ（配列番号９５）は、藻類Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅ
ｉｎｈａｒｄｔｉｉの葉緑体染色体中の２２塩基対の認識配列を認識及びカットするホー
ミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号９６）ファミリーのメンバー
である。野生型Ｉ－ＣｒｅＩ切断部位優先性を改変するために、遺伝子選択技術が使用さ
れている（Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２
：３１－４１；Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．３３：ｅ１７８；Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：３８７０－９，Ａｒｎｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０
０６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３－５８）。より最近では、モノＬＡＧＬ
ＩＤＡＤＧ（配列番号９６）ホーミングエンドヌクレアーゼを合理的に設計する方法であ
って、多様なＤＮＡ部位（哺乳動物、酵母、植物、細菌及びウイルスのゲノム中の部位を
含む）をターゲティングするようにＩ－ＣｒｅＩ及び他のホーミングエンドヌクレアーゼ
を包括的に再設計することができる方法が記載された（国際公開第２００７／０４７８５
９号）。

国際公開第２００９／０５９１９５号に最初に記載されているように、Ｉ－ＣｒｅＩ及
びその操作された誘導体は、通常は二量体であるが、第１のサブユニットのＣ末端を第２
のサブユニットのＮ末端に接続する短いペプチドリンカーを使用して、単一ポリペプチド
に融合され得る（例えば、Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．３７：１６５０－６２；Ｇｒｉｚｏｔ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：５４０５－１９も参照のこと）。従って、機能的「一
本鎖」メガヌクレアーゼは、単一の転写産物から発現され得る。このような操作されたメ
ガヌクレアーゼは、極めて低頻度のオフターゲットカッティングを示す。一本鎖メガヌク
レアーゼをコードする遺伝子を網膜細胞、好ましくは桿体視細胞に送達することによって
、突然変異ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ対立遺伝子を特異的かつ優先的に標的化、切断、及び不活性
化して、Ｐ２３Ｈロドプシンの発現を抑制することが可能である。

従って、一態様では、本発明は、Ｐ２３Ｈ突然変異対立遺伝子中のＰ２３Ｈ置換をコー
ドする突然変異を含む認識配列を認識及び切断する組換えメガヌクレアーゼを提供する。
いくつかの実施形態では、認識配列は、配列番号１～４（即ち、Ｐ２３Ｈ認識配列）から
選択される。組換えメガヌクレアーゼは、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを
含み、第１のサブユニットは、Ｐ２３Ｈ認識配列の１つの第１の認識ハーフサイトを認識
し、（ａ）配列番号６～６９のいずれか１つの残基１９８～３４４又は配列番号７０～９
３のいずれか１つの残基７～１５３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配
列；及び（ｂ）第１の認識ハーフサイトに対する特異性を決定する第１の超可変（ＨＶＲ
１）領域を含む。組換えメガヌクレアーゼは、Ｐ２３Ｈ認識配列の１つの第２のハーフサ
イトを認識する第２のサブユニットであって、（ａ）配列番号６～６９のいずれか１つの
残基７～１５３又は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基１９８～３４４と少なくと
も８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及び（ｂ）第２の認識ハーフサイトに対す
る特異性を決定する第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む第２のサブユニットを更に含む
。いくつかの実施形態では、Ｐ２３Ｈ認識配列は配列番号１であり、組換えメガヌクレア
ーゼは、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットは、配
列番号１の１つの第１の認識ハーフサイトを認識し、（ａ）配列番号６～６９のいずれか
１つの残基１９８～３４４又は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基７～１５３と少
なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及び（ｂ）第１の認識ハーフサイト
に対する特異性を決定する第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含む。組換えメガヌクレアー
ゼは、配列番号１の第２のハーフサイトを認識する第２のサブユニットであって、（ａ）
配列番号６～６９のいずれか１つの残基７～１５３又は配列番号７０～９３のいずれか１
つの残基１９８～３４４と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；及び（
ｂ）第２の認識ハーフサイトに対する特異性を決定する第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を
含む第２のサブユニットをさらに含む。

いくつかの実施形態では、Ｐ２３Ｈ認識配列は配列番号１であり、第１のサブユニット
は、配列番号６～６９のいずれか１つの残基１９８～３４４又は配列番号７０～９３のい
ずれか１つの残基７～１５３と少なくとも８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有
するアミノ酸配列を含み、第２のサブユニットは、配列番号６～６９のいずれか１つの残
基７～１５３又は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基１９８～３４４と少なくとも
８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

他の実施形態では、Ｐ２３Ｈ認識配列は配列番号１であり、ＨＶＲ１領域は、（ａ）配
列番号６～６９のいずれか１つの位置２１５；又は（ｂ）配列番号７０～９３のいずれか
１つの位置２４に対応する位置においてＷ若しくはＹを含む。他の実施形態では、Ｐ２３
Ｈ認識配列は配列番号１であり、ＨＶＲ１領域は、（ａ）配列番号６～６９のいずれか１
つの位置２１９；又は（ｂ）配列番号７０～９３のいずれか１つの位置２８に対応する位
置においてＩを含む。他の実施形態では、Ｐ２３Ｈ認識配列は配列番号１であり、ＨＶＲ
１領域は、（ａ）配列番号６～６９のいずれか１つの位置２５９；又は（ｂ）配列番号７
０～９３のいずれか１つの位置６８に対応する位置においてＶを含む。他の実施形態では
、Ｐ２３Ｈ認識配列は配列番号１であり、ＨＶＲ１領域は、（ａ）配列番号６～６９のい
ずれか１つのそれぞれ位置２１５、２１９、及び２５９；又は（ｂ）配列番号７０～９３
のいずれか１つのそれぞれ位置２４、２８、及び６８に対応する位置においてＷ若しくは
Ｙ、Ｉ及びＶの１つ以上を含む。

他の実施形態では、Ｐ２３Ｈ認識配列は配列番号１であり、ＨＶＲ２領域は、（ａ）配
列番号６～６９のいずれか１つの位置２４；又は（ｂ）配列番号７０～９３のいずれか１
つの位置２１５に対応する位置においてＹ若しくはＭを含む。他の実施形態では、Ｐ２３
Ｈ認識配列は配列番号１であり、ＨＶＲ２領域は、（ａ）配列番号６～６９のいずれか１
つの位置２８；又は（ｂ）配列番号７０～９３のいずれか１つの位置２１９に対応する位
置においてＦを含む。他の実施形態では、Ｐ２３Ｈ認識配列は配列番号１であり、ＨＶＲ
２領域は、（ａ）配列番号６～６９のいずれか１つの位置４４；又は（ｂ）配列番号７０
～９３のいずれか１つの位置２３５に対応する位置においてＨを含む。他の実施形態では
、Ｐ２３Ｈ認識配列は配列番号１であり、ＨＶＲ２領域は、（ａ）配列番号６～６９のい
ずれか１つの位置４６；又は（ｂ）配列番号７０～９３のいずれか１つの位置２３７に対
応する位置においてＳを含む。他の実施形態では、Ｐ２３Ｈ認識配列は配列番号１であり
、ＨＶＲ２領域は、（ａ）配列番号６～６９のいずれか１つの位置７０；又は（ｂ）配列
番号７０～９３のいずれか１つの位置２６１に対応する位置においてＷを含む。他の実施
形態では、Ｐ２３Ｈ認識配列は配列番号１であり、ＨＶＲ２領域は、（ａ）配列番号６～
６９のいずれか１つのそれぞれ位置２４、２８、４４、４６、及び７０；又は（ｂ）配列
番号７０～９３のいずれか１つのそれぞれ位置２１５、２１９、２３５、２３７、及び２
６１に対応する位置においてＹ若しくはＭ、Ｆ、Ｈ、Ｓ、及びＷの１つ以上を含む。

いくつかの実施形態では、組換えメガヌクレアーゼは、第１のサブユニット及び第２の
サブユニットを共有結合的に接続するリンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼである。

いくつかの実施形態では、Ｐ２３Ｈ認識配列は配列番号１であり、第１のサブユニット
は、配列番号６～６９のいずれか１つの残基１９８～３４４又は配列番号７０～９３のい
ずれか１つの残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ２３Ｈ認識配列は配列
番号１であり、第２のサブユニットは、配列番号６～６９のいずれか１つの残基７～１５
３又は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基１９８～３４４を含む。

いくつかの特定の実施形態では、Ｐ２３Ｈ認識配列は配列番号１であり、メガヌクレア
ーゼは、配列番号６～９３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、組換えメガヌクレアーゼは、野生型ＲＨＯ対立遺伝子に存在
する対応する２２塩基対の認識配列と比べて、Ｐ２３Ｈ認識配列（配列番号１～４）の１
つ（例えば、配列番号５と比べて配列番号１）を優先的に認識及び切断する。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼをコードする
核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼをコードする
核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。いく
つかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、ウイルスベクターをコードする。いくつか
のこのような実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイ
ルスベクター、アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターで
あり得る。いくつかの特定の実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、組換えＡＡＶベクタ
ーをコードする。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼをコードする
核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを提供する。いくつ
かの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベク
ター、アデノウイルスベクター、又はＡＡＶベクターであり得る。いくつかの特定の実施
形態では、ウイルスベクターは、組換えＡＡＶベクターであり得る。

別の態様では、本発明は、ＲＰ、好ましくはＰ２３Ｈ突然変異によって引き起こされる
常染色体優性ＲＰを有する被験体の治療のための医薬組成物を提供する。医薬組成物は、
薬学的に許容され得る担体及び：（ａ）インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で標的細胞において
発現される本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸；又は（ｂ）
標的細胞におけるＰ２３Ｈ認識配列（配列番号１～４）の１つに対する特異性を有する本
明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼタンパク質を含み得る。

いくつかの実施形態では、組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸は、ｍＲＮＡであ
り得る。

他の実施形態では、医薬組成物は、核酸を含む組換えＤＮＡ構築物を含む。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、核酸を含むウイルスベクターを含む。このよ
うな一実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベ
クター、アデノウイルスベクター、又はＡＡＶベクターであり得る。いくつかの特定の実
施形態では、ウイルスベクターは、組換えＡＡＶベクターであり得る。

別の態様では、本発明は、医薬として使用するための、本明細書に記載される組換えメ
ガヌクレアーゼを提供する。本発明は更に、ＲＰ、好ましくはＰ２３Ｈ突然変異によって
引き起こされる常染色体優性ＲＰを治療するための、好ましくは、Ｐ２３Ｈ突然変異対立
遺伝子及び機能的対立遺伝子、正常対立遺伝子、又は野生型対立遺伝子についてヘテロ接
合性の被験体のための医薬の製造における、本明細書に記載される組換えメガヌクレアー
ゼの使用を提供する。

別の態様では、本発明は、医薬として使用するための単離されたポリヌクレオチドであ
って、本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離さ
れたポリヌクレオチドを提供する。本発明は更に、ＲＰ、好ましくはＰ２３Ｈ突然変異に
よって引き起こされる常染色体優性ＲＰを治療するための、好ましくは、Ｐ２３Ｈ突然変
異対立遺伝子及び機能的対立遺伝子、正常対立遺伝子、又は野生型対立遺伝子についてヘ
テロ接合性の被験体のための医薬の製造における、単離されたポリヌクレオチドの使用で
あって、前記単離されたポリヌクレオチドが、本明細書に記載される組換えメガヌクレア
ーゼをコードする核酸配列を含む使用を提供する。

別の態様では、本発明は、医薬として使用するための組換えＡＡＶベクターであって、
本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離されたポ
リヌクレオチドを含む組換えＡＡＶベクターを提供する。本発明は更に、ＲＰ、好ましく
はＰ２３Ｈ突然変異によって引き起こされる常染色体優性ＲＰを治療するための、好まし
くは、Ｐ２３Ｈ突然変異対立遺伝子及び機能的対立遺伝子、正常対立遺伝子、又は野生型
対立遺伝子についてヘテロ接合性の被験体のための医薬の製造における、組換えＡＡＶベ
クターの使用であって、前記組換えＡＡＶベクターが、本明細書に記載される組換えメガ
ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む使用を提供
する。

別の態様では、本発明は、それを必要とする被験体におけるＰ２３Ｈ突然変異によって
引き起こされるＲＰを治療するための、好ましくは、Ｐ２３Ｈ突然変異対立遺伝子及び機
能的対立遺伝子、正常対立遺伝子、又は野生型対立遺伝子についてヘテロ接合性の被験体
のための方法を提供する。前記方法は、前記被験体の標的細胞のＤＮＡと、Ｐ２３Ｈ突然
変異を含む認識配列（例えば、配列番号１～４）を認識及び切断する本明細書に記載され
る組換えメガヌクレアーゼとを接触させることを含む。被験体の標的細胞は、ＲＨＯ遺伝
子対立遺伝子中のＰ２３Ｈ認識配列を含み、認識配列の切断は、ＲＨＯ遺伝子対立遺伝子
の発現を阻害する。

いくつかの実施形態では、前記方法は、Ｐ２３Ｈ突然変異によって引き起こされる常染
色体優性ＲＰを治療するためのものであり、好ましくは、Ｐ２３Ｈ突然変異対立遺伝子及
び機能的対立遺伝子、正常対立遺伝子、又は野生型対立遺伝子についてヘテロ接合性の被
験体のためのものである。

いくつかの実施形態では、被験体における標的細胞は、網膜標的細胞である。好ましい
実施形態では、網膜細胞は、桿体視細胞である。

前記方法のいくつかの実施形態では、組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸が標的
細胞に導入される。いくつかのこのような実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡであり得る。
他のこのような実施形態では、核酸は、組換えＤＮＡ構築物を使用して、細胞に導入され
得る。更に他のこのような実施形態では、核酸は、レトロウイルスベクター、レンチウイ
ルスベクター、アデノウイルスベクター、又はＡＡＶベクター等のウイルスベクターを使
用して、標的細胞に導入され得る。いくつかの特定の実施形態では、組換えメガヌクレア
ーゼをコードする遺伝子は、組換えＡＡＶベクターを使用して、標的細胞に送達される。

前記方法の他の実施形態では、本発明の組換えメガヌクレアーゼタンパク質が標的細胞
に導入される。

前記方法の様々な実施形態では、組換えメガヌクレアーゼタンパク質又は組換えメガヌ
クレアーゼをコードする核酸は、本明細書に記載される医薬組成物で被験体に投与され得
る。

別の態様では、本発明は、遺伝子改変細胞を生産するための方法を提供する。前記方法
は、（ａ）少なくとも１つのＰ２３Ｈ ＲＨＯ対立遺伝子を含む細胞を得ること；並びに
（ｂ）（ｉ）前記細胞において発現される本発明の組換えメガヌクレアーゼをコードする
核酸配列；又は（ｉｉ）組換えメガヌクレアーゼタンパク質を前記細胞に導入することを
含み、前記組換えメガヌクレアーゼは、Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ対立遺伝子上に存在するＰ２３
Ｈ認識配列に対する特異性を有し、前記組換えメガヌクレアーゼはＰ２３Ｈ認識配列を認
識及び切断し、前記Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ対立遺伝子の発現は、切断部位における非相同末端
結合によって破壊される。好ましくは、細胞は、改変前に、Ｐ２３Ｈ突然変異対立遺伝子
及び機能的対立遺伝子、正常対立遺伝子、又は野生型対立遺伝子についてヘテロ接合性で
ある。

前記方法のいくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞であり得る。いくつかのこのよ
うな実施形態では、真核細胞は、多能性細胞であり得る。このような実施形態では、多能
性細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞であり得る。いくつかの特定の実施形態では、ｉ
ＰＳ細胞は、ヒトｉＰＳ細胞であり得る。

前記方法の他の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡであり得る。

前記方法のいくつかの実施形態では、核酸は、組換えＤＮＡ構築物を使用して、細胞に
導入され得る。

前記方法のいくつかの実施形態では、核酸は、ウイルスベクターを使用して、細胞に導
入され得る。いくつかのこのような実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス
ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はＡＡＶベクターであ
り得る。いくつかの特定の実施形態では、ウイルスベクターは、組換えＡＡＶベクターで
あり得る。

別の態様では、本発明は、野生型ＲＨＯ対立遺伝子及び破壊Ｐ２３Ｈ対立遺伝子を含む
遺伝子改変細胞であって、野生型ＲＨＯタンパク質を発現し、Ｐ２３Ｈ ＲＨＯタンパク
質を発現せず、本明細書に記載される本発明の方法に従って生産される遺伝子改変細胞を
提供する。いくつかの実施形態では、破壊Ｐ２３Ｈ対立遺伝子は、メガヌクレアーゼ及び
ＮＨＥＪによる切断によって引き起こされる欠失突然変異を含む。いくつかの特定の実施
形態では、遺伝子改変細胞は、多能性細胞、ｉＰＳ細胞、又はヒトｉＰＳ細胞であり得る
。

別の態様では、本発明は、Ｐ２３Ｈ突然変異によって引き起こされるＲＰを有する被験
体を治療するための、好ましくは、Ｐ２３Ｈ突然変異対立遺伝子及び機能的対立遺伝子、
正常対立遺伝子又は野生型対立遺伝子についてヘテロ接合性の被験体のための医薬組成物
を提供する。異なる実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体と、本発明
の任意の遺伝子改変細胞及び／又は本発明の方法に従って生産される任意の遺伝子改変細
胞であって、野生型ＲＨＯタンパク質を発現する野生型ＲＨＯ対立遺伝子と、Ｐ２３Ｈ
ＲＨＯタンパク質を発現しない破壊Ｐ２３Ｈ対立遺伝子とを含む遺伝子改変細胞とを含み
得る。いくつかの実施形態では、破壊Ｐ２３Ｈ対立遺伝子は、メガヌクレアーゼ及びＮＨ
ＥＪによる切断によって引き起こされる欠失突然変異を含む。

別の態様では、本発明は、それを必要とする被験体におけるＰ２３Ｈ突然変異によって
引き起こされるＲＰを治療するための、好ましくは、Ｐ２３Ｈ突然変異対立遺伝子及び機
能的対立遺伝子、正常対立遺伝子、又は野生型対立遺伝子についてヘテロ接合性の被験体
のための方法を提供する。前記方法は、薬学的に許容され得る担体と、本発明の遺伝子改
変細胞であって、野生型ＲＨＯタンパク質を発現する野生型ＲＨＯ対立遺伝子と、Ｐ２３
Ｈ ＲＨＯタンパク質を発現しない破壊Ｐ２３Ｈ対立遺伝子とを含む遺伝子改変細胞とを
含む本明細書に記載される医薬組成物を被験体に投与することを含む。いくつかの実施形
態では、破壊Ｐ２３Ｈ対立遺伝子は、メガヌクレアーゼ及びＮＨＥＪによる切断によって
引き起こされる欠失突然変異を含む。

前記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、標的組織に送達され得る。こ
のような標的組織としては、眼、特に網膜が挙げられ得る。

更に、前記方法のいくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、遺伝子改変ｉＰＳ細胞
であり得る。このような実施形態では、遺伝子改変ｉＰＳ細胞は、標的組織に送達される
と、野生型ＲＨＯタンパク質を発現する細胞に分化し得る。いくつかの特定の実施形態で
は、遺伝子改変ｉＰＳ細胞は、野生型ロドプシンタンパク質を発現するがＰ２３Ｈロドプ
シンタンパク質を発現しない網膜細胞、特に桿体視細胞に分化し得る。

Ｐ２３Ｈ認識配列。Ａ）配列番号１の２２塩基対のＰ２３Ｈ認識配列と、野生型ヒトＲＨＯ遺伝子対立遺伝子に存在する対応する２２塩基対の認識配列（配列番号５）とのアライメント。これらの配列は、Ｐ２３Ｈ突然変異又は野生型ＲＨＯ遺伝子コード配列（それぞれ配列番号９８及び９７）のヌクレオチド４９～７０に及ぶ。Ｐ２３Ｈ認識配列内のＣ６８Ａヌクレオチド置換が強調されている。Ｂ）配列番号１のＰ２３Ｈ認識配列は、ＲＨＯ１及びＲＨＯ２と称される２つの認識ハーフサイトを含む。示されているように、各認識ハーフサイトは９塩基対を含む。認識配列中のハーフサイトは、４塩基対の中央領域によって分離されている。Ｃ）本発明の組換えメガヌクレアーゼは２つのサブユニットを含み、第１のサブユニットは、Ｐ２３Ｈ認識配列（例えば、配列番号１）の第１のハーフサイト（例えば、ＲＨＯ１）に結合し、第２のサブユニットは、第２ハーフサイト（例えば、ＲＨＯ２）に結合する。組換えメガヌクレアーゼが一本鎖メガヌクレアーゼである実施形態では、第１のサブユニットは、Ｎ末端サブユニット又はＣ末端サブユニットのいずれかとして配置され得る。同様に、第２のサブユニットは、Ｎ末端サブユニット又はＣ末端サブユニットのいずれかとして配置され得る。 ＲＨＯ１結合サブユニットのアミノ酸アライメント。Ａ～Ｆ）本発明によって包含される組換えメガヌクレアーゼは、配列番号１の９塩基対のＲＨＯ１認識ハーフサイトに結合する１つのサブユニットを含む。アミノ酸配列アラインメントは、配列番号６～９３に示されている組換えメガヌクレアーゼのＲＨＯ１結合サブユニット（配列番号１０２～１８８）について示されている。示されているように、配列番号６～６９のＲＨＯ１結合サブユニットは残基１９８～３４４を含むのに対して、配列番号７０～９３のＲＨＯ１結合サブユニットは残基７～１５３を含む。示されているように、各ＲＨＯ１結合サブユニットは、５６アミノ酸の超可変領域を含む。超可変領域内の可変残基は影付きであり、各位置における最も頻繁なアミノ酸がさらに強調されている；最も多く見られる残基は太字であるのに対して、２番目に多く見られるものは太字斜体である。８０位又は２７１位のＱ又はＥ残基を除いて、超可変領域の外側の残基は、各サブユニットにおいて同一である（しかしこれは必須ではない）（米国特許第８，０２１，８６７号を参照のこと）。図２Ａ～２Ｆに示されているほぼ全てのＲＨＯ１結合サブユニットは、ＲＨＯ２－Ｌ３－５９メガヌクレアーゼ（配列番号１０２）のＲＨＯ１結合サブユニット（残基１９８～３４４）と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。示されている残基番号は、配列番号６～９３のものである。 ＲＨＯ２結合サブユニットのアミノ酸アライメント。Ａ～Ｆ）本発明によって包含される組換えメガヌクレアーゼは、配列番号１の９塩基対のＲＨＯ２認識ハーフサイトに結合する１つのサブユニットを含む。アミノ酸配列アラインメントは、配列番号６～９３に示されている組換えメガヌクレアーゼのＲＨＯ２結合サブユニット（配列番号１９０～２７７）について示されている。示されているように、配列番号６～６９のＲＨＯ２結合サブユニットは残基７～１５３を含むのに対して、配列番号７０～９３のＲＨＯ２結合サブユニットは残基１９８～３４４を含む。示されているように、各ＲＨＯ２結合サブユニットは、５６アミノ酸の超可変領域を含む。超可変領域内の可変残基は影付きであり、各位置における最も頻繁なアミノ酸がさらに強調されている；最も多く見られる残基は太字であるのに対して、２番目に多く見られるものは太字斜体である。８０位又は２７１位のＱ又はＥ残基を除いて、超可変領域の外側の残基は、各サブユニットにおいて同一である（しかしこれは必須ではない）（米国特許第８，０２１，８６７号を参照のこと）。図３Ａ～３Ｆに示されているほぼ全てのＲＨＯ２結合サブユニットは、ＲＨＯ２－Ｌ３－５９メガヌクレアーゼ（配列番号１９０）のＲＨＯ２結合サブユニット（残基７～１５３）と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。示されている残基番号は、配列番号６～９３のものである。 Ｐ２３Ｈ認識配列をターゲティングする組換えメガヌクレアーゼを評価するための、ＣＨＯ細胞におけるレポーターアッセイの概略図。本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼについて、レポーターカセットを細胞のゲノムに安定に組み込んだＣＨＯ細胞株を生産した。レポーターカセットは、５’から３’方向に、ＳＶ４０初期プロモーターと、ＧＦＰ遺伝子の５’２／３と、本発明の操作されたメガヌクレアーゼのための認識配列、例えば配列番号１～４のいずれか１つのＰ２３Ｈ認識配列と、ＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼの認識配列（国際公開第２０１２／１６７１９２号）と、ＧＦＰ遺伝子の３’２／３とを含んでいた。このカセットを安定にトランスフェクトした細胞は、ＤＮＡ切断誘導剤の非存在下ではＧＦＰを発現しなかった。各メガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡの形質導入によって、メガヌクレアーゼを導入した。メガヌクレアーゼ認識配列のいずれかにおいてＤＮＡ切断を誘導した場合、ＧＦＰ遺伝子の重複領域が互いに組換えられて、機能的ＧＦＰ遺伝子が生じる。次いで、フローサイトメトリーによって、メガヌクレアーゼによるゲノム切断の頻度の間接的な尺度として、ＧＦＰ発現細胞の割合を決定し得る。 ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおけるＰ２３Ｈ認識配列を認識及び切断するための組換えメガヌクレアーゼの効率。Ａ）～Ｊ）配列番号６～９３に示されている各組換えメガヌクレアーゼを、Ｐ２３Ｈ認識配列を標的化するように操作し、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおいて有効性についてスクリーニングした。示されている結果は、各アッセイにおいて観察されたＧＦＰ発現細胞の割合（これは、Ｐ２３Ｈ認識配列又はＣＨＯ－２３／２４認識配列の切断について、各メガヌクレアーゼの有効性を示す）を提供する。各アッセイにおいて、陰性対照（ＲＨＯ１－２ｂｓ）を更に含めた。 ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける経時的な組換えメガヌクレアーゼ有効性。ＣＨＯレポーターアッセイにおいて、本発明によって包含される組換えメガヌクレアーゼを評価し、メガヌクレアーゼコードｍＲＮＡをＣＨＯレポーター細胞に導入した１日後、４日後、６日後、及び８日後に、ＧＦＰ発現細胞の割合を決定した。各時点において、ＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼを陽性対照として含めた。 組換えメガヌクレアーゼの選択性。Ａ）～Ｆ）ＣＨＯ細胞レポーターアッセイを使用して、Ｐ２３Ｈ認識配列（配列番号１）及び対応する野生型ＲＨＯ認識配列（配列番号５）に対する組換えメガヌクレアーゼの選択性を決定した。本発明によって包含される組換えメガヌクレアーゼを、Ｐ２３Ｈ認識配列（「ＲＨＯ１－２細胞」、灰色のバー）又は対応する野生型ＲＨＯ認識配列（「ＲＨＯ３－４細胞」、黒色のバー）を含む細胞に導入して、突然変異標的と野生型標的とを区別することができるかを決定した。 組換えＡＡＶベクターの作製及び発現。Ａ）５’末端及び３’末端において逆方向末端反復（ＩＴＲ）を有する示されている組換えＡＡＶベクターゲノムの略図。ベクターは、サイトメガロウイルス初期（ＣＭＶ）プロモーターに作動可能に連結された組換えメガヌクレアーゼＲＨＯ－１／２－Ｌ２－４９（配列番号８）のコード配列を含む。ヌクレアーゼ発現カセットを「パッケージング」プラスミドに組み込み、これをＡｄヘルパープラスミドとの結合に使用して、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－４９メガヌクレアーゼをコードする遺伝子を送達することができる組換えＡＡＶを生産した。Ｂ）２４時間後の組換えＡＡＶ形質導入ＣＨＯ細胞におけるＲＨＯ－１／２－Ｌ２－４９メガヌクレアーゼ発現のイムノブロット。 ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおいて、組換えＡＡＶによって発現させた場合の、Ｐ２３Ｈ認識配列（配列番号１）に対するＲＨＯ－１／２－Ｌ２－４９メガヌクレアーゼの効率及び選択性。野生型認識配列（配列番号５；「ＲＨＯ３－４細胞」、黒色のバー）又はＰ２３Ｈ認識配列（配列番号１；「ＲＨＯ１－２細胞」、灰色のバー）を有するＣＨＯ細胞に、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結されたＲＨＯ－１／２－Ｌ２－４９メガヌクレアーゼをコードする３つの異なる用量のＡＡＶ２ベクターを形質導入した。 シクロヘキシミドによる処理後のＣＨＯレポーター細胞におけるＲＨＯ－１／２－Ｌ２－４９メガヌクレアーゼの安定性。 Ａ）ｐＤＳ ＣＭＶ ＲＨＯ２＿Ｌ３＿５９プラスミド（配列番号２７８）のベクターマップ。Ｂ）ｐＤＳ ＣＭＶ ＲＨＯ２＿Ｌ５＿１４プラスミド（配列番号２７９）のベクターマップ。 ＲＨＯ１－２認識配列に対するＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼの特異性を実証するＣＨＯ ＧＦＦＰレポーターアッセイ。ＣＨＯ－Ｋ細胞（対照）、（配列番号５の野生型ＲＨＯ配列を含む）ＷＴ ＲＨＯ細胞、又は（配列番号１のＰ２３Ｈ ＲＨＯ配列を含む）Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ細胞に、ＧＦＰタンパク質、ＲＨＯ２－Ｌ３－５９メガヌクレアーゼ（配列番号６）、又はＲＨＯ２－Ｌ５－１４メガヌクレアーゼ（配列番号７）をコードする低力価、中力価、又は高力価の組換えＡＡＶベクターを形質導入した。形質導入後の各細胞株において、認識配列切断の尺度として、ＧＦＰ陽性細胞のパーセントを決定した。 組換えＡＡＶベクターの形質導入後のＣＨＯ ＲＨＯ１－２細胞におけるメガヌクレアーゼ発現のウエスタンブロット分析。ＲＨＯ１－２認識配列を含むＰ２３Ｈ ＲＨＯ細胞に、ＲＨＯ２－Ｌ３－５９メガヌクレアーゼ（配列番号６）又はＲＨＯ２－Ｌ５－１４メガヌクレアーゼ（配列番号７）をコードする組換えＡＡＶベクターを、細胞１個当たり１ｅ８、１ｅ９、又は２ｅ９のウイルスゲノムで形質導入した。ＲＨＯ１－２認識配列切断（上のパネル）、メガヌクレアーゼ発現（下のパネル）の尺度としてのＧＦＰ、及びローディング対照としてのβ－アクチンの発現について、細胞溶解物を分析した。レーン１～６は、ＲＨＯ２－Ｌ３－５９メガヌクレアーゼを発現するように形質導入した。レーン７～１２は、ＲＨＯ２－Ｌ５－１４メガヌクレアーゼを発現するように形質導入した。 ｐＤＳ ＧＲＫ１ ＲＨＯ２＿Ｌ５＿１４プラスミド（配列番号２８１）のベクターマップ。 網膜下ＡＡＶ注射後のマウス網膜細胞におけるメガヌクレアーゼ発現のウエスタンブロット分析。網膜下注射によって、ＲＨＯ２－Ｌ５－１４メガヌクレアーゼ（配列番号７）をコードする組換えＡＡＶベクターを野生型マウスに投与した。５匹のマウスの左眼（ＯＳ）及び右眼（ＯＤ）から網膜細胞を得、ウエスタンブロットによって、ＲＨＯ２－Ｌ５－１４メガヌクレアーゼ及びβ－アクチンの発現について、細胞溶解物を分析した。

配列の簡単な説明
配列番号１は、１つのＰ２３Ｈ認識配列（ＲＨＯ－１／２）のヌクレオチド配列を示す
。

配列番号２は、１つのＰ２３Ｈ認識配列（ＲＨＯ－９／１０）のヌクレオチド配列を示
す。

配列番号３は、１つのＰ２３Ｈ認識配列（ＲＨＯ－１１／１２）のヌクレオチド配列を
示す。

配列番号４は、１つのＰ２３Ｈ認識配列（ＲＨＯ－１３／１４）のヌクレオチド配列を
示す。

配列番号５は、野生型ＲＨＯ対立遺伝子に見られる対応する認識配列（すなわち、ＲＨ
Ｏ３－４認識配列）のヌクレオチド配列を示す。

配列番号６は、ＲＨＯ２－Ｌ３－５９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号７は、ＲＨＯ２－Ｌ５－１４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号８は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－４９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号９は、ＲＨＯ１－２ｘ．１７９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号１０は、ＲＨＯ１－２ｘ．４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号１１は、ＲＨＯ１－２ｘ．２０７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号１２は、ＲＨＯ１－２ｘ．２７７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号１３は、ＲＨＯ１－２ｘ．２９２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号１４は、ＲＨＯ１－２ｘ．３２４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号１５は、ＲＨＯ１－２ｘ．３７１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号１６は、ＲＨＯ１－２ｘ．１６４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号１７は、ＲＨＯ１－２ｘ．１８１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号１８は、ＲＨＯ１－２ｘ．１８４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号１９は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－２１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号２０は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－４３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号２１は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－４５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号２２は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－６０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号２３は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－６１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号２４は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－５８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号２５は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号２６は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－１３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号２７は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－１８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号２８は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－７０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号２９は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－８６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号３０は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－１３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号３１は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－２４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号３２は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－３７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号３３は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－５８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号３４は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－３１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号３５は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－２９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号３６は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－６１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号３７は、ＲＨＯ２－Ｌ３－２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号３８は、ＲＨＯ２－Ｌ３－３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号３９は、ＲＨＯ２－Ｌ３－５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号４０は、ＲＨＯ２－Ｌ３－１０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号４１は、ＲＨＯ２－Ｌ３－１１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号４２は、ＲＨＯ２－Ｌ３－１２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号４３は、ＲＨＯ２－Ｌ３－１３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号４４は、ＲＨＯ２－Ｌ３－２８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号４５は、ＲＨＯ２－Ｌ３－２９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号４６は、ＲＨＯ２－Ｌ３－５７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号４７は、ＲＨＯ２－Ｌ３－８０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号４８は、ＲＨＯ２－Ｌ３－８５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号４９は、ＲＨＯ２－Ｌ３－８６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号５０は、ＲＨＯ２－Ｌ３－９２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号５１は、ＲＨＯ２－Ｌ３－４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号５２は、ＲＨＯ２－Ｌ３－２０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号５３は、ＲＨＯ２－Ｌ３－７２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号５４は、ＲＨＯ１－Ｌ１－４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号５５は、ＲＨＯ１－Ｌ１－８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号５６は、ＲＨＯ１－Ｌ１－１３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号５７は、ＲＨＯ１－Ｌ１－１９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号５８は、ＲＨＯ１－Ｌ１－５８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号５９は、ＲＨＯ１－Ｌ１－６９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号６０は、ＲＨＯ１－Ｌ１－８０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号６１は、ＲＨＯ１－Ｌ１－８２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号６２は、ＲＨＯ１－Ｌ１－７３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号６３は、ＲＨＯ１－Ｌ１－８５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号６４は、ＲＨＯ１－Ｌ１－８６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号６５は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ４－１０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号６６は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ４－２９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号６７は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ４－６５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号６８は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ４－６６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号６９は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ４－８５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す
。

配列番号７０は、ＲＨＯ１－２ｘ．２１６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号７１は、ＲＨＯ１－２ｘ．２４１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号７２は、ＲＨＯ１－２ｘ．９４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号７３は、ＲＨＯ１－２ｘ．９５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号７４は、ＲＨＯ１－２ｘ．１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号７５は、ＲＨＯ１－２ｘ．６０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号７６は、ＲＨＯ１－２ｘ．７４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号７７は、ＲＨＯ１－２ｘ．８８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号７８は、ＲＨＯ１－２ｘ．２９４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号７９は、ＲＨＯ１－２ｘ．３０２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号８０は、ＲＨＯ１－２ｘ．３０６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号８１は、ＲＨＯ１－２ｘ．３３８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号８２は、ＲＨＯ１－２ｘ．３４８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号８３は、ＲＨＯ１－２ｘ．３５６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号８４は、ＲＨＯ１－２ｘ．３６４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号８５は、ＲＨＯ１－２ｘ．１４２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号８６は、ＲＨＯ１－２ｘ．１７７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号８７は、ＲＨＯ１－２ｘ．１４８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号８８は、ＲＨＯ１－２ｘ．２０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号８９は、ＲＨＯ１－２ｘ．５５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号９０は、ＲＨＯ１－２ｘ．１９７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号９１は、ＲＨＯ１－２ｘ．２５２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号９２は、ＲＨＯ１－２ｘ．３７２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号９３は、ＲＨＯ１－２ｘ．１５１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号９４は、野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号９５は、Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフのアミ
ノ酸配列を示す。

配列番号９６は、野生型ヒトロドプシンのコード領域の核酸配列を示す。

配列番号９７は、突然変異Ｐ２３Ｈロドプシンのコード領域の核酸配列を示す。

配列番号９８は、野生型ヒトロドプシン遺伝子の核酸配列を示す。

配列番号９９は、ロドプシンにおけるＰ２３Ｈ置換をコードするＣ６８Ａ突然変異を含
むヒトロドプシン遺伝子の核酸配列を示す。

配列番号１００は、野生型ヒトロドプシンのアミノ酸配列を示す。

配列番号１０１は、突然変異Ｐ２３Ｈロドプシンのアミノ酸配列を示す。

配列番号１０２は、ＲＨＯ２－Ｌ３－５９メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１０３は、ＲＨＯ２－Ｌ５－１４メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１０４は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－４９メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１０５は、ＲＨＯ１－２ｘ．１７９メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号１０６は、ＲＨＯ１－２ｘ．４メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示す
。

配列番号１０７は、ＲＨＯ１－２ｘ．２０７メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号１０８は、ＲＨＯ１－２ｘ．２７７メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号１０９は、ＲＨＯ１－２ｘ．２９２メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号１１０は、ＲＨＯ１－２ｘ．３２４メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号１１１は、ＲＨＯ１－２ｘ．３７１メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号１１２は、ＲＨＯ１－２ｘ．１６４メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号１１３は、ＲＨＯ１－２ｘ．１８１メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号１１４は、ＲＨＯ１－２ｘ．１８４メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号１１５は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－２１メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１１６は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－４３メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１１７は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－４５メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１１８は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－６０メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１１９は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－６１メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１２０は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－５８メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１２１は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－７メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４
を示す。

配列番号１２２は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－１３メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１２３は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－１８メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１２４は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－７０メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１２５は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－８６メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１２６は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－１３メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１２７は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－２４メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１２８は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－３７メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１２９は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－５８メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１３０は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－３１メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１３１は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－２９メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１３２は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－６１メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１３３は、ＲＨＯ２－Ｌ３－２メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示す
。

配列番号１３４は、ＲＨＯ２－Ｌ３－３メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示す
。

配列番号１３５は、ＲＨＯ２－Ｌ３－５メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示す
。

配列番号１３６は、ＲＨＯ２－Ｌ３－１０メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１３７は、ＲＨＯ２－Ｌ３－１１メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１３８は、ＲＨＯ２－Ｌ３－１２メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１３９は、ＲＨＯ２－Ｌ３－１３メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１４０は、ＲＨＯ２－Ｌ３－２８メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１４１は、ＲＨＯ２－Ｌ３－２９メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１４２は、ＲＨＯ２－Ｌ３－５７メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１４３は、ＲＨＯ２－Ｌ３－８０メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１４４は、ＲＨＯ２－Ｌ３－８５メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１４５は、ＲＨＯ２－Ｌ３－８６メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１４６は、ＲＨＯ２－Ｌ３－９２メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１４７は、ＲＨＯ２－Ｌ３－４メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示す
。

配列番号１４８は、ＲＨＯ２－Ｌ３－２０メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１４９は、ＲＨＯ２－Ｌ３－７２メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１５０は、ＲＨＯ１－Ｌ１－４メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示す
。

配列番号１５１は、ＲＨＯ１－Ｌ１－８メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示す
。

配列番号１５２は、ＲＨＯ１－Ｌ１－１３メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１５３は、ＲＨＯ１－Ｌ１－１９メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１５４は、ＲＨＯ１－Ｌ１－５８メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１５５は、ＲＨＯ１－Ｌ１－６９メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１５６は、ＲＨＯ１－Ｌ１－８０メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１５７は、ＲＨＯ１－Ｌ１－８２メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１５８は、ＲＨＯ１－Ｌ１－７３メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１５９は、ＲＨＯ１－Ｌ１－８５メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１６０は、ＲＨＯ１－Ｌ１－８６メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号１６１は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ４－１０メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１６２は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ４－２９メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１６３は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ４－６５メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１６４は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ４－６６メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１６５は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ４－８５メガヌクレアーゼの残基１９８～３４
４を示す。

配列番号１６６は、ＲＨＯ１－２ｘ．２１６メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１６７は、ＲＨＯ１－２ｘ．２４１メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１６８は、ＲＨＯ１－２ｘ．９４メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号１６９は、ＲＨＯ１－２ｘ．９５メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号１７０は、ＲＨＯ１－２ｘ．１メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号１７１は、ＲＨＯ１－２ｘ．６０メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号１７２は、ＲＨＯ１－２ｘ．７４メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号１７３は、ＲＨＯ１－２ｘ．８８メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号１７４は、ＲＨＯ１－２ｘ．２９４メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１７５は、ＲＨＯ１－２ｘ．３０２メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１７６は、ＲＨＯ１－２ｘ．３０６メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１７７は、ＲＨＯ１－２ｘ．３３８メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１７８は、ＲＨＯ１－２ｘ．３４８メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１７９は、ＲＨＯ１－２ｘ．３５６メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１８０は、ＲＨＯ１－２ｘ．３６４メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１８１は、ＲＨＯ１－２ｘ．１４２メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１８２は、ＲＨＯ１－２ｘ．１７７メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１８３は、ＲＨＯ１－２ｘ．１４８メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１８４は、ＲＨＯ１－２ｘ．２０メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号１８５は、ＲＨＯ１－２ｘ．５５メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号１８６は、ＲＨＯ１－２ｘ．１９７メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１８７は、ＲＨＯ１－２ｘ．２５２メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１８８は、ＲＨＯ１－２ｘ．３７２メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１８９は、ＲＨＯ１－２ｘ．１５１メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１９０は、ＲＨＯ２－Ｌ３－５９メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号１９１は、ＲＨＯ２－Ｌ５－１４メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号１９２は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－４９メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号１９３は、ＲＨＯ１－２ｘ．１７９メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１９４は、ＲＨＯ１－２ｘ．４メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号１９５は、ＲＨＯ１－２ｘ．２０７メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１９６は、ＲＨＯ１－２ｘ．２７７メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１９７は、ＲＨＯ１－２ｘ．２９２メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１９８は、ＲＨＯ１－２ｘ．３２４メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号１９９は、ＲＨＯ１－２ｘ．３７１メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号２００は、ＲＨＯ１－２ｘ．１６４メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号２０１は、ＲＨＯ１－２ｘ．１８１メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号２０２は、ＲＨＯ１－２ｘ．１８４メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す
。

配列番号２０３は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－２１メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２０４は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－４３メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２０５は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－４５メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２０６は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－６０メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２０７は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－６１メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２０８は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－５８メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２０９は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－７メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示
す。

配列番号２１０は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－１３メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２１１は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－１８メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２１２は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－７０メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２１３は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ１－８６メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２１４は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－１３メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２１５は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－２４メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２１６は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－３７メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２１７は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－５８メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２１８は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－３１メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２１９は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－２９メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２２０は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－６１メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２２１は、ＲＨＯ２－Ｌ３－２メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２２２は、ＲＨＯ２－Ｌ３－３メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２２３は、ＲＨＯ２－Ｌ３－５メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２２４は、ＲＨＯ２－Ｌ３－１０メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２２５は、ＲＨＯ２－Ｌ３－１１メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２２６は、ＲＨＯ２－Ｌ３－１２メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２２７は、ＲＨＯ２－Ｌ３－１３メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２２８は、ＲＨＯ２－Ｌ３－２８メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２２９は、ＲＨＯ２－Ｌ３－２９メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２３０は、ＲＨＯ２－Ｌ３－５７メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２３１は、ＲＨＯ２－Ｌ３－８０メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２３２は、ＲＨＯ２－Ｌ３－８５メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２３３は、ＲＨＯ２－Ｌ３－８６メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２３４は、ＲＨＯ２－Ｌ３－９２メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２３５は、ＲＨＯ２－Ｌ３－４メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２３６は、ＲＨＯ２－Ｌ３－２０メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２３７は、ＲＨＯ２－Ｌ３－７２メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２３８は、ＲＨＯ１－Ｌ１－４メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２３９は、ＲＨＯ１－Ｌ１－８メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２４０は、ＲＨＯ１－Ｌ１－１３メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２４１は、ＲＨＯ１－Ｌ１－１９メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２４２は、ＲＨＯ１－Ｌ１－５８メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２４３は、ＲＨＯ１－Ｌ１－６９メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２４４は、ＲＨＯ１－Ｌ１－８０メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２４５は、ＲＨＯ１－Ｌ１－８２メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２４６は、ＲＨＯ１－Ｌ１－７３メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２４４は、ＲＨＯ１－Ｌ１－８５メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２４８は、ＲＨＯ１－Ｌ１－８６メガヌクレアーゼの残基７～１５３を示す。

配列番号２４９は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ４－１０メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２５０は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ４－２９メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２５１は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ４－６５メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２５２は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ４－６６メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２５３は、ＲＨＯ－１／２－Ｌ４－８５メガヌクレアーゼの残基７～１５３を
示す。

配列番号２５４は、ＲＨＯ１－２ｘ．２１６メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号２５５は、ＲＨＯ１－２ｘ．２４１メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号２５６は、ＲＨＯ１－２ｘ．９４メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号２５７は、ＲＨＯ１－２ｘ．９５メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号２５８は、ＲＨＯ１－２ｘ．１メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示す
。

配列番号２５９は、ＲＨＯ１－２ｘ．６０メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号２６０は、ＲＨＯ１－２ｘ．７４メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号２６１は、ＲＨＯ１－２ｘ．８８メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号２６２は、ＲＨＯ１－２ｘ．２９４メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号２６３は、ＲＨＯ１－２ｘ．３０２メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号２６４は、ＲＨＯ１－２ｘ．３０６メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号２６５は、ＲＨＯ１－２ｘ．３３８メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号２６６は、ＲＨＯ１－２ｘ．３４８メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号２６７は、ＲＨＯ１－２ｘ．３５６メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号２６８は、ＲＨＯ１－２ｘ．３６４メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号２６９は、ＲＨＯ１－２ｘ．１４２メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号２７０は、ＲＨＯ１－２ｘ．１７７メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号２７１は、ＲＨＯ１－２ｘ．１４８メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号２７２は、ＲＨＯ１－２ｘ．２０メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号２７３は、ＲＨＯ１－２ｘ．５５メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を示
す。

配列番号２７４は、ＲＨＯ１－２ｘ．１９７メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号２７５は、ＲＨＯ１－２ｘ．２５２メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号２７６は、ＲＨＯ１－２ｘ．３７２メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号２７７は、ＲＨＯ１－２ｘ．１５１メガヌクレアーゼの残基１９８～３４４を
示す。

配列番号２７８は、ｐＤＳ ＣＭＶ ＲＨＯ２＿Ｌ３＿５９プラスミドの核酸配列を示
す。

配列番号２７９は、ｐＤＳ ＣＭＶ ＲＨＯ２＿Ｌ５＿１４プラスミドの核酸配列を示
す。

配列番号２８０は、ｐＤＳ ＧＲＫ１ ＲＨＯ２＿Ｌ３＿５９プラスミドの核酸配列を
示す。

配列番号２８１は、ｐＤＳ ＧＲＫ１ ＲＨＯ２＿Ｌ５＿１４プラスミドの核酸配列を
示す。

発明の詳細な説明
１．１ 参考文献及び定義
本明細書で言及される特許及び科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立する。本明
細書で引用される発行米国特許、許可出願、公開外国出願、及び参考文献（ＧｅｎＢａｎ
ｋデータベース配列を含む）は、それぞれが参照により組み込まれると具体的且つ個別に
示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は異なる形態で具現化することができ、本明細書に示されている実施形態に限定
されると解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が詳細且つ完全であ
り、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。例えば、一実施形態に関し
て例示されている特徴を他の実施形態に組み込むことができ、特定の実施形態に関して例
示されている特徴をその実施形態から削除することができる。加えて、本開示を考慮すれ
ば、本明細書で示唆されている実施形態に対する多数の変形及び追加は当業者には明らか
であり、これらは本発明から逸脱するものではない。

特に定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が
属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書における
本発明の説明において使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであ
り、本発明を限定するものではない。

本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全
体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、又は「その（ｔ
ｈｅ）」は、１又は１超を意味し得る。例えば、細胞（「ａ」 ｃｅｌｌ）は、単一の細
胞又は多数の細胞を意味し得る。

本明細書で使用される場合、特に具体的な指示がない限り、「又は」という語は、「い
ずれか／又は」の排他的な意味ではなく「及び／又は」の包括的な意味で使用される。

本明細書で使用される場合、「メガヌクレアーゼ」という用語は、１２塩基対を超える
認識配列において二本鎖ＤＮＡに結合するエンドヌクレアーゼを指す。好ましくは、本発
明のメガヌクレアーゼの認識配列は、２２塩基対である。メガヌクレアーゼは、Ｉ－Ｃｒ
ｅＩに由来するエンドヌクレアーゼであり得、Ｉ－ＣｒｅＩの操作された変異体であって
、例えば、ＤＮＡ結合特異性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ結合親和性、又は二量体化特性に
関して天然Ｉ－ＣｒｅＩと比べて改変されている操作された変異体を指し得る。Ｉ－Ｃｒ
ｅＩのこのような改変変異体を生産するための方法は、当技術分野で公知である（例えば
、国際公開第２００７／０４７８５９号）。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、
ヘテロ二量体として二本鎖ＤＮＡに結合する。メガヌクレアーゼはまた、ペプチドリンカ
ーを使用して一組のＤＮＡ結合ドメインが単一ポリペプチドに接続された「一本鎖メガヌ
クレアーゼ」であり得る。

本明細書で使用される場合、「一本鎖メガヌクレアーゼ」という用語は、リンカーによ
って接続された一組のメガヌクレアーゼサブユニットを含むポリペプチドを指す。一本鎖
メガヌクレアーゼは、構造：Ｎ末端サブユニット－リンカー－Ｃ－末端サブユニットを有
する。２つのメガヌクレアーゼサブユニットは、一般に、アミノ酸配列が同一ではなく、
非同一ＤＮＡ配列を認識するであろう。従って、一本鎖メガヌクレアーゼは、典型的には
、偽パリンドローム認識配列又は非パリンドローム認識配列を切断する。一本鎖メガヌク
レアーゼは、「一本鎖ヘテロ二量体」又は「一本鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」と称
され得るが、実際には二量体ではない。明確性のために、特に指定がない限り、「メガヌ
クレアーゼ」という用語は、二量体メガヌクレアーゼ又は一本鎖メガヌクレアーゼを指し
得る。Ｉ－ＣｒｅＩの一本鎖メガヌクレアーゼ変異体を生産するための方法は、当技術分
野で公知である（例えば、国際公開第２００９／０５９１９５号；Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（
２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：１６５０－６２；Ｇｒｉｚｏｔ
，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：５４０５－１
９）。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」という用語は、「メガヌクレアーゼ」という用
語と同義である。

本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、２つのメガヌクレアーゼサブ
ユニットを単一ポリペプチドに接続するために使用される外因性ペプチド配列を指す。リ
ンカーは、天然タンパク質に見られる配列を有し得るか、又はいかなる天然タンパク質に
も見られない人工配列であり得る。リンカーはフレキシブルであり得、二次構造を欠き得
るか、又は生理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有し得る。リンカーとし
ては、限定されないが、米国特許第８，４４５，２５１号によって包含されるものが挙げ
られ得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号６～９３のいずれか１つの残
基１５４～１９５を含むアミノ酸配列を有し得る。

タンパク質に関して本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、タンパク質
をコードする核酸、及びタンパク質を発現する細胞又は生物に遺伝子工学技術を適用した
結果として、変化したアミノ酸配列を有することを意味する。核酸に関して、「組換え」
という用語は、遺伝子工学技術を適用した結果として、変化した核酸配列を有することを
意味する。遺伝子工学技術としては、限定されないが、ＰＣＲ及びＤＮＡクローニング技
術；トランスフェクション、形質転換、及び他の遺伝子導入技術；相同組換え；部位特異
的突然変異誘発；並びに遺伝子融合が挙げられる。この定義によれば、天然に存在するタ
ンパク質と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質であって、しかし、クローニング及び
発現によって異種宿主において生産されるタンパク質は、組換え体とはみなされない。

本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、同じ種類の遺伝子の対立遺伝子
集団における最も一般的な天然に存在する対立遺伝子（即ち、ポリヌクレオチド配列）を
指し、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドは、その元の機能を有する。
「野生型」という用語はまた、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドを指
す。野生型対立遺伝子（即ち、ポリヌクレオチド）及びポリペプチドは、野生型配列と比
べて１つ以上の突然変異及び／又は置換を含む突然変異又は変異対立遺伝子及びポリペプ
チドと区別可能である。野生型対立遺伝子又はポリペプチドは、生物において正常表現型
を付与し得るのに対して、突然変異又は変異対立遺伝子又はポリペプチドは、いくつかの
場合では、変化した表現型を付与し得る。突然変異ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ対立遺伝子及びＰ２
３Ｈロドプシンタンパク質は、野生型ＲＨＯ対立遺伝子及びロドプシンタンパク質と区別
可能である。更に、野生型ホーミングエンドヌクレアーゼは、組換え又は天然に存在しな
いメガヌクレアーゼと区別可能である。

組換えタンパク質に関して本明細書で使用される場合、「改変」という用語は、参照配
列（例えば、野生型配列又はネイティブ配列）と比べた、組換え配列中のアミノ酸残基の
任意の挿入、欠失、又は置換を意味する。

本明細書で使用される場合、「認識配列」という用語は、メガヌクレアーゼによって結
合及び切断されるＤＮＡ配列を指す。本発明の組換えメガヌクレアーゼの場合、認識配列
は、４塩基対によって分離された一組の９塩基対の逆位「ハーフサイト」又は「認識ハー
フサイト」を含む。一本鎖メガヌクレアーゼの場合、タンパク質のＮ末端サブユニットは
第１のハーフサイトと接触し、タンパク質のＣ末端サブユニットは第２のハーフサイトと
接触する。メガヌクレアーゼによる切断は、４塩基対の３’「オーバーハング」を生じさ
せる。「オーバーハング」又は「付着末端」は、二本鎖ＤＮＡ配列のメガヌクレアーゼ切
断によって生成され得る短い一本鎖ＤＮＡセグメントである。本発明のメガヌクレアーゼ
の場合、オーバーハングは、２２塩基対の認識配列の塩基１０～１３を含む。

本明細書で使用される場合、「標的部位」又は「標的配列」という用語は、細胞の染色
体ＤＮＡの領域であって、メガヌクレアーゼのための認識配列を含む領域を指す。

本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ結合親和性」又は「結合親和性」という用語は、
メガヌクレアーゼが参照ＤＮＡ分子（例えば、認識配列又は任意配列）と非共有結合的に
会合する傾向を意味する。結合親和性は、解離定数Ｋｄによって測定される。本明細書で
使用される場合、メガヌクレアーゼは、参照認識配列に対する組換えメガヌクレアーゼの
Ｋｄが、参照メガヌクレアーゼと比べて統計的に有意な（ｐ＜０．０５）量だけ増加又は
減少する場合に、「変化した」結合親和性を有する。

本明細書で使用される場合、「相同組換え」又は「ＨＲ」という用語は、修復鋳型とし
て相同ＤＮＡ配列を使用して、二本鎖ＤＮＡ切断が修復される天然の細胞プロセスを指す
（例えば、Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１
：１９５８－１９７６を参照のこと）。相同ＤＮＡ配列は、内因性染色体配列であり得る
か、又は細胞に送達された外因性核酸であり得る。

本明細書で使用される場合、「非相同末端結合」又は「ＮＨＥＪ」という用語は、２つ
の非相同ＤＮＡセグメントの直接的な接続によって、二本鎖ＤＮＡ切断が修復される天然
の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｆｒｏｎｔ
．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８－１９７６を参照のこと）。非相同末端結合によるＤＮ
Ａ修復はエラーが起こりやすく、修復部位において鋳型にならないＤＮＡ配列の付加又は
欠失を頻繁にもたらす。いくつかの例では、標的認識配列における切断は、標的認識部位
におけるＮＨＥＪをもたらす。遺伝子のコード配列中の標的部位のヌクレアーゼ誘導性切
断とそれに続くＮＨＥＪによるＤＮＡ修復は、遺伝子機能を破壊する突然変異（例えば、
フレームシフト突然変異）をコード配列に導入し得る。従って、メガヌクレアーゼ等の操
作されたヌクレアーゼは、細胞の集団において遺伝子を有効にノックアウトするために使
用され得る。

アミノ酸配列及び核酸配列の両方に関して本明細書で使用される場合、「同一性のパー
セント」、「配列同一性」、「類似性の割合」、「配列類似性」等の用語は、アラインメ
ントされるアミノ酸残基又はヌクレオチド間の類似性を最大化する配列のアラインメント
（これは、同一又は類似の残基又はヌクレオチドの数と、残基又はヌクレオチドの総数と
、配列アラインメント中のギャップの存在及び長さとの関数である）に基づく、２つの配
列の類似性の程度の尺度を指す。標準的なパラメータを使用して配列類似性を決定するた
めに、様々なアルゴリズム及びコンピュータプログラムが利用可能である。本明細書で使
用される場合、配列類似性は、アミノ酸配列の場合にはＢＬＡＳＴｐプログラム、及び核
酸配列の場合にはＢＬＡＳＴｎプログラム（これらは両方とも、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅ
ｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎ
ｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて利用可能であり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕ
ｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ｇｉ
ｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｔｅｓ（１９９３），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２
７２；Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：
１３１－１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３ ８９－３４０２）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００
），Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７（１－２）：２０３－１４に記載されている）を使
用して測定される。本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列の類似性のパーセン
トは、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムに関する以下のパラメータに基づくスコアである：ワー
ドサイズ＝３；ギャップオープニングペナルティ＝－１１；ギャップエクステンションペ
ナルティ＝－１；及びスコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。本明細書で使用さ
れる場合、２つの核酸配列の類似性のパーセントは、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズムに関する
以下のパラメータに基づくスコアである：ワードサイズ＝１１；ギャップオープニングペ
ナルティ＝－５；ギャップエクステンションペナルティ＝－２；マッチリワード＝１；及
びミスマッチペナルティ＝－３。同様に、同一性のパーセントは、アライメントされたア
ミノ酸残基又はヌクレオチド間の同一性を最大化する配列のアライメント（これは、同一
の残基又はヌクレオチドの数を、２つの配列のうちの大きい方の残基又はヌクレオチドの
総数で割ったものの関数である）に基づいて確立され得る。

２つのタンパク質又はアミノ酸配列の改変に関して本明細書で使用される場合、「対応
する」という用語は、２つのタンパク質を（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを使用した
）標準的な配列アラインメントに供した場合に、第１のタンパク質における特定の改変が
、第２のタンパク質における改変と同じアミノ酸残基の置換であること、及び第１のタン
パク質における改変のアミノ酸位置が、第２のタンパク質における改変のアミノ酸位置に
対応又は合致することを示すために使用される。従って、Ｘ及びＹが異なる数字であり得
るという事実にもかかわらず、残基Ｘ及びＹが配列アラインメントにおいて互いに対応す
る場合、第１のタンパク質におけるアミノ酸「Ａ」への残基「Ｘ」の改変は、第２のタン
パク質におけるアミノ酸「Ａ」への残基「Ｙ」の改変に対応するであろう。

本明細書で使用される場合、「認識ハーフサイト」、「認識配列ハーフサイト」又は単
に「ハーフサイト」という用語は、二本鎖ＤＮＡ分子中の核酸配列であって、ホモ二量体
若しくはヘテロ二量体メガヌクレアーゼの単量体によって、又は一本鎖メガヌクレアーゼ
の１つのサブユニットによって認識される核酸配列を意味する。

本明細書で使用される場合、「優先的に」という用語は、第２の参照認識配列と比べて
、ゲノム中の特定の標的認識配列を認識及び切断するための組換えメガヌクレアーゼの特
異性を指す。例として、本明細書の実施例で提供されている方法を含む当技術分野で公知
の方法によって決定した場合、本発明の組換えメガヌクレアーゼは、対応する野生型認識
配列（例えば、配列番号５）を認識及び切断するよりも高い効率で、Ｐ２３Ｈ認識配列（
例えば、配列番号１）を優先的に認識及び切断し得る。いくつかの実施形態では、本発明
の組換えメガヌクレアーゼは、対応する野生型認識配列を認識及び切断するよりも約５％
、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％
、９０％、又は１００％以上高い効率で、Ｐ２３Ｈ認識配列を優先的に認識及び切断し得
る。他の実施形態では、本発明の組換えメガヌクレアーゼは、対応する野生型認識配列を
認識及び切断するよりも約１倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、又は１０００
倍以上高い効率で、Ｐ２３Ｈ認識配列を優先的に認識及び切断し得る。

本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、メガヌクレアーゼ単量体又
はサブユニット内の局在配列であって、比較的高い可変性を有するアミノ酸を含む局在配
列を指す。超可変領域は、約５０～６０個の連続残基、約５３～５７個の連続残基、又は
好ましくは約５６個の残基を含み得る。いくつかの実施形態では、超可変領域の残基は、
配列番号６～９３のいずれか１つの２４～７９位又は２１５～２７０位に対応し得る。超
可変領域は、認識配列中のＤＮＡ塩基と接触する１つ以上の残基を含み得、単量体又はサ
ブユニットの塩基優先性を変化させるように改変され得る。超可変領域はまた、メガヌク
レアーゼが二本鎖ＤＮＡ認識配列と会合するとＤＮＡ骨格に結合する１つ以上の残基を含
み得る。このような残基は、ＤＮＡ骨格及び標的認識配列に対するメガヌクレアーゼの結
合親和性を変化させるように改変され得る。本発明の異なる実施形態では、超可変領域は
、可変性を示す１～２０個の残基を含み得、塩基優先性及び／又はＤＮＡ結合親和性に影
響を与えるように改変され得る。特定の実施形態では、超可変領域は、可変性を示す約１
５～１８個残基を含み、塩基優先性及び／又はＤＮＡ結合親和性に影響を与えるように改
変され得る。いくつかの実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号６～９３の
いずれか１つの２４、２６、２８、２９、３０、３２、３３、３８、３９、４０、４２、
４４、４６、６８、７０、７３、７５、及び７７位の１つ以上に対応する。他の実施形態
では、超可変領域内の可変残基は、配列番号６～９３のいずれか１つの２１５、２１７、
２１９、２２０、２２１、２２３、２２４、２２９、２３０、２３１、２３３、２３５、
２３７、２５９、２６１、２６４、２６６、及び２６８位の１つ以上に対応する。

本明細書で使用される場合、「ＲＨＯ」、「ＲＨＯ遺伝子」、「ロドプシン遺伝子」、
及び「野生型ＲＨＯ対立遺伝子」という用語は互換的に使用され、ヒトロドプシン遺伝子
、好ましくはＮＣＢＩ参照配列ＮＧ＿００９１１５．１（配列番号９８）によって特定さ
れる遺伝子を指す。「突然変異ＲＨＯ対立遺伝子」及び「突然変異ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ対立
遺伝子」という用語は互換的に使用され、コードタンパク質におけるＰ２３Ｈ置換をもた
らすＣ６８Ａ突然変異を含むＲＨＯ対立遺伝子配列（配列番号９９）を指す。「ロドプシ
ン」及び「野生型ロドプシン」という用語は互換的に使用され、野生型ロドプシン遺伝子
によってコードされるタンパク質、特にＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００５３０．１（配列
番号１００）によって特定されるタンパク質を指す。「Ｐ２３Ｈロドプシン」という用語
は、Ｐ２３Ｈ置換を含む突然変異ロドプシンタンパク質、特に配列番号１０１に示されて
いるタンパク質を指す。

「組換えＤＮＡ構築物」、「組換え構築物」、「発現カセット」、「発現構築物」、「
キメラ構築物」、「構築物」、及び「組換えＤＮＡ断片」という用語は本明細書では互換
的に使用され、核酸断片である。組換え構築物は、限定されないが、天然では一緒に見ら
れない調節配列及びコード配列を含む核酸断片の人工的な組み合わせを含む。例えば、組
換えＤＮＡ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給源
に由来する調節配列及びコード配列であって、天然に見られるものとは異なる様式で配置
される調節配列及びコード配列を含み得る。このような構築物はそれ自体で使用され得る
か、又はベクターと併せて使用され得る。

本明細書で使用される場合、「ベクター」又は「組換えＤＮＡベクター」は、複製系と
、所定の宿主細胞におけるポリペプチドコード配列の転写及び翻訳を可能にする配列とを
含む構築物であり得る。ベクターを使用する場合、ベクターの選択は、当業者に周知であ
るように、宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依存する。ベクターとしては
、限定されないが、プラスミドベクター及び組換えＡＡＶベクター、又は本発明のメガヌ
クレアーゼをコードする遺伝子を標的細胞に送達するために適切な当技術分野で公知の任
意の他のベクターが挙げられ得る。当業者であれば、本発明の単離されたヌクレオチド又
は核酸配列のいずれかを含む宿主細胞を上手く形質転換、選択、及び増殖させるためにベ
クター上に存在しなければならない遺伝的要素を十分に把握している。

本明細書で使用される場合、「ベクター」はまた、ウイルスベクターを指し得る。ウイ
ルスベクターとしては、限定されないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベク
ター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が挙げられ
得る。

本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、Ｐ２３Ｈ認識配列（例えば、配列番号１
～４の１つ）を含む少なくとも１つのＲＨＯ対立遺伝子を含む細胞を指す。このような標
的細胞は、突然変異ＲＨＯ Ｐ２３Ｈタンパク質を発現し得る。標的細胞としては、限定
されないが、少なくとも１つのＲＨＯ遺伝子対立遺伝子中のＰ２３Ｈ認識配列を含む眼の
細胞、好ましくは眼の後部の細胞、更により好ましくは網膜の細胞（桿体視細胞を含む）
が挙げられ得る。

本明細書で使用される場合、「対照」又は「対照細胞」は、遺伝子改変細胞の遺伝子型
又は表現型の変化を測定するための基準点を提供する細胞を指す。対照細胞は、例えば、
（ａ）即ち、遺伝子改変細胞をもたらした遺伝子変化について出発物質と同じ遺伝子型の
野生型細胞；（ｂ）遺伝子改変細胞と同じ遺伝子型の細胞であって、しかし、ヌル構築物
で（即ち、目的の形質に対する既知の効果がない構築物で）形質転換されている細胞；又
は（ｃ）遺伝子改変細胞と遺伝的に同一の細胞であって、しかし、変化した遺伝子型又は
表現型の発現を誘導する条件又は刺激又は更なる遺伝子改変に曝露されない細胞を含み得
る。

２つのタンパク質又はアミノ酸配列の改変に関して本明細書で使用される場合、「対応
する」という用語は、２つのタンパク質を（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを使用した
）標準的な配列アラインメントに供した場合に、第１のタンパク質における特定の改変が
、第２のタンパク質における改変と同じアミノ酸残基の置換であること、及び第１のタン
パク質における改変のアミノ酸位置が、第２のタンパク質における改変のアミノ酸位置に
対応又は合致することを示すために使用される。従って、Ｘ及びＹが異なる数字であり得
るという事実にもかかわらず、残基Ｘ及びＹが配列アラインメントにおいて互いに対応す
る場合、第１のタンパク質におけるアミノ酸「Ａ」への残基「Ｘ」の改変は、第２のタン
パク質におけるアミノ酸「Ａ」への残基「Ｙ」の改変に対応するであろう。

本明細書で使用される場合、「治療」又は「被験体の治療」という用語は、ＲＰの１つ
以上の症候の部分的又は完全な軽減を提供する目的で、本発明の組換えメガヌクレアーゼ
又は本発明の組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸を、ＲＰを有する被験体に投与す
ることを指す。いくつかの態様では、本発明の組換えメガヌクレアーゼ又はこれをコード
する核酸は、本発明の医薬組成物の形態で治療中に投与される。好ましくは、被験体は、
Ｐ２３Ｈ突然変異対立遺伝子及び機能的対立遺伝子、正常対立遺伝子、又は野生型対立遺
伝子についてヘテロ接合性である。

本明細書で使用される場合、変数の数値範囲に関する記載は、その範囲内の値のいずれ
かに等しい変数を用いて本発明を実施し得ることを伝えることを意図する。従って、本質
的に離散的な変数の場合、変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の整数値に等しく
なり得る。同様に、本質的に連続的な変数の場合、変数は、範囲の終点を含む数値範囲内
の任意の実数値と等しくなり得る。限定されないが一例として、０～２の値を有すると記
載される変数は、変数が本質的に離散的である場合には０、１、又は２の値を取り得、変
数が本質的に連続的である場合には０．０、０．１、０．０１、０．００１の値、又は０
以上かつ２以下の任意の他の実数値を取り得る。

２．１ 突然変異ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ対立遺伝子のターゲティング及び不活性化の原理
本発明は、病原性Ｐ２３Ｈロドプシンタンパク質をコードする突然変異ＲＨＯ Ｐ２３
Ｈ対立遺伝子を標的化、切断、及び不活性化することによって、常染色体優性ＲＰを修正
又は予防し得るという仮説に部分的に基づくものである。驚くべきことに、組換えメガヌ
クレアーゼは、突然変異ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ対立遺伝子に存在するＰ２３Ｈ認識配列（例え
ば、配列番号１～４の１つ）を認識及び切断するように操作され得る。このような組換え
メガヌクレアーゼは、対応する野生型対立遺伝子（配列番号９６）と比べて、突然変異Ｒ
ＨＯ Ｐ２３Ｈ対立遺伝子を優先的に標的化及び切断し得る。切断部位におけるＮＨＥＪ
は、突然変異ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ対立遺伝子の突然変異誘発及び破壊をもたらすが、機能的
野生型ＲＨＯ対立遺伝子は依然として、網膜の桿体視細胞において野生型ロドプシンを発
現するほどにインタクトである。突然変異ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ対立遺伝子の優先的不活性化
及びＰ２３Ｈロドプシン発現の破壊は、患者におけるＲＰの進行を予防し、遅延させ又は
逆転させると予想される。

２．２ Ｐ２３Ｈ認識配列を認識及び切断するためのメガヌクレアーゼ
メガヌクレアーゼは、生細胞のゲノムにおいて部位特異的ＤＮＡ切断を起こし得、この
ようなＤＮＡ切断は、突然変異誘発ＮＨＥＪ修復を介して、又はトランスジェニックＤＮ
Ａ配列との相同組換えを介して、ゲノムの永続的な改変をもたらし得る。ＮＨＥＪは切断
部位において突然変異誘発を生じさせ、対立遺伝子の不活性化をもたらし得る。ＮＨＥＪ
関連突然変異誘発は、早期停止コドンの生成、異常な非機能的タンパク質を生じさせるフ
レームシフト突然変異を介して対立遺伝子を不活性化し得るか、又はナンセンス介在性ｍ
ＲＮＡ分解等の機構をトリガーし得る。ＮＨＥＪを介して突然変異誘発を誘導するための
メガヌクレアーゼの使用は、特定の突然変異又は野生型対立遺伝子に存在する配列をター
ゲティングするために使用され得る。

好ましい実施形態では、本発明を実施するために使用されるヌクレアーゼは、一本鎖メ
ガヌクレアーゼである。一本鎖メガヌクレアーゼは、リンカーペプチドによって接続され
たＮ末端サブユニット及びＣ末端サブユニットを含む。２つのドメインはそれぞれ、認識
配列の半分（即ち、認識ハーフサイト）を認識し、ＤＮＡ切断の部位は、２つのサブユニ
ットの接触面付近の認識配列の中央にある。メガヌクレアーゼによるＤＮＡ切断が一組の
４塩基対の３’一本鎖オーバーハングを生成するように、ＤＮＡ鎖切断は、４塩基対によ
って相殺される。

本発明の組換えメガヌクレアーゼは、Ｐ２３Ｈ認識配列（例えば、配列番号１～４の１
つ）を認識及び切断するように操作されている。このようなメガヌクレアーゼは、対応す
る野生型ＲＨＯ認識配列（配列番号９６）と比べて、突然変異ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ対立遺伝
子上のＰ２３Ｈ認識配列を優先的に切断する。本発明の例示的な組換えメガヌクレアーゼ
は、配列番号６～９３に示されている（これらは、本明細書では「ＲＨＯ１－２メガヌク
レアーゼ」又は「ＲＨＯ１／２メガヌクレアーゼ」と総称される）。

本発明の組換えメガヌクレアーゼは、第１の超可変領域（ＨＶＲ１）領域を含む第１の
サブユニット、及び第２の超可変領域（ＨＶＲ２）を含む第２のサブユニットを含む。更
に、第１のサブユニットは、Ｐ２３Ｈ認識配列中の第１の認識ハーフサイト（例えば、Ｒ
ＨＯ１ハーフサイト）に結合し、第２のサブユニットは、Ｐ２３Ｈ認識配列中の第２の認
識ハーフサイト（例えば、ＲＨＯ２ハーフサイト）に結合する。組換えメガヌクレアーゼ
が一本鎖メガヌクレアーゼである実施形態では、第１のサブユニットがＮ末端サブユニッ
トとして配置され、第２のサブユニットがＣ末端サブユニットとして配置されるように、
第１のサブユニット及び第２のサブユニットは配向され得る（例えば、配列番号７０～９
３）。代替的な実施形態では、第１のサブユニットがＣ末端サブユニットとして配置され
、第２のサブユニットがＮ末端サブユニットとして配置されるように、第１のサブユニッ
ト及び第２のサブユニットは配向され得る（例えば、配列番号６～６９）。本発明の例示
的な組換えメガヌクレアーゼは、表１に示されている。

表１．Ｐ２３Ｈ認識配列（配列番号１）を認識及び切断するように操作された例示的な組
換えメガヌクレアーゼ

*「ＲＨＯ１サブユニット％」及び「ＲＨＯ２サブユニット％」は、各メガヌクレアーゼ
のＲＨＯ１結合サブユニット領域及びＲＨＯ２結合サブユニット領域と、ＲＨＯ２－Ｌ３
－５９メガヌクレアーゼのそれぞれＲＨＯ１結合サブユニット領域及びＲＨＯ２結合サブ
ユニット領域との間のアミノ酸配列同一性を表す。

２．３ 組換えメガヌクレアーゼを送達及び発現するための方法
本発明を使用したＲＰの治療は、適切な組織の細胞において組換えメガヌクレアーゼを
発現させ得ることを必要とする。本発明の組換えメガヌクレアーゼの送達のための標的組
織は、眼の細胞、好ましくは眼の後部の細胞、更により好ましくは網膜の細胞（桿体視細
胞を含む）である。組換えメガヌクレアーゼは、精製タンパク質として、又はメガヌクレ
アーゼをコードするＲＮＡ若しくはＤＮＡとして送達され得る。一実施形態では、組換え
メガヌクレアーゼタンパク質又は組換えメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ若しくは
ベクターは、標的組織への直接的な注射を介して、標的細胞（例えば、網膜の細胞）に供
給される。例えば、網膜下注射又は硝子体内注射を介した眼へのＲＮＡ、ＤＮＡ、又は組
換えＡＡＶベクターの送達は、当技術分野で記載されている（例えば、Ｍａｒｔｉｎ ｅ
ｔ ａｌ．（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ．２８：２６７－２７５；Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ
ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１９（１０）：９７
９－９９０；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉ
ｏｎ．１４：２２１１－２２２６を参照のこと）。あるいは、メガヌクレアーゼタンパク
質、ｍＲＮＡ、又はＤＮＡは、循環系を介して全身送達され得る。

いくつかの実施形態では、組換えメガヌクレアーゼタンパク質又は組換えメガヌクレア
ーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、全身投与又は標的組織への投与のために、公知の
技術に従って医薬担体中に製剤化される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔｅｄ．２００
５）を参照のこと。本発明の医薬製剤の製造では、タンパク質／ＲＮＡ／ｍＲＮＡは、典
型的には、薬学的に許容され得る担体と混合される。当然のことながら、担体は、製剤中
の任意の他の成分と適合性であるという意味において許容され得るものでなければならず
、患者に有害なものであってはならない。担体は、固体若しくは液体又はその両方であり
得、単位用量製剤として化合物と共に製剤化され得る。

いくつかの実施形態では、細胞取り込みを促進するために、組換えメガヌクレアーゼタ
ンパク質又は組換えメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、細胞透過性ペプ
チド又は標的化リガンドにカップリングされる。当技術分野で公知の細胞透過性ペプチド
の例としては、ポリ－アルギニン（Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，ｅｔ ａｌ
．（２００８）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１６：１６２４－９）、ＨＩＶウイルス由来のＴＡＴ
ペプチド（Ｈｕｄｅｃｚ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２５：
６７９－７３６）、ＭＰＧ（Ｓｉｍｅｏｎｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４）、Ｐｅｐ－１（Ｄｅｓｈａｙｅｓ
ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：７６９８－７７０６及びＨ
ＳＶ－１ ＶＰ－２２（Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ
Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６２：１８３９－４９が挙げられる。代替的な実施形態では、メガ
ヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡが標的細胞に結合し、標的細胞によってイン
ターナリゼーションされるように、組換えメガヌクレアーゼ又は組換えメガヌクレアーゼ
をコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、標的細胞上で発現される特定の細胞表面受容体を認識
する抗体に共有結合的又は非共有結合的にカップリングされる。あるいは、組換えメガヌ
クレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡは、このような細胞表面受容体の天然リガンド
（又は、天然リガンドの一部）に共有結合的又は非共有結合的にカップリングされ得る。
（ＭｃＣａｌｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｒｒｉｅｒｓ．２（４）
：ｅ９４４４４９；Ｄｉｎｄａ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２６４－７４；Ｋａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｕｒ
ｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（３）：２２０－３０；Ｑｉａｎ ｅｔ
ａｌ．（２０１４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｔｏｘｉｃｏｌ．
１０（１１）：１４９１－５０８）。眼の細胞への直接送達のためのターゲティングリガ
ンドの例としては、ＲＧＤ（Ｐｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＮＡＳ．
１１０（１５）：６１１５－６１２０）、トランスフェリン（Ｌａｊｕｎｅｎ ｅｔ ａ
ｌ．（２０１４）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．６２：２３－３２）及びヒアルロン
酸（Ｍａｒｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．
２０２：８３－９２）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、組換えメガヌクレアーゼタンパク質又は組換えメガヌクレア
ーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、所望の眼領域内への注射又は移植（例えば、硝子
体内注射又は結膜下注射）のために、生分解性ヒドロゲル内に封入される。ヒドロゲルは
、頻繁な注射を必要とせずに、所望の眼領域への治療ペイロードの持続的且つ調整可能な
放出を提供し得るので、刺激応答性材料（例えば、温度応答性ヒドロゲル及びｐＨ応答性
ヒドロゲル）は、環境合図又は外部印加合図に応じてペイロードを放出するように設計さ
れ得る（Ｋａｎｇ Ｄｅｒｗｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｔｒａｎｓ Ａｍ Ｏｐ
ｈｔｈａｌｍｏｌ Ｓｏｃ．１０６：２０６－２１４）。

いくつかの実施形態では、組換えメガヌクレアーゼタンパク質又は組換えメガヌクレア
ーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、当技術分野で公知の方法を使用して、ナノ粒子に
共有結合的に、好ましくは非共有結合的にカップリングされるか、又はこのようなナノ粒
子内に封入される（Ｓｈａｒｍａ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉ
ｎｔ．２０１４）。ナノ粒子は、その長さスケールが１μｍ未満、好ましくは１００ｎｍ
未満のナノスケール送達系である。このようなナノ粒子は、金属、脂質、ポリマー、又は
生物学的高分子から構成されるコアを使用して設計され得、複数コピーの組換えメガヌク
レアーゼタンパク質、ｍＲＮＡ、又はＤＮＡがナノ粒子コアに付着又は封入され得る。こ
れは、各細胞に送達されるタンパク質／ｍＲＮＡ／ＤＮＡのコピー数を増加させるので、
各組換えメガヌクレアーゼの細胞内発現を増加させて、標的認識配列が切断される可能性
を最大化する。このようなナノ粒子の表面は、ポリマー又は脂質（例えば、キトサン、カ
チオン性ポリマー、又はカチオン性脂質）を用いて、その表面が更なる官能性を付与する
コアシェルナノ粒子を形成して細胞送達及びペイロードの取り込みを増強するように更に
改変され得る（Ｊｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．３３
（３０）：７６２１－３０）。有利には、ナノ粒子を適切な細胞型に誘導し、及び／又は
細胞摂取の可能性を増加させるために、ナノ粒子は、標的化分子に更にカップリングされ
得る。このようなターゲティング分子の例としては、細胞表面受容体に特異的な抗体及び
細胞表面受容体の天然リガンド（又は、天然リガンドの一部）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質又はメガヌクレアーゼをコード
するＤＮＡ／ｍＲＮＡは、リポソーム内に封入されるか、又はカチオン性脂質を使用して
複合体化される（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標），Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｚｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２
０１５），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：７３－８０；Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａ
ｌ．（２０１１），Ｊ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２０１１：８６３７３４を参照のこと）
。リポソーム製剤及びリポプレックス製剤は、標的細胞の細胞膜との融合及び／又はその
破壊を通じて、分解からペイロードを保護し、標的部位における蓄積及び保持を増強し、
細胞取り込み及び送達効率を促進し得る。

いくつかの実施形態では、組換えメガヌクレアーゼタンパク質又は組換えメガヌクレア
ーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ポリマー足場（例えば、ＰＬＧＡ）内に封入され
るか、又はカチオン性ポリマー（例えば、ＰＥＩ、ＰＬＬ）を使用して複合体化される（
Ｔａｍｂｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｔｈｅｒ Ｄｅｌｉｖ．２（４）：５２３
－５３６）。ポリマー担体は、ポリマーの侵食及び薬物の拡散の制御による調整可能な薬
物放出速度を提供するように設計され得、高い薬物封入効率は、所望の標的細胞集団への
細胞内送達まで、治療ペイロードの保護を提供し得る。

いくつかの実施形態では、組換えメガヌクレアーゼタンパク質又は組換えメガヌクレア
ーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ミセルに自己集合する両親媒性分子と組み合わさ
れる（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９（１１）：９５
６－６６）。ポリマーミセルとしては、凝集を防止し、電荷相互作用を遮蔽し、硝子体液
内の非特異的相互作用を減少させ得る親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール
）で形成されたミセルシェルが挙げられ得る。

いくつかの実施形態では、組換えメガヌクレアーゼタンパク質又は組換えメガヌクレア
ーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、標的細胞への投与及び／又は送達のために、エマ
ルジョン又は（即ち、１ｎｍ未満の平均粒径を有する）ナノエマルジョンに製剤化される
。「エマルジョン」という用語は、限定されないが、水不混和相が水相と混合されると、
非極性残基（例えば、長い炭化水素鎖）を水及び極性頭部基から水に移動させる疎水力の
結果として形成し得る脂質構造を含む任意の水中油型、油中水型、水中油中水型、又は油
中水中油型の分散液又は液滴を指す。これらの他の脂質構造としては、限定されないが、
ユニラメラ、パウキラメラ、及びマルチラメラ脂質小胞、ミセル並びににラメラ相が挙げ
られる。エマルジョンは、水相及び（典型的には、油及び有機溶媒を含有する）親油性相
から構成される。エマルジョンはまた、多くの場合、１つ以上の界面活性剤を含有する。
ナノエマルジョン製剤は周知であり、例えば、米国特許出願公開第２００２／００４５６
６７号及び米国特許出願公開第２００４／００４３０４１号並びに米国特許第６，０１５
，８３２号、米国特許第６，５０６，８０３号、米国特許第６，６３５，６７６号、及び
米国特許第６，５５９，１８９号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に
組み込まれる）に記載されている。

いくつかの実施形態では、組換えメガヌクレアーゼタンパク質又は組換えメガヌクレア
ーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、多官能性ポリマーコンジュゲート、ＤＮＡデンド
リマー、及びポリマーデンドリマーに共有結合的に付着されるか、及びそれらと非共有結
合的に会合される（Ｍａｓｔｏｒａｋｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｎａｎｏｓｃａ
ｌｅ．７（９）：３８４５－５６；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｊ Ｐｈａ
ｒｍ Ｓｃｉ．９７（１）：１２３－４３）。デンドリマーの生成は、ペイロードの容量
及びサイズを制御し得るので、高い薬物ペイロード容量を提供し得る。また、複数の表面
基の提示は、安定性を改善し、非特異的相互作用を減少させ、細胞特異的標的化及び薬物
放出を増強するために活用され得る。

いくつかの実施形態では、組換えメガヌクレアーゼをコードする遺伝子は、ウイルスベ
クターを使用して送達される。このようなベクターは当技術分野で公知であり、レンチウ
イルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター
が挙げられる（Ｖａｎｎｕｃｃｉ，ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．３６：１－２２において概説されている）。いくつかの実施形態では、ウイルスベ
クターは、標的組織に直接注射される（Ｂｏｓｃｈ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒ．１：６３－７０；Ｇｒｅｉｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４），ＰＬｏＳ Ｏｎ
ｅ．Ｎｏｖ １３；９（１１）：ｅ１１２２６８）。代替的な実施形態では、ウイルスベ
クターは、循環系を介して全身送達される。当技術分野では、様々なＡＡＶベクターが様
々な組織に局在する傾向があることが公知である。網膜標的組織では、例えば、ＡＡＶ血
清型１、２、５、８、及び９を用いて、網膜視細胞の有効な形質導入が示されている（Ｐ
ｅｔｒｓ－Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｐｈｔｈａｌ
ｍｏｌｏｇｙ．８：１２７－１３６）。ＡＡＶベクターはまた、宿主細胞において第２鎖
ＤＮＡ合成を必要としないように自己相補的であり得る（ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．
（２００１），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１２４８－５４）。

一実施形態では、メガヌクレアーゼ遺伝子送達のために使用されるウイルスベクターは
、自己制限ウイルスベクターである。自己制限ウイルスベクターは、組換えメガヌクレア
ーゼの認識配列がベクター内に存在するので、細胞又は生物において限られた存続時間を
有し得る。従って、自己制限ウイルスベクターは、プロモーター、本明細書に記載される
組換えメガヌクレアーゼ、及びＩＴＲ内のメガヌクレアーゼ認識部位のコードを提供する
ように操作され得る。メガヌクレアーゼが発現され、ゲノム内の内因性認識配列において
細胞のゲノムをカットすることができるように、自己制限ウイルスベクターは、メガヌク
レアーゼ遺伝子を細胞、組織、又は生物に送達する。送達されたメガヌクレアーゼはまた
、自己制限ウイルスベクターそれ自体の中にあるその標的部位を見出し、この標的部位に
おいてベクターをカットするであろう。カットされたら、ウイルスゲノムの５’末端及び
３’末端が露出し、エキソヌクレアーゼによって分解されて、ウイルスが死滅し、組換え
メガヌクレアーゼの産生が停止する。

組換えメガヌクレアーゼ遺伝子が、ＤＮＡ形態（例えば、プラスミド）で及び／又はウ
イルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を介して送達される場合、それらは、プロモーターに
作動可能に連結されなければならない。いくつかの実施形態では、これは、ウイルスプロ
モーター、例えばウイルスベクター由来の内因性プロモーター（例えば、レンチウイルス
ベクターのＬＴＲ）又は周知のサイトメガロウイルス若しくはＳＶ４０ウイルス初期プロ
モーターであり得る。好ましい実施形態では、メガヌクレアーゼ遺伝子は、標的細胞にお
いて優先的に遺伝子発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結される。網膜及び／又
は桿体視細胞特異的プロモーターの例としては、限定されないが、ヒトロドプシンキナー
ゼプロモーター、近位マウスオプシンプロモーター（ｍＯＰ）、ヒトＧタンパク質共役型
受容体プロテインキナーゼ１プロモーター（ｈＧＲＫ１）、及びヒト光受容体間レチノイ
ド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）プロモーター（Ｋｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００７），
Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４８（９）：３９５４－３９６１
）；Ｂｅｌｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１７（９
）：１１６２－１１７４）；Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｅｘｐ．Ｅ
ｙｅ Ｒｅｓ．５５（２）：２２５－２３３）、並びに米国特許出願公開第２０１４／０
２８７５１０号に開示されている桿体視細胞特異的プロモーターが挙げられる。

いくつかの実施形態では、本発明は、薬学的に許容され得る担体と、本発明の組換えメ
ガヌクレアーゼとを含む医薬組成物、又は薬学的に許容され得る担体と、本発明の組換え
メガヌクレアーゼをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドとを含む医薬組成
物を提供する。このような医薬組成物は、公知の技術に従って調製され得る。例えば、Ｒ
ｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａ
ｒｍａｃｙ（２１ｓｔｅｄ．２００５）を参照のこと。本発明の医薬製剤の製造では、エ
ンドヌクレアーゼポリペプチド（又は、それをコードするＤＮＡ／ＲＮＡ）は、典型的に
は、薬学的に許容され得る担体と混合され、得られた組成物が被験体に投与される。当然
のことながら、担体は、製剤中の任意の他の成分と適合性であるという意味において許容
され得るものでなければならず、被験体に有害なものであってはならない。いくつかの実
施形態では、本発明の医薬組成物は、被験体における疾患の治療において有用な１つ以上
の更なる薬剤又は生物学的分子を更に含み得る。同様に、更なる薬剤及び／又は生物学的
分子は、別個の組成物として同時投与され得る。

単回治療は、一定割合の患者標的細胞において突然変異Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ対立遺伝子を
永続的に不活性化すると想定される。しかしながら、Ｐ２３Ｈ対立遺伝子不活性化の頻度
が低い場合、又は標的細胞の大部分を修正する必要がある場合、各患者に対して複数回治
療を実施する必要があり得る。

２．４ 組換えメガヌクレアーゼ変異体
本発明の実施形態は、本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼ及びその変異体を
包含する。本発明の更なる実施形態は、本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼを
コードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド及びこのようなポリヌクレオチド
の変異体を包含する。

特に、本発明は、配列番号６～９３のメガヌクレアーゼの変異体であって、メガヌクレ
アーゼが、野生型ＲＨＯ遺伝子（配列番号９８）中の対応する野生型配列と比べて、配列
番号２～４の１つを優先的に認識及び切断するように、超可変領域が改変されている変異
体を提供する。このような更なる変異体メガヌクレアーゼは、国際公開第２００７／０４
７８５９号、米国特許第８，０２１，８６７号、米国特許第８，１１９，３６１号、米国
特許第８，１１９，３８１号、米国特許第８，１２４，３６９号、米国特許第８，１２９
，１３４号、米国特許第８，１３３，６９７号、米国特許第８，１４３，０１５号、米国
特許第８，１４３，０１６号、米国特許第８，１４８，０９８号、米国特許第８，１６３
，５１４号、米国特許第８，３０４，２２２号、米国特許第８，３７７，６７４号、及び
米国特許第８，４４５，２５１号に記載されている方法、並びに以下で議論されている方
法に従ってルーチンな実験によって生産され得る。

本明細書で使用される場合、「変異体」は、実質的に類似の配列を意味することを意図
する。「変異」ポリペプチドは、ネイティブなタンパク質の１つ以上の内部部位における
１つ以上のアミノ酸の欠失若しくは付加、及び／又はネイティブなポリペプチドの１つ以
上の部位における１つ以上のアミノ酸の置換によって、「ネイティブな」ポリペプチドか
ら生じるポリペプチドを意味することを意図する。本明細書で使用される場合、「ネイテ
ィブな」ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、変異体が由来する親配列を含む。実施形
態によって包含される変異ポリペプチドは、生物学的に活性である。即ち、それらは、ネ
イティブなタンパク質の所望の生物学的活性（即ち、本明細書に記載されるような、Ｐ２
３Ｈ認識配列（例えば、配列番号１～４の１つ）を優先的に認識及び切断する能力）を有
し続ける；このような変異体は、例えば、ヒトによる操作から生じ得る。実施形態のネイ
ティブなポリペプチドの生物学的に活性な変異体（例えば、配列番号６～９３）、又は本
明細書に記載されるＲＨＯ１結合サブユニット及びＲＨＯ２結合サブユニットの生物学的
に活性な変異体（例えば、配列番号９９～２７４）は、本明細書の他の箇所に記載されて
いる配列アライメントプログラム及びパラメータによって決定した場合、ネイティブなポ
リペプチド又はネイティブなサブユニットのアミノ酸配列と少なくとも約４０％、約４５
％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５
％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７
％、約９８％、又は約９９％の配列同一性を有するであろう。実施形態のポリペプチド又
はサブユニットの生物学的に活性な変異体は、そのポリペプチド又はサブユニットとわず
か約１～４０個のアミノ酸残基、わずか約１～２０個、わずか約１～１０個、わずか約５
個、わずか４個、３個、２個、又は更には１個のアミノ酸残基が異なり得る。

実施形態のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、短縮、及び挿入を含む様々な方法
で変化され得る。このような操作のための方法は、一般に、当技術分野で公知である。例
えば、アミノ酸配列変異体は、ＤＮＡの突然変異によって調製され得る。突然変異誘発及
びポリヌクレオチド変化のための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅ
ｌ（１９８５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８－４９
２；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
．１５４：３６７－３８２；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８７３，１９２；Ｗａｌｋｅｒ
ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３），Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍ
ｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びそれらの中で引用されている参考文献を参照のこと。
目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関するガイダ
ンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８），Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ
．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）（これは、参照により本明細書に組
み込まれる）のモデルにおいて見出され得る。保存的置換（例えば、あるアミノ酸と、類
似の特性を有する別のアミノ酸との交換）が最適であり得る。

野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインに対する相当数のアミノ酸
改変であって、得られる合理的に設計されたメガヌクレアーゼが野生型酵素とは異なるハ
ーフサイト特異性を有するような、ＤＮＡ認識配列ハーフサイト内の個々の塩基において
変化した特異性を有する組換えメガヌクレアーゼを単独で又は組み合わせてもたらすアミ
ノ酸改変が以前に同定されている（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号）。表２は
、認識ハーフサイトの各ハーフサイト位置（－１～－９）に存在する塩基に基づいて、特
異性を増強するために組換えメガヌクレアーゼ単量体又はサブユニットにおいて行われ得
る置換候補を提供する。

ポリヌクレオチドの場合、「変異体」は、ネイティブなポリヌクレオチド内の１つ以上
の部位における１つ以上のヌクレオチドの欠失及び／又は付加を含む。当業者であれば、
オープンリーディングフレームが維持されるように、実施形態の核酸の変異体が構築され
ることを認識するであろう。ポリヌクレオチドの場合、保存的変異体としては、遺伝コー
ドの縮重により、実施形態のポリペプチドの１つのアミノ酸配列をコードする配列が挙げ
られる。変異ポリヌクレオチドとしては、合成由来ポリヌクレオチド、例えば、部位特異
的突然変異誘発を使用することによって生成されるが実施形態の組換えメガヌクレアーゼ
を依然としてコードするものが挙げられる。一般に、実施形態の特定のポリヌクレオチド
の変異体は、本明細書の他の箇所に記載されている配列アライメントプログラム及びパラ
メータによって決定した場合、その特定のポリヌクレオチドと少なくとも約４０％、約４
５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８
５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９
７％、約９８％、約９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するであろう。実施形態の特
定のポリヌクレオチド（即ち、参照ポリヌクレオチド）の変異体はまた、変異ポリヌクレ
オチドによってコードされるポリペプチドと、参照ポリヌクレオチドによってコードされ
るポリペプチドとの間の配列同一性のパーセントの比較によって評価され得る。

本明細書に包含されるタンパク質配列の欠失、挿入、及び置換は、ポリペプチドの特徴
の根本的な変化を生じさせるとは予想されない。しかしながら、実行前に置換、欠失、又
は挿入の正確な効果を予測することが困難である場合、当業者であれば、Ｐ２３Ｈ認識配
列（例えば、配列番号１～４の１つ）を優先的に認識及び切断する能力についてポリペプ
チドをスクリーニングすることによって、効果が評価されることを認識するであろう。

以下の実施例によって本発明を更に例証するが、これらは限定的なものと解釈されるべ
きではない。当業者であれば、ルーチンな実験のみを使用して、本明細書に記載される特
定の物質及び手順の多数の等価物を認識し、又は確認することができるであろう。このよ
うな等価物は、以下の実施例に続く特許請求の範囲によって包含されることを意図する。

実施例１
Ｐ２３Ｈ認識配列を認識及び切断するメガヌクレアーゼの評価

１．Ｐ２３Ｈ認識配列を認識及び切断するメガヌクレアーゼ
突然変異ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ対立遺伝子に存在するＰ２３Ｈ認識配列の１つ（即ち、配列
番号１）を認識及び切断するように、組換えメガヌクレアーゼ（配列番号６～９３）（本
明細書では、「ＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼ」と総称される）を操作した（図１Ａを参
照のこと）。各ＲＨＯ１－２組換えメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０由来のＮ末端ヌクレア
ーゼ局在化シグナルと、第１のメガヌクレアーゼサブユニットと、リンカー配列と、第２
のメガヌクレアーゼサブユニットとを含む。各ＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼ中の第１の
サブユニットは配列番号１のＲＨＯ１認識ハーフサイトに結合し、第２のサブユニットは
ＲＨＯ２認識ハーフサイトに結合する（図１Ｂを参照のこと）。

図２及び３に示されているように、ＲＨＯ１結合サブユニット及びＲＨＯ２結合サブユ
ニットはそれぞれ、５６塩基対の超可変領域（それぞれＨＶＲ１及びＨＶＲ２と称される
）を含む。ＲＨＯ１結合サブユニットは、（Ｑ残基又はＥ残基を含む）８０位又は２７１
位を除いてＨＶＲ１領域の外側では同一であり、ＨＶＲ１領域内では高度に保存されてい
る。同様に、ＲＨＯ２結合サブユニットもまた、（Ｑ残基又はＥ残基を含む）８０位又は
２７１位を除いてＨＶＲ２領域の外側では同一であり、ＨＶＲ２領域内では高度に保存さ
れている。

配列番号６～９３のＲＨＯ１結合領域は図２Ａ～２Ｆに示されており、それぞれ配列番
号１０２～１８９として示されている。配列番号１０２～１８９のほぼ全てが、配列番号
１０２（これは、メガヌクレアーゼＲＨＯ２－Ｌ３－５９（配列番号６）のＲＨＯ１結合
領域である）と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号６～９３のＲＨＯ２
結合領域は図３Ａ～３Ｆに示されており、それぞれ配列番号１９０～２７７として示され
ている。配列番号１９０～２７７のほぼ全てが、配列番号１９０（これは、メガヌクレア
ーゼＲＨＯ２－Ｌ３－５９（配列番号６）のＲＨＯ２結合領域である）と少なくとも９０
％の配列同一性を共有する。

２．ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおけるＰ２３Ｈ認識配列の切断
ＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼが配列番号１のＰ２３Ｈ認識配列を認識及び切断し得る
かを決定するために、以前に記載されているＣＨＯ細胞レポーターアッセイを使用して、
各ＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼを評価した（国際公開第２０１２／１６７１９２号の図
４を参照のこと）。アッセイを実施するために、細胞のゲノムに組み込まれた非機能的緑
色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子発現カセットを有する一組のＣＨＯ細胞レポーター株
を生産した。メガヌクレアーゼによるいずれかの認識配列の細胞内切断が相同的組換え事
象を刺激して、機能的ＧＦＰ遺伝子が生じるように、一組の認識配列によって各細胞株の
ＧＦＰ遺伝子を中断した。両方の細胞株において、認識配列の一方はＲＨＯ遺伝子に由来
しており（配列番号１又は配列番号５のいずれか）、第２の認識配列は、「ＣＨＯ－２３
／２４」と称される対照メガヌクレアーゼによって特異的に認識された。配列番号１のＰ
２３Ｈ認識配列及びＣＨＯ－２３／２４認識配列を含むＣＨＯレポーター細胞は、本明細
書では「ＲＨＯ１－２細胞」と称される。ＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼ（配列番号６～
９３）の１つをコードするか、又はＣＨＯ－２３／３４メガヌクレアーゼをコードするプ
ラスミドＤＮＡをＲＨＯ１－２細胞にトランスフェクトした。製造業者の説明書に従って
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、９６
ウェルプレート中で、５０ｎｇのプラスミドＤＮＡを約４×１０^５個のＣＨＯ細胞にトラ
ンスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、フローサイトメトリーによって
細胞を評価して、非トランスフェクト陰性対照（ＲＨＯ１－２ｂｓ）と比較したＧＦＰ陽
性細胞の割合を決定した。ＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼは全て、Ｐ２３Ｈ認識配列を含
む細胞株では、陰性対照を有意に超える頻度で、及びＣＨＯ－２３／２４陽性対照と同程
度か又はそれを超える頻度で、ＧＦＰ陽性細胞を生じさせることが見出されたが、これは
、各ＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼが、細胞中の目的のＰ２３Ｈ認識配列を効率的に認識
及び切断することができたことを示している（図５を参照のこと）。

また、メガヌクレアーゼをＲＨＯ１－２細胞に導入した後１日後、４日後、６日後、及
び８日後に、ＲＨＯ１－２組換えメガヌクレアーゼの有効性を時間依存的に決定した。こ
の研究では、製造業者の説明書に従ってＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅ
ｌｌを使用して、細胞１個当たり１×１０^６コピーのメガヌクレアーゼｍＲＮＡをＲＨＯ
１－２細胞（１．０×１０^６個）にエレクトロポレーションした。トランスフェクション
の４８時間後、フローサイトメトリーによって細胞を評価して、ＧＦＰ陽性細胞の割合を
決定した。各時点において、陽性対照としてＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼも含め
た。図６に示されているように、ＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼの有効性は、８日間の評
価期間にわたって持続した。

３．結論
これらの研究では、本発明によって包含されるＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼ（配列番
号６～９３）は、細胞中の配列番号１のＰ２３Ｈ認識配列をターゲティング及び切断し得
ることが実証された。

実施例２
Ｐ２３Ｈ認識配列に対するメガヌクレアーゼの特異性

１．対応する野生型ＲＨＯ配列を含むＣＨＯレポーター細胞
配列番号１のＰ２３Ｈ認識配列に対するＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼ（配列番号６～
９３）の特異性を決定するために、対応する野生型ＲＨＯ認識配列（配列番号５）（本明
細書では、「ＲＨＯ３－４認識配列」と称される）及びＣＨＯ－２３／２４認識配列を含
むＣＨＯレポーター細胞株を前述のように作製した。得られた細胞は、本明細書では「Ｒ
ＨＯ３－４細胞」と称される。

２．ＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼの特異性
ＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼをＲＨＯ１－２細胞又はＲＨＯ３－４細胞に導入して、
組換えメガヌクレアーゼが、配列番号１のＰ２３Ｈ認識配列と、対応する野生型認識配列
（配列番号５）とを識別し得るかを決定した。前述のようにｍＲＮＡのエレクトロポレー
ションによって、ＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼｍＲＮＡをＲＨＯ１－２細胞又はＲＨＯ
３－４細胞に導入し、３～５日後にＧＦＰ陽性細胞のパーセントを決定した。図７に示さ
れているように、ＲＨＯ３－４細胞よりもＧＦＰ陽性ＲＨＯ１－２細胞の割合が高いこと
から明らかなように、試験したＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼはそれぞれ、ＲＨＯ３－４
認識配列と比べてＰ２３Ｈ認識配列を優先的に切断した（図７Ａ～７Ｅを参照のこと）。
その後の実験では、野生型ＲＨＯ３－４認識配列（配列番号５）を優先的に標的化及び切
断する組換えメガヌクレアーゼを開発することができたことが示された。上記ＣＨＯ細胞
レポーターアッセイを使用して評価した場合、このセットのメガヌクレアーゼは、ＲＨＯ
１－２細胞よりも高い割合のＧＦＰ陽性ＲＨＯ３－４細胞をもたらすことが見出された（
図７Ｆを参照のこと）。

３．結論
本発明者らは、本発明によって包含されるＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼが、対応する
野生型ＲＨＯ３－４認識配列（配列番号５）と比べて、配列番号１のＰ２３Ｈ認識配列を
優先的に切断することを実証した。

実施例３
組換えメガヌクレアーゼを発現させるための組換えＡＡＶベクターの作製及び発現

１．ＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼを発現させるための組換えＡＡＶベクター
ＣＨＯレポーター細胞においてＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼを発現するように、組換
えＡＡＶベクターを設計した。図８Ａに示されているように、組換えＡＡＶベクターは、
５’から３’に、第１の逆方向末端反復（ＩＴＲ）と、メガヌクレアーゼをコードするヌ
クレオチド配列に作動可能に連結されたＣＭＶプロモーターと、第２の逆方向末端反復と
を含む。この研究では、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－４９メガヌクレアーゼのコード配列を組
換えＡＡＶベクターに組み込んだ。

２．組換えＡＡＶ形質導入後のＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼの発現
ＲＨＯ１－２細胞におけるＲＨＯ－１／２－Ｌ２－４９メガヌクレアーゼの発現のため
に、ＨＥＫ－２９３細胞において標準的なトリプルトランスフェクションプロトコールを
使用して、組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ－ＲＨＯ－１／２）を調製した（Ｄｒｉｔｔ
ａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．３：５９－７１）。３つ
のウイルス濃度のｒＡＡＶ－ＲＨＯ－１／２ベクターをＲＨＯ１－２ＣＨＯレポーター細
胞に形質導入した。形質導入の２４時間後、細胞を溶解し、ポリクローナルメガヌクレア
ーゼ特異的抗体又はβ－アクチン特異的対照抗体を使用してウエスタンブロットによって
分析した。図８Ｂに示されているように、３つのウイルス濃度全てにおいて、ＲＨＯ－１
／２－Ｌ２－４９の発現が観察された。

３．ＡＡＶ送達ＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼの特異性
ｒＡＡＶ－ＲＨＯ－１／２ベクターをＲＨＯ１－２細胞又はＲＨＯ３－４細胞に形質導
入して、対応する野生型ＲＨＯ３－４認識配列（配列番号５）と比べた、配列番号１のＰ
２３Ｈ認識配列の認識及び切断に関するＡＡＶ送達ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－４９メガヌク
レアーゼの特異性を実証した。図９に示されているように、形質導入の３日後、ＡＡＶ送
達ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－４９メガヌクレアーゼは、使用したウイルス濃度全てにおいて
、ＲＨＯ３－４細胞よりも高い割合のＧＦＰ陽性ＲＨＯ１－２細胞を誘導したが、これは
、メガヌクレアーゼが突然変異配列を優先的に認識及び切断することを示している。

４．ＡＡＶ送達ＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼ発現の持続性
ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－４９メガヌクレアーゼ又はＧＦＰをコードする組換えＡＡＶベ
クターを形質導入したＲＨＯ１－２細胞をシクロヘキシミドで処理してタンパク質翻訳を
停止させ、細胞において発現されたタンパク質の安定性を決定した。シクロヘキシミド処
理後の様々な時点（０時間、１．５時間、６時間、及び２２時間）において細胞を溶解し
、ウエスタンブロット分析によって、ＲＨＯ－１／２－Ｌ２－４９、ＧＦＰ、及びβ－ア
クチンのタンパク質レベルを決定した。図１０に示されているように、ＲＨＯ－１／２－
Ｌ２－４９タンパク質はＧＦＰよりも有意に長く存続し、２２時間後において、メガヌク
レアーゼタンパク質の減少は見られなかった。

５．結論
この研究は、組換えＡＡＶベクターを使用して、本発明によって包含されるＲＨＯ１－
２メガヌクレアーゼを細胞において発現させ得ること、及びこのようなメガヌクレアーゼ
が、対応する野生型ＲＨＯ３－４配列（配列番号５）と比べて、配列番号１のＰ２３Ｈ認
識配列を優先的に認識及び切断することを示している。更に、この研究は、組換えＡＡＶ
ベクターを使用して発現させた場合、ＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼタンパク質が細胞に
おいて安定であることを実証している。

実施例４
ＡＡＶによって送達したＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼによる、レポーター細胞における
ＲＨＯ１－２認識配列の切断

１．組換えＡＡＶベクターの生産
この研究の目的は、ウイルス形質導入によってＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼを哺乳動
物細胞において発現させ得ることを実証することであり、ＲＨＯ１－２認識配列を切断す
るそれらの能力を更に実証することであった。

この実験のために、前述のトリプルトランスフェクション法によって、２つの組換えＡ
ＡＶ２ベクターを生産した。２つのドナープラスミドは、ｐＤＳ ＣＭＶ ＲＨＯ２＿Ｌ
３＿５９（配列番号２４８）及びｐＤＳ ＣＭＶ ＲＨＯ２＿Ｌ５＿１４（配列番号２４
９）（これらは、それぞれＲＨＯ２－Ｌ３－５９及びＲＨＯ２－Ｌ５－１４メガヌクレア
ーゼをコードしていた）であった（図１１）。これらのプラスミドは、ヌクレアーゼの発
現を駆動するＣＭＶプロモーター及びエンハンサーと、ＳＶ４０ポリＡ配列と、ゲノム複
製に必要なＡＡＶ ＩＴＲ（逆方向末端反復）配列とを含み、自己相補的ＡＡＶゲノム（
ｓｃＡＡＶ）の生産に適切である。ＡＡＶ血清型２由来のカプシドを使用して、これらの
ベクターを作製した。ＨＥＫ２９３細胞においてトリプルトランスフェクション法を使用
して組換えｓｃＡＡＶを生産し、ＣｓＣｌ勾配で精製した。ＲＴ－ＰＣＲ及びスロットブ
ロット法によって、ウイルス力価を決定した。

２．レポーター細胞の形質導入及び切断効率の分析
これらのＡＡＶ粒子が、ＲＨＯ３－４認識配列（配列番号５）ではなくＲＨＯ１－２認
識配列（配列番号１）を認識して特異的に切断することができる機能的ＲＨＯ１－２メガ
ヌクレアーゼを送達し得るかを決定するために、以前に記載されているＣＨＯレポーター
株（国際公開第２０１２／１６７１９２号を参照のこと）においてそれらを試験した。ア
ッセイを実施するために、細胞のゲノムに組み込まれた非機能的緑色蛍光タンパク質（Ｇ
ＦＰ）遺伝子発現カセットを有する一組のＣＨＯ細胞レポーター株を生産した。メガヌク
レアーゼによる認識配列の細胞内切断が相同的組換え事象を刺激して、機能的ＧＦＰ遺伝
子が生じるように、ＲＨＯ１－２認識配列又はＲＨＯ３－４認識配列のいずれかによって
各細胞株のＧＦＰ遺伝子を中断した。ＲＨＯ１－２認識配列を含むＣＨＯレポーター細胞
は、この実験では「Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ細胞」と称される。ＲＨＯ３－４認識配列を含むＣ
ＨＯレポーター細胞は、この実験では「ＷＴ ＲＨＯ細胞」と称される。ＧＦＰレポータ
ーカセットを有しない野生型対照細胞は、この実験では「ＣＨＯ Ｋ細胞」と称される。

上記組換えｓｃＡＡＶをＷＴ ＲＨＯ細胞、Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ細胞又は野生型ＣＨＯ
Ｋ細胞（陰性対照）に感染させた。３つのＭＯＩ：１×１０^８、１×１０^９、又は２×１
０^９（それぞれ「低」、「中」、及び「高」）で、レポーター細胞に感染させた。感染の
４８時間後、フローサイトメトリーによって細胞を評価して、野生型対照ＣＨＯ細胞と比
較したＧＦＰ陽性細胞の割合を決定した。図１２に示されているように、ＲＨＯ２－Ｌ３
－５９又はＲＨＯ２－Ｌ５－１４ ｓｃＡＡＶのいずれかを感染させた対照野生型ＣＨＯ
細胞は、１％未満のバックグラウンドＧＦＰ発現を示した。野生型ＲＨＯ３－４標的を有
する細胞（「ＷＴ ＲＨＯ細胞」）は、対照細胞よりも有意に高いＧＦＰ発現を示さなか
ったが、これは、ＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼがＲＨＯ３－４認識配列を切断すること
ができないことを示している。Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ細胞では、ＲＨＯ２－Ｌ３－５９及びＲ
ＨＯ２－Ｌ５－１４メガヌクレアーゼは両方とも、用量依存的に有意なＧＦＰ発現をもた
らし、最高用量では、１０％ＧＦＰ＋に迫るレベルであった。

ウエスタンブロット分析を使用して、Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ細胞におけるＧＦＰ及びメガヌ
クレアーゼ発現の両方を確認した。３つの異なる用量のｓｃＡＡＶを感染させたＰ２３Ｈ
ＲＨＯ細胞及びＷＴ ＲＨＯ細胞からのみ、全細胞溶解物を調製した。再現性の指標を
得るために、２回反復用の溶解物を採取した。（タンパク質濃度によって決定した）等量
の溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、膜に転写し、ＧＦＰ、Ｉ－ＣｒｅＩメガヌ
クレアーゼ又はβ－アクチン（ローディング対照用）のいずれかに対する抗体を使用して
プローブした。ＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩに対するポリクローナル
抗体を用いて検出可能である。

図１３に示されているように、ウエスタンブロット分析は、用量依存的なＧＦＰの検出
を明確に実証しているが、これは、図１２に示されている上記フローサイトメトリーデー
タを裏付けている。ウエスタンブロット分析はまた、用量依存的なＲＨＯ１－２メガヌク
レアーゼの発現を示している。このブロットは、ＲＨＯ２－Ｌ５－１４がＲＨＯ２－Ｌ３
－５９よりも高いレベルで発現されたことを示唆している。β－アクチンレベルは一貫し
ており、ゲルローディングが適切であることを示している。

３．結論
まとめると、これらのデータは、本発明のＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼのための発現
カセットを有する組換えｓｃＡＡＶがＣＨＯレポーター株に感染して、ＲＨＯ１－２メガ
ヌクレアーゼの発現をもたらすことができ、次いでこれが、ＷＴ ＲＨＯ３－４認識では
なくＰ２３Ｈ ＲＨＯ１－２認識配列（配列番号１）を特異的に切断することができるこ
とを実証している。

実施例５
ＲＰのマウスモデルにおけるＰ２３Ｈ対立遺伝子のインビボ切断

１．組換えＡＡＶベクターの生産及びマウス眼への網膜下送達
この研究の目的は、本発明のＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼが、マウス網膜の視細胞内
においてインビボでＲＨＯ１－２認識配列を標的化及び切断し得るかを決定することであ
った。

上記のようにトリプルトランスフェクション法を使用して組換えｓｃＡＡＶを調製し、
網膜色素変性症のマウスモデルにおいて試験した。このモデルでは、トランスジェニック
マウスは、内因性マウスＲＨＯ対立遺伝子に加えて、単一コピーのヒトＰ２３Ｈ突然変異
ＲＨＯ遺伝子を有する。これらのマウスは網膜色素変性症表現型を示さないが、それらは
、ＲＨＯ１－２認識配列のインビボ切断の分子分析に有用である。ＧＦＰレポーターＣＨ
Ｏ株では、ＲＨＯ２Ｌ５－１４がより良好に機能したので、ＲＨＯ２－Ｌ５－１４をコー
ドするｓｃＡＡＶのみをマウスの感染に使用した（但し、配列番号２８０に示されている
ドナープラスミドを使用したｓｃＡＡＶの生産を含め、ＲＨＯ２－Ｌ３－５９メガヌクレ
アーゼを使用して本実験を実施することができた）。ｓｃＡＡＶトリプルトランスフェク
ションプロトコールにおいて使用したｐＤＳ ＧＲＫ１ ＲＨＯ２＿Ｌ５＿１４ドナープ
ラスミド（配列番号２８１）は、図１４に示されている。示されているように、ＲＨＯ２
－Ｌ５－１４メガヌクレアーゼは、桿体細胞特異的ＧＲＫ１プロモーターの制御下にあっ
た。対照として、ＧＦＰ発現カセットをコードする組換えｓｃＡＡＶも調製した。ＡＡＶ
血清型５由来のカプシドを使用して、これらの組換えｓｃＡＡＶベクターを作製した。

Ｐ２３Ｈトランスジェニックマウスの１匹を使用して、ＲＨＯ２－Ｌ５－１４発現カセ
ットをコードするＡＡＶの網膜下注射が、ＲＨＯ１－２認識配列における切断をもたらし
得るかを試験した。簡潔に言えば、出生後３０日目に、ケタミン１００ｍｇ／ｋｇ及びキ
シラジン１０ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射によって、マウスを全身麻酔下に置いた。トロピカ
ミド（０．５％）及び１％プロパラカインを用いて、瞳孔を拡張した。眼科手術用顕微鏡
下で、３０ゲージの針を用いて、縁に隣接する角膜を介して、小さい切開を行った。ハミ
ルトンシリンジに装着した３３ゲージの鈍針を切開部から挿入した。網膜の鼻側四半部内
で、全ての注射を網膜下に行った。マウスに対して、ＲＨＯ２－Ｌ５－１４をコードする
１μＬのｓｃＡＡＶを一方の眼に投与し、ＧＦＰをコードする１μＬのｓｃＡＡＶを他方
の眼に投与した（両ウイルス調製物は粒子７×１０^１２個／ｍＬの濃度であった）。フル
オレセインをベクター懸濁液に追加することによって、注射中の視覚化を支援した。眼底
検査及びＯＣＴ検査を実施して、網膜下送達の成功を確認した。

イソフルランを用いてマウスを安楽死させ、注射の３０日後に眼を摘出した。手術用顕
微鏡下で、他の眼組織から網膜を慎重に解剖した。ＤＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を
使用することによって、解剖網膜からＤＮＡを単離した。簡潔に言えば、プロテアーゼＫ
を含有する溶解緩衝液を用いて、網膜を５５℃で２時間消化した。溶解後、粗抽出物をカ
ラムに通し、結合したＤＮＡを数回洗浄した。ＤＮＡを溶出し、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈ
ｅｒｍｏ）によって濃度を推定した。

ＲＨＯ１－２認識配列における突然変異の存在及び相対頻度を決定するために、ＲＨＯ
１－２遺伝子座をＰＣＲ増幅し、ディープシーケンシング分析に供した。簡潔に言えば、
ＲＨＯ１－２認識配列に及ぶ約２００ｂｐの領域を増幅するようにＰＣＲプライマーを設
計し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機器を使用したディープシーケンシング分析にゲル
精製ＰＣＲバンドを供した。

２．結果
ＰＣＲバンドのディープシーケンシングにより、１サンプル当たり５×１０^５個の配列
が得られた。ＧＦＰをコードするｓｃＡＡＶを注射した網膜は、ＲＨＯ１－２認識配列に
おいてインデル（挿入又は欠失）を有する約４×１０^３個の配列を示し、０．５４％のバ
ックグラウンドが確立された。ＲＨＯ２－Ｌ５－１４メガヌクレアーゼをコードするＡＡ
Ｖを注射したマウス網膜から単離したＤＮＡでは、インデルが３．９２％で検出され、バ
ックグラウンドよりも約７倍高かった（表３）。他の実験（データは示さず）では、対照
マウスはより低頻度のインデルを示し、典型的には約０．０１％であった。

３．結論
ディープシーケンシングのデータは、ＲＨＯ２－Ｌ５－１４メガヌクレアーゼをコード
するＡＡＶの網膜下注射が、切断及び非相同末端結合後に、網膜色素変性症のマウスモデ
ルにおいてＰ２３Ｈ ＲＨＯ１－２認識配列の突然変異をもたらしたことを実証している
。

実施例６：網膜細胞におけるＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼのインビボ発現
１．網膜細胞のウエスタンブロット分析
ＡＡＶ送達後の野生型マウスの網膜細胞においてＲＨＯ２－Ｌ５－１４メガヌクレアー
ゼを発現させ得ることを確認するために、上記のように網膜下注射によって、ＲＨＯ２－
Ｌ５－１４をコードするｓｃＡＡＶを５匹の野生型マウスに投与した。ＯＳ（左）及びＯ
Ｄ（右）の両方の眼に感染させた。注射の３０日後に網膜を切開し、全細胞溶解物を調製
し、上記のように抗Ｉ－ＣｒｅＩ抗体を使用してウエスタンブロット分析を実施した。

ウエスタンブロット分析により、ほとんどの網膜において、ＲＨＯ２Ｌ－５－１４発現
が容易に検出されることが示された（図１５のレーン３、５、７、及び１０）。他の網膜
では、発現はかなり低かったが、依然として検出可能であった（図１５のレーン１、４、
及び６）。残りの網膜では、発現のレベルはほとんど検出不可能であった（図１５のレー
ン２、８、及び９）。網膜下注射は、眼の後ろの非常に狭い領域への正確な送達に依拠す
る。この手順は、成人患者ではかなり一般的であるが、マウスモデルでは一般的な研究室
業務ではない。従って、発現の差異は、マウス網膜下注射の困難性に起因していた。

２．結論
ウエスタンブロット分析により、マウスに網膜下送達したＲＨＯ２Ｌ－５－１４をコー
ドするｓｃＡＡＶがＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼの発現をもたらしたことが実証された
。ヒトＰ２３Ｈ ＲＨＯ遺伝子に関するマウスモデルからのインデルデータと一緒に総合
すると、これらのデータは、ＲＨＯ１－２メガヌクレアーゼのＡＡＶ送達が、Ｐ２３Ｈ
ＲＨＯ対立遺伝子に欠失を引き起こすのに有効であることを示唆している。

Claims (35)

1. Ｐ２３Ｈ認識配列を認識及び切断する組換えメガヌクレアーゼであって、第１のサブユ
   ニット及び第２のサブユニットを含み、前記第１のサブユニットが前記Ｐ２３Ｈ認識配列
   の第１の認識ハーフサイトを認識し、且つ
   （ａ）配列番号６～６９のいずれか１つの残基１９８～３４４又は配列番号７０～９３
   のいずれか１つの残基７～１５３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
   ；及び
   （ｂ）第１の超可変（ＨＶＲ１）領域
   を含み、
   前記第２のサブユニットが前記Ｐ２３Ｈ認識配列の第２の認識ハーフサイトを認識し、
   （ａ）配列番号６～６９のいずれか１つの残基７～１５３又は配列番号７０～９３のい
   ずれか１つの残基１９８～３４４と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
   ；及び
   （ｂ）第２の超可変（ＨＶＲ２）領域
   を含む、組換えメガヌクレアーゼ。
2. 前記第１のサブユニットが、配列番号６～６９のいずれか１つの残基１９８～３４４又
   は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基７～１５３と少なくとも８５％の配列同一性
   を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニットが、配列番号６～６９のいずれか
   １つの残基７～１５３又は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基１９８～３４４と少
   なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えメガ
   ヌクレアーゼ。
3. 前記第１のサブユニットが、配列番号６～６９のいずれか１つの残基１９８～３４４又
   は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基７～１５３と少なくとも９０％の配列同一性
   を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニットが、配列番号６～６９のいずれか
   １つの残基７～１５３又は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基１９８～３４４と少
   なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の組換
   えメガヌクレアーゼ。
4. 前記第１のサブユニットが、配列番号６～６９のいずれか１つの残基１９８～３４４又
   は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基７～１５３と少なくとも９５％の配列同一性
   を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニットが、配列番号６～６９のいずれか
   １つの残基７～１５３又は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基１９８～３４４と少
   なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項
   に記載の組換えメガヌクレアーゼ。
5. 前記Ｐ２３Ｈ認識配列が配列番号１を含み、前記ＨＶＲ１領域が、
   （Ａ）配列番号６～６９のいずれか１つの２１５位；又は
   （Ｂ）配列番号７０～９３のいずれか１つの２４位
   に対応する位置においてＷ又はＹを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の組換えメ
   ガヌクレアーゼ。
6. 前記Ｐ２３Ｈ認識配列が配列番号１を含み、前記ＨＶＲ１領域が、配列番号６～６９の
   いずれか１つの残基２１５～２７０又は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基２４～
   ７９を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換えメガヌクレアーゼ。
7. 前記Ｐ２３Ｈ認識配列が配列番号１を含み、前記ＨＶＲ２領域が、配列番号６～６９の
   いずれか１つの残基２４～７９又は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基２１５～２
   ７０を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組換えメガヌクレアーゼ。
8. 前記第１のサブユニット及び前記第２のサブユニットを共有結合的に接続するリンカー
   を含む一本鎖メガヌクレアーゼである、請求項１～７のいずれか１項に記載の組換えメガ
   ヌクレアーゼ。
9. 前記第１のサブユニットが、配列番号６～６９のいずれか１つの残基１９８～３４４又
   は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基７～１５３を含む、請求項１～８のいずれか
   １項に記載の組換えメガヌクレアーゼ。
10. 前記第２のサブユニットが、配列番号６～６９のいずれか１つの残基７～１５３又は配
    列番号７０～９３のいずれか１つの残基１９８～３４４を含む、請求項１～９のいずれか
    １項に記載の組換えメガヌクレアーゼ。
11. 配列番号６～９３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか１
    項に記載の組換えメガヌクレアーゼ。
12. 前記Ｐ２３Ｈ認識配列が配列番号１～４の１つを含む、請求項１～１１のいずれか１項
    に記載の組換えメガヌクレアーゼ。
13. 前記Ｐ２３Ｈ認識配列が配列番号１を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組
    換えメガヌクレアーゼ。
14. 配列番号５を含む認識配列と比べて、配列番号１を含むＰ２３Ｈ認識配列を優先的に認
    識及び切断する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組換えメガヌクレアーゼ。
15. 請求項１～１４のいずれか１項に記載の組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列
    を含む、単離されたポリヌクレオチド。
16. 請求項１５に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、組換えＤＮＡ構築物。
17. 組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターをコードする、請求項１６に記載の組換
    えＤＮＡ構築物。
18. 請求項１５に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、組換えＡＡＶベクター。
19. それを必要とする被験体における網膜色素変性症を治療するための方法であって、前記
    被験体の標的細胞のＤＮＡと、Ｐ２３Ｈ認識配列を認識及び切断する組換えメガヌクレア
    ーゼと、を接触させることを含み、
    前記標的細胞が、ＲＨＯ遺伝子対立遺伝子中に前記Ｐ２３Ｈ認識配列を含み、
    前記Ｐ２３Ｈ認識配列の切断が、前記ＲＨＯ遺伝子対立遺伝子の発現を阻害し、
    前記組換えメガヌクレアーゼが、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、
    前記第１のサブユニットが前記Ｐ２３Ｈ認識配列の第１の認識ハーフサイトを認識し、
    （ａ）配列番号６～６９のいずれか１つの残基１９８～３４４又は配列番号７０～９３
    のいずれか１つの残基７～１５３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
    ；及び
    （ｂ）第１の超可変（ＨＶＲ１）領域
    を含み、
    前記第２のサブユニットが前記Ｐ２３Ｈ認識配列の第２の認識ハーフサイトを認識し、
    （ｉ）配列番号６～６９のいずれか１つの残基７～１５３又は配列番号７０～９３のい
    ずれか１つの残基１９８～３４４と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
    ；及び
    （ｉｉ）第２の超可変（ＨＶＲ２）領域
    を含む、方法。
20. 常染色体優性網膜色素変性症を治療するためのものである、請求項１９に記載の方法。
21. 前記第１のサブユニットが、配列番号６～６９のいずれか１つの残基１９８～３４４又
    は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基７～１５３と少なくとも８５％の配列同一性
    を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニットが、配列番号６～６９のいずれか
    １つの残基７～１５３又は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基１９８～３４４と少
    なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９又は２０に記載の
    方法。
22. 前記第１のサブユニットが、配列番号６～６９のいずれか１つの残基１９８～３４４又
    は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基７～１５３と少なくとも９０％の配列同一性
    を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニットが、配列番号６～６９のいずれか
    １つの残基７～１５３又は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基１９８～３４４と少
    なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９～２１のいずれか
    １項に記載の方法。
23. 前記第１のサブユニットが、配列番号６～６９のいずれか１つの残基１９８～３４４又
    は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基７～１５３と少なくとも９５％の配列同一性
    を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニットが、配列番号６～６９のいずれか
    １つの残基７～１５３又は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基１９８～３４４と少
    なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９～２２のいずれか
    １項に記載の方法。
24. 前記Ｐ２３Ｈ認識配列が配列番号１を含み、前記ＨＶＲ１領域が、
    （Ａ）配列番号６～６９のいずれか１つの２１５位；又は
    （Ｂ）配列番号７０～９３のいずれか１つの２４位
    に対応する位置においてＷ又はＹを含む、請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法
    。
25. 前記Ｐ２３Ｈ認識配列が配列番号１を含み、前記ＨＶＲ１領域が、配列番号６～６９の
    いずれか１つの残基２１５～２７０又は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基２４～
    ７９を含む、請求項１９～２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記Ｐ２３Ｈ認識配列が配列番号１を含み、前記ＨＶＲ２領域が、配列番号６～６９の
    いずれか１つの残基２４～７９又は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基２１５～２
    ７０を含む、請求項１９～２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記組換えメガヌクレアーゼが、前記第１のサブユニット及び前記第２のサブユニット
    を共有結合的に接続するリンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼである、請求項１９～２
    ６のいずれか１項に記載の方法。
28. 前記第１のサブユニットが、配列番号６～６９のいずれか１つの残基１９８～３４４又
    は配列番号７０～９３のいずれか１つの残基７～１５３を含む、請求項１９～２７のいず
    れか１項に記載の方法。
29. 前記第２のサブユニットが、配列番号６～６９のいずれか１つの残基７～１５３又は配
    列番号７０～９３のいずれか１つの残基１９８～３４４を含む、請求項１９～２８のいず
    れか１項に記載の方法。
30. 前記組換えメガヌクレアーゼが、配列番号６～９３のいずれか１つのアミノ酸配列を含
    む、請求項１９～２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記Ｐ２３Ｈ認識配列が配列番号１～４の１つを含む、請求項１９～３０のいずれか１
    項に記載の組換えメガヌクレアーゼ。
32. 前記Ｐ２３Ｈ認識配列が配列番号１を含む、請求項１９～３１のいずれか１項に記載の
    組換えメガヌクレアーゼ。
33. 前記組換えメガヌクレアーゼが、配列番号５を含む認識配列と比べて、配列番号１を含
    むＰ２３Ｈ認識配列を優先的に認識及び切断する、請求項１９～３２のいずれか１項に記
    載の方法。
34. 前記被験体における前記標的細胞が網膜細胞である、請求項１９～３３のいずれか１項
    に記載の方法。
35. 組換えＡＡＶベクターを使用して、前記組換えメガヌクレアーゼをコードする遺伝子を
    前記標的細胞に送達する、請求項１９～３４のいずれか１項に記載の方法。

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